DE69636495T2

DE69636495T2 - Multi-Tumor aberrante Wachstumsgene

Info

Publication number: DE69636495T2
Application number: DE69636495T
Authority: DE
Inventors: Jörn Bullerdiek; Jan Willem VAN DE VEN; Franciscus Henricus SCHOENMAKERS; Rafael Mols
Original assignee: Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB
Current assignee: Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB
Priority date: 1995-02-17
Filing date: 1996-02-19
Publication date: 2007-05-24
Anticipated expiration: 2016-02-20
Also published as: PL321831A1; CZ247597A3; CA2213237A1; DE811061T1; JP2009254378A; EP1762619A3; EP0811061B2; JP2008099698A; KR19980702276A; WO1996025493A1; AU4879096A; EP0811061A1; FI973354A0; EP1762619B1; EP0727487A1; EP1762619A2; US6544784B1; EP0811061B1; HUP9800028A3; JP2007082549A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifizierung von Mitgliedern der LIM-Proteinfamilie als eine weitere Art von Tumortyp-spezifischen Bruchpunktbereichgenen und häufigen Fusionspartnern der HMG-Gene in einer Anzahl von Tumoren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf mesenchymale Tumoren-Harmatome (z. B. Brust und Lunge), Lipome, pleomorphe Speicheldrüsenadenome, uterine Leiomyome, Angiomyxome, Fibroadenome der Brust, Polypen des Endometriums, arteriosklerotische Plaques und andere gutartige Tumore sowie verschiedene bösartige Tumoren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Sarkome (z. B. Rhabdomyosarkom, Osteosarkom) und Karzinome (z. B. der Brust, Lunge, Haut, Schilddrüse) sowie Leukämien und Lymphome. Das LPP (Lipombevorzugter Partner)-Gen dieser Familie hat sich als spezifisch für Lipome herausgestellt. Die Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung der Mitglieder der LIM-Genfamilie und derer Derivate in Diagnose und Therapie.
Es ist daher festgestellt worden, dass Mitglieder der LIM-Familie als ein postuliertes Multi-Tumor aberrantes Wachstumsgen (MAG) identifiziert werden können, das an Chromosomenaberrationen beteiligt ist. Unter diesen wird das Chromosom 3-abgeleitete Lipombevorzugter Partner (LPP)-Gen insbesondere mit Lipomen in Verbindung gebracht.
LIM-Proteine sind Proteine, die cysteinreiche zinkbindende Domänen, sogenannte LIM-Domänen, tragen. Sie sind an Protein-Protein-Wechselwirkungen beteiligt [siehe Lit. 80 für einen Überblick]. Eines der Mitglieder der Proteinfamilie ist das nun offenbarte LPP-Protein, das auf dem Chromosom 3 liegt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung sind die Aberrationen in dem LPP-Gen auf Chromosom 3 als Modell verwendet worden, um das allgemeinere Konzept der LIM-Genfamilie sowohl in gutartigen als auch in bösartigen Tumoren aufzudecken.
Obwohl die LIM-Genfamilie als solche bekannt ist, ist bis zu der vorliegenden Erfindung die Korrelation zwischen dieser Familie und tumorinduzierenden Chromosomenaberrationen, wie Translokationen, Deletionen, Insertionen und Inversionen, nicht vorhergesehen worden. Außerdem ist bisher nicht vorher gezeigt worden, dass Veränderungen des physiologischen Expressionsgrades der Mitglieder der Genfamilie wahrscheinlich ebenfalls an der Tumorentwicklung beteiligt sind.
Gestützt auf diese Einsichten stellt die vorliegende Erfindung nun die Mitglieder der Genfamilie oder deren Derivate in isolierter Form und deren Verwendung in diagnostischen und therapeutischen Anwendungen bereit. Weiterhin kann das Wissen über den Ort und die Nukleotidsequenz der Gene verwendet werden, um deren Umordnung oder Expression zu untersuchen und um eine mögliche Zunahme oder Abnahme ihres Expressionsgrades und dessen Effekte auf das Zellwachstum zu identifizieren. Auf diese Information gestützt können diagnostische Tests oder therapeutische Behandlungen entwickelt werden.
In dieser Anmeldung wird der Begriff "Multi-Tumor aberrantes Wachstum (oder MAG)-Gen" verwendet, um die Beteiligung dieser Arten von Genen an verschiedenen Arten von Krebs anzuzeigen. Der Begriff bezieht sich auf alle Mitglieder der LIM-Genfamilie, die an nichtphysiologischem proliferativem Wachstum beteiligt sind und insbesondere an bösartigen oder gutartigen Tumoren, einschließlich arteriosklerotischen Plaques, beteiligt sind. Erfindungsgemäß wurde jedoch weiterhin herausgefunden, dass sogar Brüche außerhalb des tatsächlichen Gens, aber in dessen Nähe, zu einem aberranten Wachstum führen können. Der Begriff MAG-Gen soll daher ebenfalls die unmittelbare Umgebung des Gens einschließen. Der Fachmann wird verstehen, dass die "unmittelbare Umgebung" so verstanden werden sollte, dass sie die Umgebungen des Gens einschließt, in denen Brüche oder Umanordnungen zu dem oben definierten nichphysiologischen proliferativen Wachstum führen.
Der Begriff "Wildtypzelle" wird verwendet, um eine Zelle zu bezeichnen, die kein aberrantes Chromosom beherbergt, oder eine Zelle, die einen physiologischen Expressionsgrad des relevanten Gens aufweist. "Wildtyp" oder "normales Chromosom" bezieht sich auf ein nichtaberrantes Chromosom.
Die vorliegende Erfindung sieht verschiedene diagnostische und therapeutische Anwendungen vor, die auf den Informationen beruhen, die von den Genen erhalten werden können. Diese Information umfasst nicht nur dessen Nukleotidsequenz oder die Aminosäuresequenz des von dem Gen abgeleiteten Genprodukts, sondern umfasst auch die Transkriptions- oder Translationsgrade des Gens.
Die Erfindung ist daher zweifach. Einerseits kann die Aberration im Zellwachstum direkt oder indirekt durch die physikalischen Brüche verursacht sein, die in dem Gen oder dessen Umgebung auftreten. Andererseits kann die Aberration im Zellwachstum durch einen nichtphysiologischen Expressionsgrad des Gens verursacht sein. Dieser nichtphysiologische Expressionsgrad kann durch den Bruch verursacht sein oder kann auf einem anderen Anreiz beruhen, der das Gen aktiviert oder deaktiviert. Gegenwärtig ist der genaue Mechanismus oder Ursprung des aberranten Zellwachstums noch nicht aufgelöst. Eine exakte Kenntnis dieses Mechanismus ist jedoch nicht notwendig, um Verfahren zur Diagnose oder Behandlung zu definieren.
Erfindungsgemäße diagnostische Verfahren beruhen daher auf der Tatsache, dass eine Aberration in einem Chromosom zu einer detektierbaren Veränderung in dem Aussehen oder dem biochemischen Verhalten des Chromosoms führt. Eine Translokation führt z. B. zu einem ersten Teil des Chromosoms (und folglich des MAG-Gens), der durch einen anderen (zweiten) Teil ersetzt wurde (im Folgenden als "erste und zweite Substitutionsteile" bezeichnet). Der erste Teil erscheint häufig irgendwo anders auf einem anderen Chromosom, von dem der zweite Teil stammt. Als Konsequenz werden Hybriden zwischen den verbleibenden Teilen von beiden (oder im Falle von dreifachen Translokationen sogar mehr) Chromosomen und den durch deren Translokationspartner bereitgestellten Substitutionsteilen gebildet. Da nun festgestellt wurde, dass die Brüche in einem MAG-Gen auftreten, führt dies zu hybriden Genprodukten des MAG-Gens. Markierungssubstanzen, wie etwa hybridisierende Moleküle wie RNA, DNA oder DNA/RNA-Hybride, oder Antikörper können solche Hybride sowohl auf der DNA-Ebene als auch auf der RNA- oder Proteinebene detektieren.
Zum Beispiel umfasst das Transkript eines Hybriden noch immer den Bereich, der durch den verbleibenden Teil des Gens/Chromosoms bereitgestellt wird, aber ihm fehlt der Bereich, der durch den Substitutionsteil, der transloziert wurde, bereitgestellt wurde. Im Falle von Inversionen, Deletionen und Insertionen kann das Gen auf gleiche Weise betroffen sein.
Translokationen sind üblicherweise ebenfalls zytogenetisch detektierbar. Die anderen Aberrationen sind schwieriger festzustellen, da sie oft nicht auf einer zytogenetischen Ebene sichtbar sind. Die Erfindung sieht nun Möglichkeiten zum Diagnostizieren all dieser Arten chromosomaler Aberrationen vor.
Bei Translokationen detektieren Markierungssubstanzen oder Sonden, die auf dem MAG-Gen basieren, für die verbleibenden und Substitutionsteile eines Chromosoms in situ den verbleibenden Teil auf dem ursprünglichen Chromosom, aber den Substitutionsteil auf einem anderen, dem Translokationspartner.
Im Fall von Inversionen hybridisieren z. B. zwei Sonden in einem spezifischen Abstand in dem Wildtyp-Gen. Dieser Abstand könnte sich jedoch durch eine Inversion ändern. In situ können solche Inversionen daher durch Markierung eines Satzes geeigneter Sonden mit demselben oder unterschiedlichen detektierbaren Markierungssubstanzen, wie etwa fluoreszierenden Markierungen, sichtbar gemacht werden. Deletionen und Insertionen können auf ähnliche Weise detektiert werden.
Erfindungsgemäß können die oben beschriebenen in situ-Anwendungen sehr vorteilhaft durch Verwendung von FTSH-Techniken durchgeführt werden. Die Markierungssubstanzen sind z. B. zwei Cosmide, von denen eines die Exons 1 bis 3 des MAG-Gens umfasst, während das andere die Exons 4 und 5 umfasst. Beide Cosmide sind mit unterschiedlichen fluoreszierenden Markierungssubstanzen, z. B. blau und gelb, markiert. Das normale Chro mosom zeigt eine Kombination beider Markierungen, so dass es ein grünes Signal ergibt, während die Translokation als blaues Signal auf dem verbleibenden Teil eines Chromosoms (z. B. 12) sichtbar ist, während das gelbe Signal auf einem anderen Chromosom, das den Substitutionsteil umfasst, gefunden wird. Wenn dieselben Markierungen für beide Sonden verwendet werden, beträgt die Intensität des Signals auf dem normalen Chromosom 100 %, während das Signal des aberranten Chromosoms 50 % beträgt. Im Falle von Inversionen verschiebt sich eines der Signale von einem Ort auf dem normalen Chromosom zu einem anderen auf dem aberranten Chromosom.
In den oben beschriebenen Anwendungen muss zum Vergleich eine Referenz eingeschlossen werden. Üblicherweise ist nur eines der zwei Chromosomen betroffen. Es ist daher sehr bequem, das normale Chromosom als interne Referenz zu verwenden. Außerdem ist es wichtig, eine der Markierungssubstanzen auf dem verbleibenden oder nicht geänderten Teil des Chromosoms und die andere auf dem Substitutions- oder invertierten Teil auszuwählen. Als Alternative kann eine Kombination von Sonden basierend auf beiden Translokations- oder Fusionspartnern verwendet werden. Zum Beispiel kann man für die Identifizierung von Lipomen Sonden basierend auf den LIM-Domänen des LPP-Gens einerseits und basierend auf Exons 1 bis 3 des HMGI-C-Gens andererseits verwenden.
Außerdem wurde herausgefunden, dass Brüche auch außerhalb des Gens, d. h. 5' oder 3' davon auftreten können. Die Wahl der Sonden schließt dann selbstverständlich mindestens eine Sonde ein, die mit einer DNA-Sequenz hybridisiert, die 5' oder 3' des Gens angeordnet ist.
Der hier verwendete Begriff "Sonden" sollte weit ausgelegt werden und schließt ein, ist aber nicht beschränkt auf lineare DNA- oder RNA-Stränge, künstliche Hefechromosomen (YACs) oder ringförmige DNA-Formen, wie etwa Plasmide, Phagen, Cosmide usw.
Diese in situ-Verfahren können an Metaphasen- und Interphasen-Chromosomen verwendet werden.
Neben den oben beschriebenen in situ-Verfahren können unterschiedliche diagnostische Techniken auf einer stärker biochemischen Ebene durchgeführt werden, z. B. basierend auf Veränderungen in der DNA, RNA oder dem Protein oder auch Veränderungen in dem physiologischen Expressionsgrad des Gens.
Die Grundlage für die Verfahren, die auf Veränderungen in dem biochemischen Verhalten des Chromosoms beruhen, ist die Tatsache, dass durch Auswählen geeigneter Sonden Veränderungen in der Länge oder Zusammensetzung des Gens, Transkripts oder Proteins auf einem Gel oder Blot detektiert werden können. Veränderungen der Länge sind sichtbar, da das normale Gen, Transkript(e) oder Protein(e) an einer anderen Stelle auf dem Gel oder Blot als das aberrante erscheint. Im Falle einer Translokation erscheint eine größere Anzahl von Flecken als normalerweise.
Basierend auf dem oben beschriebenen Prinzip kann die Erfindung daher z. B. ein Verfahren zum Diagnostizieren von Zellen mit nichtphysiologischen Proliferationsvermögen betreffen, dass die Schritte Entnehmen einer Biopsie von zu diagnostizierenden Zellen, Isolieren eines geeigneten MAG-Gen zugehörigen Makromoleküls daraus und Analysieren des somit erhaltenen Makromoleküls durch Vergleichen mit einem Referenzmolekül, das aus Zellen stammt, die kein nichtphysiologisches Proliferationsvermögen zeigen, bevorzugt von demselben Individuum, umfasst. Das MAG-Gen zugehörige Makromolekül kann daher eine DNA, eine RNA oder ein Protein sein. Das MAG-Gen kann ein Mitglied der LIM-Familie sein.
In einer spezifischen Ausführungsform dieser Art von Diagnoseverfahren umfasst die Erfindung die Schritte Entnehmen einer Biopsie der zu diagnostizierenden Zellen, Extrahieren der gesamten RNA daraus, Herstellen einer Erststrang-cDNA (first strand) der mRNA-Spezies in dem Gesamt-RNA-Extrakt oder poly-A-ausgewählter Fraktion(en) daraus, wobei die cDNA ein geeignetes Ende umfasst; Durchführen einer PCR unter Verwendung eines MAG-Gen-spezifischen Starters und eines endspezifischen Starters, um MAG-Genspezifische cDNAs zu amplifizieren; Trennen der PCR-Produkte auf einem Gel, um ein Bandenmuster zu erhalten; Beurteilen der Gegenwart aberranter Banden durch Vergleich mit Wildtyp-Banden, bevorzugt von demselben Individuum stammend.
Als Alternative kann eine Amplifikation mittels der Nukleinsäuresequenz-basierten Amplifikation (NASBA)-Technik [81] oder deren Variationen durchgeführt werden.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Verfahren die Schritte Entnehmen einer Biopsie der zu diagnostizierenden Zellen, Isolieren des Gesamtproteins daraus, Trennen des Gesamtproteins auf einem Gel, um im Wesentlichen individuelle Banden zu erhalten, wahlweise Übertragen der Banden auf einen Westernblot, Hybridisieren der so erhaltenen Banden mit Antikörpern, die gegen einen Teil des Proteins gerichtet sind, der durch den übrig bleibenden Teil des MAG-Gens codiert ist, und gegen einen Teil des Proteins, der durch den Substitutionsteil des MAG-Gens codiert ist; Sichtbarmachen der Antigen-Antikörper-Reaktionen und Ermitteln der Gegenwart von aberranten Banden durch Vergleich mit Banden von Wildtyp-Proteinen, bevorzugt von demselben Individuum stammend.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Verfahren Entnehmen einer Biopsie der zu diagnostizierenden Zellen; Isolieren der Gesamt-DNA daraus; Verdauen der DNA mit einem oder mehreren sogenannten "rarecutter" Restriktionsenzymen (typischerweise "6- oder Mehrschneider"); Trennen des so hergestellten Verdauungsproduktes auf einem Gel, um ein Trennmuster zu erhalten; wahlweise Übertragen des Trennmusters auf einen Southern-Blot; Hybridisieren des Trennmusters in dem Gel oder auf dem Blot mit einem Satz von Sonden unter Hybridisierungsbedingungen; Sichtbarmachen der Hybridisierungen und Ermitteln der Gegenwart aberranter Banden durch Vergleich mit Wildtypbanden, bevorzugt von demselben Individuum stammend.
Änderungen des Expressionsgrades des Gens können durch das Messen von mRNA-Spiegeln oder Proteinspiegeln mittels einer geeigneten Sonde detektiert werden.
Diagnostische Verfahren, die auf abnormalen Expressionsgraden des Gens basieren, können die Schritte Entnehmen einer Probe der zu diagnostizierenden Zellen; Isolieren von mRNA daraus; und Ermitteln der Gegenwart und/oder der (relativen) Menge an mRNA, die von dem MAG-Gen von Interesse im Vergleich mit einer Kontrolle transkribiert wurde, erfassen. Ermitteln der Gegenwart oder (relativen) Menge der mRNA kann durch Amplifizieren mindestens eines Teils der mRNA des MAG-Gens mittels RT-PCR oder ähnlicher Amplifikationstechniken erreicht werden. In einer alternativen Ausführungsform kann der Expressionsgrad durch Bestimmung der Gegenwart oder der Menge des Genprodukts (z. B. Protein) mittels z. B. monoklonaler Antikörper ermittelt werden.
Das diagnostische Verfahren der Erfindung kann für Erkrankungen verwendet werden, bei welchen Zellen mit einem nichtphysiologischen Proliferationsvermögen aus der Gruppe aus gutartigen Tumoren, wie etwa mesenchymalen Tumoren-Harmatomen (z. B. Brust und Lunge), Fettgewebetumoren (z. B. Lipome), pleomorphen Speicheldrüsenadenomen, uterinen Leiomyomen, Angiomyxomen, Fibroadenomen der Brust, Polypen des Endometriums, arteriosklerotischen Plaques und anderen gutartigen Tumoren sowie verschiedenen bösartigen Tumoren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Sarkome (z. B. Rhabdomyosarkom, Osteosarkom) und Karzinome (z. B. der Brust, Lunge, Haut, Schilddrüse) ausgewählt werden. Die Erfindung ist nicht auf die Diagnose und Behandlung sogenannter gutartiger und bösartiger solider Tumoren beschränkt, sondern ihre Prinzipien haben sich als ebenfalls als auf hämatologische Bösartigkeiten wie Leukämien und Lymphome anwendbar herausgestellt.
Neue Veröffentlichungen deuten darauf hin, dass arteriosklerotische Plaques ebenfalls abnormale Proliferation [26] hauptsächlich glatter Muskelzellen mit sich bringen, und es wurde postuliert, dass arteriosklerotische Plaques gutartige Tumoren darstellen [27]. Daher muss diese Art von Störung ebenfalls als eine mögliche Indikation für die Verwendung der MAG-Genfamilie verstanden werden, insbesondere in diagnostischen und therapeutischen Anwendungen.
Neben den oben beschriebenen therapeutischen und diagnostischen Verfahren können die Prinzipien der Erfindung ebenfalls zur Herstellung eines nichtmenschlichen transgenen Tiermodells zum Testen von Pharmazeutika zur Behandlung von MAG-Gen-bezogenen bösartigen oder gutartigen Tumoren und arteriosklerotischen Plaques verwendet werden. Eines der Beispiele beschreibt die Herstellung solch eines Tiermodells.
Es sollte klar sein, dass die Prinzipien der vorliegenden Erfindung hier lediglich zur Erläuterung nur mit Bezug auf das LPP-Gen auf Chromosom 3 beschrieben werden. Basierend auf den in dieser Anmeldung bereitgestellten Informationen wird ein Fachmann in der Lage sein, entsprechende Gene der Genfamilie zu isolieren und sequenzieren und die Prinzipien dieser Erfindung durch Verwendung des Gens und seiner Sequenz ohne Abweichen vom Schutzumfang des allgemeinen Konzepts dieser Erfindung anzuwenden.
Die vorliegende Erfindung wird daher durch die folgenden Beispiele, die in keiner Weise den Schutzumfang beschränken sollen, weiter erklärt.
BEISPIELE
Beispiel 1
1. Einführung
Dieses Beispiel beschreibt die Isolierung und Analyse 75 überlappender YAC-Klone und die Erstellung eines YAC-Kontigs (Satz überlappender Klone), das einen Bereich von ungefähr 6 Mb an genomischer DNA um den Ort D12S8 überspannt und MAR einschließt. Die Orientierung des YAC Kontigs auf dem langen Arm des Chromosoms 12 wurde durch Doppelfarb-FISH-Analyse bestimmt. Auf der Basis von STS-Gehaltkartierung und Restriktionsenzymanalyse wurde eine weitreichende physikalische Karte dieses 6 Mb DNA-Bereichs erstellt. Das Kontig stellt eine nützliche Quelle zum cDNA-Fang dar, der auf das Identifizieren von Genen, die in 12q15 angeordnet sind, gerichtet ist, einschließlich des einen, das direkt durch die unterschiedlichen Chromosom 12-Aberrationen betroffen ist.
2. Materialien und Verfahren
2.1. Zelllinien
Die Zelllinien PK89-12 und LIS-3/SV40/A9-B4 wurden zur Chromosomenzuordnung unter Verwendung somatischer Zellhybrid (CASH)-Experimente verwendet. PK89-12, das Chromosom 12 als einziges menschliches Chromosom in einem genetischen Hamsterhintergrund enthält, ist zuvor beschrieben worden [29].PK89-12 Zellen wurden in einem DME-F12-Medium kultiviert, das mit 10 % fetalem Rinderserum, 200 IU/ml Penicillin und 200 μg/ml Streptomycin ergänzt wurde. Der somatische Zellhybrid LIS-3/SV40/A9-B4 wurde bei Fusion der myxoiden Liposarkom-Zelllinie LIS-3/SV40, die ein t(12;16) (q13;p11.2) trägt, und Maus A9-Zellen erhalten, und es wurde bereits vorher gezeigt, dass sie der (16), aber weder der (12) noch das normale Chromosom 12 enthält [30]. LIS-3/SV40/A9-B4 Zellen wurden in einem selektiven AOA-Medium kultiviert (AOA-Medium, das aus DME-F12-Medium bestand, das mit 10 % fetalem Rinderserum, 0,05 mM Adenin, 0,05 mM Oubain und 0,01 mM Azaserin ergänzt wurde). Beide Zelllinien wurden häufig durch zytogenetische Standardtechniken getestet.
2.2. Nukleotidsequenzanalyse und Oligonucleotide
Nukleotidsequenzen wurden gemäß dem Dideoxykettenabbruchverfahren unter Verwendung eines T7-Polymerase-Sequenzierungskits (Pharmacia/LKB) oder eines dsDNA-Zyklus-Sequenzierungssystems (GIBO/BRL) bestimmt. DNA-Fragmente wurden in pGEM-3Zf(+) subkloniert und unter Verwendung eines FITC-markierten Standard SP6- oder T7-Starters oder spezifischer Starter, die basierend auf neu erhaltenen Sequenzen synthetisiert wurden, sequenziert. Die Sequenzierungsergebnisse wurden unter Verwendung eines automatisierten laserfluoreszierenden (A.L.F.) DNA-Sequenzierers (Pharmacia Biotech) und Standard 30 cm, 6 % Hydrolink^R, Long Range^TM Gelen (AT Biochem) erhalten. Die Nukleotidsequenzen wurden unter Verwendung der Sequenzanalyse-Software Genepro (Riverside Scientific), PC/Gene (IntelliGenetics), des IntelliGenetics Suite Soft warepakets (IntelliGenetics, Inc.) und Oligo analysiert [31]. Alle Oligonukleotide wurden von Pharmacia Biotech erworben.
2.3. Chromosomherstellung und Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)
Eine FISH-Analyse der YAC-Klone wurde durchgeführt, um deren chromosomale Positionen zu bestimmen und chimäre Klone zu identifizieren. Eine FISH-Analyse von Cosmid-Klonen, die den STSs der YAC-Insertenden entsprechen, wurde durchgeführt, um deren chromosomale Positionen festzustellen. Die Cosmide wurden aus der Humangenom-Bibliothek CMLW-25383 [32] oder der geordneten Chromosom 12-spezifischen Bibliothek, die am Lawrence Livermore National Laboratory hergestellt wurde (LL12NC01, Lit. 33), gemäß Standardverfahren isoliert [34]. Eine Routine-FISH-Analyse wurde im Wesentlichen wie zuvor beschrieben durchgeführt [30, 35]. DNA wurde mit Biotin-11-dUTP (Boehringer) unter Verwendung des Protokolls von Kievits et al. markiert [36]. Antifade-Medium, bestehend aus DABCO (2 g/100 ml, Sigma), 0,1 M Tris-HCl pH 8, 0,02% Thimerosal und Glyzerin (90 %), und das Propidiumiodid (0,5 μg/ml, Sigma) als Gegenfärbung enthielt, wurde 15 Minuten bevor die Proben auf einem Zeiss Axiophot Fluoreszenz-Mikroskop unter Verwendung eines doppelten Bandpassfilters für FITC/Texasrot (Omega Optical, Inc.) analysiert wurden, zugegeben. Die Ergebnisse wurden auf Scotch (3M) 640 ASA Film aufgenommen.
Für die Doppelfarb-FISH-Experimente wurde LLNL12NC01-96C11 mit Digoxygenin-11-dUTP (Boehringer) markiert und die Cosmide LLNL12NC01-1F6 und -193F10 mit Biotin-11-dUTP. Gleiche Mengen jeder Sonde wurden kombiniert, und diese Mischung wurde zur Hybridisierung verwendet. Nach der Hybridisierung wurden die Objektträger für 20 Minuten mit Avidin-FITC inkubiert und dann gewaschen, wie von Kievits et al. beschrieben [36]. Die nachfolgende Reihe von Inkubierungen in TNB-Puffer (0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,5 % Boehringer Blocker (Boehringer)) und Waschschritte wurden in TNT-Puffer (0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,05 % Tween-20) durchgeführt; alle Inkubationen wurden bei 37 °C für 30 Minuten durchgeführt. Während der zweiten Inkubation wurden Ziegen-α-Avidin-biotin (Vector) und Maus-α-Digoxygenin (Sigma) gleichzeitig verwendet. Während der dritten Inkubation wurden Avidin-FITC und Kaninchen-α-Maus-TRITC (Sigma) angewendet. Während der letzten Inkubation wurde Ziegen-α-Kaninchen-TRITC (Sigma) angewendet. Nach einem letzten Waschen in TNT-Puffer wurden die Proben zweimal in 1 × PBS gewaschen und dann durch eine Ethanol-Reihe (70 %, 90 %, 100 %) getrocknet. Antifade-Medium, das 75 ng/μl DAPI (Serva) als Gegenfärbung enthielt, wurde verwendet. Die Proben wurden auf einem Zeiss Axiophot Fluoreszenzmikroskop wie oben beschrieben analysiert.
2.4. Screening von YAC-Bibliotheken
YAC-Klone wurden aus CEPH-Humangenom-YAC-Bibliotheken Mark 1 und 3 [37, 38] isoliert, die uns durch das Centre d'Étude du Polyphormisme Humain (CEPH) zugänglich gemacht wurden. Das Screening wurde durchgeführt, wie zuvor beschrieben [39]. Kontaminierende Candida parapsylosis, denen manchmal begegnet wurde, wurden durch Zugabe von Terbinafin (freundlicherweise bereitgestellt von Dr. Dieter Römer, Sandoz Pharma LTD, Basel, Schweiz) zu dem Wachstumsmedium (Endkonzentration: 25 μg/ml) beseitigt. Die isolierten YAC-Klone wurden durch STS-Gehaltkartierung, contour-clamped homogeneous electric field (CHEF) Gel-Elektrophorese [40], Restriktionskartierung und Hybridisierungs- und FISH-Analyse charakterisiert.
2.5. PCR-Reaktionen
PCR-Amplifikation wurde durch Verwendung einer Pharmacia/LKB Gen-ATAQ-Steuerung (Pharmacia/LKB) in Endvolumen von 100 μl, die 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,01 % Gelatine, 2 mM dNTPs, 20 pM jedes Amplimers, 2,5 Einheiten Amplitaq (Perkin-Elmer Cetus) und 100 ng (für Superpools) oder 20 ng (für Pools) DNA enthielten, durchgeführt. Nach anfänglicher Denaturierung für 5 Minuten bei 94 °C wurden 35 Amplifikationszyklen durchgeführt, die jeder aus Denaturierung für 1 Minute bei 94 °C, Annealing für 1 Minute bei der geeigneten Temperatur (siehe Tabelle I) und Verlängerung für 1 Minute bei 72 °C bestanden. Die PCR-Reaktion wurde durch eine abschließende Ver längerung bei 72 °C für 5 Minuten abgeschlossen. Die Ergebnisse wurden durch Analyse von 10 μl des Reaktionsprodukts auf Polyacrylamid-Minigelen beurteilt.
2.6. Gepulste Feldgelelektrophorese und Southern-Blot-Analyse
Gepulste Feldgelelektrophorese und Southern-Blot-Analyse wurden genau wie von Schoenmakers et al. beschrieben durchgeführt [39]. Agaroseblöckchen, die hochmolekulare YAC-DNA (ungefähr 1 × 10⁸ Hefezellen äquivalent) enthielten, wurden zweifach in ungefähr 25 ml TE-Puffer (pH 8,0) für 30 Minuten bei 50 °C äquilibriert, gefolgt von zwei ähnlichen Äquilibrierungsdurchgängen bei Raumtemperatur. Die Blöckchen wurden anschließend in 2 ml Rundboden-Eppendorf-Röhrchen überführt und zweimal für 30 Minuten in 500 μl des geeigneten 1 × Restriktionspuffers bei der geeigneten Restriktionstemperatur äquilibriert. Danach wurde die DNA in den Blöckchen gemäß den Lieferantenanweisungen (Boehringer) für 4 Stunden unter Verwendung von 30 Einheiten Restriktions-Endonuklease pro Verdauungsreaktion verdaut. Nach der Verdauung wurden die Blöckchen gemeinsam mit geeigneten Molekulargewichtmarkierungssubstanzen auf ein 1 % Agarose/0,25 × TBE-Gel geladen, mit LMP-Agarose versiegelt und auf einer CHEF-Vorrichtung (Biorad) für 18 Stunden bei 6,0 V/cm unter Verwendung eines Pulswinkels von 120 Grad und konstanten Pulszeiten, die von 10 Sekunden (Trennung bis 300 kbp) bis 20 Sekunden (Trennung bis zu 500 kbp) variierten, fraktioniert. Im Falle großer Restriktionsfragmente wurden zusätzliche Läufe durchgeführt, die auf die Trennung von Fragmenten mit Größen oberhalb 500 kbp gerichtet waren. Elektrophorese wurde bei 14 °C in 0,25 × TBE durchgeführt. Als Molekulargewicht-Markierungssubstanzen wurden Lambda Ladders (Promega) und selbstgemachte Blöckchen, die Lambda-DNA, geschnitten mit Restriktions-Endonuklease HindIII, enthielten, verwendet. Nach der Elektrophorese wurden die Gele mit Ethidiumbromid angefärbt, fotografiert und unter Verwendung eines Stratalinker (Stratagene), auf 120 mJ eingestellt, UV-bestrahlt. Die DNA wurde anschließend auf Hybond N⁺ Membranen (Amersham) für 4 bis 16 Stunden unter Verwendung von 0,4 N NaOH als Transferpuffer geblottet. Nach dem Blotten wurden die Membranen für 15 Minuten bei 80 °C getrocknet, kurz in 2 × SSPE neutralisiert und für mindestens 3 Stunden bei 42 °C in 50 ml einer Lösung aus 50 % Formamid, 5 × SSPE, 5 × Denhardts, 0,1 % SDS und 200 μg/ml Heparin vorhybridisiert. Die Filter wurden anschließend für 16 Stunden bei 42 °C in 10 ml einer Lösung aus 50 % Formamid, 5 × SSPE, 1 × Denhardts, 0,1 % SDS, 100 μg/ml Heparin, 0,5 % Dextransulfat und 2 – 3 × 10⁶ cpm/ml markierter Sonde hybridisiert. Danach wurden die Membranen zunächst zweimal für 5 Minuten in 2 × SSPE/0,1 % SDS bei Raumtemperatur, dann für 30 Minuten in 2 × SSPE/0,1 % SDS bei 42 °C und abschließend in 0,1 × SSPE l 0,1 % SDS für 20 Minuten bei 65 °C gewaschen. Kodak XAR-S-Filme wurde bei 80 °C für 3 bis 16 Stunden, abhängig von der Sondenleistung, belichtet. Verstärkungsschirme (Kyokko Special 500) wurden verwendet.
2.7. Erzeugung von STSs aus YAC-Insert-Enden
STSs aus YAC-Insert-Enden wurden unter Verwendung eines Vectorette-PCR-Verfahrens in Kombination mit direkter DNA-Sequenzierungsanalyse, im Wesentlichen wie von Geurts et al. [41] beschrieben, erhalten. Startersets wurden entwickelt und auf Humangenom-DNA getestet, im Wesentlichen entsprechend den oben beschriebenen Verfahren. STSs werden aus Gründen der Einfachheit in dieser Anmeldung durch ihre abgekürzten Namen (z. B.: RM1 anstelle von STS 12-RM1) bezeichnet.
3. Ergebnisse
3.1. Aufbau eines YAC-Kontigs um den Ort D12S8 herum
In vorherigen Untersuchungen [39] wurde ein 800 kb YAC-Kontig um D 1258 herum beschrieben. Dieses Kontig bestand aus den folgenden drei, teilweise überlappenden, nicht-chimären CEPH YAC-Klonen: 258F11, 320F6 und 234G11. Diese Kontig wurde als Ausgangspunkt für ein Chromosomenwanderungsprojekt verwendet, um den DNA-Bereich auf dem langen Arm von Chromosom 12 zu definieren, der die Bruchpunkte einer Vielzahl gutartiger solider Tumoren umgibt, die alle proximal zu D12S8 und distal zu CHOP angeordnet sind. Anfänglich wurde die Chromosomenwanderung bidirektional durchgeführt, bis die Größe des Kontigs eine zuverlässige Bestimmung seiner Orientierung erlaubte. In den bidirektionalen und den anschließenden unidirektionalen Chromosomenwanderungs schritten wurde das folgende allgemeine Verfahren verwendet. Zunächst führte die Rettung und Sequenzierung der Enden der YAC-Klone zu DNA-Markierungssubstanzen, welche die linken und rechten Seiten von diesen charakterisierten (Tabelle I). Basierend auf den Sequenzdaten der Enden von 40 YAC-Inserts, wurden Startersets zur spezifischen Amplifizierung der DNA entwickelt; dadurch wurden STSs ermittelt (Tabelle II). Deren Lokalisierung auf 12q13-qter wurde durch CASH sowie FISH bestimmt, nachdem entsprechende Cosmid-Klone isoliert wurden. Es sollte angemerkt werden, dass isolierte YAC-Klone häufig ebenfalls durch FISH-Analyse beurteilt wurden, so dass nicht nur der chromosomale Ursprung ihrer Inserts aufgedeckt wurde, sondern ebenfalls in einer Anzahl von Fälle ihre chimäre Natur festgestellt und definiert wurde. Darüber hinaus sollte betont werden, dass Daten, die durch Restriktions-Endonukleaseanalyse überlappender YAC-Klone erhalten wurden, ebenfalls bei der YAC-Klonbewertung und dem anschließenden Alignment berücksichtigt wurden. Mit den sequenziell ausgewählten und bewerteten Startersets wurde das Screening der YAC- und Cosmid-Bibliotheken durchgeführt, um die Bausteine für den Kontig-Aufbau zu isolieren. Daher wurde der Kontig-Aufbau unter Verwendung von Daten durchgeführt, die aus FISH- und STS-Gehaltkartierung sowie Restriktions-Endonukleaseanalyse stammten. Unter Verwendung dieser Vorgehensweise haben wir ein YAC-Kontig erstellt, das aus 75 überlappenden YAC-Klonen bestand, die ungefähr 6 Mb der DNA abdeckten (1). Dieses Kontig schien die Chromosom 12-Bruchpunkte aller untersuchter Tumor-abgeleiteter Zelllinien zu umgeben [39]. Die Eigenschaften der YACs, die zum Aufbau dieses Kontigs verwendet wurden, sind in Tabelle I angegeben.
3.2. Ermittlung der chromosomalen Orientierung des YAC-Kontigs
Um eine unidirektionale Chromosomenwanderung in Richtung des Zentromers des Chromosoms 12 zu ermöglichen, wurde die Orientierung des DNA-Bereichs, der durch die STSs RM14 und RM26 flankiert ist (ungefähre Größe: 1450 kb), durch Doppelfarb-Interphasen-FISH-Analyse bestimmt. Cosmid-Klone, welche diesen STSs entsprachen (d. h. LL12NC01-1F6 (RM14) und LL12NC01-96C11 (RM26)), wurden markiert, so dass sie jeweils grüne oder rote Signale zeigten. Als Referenzort wurde das Cosmid LL12NC01-193F10 markiert, so dass es bei der Detektion grüne Signale zeigte.
LL12NC01-193F10 war zuvor distal zu dem Bruchpunkt von LIS-3/SV40 (d. h. CHOP) und proximal zu den Chromosom 12q-Bruchpunkten in der Lipom-Zelllinie Li-14/SV40 und der uterinen Leiomyom-Zelllinie LM-30.1/SV40 kartiert worden. LL12NC01-1F6 und LL12NC01-96C11 stellten sich als distal zu den 12q-Bruchpunkten in der Lipom-Zelllinie Li-14/SV40 und der uterinen Leiomyom-Zelllinie LM-30.1/SV40 kartierend heraus. Daraus wurde geschlossen, dass LL12NC01-193F10 proximal sowohl zu RM14 als auch RM26 kartiert (nichtveröffentlichte Ergebnisse). Von 150 gezählten informativen Interphasen zeigten 18 % eine Signalreihenfolge von rot-grün-grün, während 72 % eine Signalreihenfolge von grün-rot-grün zeigten. Gestützt auf diese Beobachtungen schlossen wir, dass RM26 proximal zu RM14 kartiert, und daher behielten wir nur das Verlängern des YAC-Kontigs von der RM26 (d. h. proximalen) Seite unseres Kontigs bei. Nur die Cosmide, die RM14 und RM26 enthielten, wurden durch Doppelfarben-Interphasenkartierung geordnet; die Reihenfolge aller anderen wurde aus Daten des YAC-Kontigs abgeleitet. Schließlich sollte zur Kenntnis genommen werden, dass die chromosomale Orientierung des Kontigs, wie sie auf Basis der Ergebnisse der Doppelfarben-Interphasen-FISH-Studien vorgeschlagen wurde, unabhängig bestätigt wurde, nachdem das YAC-Kontig über die Chromosom 12-Bruchpunkte, wie sie in einer Vielzahl von Tumor-Zelllinien vorhanden sind, hinaus verlängert worden war. Diese bestätigende Information wurde in ausgedehnten FISH-Untersuchungen erhalten, in denen die Positionen von 'YAC und Cosmid-Klonen relativ zu den Chromosom 12q13-q15-Bruchpunkten primärer Lipome, Uterinleiomyome, pleomorpher Speicheldrüsenadenome und pulmonärer Chondroid-Hamratome oder abgeleiteter Zelllinien bestimmt wurden [24, 42, 25, 43].
3.3. Herstellung einer physikalischen Rare-Cutter-Karte aus dem 6 Mb YAC-Kontig um D12S8 herum
Southern-Blots von Gesamthefe-plus YAC-DNA, bis zum Abschluss mit Rare-Cutter-Enzymen (siehe Materialien und Verfahren) verdaut und auf CHEF-Gelen getrennt, wurden nacheinander hybridisiert mit i) der STS, die für das anfängliche Screening des fraglichen YAC verwendet wurde, ii) pYAC4 rechter Arm Sequenzen, iii) pYAC4 linker Arm Sequenzen und iv) einer menschlichen ALU-Wiederholungs-Sonde (BLUR-8). Die auf diese Weise erhaltene weitrechende Restriktionskarte wurde durch Sondierung mit PCR-isolierten STSs/YAC-Endsonden vervollständigt. Gelegentlich wurden Doppelverdauungen durchgeführt.
Die Restriktionskarten einzelner YAC-Klone wurden abgeglichen, und eine Konsens-Restriktionskarte wurde erstellt. Es ist wichtig anzumerken, dass die gesamte Konsens-Rare-Cutter-Karte durch mindestens zwei unabhängige Klone, die eine volle interne Konsistenz zeigten, gestützt wurde.
3.4. Physikalische Kartierung von CA-Wiederholungen und monomorphen STSs/ESTs
Gestützt auf integrierte Kartierungsdaten, die aus dem Zweiten Internationalen Workshop zum menschlichen Chromosom 12 [44] hervorgingen, wurde erwartet, dass eine Anzahl veröffentlichter Markierungssubstanzen innerhalb des hier dargestellten YAC-Kontigs kartiert. Um eine vollständige Integration unserer Kartierungsdaten mit jenen, die durch andere erhalten wurden, zu ermöglichen, wurde eine Anzahl von Markierungssubstanzen auf unserem Kontig STS-Gehalt-kartiert, und diejenigen, die positiv gefunden wurden, wurden anschießend durch (Starter-)Hybridisierung auf YAC-Southern-Blots sublokalisiert. Unter den Markierungssubstanzen, von denen sich herausgestellt hat, dass sie auf dem hier dargestellten Kontig liegen, befanden sich CA-Wiederholungen, D12S313 (AFM207xf2) und D12S335 (AFM273vg9) [45], D12S375 (CHLC GATA3F02) und D12S56 [46]. Weiterhin wurden das Interferon Gamma-Gen (IFNG) [47], das rasverwandte Protein-Gen Rap1B [48] und das exprimierte Sequenz-Tag EST01096 [49] unter Verwendung von Startersets, die basierend auf öffentlich zugänglichen Sequenzdaten entwickelt wurden, kartiert (siehe Tabelle II). Markierungssubstanzen, die getestet wurden und sich als negativ herausgestellt haben, schlossen D12S80 (AFM102xd6), D12S92 (AFM203va7), D12S329 (AFM249xh9) und D12S344 (AFM296xd9) ein.
4. Diskussion
In dem vorliegenden Beispiel wurde die Erstellung eines YAC-Kontigs und einer physikalischen Rare-Cutter-Karte erläutert, die ungefähr 6 Mb auf 12q15 abdeckt, einem Bereich auf dem langen Arm des menschlichen Chromosoms 12, der MAR enthält, in welchem eine Anzahl von rezidivierenden chromosomalen Aberrationen gutartiger solider Tumoren bekannterweise kartieren.
Das Ausmaß an Überlappung zwischen einzelnen YACs ist sorgfältig bestimmt worden, was die Gesamtlänge des Kontigs bei ungefähr 6 Mb anordnet (1). Es sollte angemerkt werden, dass unsere Größenbestimmungsdaten für einige des YAC-Klone leicht von den Größen abweichen, die durch CEPH bestimmt wurden [50]. Wir glauben, dass dies am wahrscheinlichsten an Unterschieden in den Parametern zum Laufenlassen der gepulsten Feldgele in den unterschiedlichen Laboratorien liegt.
Unter Verwendung der Restriktionskartierung und der STS-Gehalt-Analyse wurde eine weitreichende physikalische Konsenskarte (1) erstellt. Die gesamte zusammengesetzte Karte wird durch mindestens zweifache Abdeckung unterstützt. Insgesamt wurden über 30 Mb an YAC-DNA durch Restriktions- und STS-Gehalt-Analyse charakterisiert, was einer durchschnittlichen Kontig-Abdeckung von ungefähr 5 Mal entspricht. Obwohl die "angeborene" beschränkte Auflösung, die mit der Technik der gepulsten Feldelektrophorese verbunden ist, keine sehr präzisen Größenabschätzungen erlaubt, zeigte ein Vergleich mit Restriktionskartierungsdaten, die von einem 500 kb Cosmid-Kontig erhalten wurden, das innerhalb des YAC-Kontigs enthalten ist, das hier gezeigt wird, eine bemerkenswert gute Korrelation. Nach Extrapolation von den Cosmid-Daten schätzen wir die Genauigkeit der hier vorgestellten physikalischen Rare-Cutter-Karte auf ungefähr 10 kb.
Die Ergebnisse unserer physikalischen Kartierungsuntersuchungen erlaubten die Integration dreier Gen-spezifischer sowie fünf anonymer Markierungssubstanzen, die durch andere isoliert wurden (in 1 zwischen den Pfeilen gezeigt). Die anonymen Markierungssubstanzen umfassen eine monomorphe und vier polymorphe Markierungssubstanzen. Fünf vorher veröffentlichte YAC-Ende-abgeleitete Einzelkopie-STSs (RM1, RM4, RM5, RM7 und RM21) sowie vier veröffentlichte CA-Wiederholungen (D12S56, D12S313, D12S335 und D12S375) und drei veröffentlichte Gen-assoziierte STSs/ESTs (RAP1B, EST01096 und IFNG) sind auf derselben physikalischen Karte angeordnet worden, und dies wird die (Verbindungs-) Kartierung und Identifikation einer Anzahl von Merkmals-/Krankheitsgenen erleichtern, die in derselben Region kartieren. Außerdem konnten wir 72 YAC-Ende-abgeleitete (Tabelle I) und acht Cosmid-Ende- oder inter-ALU-abgeleitete DNA-Markierungssubstanzen (CH9, RM1, RM110, RM111, RM130, RM131, RM132 und RM133), die während des Verfahrens der Chromosomenwanderung entwickelt wurden, auf derselben physikalischen Karte anordnen. Der automatische Mailserver PYTHIA bei [email protected] wurde verwendet, um die abgeleiteten Sequenzen dieser DNA-Markierungssubstanzen nach der Gegenwart von Wiederholungen zu screenen. Für 43 dieser 72 DNA-Markierungssubstanzen (wie in Tabelle II aufgelistet) wurden Startersets entwickelt, und die entsprechenden STSs wurden durch PCR sowie Southern-Blot-Analyse menschlicher genomischer DNA als einzelne Kopie bestimmt. Die 29 verbleibenden DNA-Markierungssubstanzen (in den gelben Kästen abgebildet) stellen YAC-Ende-abgeleitete Sequenzen dar, für welche wir keine Startersets entwickelt haben. Diese YAC-Ende-Sequenzen kartieren auf Basis von Restriktionskartierung vermutlich auf Chromosom 12. Das abschließende Bild enthüllt eine Gesamtmarkierungssubstanzdichte in diesem Bereich von ungefähr eins innerhalb aller 70 kb.
Die Analyse des hier vorgestellten Kontigs enthüllte viele CpG-reiche Bereiche, möglicherweise HTF-Inseln, die dafür bekannt sind, dass sie häufig mit Haushaltsgenen verbunden sind. Diese CpG-Insels sind am wahrscheinlichsten an den 5'-Enden von bisher nicht identifizierten Genen angeordnet: Es ist gezeigt worden, dass in 90 % der Fälle, in denen drei oder mehr Rare-Cutter-Restriktionsstellen in YAC-DNA zusammenfallen, ein zugehöriges Gen vorhanden ist [51]. Dies ist wahrscheinlich eine Unterschätzung der Anzahl der Gene, die noch in diesem Bereich identifiziert werden müssen, da 60 % der gewebespezifischen Gene nicht mit CpG-Inseln verbunden sind [52] und da es außerdem möglich ist, dass zwei Gene in unterschiedlichen Orientierungen von einer einzelnen Insel transkribiert werden [53].
Während sich herausgestellt hat, dass einige der YAC-Klone, die aus der CEPH YAC-Bibliothek Mark 1 isoliert wurden, chimär sind, konnten in jedem Screening überlappende YAC-Klone erhalten werden, die basierend auf FISH, Restriktionskartierung und STS-Gehaltanalyse nicht chimär erschienen, was in Übereinstimmung mit der berichteten Komplexität der Bibliothek ist. Der Grad des Chimärismus für die CEPH-YAC-Bibliothek Mark 1 wurde für den Bereich, der sich hier in der Untersuchung befindet, zu 18 % (12 aus 68) bestimmt. Die kleine Zahl an YACs von der CEPH-YAC-Bibliothek Mark 3 (nur 7 MEGA YACs wurden in diese Studie eingeschlossen) erlaubte keine zuverlässige Abschätzung des Prozentsatzes an chimären Klonen, die in dieser Bibliothek vorhanden sind. Die Durchschnittsgröße der YACs, die von der Mark 1 Bibliothek abgeleitet wurden, berechnete sich zu 381 kb; nicht chimäre YACs (n = 58) wiesen eine Durchschnittsgröße von 366 kb auf, während sich herausstellte, dass chimäre YACs (n = 12) eine beträchtlich größere Durchschnittsgröße hatten; d. h. 454 kb.
Als Zusammenfassung präsentieren wir ein 6 Mb YAC-Kontig, das einem menschlichen chromosomalen Bereich entspricht, der bei einer Vielzahl gutartiger solider Tumoren häufig umgeordnet wird. Das Kontig verbindet über 84 Orte, einschließlich dreier Genassoziierter STSs. Darüber hinaus haben wir durch Restriktionskartierung mindestens 12 CpG-Inseln identifiziert, die auf dort vorhandene Gene hinweisen können. Schließlich sind vier CA-Wiederholungen innerhalb des Kontigs sublokalisiert worden. Die Integration der genetischen, physikalischen und transkriptionalen Karten des Bereichs stellen ein Grundgerüst für weitere Untersuchungen dieses Bereichs des Chromosoms 12 bereit. Anfängliche Untersuchungen werden sich wahrscheinlich auf MAR und ULCR12 konzentrieren, da diese Bereiche die Bruchpunkt-Häufungsbereiche mindestens dreier unterschiedlicher Arten solider Tumoren enthalten. Die unterschiedlichen YAC-Klone, die wir hier beschreiben, sind wertvolle Mittel für solche Untersuchungen. Sie sollten die Suche nach Genen, die in diesem Bereich liegen, und die Identifizierung jener, die direkt durch Chromosom 12q-Aberrationen der verschiedenen gutartigen soliden Tumoren betroffen sind, erleichtern.
Beispiel 2
1. Einleitung
Es wurde festgestellt, dass der 1,7 Mb Multiaberrationsbereich (MAR) auf dem menschlichen Chromosom 12q15 wiederkehrende Chromosom 12-Bruchpunkte beherbergt, die häufig in unterschiedlichen gutartigen soliden Tumorarten gefunden werden. In diesem Beispiel wird die Identifizierung eines HMG-Gens innerhalb MAR beschrieben, die von pathogenetischer Relevanz zu sein scheint. Unter Verwendung einer positionellen Kloning-Vorgehensweise wurde das Hochmobilitätsgruppenprotein-Gen HMGI-C innerhalb eines 175 kb Segments von MAR identifiziert und seine genomische Organisation charakterisiert. Durch FISH wurde innerhalb dieses Gens die Mehrheit der Bruchpunkte sieben unterschiedlicher gutartiger solider Tumorarten genau lokalisiert. Durch Southern Blot und 3'-RACE-Analyse wurden konsistente Umordnungen in HMGI-C und/oder die Expression veränderter HMGI-C-Transkripte gezeigt. Diese Ergebnisse deuten auf eine Verbindung zwischen einem Mitglied der HMG-Genfamilie und der Entwicklung gutartiger solider Tumoren hin.
2. Materialien und Verfahren
2.1. Zellkultur und primäre Tumorproben
Die in 3 aufgelisteten Tumorzelllinien wurden durch ein Transfektionsverfahren erstellt [54] und sind zuvor in [39, 24] und in einem Artikel von Van de Ven et al., Genes Chromosom. Cancer 12, 296-303 (1995), der in dieser Anmeldung als Anhang 1 enthalten ist, beschrieben worden. Die Zellen wurden in TC199-Medium kultiviert, das mit 20 % fetalem Rinderserum ergänzt wurde, und wurden durch zytogenetische Standardtechniken in regelmäßigen Abständen getestet. Die humanen hepatozellulären Karzinomzelllinien Hep 3B und Hep G2 wurden von der ATCC (Zugangsnummern ATCC HB 8064 und ATCC HB 8065) erhalten und in DMEM/F12, ergänzt mit 4 % Ultroser (Gibco/BRL) kultiviert. Primäre solide Tumoren wurden von unterschiedlichen Universitätskliniken erhalten.
2.2. YAC- und Cosmid-Klone
YAC-Klone wurden aus den CEPH Mark 1 [57] und Mark 3 [58] YAC-Bibliotheken unter Verwendung einer Kombination von PCR-basierendem Screening (59) und Kolonie-Hybridisierungs-Analyse isoliert. Cosmid-Klone wurden aus einer humanen Chromosom 12-spezifischen Cosmid-Bibliothek (LL12NC01) [60] isoliert, die vom Lawrence Livermore National Laboratory (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von P. de Jong) erhalten wurde. LL12NC01-abgeleitete Cosmid-Klone werden durch ihre Mikrotiterplattenadressen angegeben; d. h. zum Beispie127E12.
Cosmid-DNA wurde unter Verwendung von Standardtechniken extrahiert, welche die Reinigung über Qiagentips (Diagen) beinhalten. Agarose-Blöckchen, die Hefe- und YAC-DNA von hohem Molekulargewicht enthalten (1 × 10⁹ Zellen ml^–1 äquivalent) wurden wie zuvor beschrieben hergestellt [61]. Die Blöckchen wurden sorgfältig gegen vier Wechsel von 25 ml T₁₀E₁ (pH 8,0), gefolgt von zwei Wechseln 0,5 ml 1 × Restriktionspuffer dialysiert, bevor sie entweder einer gepulsten Feldrestriktionsenzymkartierung oder eine YAC-Ende-Rettung unterworfen wurden. YAC-Ende-Rettung wurde unter Verwendung eines Vectorette-PCR-Verfahrens in Kombination mit direkter Festphasen-DNA-Sequenzierung durchgeführt, wie zuvor in Literaturstelle 61 beschrieben. Inter-Alu-PCR-Produkte wurden unter Verwendung veröffentlichter Oligonukleotide TC65 oder 517 [62] isoliert, denen SalI-Enden zugegeben wurden, um das Klonieren zu erleichtern. Nach der Sequenzanalyse wurden Starterpaare unter Verwendung des OLIGO-Computeralgorithmus entwickelt [61].
2.3. DNA-Markierung
DNA aus YACs, Cosmiden, PCR-Produkten und Oligonukleotiden wurde unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken markiert. Für FISH wurden Klone oder Inter-Alu-PCR-Produkte von YACs mit Biotin-11-dUTP (Boehringer) durch Bruchstellentranslation biotinyliert. Für Filterhybridisierungen wurden Sonden mit α-3²P-dCTP unter Verwendung von Zufallshexameren radiomarkiert [62]. Im Falle von PCR-Produkten mit einer Größe kleiner als 200 bp wurde ein ähnliches Protokoll verwendet, es wurden jedoch spezifische Oligonukleotide verwendet, um Markierungsreaktionen zu starten. Oligonukleotide wurden unter Verwendung von γ-³²P-ATP markiert.
2.4. Nukleotidsequenz-Analyse und PCR-Amplifikation
Nukleotidsequenzen wurden wie im Beispiel 1 beschrieben bestimmt. Sequenzierungsergebnisse wurden unter Verwendung eines A.L.F. DNA-Sequencers^TM (Pharmacia Biotech) auf Standard 30 cm, 6 % Hydrolink^R Long Range^TM-Gelen (AT Biochem) analysiert. PCR-Amplifikationen wurden im Wesentlichen wie zuvor beschrieben durchgeführt [39].
2.5. Schnelle Amplifikation von cDNA-Enden (RACE)
Die schnelle Amplifikation von 3' cDNA-Enden (3'-RACE) wurde unter Verwendung einer leichten Veränderung eines Teils des GIBO/BRL 3'-ET-Protokolls durchgeführt. Zur Erststrang-cDNA-Synthese wurde ein Adapterstarter (AP2) AAG GAT CCG TCG ACA TC(T)₁₇ verwendet. Für sowohl die ersten als auch zweiten Durchgänge der PCR wurde der universelle Amplifikationsstarter (UAP2) CUA CUA CUA CUA AAG GAT CCG TCG ACA TC als "umgekehrter Starter" verwendet. In dem ersten PCR-Durchgang wurden die folgenden spezifischen "Vorwärtsstarter" verwendet: i) 5'-CTT CAG CCC AGG GAC AAC-3' (Exon 1), ii) 5'-CAA GAG GCA GAC CTA GGA-3' (Exon 3) oder iii) 5'-AAC AAT GCA ACT TTT AAT TAC TG-3' (3'-UTR). In dem zweiten PCR-Durchgang wurden die folgenden spezifischen Vorwärtsstarter (ineinander geschachtelte Starter verglichen mit jenen, die in dem ersten Durchgang verwendet wurden) verwendet: i) 5'-CAU CAU CAU CAU CGC CTC AGA AGA GAG GAC-3' (Exon 1), ii) 5'-CAU CAU CAU CAU GTT CAG AAG AAG CCT GCT-3' (Exon 4) oder iii) 5'-CAU CAU CAU CAU TTG ATC TGA TAA GCA AGA GTG GG-3' (3'-UTR). Das Anhängen von CUA/CAU-Enden an die verschachtelten spezifischen Starter erlaubte die Verwendung des direktionalen CloneAmp Kloningsystems (GIBCO/BRL).
3. Ergebnisse
3.1 Entwicklung von Cosmid-Kontig und STS-Karte von MAR-Segment
Im Laufe einer positionellen Kloningbemühung, die sich auf den langen Arm des humanen Chromosoms 12 konzentrierte, konstruierten wir ein künstliches Hefechromosom (YAC)-Kontig, das ungefähr 6 Mb umspannte und aus 75 überlappenden YACs bestand. Für dessen Beschreibung wird auf Beispiel 1 verwiesen. Dieses Kontig umgab MAR (siehe ebenso 2), in welchem sich die meisten der Chromosomen 12q13-q15-Bruchpunkte, die in einer Vielzahl von primären gutartigen soliden Tumoren (34 Tumoren acht unterschiedlicher Arten, die bisher getestet wurden; Tabelle 5) und Tumorzelllinien (26 bisher getestet, abgeleitet von Lipom, uterinem Leiomyom und pleomorphem Speicheldrüsenadenom; 3) vorhanden sind, zu häufen scheinen. Wir haben sowohl eine weitreichende STS- als auch eine physikalische Rare-Cutter-Karte von MAR entwickelt und durch FISH-Analyse herausgefunden, dass die meisten Bruchpunkte innerhalb des 445 kb Unterbereichs von MAR, der zwischen STSs RM33 und RM98 angeordnet ist, kartieren (siehe 2 und 3). FISH-Experimente, die eine weitreichende Qualitätskontrolle umfassten, wurden gemäß Routineverfahren durchgeführt, wie sie zuvor beschrieben wurden [25, 39, 24, 42, 36]. Um die Verteilung der Bruchpunkte innerhalb diese 445 kb MAR-Segments weiter zu verfeinern, ist ein Cosmid-Kontig, das aus 54 überlappenden Cosmid-Klonen bestand, entwickelt worden und eine dichte STS-Karte (2) erstellt worden. Das Cosmid-Kontig wurde durch Vergleich mit der physikalischen Rare-Cutter-Karte und durch STS-Gehaltkartierung nochmals geprüft.
3.2. Anhäufung der Chromosom 12q-Bruchpunkte innerhalb eines 175 kb DNA-Segments von MAR
Die Chromosom 12q-Bruchpunkte in den unterschiedlichen untersuchten Tumorzelllinien wurden innerhalb des Cosmid-Kontigs durch FISH genau lokalisiert (3). Als Teil unserer Qualitätskontroll-FISH-Experimente [25, 39, 24, 42] wurden ausgewählte Cosmide zuerst auf von normalen Lymphozyten stammenden Metaphasen-Spreads getestet. FISH- Ergebnisse deuteten darauf hin, dass die Mehrzahl (mindestens 18 der 26 Fälle) der Chromosom 12-Bruchpunkte in diesen Tumorzelllinien angehäuft innerhalb des 175 kb DNA-Intervalls zwischen RM99 und RM133 gefunden wurden, was anzeigt, dass dieses Intervall den Hauptbruchpunktanhäufungsbereich bildet. FISH-Ergebnisse, die mit Li-501/SV40 erhalten wurden, zeigten, dass ein Teil von MAR auf ein offensichtlich normales Chromosom 3 transloziert wurde; eine Chromosomenaberration, die durch angewendete Zytogenetik übersehen wurde. Schließlich ist die Tatsache interessant, festzustellen, dass die Bruchpunkte der uterinen Leiomyomzelllinien LM-5.1/SV40, LM-65/SV40 und LM-608/SV40 sich als innerhalb desselben Cosmid-Klons kartierend herausgestellt haben; d. h. Cosmid 27E12.
Wir haben ebenfalls FISH-Experimente an acht unterschiedlichen Arten primärer gutartiger solider Tumoren mit Chromosom 12q13-q15-Aberrationen durchgeführt (Tabelle 4). Eine Mischung der Cosmid-Klone 27E12 und 142H1 wurde als molekulare Sonde verwendet. Als Zusammenfassung waren die Ergebnisse der FISH-Untersuchungen an primären Tumoren mit jenen, die für die Tumorzelllinien erhalten wurden, konsistent. Die Beobachtung, dass Bruchpunkte jeder der sieben unterschiedlichen getesteten Tumorarten innerhalb desselben 175 kb DNA-Intervalls von MAR gefunden wurden, deutete darauf hin, dass dieses Intervall von kritischer Relevanz für die Entwicklung dieser Tumoren ist.
In einer empfindlicheren Herangehensweise, um HMGI-C- oder 3'-aberrante HMGI-C-Transkripte zu detektieren, haben wir 3'-RACE-Experimente durchgeführt. In Kontrollexperimenten unter Verwendung einer Anzahl von Geweben mit variierenden HMGI-C-Transkriptionsgraden (hohe Grade in Hep 3B Hepatomzellen, mittlere in Hep G2 Hepatomzellen und niedrige in Myometrium, normalem Fettgewebe und Pseudomyxom) erhielten wir 3'-RACE-Klone, die bei molekularem Kloning und Nukleotidsequenzanalyse perfekte Teil-cDNA-Kopien von 3'-HMGI-C-mRNA-Sequenzen darzustellen schienen; unabhängig davon, welches der drei ausgewählten Startersets verwendet wurde (siehe Methodik). RACE-Produkte, die am wahrscheinlichsten krypischen oder aberrant gespliceten HMGI-C Transkripten entsprachen, wurden gelegentlich beobachtet; ihre ektopischen Sequenzen wurden auf das HMGI-C-Intron 3 oder 4 zurückkartiert.
Bei einer ähnlichen 3'-RACE-Analyse von zehn unterschiedlichen primären Tumoren oder Tumorzelllinien, die von Lipom, uterinem Leiomyom und pleomorphem Speicheldrüsenadenom stammten, entdeckten wir sowohl gleichbleibende als auch einzigartige PCR-Produkte. Die gleichbleibenden PCR-Produkte schienen in den meisten Fällen perfekte Teil-cDNA-Kopien von 3'-HMGI-C mRMA-Sequenzen darzustellen. Sie stammten am wahrscheinlichsten von einem vermutlich nicht betroffenen HMGI-C-Allel und könnten als innere Kontrollen betrachtet werden. Die einzigartigen PCR-Produkte der zehn Tumorzellenproben, die hier präsentiert werden, schienen ektopische Sequenzen zu enthalten, die mit HMGI-C-Sequenzen verschmolzen waren. In den meisten Fällen wurde festgestellt, dass die ektopischen Sequenzen von etablierten Translokationspartnern stammten, so dass sie einen unabhängigen Beweis für translokationsinduzierte Umordnungen des HMGI-C-Gens darstellen. Die Informationen bezüglich der Nukleotidsequenzen, Diversionspunkte und chromosomalen Ursprünge der ektopischen Sequenzen dieser RACE-Produkte sind in Tabelle 5 zusammengefasst.
Eine erste und vorläufige Beurteilung isolierter ektopischer Sequenzen enthüllte phasengleiche offene Leseraster variabler Länge. Für Li-501/SV40 ist es interessant festzustellen, dass in der Northern-Blot-Analyse die isolierten ektopischen Sequenzen ein Transkript von über 10 kb in einer Vielzahl von Geweben, einschließlich Herz, Niere, Leber, Lunge, Pankreas, Plazenta und Skelettmuskel, aber nicht in Gehirn (Daten nicht gezeigt) detektierten. Da Chromosom 3 der bevorzugte Partner bei Chromosom 12q13-q15-Translokationen in Lipomen ist und herausgefunden wurde, dass die Chromosom 3 -Bruchpunkte verschiedener Lipome von dem YAC-Klon CEPH192B10 umspannt werden, könnte das detektierte Transkript einem mutmaßlichen Lipom-bevorzugten Partnergen (LPP) entsprechen.
Beispiel 3
Hybrid-HMGI-C in Lipomzellen
cDNA-Klone des Chromosom 3-abgeleiteten Lipom-bevorzugten Partnergens LPP (> 50 kb) wurden isoliert und ihre Nukleotidsequenz erstellt. Daten einer zusammengesetzten cDNA sind in 4 gezeigt. Ein offenes Leseraster für ein Protein (612 Aminosäuren (aa)) mit einer Aminosäuresequenzähnlichkeit (über 50 %) zu Zyxin aus Hühnern wurde identifiziert. Zyxin ist ein Mitglied der LIM-Proteinfamilie, dessen Mitglieder alle sogenannte LIM-Domänen besitzen [78]. LIM-Domänen sind cysteinreiche, zinkbindende Proteinsequenzen, die in einer wachsenden Anzahl von Proteinen mit unterschiedlichen Funktionen, einschließlich Transkriptionsregulatoren, Proto-Onkogen-Produkte und Adhäsionsplaque-Bestandteile, gefunden werden. Es ist postuliert worden, dass viele der LIM-Familienmitglieder eine Rolle in der Zellsignalisierung und Regulierung des Zellschicksals während der Entwicklung spielen. Kürzlich wurde gezeigt, dass LIM-Domänen modulare proteinbindende Schnittstellen sind [79]. Wie Zyxin, das an Stellen der Zelladhäsion an die extrazelluläre Matrix und an andere Zellen vorhanden ist, besitzt das abgeleitete LPP-codierte Protein (6) drei LIM-Domänen, und ihm fehlen klassische DNA-bindende Homäodomänen.
Bei der 3'-RACE-Analyse von Li-501/SV40 wurde ein HMGI-C enthaltendes Fusionstranskript identifiziert, aus dem ein Hybridprotein (324 aa) vorhergesagt werden konnte und das anschließend als aus drei DBDs (83 aa) aus HMGI-C und Carboxy-terminal von diesen den drei LIM-Domänen (241 aa), codiert durch LPP, bestehend vorhergesagt wurde. Bei der PCR-Analyse unter Verwendung geeigneter verschachtelter Amplimer-Sets wurden ähnliche HMGI-C/LPP-Hybridtranskripte in verschiedenen primären Lipomen und Lipomzelllinien, die ein t(3;12) tragen und ebenfalls in einem zytogenetisch normalen Lipom detektiert. Diese Daten zeigen, dass die zytogenetisch detektierbaren und ebenfalls die versteckten t(3;12) Translokationen in Lipomen konsistent zu der phasengleichen Verschmelzung von den DNA-bindenden Molekülen von HMGI-C mit den vermuteten modularen proteinbindenden Schnittstellen des LPP-codierten Proteins führen, so dass sie die saure Domäne von HMGI-C durch LIM-Domänen ersetzen. Folglich werden diese proteinbindenden Schnittstellen am wahrscheinlichsten in der Kernumgebung dieser Lipomzellen präsentiert, wo sie die Genexpression beeinflussen könnten, was möglicherweise zu aberranter Wachstumsregulierung führt. Aus der großen Vielzahl gutartiger mesenchymaler Tumoren mit Chromosom 12q13-q15-Aberrationen ist dies das erste Beispiel eines Chromosomen-Translokationspartners, der wiederholend und konsistent zu der Bildung eines wohldefinierten tumorassoziierten HMGI-C-Fusionsproteins beiträgt.
5 zeigt die cDNA-Sequenz des vollständigen isolierten LPP-Gens.
Beispiel 4
Diagnostischer Test für Lipom
Eine Biopsie eines Patienten mit einem Lipom wurde entnommen. Aus dem so erhaltenen Material wurde die Gesamt-RNA unter Verwendung des TRIZOL^TM LS Standardprotokolls von GIBCO/BRL, wie in dem Handbuch des Herstellers beschrieben, extrahiert. Diese Gesamt-RNA wurde verwendet, um den ersten Strang der cDNA unter Verwendung von reverser Transkriptase (GIBCO/BRL) und einem Oligo dT (17) Starter herzustellen, der eine angehängte kurze zusätzliche Nukleotidstrecke enthielt. Die Sequenz des verwendeten Starters ist wie in Beispiel 2 unter Punkt 2.5 beschrieben. RNase H wurde anschließend verwendet, um die RNA aus dem synthetisierten DNA/RNA-Hybridmolekül zu entfernen. PCR wurde unter Verwendung eines genspezifischen Starters (Beispiel 2, Punkt 2.5) und eines Starters, der zu der angehängten kurzen zusätzlichen Nukleotidstrecke komplementär war, durchgeführt. Das so erhaltene PCR-Produkt wurde durch Gel-Elektrophorese analysiert. Fusionskonstrukte wurden durch ihren Vergleich mit den Hintergrundbanden normaler Zellen desselben Individuums detektiert.
In einem zusätzlichen Experiment wurde ein zweiter Durchgang halb verschachtelter PCR unter Verwendung eines internen Starters und des Starters, der zu der kurzen Nukleotidstrecke komplementär ist, durchgeführt. Die Empfindlichkeit des Tests wurde somit signifikant verbessert.
7 zeigt ein typisches Gel.
TABELLEN TABELLE I Analyse der YAC-Klone
YAC-Klone wurden aus CEPH-YAC-Bibliotheken isoliert, wie in den Materialien und Verfahren beschrieben. ND: nicht detektiert durch die verwendeten Verfahren. Orientierungspunkte, die nicht innerhalb des 6 Mb Kontigs kartieren, sind in Klammem gesetzt. GenBank-Zugangsnummern sind angegeben (#).
TABELLE II PCR-Starter
STSs wurden isoliert, wie in Materialien und Verfahren beschrieben, oder bei EST01096, IFNG und Rap 1B aus der Literatur erlangt.
LEGENDE ZU DEN FIGUREN
1
Weitreichende physikalische Karte eines 6 Mb-Bereichs auf dem langen Arm des menschlichen Chromosoms 12, abgeleitet von einem YAC-Kontig, das aus 75 überlappenden CEPH-YAC-Klonen besteht und die Chromosom 12q-Bruchpunkte überspannt, die in einer Vielzahl von gutartigen soliden Tumoren vorhanden sind. Die weitreichende physikalische Karte der zusammengesetzten genomischen DNA, die durch die YAC-Inserts abgedeckt ist, wird durch eine schwarze durchgezogene Linie dargestellt, wobei die relativen Positionen der verschiedenen Restriktionsstellen von Rare-Cutting-Enzymen angezeigt sind. DNA-Bereiche, in denen zusätzliche Schnittstellen eines besonderen Restriktionsenzyms gefunden werden könnten, sind durch Pfeile angezeigt. Polymorphe Restriktions-Endonukleasestellen sind mit Sternchen markiert. DNA-Markierungssubstanzen, die von anderen isoliert und definiert worden sind, sind in grün abgebildet. DNA-Markierungssubstanzen, die von uns erhalten wurden, sind in Kästen gezeigt und mit einem Akronym gekennzeichnet (siehe ebenfalls Tabelle I und II). Die relativen Positionen dieser DNA-Markierungssubstanzen in der weitreichenden physikalischen Karte sind angegeben, und jene, die besonderen YAC-Enden entsprechen, sind mit diesen durch eine gepunktete Linie verbunden. Einige der DNA-Markierungssubstanzen sind einem DNA-Intervall zugeordnet worden, und dies ist durch Pfeile angezeigt. Für DNA-Markierungssubstanzen in weißen Kästen sind STSs entwickelt worden, und Startersets sind in Tabelle II angegeben. Für jene im gelben Kasten sind keine Startersets entwickelt worden. Die DNA-Intervalle, die RAP1B, EST01096 oder IFNG enthalten, sind angegeben. Wo sie anwendbar sind, sind D-Zahlzuordnungen angegeben. Unter der weitreichenden physikalischen Karte sind die Größen und relativen Positionen der überlappenden YAC-Klone, die in die weitreichende Konsensrestriktionskarte passen, als durchgezogene blaue Linien angegeben. DNA-Bereiche von YAC-Inserts, die nicht in die weitreichende Konsensrestriktionskarte passen, sind durch gepunktete blaue Linien dargestellt. CEPH-Mikrotiterplattenadressen der YAC-Klone sind aufgeführt. Die Orientierung des YAC-Kontigs auf Chromosom 12 ist angegeben. Die relativen Positionen von ULCR12 und MAR sind durch rote durchgezogene Li nien angegeben, die mit den entsprechenden Akronymen gekennzeichnet sind. Die Zugangsnummern von STSs, die nicht in Tabelle I aufgelistet sind: CH9 (#U27142); RM1 (#U29049); RM110 (#U29022); RM111 (#U29023); RM130 (#U27139); RM131 (#U29001); RM132 (#U27138); RM133 (#U27137). Restriktionsstellen: B: BssHII; K: KspI (= SacII); M: MluI; N: NotI; P: PvuI; Sf SfiI.
2
Kontig überlappender Cosmide, weitreichende Restriktions- und STS-Karte, die ein Segment von MAR von ungefähr 445 kb überspannt. Kontig-Elemente sind nummeriert und in der Liste unten definiert. LL12NC01-abgeleitete Cosmid-Klone sind nach ihren Mikrotiterplattenadressen benannt. GenBank-Zugangsnummern (#) der unterschiedlichen STSs sind unten aufgeführt. STSs sind in abgekürzter Form angegeben; z. B. RM33 anstelle von STS 12-RM33. Eine 40 kb-Lücke zwischen den STSs "K" und "O" in dem Cosmid-Kontig wurde durch λ-Klone (Klone 38 und 40) und PCR-Produkte (Klone 37 und 39) abgedeckt. Die Orientierung des Kontigs auf dem langen Arm von Chromosom 12 sowie die Reihenfolge von 37 STSs (in Kästen angegeben oder mit umkreisten Großbuchstaben markiert) ist angegeben. Die schrägen Linien und Pfeile um einige der STS-Symbole im oberen Bereich der Figur markieren den Bereich, dem die spezielle STS zugeordnet worden ist. Es soll angemerkt werden, dass das Cosmid-Kontig nicht maßstabsgerecht ist; schwarze Quadrate stehen für STSs von Cosmid-Enden, während die Gegenwart von STSs, die inneren Cosmid-Sequenzen entsprechen, durch Punkte dargestellt sind. Weitreichende Restriktionskarte: Bs: BssHII; K: KspI (= SacII); M: MluI; N: NotI; P: PvuI; Sf: SfiI. Im unteren Bereich der Figur sind ausführliche Restriktionskarten jener Bereiche gezeigt, die Exons (Kästen unten) des HMGI-C-Gens enthalten. Nichtcodierende Sequenzen sind durch offene Kästen dargestellt, und codierende Sequenzen durch schwarze Kästen. Geschätzte Größen (kb) der Introns sind wie angegeben. Die relativen Positionen der Translationsstart-(ATG) und -stop-(TAG)-Kodons in dem HMGI-C-Gen sowie das vermutliche Polyadenylierungssignal sind durch Pfeile angegeben. Ausführliche Restriktionskarte: B: BamHI; E: EcoRI; H: HindIII. MAR: Multi-Aberrationsbereich; DBD: DNA-bindende Domäne.
3
Schematische Darstellung von FISH-Kartierungsdaten, die für Tumorzelllinien mit Chromosom 12q13-q15-Aberrationen erhalten wurden, einschließlich 8 Lipomen, 10 uterinen Leiomyomen und 8 pleomorphen Speicheldrüsenadenomzelllinien in aufeinander folgenden Experimenten, die unseren früheren FISH-Untersuchungen folgten. Verwendete Sonden umfassen Phagen-Klone pRM144 (entsprechende STSs:RM86 und RM130) und pRM147 (RM151) und Cosmid-Klone 7D3 oder 152F2 (RM103), 154F9 (CH9), 27E12 (EM11), 211A9 (RM33), 245E8 (RM53), 185H2 (RM76), 202A1 (RM98), 142H1 (RM99), 154B12 (RM132) und 124D8 (RM133). Das DNA-Intervall zwischen RM33 und RM98 wird auf ungefähr 445 kb geschätzt. Punkte geben schlüssige FISH-Experimente an, die an Metaphasen-Chromosomen einer speziellen Zelllinie unter Verwendung eines Klons als molekulare Sonde durchgeführt wurden, der die STS enthält, die in dem Kasten oben angegeben ist. Durchgezogene Linien geben DNA-Intervalle an, zu denen geschlossen wurde, dass ein Bruchpunkt einer speziellen Zelllinie darin kartiert. Offene Dreiecke geben Deletionen an, die während der FISH-Analyse beobachtet wurden. Offene Kreise geben Ergebnisse von FISH-Experimenten auf Metaphasen-Chromosomen von Li-501/SV40 Zellen mit Hybridisierungssignalen auf einem zytogenetisch normalen Chromosom 3 an. Die Positionen von Chromosom 12 Bruchpunkten auf Tumorzelllinien, die außerhalb MAR kartieren, sind durch Pfeile angegeben. Die molekular klonierten Bruchpunkte von LM-30.1/SV40 und LM-608/SV40 sind durch Sternchen angegeben. Bruchpunkte in unterschiedlichen uterinen Leiomyomzelllinien, die das Cosmid 27E12 (EM11) spalten, sind durch "across" angegeben.
4
3'-RACE-Produkt, das die Verbindung zwischen einem Teil des HMGI-C-Gens und einem Teil des LPP-Gens umfasst. Die verwendeten Starter und die Verbindungsstelle sind angegeben. Die cDNA-Synthese wurde intern gestartet und nicht auf dem wahren Poly(A)-Ennde.
5
Teil-cDNA-Sequenz des LPP-Gens.
6
Aminosäuresequenz des LPP-Gens. LIM-Domänen sind von einem Kasten umgeben. Der Bruchpunkt ist mit einem Pfeil angegeben.
7
Gel von PCR-Produkten, die wie in Beispiel 4 beschrieben erhalten wurden.
Literaturnachweise

1. Sreekantaiah, C, Leong, S.L.P., Karakousis, C.P., McGee, D.L., Rappaport, W.D., Villar, H.V., Neal, D., Fleming, S., Wankel, A., Herrington, P.N., Cannona, R. und Sandberg, A.A. (1991). Cytogenetic profile of 109 lipomas. Cancer Res. 51: 422-433.
2. Nilbert, M. und Heim, S. (1990). Uterine leiomyoma cytogenetics. Genes Chrom. Cancer 2: 3-13.
3. Pandis, N., Heim, S., Willen, H., Bardi, G., Floderus, U.M., Mandahl, N. und Mitelman, F. (1991). chromosome analysis of 96 uterine leiomyomas. Cancer Genet. Cytogenet. 55: 11-18.
4. Sandros, J., Stenman, G. und Mark, J. (1990). Cytogenetic and molecular observations in human and experimental salivary gland tumours. Cancer Genet. Cytogenet. 44: 153-167.
5. Bullerdiek, J., Wobst, G., Meyer-Bolte, K., Chilla, R., Haubrich, J., Thode, B. und Bartnitzke, S. (1993). Cytogenetic subtyping of 220 salivary gland pleomorphic adenomas: correlation to occurrence, histological subtype, and in vitro cellular behavior. Cancer Genet. Cytogenet. 65: 27-31.
6. Walter, T.A., Xuan Fan, S., Medchill, M.T., Berger, C.S., Decker, H-J.H. und Sandberg, A.A. (1989). Inv(l2)(p11.2q13) in an endometrial polyp. Cancer Genet. Cytogenet. 41: 99-103.
7. Vanni, R., Dal Cin, P., Marras, S., Moerman, P., Andrtia, A., Valdes, E., Deprest, J., und Van den Berghe, H., (1993). Endometrial polyp: Another benign tumor characterized by 12q13-q15 changes. Cancer Genet. Cytogenet. 68: 32-33.
8. Mandahl, N., Orndal, C., Heim, S., Willen, H., Rydholm, A., Bauer, H.C.F. und Mitelman, F. (1993). Aberrations of chromosome segment 12q13-15 characterize a subgroup of hemangiopericytomas. Cancer 71: 3009-3013.
9. Mandahl, N., Heim, S., Arheden, K., Rydholm, A., Willen, H. und Mitelman, F. (1989). Chromosomal rearrangements in chondromatous tumors. Cancer 65:24 2-248.
10. Bridge, J.A., Persons, D.L., Neff, J.R. und Bhatia, P. (1992). Clonal karyotypic aberrations in enchondroma. Cancer Detect. Prev. 16: 215-219.
11. Hirabayashi, Y., Yoshida, M.A., Ikeuchi, T., Ishida, T., Kojima, T. Higaki, S., Machinami, R. und Tonomura,
A. (1992). Chromosome rearrangements at 12q13 in two cases of chondrosarcomas. Cancer Genet. Cytogenet. 60: 35-40.
12. Mandahl, N., Willen, H., Rydholm, A. und Mitelman, F. (1993). Rearrangement of band q13 on both chromosomes 12 in a periosteal chondroma. Genes Chrom. Cancer 6: 121-123.
13. Dal Cin, P., Kools, P., De Jonge, I., Moennan, Ph., Van de Ven W., Van den Berghe H. (1993a). Rearrangement of 12q14-15 in Pulmonary Chondroid Hamartoma. Genes Chrom. Cancer, 8, 131-133.
14. Schoenberg Fejzo, M., Yoon, S.J., Montgomery, K.T., Rein, M.S., Weremowicz, S., Krauter, K.S., Dorman, T.E., Fletcher, J.A., Mao, J., Moir, D.T., Kucherlapati, R.S., und Morton, C.C. (1995). Identification of a YAC spanning the translocation breakpoints in uterine leiomyomata, pulmonary Chondroid hamartoma and lipoma. Physical mapping of the 12q14-15 breakpoint region in uterine leiomyomata. Genomics 26: 265-275.
15. Birdsal, S.H., MacLennan, K.A. und Gusterson, B.A. (1992). t(6;12)(q23;q13) and t(10;16)(q22;p11) in a phyllodes tumor of the breast. Cancer Genet. Cytogenet. 60: 74-77.
16. Rohen, C, Bonk, U., Staats, B., Bartnizke, S. und Bullerdiek, J. (1993). Two human breast tumors with translocations involving 12q13-15 as the sole cytogenetic abnormality. Cancer Genet. Cytogenet., 69: 68-71.
17. Jenkins, R.B., Kimmeil, D.W., Moertel, CA., Schulz, CA., Menezes, R.M., Scheihauer, B., Kelly, P.J. und Dewald, G.W. (1989). Recurrent cytogenetic abnormalities in 80 gliomas. Cytogenet. Cell Genet. 51: 1019.
18. Noguera, R., Llombart-Bosch, A., Lopez-Gines, C, Carda, C. und Fernandez, C1. (1989). Giant-cell tumor of bone, stage II, displaying translocation t(12;19)(q13;q13). Virchows Archiv A Pathol. Anat. 415: 377-382.
19. Turc-Carel, C., Limon, J., Dal Cin, P., Rao, U., Karakousis, C, und Sandberg, A.A. (1986). Cytogenetic studies of adipose tissue tumours. II. Recurrent reciprocal translocation t(12;16)(q13;p11) in myxoid liposarcomas. Cancer Genet. Cytogenet. 23: 291-299.
20. Rodiguez, E., Sreekantaiah, C., Reuter, V.E., Motzer, R.J. und Chaganti, R.S.K. (1992). t(12;22)(q13;q13) and trisomy 8 are nonrandom aberrations in clear-cell sarcoma. Cancer Genet. Cytogenet. 64: 107-110.
21. Reeves, B.R., Fletcher, C.D.M. und Gusterson, B.A. (1992). Translocation t(12;22)(q13;q13) is a nonrandom rearrangement in clear cell sarcoma. Cancer Genet. Cytogenet. 64: 101-103.
22. Fletcher, J.A. (1992). Translocation (12;22)(q13-14;q12) is a nonrandom aberration in soft-tissue clear-cell sarcoma. Genes Chrom. Cancer 5: 184.
23. Roberts, P., Browne, C.F., Lewis, I.J., Bailey, C.C., Spiee, R.D., Williams, J. und Batcup, G. (1992). 12q13 Abnormality in rhabdomyosarcoma. A nonrandom Occurrence? Cancer Genet. Cytogenet. 60: 135-140.
24. Schoenmakers, H.F.P.M., Mols, R., Wanschura, S., Kools, P.F.J., Geurts, J.M.W., Bartnitzke, S., Bullerdiek, J., Van den Berghe, H., und Van de Ven, W.J.M. (1994b). Identification, molecular cloning and characterization of the chromosome 12 breakpoint cluster region of uterine leiomyomas. Genes Chrom. & Cancer. 11: 106-118.
25. Van de Ven, W.J.M., Schoenmakers, H.F.P.M., Wanschura, S., Kazmierczak, B., Kools, P.F.J., Geurts, J.M.W., Bartnitzke, S., Van den Berghe, H., und Bullerdiek, J. (1995). Molecular characterization of MAR, a multiple aberration region on human chromosome segment 12q13-q15 implicated in various solid tumors. Genes Chrom. & Cancer. 12: 296-303. (Als "ANHANG 1" enthalten)
26. Casalone, r. et al. (1991) Cytogenetic analysis reveals clonal proliferation of smooth muscle cells in etherosclerotic plaques. Hum. Gen. 87, 139-143.
27. Vanni, R. et al. (1990) Atherosclerotic plaque as a benign tumor. Cancer Genet. Cytogenet. 47, 273-274.
28. Giancotti, V. et al. Elevated levels of a specific class of nuclear phosphoproteins in cells transformed with ras and v-mos oncogenes and by co-transfection with c-myc and polyoma middle T genes. EMBO J. 6, 1981-1987 (1987).
29. Warburton, D., Gersen, S., Yu, M-T., Jackson, C., Handelin, B. und Housman, D. (1990). Monochromosomal rodent-human hybrids from microcell fusion of human lymphoblastoid cells containing an inserted dominant selectable marker. Genomics 6: 358-366.
30. Schoenmakers, H.F.P.M., Kools, P.F.J., Kazmierczak, B., Bullerdiek, J., Claussen, U., Horsthemke, B., Van den Berghe, H. und Van de Ven, W.J.M. (1993). Isolation of a somatic cell hybrid retaining the der (16) t(12;16)(q13;p11.2) from a myxoid liposarcoma cell line. Cytogenet. Cell Genet. 62: 159-161.
31. Rychlik, W. und Rhoads, R.E. (1989). A Computer program for choosing optimal oligonucleotides for filterhybridization, sequencing and in vitro amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 17: 8543-8551.
32. Verbeek, J.S., Roebroek, A.J.M., Van den Ouweland, A.M.W., Bloemers, H.P.J. und Van de Ven, W.J.M. (1985). Human c-fms proto-oncogene: comparative analysis with an abnormal allele. Mol. Cell. Biol. 5: 422-426.
33. Montgomery, K.T., LeBlanc, J.M., Tsai, P., McNinch, J.S., Ward, D.C., De Jong, P.J., Kucherlapati, R., und Krauter, K.S. (1993). Characterization of two chromosome 12 cosmid libraries and development STSs from cosmids mapped by FISH. Genomics 17: 682-693
34. Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
35. Dal Cin, P., Kools, P., Sciot, R., De Wever, I., Van Damme, B., Van de Ven, W. und Van den Berghe, H. (1993b). Molecular cytogenetic characterization of ring chromosomes in adipose tissue tumors. Cancer Genet. Cytogenet., 68, 85-90.
36. Kievits, T., Dauwerse, J.G., Wiegant, J., Devilee, P., Breuning, M.H., Cornelisse, C.J. und van Ommen, G., Pearson, P.L. (1990). Rapid subchromosomal localization of cosmids by nonradioactive in situ hybridization. Cytogenet. Cell Genet. 53: 134-136.
37. Albertsen, H.M., Abderrahim, H., Cann, H.M., Dausset, J., L Paslier, D., und Cohen, D. (1990). Construction and characterization of a yeast artificial chromosome library containing seven haploid human genome equivalents. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 4256-4260.
38. Chumakov, I., Rigault, P., Guillou, S., Ougen, P., Billaut, A., Guasconi, G., Gervy, P., LeGall, I., Soularue, P., Grinas, L., Bougueleret, L., Bellanne-Chantelot, C., Lacroix, B., Barillot, E., Gesnouin, P., Pook, S., Vaysseix, G., Frelat, G., Schmitz, A., Sambucy, J.L., Bosch, A., Estivill, X., Weissenbach, J., Vignal, A., Riethman, H., Cox, D., Patterson, D., Gardiner, K., Hattori, M., Sakaki, Y., Ichikawa, H., Ohki, M., L Paslier, D., Heilig, R., Antonarakis, S., und Cohen, D. (1992). Continuum of overlapping clones spanning the entire human chromosome 21q. Nature 359: 380-387.
39. Schoenmakers, H.F.P.M., Kools, P.F.J., Mols, R., Kazmierczak, B., Bartnitzke, S., Bullerdiek, J., Dal Cin, P., De Jong, P.J., Van den Berghe, H. und Van de Ven, W.J.M. (1994a). Physical mapping of chromosome I2q breakpoints in lipoma, pleomorphic salivary gland adenoma, uterine leiomyoma, and myxoid liposarcoma. Genomics 20: 210-222.
40. Chu, G., Vollrath, D. und Davis, R.W. (1986) Separation of large DNA molecules by contour-clamped homogeneous electric fields. Science 234: 1582-1585.
41. Geurts, J., Schoenmakers H.F.P.M., Mols, R., und Van de Ven, W.J.M. (1994). Improved procedure for rapid isolation and sequencing of DNA insert termini in yeast artificial chromosomes. Meth. Mol. Cell. Biol., 4: 257-265.
42. Kools, P.F.J., Wanschura, S., Schoenmakers, E.F.P.M., Geurts, J.W.M., Mols, R., Kazmierczak, B., Bullerdiek, J., Van den Berghe, H. und Van de Ven, W.J.M. (1995). Identification of the chromosome 12 translocation breakpoint region of a pleomorphic salivary gland adenoma with t(1;12)(p22;q15) as the sole cytogenetic abnormality. Cancer Genet. Cytogenet., 79: 1-7. (Als "ANHANG 2" enthalten)
43. Kazmierczak, B., Wanschura, S., Rosigkeit, J., Meyer-Bolte, K., Uschinsky, K., Haupt, R., Schoenmakers, E.F.P.M., Bartnitzke, S., Van de Ven, W.J.M. und Bullerdiek, J. (1995). Molecular characterization of 12q14-15 rearrangements in three pulmonary chondroid hamartomas. Cancer Res., in press.
44. Kucherlapati, R., Craig, I., und Marynen, P. (1994). Report of the second international Workshop on human chromosome 12 mapping 1994. Cytogenet. Cell Genet. 67: 246-276
45. Gyapay, G., Morissette, J., Vignal, A., Dib, C., Fizames, C., Millasseau, P., Marc, S., Bernardi, G., Lathrop, M. und Weissenbach, J. (1994). The 1993-94 Genethon human genetic linkage map. Nature Genetics 7: 246-339.
46. Ulinowski, Z., Taylor, K., Griffin, D., Delhanty, J. und Wolfe, J. (1991). D12S56: a highly polymorphic locus on human chromosome 12q14. Ann. Hum. Genet. 55: 279-282.
47. Trent, J.M., Olson, S. und Lawn, R.M. (1982) Chromosomal localization of human leukocyte, fibroblast, and immune interferon genes by means of in situ hybridization. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 79: 7809-7813.
48. Pizon, V., Lerosey, I., Chardin, P. und Tavitian, A. (1988). Nucleotide sequence of a human cDNA encoding a ras-related protein (rap1B). Nucleic Acids Res. 16: 7719.
49. Adams, M.D., Dubnick, M., Kerlavage, A.R., Moreno, R., Kelley, J.M., Utterback, T.R., Nagle, J.W., Fields, C, und Venter, J.C. (1992). Sequence identification of 2,375 human brain genes. Nature 355: 632-634.
50. Cohen, D., Chumakov, I., und Weissenbach, J. (1993). A first-generation physical map of the human genome. Nature 366: 698-701.
51. Larsen, F., Gundersen, G., und Prydz, H. (1992a). Choice of enzymes for mapping based on CpG islands in the human genome. GATA 9: 80-85.
52. Larsen, F., Gundersen, G., Lopez, R., und Prydz, H. (1992b). CpG islands as gene markers in the human genome. Genomics 13: 1095-1107.
53. Lavia, P., MacLeod, D., und Bird, A. (1987). Coincident start sites for divergent transcripts at randomly selected CPG-rich island of mouse. EMBO J. 6: 2773-2779.
54. Kazmierczak, B., Bartnitzke, S., Hartl, M. & Bullerdiek, J. In vitro transformation by the SV40 "early region" of cells from a human benign salivary gland tumor with a 12q13-q15 rearrangement. Cytogenet. Cell Genet. 53, 37-39 (1990).
55. Albertsen, H.M., Adderrahim, H., Cann, H.M., Dausset, J., Le Paslier, D. & Cohen, D. Construction and characterization of a yeast artificial chromosome library containing seven haploid human genome equivalents. Proc. natl. Acad. Sei. U.S.A. 87, 4256-4260 (1990).
56. Chumakov, I. et al. Continuum of overlapping clones spanning the entire human chromosome 21q. Nature 359, 380-387 (1992).
57. Green, E.D. & Olson, M.V. Systematic screening of yeast artificial-chromosome libraries using the polymeraase chain reaction. Proc. natl. Acad. Sei. U.S.A. 87, 1213-1217 (1990).
58. Montgomery, K.T. et al. Characterization of two chromosome 12 cosmid libraries and development of STSs from cosmids mapped by FISH. Genomics 17, 682-693 (1993).
59. Geurts, J.M.W., Schoenmakers E.F.P.M., Mols, R. & Van de Ven, W.J.M. Improved procedure for rapid isolation and sequencing of DNA insert termini in yeast artificial chromosomes. Meth. Mol. Cell. Biol. 4, 2 57-265 (1994).
60. Nelson, D.L. et al. Alu polymerase chain reaction: A method for rapid isolation of human-speeific sequences from complex DNA sources. Proc. natl. Acad. Sei. U.S.A. 86, 6686-6690 (1989).
61. Rychlik, W. & Rhoads, R.E. A Computer program for choosing optimal oligonucleotides for filter hybridization, sequencing and in vitro amplification of DNA. Nucl. Acids Res. 17, 8543-8551 (1989).
62. Feinberg, A.P. & Vogelstein, B. A technique for radiolabelling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity. Anal. Biochem. 132, 6-13 (1984).
63. Smith, M.W., Holmsen, A.L., Wei, Y.H., Peterson, M. & Evans, G.A. Genomic sequence sampling: a strategy for high resolution sequence-based physical mapping of complex genomes. Nature Genetics 7, 40-47 (1994).
64. Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990).
65. Patel, U.A. et al. Expression and cDNA cloning of human HMGI-C phosphoprotein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 201, 63-70 (1994).
66. Bustin, M., Lehn, D.A. & Landsman, D. Structural features of the HMG chromosomal proteins and their genes. Biochim. Biophys. Acta 1049, 231-243 (1990).
67. Manfioletti, G. et al. cDNA cloning of the HMGI-C hosphoprotein, a nuclear protein associated with neoplastic and undifferentiated phenotypes. Nucl. Acids Res. 19, 6793-6797 (1991).
68. Wagner, M.J., Ge, Y., Siciliano, M. & Wells, D.E. A hybrid cell mapping panel for regional localization of probes to human chromsome 8. Genomics 10, 114-125 (1991).
69. Friedman, M., Holth, L.T., Zoghbi, H.Y. & Reeves, R. Organization, inducible-expression and chromosome localization of the human HMG-I(Y) nonhistone protein gene. Nucl. Acids Res. 21, 4259-4267 (1993).
70. Rabbitts, T.H. Chromosomal translocations in human cancer. Nature 372, 143-149 (1994).
71. Yang-Yen, H.F. & Rothblum, L.I. Purification and characterization of a high-mobility-group-like DNA-binding protein that stimulates rRNA synthesis in vitro. Mol. Cell. Biol. 8, 3406-3414 (1988).
72. Reeves, R., Langan, T.A. & Nissen, M.S. Phosphorylation of the DNA-binding domain of nonhistone high-mobility group I protein by cdc2 kinase: reduction of binding affinity. Proc. natl. Acad. Sei. U.S.A. 88, 1671-1675 (1991).
73. Thanos, D. & Maniatis, T. The high mobility group protein HMGI(Y) is required for NF-B-dependent virus induction of the human IFN-β gene. Cell 71, 777-789 (1992).
74. Du, W. & Maniatis, T. The high mobility group protein HMGI(Y) can stimulate or inhibit DNA binding of distinct transcriptional factor ATF-2 isoforins. Proc. natl. Acad. Sei. U.S.A. 91, 11318-11322 (1994).
75. Aizawa, S., Nishino, H., Saito, K., Kimura, K., Shirakawa, H. & Yoshida, M. Stimulation of transcription in eultured cells by high mobility group protein 1: Essential role of the acidic carboxyterminal region. Biochemistry 33, 14690-14695 (1994).
76. Mitelman F (1994): Catalog of chromosome Aberrations in Cancer. 4. Auflage, New York, Wiley-Liss.
77. Miles, J.H., Zonanna, J., Mcfarlane, J., Aleck, K.A. & Bawle, E. Macrocephaly with hamartomas: Bannayan-Zonana syndrome. Am. J. Med. Genet. 19, 225-234 (1984).
78. Crawford, A.W., Pino, J.D. & Beckerie, M.C.J. Cell. Biol., 124, 117-127 (1994)
79. Schmeichel, K.L. & Beckerie, M.C. Cell, 79, 211-219 (1994)
80. Sanchez-Garcia, I. & Rabbitts, T. (1994) The LIM domain: a new structural motif found in zinc-fingerlike proteins. Trends in Genetics 10(9), 315-320.
81. Compton, J. (1991). Nucleic acid sequence-based amplification. Nature 350, 91-92.

ANHANG 1

Eingegangen am 27. September 1994: angenommen am 7. November 1994. Anfragen nach Kopien sind an Dr. Wim J.M. van de Ven zu richten, Center for Human Genetics, University of Leuven, Herestraat 49, B-3000 Leuven, Belgien.
Genes, Chromosome & Cancer 12: 296-303 (1995)

Molekulare Charakterisierung von MAR, einem Multi-Aberrationsbereich auf dem menschlichen Chromosomensegment 12q13-q15, der mit verschiedenen soliden Tumoren in Verbindung gebracht wird.

Wim J.M Van de Ven, Eric F.P.M. Schoenmakers, Sylke Wanschura, Bernd Kazmierczak, Patrick F.H. Kools, Jan M.W. Geurts, Sabine Bartnitzke, Nerman Van den Berghe und Jörn Bullerdiek.
Zentrum für Humangenetik, Universität Leuven, Belgien (W.J.M.V.D.V., E.F.P.M.S., P.F.J.K., J.W.M.G., H.V.D.B.);
Zentrum für Humangenetik, Universität Bremen, Deutschland (S.W., B.K., S.B., J.B.)

Chromosomenarm 12q-Bruchpunkte in sieben Zelllinien, die von primären pleomorphen Speicheldrüsenadenomen abstammen, wurden durch FISH-Analyse relativ zu neun DNA-Sonden kartiert. Diese Sonden sitzen alle in einem 2,8 Mb genomischen DNA-Bereich des Chromosomensegments 12q13-q15 und entsprechen zuvor veröffentlichten sequenzmarkierten Stellen (STS). Ihre relativen Positionen wurden auf der Basis von YAC-Klonierung und weitreichender physikalischer und STS-Gehalts-Kartierung festgelegt. Es wurde festgestellt, dass die 12q-Bruchpunkte von fünf der Zelllinien innerhalb dreier unterschiedlicher Unterbereiche des 445 kb DNA-Intervalls kartieren, das kürzlich als uteriner Leiomyom-Häufungsbereich von Chromosom 12 -Bruchpunkten (ULCR12) zwischen STS RM33 und RM98 definiert wurde. Alle sieben Bruchpunkte schienen innerhalb des 1,7 Mb DNA-Bereichs zwischen STS RM36 und RM103 zu kartieren. Außerdem hat sich herausgestellt, dass die Chromosom 12 Bruchpunkte dreier primärer pleomorpher Speicheldrüsenadenome ebenfalls zwischen RM36 und RM103 kartieren. Schließlich hat FISH-Analyse zweier Lipomzelllinien mit 12q13-q15 Aberrationen die Bruchpunkte dieser relativ kleinen und aneinandergrenzenden DNA-Segmente genau lokalisiert, die genauso wie jene der zwei primären Lipome, ebenfalls zwischen RM36 und RM103 lokalisiert zu sein schienen. Wir schließen aus der beobachteten Häufung der 12q-Bruchpunkte der drei unterschiedlichen soliden Tumorarten, dass der 1,7 Mb DNA-Bereich des langen Arms von Chromosom 12 zwischen RM36 und RM103 ein Multi-Aberrationsbereich ist, den wir als MAR bezeichnen. Genes Chromosom Cancer 12: 296-303 (1995). © 1995 Wiley-Liss, Inc.
EINLEITUNG
Chromosomen-Translokationen mit Beteiligung des Bereichs q13-q15 von Chromosom 12 sind bei einer großen Vielzahl solider Tumoren beobachtet worden (Mitelman, 1991). In Untergruppen von zytogenetisch abnormalen uterinen Leiomyomen (Nilbert und Heim, 1990; Pandis et al., 1991), pleomorphen Speicheldrüsenadenomen (Sandros et al., 1990; Bullerdiek et al., 1993) und gutartigen Fettgewebstumoren (Sreekantaiah et al., 1991) werden 12q13-q15-Aberrationen häufig beobachtet. In einer neuen Untersuchung (Schoenmakers et al., 1994b) haben wir ULCR12, den uterinen Leiomyom-Häufungsbereich von Chromosom 12 -Bruchpunkten identifiziert und molekular charakterisiert. In der vorliegenden Untersuchung konzentrieren wir uns auf die Chromosomenarm 12q-Bruchpunkte im pleomorphen Adenom der Speicheldrüsen, einem gutartigen epithelialen Tumor, der aus den großen oder kleinen Speicheldrüsen stammt. Dies ist die häufigste Art von Speicheldrüsentumoren und macht beinahe 50 % aller Neoplasmen in diesen Organen aus. Ungefähr 85 % dieser Tumoren werden in der Ohrspeicheldrüse gefunden, 10 % in den kleinen Speicheldrüsen und 5 % in der Submandibulardrüse (Seifert et al., 1986). Obwohl viele dieser Adenome einen normalen Karyotypen aufzuweisen scheinen, haben zytogenetische Studien ebenfalls wiederkehrende spezifische Chromosomenanomalien enthüllt (Sandros et al., 1990; Bullerdiek et al., 1993). Neben Chromosom 8-Aberrationen, häufig Translokationen mit einem Bruchpunkt in 8q12, mit, als häufigste Aberration t(3;8)(p21;q12), sind Aberrationen von Chromosom 12, häufig Translokationen unter Beteiligung von 12q13-q15, ebenfalls häufig. Nicht wiederkehrende klonale Abnormalitäten sind ebenfalls beschrieben worden. Die häufige Beteiligung des Bereichs 12q13-q15 an verschiedenen soliden Tumorarten deutet darauf hin, dass dieser chromosomale Bereich Gen(e) beherbergt, die an der Entwicklung dieser Tumoren beteiligt sein könnten. Molekulares Klonieren der Chromosom 12 -Bruchpunkte dieser Tumoren und Charakterisierung der Verbindungsfragmente kann daher zu der Identifizierung eines solchen Gens oder solcher Gene führen.
Basierend auf Fluoreszenz in situ Hybridisierungs (FISH)-Daten haben wir zuvor berichtet, dass die Chromosom 12 -Bruchpunkte bei einer Anzahl von Zelllinien, die von primären pleomorphen Speicheldrüsenadenomen stammen (Kazmierzak et al., 1990; Schoenmakers et al., 1994a) auf dem langen Arm von Chromosom 12 in dem Intervall zwischen den Gen-Orten D12S19 und D12S8 lokalisiert sind (Schoenmakers et al., 1994a). Es ist geschätzt worden, dass dieses DNA-Intervall ungefähr 7 cM beträgt (Keats et al., 1989; Craig et al., 1993). Das Intervall, das die Chromosom 12 -Bruchpunkte dieser Tumorzellen enthält, wurde weiter eingeengt, indem gezeigt wurde, dass alle Bruchpunkte distal zu dem CHOP-Gen kartieren, das direkt durch die charakteristische t(12;16) Translokation in myxoiden Liposarkomen betroffen ist (Aman et al, 1992; Crozat et al., 1993; Rabbitts et al., 1993) und zwischen D12S19 und D12S8 lokalisiert ist. In jüngeren Untersuchungen (Kools et al., 1995) wurde der Chromosom 12-Bruchpunkt der pleomorphen Speicheldrüsenadenomzelllinie Ad-312/SV40 genau in einem DNA-Bereich zwischen den sequenzmarkierten Stellen (STSs) RM110 und RM111 lokalisiert, dessen Größe weniger als 165 kb beträgt. FISH-Beurteilung der Chromosom 12 -Bruchpunkte anderer pleomorpher Speicheldrüsenzelllinien deutete darauf hin, dass sie proximal zu dem einen in Ad-312/SV40, in einer Entfernung von mehr als 800 kb lokalisiert sein müssen (Kools et al, 1995). Diese Ergebnisse zeigten in Richtung einer möglichen Verteilung der Chromosom 12 -Bruchpunkte über einen relativ großen genomischen Bereich auf dem langen Arm des Chromosoms 12.
Hier berichten wir über die physikalische Kartierung der Chromosom 12 -Bruchpunkte in pleomorphen Speicheldrüsenadenomzellen von primären Tumoren sowie etablierten Tumorzelllinien. Die karyotypischen Anomalien, die in den Zellen beobachtet wurden, waren alle unterschiedlich, jedoch war immer der Bereich q13-q15 von Chromosom 12 beteiligt. Unter Verwendung von DNA-Sonden zwischen D12S8 und CHOP, die sequenzmarkierten Stellen (STSs) einer weitreichenden physikalischen Karte eines 6 Mb DNA-Bereichs entsprachen und während Chromosomenwanderungs-Experimenten erhalten wurden, führten wir FISH-Experimente durch und definierten genauer einen größeren Chromosom 12-Bruchpunkthäufungsbereich pleomorpher Speicheldrüsenadenome. Dieser Bruchpunkthäufungsbereich schien mit ULCR12 zu überlappen. Außerdem haben wir getestet, ob 12q13q-15-Bruchpunkte von Lipomen ebenfalls innerhalb desselben Bereiches kartieren könnten wie jene vom pleomorphen Speicheldrüsenadenom und uterinen Leiomyom.
MATERIALIEN UND VERFAHREN
Primäre solide Tumoren und abgeleitete Zelllinien
Primäre solide Tumoren, die pleomorphe Speicheldrüsenadenome, Lipome und uterine Leiomyome enthielten, wurden aus den Universitätskliniken in Leuven, Belgien (Dr. I. De Wever); in Bremen, Deutschland (Dr. R. Chille); in Krefeld, Deutschland (Dr. J. Haubrich) und aus dem pathologischen Institut in Göteborg, Schweden (Dr. G. Stenman) erhalten. Zur Zellkultur und nachfolgenden FISH-Analyse wurden Tumorproben fein zerkleinert, für 4 bis 6 Stunden mit 0,8 % Collagenase (Boehringer, Mannheim, BRD) behandelt und gemäß Routineverfahren weiter für die FISH-Analyse verarbeitet.
Humane Tumorzelllinien, die in dieser Untersuchung verwendet wurden, schlossen die zuvor beschriebenen pleomorphen Speicheldrüsenadenomzelllinien Ad-211/SV40, Ad-248/SV40, Ad-263/SV40, Ad-295/SV40, Ad-302/SV40, Ad-366/SV40 und Ad-386/SV40 (Kazmierczak et al., 1990; Schoenmakers et al., 1994a) und die Lipomzelllinien Li-14/SV40 (Schoenmakers et al., 1994a) und kürzlich entwickelte Li-538/SV40 ein. In diesen Zelllinien gefundene Chromosom 12-Aberrationen sind in Tabelle I aufgeführt. Zellen wurden in TC199 Kulturmedium mit Earle's Salz, ergänzt mit 20 % fetalem Rinderserum, vermehrt. TABELLE 1 Chromosom 12-Aberrationen in primären humanen soliden Tumoren und Zelllinien* Aberration

* Ad, pleomorphes Speicheldrüsenadenom; Li, Lipom; uterines Leiomyom

DNA-Sonden
Im Zusammenhang mit einem humanen Genomprojekts, das sich auf den langen Arm von Chromosom 12 konzentrierte, isolierten wir die Cosmid-Klone cRM33, cRM36, cRM51, cRM69, cRM72, cRM76, cRM98, cRM103 und cRM133 aus der Chromosom 12-spezifisch angeordneten Cosmid-Bibliothek LLNL12NC01 (Montgomery et al., 1993). Weitere Einzelheiten über diese Cosmid-Klone sind in dem Zweiten internationalen Chromosom 12-Workshop (1994) berichtet worden und werden an anderem Ort beschrieben (Kucherlapati et al., 1994). Zusammengefasst wurden anfängliche Screenings unter Verwendung einer PCR-basierten Screeningstrategie durchgeführt (Green und Olson, 1990), gefolgt von Filterhybridisierungsanalyse als abschließender Screeningschritt, wie zuvor beschrieben (Schoenmakers et al, 1994b). Die Cosmid-Klone wurden unter Verwendung von STSs, abgeleitet aus YAC-Klonen, isoliert. STSs wurden bei der Rettung der YAC-Insertenden unter Verwendung einer Verfahrensweise unter Beteiligung von Vectorette-PCR, gefolgt von direkter Festphasen-Fluoreszenzsequenzierung der PCR-Produkte (Geurts et al., 1994) oder aus Inter-Alu-PCR (Nelson et al., 1989) erhalten. Cosmid-Klone wurden gemäß Standardverfahren gezüchtet und gehandhabt (Sambrook et al., 1989).
Der Cosmid-Klon cPK12gter, der auf dem telomeren Bereich des langen Arms von Chromosom 12 kartiert (Kools et al., 1995) wurde als Referenzmarkierungssubstanz verwendet.
Chromosomen-Zubereitungen und Fluoreszenz in situ Hybridisierung
Metaphasen-Spreads der pleomorphen Speicheldrüsenadenomzelllinien oder normaler humaner Lymphozyten wurden wie zuvor beschrieben hergestellt (Schoenmakers et al., 1993). Um die Identität der Chromosomen in den FISH-Experimenten eindeutig festzustellen, wurde die FISH-Analyse nach GTG-Banding derselben Metaphasen-Spreads durchgeführt. GTG-Banding wurde im Wesentlichen wie von Smit et al. (1990) beschrieben durchgeführt. In situ-Hybridisierungen wurden gemäß einem Protokoll durchgeführt, das von Kievits et al. (1990) beschrieben wurde, mit einigen kleinen Änderungen (Kools et al., 1994; Schoenmakers et al., 1994b). Cosmid- und YAC-DNA wurde mit Biotin-11-dUTP (Boehringer Mannheim) oder Biotin-14-dATP (BRL, Gaithersburg) markiert, wie zuvor beschrieben (Schoenmakers et al, 1994b). Proben wurden auf einem Zeiss Axiophot Fluoreszenz-Mikroskop unter Verwendung eines FITC-Filters (Zeiss) analysiert. Ergebnisse wurden auf Scotch (3M) 640 ASA-Film aufgenommen.
ERGEBNISSE
FISH-Kartierung von 12q-Bruchpunkten in Zelllinien vom pleomorphen Speicheldrüsen-adenom
In vorhergehenden Untersuchungen (Schoenmakers et al., 1994a), kartierten wir die Chromosom 12 -Bruchpunkte in einer Anzahl von pleomorphen Adenomen der Speicheldrüsen relativ zu verschiedenen DNA-Markierungssubstanzen und stellten fest, dass diese alle proximal zu Gen-Ort D12S8 und distal zu dem CHOP-Gen lokalisiert waren. Dieser Bereich ist etwas kleiner als der 7 cM-Bereich, der durch die Verbindung der Orte D12S8 und D12S19 umgeben ist (Keats et al., 1989). Unter Verwendung von YAC-Klonierung ist eine weitreichende physikalische/STS-Karte aufgebaut worden, die den größten Teil jenes 7 cM-Bereichs bedeckt, wie kürzlich berichtet wurde (Kucherlapati et al., 1994). Weiterhin sind zahlreiche genomische Klone (Cosmid-Klone) isoliert worden und deren relative Positionen innerhalb dieser Karte bestimmt worden (Kucherlapati et al., 1994). Neun dieser Cosmide, einschließlich cRM33, cRM36, cRM51, cRM69, cRM72, cRM76, cRM98, cRM103 und cRM133, wurden in FISH-Untersuchungen verwendet, um die Positionenden der Chromosom 12 -Bruchpunkte der sieben Zelllinien, die von pleomorphen Adenomen der Speicheldrüsen stammen, festzustellen (Tabelle 1). Die relative Kartierungsreihenfolge dieser neun Cosmid-Klone, die einen genomischen Bereich auf dem langen Arm des Chromosoms 12 von ungefähr 2,8 Mb bedecken, ist in 1 angegeben, und die Ergebnisse der FISH-Untersuchungen mit den unterschiedlichen Cosmid-Sonden sind in derselben Figur schematisch zusammengefasst. Zur Veranschaulichung sind FISH-Ergebnisse, die mit Metaphasenzellen der Zelllinie Ad-295/SV40 unter Verwendung von cRM76 und cRM103 als Sonden erhalten wurden, in 2 gezeigt. Es soll angemerkt werden, dass zur Identifizierung von Chromosomen Pre-FISH-GTG-Banding routinemäßig verwendet wurde. Auf der Basis eines solchen Bandings konnten Hybridisierungssignale schlüssig Chromosomen bekannter Identität zugeordnet werden; dies war von größerer Bedeutung für Fälle mit Kreuz- oder Hintergrund-Hybridisierungssignalen, da diese gelegentlich beobachtet wurden. Wenn GTG-Banding in Kombination mit FISH-Analyse unschlüssige Ergebnisse zeigte, entweder wegen schwacher Hybridisierungssignale oder ziemlich unklarem Banding, wurden FISH-Experimente mit dem Cosmid-Klon cPK12qter (Kools et al., 1995) als Referenzsonde durchgeführt.
FISH-Analyse von Metaphasen-Chromosomen jeder der sieben pleomorphen Speicheldrüsenadenomzelllinien mit Cosmid-cRM103 zeigte, dass dieses Cosmid distal zu den Chromosom 12 -Bruchpunkten aller sieben hier untersuchten Zelllinien kartierte. Metaphasen-Chromosomen von sechs der sieben Zelllinien wurden ebenfalls mit der Sonde cRM69 und, in zwei Fällen, mit cRM51 getestet. Die Ergebnisse der letzteren Experimente waren immer mit jenen, die mit cRM103 erhalten wurden, konsistent. Ähnliche FISH-Analyse mit cRM36 als Sonde zeigte, dass diese Sonde proximal zu allen Bruchpunkten kartierte. Diese Ergebnisse waren immer mit jenen konsistent, die für fünf der sieben Zelllinien in Experimenten unter Verwendung von cRM72 erhalten wurden. Zusammen zeigten die Ergebnisse unserer FISH-Untersuchungen, dass die Chromosom 12 -Bruchpunkte aller sieben Zelllinien zwischen cRM36 und cRM103 kartieren, was einen genomischen Bereich von ungefähr 1,7 Mb überspannt.
Feinkartierung von 12q-Bruchpunkten in Zelllinien, die von pleomorphen Adenomen der Speicheldrüsen abstammen.
Zur nachfolgenden Feinkartierung der Chromosom 12 -Bruchpunkte der sieben pleomorphen Speicheldrüsenadenomzelllinien wurden zusätzliche FISH-Untersuchungen durchgeführt, wie schematisch in 1 zusammengefasst. Die Bruchpunkte der Zelllinien Ad-211/SV40, Ad-295/SV40 und Ad-366/SV40 schienen innerhalb des DNA-Bereichs zwischen cRM76 und cRM133 lokalisiert zu sein, der auf ungefähr 75 kb geschätzt wurde. Die Bruchpunkte der vier anderen Zelllinien wurden in unterschiedlichen Bereichen des 1,7 Mb-Bereichs zwischen cRM36 und cRM103 gefunden. Jener der Zelllinie Ad-248/SV40 in einem DNA-Segment von ungefähr 270 kb zwischen cRM33 und cRM76, jener von Ad-263/SV40 in einem DNA-Segment von ungefähr 1 Mb zwischen cRM98 und cRM103, jener von Ad-302/SV40 in einem DNA-Segment von ungefähr 240 kb zwischen cRM33 und cRM36 und jener von Ad-386/SV40 in einem DNA-Segment von ungefähr 100 kb zwischen cRM98 und cRM133. Als Schlussfolgerung deuteten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Chromosom 12 -Bruchpunkte der meisten (5 von 7) Zelllinien über den 445 kb genomischen Bereich auf dem langen Arm des Chromosoms 12 zwischen cRM33 und cRM98 verteilt sind. Es ist wichtig, bereits hier anzumerken, dass genau für diesen Bereich gezeigt wurde, dass er die Chromosom 12q-Bruchpunkte in Zelllinien enthält, die von primären uterinen Leiomyomen abstammen (siehe 3) und daher ULCR12 genannt wurde (Schoenmakers et al., 1994b). Da dieses Segment des langen Arms von Chromosom 12 an mindestens zwei Arten von soliden Tumoren beteiligt ist (Schoenmakers et al., 1994b; diese Untersuchung) und, wie wir unten zeigen werden, auch an einer dritten soliden Tumorart, werden wir von nun an das DNA-Intervall zwischen cRM36 und cRM103 als MAR (Multi-Aberrationsbereich) bezeichnen.
FISH-Kartierung von 12q-Bruchpunkten in primären pleomorphen Speicheldrüsenadenomen
Unsere FISH-Untersuchungen an Metaphasen-Chromosomen von pleomorphen Adenomen der Speicheldrüsen, die bisher dargestellt wurden, waren auf Zelllinien beschränkt, die von primären Tumoren abgeleitet sind. Obwohl es vernünftig ist, anzunehmen, dass die Chromosom 12 -Bruchpunkte in Zelllinien ähnlich, wenn nicht sogar identisch mit denen in den entsprechenden Tumoren sind, können Unterschiede als Ergebnis der Erstellung von Zelllinien oder nachfolgender Zellkultur nicht vollständig ausgeschlossen werden. Daher haben wir untersucht, ob die Chromosom 12 -Bruchpunkte in drei primären Speicheldrüsenadenomen ebenfalls auf MAR kartierten. Um diese Möglichkeit zu testen, wurde eine Kombination der Cosmid-Klone cRM33 und cRM103 als molekulare Sonde verwendet. In allen drei Fällen umspannte dieser Cosmid-Pool eindeutig die Chromosom 12 -Bruchpunkte (Daten nicht gezeigt), was zeigt, dass diese Bruchpunkte tatsächlich innerhalb MAR lokali siert waren. In einer neuen Untersuchung (Wanschura et al., zur Veröffentlichung eingereicht) wurde berichtet, dass die Chromosom 12 Bruchpunkte von fünf primären uterinen Leiomyomen mit 12q14-15 Aberrationen ebenfalls gehäuft innerhalb des 1,5 Mb DNA-Fragments (zwischen cRM33 und cRM103) gefunden wurden, das dafür bekannt ist, die Bruchpunkte verschiedener Zelllinien zu beherbergen, die von primären uterinen Leiomyomen stammen (schematisch in 3 zusammengefasst). Konsistent mit den Ergebnissen der Bruchpunkt-Kartierungs-Untersuchungen unter Verwendung von Zelllinien weisen die Ergebnisse mit den zwei primären soliden Tumorarten nach, dass die Bruchpunkte der primären Tumorzellen in MAR liegen.
Chromosomensegment 12q13-q15 -Bruchpunkte von Lipomen, die innerhalb MAR kartieren
Um die Möglichkeit zu testen, dass die Chromosom 12 -Bruchpunkte weiterer solider Tumoren mit 12q13-q15-Aberrationen ebenfalls innerhalb MAR kartieren, untersuchten wir zwei Lipomzelllinien durch FISH-Analyse – Li-14/SV40 und Li-538/SV40. Die Chromosom 12-Aberrationen dieser zwei Lipomzelllinien sind in Tabelle 1 angegeben. Als molekulare Sonden wurden Cosmid-Klone cRM33, cRM53, cRM72, cRM76, cRM99, cRM103 und cRM133 verwendet. Die Bruchpunkte von Li-14/SV40 wurden auf das 75 kb DNA-Intervall zwischen RM76 und RM133 kartiert und jene von Li-538/SV40 auf das 90 kbp Intervall zwischen RM76 und RM99 (Daten nicht gezeigt), wie schematisch in 3 gezeigt. Eine ähnliche FISH-Analyse von zwei primären Lipomen unter Verwendung einer Mischung von cRM36 und cRM103 als molekulare Sonde resultierte in einem Hybridisierungsmuster, das zeigte, dass die Mischung von Sonden Sequenzen auf beiden Seiten der Bruchpunkte detektierte. Diese Ergebnisse sind die ersten Hinweise darauf, dass auch in Lipomen Chromosom 12q13-q15 Bruchpunkte auftreten, die innerhalb MAR kartieren. Mehr Lipomfälle sollten untersucht werden, um eine angemessene Interpretation dieser Beobachtung zu ermöglichen.
DISKUSSION
In dieser Untersuchung haben wir die Chromosom 12 -Bruchpunkte dreier primärer pleomorpher Speicheldrüsenadenome sowie von sieben etablierten Zelllinien, die von solchen Tumoren abstammen, kartiert. Alle Bruchpunkte schienen in einem zuvor molekular klonierten und charakterisierten chromosomalen DNA-Segement auf dem langen Arm von Chromosom 12, von ungefähr 1,7 Mb Größe, lokalisiert zu sein, wobei fünf von ihnen in einem DNA-Intervall von weniger als 500 kb angehäuft waren. Der 1,7 Mb DNA-Bereich enthält anscheinend einen Hauptbruchpunkt-Anhäufungsbereich für diese Art von Tumor. In einer vorherigen Untersuchung haben wir die Charakterisierung des Chromosom 12 Bruchpunkts der pleomorphen Speicheldrüsenadenomzelllinie Ad-312/SV40 beschrieben (Kools et al., 1995). Es ist nun bekannt, dass der Bruchpunkt dieser Zelllinie in einer Entfernung von mehr als 2 Mb distal zu diesem hier berichteten Hauptbruchpunkt-Anhäufungsbereich kartiert. Es ist möglich, dass der Ad-312/SV40-Bruchpunkt an anderen pathogenetisch relevanten genetischen Sequenzen beteiligt ist als an jenen, die durch die angehäuften Bruchpunkte betroffen sind. Es sollte jedoch noch nicht die Möglichkeit ausgeschlossen werden, dass alle zwölf 12q13-q15-Bruchpunkte in pleomorphen Speicheldrüsenadenomen, die bisher kartiert wurden, zu derselben Kategorie gehören und über einen relativ großen DNA-Bereich dieses Chromosoms verteilt sind, was an die 11q13-Bruchpunkte in B-Zell-Malignitäten erinnert (Raynaud et al., 1993). Eine noch genauere Lokalisierung der unterschiedlichen Bruchpunkte könnte mehr Licht auf diese Angelegenheit werfen.
Von Bedeutung ist die Beobachtung, dass das DNA-Segement, das die angehäuften 12q-Bruchpunkte pleomorpher Speicheldrüsenadenome beherbergt, mit dem DNA-Bereich zusammenzufallen scheint, der kürzlich als uteriner Leiomyom-Anhäufungsbereich von Chromosom 12 -Bruchpunkten definiert wurde, bekannt als ULCR12 (Schoenmakers et al., 1994b). Von weiterem Interesse ist die Tatsache, dass dieser Bereich des Chromosoms 12 ebenfalls Bruchpunkte primärer Lipome und Lipomzelllinien, die von primären Tumoren mit 12q13-q15-Aberrationen stammen, beherbergt. Zusammen zeigen die Ergebnisse all dieser Untersuchungen nun deutlich, dass Chromosom 12 -Bruchpunkte dreier unter schiedlicher solider Tumorarten in demselben 1,7 Mb Genombereich auf dem langen Arm von Chromosom 12 kartieren, was diesen Bereich als Multi-Aberrationsbereich etabliert. Um diese Eigenschaft wiederzugeben, haben wir dieses DNA-Segment MAR genannt.
Genetische Aberrationen unter Beteiligung des chromosomalen Bereichs 12q13-q15 sind durch viele zytogenetische Untersuchungen an einer Vielzahl solider Tumoren außer den drei bereits erwähnten in Zusammenhang gebracht worden. Die Beteiligung von 12q13-q15 ist ebenfalls für endometriale Polypen berichtet worden (Walter et al., 1989; Vanni et al., 1993), Klarzellensarkome, die durch wiederkehrende t(12;22)(q13;q13) gekennzeichnet sind (Fletcher, 1992; Reeves et al., 1992; Rodrigurez et al., 1992), eine Untergruppe von Rhabdomyosarkom (Roberts et al., 1992) und Hämangiopericytom (Mandahl et al., 1993a), Chondromtumoren (Mandahl et al., 1989; Bridge et al., 1992; Hirabayashi et al., 1992; Mandahl et al., 1993b) und Hamartome der Lunge (Dal Cin et al., 1993). Schließlich sind mehrere Fallberichte von soliden Tumoren mit Beteiligung des Chromosomenbereichs 12q13-q15 veröffentlicht worden – z. B. Tumoren der Brust (Birdsal et al., 1992; Rohen et al., 1993), diffuse Astrocytome (Jenkins et al., 1989) und ein Riesenzellentumor des Knochens (Noguera et al., 1989). Auf der Basis der Ergebnisse zytogenetischer Studien konnten keine Vorhersagen über die relative Verteilung der Bruchpunkte dieser Tumortypen getroffen werden. Im Lichte der Ergebnisse der vorliegenden Untersuchung wäre es interessant zu sehen, ob die Bruchpunkte irgendeines dieser soliden Tumoren ebenfalls innerhalb von oder nahe MAR kartieren. Die nun verfügbaren verschiedenen Cosmid-Klone stellen die Mittel bereit, um dies leicht zu testen.
Die Beobachtung, dass 12q-Bruchpunkte mindestens dreier unterschiedlicher Arten von soliden Tumoren in demselben DNA-Bereich kartieren, ist verblüffend, da sie auf die Möglichkeit hindeuten könnte, dass dieselben genetischen Sequenzen in MAR pathogenetisch relevant für Tumorentwicklungen in unterschiedlichen Geweben sind. Falls dies so sein sollte, wäre es verlockend zu spekulieren, dass das Gen oder die Gene, die durch die genetischen Aberrationen betroffen sind, an der Wachstumsregulierung beteiligt sein könnten. Andererseits kann man noch nicht die Möglichkeit ausschließen, dass genetische Sequenzen in MAR nicht pathogenetisch relevant sind, da die beobachtete Anhäufung genetischer Aberrationen in MAR einfach eine genetische Instabilität dieses Bereiches widerspiegeln könnte, was in verschiedenen soliden Tumoren offensichtlich wird. Um mehr Einblick in diese Angelegenheit zu erhalten, sollten die in MAR liegenden Gene identifiziert und charakterisiert werden, und dies kann durch verschiedene Herangehensweisen unter Verwendung unterschiedlicher Techniken erreicht werden (Parrish und Nelson, 1993).
DANKSAGUNGEN
Die konstruktive Unterstützung des leitenden Direktors G. Everaerts wird sehr geschätzt. Die Autoren möchten P. Dal Cin, J. Haubrich, R. Hille, G. Stenman und I. De Wever für das Bereitstellen der soliden Tumorproben danken, die in diesem Bericht untersucht wurden; C. Huysmans, E. Meyen, K. Meyer-Bolte, R. Mols und M. Willems für hervorragende technische Unterstützung; und M. Leys für die Bebilderung. Diese Arbeit wurde teilweise durch die EU durch das Biomed 1 Programm "Molekulare Zytogenetik solider Tumoren", das "Geconcerteerde Onderzoekacties 1992-1996", den Nationalen Fond für wissenschafliche Forschung (NFWO; Kom op tegen Kanker), das "ASLK-Programma voor Kankeronderzoek",das "Schwerpunktprogramm: Molekulare und Klassische Tumorcytogenetik" der Deutschen Forschungsgemeinschaft und die Tönjes-Vagt-Stiftung unterstützt. Dieser Text stellt Ergebnisse des belgischen Programms zu Anziehungspunkten zwischen Universitäten dar, das durch den belgischen Staat, Büro des Premierministers, Forschungspolitikprogrammatik initiiert wurde. Die wissenschaftliche Verantwortung wird durch die Autoren übernommen. J.W.M. Geurts ist ein "Aspirant" für den Nationalen Fond für wissenschaftliche Forschung (NFWO; Kom op tegen Kanker).
Literaturnachweise

Aman P, Ron D, Mandahl N, Fioretos T, Heim S, Arheden K, Willen H, Rydholm A, Mitelman F (1992) Rearrangement of the transcription factor gene CHOP in myxoid liposarcomas with t(12;16)(q13;p11). Genes Chromosom Cancer 5: 278-285.
Birdsal SH, MacLennan KA, Gusterson, BA (1992) t(6;12)(q23;q13) and t(10;16)(q22;p11) in a phyllodes tumor of the breast. Cancer Genet Cytogenet 60: 74-77.
Bridge JA, Persons DL, Neff JR, Bhatia P (1992) Clonal karyotypic aberrations in enchondroma. Cancer Detect Prev 16: 215-219.
Bullerdiek J, Wobst G, Meyer-Bolte K, Chilla R, Haubrich J, Thode B, Bartnitzke S (1993): Cytogenetic subtyping of 220 salivary gland pleomorphic adenomas: correlation to occurrence, histological subtype, and in vitro cellular behavior. Cancer Genet Cytogenet 65: 27-31.
Craig IW, Gedde-Dahl T, Gemmill R, Kucherlapati R (1993) Report of the committee on the genetic constitution of chromosome 12. Genome Prior Rep 1: 402-418.
Crozat A, Aman P, Mandahl N, Ron D (1993) Fusion of CHOP to a novel RNA-binding protein in human myxoid liposarcoma. Nature 363: 640-644.
Dal ein P, Kools P, De Jonge I, Moerman Ph, Van de Ven W, Van den Berghe H (1993) Rearrangement of 12q14-15 in pulmonary chondroid hamartoma. Genes Chromosom Cancer 8: 131-133.
Fletcher JA (1992) Translocation (12;22)(q13-14?q12) is a nonrandom aberration in softtissue clear-cell sarcoma. Genes Chromosom Cancer 5: 184.
Geurts JMW, Schoenmakers HFPM, Mols R, Van de Ven WJM (1994) An improved procedure to quickly isolate and sequence the termini of DNA inserts of yeast artificial chromosomes. Meth Mol Cell Biol 4: 257-265.
Green ED, Olson MV (1990) Systematic screening of yeast artificial-chrorosome libraries using the polymerase chain reaction. Proc Natl Acad Sei USA 87: 1213-1217.
Hirabayashi Y, Yoshida MA, Ikeuchi T, Ishida T, Kojima T, Higaki S, Machinaini R, Tonomura A (1992) Chromosome rearrangements at 12q13 in two cases of chondrosarcomas. Cancer Genet Cytogenet 60: 35-40.
Jenkins RB, Kimmell DW, Moertel CA, Schulz CA, Menezes RM, Scheihauer B, Kelly PJ, Dewald GW (1989) Recurrent cytogenetic abnormalities in 80 gliomas. Cytogenet Cell Genet 51: 1019.
Kazmierczak B, Bartnitzke S, Hartl M, Bullerdiek J (1990): In vitro transformation by the SV40 "early region" of cells from a human benign salivary gland tumour with a 12q13→q15 rearrangement. Cytogenet Cell Genet 53: 37-39.
Keats B, Ott J, Conneally M (1989) Report of the committee on linkage and gene order. Cytogenet Cell Genet 51: 459-502.
Kievits T, Dauwerse JG, Wiegant J, Devilee P, Breuning MH, Cornelisse CJ, van Omraen G, Pearson PL (1990) Rapid subchromosomal localization of cosmids by nonradioactive in situ hybridization. cytogenet Cell Genet 53: 134-136.
Kools PFJ, Roebroek AJM, Van de Velde HJK, Marynen P, Bullerdiek J, Van de Ven WJM (1993): Regional mapping of the human NSP gene to chromosome 14q21-q22 by fluorescence in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet 66: 48-50.
Kools PFJ, Wanschura S, Schoenmakers EFPM, Geurts JWM, Mols R, Kazmierczak B, Bullerdiek J, Van den Berghe H, Van de Ven WJM (1995) Identification of the chromosome 12 translocation breakpoint region of a pleomorphic salivary gland adenoma with t(1;12)(p22;q15) as the sole cytogenetic abnormality. Cancer Genet Cytogenet, In press, 1995.
Kucherlapati R, Craig I, Marynen P (1994) Report of the second international Workshop on human chromosome 12 mapping 1994. Cytogenet Cell Genet 67: 245-276.
Mandahl N, Heim S, Arheden K, Rydholm A, Willen H, Mitelman F (1989) Chromosomal rearrangements in chondromatous tumors. Cancer 65: 242-248.
Mandahl N, Orndal C, Heim S, Willen H, Rydholm A, Bauer HCF, Mitelman F (1993a) Aberrations of chromosome segment 12q13-15 characterize a subgroup of hemangiopericytomas. Cancer 71: 3009-3013.
Mandahl N, Willen H, Rydholm A, Mitelman F (1993b) Rearrangement of band q13 on both chromosomes 12 in a periosteal chondroma. Genes Chrom Cancer 6: 121-123.
Mitelman F (1991): Catalog of Chromosome Aberrations in Cancer. 4. Aufl., New York, Alan R. Liss.
Montgomery KT, LeBlanc JM, Tsai P, McNinch JS, Ward DC, De Jong PJ, Kucherlapati R, Krauter KS (1993) Characterization of two chromosome 12 cosmid libraries and development of STSs from cosmids mapped by FISH. Genomics 17: 682-693.
Nelson DL, Ledbetter SA, Corbo L, Victoria MF, Ramirez-Solis R, Webster TD, Ledbetter DH, Caskey CT (1989) Alu polymerase chain reaction: A method for rapid isolation of human-specific sequences from complex DNA sources. Proc Natl Acad Sei USA 86: 6686-6690.
Nilbert M, Heim S (1990) Uterine leiomyoma cytogenetics. Genes Chromosom Cancer 2: 3-13.
Noguera R, Llombart-Bosch A, Lopez-Gines C, Carda C, Fernandez C1 (1989) Giant-cell tumor of bone, stage II, displaying translocation t(12;19)(qi3;q13). Virchows Archiv A Pathol Anat 415: 377-382.
Pandis N, Heim S, Bardi G, Floderus U-M, Willen H, Mandahl N, Mitelman F (1991) Chromosome analysis of 96 uterine leiomyomas. Cancer Genet Cytogenet 55: 11-18.
Parrish JE, Nelson DL (1993) Methods for finding genes a major rate-limiting step in positional cloning. GAT 10: 29-41.
Rabbitts TH, Forster A, Larson R, Nathan P (1993) Fusion of the dominant negative transcription regulator CHOP with a novel gene FUS by translocation t(12;16) in malignant liposarcoma. Nature Genet 4: 175-180.
Raynaud SD, Bekri S, Leroux D, Grosgeorge J, Klein B, Bastard C, Gaudray P, Simon MP (1993) Expanded range of 11q13 breakpoints with differing patterns of cyclin D1 expression in B-cell malignancies. Genes Chromosom Cancer 8: 80-87.
Reeves BR, Fletcher CDM, Gusterson BA (1992) Translocation t(12;22)(q13;q13) is a nonrandom rearrangement in clear cell sarcoma. Cancer Genet Cytogenet 64: 101-103.
Roberts P, Browne CF, Lewis IJ, Bailey CC, Spiee RD, Williams J, Batcup G (1992) 12q13 Abnormality in rhabdomyosarcoma. A nonrandom Occurrence? Cancer Genet Cytogenet 60: 135-140.
Rodriguez E, Sreekantaiah C, Reuter VE, Motzer RJ, Chaganti RSK (1992) t(12;22) (q13;q13) and trisomy 8 are nonrandor aberrations in clear-cell sarcoma. Cancer Genet Cytogenet 64: 107-110.
Rohen C, Bonk U, Staats B, Bartnizke S, Bullerdiek J (1993) Two human breast tumors with translocations involving 12q13-15 as the sole cytogenetic abnormality. Cancer Genet Cytogenet 69: 68-71.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
Sandros J, Stenman G, Mark J (1990): Cytogenetic and molecular observations in human and experimental salivary gland tumours. Cancer Genet Cytogenet 44: 153-167.
Schoenmakers HFPM, Kools PFJ, Kazmierczak B, Bullerdiek J, Claussen U, Horsthemke B, Van den Berghe H, Van de Ven WJM (1993) Isolation of a somatic cell hybrid retaining the der (16) t(12;16)(q13;p11.2) from a myxoid liposarcoma cell line. Cell Genet Cytogenet 62: 159-161.
Schoenmakers HFPM, Kools PFJ, Mols R, Kazmierczak B, Bartnitzke S, Bullerdiek J, Dal ein P, De Jong PJ, Van den Berghe H, Van de Ven WJM (1994a) Physical mapping of chromosome 12q breakpoints in lipoma, pleomorphic salivary gland adenoma, uterine leiomyoma, and myxoid liposarcoma. Genomics 20: 210-222.
Schoenmakers HFPM, Mols R, Wanschura S, Kools PFJ, Geurts JMW, Bartnitzke S, Bullerdiek J, Van den Berghe H, Van de Ven WJM (1994b) Identification, molecular cloning and characterization of the chromosome 12 breakpoint cluster region of uterine leiomyomas. Genes Chromosom Cancer 11: 106-118.
Second International Chromosome 12 Workshop, New Haven, CT, USA, June 20-22, 1994.
Seifert G, Miehlke A, Haubrich J, Chilla R (1986): Diseases of the salivary glands. Pathology. Diagnosis. Treatment. Facial nerve surgery. Übersetzt von P.M. Stell. Thieme, Stuttgart, New York, pp 182-194.
Smit VTHBM, Wessels JW, Mollevanger P, Schrier PI, Raap AK, Beverstock GC, Cornelisse CJ (1990) Combined GTG-banding and nonradioactive in situ hybridization improves characterization of complex karyotypes. Cytogenet Cell Genet 54: 20-23.
Sreekantaiah C, Leong SLP, Karakousis CP, McGee DL, Rappaport WD, Villar HV, Neal D, Fleming S, Wankel A, Herrington PN, Cannona R, Sandberg AA (1991) Cytogenetic profile of 109 lipomas. Cancer Res 51: 422-433.
Vanni R, Dal ein P, Marras S, Moerman Ph, Andria M, Valdes E, Deprest J, und Van den Berghe H (1993) Endometrial polyp: Another benign tumor characterized by 12q13-15 changes. Cancer Genet Cytogenet 68: 32-33.
Walter TA, Xuan Fan S, Medchill MT, Berger CS, Decker H-JH, Sandberg AA (1989) Inv(12)(p11.2q13) in an endometrial polyp. Cancer Genet Cytogenet 41: 99-103. Wanschura S, Beige G, Stenman G, Kools P, Dal Chin P, Schoenmakers E, Huysmans C, Bartnizke S, Van de Ven W, und Bullerdiek J (zur Veröffentlichung eingereicht). Mapping of the translocation breakpoints of primary pleomorphic adenomas and lipomas within a common region of chromosome 12.

LEGENDEN DER FIGUREN VON ANHANG 1
1
Schematische Darstellung von FISH-Kartierungsdaten, die für die sieben pleomorphen Speicheldrüsenadenomzelllinien erhalten wurden, die in dieser Untersuchung getestet wurden. Cosmid-Klone, die als Sonden in den FISH-Kartierungsuntersuchungen verwendet wurden, kartieren an sequenzmarkierten Stellen, die aus überlappenden YAC-Klonen erhalten wurden. Sie sind nach den Akronymen der STSs, wie in den Kästen gezeigt, benannt, und ihre relative Anordnung ist dargestellt. Das DNA-Intervall zwischen RM69 und RM72 wird auf ungefähr 2,8 Mb geschätzt. Die durchgezogenen Linien zeigen DNA-Intervalle, in denen die Bruchpunkte der verschiedenen Zelllinien lokalisiert sind. Die Punkte zeigen FISH-Experimente an, die an Metaphasen-Chromosomen der verschiedenen Zelllinien unter Verwendung eines Cosmid-Klons durchgeführt wurden, welcher der STS entspricht, die über diesen als Molekularsonde gezeigt ist. Die relativen Positionen von MAR und ULCR12 sind in dem unteren Teil der Figur gezeigt. Ad, pleomorphes Speicheldrüsenadenom; MAR, Multi-Aberrationsbereich; ULCR12, uteriner Leiomyom-Häufungsbereich von Chromosom 12 -Bruchpunkten.
2

a: Teil-Karyotyp von Ad-295/SV40, welcher der (8), der (12), der (18) und die entsprechenden normalen Chromosomen zeigt.
b: FISH-Analyse von Metaphasen-Chromosomen von Ad-295/SV40-Zellen unter Verwendung von DNA von Cosmid-Klon cRM76 als Molekularsonde. Hybridisierungssignale auf normalem Chromosom 12 (Pfeil) und der (12) (Pfeilspitze).
c: GTG-Banding-Muster von Metaphasen-Chromosomen von Ad-295/SV40, gezeigt in b.
d: FISH-Analyse von Metaphasen-Chromosomen von Ad-295/SV40-Zellen unter Verwendung von DNA von Cosmid-Klon cRM103 als Molekularsonde. Hybridisierungssignale auf normalem Chromosom 12 (Pfeil) und der (18) (Pfeilspitze).

3
Schematische Darstellung von Chromosom 12-Bruchpunkt-Kartierungsdaten, die für primäre pleomorphe Speicheldrüsenadenome, uterine Leiomyome und Lipome sowie von solchen soliden Tumoren abgeleitete Zelllinien erhalten wurden. Die Ergebnisse werden mit Daten für primäre uterine Leiomyome (Wanschura et al., zur Veröffentlichung eingereicht) und von solchen Tumoren abgeleitete Zelllinien (Schoenmakers et al., 1994b) verglichen. Cosmid-Klone, die als Sonden in den FISH-Kartierungsuntersuchungen verwendet wurden, entsprechen sequenzmarkierten Stellen, die aus überlappenden YAC-Klonen erhalten wurden. Cosmid-Klone wurden nach den Akronymen der STSs benannt, wie in den Kästen gezeigt, und ihre relative Ordnung ist wie dargestellt. Die geschätzten Größen der DNA-Intervalle zwischen STSs sind angegeben. Ad, pleomorphes Speicheldrüsenadenom; Li, Lipom; LM, uterines Leiomyom.
ANHANG 2

Vom Zentrum für Humangenetik (P.F.J.K., E.F.P.M.S., J.W.M.G., R.M., H.V.D.B., W.J.M.V.D.V), Universität Leuven, Leuven, Belgien und dem Zentrum für Humangenetik (S.W., B.K., J.B.), Universität Bremen, Bremen, Deutschland.
P.F.J. Kools und Sylke Wanschura haben in gleicher Weise zu dieser Untersuchung beigetragen und müssen als gemeinsame Erstautoren betrachtet werden.
Anfragen nach Kopien sind an Dr. Wim. J.M. Van de Ven, Center for Human Genetics, Universität Leuven, Herestraat 49, B-3000, Leuven, Belgien zu richten.
Eingegangen am 13. April 1994; angenommen am 6. Juli 1994.

LEITARTIKEL
Identifizierung des Chromosom 12-Translokationsbruchpunktbereichs eines pleomorphen Speicheldrüsenadenoms mit t(1;12)(p22;q15) als einzige zytogenetische Abnormalität Patrik F.J. Kools, Sylke Wanschura, Eric F.P.M. Schoenmakers, Jan W.M. Geurts, Raf Mols, Bernd Kazmierczak, Jörn Bullerdiek, Herman Van den Berghe und Wim J. Van de Ven.
ZUSAMMENFASSUNG
Zelllinie Ad-312/SV40, die von einem primären pleomorphen Speicheldrüsenadenom mit t(1;12)(p22;q15) abgeleitet wurde, wurde in Fluoreszenz in situ Hybridisierungs-(FISH)-Analyse verwendet, um ihren Translokations-Bruchpunktbereich auf Chromosom 12 zu charakterisieren. Die Ergebnisse vorheriger Untersuchungen haben darauf hingedeutet, dass der Chromosom 12-Bruchpunkt in Ad-312/SV40 proximal zu dem Gen-Ort D12S8 und distal zu dem CHOP-Gen lokalisiert ist. Wir beschreiben hier zwei teilweise überlappende künstliche Hefechromosom (YAC) Klone, Y4854 (500 kbp) und Y9091 (460 kbp), die wir in dem Zusammenhang mit einem Chromosomenwanderungsprojekt mit D21S8 und CHOP als Ausgangspunkte isolierten. Anschließend haben wir Cosmid-Klone isoliert, die verschiedenen sequenzmarkierten Stellen (STSs) entsprechen, die innerhalb der Inserts dieser YAC-Klone kartieren. Diese umfassten cRM51, cRM69, cRM85, cRM90, cRM91, cRM110 und cRM111.
Wir präsentieren eine zusammengesetzte weitreichende Restriktionskarte, welche die Inserts dieser beiden YAC-Klone umgibt und zeigen durch FISH-Analyse, dass beide YACs den Chromosom 12-Bruchpunkt, der in Ad-312/SV40-Zellen vorhanden ist, überspannen. In FISH-Untersuchungen schienen die Cosmid-Klone cRM85, cRM90 und cRM111 distal zu dem Chromosom 12 Bruchpunkt zu kartieren, während gefunden wurde, dass die Cosmid-Klone cRM51, cRM69, cRM91 und cRM110 proximal zu ihm kartierten. Diese Ergebnisse ordnen den Chromosom 12-Bruchpunkt in Ad-312/SV40 einem DNA-Bereich von weniger als 165 kbp zu. Die FISH-Beurteilung der Chromosom 12 -Bruchpunkte in fünf anderen pleomorphen Speicheldrüsenadenomzelllinien deutete darauf hin, dass diese proximal zu dem einen in Ad-312/SV40, in einem Abstand von mehr als 0,9 Mb von STS RM91 lokalisiert sind. Während diese Ergebnisse einen potenziell kritischen Bereich auf Chromosom 12 genau lokalisieren, stellen sie außerdem einen Hinweis auf die mögliche Beteiligung von Chromosom 12q13-q15-Sequenzen, die anderswo lokalisiert sind, dar.
EINLEITUNG
Das pleomorphe Speicheldrüsenadenom stellt einen gutartigen Epitheltumor dar, der aus den großen und kleinen Speicheldrüsen stammt. Er ist die häufigste Art von Speicheldrüsentumoren und macht beinahe 50 % aller Neoplasmen in diesen Organen aus; 85 % der Tumore werden in der Ohrspeicheldrüse gefunden, 10 % in den kleinen Speicheldrüsen und 5 % in der Submandibulardrüse [1]. Ungefähr 50 % dieser Adenome scheinen einen normalen Karyotyp zu haben, aber zytogenetische Studien haben ebenfalls sich wiederholende spezifische Chromosomenanomalien enthüllt [2, 3]. Häufig beobachtete Anomalien umfassen Aberrationen von Chromosom 8, üblicherweise unter Beteiligung des 8q12-q13-Bereichs, wobei die häufigste Aberration t(3;8)(p21;q12) ist, und Aberrationen von Chromosom 12, üblicherweise Translokationen mit Beteiligung des Bereichs 12q13-q15. Nicht wiederkehrende klonale Chromosomenabnomalitäten sind ebenfalls berichtet worden. Das hochspezifische Muster von Chromosomenumordnungen mit konsistenten Bruchpunkten bei 8q12-q13 und 12q13-q15 deutet darauf hin, dass diese chromosomalen Bereiche Gene beherbergen, die an der Entwicklung dieser Tumoren beteiligt sein könnten. Molekulare Klonierung der Chromosomenbruchpunkte und Charakterisierung ihrer Verbindungsfragmente kann zu der Identifizierung von pathogenetisch relevanten Genen führen. Gegenwärtig sind noch nicht solche Molekulardaten für diese Tumoren berichtet worden.
Auf Basis von Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)-Daten wurde kürzlich gezeigt, dass die Chromsom 12 -Bruchpunkte in sechs pleomorphen Speicheldrüsenadenomzelllinien im Bereich 12q13-q15, genauer in dem Genomintervall zwischen den Gen-Orten D12S19 und D12S8 kartieren [4, 5]. Für die geschlechtsgemittelte genetische Größe dieses genomischen DNA-Intervalls wurde bei HGM107 cM berichtet [6]. Wir berichteten ebenfalls, dass die Chromosom 12 -Bruchpunkte in Speicheldrüsenadenomen distal zu dem CHOP-Gen kartieren [5], was eine frühere Untersuchung unterstützt, die darauf hindeutet, dass die 12q13-q15 Translokationsbruchpunkte in pleomorphen Speicheldrüsenadenomen sich von jenen in myoxiden Liposarkomen unterscheiden [7]. Hier berichten wir über die physikalische Kartierung des Chromosom 12-Bruchpunkts in der pleomorphen Speicheldrüsenadenomzelllinie Ad-312/SV40, die ein t(1;12)(p22;q15) als einzige zytogenetische Abnormalität trägt.
MATERIALIEN UND VERFAHREN
Tumorzelllinien
In dieser Untersuchung verwendete Humantumorzelllinien umfassten die zuvor beschriebenen pleomorphen Speicheldrüsenadenomzelllinien Ad-248/SV40, Ad-263/SV40, Ad-295/SV40, Ad-302/SV40, Ad-312/SV40 und Ad-366/SV40 [5, 8]. Zellen wurden in TC199 Kulturmedium mit Earle's Salzen, ergänzt mit 20 % fetalem Rinderserum kultiviert. Ändere in dieser Untersuchung verwendete Zelllinien umfassten den somatischen Zellhybrid PK89-12, der Chromosom 12 als einziges menschliches Chromosom in einem genetischen Hamsterhintergrund enthält [9], und den somatischen Zellhybrid LIS-3/SV40/A9-B4 [4]. Die letztere Zelllinie wurde bei Fusion der myxoiden Liposarkomzelllinie LIS-3/SV40, welche die spezifische t(12;16) (q13;p11.2) trägt, mit Maus-A9-Zellen erhalten. Es wurde zuvor gezeigt, dass dieser somatische Zellhybride der (16), aber weder der (12) noch das normale Chromosom 12 enthält [4]. PK89-12 und LIS-3/SV40/A9-B4-Zellen wurden in DME-F12-Medium ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum kultiviert. Die Zelllinien wurden durch zytogenetische Standardtechniken in regelmäßigen Abständen analysiert.
Isolation von YAC- und Cosmid-Klonen
Im Zusammenhang mit Humangenomkartierungsuntersuchungen, die ausführlich an anderem Ort beschrieben werden (Schoenmakers et al., in Vorbereitung), isolierten wir YAC-Klone Y4854 und Y9091 aus der CEPH YAC-Bibliothek erster Generation [10] und Cosmid-Klone cRM51, cRM69, cRM85, cRM90, cRM91, cRM103, cRM110 und cRM111 aus der Chromosom 12-spezifischen angeordneten Cosmid-Bibliothek LLNLNC01 [11]. YAC- und Cosmid-Klone wurden wie zuvor beschrieben isoliert [5]. Anfängliche Screenings der YAC- sowie der Cosmid-Bibliothek wurden unter Verwendung einer Screening-Strategie durchgeführt, welche die polymerase Kettenreaktion (PCR) umfasste [12]. Filterhybridisierungsanalyse wurde als abschließender Screeningschritt verwendet, wie zuvor beschrieben [5]. Cosmid-Klone wurden unter Verwendung von STSs isoliert, und jene, die STSs innerhalb der Inserts der YAC-Klone Y4854 und Y9091 entsprechen, sind in 1 angegeben. STSs wurden mittels Rettung von YAC-Insert-Endsequenzen unter Verwendung eines Vectorette-PCR-Verfahrens [13] oder Alu-PCR [14, 15] erhalten. PCR-Produkte wurden direkt mittels Festphasen-Fluoreszenz-Sequenzierung sequenziert. Cosmid-Klone wurden gemäß Standardverfahren kultiviert und gehandhabt [16]. YAC-Klone wurden durch gepulste Feldgelelektrophorese [17], Restriktionskartierung und Hybridisierung, wie zuvor beschrieben [5], charakterisiert.
Chromosomenherstellungen und Fluoreszenz in situ Hybridisierung
Zellen aus den pleomorphen Speicheldrüsenadenom-Tumorzelllinien wurden mit Colcemid (0,04 μg/ml) für 30 Minuten behandelt und dann gemäß Routineverfahren geerntet. Metaphasen-Spreads der Tumorzellen wurden wie zuvor beschrieben hergestellt [4]. Um die Identitiät der Chromosomen in den FISH-Experimenten festzulegen, wurde die FISH- Analyse nach G-Banding derselben Metaphasen-Spreads durchgeführt. G-Banding wurde im Wesentlichen wie von Smit et al. beschrieben durchgeführt [18]. In situ Hybridisierungen wurden gemäß einem von Kievits et al. beschriebenen Protokoll [19] mit einigen kleineren Veränderungen [5, 20] durchgeführt. Cosmid- und YAC-DNA wurde mit Biotin-11-dUTP (Boehringer Mannheim) oder Biotin-l4-dATP (BRL, Gaithersburg) wie früher be schrieben markiert [5]. Chromosomen wurden mit Propidiumiodid gegengefärbt und auf einem Zeiss Axiophot Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung eines FITC-Filters (Zeiss) analysiert. Die Ergebnisse wurden auf Scotch (3M) 640 ASA Film aufgenommen.
ERGEBNISSE
Isolierung und Charakterisierung von YAC-Klonen, die den Chromosom 12-Bruchpunkt der pleomorphen Speicheldrüsenadenomzelllinie Ad-312/SV40 überspannen
In vorherigen Untersuchungen [5] haben wir die Chromosom 12 -Bruchpunkte von sechs pleomorphen Speicheldrüsenadenomzelllinien proximal zu dem Gen-Ort D12S8 und distal zu CHOP kartiert. Das DNA-Intervall zwischen diesen Orten ist etwas kleiner als 7 cM (geschätzte Entfernung zwischen den Orten D12S8 und D12S19 [6]), aber immer noch beachtlich groß. Um den Translokationsbruchpunkt von Ad-312/SV40 molekular zu definieren, haben wir Humangenom-Kartierungsuntersuchungen an dem DNA-Intervall zwischen dem Ort D12S8 und dem CHOP-Gen durchgeführt. Bei dem Verfahren der direktionalen Chromosomenwanderung beginnend von D12S8 und dem CHOP-Gen erhielten wir überlappende YAC-Klone Y9091 und Y4854. Das DNA-Insert von Y9091 schien 460 kbp zu betragen und jenes von Y4854 500 kbp. Darüber hinaus schien das DNA-Insert jedes YAC-Klons den Chromosom 12-Bruchpunkt von Ad-312/SV40 zu überspannen, wie wir unten zeigen werden. Eine weitreichende Restriktionskarte der Inserts dieser YAC-Klone wurde unter Verwendung von gepulster Feldgelelektrophorese und Hybridisierungsanalyse erstellt (1). Auf der Basis von STS-Gehaltkartierung und Southern Blot-Analyse schienen die Inserts der YAC-Klone Y9091 und Y4854, wie in 1 gezeigt, zu überlappen. Die getesteten STSs entsprechen Endsequenzen anderer überlappender YAC-Klone, die hier nicht gezeigt sind, oder Sequenzen, die mittels Inter-Alu-PCR erhalten wurden.
Von diesen repräsentieren RM90 und RM91 solche Endklon-STSs von YAC Y9091 und RM48 und RM54 von Y4854, während RM110 und EM111 STSs repräsentieren, die von Inter-Alu-PCR stammen. Für eine Anzahl von STSs, die innerhalb der Inserts der YAC-Klone Y4854 und Y9091 kartieren, wurden entsprechende Cosmid-Klone für die Verwendung in FISH-Analyse isoliert, z. B. cRM51, cRM69, cRM85, cRM90, cRM91, cRM110 und cRM111.
Die Inserts der zwei überlappenden YAC-Klone sind am wahrscheinlichsten nicht chimär, was aus den folgenden Beobachtungen abgeleitet wurde. FISH-Analyse von Metaphasen-Chromosomen von normalen menschlichen Lymphozyten mit Y4854 oder Y9091-DNA als Molekularsonde zeigten Hybridisierungssignale nur in dem Chromosomenbereich 12q13-q15. Für Y9091 wurde dies weiter durch Beobachtungen bestätigt, die in FISH-Untersuchungen erfolgten, in denen Cosmid-Klone cRM90 oder cRM91 als Sonde verwendet wurden; das DNA-Insert jedes dieser beiden Cosmide entspricht den alternativen Endsequenzen des YAC-Klons Y9091. Schließlich schienen die Endsequenz-STSs von Y9091 auf dem Chromosom 12 und distal zu dem CHOP-Gen zu kartieren, was durch PCR-Analyse auf PK89-12-DNA ermittelt wurde, die das menschliche Chromosom 12 als einziges menschliches Chromosom in einen genetischen Hamsterhintergrund enthält, und LIS-3/SV40/A9-B4-DNA, von der zuvor gezeigt wurde, dass sie der (16), von der spezifischen t(12;16) von myxoidem Liposarkom, aber weder der (12) noch das normale Chromosom 12 enthält [4]. Aus den Chromosomenwanderungsuntersuchungen schlossen wir, dass die überlappenden Inserts der zwei YAC-Klone einen DNA-Bereich von ungefähr 640 kbp darstellen, der auf Chromosom 12q zwischen D12S8 und CHOP liegt. Da die 640 kbp zusammengesetzte weitreichenden Restriktionskarte des YAC-Kontigs mit mindestens doppelter Abdeckung des gesamten Bereichs hergestellt wurde, ist es nicht unvernünftig anzunehmen, dass der 640 kbp-Bereich mit der chromosomalen DNA angrenzend ist, obwohl Mikrodeletionen an diesem Punkt nicht ausgeschlossen werden können.
Chromosomenwanderung wurde routinemäßig durch FISH-Kartierung von YAC-Klonen und/oder Cosmid-Klonen, die den YAC-Insertsequenzen entsprechen, beurteilt. Es sollte angemerkt werden, dass zur Identifizierung der Chromosomen in den meisten Fällen G-Banding verwendet wurde. Auf der Basis solchen G-Bandings konnten Hybridisierungssignale schlüssig Chromosomen bekannter Identität zugeordnet werden; dies war ebenfalls von Bedeutung für die Fälle mit Kreuz- oder Hintergrund-Hybridisierungssignalen, die gelegentlich beobachtet wurden. G-Banding vor der FISH-Analyse führte manchmal zu ziemlich schwachen Hybridisierungssignalen oder ziemlich unklaren Banding-Mustern. Daher führten wir FISH-Experimente durch, bei welchen die YAC- und Cosmid-Klone, die zu beurteilen waren, in Kombination mit einer Referenzsonde verwendet wurden. Cosmid-Klon cPK12qter, der glücklicherweise während des Screenings einer Cosmid-Bibliothek erhalten wurde, wurde als Referenzmarkierungssubstanz ausgewählt. FISH-Analyse von Metaphasen-Chromosomen normaler Lymphozyten (2A) zeigte, dass cPK12qter auf dem telomeren Bereich des langen Arms von Chromosoms 12 kartiert. Um Chromosom 12 in diesem Experiment zu identifizieren, wurde die Centromer 12-spezifische Sonde pα12H8 [21] verwendet. FISH-Analyse von Metaphasenchromosomen von Ad-312/SV40-Zellen unter Verwendung von YAC-Klon Y4854 (2B) oder Y9091 (2C) in Kombination mit der Referenzsonde cPK12qter zeigte in beiden Fällen Hybridisierungssignale des YAC-Inserts auf der (1) sowie der (12). Wir schlossen aus diesen Ergebnissen, dass die Insert-DNA jedes YAC-Klons den Chromosom 12-Bruchpunkt in dieser Zelllinie überspannen könnte. Es sollte angemerkt werden, dass G-Banding eine Telomer-Assoziation unter Beteiligung des kurzen Arms von Chromosom 12 in 2C zeigte. Die Beobachtung, dass der YAC-Klon Y9091 den Chromosom 12-Bruchpunkt in Ad-312/SV40 überspannte, wurde unabhängig in FISH-Untersuchungen bestätigt, in denen der Cosmid-Klon cRM90 oder cRM91 als Molekularsonde verwendet wurde; es wurde gezeigt, dass sie die alternativen Endsequenzen des Y9091-Inserts enthalten. cRM90 schien distal zu dem Chromosom 12-Bruchpunkt zu kartieren, während cRM91 proximal kartierend gefunden wurde (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse legten ebenfalls die chromosomale Orientierung des in 1 gezeigten YAC-Kontigs fest. Als Zusammenfassung schlossen wir aus diesen FISH-Untersuchungen, dass der Chromosom 12-Translokationsbruchpunkt in Ad-312/SV40 in dem DNA-Intervall liegen muss, das den überlappenden Sequenzen (ungefähr 300 kbp) der zwei YAC-Klone entspricht.
Feinkartierung des Chromosom 12-Translokationsbruchpunkts von Ad-312/SV40
In einer Herangehensweise zur weiteren Einengung des Chromosom 12-Translokationsbruchpunktbereichs von Ad-312/SV40 wurden Cosmid-Klone mit unterschiedlichen Kartierungspositionen innerhalb des YAC-Klons Y9091 isoliert. Diese umfassten cRM69, cRM85, cRM110 und cRM111. cRM69 und cRM85 wurden auf Basis von STS-Sequenzen von YAC-Klonen isoliert, die hier nicht gezeigt sind. cRM110 und cRM111 wurden mittels Inter-Alu-PCR erhalten. Für RM110 wurde durch Southern-Blot-Analyse gezeigt, dass es mit einem terminalen MluI-Fragment von Y9091 hybridisiert und nicht mit dem DNA-Insert des überlappenden YAC-Klons mit RM69 als telomere Endsequenzen. Die Lokation von RM110 ist wie in 1 gezeigt. Es wurde gezeigt, dass RM111 mit einem BssHII, MluI, PvuI und SfiI-Fragment von Y9091 hybridisiert, und daher in dem PvuI-SfiI-Fragment von Y9091 lokalisiert ist, zu dem ebenfalls STS RM48 kartiert wurde (1). FISH-Analyse von Metaphasen-Chromosomen von Ad-312/SV40 mit cRM69 oder cRM110 als Sonde zeigte, dass das DNA-Insert dieser Cosmide proximal zu dem Chromosom 12-Translokationsbruchpunkt in dieser Zelllinie kartiert, wie in 3A für cRM69 dargestellt. Nachfolgende FISH-Analyse von Ad-312/SV40 mit cRM85 oder cRM111 als Sonde zeigte Hybridisierungssignale distal zu dem Translokationsbruchpunkt, wie in 3B für cRM111 gezeigt. Die Ergebnisse mit cRM85 und cRM111 sind in Übereinstimmung mit der beobachteten Bruchpunktüberspannung durch YAC-Klon Y4854, da cRM85 distal zu und cRM111 nahe STS RM48 kartiert, die das telomäre Ende des YAC-Klons Y4854 markiert. Als Schlussfolgerung muss der Chromosom 12-Translokationsbruchpunkt in Ad-312/SV40 in dem DNA-Intervall zwischen cRM110 und cRM111 lokalisiert sein, wie in 4 schematisch zusammengefasst.
FISH-Beurteilung von Chromosom 12 -Bruchpunkten in anderen pleomorphen Speicheldrüsenadenomzelllinien
Um die Position ihrer Chromosom 12 -Bruchpunkte relativ zu dem Ad-312/SV40 zu bestimmen, wurden fünf andere pleomorphe Speicheldrüsenadenomzelllinien durch FISH- Analyse beurteilt, wie in 4 schematisch zusammengefasst. Diese Zelllinien, die aus primären Tumoren entwickelt wurden [5, 8], umfassten Ad-248/SV40, Ad-263/SV40, Ad-295/SV40, Ad-302/SV40 und Ad-366/SV40. Die Chromosom 12 Aberrationen dieser Zelllinien sind in 4 aufgeführt. FISH-Analyse von Metaphasen-Chromosomen dieser Zelllinien unter Verwendung von cRM91 zeigte, dass die Chromosom 12 -Bruchpunkte all dieser Zelllinien proximal zu diesem Cosmid-Klon kartierten (Daten nicht gezeigt). Eine ähnliche FISH-Analyse wurde ebenfalls unter Verwendung eines Cosmid-Klons, welcher der sequenzmarkierten Stelle RM103 entsprach, als Sonde durchgeführt. Es wurde gefunden, dass RM103 proximal zu RM91 in einem Abstand von ungefähr 0,9 Mbp kartiert. In allen Fällen erschien cRM103 distal zu den Chromosom 12-Translokationsbruchpunkten zu kartieren, was anzeigt, dass die Chromosom 12 -Bruchpunkte in diesen fünf pleomorphen Speicheldrüsenadenomzelllinien in einem relativ großen Abstand von dem der Ad-312/SV40-Zellen lokalisiert sind.
DISKUSSION
In den hier präsentierten Untersuchungen haben wir einen Chromosomenbereich auf dem langen Arm von Chromosom 12 identifiziert, molekular kloniert und charakterisiert, in welchem der Translokationsbruchpunkt der pleomorphen Speicheldrüsenadenomzelllinie Ad-312/SV40 zu kartieren scheint. In vorherigen Untersuchungen [5] haben wir bereits Belege bereitgestellt, dass der Chromosom 12-Bruchpunkt dieser Zelllinie zwischen D12S8 und CHOP lokalisiert war. Da die hier beschriebenen, zwei Bruchpunkte überspannenden YAC-Klone in direktionalen Chromosomenwanderungsexperimenten unter Verwendung von D12S8 und dem CHOP-Gen als Anfangsausgangspunkte erhalten wurden, bestätigen die Chromosom 12-Bruchpunktkartierungsergebnisse, die hier vorgestellt werden, unsere vorherige Behauptung. Die FISH-Ergebnisse, die mit dem kompletten YAC-Insert von Y9091 als Molekularsonde erhalten wurden, wurden unabhängig in FISH-Untersuchungen unter Verwendung von Cosmid-Klonen bestätigt, die Sequenzen enthielten, die verschiedenen Bereichen des Inserts des YAC-Klons entsprachen. Dies ist von Bedeutung, da die unabhängigen Bestätigungsergebnisse es ziemlich unwahrscheinlich machen, dass die mit dem kompletten Insert von Y9091 beobachteten Spaltungssignale anders als durch eine tatsächliche Spaltung von Sequenzen, die in dem YAC repräsentiert sind, erklärt werden kann. Die Gegenwart, zum Beispiel, von hochverwandten genetischen Sequenzen auf beiden Seiten eines Chromosomen-Bruchpunkts könnten leicht zu falschen Schlussfolgerungen führen, wenn sie nur auf FISH-Ergebnissen eines YAC-Inserts beruhen würden. Schließlich haben unsere Kartierungsuntersuchungen ebenfalls abschließend die chromosomale Orientierung der weitreichenden Restriktionskarte festgelegt, die wir in diesen Untersuchungen erzeugt haben. Diese Orientierung wurde bereits auf Basis von Zweifarb-FISH-Untersuchungen vorhergesagt (nicht veröffentlichte Beobachtungen).
Die hier beschriebenen FISH-Untersuchungen ermöglichten uns, den Chromosom 12-Bruchpunkt in Ad-312/SV40 Zellen auf das 190-kbp-DNA-Intervall zwischen den etablierten STSs RM48 und RM69 zu kartieren. Der Bruchpunktbereich kann jedoch auf Basis des folgenden etwas weiter eingeengt werden. Die Tatsache, dass gezeigt wurde, dass Y4854 den Bruchpunkt überspannt, zeigt an, dass mindestens ein beträchtlicher Teil der telomeren Hälfte dieses YAC-Klons distal zu dem Bruchpunkt kartieren muss. Wie viel genau, muss noch festgelegt werden. Andererseits schien STS RM69 ungefähr in der Mitte des DNA-Inserts des Cosmid-Klons cRM69 lokalisiert zu sein, was darauf hindeutet, dass der Bruchpunkt nahe 25 kbp distal zu RM69 liegt. Darüber hinaus schien RM69 RM110 zu fehlen (Daten nicht gezeigt) und, da cRM110 proximal zu den Chromosom 12-Bruchpunkt in Ad-312/SV40 Zellen gefunden wurde, sollte der Bruchpunkt noch weiter distal zu RM69 liegen als die zuvor erwähnten 25 kbp. Zusammen engt dies den Chromosom 12-Bruchpunktbereich auf ein DNA-Intervall ein, das beträchtlich kleiner als 165 kbp sein muss. Eine weitere genaue Lokalisierung des Bruchpunktes wird es uns ermöglichen, den Chromosom 12-Bruchpunkt molekular zu klonieren und die genetischen Sequenzen in dem Bruchpunktverbindungsbereich zu charakterisieren, was zu der Identifizierung pathogenetisch relevanter Sequenzen führen könnte. Die Identifizierung der in den DNA-Inserts der YAC-Klone Y4854 und Y9091 vorhandenen Gene mittels Sequenzierung, direkter Hybridisierung, direkter Selektion oder Exon-Trapping könnte eine nützliche alternative Herangehensweise zum Identifizieren des Gens in diesem Bereich des langen Arms von Chromosomen 12 darstellen, der pathogenetisch kritisch für die pleomorphe Speicheldrüsenadenomtumorgenese sein könnte.
Die Beobachtung, dass die Chromosom 12 -Bruchpunkte in anderen pleomorphen Speicheldrüsenadenomen in einem entfernten und stärker proximalen Bereich auf dem langen Arm des Chromosoms 12 liegen, ist von Interesse. Sie könnte bedeuten, dass die Chromosom 12 -Bruchpunkte in pleomorphen Speicheldrüsenadenomen über einen relativ großen DNA-Bereich des langen Arms von Chromosom 12 verteilt sind, was an die 11q13-Bruchpunkte in B-Zell-Malignitäten erinnert [22]. Die Aufklärung der genauen Lokalisierung der Chromosom 12-Bruchpunkte in den anderen pleomorphen Speicheldrüsenadenomzelllinien könnten mehr Licht auf diesen Gegenstand werfen. Andererseits könnte sie in Richtung alternativer Sequenzen auf dem langen Arm von Chromosom 12 zwischen D1218 und dem CHOP-Gen deuten, die von Bedeutung, vermutlich für die Wachstumsregulierung in pleomorphen Speicheldrüsenadenomen, sein könnten. Die Tatsache, dass der hier beschriebene Chromosom 12-Bruchpunktbereich bisher nur in der Ad-312/SV40 Zelllinie gefunden worden ist, macht es notwendig, eine größere Anzahl von Speicheldrüsenadenomen mit Chromosom 12q13-q15-Aberrationen zu analysieren, um die potentielle Relevanz für die Tumorgenese der Chromosom 12-Sequenzen zu beurteilen, die in der untersuchten Zelllinie betroffen sind. Wenn mehr Fälle mit Aberrationen in diesem Bereich von Chromosom 12 gefunden werden können, wäre es von Interesse, herauszufinden, ob diese Tumoren eine klinische Untergruppe bilden. Schließlich sind Chromosomentranslokationen unter Beteiligung des Bereichs q13-q15 des menschlichen Chromosoms 12 für eine Vielzahl anderer solider Tumoren berichtet worden: gutartige Fettgewebstumoren, uterines Leiomyom, Rhabdomyosarcom, Hemangiopericytom, Klarzellsarcom, chondromatöse Tumoren und Hamartome der Lunge. Ob die Chromosom 12-Bruchpunkte in einigen dieser Tumoren innerhalb desselben Bereichs wie jenem von Ad-312/SV40 kartieren oder nicht, muss noch festgestellt werden. Die in diesem Bericht beschriebenen YAC- und Cosmid-Klone stellen nützliche Werkzeuge dar, um dies zu untersuchen.
Die Verfügbarkeit einer Kopie der CEPH YAC-Bibliothek erster Generation [10] und einer Kopie der angeordneten Chromosom 12-spezifischen Cosmid-Bibliothek (LLNL12NC01) [11) wird sehr geschätzt. Die Cosmid-Bibliothek wurde als Teil des National Laboratory Gene Library Project unter der Schirmherrschaft des US DOE von LLNL unter der Vertragsnummer W-7405-Eng-48 aufgebaut. Die Autoren würdigen die hervorragende technische Unterstützung von M. Dhaen, C. Huysmans, E. Meyen, K. Meyer-Bolte und M. Willems und möchten M. Leys für die Bebilderung danken. Diese Arbeit wurde teilweise durch die EU durch das Biomed 1-Programm "Molecular Cytogenetics of Solid Tumours", die "Geconcerteerde Onderzoekacties 1992-1996" die "Association Luxembougeoise contre le Cancer", den Nationalen Fond für wissenschaftliche Forschung (NFWO; Kom op tegen Kanker), das "ASLK-Programma voor Kankeronderzoek",das "Schwerpunktprogramm: Molekulare und Klassische Tumorcytogenetik" der Deutschen Forschungsgemeinschaft und die Tönjes-Vagt Stiftung unterstützt. Dieser Text stellt Ergebnisse des belgischen Programms für Anziehungspunkte zwischen Universitäten dar, das durch den belgischen Staat, Büro des Premierministers, Wissenschaftspolitikprogrammatik initiiert wurde. Die wissenschaftliche Verantwortung wird von den Autoren übernommen. J.W.M. Geurts ist ein "Aspirant" des Nationalen Fonds für wissenschaftliche Forschung NFWO; KOm op tegen Kanker).
Literaturnachweise

1. Seifert G, Miehlke A, Haubrich J, Chilla R (1986): Diseases of the salivary glands. Pathology. Diagnosis. Treatment. Facial nerve surgery. Translated by P.M. Stell. Thieme, Stuttgart, New York, S. 1820194.
2. Sandros J, Stenman G, Mark J (1990): Cytogenetic and molecular observations in human and experimental salivary gland tumours. Cancer Genet Cytogenet 44: 153-167.
3. Bullerdiek J, Wobst G, Meyer-Bolte K, Chilla R, Haubrich J, Thode B, Bartnitzke S (1993): Cytogenetic subtyping of 220 salivary gland pleoraorphic adenomas: correlation to occurrence, histological subtype, and in vitro cellular behavior. Cancer Genet Cytogenet 65: 27-31.
4. Schoenmakers HFPM, Kools PFJ, Kazmierczak B, Bullerdiek J, Claussen U, Horsthemke B, Van den Berghe H, Van de Ven WJM (1993): Isolation of a somatic cell hybrid retaining the der (16) t(12;16)(q13;p11.2) from a myxoid liposarcoma cell line. Cell Genet Cytogenet 62: 159-161.
5. Schoenmakers HFPM, Kools PFJ, Mols R, Kazmierczak B, Bartnitzke S, Bullerdiek J, Dal ein P, De Jong PJ, Van den Berghe H, Van de Ven WJM (1993): Physical mapping of chromosome 12q breakpoints in lipoma, pleomorphic salivary gland adenoma, uterine leiomyoma, and myxoid liposarcoma. Genomics, 20: 210-222.
6. Keats B, Ott J, Conneally M (1989): Reports of the committee on linkage and gene order. Cytogenet Cell Genet 51: 459-502.
7. Stenman G, Sahlin P, Mark J, Chaganti RKS, Kindblom LS, Aman P (1993): The 12q13-q15 translocation breakpoints in pleomorphic adenoma and clear-cell sarcoma of tendons and aponeuroses are different from that in myxoid liposarcoma. Genes Chrom Cancer 7: 178-180.
8. Kazmierczak B, Bartnitzke S, Hartl M, Bullerdiek J (1990): In vitro transformation by the SV40 "early region" of cells from a human benign salivary gland tumour with a 12q13→q15 rearrangement. Cytogenet Cell Genet 53: 37-39.
9. Warburton D, Gersen S, Yu M-T, Jackson C, Handelin B, Housman D (1990): Monochromosomal rodent-human hybrids from microcell fusion of human lymphoblastoid cells containing an inserted dominant selectable marker. Genomics 6: 358-366.
10. Albertsen HM, Abderrahim H, Cann HM, Dausset J, Le Paslier D, Cohen D (1990): Construction and characterization of a yeast artificial chromosome library containing seven haploid human genome equivalents. Proc Natl Acad Sei USA 87: 4256-4260.
11. Montgomery KT, LeBlanc JM, Tsai P, McNinch JS, Ward DC, De Jong PJ, Kucherlapati R, Krauter KS (1993): Characterization of two chromosome 12 cosmid libraries and development of STSs from cosmids mapped by FISH. Genomics 17: 682-693.
12. Green ED, Olson MV (1990): Systematic screening of yeast artificial-chromosome libraries using the polymerase chain reaction. Proc Natl Acad Sei USA 87: 1213-1217.
13. Geurts JMW, Schoenmakers HFPM, Mols R, Van de Ven WJM (1994): Improved procedure for rapid isolation and sequencing of DNAS termini in yeast artificial chromosomes. Meth Mol Cell Biol, In Press.
14. Nelson DL, Ledbetter SA, Corbo L, Victoria MF, Ramirez-Solis R, Webster TD, Ledbetter DH, Caskey CT (1989): Alu polyrmerase chain reaction. A method for rapid isolation of human-specific sequences from complex DNA sources. Proc Natl Acad Sei USA 86: 6686-6690.
15. Breukel C, Wijnen J, Trops C, Van de Klift H, Dauwerse H, Meera Khan P (1990): Vector-Alu PCR: a rapid step in mapping cosmids and YACs. Nucl Acids Res 18: 3097.
16. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989): Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
17. Chu G, Vollrath D, Davis RW (1986): Separation of large DNA molecules by contourclamped homogeneous electric fields. Science 234: 1582-1585.
18. Smit VTHBM, Wessels JW, Mollevanger P, Schrier. PI, Raap EK, Beverstock GC, Cornelisse CJ (1990): Combined GTG-banding and nonradioactive in situ hybridization inproves characterization of complex karyotypes. Cytogenet Cell Genet 54: 20-23.
19. Kievits T, Dauwerse JG, Wiegant J, Devilee P, Breuning MH, Cornelisse CJ, van Ommen G, Pearson PL (1990): Rapid subchromosomal localization of cosmids by nonradioactive in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet 53: 134-136.
20. Kools PFJ, Roebroek AJM, Van de Velde HJK, Marynen P, Bullerdiek J, Van de Ven WJM (1993): Regional mapping of the human NSP gene to chromosome I4q21-q22 by fluorescence in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet 66: 48-50.
21. Looijenga LHJ, Smit VTHBM, Wessels JW, Mollevanger P, Oosterhuis JW, Cornelisse CJ (1990): Localization and polymorphism of a chromosome 12-specific α satellite DNA sequence. Cytogenet Cell Genet 53: 216-218.
22. Raynaud SD, Bekri S, Leroux D, Grosgeorge J, Klein B, Bastard C, Gaudray P, Simon MP (1993): Expanded range of 11q13 breakpoints with differing patterns of cyclin D1 expression in B-cell malignancies. Genes Chrom Cancer 8: 80-87.

LEGENDEN DER FIGUREN VON ANHANG 2
1
Zusammengesetzte physikalische Karte der überlappenden DNA-Inserts der YAC-Klone Y4854 und Y9091. Größen der DNA-Inserts sind angegeben. Die relativen Positionen der YAC-Klone sind durch Balken unterhalb der weit reichenden physikalischen Karte dargestellt. Sequenzmarkierte Stellen (STSs), die End-Klonen von YACs entsprechen, einschließlich hier nicht gezeigter YACs, sind durch RM-Codes in Kästen oberhalb der Restriktionskarte dargestellt. STSs, die von Inter-Alu-PCR-Produkten erhalten wurden, sind unterhalb der Restriktionskarte angegeben, und die DNA-Bereiche, zu denen sie kartiert worden sind, sind durch Pfeile markiert. B: BssHII; M: MluI; P: PvuI; Sf SfiI. Eine polymorphe MluI-Stelle ist durch ein Sternchen markiert.
2
A) Kartierung des Cosmid-Klons cPK12qter auf den telomeren Bereich des langen Arms von Chromosom 12. Centromer 12-spezifische Sonde pα12H8 wurde verwendet, um die Identität von Chromosom 12 festzulegen. FISH-Analyse wurde auf Metaphasenchromosomen auf menschlichen Kontrolllymphozyten durchgeführt. Hybridisierungssignale von cPK12qter sind mit kleinen Pfeilspitzen markiert, jene der Centromer 12-spezifischen Sonde mit Sternchen. B, C) FISH-Analyse von Metaphasenchromosomen von Ad-312/SV40-Zellen unter Verwendung von DNA von YAC-Klon Y4854 (B) oder Y9091 (C) als Molekularsonde in Kombination mit Kosmid-Klon cPK12qter als Referenzmarkierungssubstanz. Hybridisierungssignale der YAC-Klone auf Chromosom 12 sind durch große Pfeilspitzen gezeigt; jene auf der (1) durch große Pfeile beziehungsweise jene auf der (12) durch kleine Pfeile. Die Hybridisierungssignale des Cosmid-Klons cPK12qter sind durch kleine Pfeilspitzen gezeigt.
3
FISH-Analyse von Metaphasenchromosomen von Ad-312/SV40-Zellen unter Verwendung von DNA des Cosmid-Klons cRM69 (A) oder cRM111 (B) als Molekularsonde in Verbindung mit Cosmid-Klon cPK12qter als Referenzmarkierungssubstanz. Die Position der Hybridisierungssignale von cPK12qter sind durch kleine Pfeilspitzen gezeigt. In (A) ist die Position des Hybridisierungssignals von cRM69 auf dem normalen Chromosom 12 durch eine große Pfeilspitze gezeigt und jene auf der (12) mit einem kleinen Pfeil. In (B) ist die Position des Hybridisierungssignals von cRM111 auf dem normalen Chromosom 12 durch eine große Pfeilspitze gezeigt und jene auf der (1) mit einem großen Pfeil.
4
Schematische Darstellung der FISH-Kartierungsdaten, die für die sechs pleomorphen Speicheldrüsenadenomzelllinien erhalten wurden, die in dieser Untersuchung getestet wurden. Die spezifischen Chromosom 12-Aberrationen in den unterschiedlichen Zelllinien sind angegeben. Cosmid-Klone, die als Sonden in den FISH-Kartierungsuntersuchungen verwendet wurden, entsprechen den sequenzmarkierten Stellen, die aus überlappenden YAC-Klonen erhalten wurden. Einzelne FISH-Experimente sind durch Punkte gezeigt. Cosmid-Klone wurde nach den Acronymen der STSs benannt, wie in den Kästen gezeigt, und ihre relative Anordnung ist wie dargestellt. Das DNA-Intervall zwischen RM90 und RM103 wird auf ungefähr 1,3 Mb geschätzt. Einfügung: Schematische Darstellung der G-Banding-Derivatchromosomen der (1) und der (12) der Ad-312/SV40 Zelllinie, die ein t(1;12)(p22;q15) trägt. Die Positionen der Chromosomen 12-Bruchpunkte von Ad-248/SV40, Ad-263/SV40, Ad-295/SV40, Ad-302/SV40 und Ad-366/SV40 sind distal zu RM103, wie durch den Pfeil gezeigt. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Multi-Tumor aberrantes Wachstum (MAG)-Gen, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die mindestens die Nukleotidsequenz des LPP-Genes, wie in 5 gezeigt, oder dessen komplementären Stranges aufweist.
Multi-Tumor aberrantes Wachstum (MAG)-Gen gemäß Anspruch 1 zur Verwendung beim Entwerfen von expressionsmodulierenden Verbindungen oder Techniken zur Behandlung von nichtphysiologischen Proliferationsphänomenen bei Mensch oder Tier.
Multi-Tumor aberrantes Wachstum (MAG)-Gen gemäß Anspruch 1 zur Verwendung beim Entwerfen von Nukleotidsonden zum (klinischen/medizinischen) Diagnostizieren von Zellen, die ein nichtphysiologisches Proliferationsvermögen verglichen mit Wildtypzellen aufweisen.
Protein, das durch das Multi-Tumor aberrante Wachstum (MAG)-Gen gemäß Anspruch 1 codiert wird, zur Verwendung bei der Herstellung von Antikörpern zum (klinischen/medizinischen) Diagnostizieren von Zellen, die ein nichtphysiologisches Proliferationsvermögen verglichen mit Wildtypzellen aufweisen.
In situ-Diagnoseverfahren zum Diagnostizieren von Zellen, die ein nichtphysiologisches Proliferationsvermögen aufweisen, das die folgenden Schritte aufweist: a) Entwerfen eines Satzes von Nukleotidsonden basierend auf der Nukleotidesequenz des MAG-Gens gemäß Anspruch 1, wobei eine der Sonden mit einem Bereich des aberranten Gens hybridisierbar ist, der im Wesentlichen an demselben Genort wie ein entsprechender Bereich des Wildtyp-Gens liegt, und wobei die andere Sonde mit einem Bereich des aberranten Gens hybrtdisierbar ist, der an einem anderen Genort als einem entsprechenden Bereich des Wildtyp-Gens liegt; b) Inkubieren eines oder mehrerer Interphasen- oder Metaphasenchromosomen oder Zellen, die ein nichtphysiologisches Proliferationsvermögen aufweisen, mit der Sonde unter Hybridisierungsbedingungen; und c) Sichtbarmachen der Hybridisierung zwischen der Sonde und dem Gen.
Verfahren zum Diagnostizieren von Zellen, die ein nichtphysiologisches Proliferationsvermögen aufweisen, das die folgenden Schritte umfasst: a) Isolieren eines Makromoleküls aus einer Probe von zu diagnostizierenden Zellen, wobei das Makromolekül dem MAG-Gen gemäß Anspruch 1 zugehörig ist; und b) Analysieren des so erhaltenen Makromoleküls durch Vergleich mit einem Wildtyp-Referenzmolekül.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das Wildtyp-Referenzmolekül von demselben Individuum stammt.
Verfahren gemäß Anspruch 6 oder 7, das die folgenden Schritte umfasst: a) Extrahieren von Gesamt-RNA aus einer Probe von zu diagnostizierenden Zellen; b) Herstellen mindestens einer erststrängigen (first strand) cDNA der mRNA-Spezies in dem Gesamt-RNA-Extrakt, wobei die cDNA einen Schwanz umfasst; c) Durchführen einer PCR und/oder RT-PCR unter Verwendung eines Starters, der für ein MAG-Gen gemäß Anspruch 1 spezifisch ist, und eines Schwanz-spezifischen und/oder Partner-spezifischen/verschachtelten Starters, um MAG-Gen- oder Derivatspezifische cDNAs zu amplifizieren; d) Trennen der PCR-Produkte auf einem Gel, um ein Bandenmuster zu erhalten; und e) Beurteilen der Gegenwart von aberranten Banden durch Vergleich mit Wildtyp-Banden.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die Wildtypbanden von demselben Individuum stammen.
Verfahren gemäß Anspruch 6 oder 7, das die folgenden Schritte umfasst: a) Isolieren des Gesamtproteins aus einer Probe von zu diagnostizierenden Zellen; b) Trennen des Gesamtproteins auf einem Gel, um im Wesentlichen einzelne Banden zu erhalten und wahlweises Überführen der Banden auf einen Westernblot; c) Hybridisieren der so erhaltenen Banden mit Antikörpern, die gegen eine Teil des Proteins gerichtet sind, der durch den verbleibenden Teil des MAG-Gens gemäß Anspruch 1 codiert ist, und gegen einen Teil des Proteins, der durch den Substitutionsteil des MAG-Gens codiert ist, und d) Sichtbarmachen der Antigen-Antikörper-Reaktionen und Festellen der Gegenwart von aberranten Banden durch Vergleich mit Banden von Wildtyp-Proteinen.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die Wildtyp-Proteine von demselben Individuum stammen.
Verfahren gemäß Anspruch 6 oder 7, das die folgenden Schritte umfasst: a) Isolieren von Gesamt-DNA aus einer Probe von zu diagnostizierenden Zellen; b) Verdauen der DNA mit einem oder mehreren selten schneidenden (rare cutter) Restriktionsenzymen; c) Trennen des so hergestellten Verdauungsprodukts auf einem Gel, um ein Trennungsmuster zu erhalten; d) wahlweises Überführen des Trennungsmusters auf einen Southernblot; e) Hybridisieren des Trennungsmusters im Gel oder auf dem Blot unter Hybridisierungsbedingungen mit einer oder mehreren informativen Sonden; und f) Sichtbarmachen der Hybridisierungen und Feststellen der Gegenwart von aberranten Banden, die vom MAG-Gen gemäß Anspruch 1 stammen, durch Vergleich mit Wildtyp-Banden.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die Wildtyp-Banden von demselben Individuum stammen.
Verfahren gemäß Anspruch 6 oder 7, das mindestens einige der folgenden Schritte umfasst: a) Extahieren von mRNA aus einer Probe von zu diagnostizierenden Zellen; b) Feststellen der Gegenwart oder der (relativen) Menge von mRNA, die von einem MAG-Gen gemäß Anspruch 1 abgeleitet ist; und c) Vergleichen des Ergebnisses aus Schritt b) mit dem Ergebnis eines ähnlichen Experiments mit Wildtyp-Zellen.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei die Wildtyp-Zellen von demselben Individuum stammen.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 bis 15, wobei die Zellen, die ein nichtphysiologisches Proliferationsvermögen aufweisen, aus der Gruppe bestehend aus mesenchymalen Tumoren Hamartomen, Fettgewebetumoren, pleomorphen Speicheldrüsenadenomen, uterinen Leiomyomen, Angiomyxomen, Fibroadenomen der Brust, Polypen des Endometriums, atherosklerotischen Plaques und anderen gutartigen Tumoren sowie verschiedenen bösartigen Tumoren, einschließlich Sarkomen und Karzinomen und hämätologischen Malignitäten ausgewählt sind.
Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die Zellen, die ein nichtphysiologisches Proliferationsvermögen aufweisen, aus der Gruppe bestehend aus den mesenchymalen Tumoren Hamartomen der Brust und Lunge, Lipomen, Rhabdomyosarkomen, Osteosarkamen, Brustharzinomen, Lungenkarzinomen, Hautkazinomen, Thyroidkarzinomen, Leukämien und Lymphomen ausgewählt sind.
Diagnosekit, das einen Satz markierter Nukleotidesonden basierend auf der Nukleotidesequenz des LPP-Gens, wie in 5 gezeigt, umfasst.
Diagnosekit gemäß Anspruch 18, das zusätzlich markierte Schwanz-spezifische PCR-Starter umfasst.
Diagnosekit gemäß Anspruch 18, das zusätzlich selten schneidende Restriktionsenzyme umfasst.
Nichtmenschliches Tiermodell für die Bewertung der Nützlichkeit von Verbindungen oder Zusammensetzungen bei der Behandlung von Erkrankungen oder Störungen, die mit Zellen einhergehen, die ein nichtphysiologisches Proliferationsvermögen aufweisen, wobei das nichtmenschliche Tier ein transgenes nichtmenschliches Tier ist, das ein MAG-Gen gemäß Anspruch 1 in seinem Genom beherbergt.
Tiermodell gemäß Anspruch 21, wobei das MAG-Gen ein aberrantes MAG-Gen, wie etwa ein Fusionsprodukt des verbleibenden Teils des Gens und des Substitutionsteils seines Translokationspartners, ist.
Tiermodell gemäß Anspruch 21, wobei das MAG-Gen eine nichtphysiologische Expressionsstärke zeigt.
Nichtmenschliches Tiermodel für die Bewertung der Nützlichkeit von Verbindungen oder Zusammensetzungen bei der Behandlung von Krankheiten oder Störungen, die mit Zellen einhergehen, die ein nichtphysiologisches Proliferationsvermögen aufweisen, wobei das nichtmenschliche Tier eine spezifische genetische Aberration, die ein MAG-Gen ge mäß Anspruch 1 betrifft, in dem Genom mindestens eines Teils seiner Zellen beherbergt, wobei die Aberration durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen induziert wurde.
Tiermodell gemäß einem der Ansprüche 21 bis 24, wobei das Tier ein nichtmenschliches Säugetier, insbesondere eine Maus, Ratte, ein Hund oder höherer Primat, wie ein Schimpanse, ist.
Poly- oder Oligonukleotid-Sonden und Starter, die auf dem MAG-Gen gemäß Anspruch 1 basieren.