CN116179710B - 基于高通量测序平台的brca1/2基因突变检测的引物组、文库构建与环化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种基于高通量测序平台的BRCA1/2基因突变检测的引物组、文库构建与环化方法，本发明专利基于国产高通量测序平台MGI设计，能采用更少的样本使用量、更少的引物对数及摩尔用量、更少的扩增管数、更小的PCR反应体积、更简单的反应体系，简化了样本建库流程、缩短建库时长，达到最优的扩增效果及特异性，不仅样本、引物使用量少，单个样本所需测序数据量低，一定程度上节约了测序成本。并且提供了一种文库构建与文库环化方法，单个样本所需数据量仅为2.5M，即可达到测序数据比对率100％、捕获率大于99％、均一性大于99％，500×测序深度下覆盖度100％。

Description

基于高通量测序平台的BRCA1/2基因突变检测的引物组、文库 构建与环化方法
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种基于高通量测序平台的BRCA1/2基因突变检测的引物组、文库构建与环化方法。
背景技术
乳腺癌是中国女性最常见的恶性肿瘤，居癌症相关死因的第5位。研究表明，5％～10％的乳腺癌患者具有明确的遗传基因突变，称之为遗传性乳腺癌(hereditary breastcancer，HBC)，其中BRCA1/2基因突变占15％，其他主要易感基因有TP53、CDH1、LKB1、PTEN、CHEK2、ATM和PALB2等。乳腺癌易感基因包括乳腺癌易感基因1(breast cancersusceptibility gene 1，BRCA1)和乳腺癌易感基因2(breast cancer susceptibilitygene 2，BRCA2)，是重要的抑癌基因，其编码产物参与DNA损伤同源性重组修复组(homologous recombination)、基因转录调控和细胞周期调节等。
传统的Sanger测序是目前国内临床检测BRCA1/2基因突变的主要检测手段，但其普遍存在检测范围小、样本使用量大、引物试剂耗费量大等缺点。而对BRCA1/2全部编码序列及邻近内含子序列检测来说，检测通量较低、周期长，单样本检测费用也较高(成本在600-1000元不等)。此外，市面上也有基于高分辨率熔点曲线分析(High ResolutionMelting Analysis，HRM)技术的检测试剂盒，但仅能检测几个已知位点，其作用非常有限。而高通量测序技术(Next-Gene Sequnencing,NGS)能够实现一次实验扩增检测BRCA1和BRCA2两个基因全部编码区的胚系突变，通量高且检测精准。
目前已有多个基于NGS技术，用于检测人类乳腺癌易感基因BRCA1和BRCA2的试剂盒或发明专利(包括多重PCR靶向建库技术和特异性探针杂交捕获)。但存在初始样本投入量较高(20ng-50ng不等)、探针费用昂贵，或由于初始扩增管数过多带来的操作繁琐、样本使用量大(40ng-400ng不等)、试剂耗费成本高，以及引物对数较多(97-216对引物不等)或引物投入量大(200μM-400μM)带来的成本增加等问题。
发明内容
为了在现有技术上进一步优化内容，本发明提供一组可用于扩增BRCA1基因和BRCA2基因所有转录本的外显子编码区、以及外显子与内含子交界处±20bp的引物组，引物组使用量较低，总投入量最低为107.7μM，引物投入摩尔用量在0.1μM-3.0μM之间。
以及提供一种用于MGI平台文库构建及文库环化方法，适配多种样本类型，仅需6ng样本即可在7h内完成整个建库与环化流程，PCR组分简单、扩增管数少、操作简便，文库环化步骤中，模板变性和引物退火在同一时空中进行，整个反应可在室温下进行，无需担心单链复性，大大提高的文库环的产量，单个样本所需数据量为2.5M，即可达到测序数据比对率100％、捕获率大于99％、均一性大于99％，500×测序深度下覆盖度100％。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
基于高通量测序平台的BRCA1/2基因突变检测的引物组，所述引物组包括分为三组的133对引物对，每对引物对的正向引物和反向引物5’端至3’端依次包括通用序列和特异性序列；
第一组引物对的正向引物的特异性序列如SEQ ID NO.1,2,3,4,5……44所示，对应的反向引物的特异性序列如SEQ ID NO.134,135,136,137,138……177所示；
第二组引物对的正向引物的特异性序列如SEQ ID NO.45,46,47,48,49……89所示，对应的反向引物的特异性序列如SEQ ID NO.178,179,180,181,182……222所示；
第三组引物对的正向引物的特异性序列如SEQ ID NO.90,91,92,93,94……133所示，对应的反向引物的特异性序列如SEQ ID NO.223,224,225,226,227……266所示。
进一步的，所述133对引物对的摩尔用量范围如下：
进一步的，每对引物对的正向引物和反向引物的通用接头序列为与基因测序平台适配的接头序列。
进一步的，适配于MGI高通量测序平台的每对引物对的正向引物的通用接头序列如SEQ ID NO.267所示，反向引物的通用接头序列如SEQ ID NO.268所示。
SEQ ID NO.267：TTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT；
SEQ ID NO.268：GAACGACATGGCTACGATCCGACTT。
本发明还提供一种BRCA1/2基因突变检测的文库构建方法，包括以下步骤：
S1、使用上述的第一组引物对、第二组引物对、第三组引物对分别进行扩增样本基因；
具体为：将提取好的样本gDNA稀释至2ng，配制3管PCR反应体系分别进行PCR扩增，反应体系1需加入第一组引物对，反应体系2需加入第二组引物对，反应体系3需加入第三组引物。
S2、将步骤S1的第一组引物对扩增产物、第二组引物对扩增产物和第三组引物扩增产物按照(1-3):(3-7):(5-11)的比例混合后进行纯化，得到纯化后的第一轮PCR扩增产物；优选第一组引物对扩增产物、第二组引物对扩增产物和第三组引物扩增产物的加入量分别为4μL、12μL、20μL。
S3、以所述第一轮PCR扩增产物为模板进行第二轮PCR扩增反应，目的是为了进一步增加靶标产物量并加上样本识别标签；
S4、对第二轮PCR扩增产物进行纯化，得到所述BRCA1/2基因突变检测的文库。
进一步的，BRCA1/2基因突变检测的文库构建方法具体包括以下步骤：
进一步的，步骤S1中，样本的类型包括外周血、口腔拭子和宫颈脱落细胞。
进一步的，步骤S1中，所述引物组的总用量为107.7-134.3μM，优选为121μM。
进一步的，步骤S1中，PCR反应体系包括5μL 5×mPCR Mix、18μL引物池1引物组、1μL gDNA(2ng/μL)、1μL ddH2O；反应体系2包括5μL 5×mPCRMix、17μL引物池2引物组、1μLgDNA(2ng/μL)、2μL ddH2O；反应体系3包括5μL 5×mPCRMix、10μL引物池3引物组、1μL gDNA(2ng/μL)、9μL ddH2O。
进一步的，步骤S1中，所述5×mPCR Mix(1mL)包括500μL 10×multiPCR Buffer、125μLdNTP(10mM)、50μLHotStart Taq Polymerase(5U/μL)、325μL ddH2O。
进一步的，步骤S1中，所述10×multiPCR Buffer组分包括8-12mM Tris-HCl(pH8.3)、240-270mM KCl、0.8-1.2mM MgCl2、10mL 50％甘油、2.5mL 20％曲拉通100、0.75mgBSA，ddH2O定容至50mL。
进一步的，步骤S1中，PCR反应程序为降落PCR，程序分为94℃预变性3min、94℃变性20s，66℃退火20s(-1℃/cycles)，72℃延伸25s，14个循环、94℃变性20s，53℃退火20s，72℃延伸25s，21个循环、72℃延伸1min。
进一步的，上述步骤中的纯化可采用海狸生物DNA片段分选磁珠，所用磁珠体积比例为0.8倍。
进一步的，步骤S3中，第二轮PCR扩增反应的PCR反应体系包括5μL 5×mPCR Mix、4μL上游通用引物、4μL下游通用引物、8μL纯化后的第一轮PCR扩增产物、4μL ddH2O。所述上游通用引物GAACGACATGGCTACGATCCGA，该引物5’端需采用磷酸化标记1个碱基；下游通用引物
TGTGAGCCAAGGAGTTGNNNNNNNNNNTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGC，其中NNNNNNNNNN代表MGI平台的Barcode序列，需每个样本唯一。
进一步的，步骤S3中，所述PCR反应程序为94℃预变性3min、94℃变性20s，62℃退火20s，72℃延伸30s，11个循环、72℃延伸1m 30s。
本发明还提供一种BRCA1/2基因突变检测的文库环化方法，其特征在于，包括上述的BRCA1/2基因突变检测的文库构建方法，还包括以下步骤：
S5、将步骤S4得到的所述BRCA1/2基因突变检测的文库进行Qubit定量，等质量混合，取混合后总量为100-400ng的文库进行加ddH2O定容至27μL；
S6、加入末端修复酶及对应buffer1，进行末端修复反应，得到末端修复后的混合文库；优选的，末端修复酶为1UNEB公司的DNA聚合酶I大片段(Klenow)；
S7、将末端修复后的混合文库进行单链处理，加入环化引物，变性及退火反应，得到单链混合文库；
S8、将单链混合文库进行环化，加入连接酶及对应buffer2，环化反应，得到单链文库环；优选连接酶为NEB公司的T4 DNA连接酶；
S9、对单链文库环进行消化，加入消化酶Mix，所述消化酶Mix为NEB公司的核酸外切酶I和核酸外切酶III混合物，混合比为1:1；
S10、对单链文库环进行纯化，Qubit定量后上机测序。
进一步的，步骤S5中，所述等质量混合为每个文库取10-40ng，混合好后补ddH2O至文库数量N×2体积(μL)。
进一步的，步骤S6中，所述buffer1的组分包括10-100mM Tris-HCl(pH7.9)、50-500mM NaCl、10-100mM MgCl2、1-10mM DTT。
进一步的，步骤S6中，末端修复反应的条件为25℃反应15min，80℃反应10min。
进一步的，步骤S7中，所述环化引物序列如SEQ ID NO.269所示；SEQ ID NO.269：GCCATGTCGTTCTGTGAGCCAAGG。
进一步的，步骤S7中，所述变性及退火反应的方法为95℃反应3min，PCR仪中降温至4℃。
进一步的，步骤S8中，所述buffer2的组分包括60-300mM Tris-HCl(pH7.6)、10-50mM MgCl2、1-5mMATP、1-5mM DTT、76-380mg/mLPEG6000。
进一步的，步骤S8中，所述环化反应的条件为25℃反应30min。
进一步的，步骤S9中，对单链文库环进行消化反应的程序为37℃反应30min，80℃反应20min，冷却至4℃。
进一步的，所述文库环化方法无需在冰上配置，在室温下即可完成。
进一步的，上机测序方法为MGISEQ-200RS高通量测序试剂套装，可选择PE150读长、FCS或FCL。
本发明的有益效果是：
1.本发明初始样本使用量少。现有类似技术所需样本总使用量在40ng-400ng不等，本发明仅需6ng，最低检测限可达2ng。
2.本发明引物对数少。现有类似技术引物对数在97-216对引物不等，本发明仅需133对引物。引物对数为97对引物的发明专利需分为8管进行扩增，从而保证扩增特异性和均一性，而本发明133对引物经摩尔比优化，仅需3管即可保证扩增特异性和均一性。
3.本发明引物摩尔用量少。现有类似技术引物摩尔用量在200-400μM不等，本发明最低仅需107.7μM。
4.本发明PCR扩增管数少。现有类似技术扩增管数在2-8管，本发明仅需3管。扩增管数在2管的现有技术，其引物对数较多、摩尔用量大、且非特异扩增较多、均一性较差。本发明133对引物分为3管PCR扩增，且测序结果显示特异性、均一性均较好，高达99％。
5.本发明PCR反应组分简单。与扩增管数少的现有类似技术相比，其PCR组分需添加TMAC等提高反应特异性的化学物质，而本发明仅需普通PCR组分、无需添加特高特异性的化学物质，即可实现高特异性扩增。
6.本发明单个样本所需数据量少。现有BRCA基因突变检测的高通量测序技术，其单个样本所需数据量在2M-25M不等。单个样本所需数据量为2M的仅能达到100×测序深度下覆盖度大于99％，且捕获率、均一性较差。本发明专利单个样本2.5M的数据量可达500×测序深度下覆盖度100％，且捕获率、均一性较好。
7.本发明文库构建、环化方法等无需在冰上操作。MGI测序平台需文库环化过程，其模板变性成单链后需在冰上保持，本发明中提供的改良环化方法，制作的单链更为稳定，无需在冰上操作，简约了操作。
8.本发明建库时间短。本发明手动建库时长仅3h，手动建库并进行文库环化约7h。
9.本发明适配样本类型丰富。包括外周血、口腔拭子、宫颈脱落细胞等，同时由于最低检测限低至2ng，可满足由于采样不佳或提取不佳导致的低浓度样本的建库需求。
附图说明
图1为实施例1中随机挑选4个文库的电泳质检图；
图2为实施例2中杂合致病突变13-32954030(c.9097dup,p.Thr3033fs)的Sanger测序验证正向引物峰图；
图3为实施例2中杂合致病突变13-32954030(c.9097dup,p.Thr3033fs)的Sanger测序验证反向引物峰图。
具体实施方式
下面结合附图进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1
待测外周血、口腔拭子、宫颈脱落细胞样本gDNA均由普通的商业化试剂盒提取，将提取好的gDNA用ddH2O稀释至2ng/μL。
1)进行第一轮多重PCR靶向特异性扩增反应，每个样本需分别配制3管PCR反应体系，所用引物摩尔用量如下表：
/>
/>
/>
/>
实施例中引物池1的总摩尔量投入量为50μM、引物池2的总摩尔投入量为43.4μM、引物池3的总摩尔投入量为27.4μM，总使用量为121μM，反应体系如下：
2)反应体系配制好后于PCR仪中进行反应，PCR扩增程序为94℃预变性3min、94℃变性20s，66℃退火20s(-1℃/cycles)，72℃延伸25s，14个循环、94℃变性20s，53℃退火20s，72℃延伸25s，21个循环、72℃延伸1min。
3)反应结束后取出，将PCR反应管1取4μL、PCR反应管2取12μL、PCR反应管3取20μL，混合为一管，随后进行产物纯化。
4)采用海狸生物DNA片段分选磁珠进行纯化，磁珠用量为28.8μL，最终用20μLddH2O进行洗脱，其余操作步骤按说明书。
5)取步骤4)纯化好的PCR产物作为模板，进行第二轮PCR反应，反应体系如下：
组分 体积(μL)
5×mPCRMix 5
上游通用引物(10μM) 4
下游通用引物(10μM) 4
纯化后的第一轮PCR产物 8
ddH2O 4
本实施例中所用的下游通用引物中Barcode序列如下：
6)第二轮PCR反应程序为94℃预变性3min、94℃变性20s，62℃退火20s，72℃延伸30s，11个循环、72℃延伸1m 30s。
7)采用海狸生物DNA片段分选磁珠进行纯化，磁珠用量为16μL，最终用20μL ddH2O进行洗脱，其余操作步骤按说明书。
8)对纯化后的文库进行Qubit定量，使用测试试剂盒为Qubit 1×dsDNA HS检测试剂盒，具体操作步骤同说明书。
9)对纯化后的文库进行片段大小质控，结果如图1，条带分布在300bp-400bp之间，符合目的大小，且无明显的非特异性条带。
10)定量后的文库每个取40ng进行混合，随后补ddH2O至文库数量N×2体积(μL)，本实施例中文库浓度如下，文库总体积27.3μL，补ddH2O 20.7μL。
序号 Barcode Barcode文库浓度(ng/μL) 取用体积(μL)
1 1 53.0 0.8
2 2 56.0 0.7
3 3 53.0 0.8
4 4 20.8 1.9
5 13 32.1 1.2
6 14 30.2 1.3
7 15 48.3 0.8
8 16 58.0 0.7
9 25 53.0 0.8
10 26 52.0 0.8
11 28 45.5 0.9
12 29 23.5 1.7
13 30 30.2 1.3
14 32 24.7 1.6
15 33 37.2 1.1
16 34 52.0 0.8
17 35 41.7 1.0
18 36 38.7 1.0
19 37 35.8 1.1
20 38 33.3 1.2
21 39 36.1 1.1
22 41 33.2 1.2
23 42 15.5 2.6
11)取上述混合文库20μL，加入7μL ddH2O、1μL 1U/μL DNA聚合酶I大片段、3μLbuffer1，斡旋混匀后于PCR仪上进行反应，反应程序为25℃反应15min，80℃反应10min，冷却至4℃。
12)向上述体系中加入1μL环化引物(1μM)，斡旋混匀后于PCR仪上进行反应，反应程序为95℃反应3min，PCR仪中降温至4℃。
13)向上述体系中加入0.5μL T4 DNA连接酶，8μL buffer2，斡旋混匀后于PCR仪上进行反应，反应程序为25℃反应30min。
14)反应结束后取出，加入1μL消化酶Mix，斡旋混匀后与PCR仪上进行反应，反应程序为37℃反应30min，80℃反应20min，冷却至4℃。
15)反应结束后对其进行磁珠纯化，所选磁珠为海狸生物DNA片段筛选磁珠，所用体积为60μL，最后采用20μL ddH2O洗脱，其余步骤同说明书。
16)对上述环化文库进行Qubit定量，采用试剂盒为Qubit ssDNA检测试剂盒，随后进行上机测序，本实施例中测序试剂为MGISEQ-200RS高通量快速测序试剂套装(FCSPE150)，测序仪为MGI200。
本实施例中各个样本测序结果如下：
分别随机选取外周血、口腔拭子、宫颈脱落细胞样本各2例，采用Sanger测序对其BRCA1基因和BRCA2基因所有靶向序列进行阴阳性验证，本实施例中Sanger测序由擎科生物完成，比对结果如下：
实施例2
对若干细胞系进行建库及文库环化并上机测序，细胞系均购自ATCC，实施例2中引物摩尔用量如下表：
/>
/>
/>
实施例2中引物池1的总摩尔量投入量为45.8μM、引物池2的总摩尔投入量为38.9μM、引物池3的总摩尔投入量为23μM，总使用量为107.7μM，其余步骤同实施例1。
其中测得22RV1细胞系包含1个BRCA2基因上的致病突变，及其他本发明的引物组覆盖范围内测得BRCA1和BRCA2基因突变，Sanger测序峰图见图2及图3，其峰图符合杂合型***或缺失Sanger峰图，22RV1细胞系测得突变如下表，所述突变均通过Sanger验证，符合率100％：
Chr Start End Sanger REF ALT InterVar Otherinfo
13 32907536 32907537 √ TT - Uncertain significance het
13 32911888 32911888 √ A G Benign het
13 32913055 32913055 √ A G Benign hom
13 32913920 32913920 √ G A Likely benign het
13 32915005 32915005 √ G C Benign hom
13 32915411 32915414 √ AATT - Benign het
13 32929232 32929232 √ A G Benign het
13 32929387 32929387 √ T C Benign hom
13 32936646 32936646 √ T C Benign hom
13 32953388 32953388 √ T C Benign hom
13 32954030 32954030 √ - A Pathogenic het
17 41223094 41223094 √ T C Benign het
17 41234470 41234470 √ A G Benign het
17 41244000 41244000 √ T C Benign het
17 41244435 41244435 √ T C Benign het
17 41244936 41244936 √ G A Benign het
17 41245237 41245237 √ A G Benign het
17 41245466 41245466 √ G A Benign het
17 41249364 41249364 √ A - Benign het
17 41251931 41251931 √ G A Benign het
实施例3
对实施例1中样本文库，进行不同投入量的文库环化测试，所述投入量分别为每个文库取10ng、20ng、30ng、40ng，混合方式同实施例1，分别依次取总量100ng、200ng、300ng、400ng进行文库环化，环化方法同实施例1，最终环化文库浓度依次为1.23ng/μL、1.58ng/μL、1.69ng/μL、2.02ng/μL，分别上机测序后，均能满足覆盖度100％，所检出突变与Sanger测序结果完全一致。说明所提供的文库环化方法效率高，灵敏度好，可满足宽范围的不同浓度文库环化需求。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (7)

1.基于高通量测序平台的BRCA1/2基因突变检测的引物组，其特征在于，所述引物组包括分为三组的133对引物对，每对引物对的正向引物和反向引物5’端至3’端依次包括通用序列和特异性序列；
第一组引物对的正向引物的特异性序列如SEQ ID NO.1,2,3,4,5……44所示，对应的反向引物的特异性序列如SEQ ID NO.134,135,136,137,138……177所示；
第二组引物对的正向引物的特异性序列如SEQ ID NO.45,46,47,48,49……89所示，对应的反向引物的特异性序列如SEQ ID NO.178,179,180,181,182……222所示；
第三组引物对的正向引物的特异性序列如SEQ ID NO.90,91,92,93,94……133所示，对应的反向引物的特异性序列如SEQ ID NO.223,224,225,226,227……266所示。
2.根据权利要求1所述的基于高通量测序平台的BRCA1/2基因突变检测的引物组，其特征在于，所述133对引物对的用量范围比例如下表所示：
3.根据权利要求1所述的基于高通量测序平台的BRCA1/2基因突变检测的引物组，其特征在于，每对引物对的正向引物和反向引物的通用接头序列为与基因测序平台适配的接头序列。
4.根据权利要求1所述的基于高通量测序平台的BRCA1/2基因突变检测的引物组，其特征在于，所述高通量测序平台为MGI测序平台，每对引物对的正向引物的通用接头序列如SEQ ID NO.267所示，反向引物的通用接头序列如SEQ ID NO.268所示。
5.BRCA1/2基因突变检测的文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、使用权利要求1-4任一项所述的第一组引物对、第二组引物对、第三组引物对分别进行扩增样本基因；
S2、将步骤S1的第一组引物对扩增产物、第二组引物对扩增产物和第三组引物扩增产物按照1-3:3-7:5-11的比例混合纯化，得到纯化后的第一轮PCR扩增产物；
S3、以所述第一轮PCR扩增产物为模板进行第二轮PCR扩增反应；
S4、对第二轮PCR扩增产物进行纯化，得到所述BRCA1/2基因突变检测的文库。
6.根据权利要求5所述的BRCA1/2基因突变检测的文库构建方法，其特征在于，步骤S1中，样本的类型包括外周血、口腔拭子和宫颈脱落细胞。
7.根据权利要求5所述的BRCA1/2基因突变检测的文库构建方法，其特征在于，步骤S1中，所述引物组的总用量为107.7-134.4μM。
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