DE60126248T2 - Verwendung von brustkrebs membranproteine für behandlung, prophylaxe und diagnose von brustkrebs - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Identifizierung von Membranproteinen, von denen bisher nicht in menschlichen Brustkrebszellen berichtet worden ist und die biologische Targets bilden können, gegen die therapeutische Antikörper oder andere Pharmazeutika hergestellt werden können oder die als diagnostische und prognostische Marker für Brustkrebs und Brustkrebsmetastasen von Nutzen sind.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Brustkrebs ist der am häufigsten diagnostizierte Nicht-Hautkrebs bei Frauen in den Vereinigten Staaten. In bezug auf die Todesfälle, die mit Krebs verbunden sind, liegt er an zweiter Stelle nach dem Lungenkrebs. Ungefähr 180.000 neue Fälle von Brustkrebs wurden 1997 diagnostiziert, und es wird erwartet, daß etwa 44.000 Frauen an dieser Kranheit sterben (National Cancer Institute, www.nci.nih.gov, USA, 1999). In Großbritannien ist Brustkrebs bei weitem der häufigste Krebs bei Frauen, mit 34.600 neuen Fällen im Jahre 1998 (Cancer Research Campaign, www.crc.ors.uk, UK, 2000). Brustkrebs tritt zu neunundneunzig Prozent bei Frauen auf. Das Risiko für die Entwicklung von Brustkrebs steigt mit dem Alter stetig an; das Lebensdauerrisiko einer Entwicklung von Brustkrebs beträgt bei Frauen in den USA schätzungsweise 1 zu 8. Die jährlichen Kosten für die Brustkrebsbehandlung in den USA betragen ungefähr $10 Milliarden (Fuqua, et. al. 2000, American Association for Cancer Research, www.aacr.org, USA). Die Brustkrebshäufigkeit stieg über die letzten fünf Jahrzehnte an, hat aber seit kurzem ein Plateau erreicht. Dies kann einen Zeitraum der Früherkennung von Brustkrebs durch Mammographie wiederspiegeln. Eine Anzahl von anerkannten Faktoren kann das Risiko von Frauen, zu erkranken, erhöhen. Diese umfassen hohes Lebensalter, eine Brustkrebsvorgeschichte, eine signifikante Strahlungsbelastung, eine starke familiäre Brustkrebsvorgeschichte, obere sozioökonomische Klasse, Nulliparität, eine vorzeitige Menarche, eine späte Menopause oder ein höheres Alter als 30 Jahre bei der ersten Schwangerschaft. Frühzeitiger längerer Gebrauch von oralen Verhütungsmitteln erhöht scheinbar das Risiko leicht. Ein längerer Östrogenersatz nach der Menopause erhöht das Risiko um 20 bis 40 %. Es ist spekuliert worden, daß eine sinkendes Menarchealter, sich verändernde Ge burtsmuster oder eine Erhöhung der Verwendung von exogenen Östrogenen zur Erhöhung der Brustkrebshäufigkeit beiträgt (Fuqua, et. al. 2000, American Association for Cancer Research, www.aacr.org, USA).
  • Ursachen von Brustkrebs
  • Brustkrebs ist eine heterogene Krankheit. Obwohl weibliche Hormone eine bedeutende Rolle bei der Steuerung des Beginns und der Entwicklung von vielen Brusttumoren spielen, gibt es eine Vielzahl von anderen erkannten und unbekannten involvierten Faktoren. Störungen in identifizierten Onkogenen umfassen die Amplifikation des HER-2- und des epidermalen Wachstumfaktorrezeptorgens und eine Überexprimierung von Cyclin D1. Die Überexprimierung von diesen Onkogenen ist mit einer signifikant schlechteren Prognose verbunden. Ebenso sind die genetischen Veränderungen oder der Verlust von Tumorsuppressionsgenen, wie des p53-Gens, bei Brustkrebs gut dokumentiert worden und sind ebenso mit einer schlechteren Prognose verbunden. Forscher haben zwei Gene, genannt BRCA1 und BRCA2, identifiziert, welche für den familiären Prämenopause-Brustkrebs prognostisch sind. Eine Bewertung des genetischen Risikos ist nun möglich, was die Identifizierung von Kandidaten für Chemoprophylaxeversuche verbessern kann (Fuqua, et. al. 2000, American Association for Cancer Research, www.aacr.org, USA).
  • Diagnose
  • Frühzeitige Diagnose von Brustkrebs ist lebenswichtig, um den günstigsten Ausgang der Behandlung sicherzustellen. Viele Länder mit fortschrittlichen Gesundheitssystemen haben Screening-Programme für Brustkrebs eingeführt. Dies nimmt typischerweise die Form von regelmäßigen Röntgenaufnahmen der Brust (Mammographie) zwischen dem 50. und 60. Lebensjahr an, wo die größte Wirkung dieser Intervention gezeigt worden ist. Einige Behörden befürworteten die Verlängerung dieser Programme über 60 hinaus und die Altersgruppe von 40 bis 49. Gesundheitsbehörden in vielen Ländern werben ebenso für die Wichtigkeit der regelmäßigen Selbstkontrolle der Brust durch Frauen. Anomalien, die während dieser Screeening-Verfahren nachgewiesen werden, und Fälle, die als symptomatisch dargestellt werden, würden normalerweise durch Aspirationszytologie, Kernpunktionsbiopsie mit einer stereotaktischen oder Ultraschalltechnik für nicht tastbare Läsionen oder Inzisions- oder Exzisionsbiopsie bestätigt werden. Gleichzeitig würden andere Informationen, die für die Behandlungsoptionen und Prognose relevant sind, wie Östrogen- (ER) und Progesteron-Rezeptor- (PR) -Status, bestimmt werden (National Cancer Institute, USA, 2000, Breast Cancer PDQ, www.nci.nih.gov).
  • Krankheits-Staging und Prognose
  • Staging ist das Verfahren, um herauszufinden, wie weit sich der Krebs ausgebreitet hat. Das Staging-System des American Joint Committee on Cancer (AJCC), ebenso bekannt als das TNM-System, ist eines, das sehr oft für Brustkrebs verwendet wird. Das TNM-System zum Staging ergibt drei Schlüsselinformationen:
    Der Buchstabe T, gefolgt von einer Zahl von 0 bis 4, beschreibt die Tumorgröße und die Ausbreitung auf der Haut oder Brustwand unter der Brust. Eine höhere Zahl bedeutet einen größeren Tumor und/oder größere Ausbreitung im Gewebe nahe der Brust.
  • Der Buchstabe N, gefolgt von einer Zahl von 0 bis 3, gibt an, ob sich der Krebs auf Lymphknoten nahe der Brust ausgebreitet hat, und wenn dem so ist, ob die betroffenen Knoten an anderen Strukturen unter dem Arm haften.
  • Der Buchstabe M, gefolgt von 0 oder 1, zeigt, ob der Krebs auf anderen Organen des Körpers oder auf Lymphknoten, welche nicht neben der Brust liegen, metastasiert.
  • Um diese Informationen ein wenig deutlicher zu machen, können die TNM-Beschreibungen zusammen in eine einfachere Gruppe von Stadien gruppiert werden, markiertes Stadium 0 bis Stadium IV (0–4). Je niedriger im allgemeinen die Zahl, desto weniger hat sich der Krebs ausgebreitet. Eine höhere Zahl, wie Stadium IV (4), bedeutet einen ernsteren Krebs. (American Cancer Society, 2000, USA, www.cancer.org) Überleben von Brustkrebs nach Stadien
    Figure 00030001
    Figure 00040001
    • (American Cancer Society, 2000, USA, www.cancer.org)
  • Obwohl das anatomische Stadium (die Größe des primären Tumors, das Betroffensein der Achsellymphknoten) ein wichtiger prognostischer Faktor ist, können andere Merkmale prognostischen Wert haben. Beispielsweise zeigten die Studien der National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project (NSABP) und der International Breast Cancer Study Group (IBCSG), daß die nukleare Klasse bzw. histologische Klasse des Tumors wichtige Indikatoren für das Ergebnis im Anschluß an eine begleitende Brustkrebstherapie sind. Es gibt fundierte Beweise, daß der Östrogenrezeptorstatus und Messungen der proliferativen Kapazität des primären Tumors (Thymidinmarkierungsindex oder durchflußzytometrische Messungen der S-Phase und Ploidie) bedeutenden unabhängigen prognostischen Wert haben können. Bei Krankheiten im Stadium II kann der PR-Status größeren prognostischen Wert als der ER-Status haben. Tumorvaskularisierung, c-erbB-2-, c-myc-, p53-Expression und Lymphgefäßinvasion können ebenso prognostische Indikatoren bei Patienten mit Brustkrebs sein (National Cancer Institute, USA, 2000, Breast Cancer PDQ, www.nci.org und die Verweise darin).
  • Behandlung
  • Chirurgische Behandlung, Strahlentherapie, Hormontherapie und Chemotherapie sind die häufigsten Behandlungen von Brustkrebs.
  • Chirurgische Behandlung
  • Die meisten Frauen mit Brustkrebs werden eine gewisse Art einer chirurgischen Behandlung erhalten. Der Zweck der chirurgischen Behandlung ist es, so viel wie möglich von dem Krebs zu entfernen. Das kann in Form einer Tumorentfernung oder einer stärkerer Mastektomie mit Brustrekonstruktion sein. Die chirurgische Behandlung kann ebenso mit anderen Behandlungen, wie Chemotherapie, Hormontherapie oder Strahlentherapie, kombiniert werden. Die chirurgische Behandlung kann ebenso durchgeführt werden, um herauszufinden, ob sich der Brustkrebs in den Lymphknoten unter dem Arm (Achseldissektion) ausgebreitet hat, um ein normaleres Erscheinungsbild wieder herzustellen (Wiederherstellungschirurgie) oder um die Symptome von fortgeschrittenem Krebs zu lindern.
  • Chemotherapie
  • Chemotherapie ist die Verwendung von antineoplastischen Substanzen zur Tötung der Krebszellen. Wenn die Chemotherapie nach einer chirurgischen Behandlung angewandt wird (zusätzliche Therapie), kann sie die Wahrscheinlichkeit des Wiederauftretens von Krebs verringern. Chemotherapie kann ebenso als die Hauptbehandlung für Frauen verwendet werden, deren Krebs weit ausgebreitet ist, wenn er festgestellt wird, oder sich nach der anfänglichen Behandlung weit ausbreitet. Neoadjuvante Chemotherapie erhält man vor der chirurgischen Behandlung, oftmals um den Tumor zu schrumpfen und die Entfernung zu erleichtern. Chemotherapie erhält man in Zyklen, wobei jedem Behandlungszeitraum eine Erholungsdauer folgt. Der gesamte Verlauf dauert drei bis sechs Monate. Es ist oftmals effektiver, mehrere Arzneimittel als ein einziges Arzneimittel zu verwenden. Die am meisten verwendeten Kombinationen sind: Cyclophosphamid, Methotrexat und Fluoruracil (CMF); Cyclophosphamid, Doxorubicin (Adriamycin) und Fluoruracil (CAF); Doxorubicin (Adriamycin) und Cyclophosphamid (AC), mit oder ohne Paclitaxel (Taxol), Doxorubicin (Adriamycin), gefolgt von CMF.
  • Strahlentherapie
  • Strahlentherapie wird üblicherweise bei der Brustkrebsbehandlung angewandt. Sie kann verwendet werden, um die Größe eines Tumors vor der chirurgischen Behandlung zu verkleinern oder um die restlichen Krebszellen in der Brust, Brustwand oder dem Unterarmbereich nach der chirurgischen Behandlung zu zerstören.
  • Hormontherapie und Chemoprophylaxe
  • Das Hormon Östrogen kann das Wachstum von Brustkrebszellen bei manchen Frauen erhöhen. Ein Arzneimittel wie Tamoxifen, welches die Wirkung von Östrogen blockiert, wird verabreicht, um dieses Wachstum zu bekämfen. Ein anderes neueres Arzneimittel, Raloxifene, blockiert ebenso die Wirkung von Östrogen auf Brustgewebe und Brustkrebs. Es gibt zunehmende Beweise, daß diese Anti-Östrogen-Behandlungen ebenso eine Rolle bei der Chemoprophylaxe von Brustkrebs bei risikoreichen Individuen spielen können.
  • Immuntherapie
  • Trastuzumab (Herceptin) ist ein neues immuntherapeutisches Mittel, das sich an einen Wachstumsfaktorrezeptor, bekannt als c-erbB2/HER2/neu, anlagert, der in kleinen Mengen auf der Oberfläche von normalen Brustzellen und mit viel höheren Niveaus bei einigen Brustkrebsar ten vorliegt. Dieses Protein kann den Krebs veranlassen, zu wachsen und sich schneller auszubreiten. Herceptin kann das c-erbB2/HER2/neu-Protein an der Beschleunigung des Brustkrebszellwachstums hindern. Es kann ebenso das Immunsystem dabei unterstützen, den Krebs stärker anzugreifen. Mit Herceptin beginnt man derzeit, wenn die Standardhormon- oder -chemotherapie nicht mehr wirkt (American Cancer Society, 2000, USA, www.cancer.org).
  • Therapeutische Herausforderungen
  • Hauptherausforderungen bei der Brustkrebsbehandlung sind es, die Früherkennungsrate zu verbessern, neue nicht-invasive Marker zu finden, die verwendet werden können, um dem Krankheitsverlauf zu verfolgen und einen Rückfall zu erkennen, und verbesserte und weniger toxische Therapien zu finden, speziell für fortgeschrittenere Krankheiten, bei denen eine Überlebenszeit von 5 Jahren noch sehr selten ist. Es besteht eine große Notwendigkeit, Ziele zu identifizieren, die für Krebszellen spezifischer sind, idealerweise die, die auf der Oberfläche der Tumorzellen exprimiert werden, so daß sie durch vielversprechende neue Ansätze, wie immuntherapeutische und zielgerichtete Toxine angegriffen werden können.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und/oder Verwendungen für Screening, Diagnose, Prognose und Therapie von Brustkrebs, für das Überwachen der Wirksamkeit der Brustkrebsbehandlung, und für die Arzneimittelentwicklung zur Behandlung von Brustkrebs bereit.
  • Wir verwendeten Massenspektrometrie zur Identifizierung von Peptiden, erzeugt durch Gelelektrophorese und tryptische Digestion von Membranproteinextrakten von laborkultivierten menschlichen Brustzellinien. Peptidsequenzen wurden mit bestehenden cDNA-Datenbanken und entsprechenden identifizerten Gensequenzen verglichen. In Brustzellmembranen ist von vielen dieser Peptidsequenzen bisher nicht berichtet worden, so daß sie eine neue Gruppe von Proteinen mit potentiellem diagnostischem und/oder therapeutischem Wert darstellen.
  • Daher stellt ein erster Aspekt der Erfindung Verfahren zur Diagnose von Brustkrebs bereit, welches das Analysieren einer Probe von Brustgewebe durch eindimensionale Elektrophorese umfaßt, um ein Brustkrebs-assoziiertes Membranprotein (BCMP) nachzuweisen. Nur BCMP 17 (BST-2) soll einen Teil der hierin offenbarten Erfindung bilden. Der Ausdruck ein „BCMP" oder „BCMPs" soll sich nur auf BCMP 17 (BST-2) beziehen. Diese Verfahren auch sind für Screening, Prognose, Überwachen der Ergebnisse der Therapie, Arzneimittelentwicklung und Entdeckung neuer Targets für die Arzneimittelbehandlung geeignet.
  • Ein zweiter Aspekt der Erfindung stellt die Verwendung von Verbindungen, wie in den Ansprüchen 1, 4 und 19 definiert, für die Herstellung eines Medikaments bereit, das in Verfahren zum Behandeln von Brustkrebs nützlich ist, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung an einen Patienten, die die Expression oder die biologische Aktivität (oder beides) eines BCMP bei Patienten mit Brustkrebs moduliert (z. B. hochreguliert oder herunterreguliert) oder ergänzt, um (a) den Ausbruch oder die Entwicklung von Brustkrebs zu verhindern; (b) das Fortschreiten von Brustkrebs zu verhindern; oder (c) die Symptome von Brustkrebs zu lindern.
  • Ein dritter Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zum Screening von Verbindungen bereit, die die Expression oder biologische Aktivität eines BCMP modulieren (z. B. hochregulieren oder herunterregulieren).
  • Ein vierter Aspekt der Erfindung stellt die Verwendung von monoklonalen und polyklonalen Antikörpern bereit, die immunspezifisch an ein BCMP binden können.
  • Daher stellt in einem fünften Aspekt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Screening und/oder Diagnose von Brustkrebs bei einem menschlichen Subjekt bereit, wobei das Verfahren den Schritt des Identifizierens der Gegenwart oder Abwesenheit von BCMP 17, definiert durch ein scheinbares Molekulargewicht von 15 kDa, einer Peptidsequenz aus einer tryptischen Digestion LQDASAEVER und SwissProt-Hinterlegungsnummer Q10589, in einer biologischen Probe, die aus dem menschlichen Subjekt erhalten wird, umfaßt.
  • In einem sechsten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für das Überwachen und/oder Analysieren der Brustkrebsbehandlung bei einem menschlichen Subjekt bereit, umfassend den Schritt des Identifizierens der Gegenwart oder Abwesenheit von BCMPs, wie oben definiert, in einer biologischen Probe, die aus dem menschlichen Subjekt erhalten wird.
  • In einem siebenten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren der Gegenwart oder Abwesenheit von metastatischen Brustkrebszellen in einer biologischen Probe, die aus einem menschlichen Subjekt erhalten wird, bereit, umfassend den Schritt des Identifizierens der Gegenwart oder Abwesenheit der BCMPs, wie oben definiert.
  • In einem achten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Überwachen und/oder Analysieren der Brustkrebsbehandlung in einem menschlichen Subjekt bereit, umfassend den Schritt der Bestimmung, ob die BCMPs, wie oben definiert, in einer biologischen Probe, die aus einem Patienten erhalten wird, erhöht/verringert werden.
  • Die verwendete biologische Probe kann aus jeder Quelle sein, wie eine Serumprobe oder eine Gewebeprobe, beispielsweise Brustgewebe. Wenn man beispielsweise nach einem Nachweis für metastatischen Brustkrebs sucht, würde man an den Hauptstellen von Brustmetastasen, beispielsweise Lymphknoten, Leber, Lunge und/oder Knochen, suchen.
  • Diese Aspekte der vorliegenden Erfindung werden in den Ansprüchen dargestellt und nachstehend erläutert.
  • Kurzbeschreibung der Zeichnunngen
  • 1 bis 8 und 10 sollen keinen Teil der hierin offenbarten Erfindung bilden.
  • 9 zeigt das Niveau an mRNA-Expression in verschiedenen Geweben für BCMP 17.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die nachstehend ausführlich beschriebene Erfindung stellt Verfahren für klinisches Screening, Diagnose und Prognose von Brustkrebs bei einem Säugersubjekt zum Identifizieren von Patienten, die am wahrscheinlichsten auf eine spezielle therapeutische Behandlung reagieren, für das Überwachen der Ergebnisse der Brustkrebstherapie, für Arzneimittelscreening und Arzneimittelentwicklung bereit. Die Erfindung umfaßt ebenso die Verwendung von therapeutischen Zusammensetzungen für ein Säugersubjekt, um Brustkrebs zu behandeln oder zu verhindern. Das Säugersubjekt kann ein nicht menschlicher Säuger sein, aber ist bevorzugt ein Mensch, stärker bevorzugt eine menschliche erwachsene Person, d. h. ein menschliches Subjekt mit einem Alter von mindestens 21 (stärker bevorzugt mindestens 35, mindestens 50, mindestens 60, mindestens 70 oder mindestens 80). Hinsichtlich der Klarheit der Offenbarung und nicht zur Einschränkung wird die Erfindung in bezug auf die Analyse von Brustgewebeproben beschrieben. Jedoch können, wie dem Fachmann bekannt ist, die nachstehend beschriebenen Assays und Techniken auf andere Typen von Patientenproben angewandt werden, einschließlich eine Körperflüssigkeit (z. B. Blut, Serum, Plasma oder Speichel), eine Gewebeprobe von einem Patient mit dem Risiko von Brustkrebs (z.B. eine Biopsie, wie eine Brustgewebebiopsie) oder ein Homogenat davon. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind zum Screening, Diagnose und Prognose von einem lebenden Subjekt besonders geeignet, können aber ebenso für die Diagnose eines Subjekts post mortem verwendet werden, um beispielsweise Familienmitglieder mit dem Risiko zur Entwicklung derselben Krankheit zu identifizieren.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich Brustgewebe auf die Brust selbst sowie das Gewebe, das daneben und/oder innerhalb der Strata liegt, die sich unterhalb der Brust befinden.
  • Brustkrebs-assoziierte Membranproteine (BCMPs)
  • In einem Aspekt der Erfindung wird die eindimensionale Elektrophorese verwendet, um Brustgewebe von einem Subjekt, bevorzugt einem lebenden Subjekt, zu analysieren, um die Expression von einem oder mehreren Brustkrebs-assoziierten Membranproteinen (BCMPs) für Screening oder Diagnose von Brustkrebs zu messen, um die Prognose von einem Brustkrebspatient zu bestimmen, um die Wirksamkeit der Brustkrebstherapie zu überwachen, oder für die Arzneimittelentwicklung. Wie hierin verwendet, bedeutete die „eindimensionale Elektrophorese" (1D-Elektrophorese) eine Technik, umfassend denaturierende Elektrophorese; dies erzeugt ein eindimensionales Gel (1D-Gel), welches eine Vielzahl von getrennten Proteinen enthält. Bevorzugt nutzt der Schritt der denaturierenden Elektrophorese die Polyacrylamidelektrophorese in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS-PAGE). Besonders bevorzugt sind sehr genaue und automatisierbare Verfahren und Vorrichtungen („die Bevorzugte Technologie"), die in WO 98/23950 beschrieben werden, mit speziellem Verweis auf das bevorzugte Protokoll auf den Seiten 19 bis 29. Kurz gesagt, stellt die Bevorzugte Technologie effiziente, computerunterstützte Verfahren und Vorrichtungen zum Identifizieren, Selektieren und Charakterisieren von Biomolekülen in einer biologischen Probe bereit. Eine eindimensionale Anordnung wird durch Trennen von Biomolekülen auf einem eindimensionalen Gel gemäß ihrer elektrophoretischen Mobilität erzeugt. Ein computergeneriertes digitales Profil der Anordnung wird erzeugt, welches die Identität, das scheinbare Molekulargewicht von einer Vielzahl von Biomolekülen, die in der eindimensionalen Anordnung detektiert wurden, darstellt, wodurch der computerunterstützte Vergleich von Profilen aus mehreren biologischen Proben sowie die computerunterstützte Exzision der interessierenden getrennten Proteine ermöglicht wird.
  • Ein bevorzugter Scanner zum Detektieren fluoreszenz-markierter Proteine ist in WO 96/36882 und in den Ph.D.-Thesen von David A. Basiji mit dem Titel „Development of a High-throughput Fluorescence Scanner Employing Internal Reflection Optics and Phasesensitive Detection (Total Internal Reflection, Electrophoresis)", University of Washington (1997), Band 58/12-B von Dissertation Abstracts International, Seite 6686, beschrieben. Diese Dokumente beschreiben einen Bildscanner, der speziell für automatisierten, integrierten Betrieb bei hohen Geschwindigkeiten konstruiert wurde. Der Scanner kann Gele abbilden, die mit Fluoreszenzfarbstoffen oder Silberfärbungen sowie Speicherleuchtstoffolien gefärbt worden sind. Die Basiji-Thesen stellen ein phasenempfindliches Detektionssystem zum Unterscheiden modulierter Fluoreszenz vom Grundrauschen aufgrund von Laserstreuung oder homogener Fluoreszenz bereit, aber der Scanner kann ebenso in einer nicht-phasenempfindlichen Weise betrieben werden. Diese Fähigkeit zur phasenempfindlichen Detektion würde die Empfindlichkeit der Vorrichtung um eine Größenordnung oder mehr im Vergleich zu konventionellen Fluoreszenzbildgebungssystemen erhöhen. Die erhöhte Empfindlichkeit würde die Probenherstellungslast auf den Vorrichtungen stromaufwärts verringern, während die verbesserte Bildqualität die Bildanalyse stromabwärts in dem Verfahren vereinfacht.
  • Ein stärker bevorzugter Scanner ist der Apollo 2-Scanner (Oxford Glycosciences, Oxford, UK), der eine modifizierte Version des oben beschrieben Scanners ist. Bei dem Apollo 2-Scanner wird das Gel durch den Scanner auf einem Meßspindel-Antriebssystem transportiert. Dies ist gegenüber dem Legen der Glasplatte auf das riemengetriebene System, das in den Basiji-Thesen beschrieben wird, bevorzugt, da es ein reproduzierbares Mittel zum genauen Transport des Gels hinter der Abbildungsoptik bereitstellt.
  • Bei dem Apollo 2-Scanner wird das Gel vor drei Ausrichtungsstopps gesichert, die die Glasplatte in einer bekannten Position festhalten. Dadurch kann zusammen mit dem obigen genannten Präzisionstransportsystem die absolute Position des Gels vorhergesagt und aufge zeichnet werden. Dies stellt sicher, daß die Koordinaten von jedem Merkmal auf dem Gel genauer bestimmt und, wenn gewünscht, einem Schneideroboter zur Exzision des Merkmals genauer übermittelt werden können. Bei dem Apollo 2-Scanner hat der Träger, der das Gel hält, vier integrale fluoreszierende Marker zur Verwendung, um die Bildgeometrie zu korrigieren. Diese Marker sind ein Qualitätskontrollmerkmal, welches bestätigt, daß das Scannen korrekt durchgeführt worden ist.
  • Im Vergleich zu dem in den Basiji-Thesen beschriebenen Scanner sind die optischen Komponenten des Apollo 2-Scanners umgekehrt worden. Bei dem Apollo 2-Scanner befinden sich der Laser, der Spiegel, der Wellenleiter und andere optische Bestandteile über der Glasplatte, die gescannt wird. Der in den Basiji-Thesen beschriebene Scanner weist diese Komponenten darunter auf. Bei dem Apollo 2-Scanner wird die Glasplatte auf der Scannergelseite nach unten montiert, so daß der optische Weg durch die Glasplatte bleibt. Dadurch werden jegliche Teilchen des Gels, die von der Glasplatte abbrechen können, eher auf den Grund der Vorrichtung als in die Optiken fallen. Dies beeinflußt nicht die Funktionalität des Systems, erhöht aber seine Zuverlässigkeit.
  • Noch stärker bevorzugt ist der Apollo 3-Scanner, bei dem der Signalausgang auf die vollständigen 16-bit-Daten ohne jegliche Peaksättigung oder ohne Quadratwurzelkodierung des Signals digitalisiert wird. Ein Kompensationsalgorithmus ist ebenso angewendet worden, um jegliche Variation in der Detektionsempfindlichkeit entlang des Weges des Abtaststrahls zu korrigieren. Diese Variation erfolgt aufgrund von Anomalien in den Optiken und Unterschieden in der Sammelwirksamkeit über dem Wellenleiter. Eine Kalibrierung wird durchgeführt unter Verwendung einer Plexiglasplatte mit einem gleichmäßigen Fluoreszenzdurchsatz. Die Daten, die aus einem Scan von dieser Platte erhalten werden, werden verwendet, um die Multiplikationsfaktoren zu bestimmen, welche benötigt werden, um das Signal aus jedem Pixelniveau auf ein Zielniveau zu erhöhen. Diese Faktoren werden dann in anschließenden Scans von Gelen verwendet, um jegliche internen optischen Variationen zu entfernen.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Brustkrebs-assoziiertes Membranprotein" (BCMP) auf ein Merkmal (z. B. ein Band in einem 1D-Gel), das durch 1D-Elektrophorese einer Brustgewebeprobe detektierbar ist und in Brustgewebe von einem Subjekt mit Brustkrebs vorliegt.
  • Die hierin offenbarten BCMPs sind in Membranproteinextrakten von laborkultivierten menschlichen Brustzellinien durch die Verfahren und Vorrichtung der Bevorzugten Technologie identifiziert worden (im allgemeinen 1D-Gelelektrophorese und tryptische Digestion von Membranproteinextrakten von laborkultivierten menschlichen Brustzellinien). Peptidesequenzen wurden mit den SWISS-PROT- und trEMBL-Datenbanken (gehalten von dem Swiss Institute of Bioinformatics (SIB) und dem European Bioinformatics Institue (EBI), die unter http://www.expasy.com/ zugänglich sind) und der GenBank-Datenbank (gehalten von dem National Institute of Health (NIH), das unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/ zugänglich ist) und entsprechenden identifizierten Genen verglichen. Veröffentlichte Berichte und Datenbanken, einschließlich Datenbanken von Proteinen, die in normalen menschlichen Brustluminalepithelzellen exprimiert werden (Page et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1999, 96 (22): 12589–94 ; GB-Patentanmeldung Nr. 9919258.5), wurden durchsucht, um zu ermitteln, ob vorher gezeigt worden ist, daß die Produkte von jeden der identifizierten Gene in der Membran von menschlichen Brustzellen oder menschlichen Brustkrebszellen exprimiert werden. Zwei Gruppen von BCMPs sind identifiziert worden: (1) Proteinsequenzen, die konzeptionellen Translationen von cDNAs entsprechen, für die kein Protein oder biologische Funktion beschrieben worden ist, und für die die vorliegende Erfindung die Existenz des Proteinproduktes und seine Lokalisierung in den Membranen von menschlichen Brustkrebszellen definiert; (2) bekannte Proteine, die zuvor nicht in Brustzellmembranen beschrieben worden sind und von denen die vorliegende Erfindung zeigt, daß sie zusätzlich bei menschlichem Brustkrebs involviert sein können. BCMP 17 kann als Marker für Brustzellen, insbesondere Brustkrebszellen, genutzt werden. Die Aminosäuresequenz von diesen BCMP 17 wird durch die Swiss Prot-Hinterlegungsnummer Q10589 identifiziert, und die Sequenz wird hierin durch Verweis aufgenommen. Das scheinbare Molekulargewicht beträgt 15 KDa und die Aminosäuresequenzen von Peptiden aus der tryptischen Digestion von BCMP 17, identifiziert durch Tandem-Massenspektrometrie und Datenbankforschung, wie in den Beispielen nachstehend beschrieben, ist LQDASAEVER.
  • Das oben beschriebene BCMP 17 kann in der Diagnose und Therapie von Brustkrebs, die nachstehend ausführlicher erläutert werden, verwendet werden.
  • Für jedes gegebene BCMP wird das detektierte Niveau, das beim Analysieren von Brustgewebe aus Subjekten mit Brustkrebs erhalten wird, in bezug auf das detektierten Niveau, das beim Analysieren von Brustgewebe aus Subjekten ohne Brustkrebs erhalten wird, von dem speziellen Analyseprotokoll und Detektionsverfahren, das verwendet wird, abhängen, vorausgesetzt, daß dieses BCMP zwischen normalem und erkranktem Gewebe unterschiedlich exprimiert wird. Folglich erwägt die vorliegende Erfindung, daß jedes Labor einen Referenzbereich für jedes BCMP in Subjekten ohne Brustkrebs gemäß dem Analyseprotokoll und dem Detektionsverfahren in Verwendung etablieren wird, wie es in der Diagnosetechnik üblich ist. Bevorzugt sind mindestens eine positive Kontrollbrustgewebeprobe von einem Subjekt, von dem bekannt ist, daß es Brustkrebs hat, oder mindestens eine negative Kontrollbrustgewebeprobe von einem Subjekt, von dem bekannt ist, daß es keinen Brustkrebs hat (und stärker bevorzugt sowohl eine positive als auch eine negative Kontrollprobe) in jeder Charge von analysierten Testproben vorgesehen.
  • In einer Ausführungsform wird das Expressionsniveau eines Proteins in bezug auf einen Ausgangswert bestimmt, der als das Signalniveau definiert wird, das aus einer proximalen Region des Bildes erhalten wird, das (a) zu dem speziellen, in Frage kommenden Merkmal in der Fläche äquivalent ist; und (b) kein erkennbares Proteinmerkmal enthält.
  • BCMPs können für Detektion, Prognose, Diagnose oder Überwachung von Brustkrebs oder für die Arzneimittelentwicklung verwendet werden. In einer Ausführungsform der Erfindung wird Brustgewebe von einem Subjekt (z.B. ein Subjekt mit Brustkrebsverdacht) durch 1D-Elektrophorese zur Detektion von ein oder mehreren der BCMPs analysiert. Eine verringerte Häufigkeit von dem einen oder mehreren BCMPs in dem Brustgewebe von dem Subjekt in bezug auf Brustgewebe von einem Subjekt oder Subjekten ohne Brustkrebs (z. B. eine Kontrollprobe) oder eines zuvor festgelegten Referenzbereiches gibt die Gegenwart oder Abwesenheit von Brustkrebs an.
  • Es wird für einen Fachmann offensichtlich sein, das ein gegebenes BCMP gemäß den Daten, die für das BCMP bereitgestellt werden, beschrieben werden kann. Das BCMP ist ein Protein, das eine Peptidsequenz umfaßt, die für das BCMP beschrieben ist (wobei es bevorzugt eine Vielzahl, stärker bevorzugt alle Peptidsequenzen, die für das BCMP beschrieben sind, umfaßt).
  • In einer Ausführungsform wird Brustgewebe von einem Subjekt hinsichtlich der quantitativen Detektion der BCMPs analysiert, wobei eine Veränderung der Häufigkeit des BCMP in dem Brustgewebe von dem Subjekt in bezug auf Brustgewebe von einem Subjekt oder Subjekten ohne Brustkrebs (z. B. eine Kontrollprobe oder ein zuvor festgelegter Referenzbereich) die Gegenwart von Brustkrebs angibt.
  • Für jedes BCMP stellt die vorliegende Erfindung außerdem die Verwendung bereit von: (a) einem Präparat, umfassend das isolierte BCMP; (b) einem Präparat, umfassend ein oder mehrere Fragmente des BCMP; und (c) Antikörper, die an das BCMP, an die Fragmente oder sowohl an BCMP als auch an die Fragmente binden. Wie hierin verwendet, ist ein BCMP „isoliert", wenn es in einem Präparat vorliegt, das im wesentlichen frei von kontaminierenden Proteinen ist, d. h. ein Präparat, bei dem weniger als 10 % (bevorzugt weniger als 5 %, stärker bevorzugt weniger als 1 %) des vorhandenen Gesamtproteins kontaminierendes Protein/kontaminierende Proteine ist/sind. Ein kontaminierendes Protein ist ein Protein mit einer signifikant unterschiedlichen Aminosäuresequenz als der des isolierten BCMPs, wie durch Massenspektralanalyse bestimmt wird. Wie hierin verwendet, ist eine „signifikant unterschiedliche" Sequenz eine, die es erlaubt, daß das kontaminierende Protein von dem BCMP durch Massenspektralanalyse, die gemäß dem Referenzprotokoll durchgeführt wird, getrennt wird.
  • Die BCMPs können durch jedes dem Fachmann bekannte Verfahren analysiert werden, einschließlich die hierin beschriebene Bevorzugte Technologie, Kinaseassays, Enzymassays, Bindungsassays und andere funktionelle Assays, Immunoassays und Western-Blot, sind aber nicht darauf beschränkt. In einer Ausführungsform werden die BCMPs auf einem 1-D-Gel aufgrund ihrer Molekulargewichte getrennt und durch Färben des Gels sichtbar gemacht. In einer Ausführungsform werden die BCMPs mit einem Fluoreszenzfarbstoff gefärbt und mit einem Fluoreszenzscanner abgebildet: Sypro Red (Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon) ist ein geeigneter Farbstoff für diesen Zweck. Ein bevorzugter Fluoreszenzfarbstoff wird in US-Anmeldung Nr. 09/412, 168, eingereicht am 5. Oktober 1999, die hierin in ihrer Gesamtheit durch Verweis aufgenommen wird, beschrieben.
  • Alternativ können BCMPs in einem Immunoassay detektiert werden. In einer Ausführungsform wird ein Immunoassay durch Kontaktieren einer Probe eines zu untersuchenden Subjekts mit einem Anti-BCMP-Antikörper unter Bedingungen, bei denen die immunospezifische Bindung stattfinden kann, wenn das BCMP vorliegt, und Detektieren oder Messen der Menge jeder immunospezifischen Bindung durch den Antikörper durchgeführt. Anti-BCMP-Antikörper können durch die hierin gelehrten Verfahren und Techniken hergestellt werden.
  • In einer Ausführungsform kann die Bindung von Antikörper in Gewebeschnitten verwendet werden, um abweichende BCMP-Lokalisierung oder ein abweichendes Niveau von einem oder mehreren BCMPs zu detektieren. In einer speziellen Ausführungsform kann der Antikörper gegen BCMP verwendet werden, um ein Patientengewebe (z. B. eine Brustgewebebiopsie) hinsichtlich des Niveaus des BCMP zu analysieren, wo ein abweichendes Niveau an BCMP für Brustkrebs indikativ ist. Wie hierin verwendet, bedeutet ein „abweichendes Niveau" ein Niveau, das im Vergleich zu dem Niveau bei einem Subjekt ohne Brustkrebs oder einem Referenzniveau erhöht oder verringert wird. Wenn gewünscht, kann der Vergleich mit einer entsprechenden Probe von demselben Subjekt, entnommen aus einem Teil des Körpers, der nicht von Brustkrebs befallen ist, durchgeführt werden.
  • Ein geeigneter Immunoassay kann verwendet werden, einschließlich und ohne Einschränkung konkurrierende und nicht-konkurrierende Assaysysteme unter Verwendung von Verfahren wie Western-Blots, Radioimmunoassays, ELISA (heterologer Enzym-Immunassay), "Sandwich"-Immunoassays, Immunopräzipitationsassays, Precipitinreaktionen, Geldiffusionsprecipitinreaktionen, Immunodiffusionsassays, Agglutinationsassays, Komplement-Fixationsassays, immunoradiometrische Assays, Fluoreszensimmunoassays und Protein-A-Immunoassays.
  • Beispielsweise kann ein BCMP in einer flüssigen Probe (z. B. Blut, Urin oder Brustgewebehomogenat) mittels eines Zweischritt-Sandwich-Assays detektiert werden. Im ersten Schritt wird ein Fängerreagens (z. B. ein Anti-BCMP-Antikörper) verwendet, um das BCMP zu binden. Das Fängerreagens kann gegebenenfalls auf einer festen Phase immobilisiert sein. Im zweiten Schritt wird ein direkt oder indirekt markiertes Nachweisreagens verwendet, um das gebundene BCMP zu detektieren. In einer Ausführungsform ist die Nachweisreagens ein Lectin. Jedes Lectin kann für diesen Zweck verwendet werden, das bevorzugt eher an das BCMP als an andere Isoformen, die dasselbe Kernprotein wie das BCMP haben, oder an andere Proteine, die die Antigendeterminante, die durch den Antikörper erkannt wird, teilen, bindet. In einer bevorzugten Ausführungsform bindet das gewählte Lectin an das BCMP mit mindestens 2fach größerer Affinität, stärker bevorzugt mindestens 5fach größerer Affinität, noch stärker bevorzugt mindestens 10fach größerer Affinität, als an die anderen Isoformen, die dasselbe Kernprotein wie das BCMP haben, oder an die anderen Proteine, die die Antigendeterminante, die durch den Antikörper erkannt wird, teilen. Basierend auf der vorliegenden Beschreibung kann ein Lectin, das zum Detektieren eines gegebenen BMCP geeignet ist, ohne weiteres durch in der Technik bekannte Verfahren identifiziert werden, beispielsweise beim Testen von einem oder mehreren Lectinen, die in Tabelle I auf Seiten 158–159 von Sumar et al., Lecitins as Indicators of Disease-Associated Glycoforms, In: Gabius H-J & Gabius S (Hrg.), 1993, Lecitins and Glycobiology, auf S. 158–174 aufgelistet sind. In einer alternativen Ausführungsform ist das Nachweisreagens ein Antikörper, z. B. ein Antikörper, der andere posttranslationelle Modifikationen immunospezifisch detektiert, wie ein Antikörper, der immunospezifisch an phosphorylierte Aminosäuren bindet. Beispiele solcher Antikörper umfassen die, die an Phosphotyrosin binden (BD Transduction Laboratories, Katalog-Nr.: P11230-050/P11230-150; P11120; P38820; P39020), die, die an Phosphoserin binden (Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA, Katalog Nr. 61-8100), und die, die an Phosphothreonin binden (Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA, Katalog-Nr.: 71-8200, 13-9200).
  • Wenn gewünscht, kann ein Gen, das für ein BCMP kodiert, ein verwandtes Gen oder verwandte Nukleinsäurensequenzen oder -untersequenzen, einschließlich komplementäre Sequenzen, auch in Hybridisierungsassays verwendet werden. Ein Nukleotid, das für ein BCMP kodiert, oder Untersequenzen davon, umfassend mindestens 8 Nukleotide, bevorzugt mindestens 12 Nukleotide und am stärksten bevorzugt mindestens 15 Nukleotide, können als eine Hybridisierungssonde verwendet werden. Hybridisierungsassays können zur Detektion, Prognose, Diagnose oder das Überwachen von Bedingungen, Störungen oder Krankheitszuständen, die mit abweichender Expression von Genen, die BCMPs kodieren, assoziiert werden, oder für andere Diagnose von Subjekten mit Anzeichen oder Symptomen, die auf Brustkrebs schließen lassen, verwendet werden. Insbesondere kann ein solcher Hybridisierungsassay durch ein Verfahren durchgeführt werden, umfassend das Kontaktieren einer Probe eines Subjektes, die Nukleinsäure enthält, mit einer Nukleinsäuresonde, die mit DNA oder RNA hybridisieren kann, die ein BCMPA kodiert, unter Bedingungen, so daß die Hybridisierung stattfinden kann, und Detektieren oder Messen jeglicher resultierenden Hybridisierung. Nukleotide können für die Therapie von Subjekten mit Brustkrebs verwendet werden, wie nachstehend beschrieben.
  • Die Erfindung stellt ebenso die Verwendung von diagnostischen Kits bereit, umfassend einen Anti-BCMP-Antikörper. Außerdem kann ein solcher Kit gegebenenfalls ein oder mehrere der folgenden umfassen: (1) Instruktionen für die Verwendung des Anti-BCMP-Antikörpers für Diagnose, Prognose, therapeutisches Überwachen oder jegliche Kombination dieser Anwendungen; (2) einen markierten Bindungspartner für den Antikörper; (3) eine feste Phase (wie ein Reagensstreifen), auf der der Anti-BCMP-Antikörper immobilisiert wird; und (4) ein Etikett oder Einlage, die die behördliche Zulassung für Diagnose, Prognose oder therapeutische Verwendung angibt, oder jede Kombination davon. Wenn kein markierter Bindungspartner für den Antikörper bereitgestellt wird, kann der Anti-BCMP-Antikörper selbst mit einem detektierbaren Marker, z. B. einer chemilumineszierenden, enzymatischen, fluoreszierenden oder radioaktiven Einheit, markiert werden.
  • Die Erfindung stellt ebenso die Verwendung eines Kits bereit, umfassend eine Nukleinsäuresonde, die an RNA hybridisieren kann, die für ein BCMP kodiert. In einer speziellen Ausführungsform umfaßt ein Kit in einem oder mehreren Behältern ein Paar an Primern (z. B. jedes in einer Größenordnung von 6 bis 30 Nukleotiden, stärker bevorzugt 10 bis 30 Nukleotiden und noch stärker bevorzugt 10 bis 20 Nukleotiden), die unter geeigneten Reaktionsbedingungen die Amplifikation von mindestens einem Teil einer Nukleinsäure, die für ein BCMP kodiert, auslösen können, wie durch Polymerase-Kettenreaktion (siehe z. B., Innis et al., 1990, PCR Protocols, Academic Press, Inc., San Diego, CA), Ligase-Kettenreaktion (siehe EP 320.308 ) Verwendung von Qβ-Replikase, cyclische Sondenreaktion oder andere in der Technik bekannte Verfahren.
  • Ein Kit kann gegebenenfalls ferner eine vorbestimmte Menge eines isolierten BCMP-Proteins oder einer Nukleinsäure, die für ein BCMP kodiert, z. B. zur Verwendung als ein Standard oder eine Kontrolle, umfassen.
  • Verwendung in klinischen Studien
  • Die diagnostischen Verfahren der vorliegenden Erfindung können das Überwachen einer klinischen Studie unterstützen, z. B. um Arzneimittel für die Therapie von Brustkrebs zu bewerten. In einer Ausführungsform werden mögliche Moleküle hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet, BCMP-Niveaus in einem Subjekt mit Brustkrebs auf die Niveaus rückzuführen, die in Subjekten ohne Brustkrebs oder bei einem behandelten Subjekt (z. B. nach der Behandlung mit Taxol oder Doxorubacin) gefunden werden, wiederherzustellen, um die BCMP-Niveaus bei oder nahe Nicht-Brustkrebswerten zu halten. Die Niveaus von ein oder mehreren BCMPs können analysiert werden.
  • In einer anderen Ausführungsform werden die Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet, um Kandidaten für eine klinische Studie zu screenen, um Individuen mit Brustkrebs zu identifizieren; diese Individuen können dann aus der Studie ausgeschlossen werden oder können in eine separate Kohorte für die Behandlung oder Analyse gegeben werden. Wenn gewünscht, können die Kandidaten gleichzeitig gescreent werden, um Individuen mit Brustkrebs zu identifizieren; wobei die Verfahren für diese Screens in der Technik allgemein bekannt sind.
  • Reinigung von BCMPs
  • In speziellen Aspekten stellt die Erfindung die Verwendung von isolierten BCMPs, bevorzugt menschlichen BCMPs, und Fragmenten und Derivaten davon bereit, die eine Antigendeterminante umfassen (d. h. durch einen Antikörper erkannt werden können), oder die anderweitig funktionell aktiv sind, sowie Nukleinsäuresequenzen, die die vorhergehenden kodieren. „Funktionell aktiv", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Material, das eine oder mehrere funktionelle Aktivitäten, die mit einem Voll-Längen-BCMP (Wildtyp) verbunden sind, z. B. Binden an ein BCMP-Substrat oder BCMP-Bindungspartner, Antigenität (Binden an einen Anti-Target-Antikörper), Immunogenität, enzymatische Aktivität usw. zeigt.
  • In speziellen Ausführungsformen stellt die Erfindung die Verwendung von Peptidfragmenten eines BCMP bereit, umfassend mindestens 5 Aminosäuren, mindestens 10 Aminosäuren, mindestens 50 Aminosäuren oder mindestens 75 Aminosäuren. Fragmente, denen es an einigen oder allen der Regionen eines BCMPs mangelt, werden ebenso bereitgestellt, wie es Pro teine sind (z. B. Fusionsproteine). die diese Fragmente umfassen. Nukleinsäuren, die die vorhergehenden kodieren, werden bereitgestellt.
  • Sobald eine rekombinante Nukleinsäure, die für das BCMP kodiert, ein Teil des BCMP oder ein Präkursor des BCMP identifiziert ist, kann das Genprodukt analysiert werden. Dies wird durch Assays erreicht, die auf den physikalischen oder funktionellen Eigenschaften des Produktes basieren, einschließlich radioaktive Markierung des Produktes, gefolgt von Analyse durch Gelelektrophorese, Immunoassay usw..
  • Die hierin identifizierten BCMPs können durch Standardverfahren isoliert und gereinigt werden, einschließlich Chromatographie (z. B. Ionenaustausch, Affinität und Größensäulenchromatographie), Zentrifugation, unterschiedliche Löslichkeit oder durch andere Standardtechniken zur Reinigung von Proteinen.
  • Sobald alternativ eine rekombinante Nukleinsäure, die für das BCMP kodiert, identifiziert ist, kann die gesamte Aminosäuresequenz des BCMPs von der Nukleotidsequenz der genkodierenden Region, die die rekombinante Nukleinsäure enthält, abgeleitet werden. Infolgedessen kann das Protein durch chemische Standardverfahren, die in der Technik bekannt sind (z. B. siehe Hunkapiller et al., 1984, Nature 310: 105–111), synthetisiert werden.
  • In einer anderen alternativen Ausführungsform können native BCMPs aus natürlichen Quellen durch Standardverfahren, wie denen, die oben beschrieben sind (z. B. Immunoaffinitätsreinigung), gereinigt werden.
  • Die Erfindung stellt daher die Verwendung eines isolierten BCMPs, eines isolierten BCMP-verwandten Polypeptids und eines isolierten Derivats oder Fragments eines BCMPs oder eines BCMP-verwandten Polypeptids bereit; wobei jedes der Vorhergehenden durch rekombinante DNA-Verfahren oder durch chemische Syntheseverfahren hergestellt werden können.
  • Isolation von DNA, die für ein BCMP kodiert
  • Spezielle Ausführungsformen zum Klonen eines Gens, das für ein BCMP kodiert, werden nachstehend durch die Beispiele und ohne Einschränkung dargestellt.
  • Nukleotidsequenzen, einschließlich DNA und RNA, die eine Sequenz, die für ein BCMP oder ein Fragment davon oder ein BCMP-verwandtes Polypeptid kodiert, umfassen, können unter Verwendung der in der Technik bekannten Verfahren synthetisiert werden, wie unter Verwendung konventioneller chemischer Ansätze oder Amplifikation mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Die Nukleotidsequenzen erlauben ebenso die Identifizierung und das Klonen des Gens, das für ein BCMP homolog oder BCMP ortholog kodiert, einschließlich beispielsweise durch Screening von cDNA-Bibliotheken, Genbibliotheken oder Expressionsbibliotheken.
  • Um beispielsweise ein Gen, das für ein BCMP kodiert, durch PCR-Verfahren zu klonen, können verankerte degenerierte Oligonukleotide (oder eine Gruppe der wahrscheinlichsten Oligonukleotide) für alle BCMP-Peptidfragmente, die als Teil desselben Proteins identifiziert wurden, konstruiert werden. PCR-Reaktionen können unter einer Vielzahl von Bedingungen mit relevanter cDNA und genomischen DNAs (z. B. von Brustgewebe oder von Zellen des Immunsystems) aus einer oder mehreren Spezies durchgeführt werden. Ebenso können Vectorette-Reaktionen auf jeder verfügbaren cDNA und genomischen DNA unter Verwendung der Oligonukleotide (die bevorzugt verschachtelt sind) wie oben durchgeführt werden. Vectorette-PCR ist ein Verfahren, das die Amplifikation von spezifischen DNA-Fragmenten in Situationen ermöglicht, wo die Sequenz von nur einem Primer bekannt ist. Daher verlängert es die Anwendung der PCR auf DNA-Stücke, wo die Sequenzinformation nur an einem Ende verfügbar ist. (Arnold C, 1991, PCR Methods Appl. 1(1): 39–42; Dyer KD, Biotechniques, 1995, 19(4): 550–2). Vectorette-PCR kann mit Sonden durchgeführt werden, die beispielsweise verankerte degenerierte Oligonukleotide sind (oder die wahrscheinlichsten Oligonukleotide), die für BCMP-Peptidfragment kodieren, unter Verwendung einer Genbibliothek oder cDNA-Bibliothekenpools als eine Matrize.
  • Verankerte degenerierte Oligonukleotide (und die wahrscheinlichsten Oligonukleotide) können für alle BCMP-Peptidfragmente konstruiert werden. Diese Oligonukleotide können markiert und an Filtern hybridisiert werden, die cDNA- und genomische DNA-Bibliotheken enthalten. Oligonukleotide zu unterschiedlichen Peptiden von demselben Protein werden oftmals dieselben Mitglieder der Bibliothek identifizieren. Die cDNA- und genomischen DNA-Bibliotheken können aus jeder geeigneten oder gewünschten Säugetierspezies, beispielsweise von Menschen, erhalten werden.
  • Nukleotidsequenzen, umfassend eine Nukleotidsequenz, die für ein BCMP oder BCMP-Fragment der vorliegenden Erfindung kodiert, sind hinsichtlich ihrer Fähigkeit, selektiv mit komplementären Stücken von Genen, die andere Proteine kodieren, zu hybridisieren, nützlich. In Abhängigkeit der Anwendung kann eine Vielzahl von Hybridisierungsbedingungen eingesetzt werden, um Nukleotidsequenzen, die zu mindestens 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % oder 99 % identisch oder zu 100 % identisch zu der Sequenz eines Nukleotids, das für ein BCMP kodiert, zu erhalten.
  • Für einen hohen Grad an Selektivität werden relativ stringente Bedingungen verwendet, um die Doppelstränge zu bilden, wie salzarme oder Hochtemperaturbedingungen. Wie hierin verwendet, bedeuten „hoch stringente Bedingungen" die Hybridisierung an filtergebundene DNA in 0,5M NaHPO4, 7 % Natriumdodecylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65°C und Waschen in 0,1 × SSC/0,1 % SDS bei 68°C (Ausubel F. M. et al., Hrsg., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Bd. I, Green Publishing Associates, Inc., und John Wiley & Sons, Inc., New York, auf S. 2.10.3; hierin in ihrer Gesamtheit durch Verweis aufgenommen). Für einige Anwendungen sind weniger stringente Bedingungen für die Doppelstrangbildung erforderlich. Wie hierin verwender, bedeuten „mäßig stringente Bedingungen" Waschen in 0,2 × SSC/0,1 % SDS bei 42°C (Ausubel et al., 1989, oben). Hybridisierungsbedingungen können ebenso durch die Addition von erhöhenden Mengen von Formamid stringenter gemacht werden, um den Hybriddoppelstrang zu destabilisieren. Daher können spezielle Hybridisierungsbedingungen ohne weiteres manipuliert werden, und werden im allgemeinen in Abhängigkeit der gewünschten Ergebnisse gewählt. Im allgemeinen betragen günstige Hybridisierungstemperaturen in Gegenwart von 50 % Formamid: 42°C für eine Sonde, die zu 95 bis 100 % identisch zu dem Fragment eines Gens ist, das für ein BCMP kodiert, 37°C für 90 bis 95 % Identität und 32°C für 70 bis 90 % Identität.
  • Bei der Herstellung von Genbibliotheken werden DNA-Fragmente erzeugt, wobei einige von diesen DNA-Fragmenten Teile oder die Gesamtheit eines BCMP kodieren werden. Jedes geeignete Verfahren zur Herstellung von DNA-Fragmenten kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Beispielsweise kann die DNA an speziellen Stellen unter Verwendung verschiedener Restriktionsenzyme gespalten werden. Alternativ kann man DNAse in Gegenwart von Mangan verwenden, um die DNA zu fragmentieren, oder die DNA kann physika lisch geschnitten werden, wie beispielsweise durch Ultraschallbehandlung. Die DNA-Fragmente können nach der Größe durch Standardtechniken getrennt werden, einschließlich Agarose- und Polyacrylamid-Gelelektrophorese, Säulenchromatographie und Saccharose-Gradientenzentrifugation, sind aber nicht darauf beschränkt. Die DNA-Fragmente können dann in geeignete Vektoren eingeführt werden, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Plasmide, Cosmide, Bakteriophagen lambda oder T4, und künstliches Hefechromosom (YAC). (Siehe z. B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D. M. (Hrsg.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U. K. Bd. I, II; Ausubel F. M. et al., Hrsg., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Bd. I, Green Publishing Associates, Inc., und John Wiley & sons, Inc., New York). Die Genbibliothek kann durch Nukleinsäurehybridisierung an einer markierten Sonde gescreent werden (Benton und Davis, 1977, Science 196: 180; Grunstein und Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72: 3961).
  • Basierend auf der vorliegenden Beschreibung können die Genbibliotheken mit markierten degenerierten Oligonukleotidsonden, die der Aminosäuresequenz irgendeines Peptids des BCMP entspricht, unter Verwendung optimaler Ansätze, die in der Technik allgemein bekannt sind, gescreent werden. Jede Sonde weist mindestens 10 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 20 Nukleotide, mindestens 25 Nukleotide, mindestens 30 Nukleotide, mindestens 40 Nukleotide, mindestens 50 Nukleotide, mindestens 60 Nukleotide, mindestens 70 Nukleotide, mindestens 80 Nukleotide oder mindestens 100 Nukleotide auf. Bevorzugt wiest eine Sonde 10 Nukleotide oder mehr und stärker bevorzugt 15 Nukleotide oder mehr auf.
  • Es wurde herausgefunden, daß das hierin offenbarte BCMP 17 den Isoformen von zuvor identifizierten Proteinen, die durch Gene kodiert sind, deren Sequenzen öffentlich bekannt sind, entspricht. (Sequenzanalyse und Proteinidentifizierung von BCMPs wurden unter Verwendung der in den Beispielen beschriebenen Verfahren durchgeführt). Um ein solches Gen zu screenen, kann jede Sonde verwendet werden, die komplementär zu dem Gen oder seinem Komplement ist; bevorzugt weist die Sonde 10 Nukleotide oder mehr, stärker bevorzugt 15 Nukleotide oder mehr auf. Die SWISS-PROT- und trEMBL-Datenbanken (gehalten von dem Swiss Institute of Bioinformatics (SIB) und the European Bioinformatics Institute (EBI), die zugänglich sind unter http://www.expasy.ch/) und die GenBank-Datenbank (gehalten von dem National Institute of Health (NHI), das zugänglich ist unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) stellen Proteinsequenzen für die BCMPs bereit.
  • Wenn eine Bibliothek gescreent wird, werden Klone mit eingeführter DNA, die für das BCMP oder ein Fragment davon kodiert, an einem oder mehreren Mitgliedern der entsprechenden Gruppe von degenerierten Oligonukleotidsonden (oder ihrem Komplement) hybridisieren. Die Hybridisierung von solchen Oligonukleotidsonden an Genbibliotheken wird unter Verwendung von in der Technik bekannten Verfahren durchgeführt. Beispielsweise kann die Hybridisierung mit einem der oben erwähnten degenerierten Gruppen von Oligonukleotidsonden oder ihrem Komplement (oder mit jedem Mitglied einer solchen Gruppe oder seines Komplements) unter hoch stringenten oder mäßig stringenten Bedingungen, wie oben definiert, durchgeführt werden, oder kann in 2x SSC, 1,0 % SDS bei 50°C durchgeführt und unter Verwendung der oben beschriebenen Waschbedingungen für hoch stringente oder mäßig stringente Hybridisierung gewaschen werden.
  • In noch einem anderen Aspekt können Klone, enthaltend Nukleotidsequenzen, die für das gesamte BCMP, ein Fragment eines BCMP, ein BCMP-verwandtes Polypeptid oder ein Fragment eines BCMP-verwandten Polypeptids von jedem der Vorhergehenden kodiert, ebenso durch Screening-Expressionsbibliotheken erhalten werden. Beispielsweise wird DNA aus der relevanten Quelle isoliert, und zufällige Fragmente werden hergestellt und in einen Expressionsvektor ligiert (z. B. eine Bakteriophage, ein Plasmid, ein Phagemid oder ein Kosmid), so daß die eingeführte Sequenz in dem Vektor durch die Wirtszelle exprimiert werden kann, in die der Vektor dann eingeführt wird. Verschiedene Screeningassays können dann verwendet werden, um nach exprimierten BCMP oder BCMP-verwandten Polypeptide zu selektieren. In einer Ausführungsform können verschiedene Anti-BCMP-Antikörper verwendet werden, um die gewünschten Klone unter Verwendung der in der Technik bekannten Verfahren zu identifizieren. Siehe beispielsweise Harlow und Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Appendix IV. Kolonien oder Plaques aus der Bibliothek werden mit den Antikörpern in Kontakt gebracht, um die Klone zu identifizieren, die Antikörper binden.
  • In einer Ausführungsform können Kolonien oder Plaques, enthaltend DNA, die für ein BCMP, ein Fragment eines BCMP, ein BCMP-verwandtes Polypeptid oder ein Fragment eines BCMP-verwandten Polypeptids kodiert, unter Verwendung von DYNA-Beads gemäß Olsvick et al., 29. ICAAC, Houston, Tex. 1989, hierin durch Verweis aufgenommen, detektiert werden. Anti-BCMP-Antikörper werden mit tosylierten DYNA-Beads M280 vernetzt, und diese Antikörper-enthaltenden Kügelchen werden dann mit Kolonien oder Plaques, die rekombinante Polypeptide exprimieren, kontaktiert. Kolonien oder Plaques, die ein BCMP oder BCMP-abgeleitetes Polypeptid exprimieren, werden als eines von denen, die die Kügelchen binden, identifiziert.
  • Alternativ können die Anti-BCMP-Antikörper nichtspezifisch an einem geeigneten Träger, wie Siliciumdioxid oder Celite®-Harz immobilisiert werden. Dieses Material wird dann zur Adsorption an bakteriellen Kolonien verwendet, die das BCMP-Protein oder BCMP-verwandte Polypeptid, wie hierin beschrieben, exprimieren.
  • In einem anderen Aspekt kann die PCR-Amplifikation verwendet werden, um aus genomischer DNA eine im wesentlichen reine DNA zu isolieren (d. h. eine DNA, die im wesentlichen frei von kontaminierenden Nukleinsäuren ist), die das gesamte BCMP oder einen Teil davon kodiert. Bevorzugt ist eine solche DNA mindestens zu 95 % rein, stärker bevorzugt mindestens zu 99 % rein. Oligonukleotidsequenzen, degenerierte oder sonstige, die den Peptidsequenzen von hierin offenbarten BCMPs entsprechen, können als Primer verwendet werden.
  • PCR kann durchgeführt werden, z. B. durch die Vewendung eines Perkin-Elmer Cetus-Termocyclers und Taq-Polymerase (Gene Amp® oder AmpliTaq DNA-Polymerase). Man kann wählen, um mehrere unterschiedliche degenerierte Primer zur Verwendung in den PCR-Reaktionen zu synthetisieren. Es ist ebenso möglich, die Stringenz der Hybridisierungsbedingungen, die beim Priming der PCR-Reaktionen verwendet werden, zu variieren, um größere oder geringer Grade an Nukleotidsequenzähnlichkeit zwischen den degenerierten Primern und den entsprechenden Sequenzen in der DNA zu ermöglichen. Nach erfolgreicher Amplifikation eines Segments der Sequenz, die ein BCMP kodiert, kann das Segment molekular geklont und sequenziert werden und als eine Sonde verwendet werden, um einen vollständigen genomischen Klon zu isolieren. Dies wird wiederum die Bestimmung der vollständigen Nu kleotidsequenz des Gens, die Analyse seiner Expression und die Herstellung seines Proteinproduktes für die funktionelle Analyse, wie unten beschrieben, erlauben.
  • Das Gen, das für ein BCMP kodiert, kann ebenso durch mRNA-Selektion durch Nukleinsäurehybridisierung, gefolgt von In-vitro-Translation, identifiziert werden. In diesem Verfahren werden Fragmente verwendet, um komplementäre mRNAs durch Hybridisierung zu isolieren. Diese DNA-Fragmente können verfügbare, gereinigte DNA, die für ein BCMP einer anderen Spezies kodiert, (z. B. Maus, Mensch) darstellen. Immunopräzipitationsanalysen oder funktionelle Assays (z. B. Aggregationsfähigkeit in vitro; Bindung an Rezeptor) der In-vitro-Translationsprodukte der isolierten Produkte der isolierten mRNAs identifiziert die mRNA und daher die komplementären DNA-Fragmente, die die gewünschten Sequenzen enthalten. Außerdem können spezifische mRNAs durch die Adsorption von Polysomen, die aus Zellen isoliert sind, selektiert werden, um Antikörper zu immobilisieren, die spezifisch ein BCMP erkennen. Eine radioaktiv markierte cDNA, die für ein BCMP kodiert, kann unter Verwendung der selektierten mRNA (aus den adsorbierten Polysomen) als Matrize synthetisiert werden. Die radioaktiv markierte mRNA oder cDNA kann dann als eine Sonde verwendet werden, um die DNA-Fragmente, die für ein BCMP kodieren, unter anderen genomischen DNA-Fragmenten zu identifizieren.
  • Alternativen zum Isolieren genomischer DNA, die für ein BCMP kodiert, umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, chemisches Synthetisieren der Gensequenz selbst aus einer bekannten Sequenz oder Herstellen der cDNA zu der mRNA, die für das BCMP kodiert. Beispielsweise kann RNA zum cDNA-Klonen des Gens, das für ein BCMP kodiert, aus Zellen isoliert werden, die das BCMP exprimieren. Der Fachmann wird aus der vorliegenden Beschreibung entnehmen, daß andere Verfahren verwendet werden können.
  • Jede geeignete eukaryotische Zelle kann als die Nukleinsäurequelle für das molekulare Klonen des Gens, das für ein BCMP kodiert, dienen. Die Nukleinsäuresequenzen, die für das BCMP kodieren, können aus Wirbeltier-, Säugetier-, Primat-, Mensch-, Schwein-, Rind-, Katze-, Vogel-, Pferd-, Hunde- oder Mausquellen isoliert werden. Die DNA kann durch in der Technik bekannte Standardverfahren aus geklonter DNA (z. B. einer DNA-„Bibliothek") durch chemische Synthese, durch cDNA-Klonen oder durch Klonen der genomischen DNA oder Fragmenten davon, gereinigt aus der gewünschten Zelle, erhalten werden. (Siehe z. B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D. M. (Hrsg.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. Bd. I, II.) Klone, abgeleitet aus genomischer DNA, können regulatorische und Intron-DNA-Regionen zusätzlich zu kodierenden Regionen enthalten; Klone, abgeleitet von cDNA, werden nur Exonsequenzen enthalten.
  • Das identifizierte und isolierte Gen oder die identifizierte und isolierte cDNA kann dann in jeden geeigneten Klonierungsvektor eingeführt werden. Eine große Anzahl von Vektor-Wirts-Systemen, die in der Technik bekannt sind, können verwendet werden. Der Fachmann wird erkennen, daß die einzige Einschränkung die ist, daß das gewählte Vektorsystem mit der verwendeten Wirtszelle kompatibel ist. Diese Vektoren umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Bakteriophagen, wie lambda-Derivate, Plasmide, wie PBR322 oder pUC-Plasmidderivate, oder den Bluescript-Vektor (Stratagene) oder modifizierte Viren wie Adenoviren, Adeno-assoziierte Viren oder Retroviren. Die Einführung in einen Klonierungsvektor kann beispielsweise durch Ligierung des DNA-Fragments in einen Klonierungsvektor erreicht werden, der komplementäre kohäsive Enden aufweist. Wenn jedoch die komplementären Restriktionsstellen, die verwendet werden, um die DNA zu fragmentieren, nicht in dem Klonierungsvektor vorliegen, können die Enden der DNA-Moleküle enzymatisch modifiziert werden. Alternativ kann jede gewünschte Stelle durch Ligierung von Nukleotidsequenzen (Linkern) auf den DNA-Enden hergestellt werden; diese ligierten Linker können spezifische chemisch synthetisierte Oligonukleotide, die Restriktionsendonuklease-Erkennungssequenzen kodieren, umfassen. Bei einem alternativen Verfahren können der gespaltene Vektor und das Gen, das für ein BCMP kodiert, durch homopolymeres Tailing modifiziert werden. Rekombinante Moleküle können in Wirtszellen über Transformation, Transfektion, Infektion, Elektroporation usw. eingeführt werden, so daß viele Kopien der Gensequenz erzeugt werden.
  • In speziellen Ausführungsformen ermöglicht die Transformation von Wirtszellen mit rekombinanten DNA-Molekülen, die das isolierte Gen, das für das BCMP kodiert, cDNA oder synthetisierte DNA-Sequenz einführt, die Erzeugung von mehreren Kopien des Gens. Daher kann das Gen in großen Mengen durch wachsende Transformanten, Isolieren der rekombinanten DNA-Moleküle aus den Transformanten und, wenn notwendig, Wiedergewinnen des eingeführten Gens aus der isolierten rekombinanten DNA erhalten werden.
  • Die Nukleotidsequenzen umfassen Nukleotidsequenzen, die Aminosäuresequenzen, mit im wesentlichen denselben Aminosäuresequenzen wie native BCMPs kodieren, Nucleotidsequenzen, die Aminosäuresequenzen mit funktionell äquivalenten Aminosäuren kodieren, Nukleotidsequenzen, die BCMPs, Fragmente von BCMP, BCMP-verwandte Polypeptide oder Fragmente von BCMP-verwandten Polypeptiden kodieren.
  • In einer speziellen Ausführungsform kann ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein BCMP-verwandtes Polypeptid kodiert, durch Einführen von ein oder mehreren Nukleotidsubstitutionen, -additionen oder -deletionen in die Nukleotidsequenz eines BCMP erzeugt werden, so daß ein oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -additionen oder -deletionen in das kodierte Protein eingeführt werden. Standardverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, können verwendet werden, um Mutationen einzuführen, einschließlich beispielsweise ortsgerichtete Mutagenese und PCR-vermittelte Mutagenese. Bevorzugt werden konservative Aminosäuresubstitutionen bei einem oder mehreren vorhergesehenen nicht essentiellen Aminosäureresten vorgenommen. Eine „konservative Aminosäuresubstitution" ist eine, bei der der Aminosäurerest durch einem Aminosäurerest ersetzt wird, der eine Seitenkette mit einer ähnlichen Ladung aufweist. Familien von Aminosäureresten mit Seitenketten mit ähnlichen Ladungen sind in der Technik definiert worden. Diese Familien umfassen Aminosäuren mit basischen Seitenketten (z. B. Lysin, Arginin, Histidin), sauren Seitenketten (z. B. Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladenen polaren Seitenketten (z. B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), nicht polaren Seitenketten (z. B. Alanin, Valin, Leuzin, Isoleuzin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), beta-verzweigten Seitenketen (z. B. Threonin, Valin, Isoleuzin) und aromatischen Seitenketten (z. B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin). Alternativ können Mutationen zusammen mit allen oder einem Teil der kodierenden Sequenz zufällig eingeführt werden, wie durch Sättigungsmutagenese und die resultierenden Mutanten können hinsichtlich der biologischen Aktivität gescreent werden, um Mutanten, die die Aktivität erhalten, zu identifizieren. Nach Mutagenese kann das kodierte Protein exprimiert werden und die Aktivität des Proteins kann bestimmt werden.
  • Expression von DNA, die BCMPs kodiert
  • Die Nukleotidsequenz, die für ein BCMP, ein BCMP-Analogon, ein BCMP-verwandtes Peptid oder ein Fragment oder anderes Derivat von jedem der Vorhergehenden kodiert, kann in einen geeigneten Expressionsvektor eingeführt werden, d. h. einen Vektor, der die notwendigen Elemente für die Transkription und Translation der eingeführten Protein-kodierenden Sequenz enthält. Die notwendigen transkriptionellen und translatorischen Signale können ebenso durch das native Gen, das für das BCMP kodiert, oder seine flankierenden Regionen, oder das native Gen, das für das BCMP-verwandte Polypeptid kodiert, oder seine flankierenden Regionen zugeführt werden. Eine Vielzahl von Wirts-Vektor-Systemen kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um die Protein-kodierende Sequenz zu exprimieren. Diese umfassen Säugetierzellsysteme, infiziert mit Virus (z. B. Vakzinevirus, Adenovirus usw.), Insektenzellsysteme, infiziert mit Virus (z. B. Baculovirus); Mikroorganismen. wie Hefe, enthaltend Hefevektoren; oder Bakterien, transformiert mit Bakteriophage, DNA, Plasmid-DNA oder Kosmid-DNA, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Expressionselemente von Vektoren variieren in ihren Stärken und Spezifitäten. In Abhängigkeit des verwendeten Wirts-Vektor-Systems kann jedes von einer Vielzahl von geeigneten Transkriptions- und Translationselementen verwendet werden. In speziellen Ausführungsformen wird eine Nukleotidsequenz, die ein menschliches Gen kodiert (oder eine Nukleotidsequenz, die einen funktionell aktiven Teil eines menschlichen BCMP kodiert), exprimiert. In noch einer anderen Ausführungsform wird ein Fragment eines BCMP, umfassend eine Domäne des BCMP, exprimiert.
  • Jedes der zuvor beschriebenen Verfahren für die Einführung von DNA-Fragmenten in einen Vektor kann verwendet werden, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die ein chimäres Gen enthalten, bestehend aus geeigneten transkriptionellen und translatorischen Kontrollsignalen und den Protein-kodierenden Sequenzen. Diese Verfahren können in vitro rekombinante DNA und Synthesetechniken und In-vivo-Rekombinanten umfassen (genetische Rekombination). Die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die für ein BCMP oder Fragment davon kodiert, kann durch eine zweite Nukleinsäuresequenz reguliert werden, so daß das BCMP oder Fragment in einem Wirt, der mit dem rekombinanten DNA-Molekül transformiert wird, exprimiert wird. Beispielsweise kann die Expression eines BCMP durch jeden Promotor oder jedes Enhancer-Element, das in der Technik bekannt ist, kontrolliert werden. Promotoren, die verwendet werden können, um die Expression des Gens, das für ein BCMP oder ein BCMP-verwandtes Polypeptid kodiert, zu steuern, umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, die SV40 Early Promotor-Region (Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290: 304– 310), den Promotor, enthalten in der langen 3'-terminalen Wiederholung von Rous-Sarkom- Virus (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22: 787–797), den Herpes-Thymidinkinasepromotor (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1441–1445), die Regulationssequenzen des Metallothioneingens (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39–42), den Tetracyclin-Promotor (Tet-Promotor) (Gossen et al., 1995, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89: 5547–5551); prokaryotische Expressionsvektoren, wie den β-Lactamase-Promotor (Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727–3731) oder den tac-Promotor (DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21–25; siehe ebenso „Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242: 74–94); Pflanzenexpressionsvektoren, umfassend die Nopalin-Synthetase-Promotorregion (Herrera-Estrella et al., Nature 303: 209–213) oder den Blumenkohlmosaik-Virus-35S-RNA-Promotor (Gardner, et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9: 2871), und den Promotor der photosynthetischen Enzym-Ribulosebiphosphatcarboxylase (Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 310:115–120); Promotorelemente von Hefe oder anderen Pilzen, wie den Gal4-Promotor, den ADC-Promotor (Alkoholdehydrogenase-Promotor), PGK-Promotor (Phosphoglycerolkinase-Promotor), Alkaliphosphatasepromotor und die folgenden tierischen, transkriptionellen Kontrollregionen, die Gewebespezifität zeigen und in transgenen Tieren verwendet worden sind: Elastase-I-Gen-Kontrollregion, die in Pankreasdrüsenzellen aktiv ist (Swift et al., 1984, Cell 38: 639–646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399–409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425– 515); Insulingen-Kontrollregion, die in Pankreas-beta-Zellen aktiv ist (Hanahan, 1985, Nature 315: 115–122), Immunoglobulingen-Kontrollregion, die in Lymphoidzellen aktiv ist (Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647–658; Adames et al., 1985, Nature 318: 533–538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436–1444), Maus-Mammatumorvirus-Kontrollregion, die in Hoden-, Brust-, lymphoiden und Mastzellen aktiv ist (Leder et al., 1986, Cell 45: 485–495), Albumingen-Kontrollregion, die in der Leber aktiv ist (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1: 268–276), Alpha-Fetoproteingen-Kontrollregion, die in der Leber aktiv ist (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639–1648; Hammer et al., 1987, Science 235: 53–58), Alpha-1-Antitrypsingen-Kontrollregion, die in der Leber aktiv ist (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1: 161–171), beta-Globingen-Kontrollregion, die in den Knochenmarkszellen aktiv ist (Mogram et al., 1985, Nature 315: 338–340; Kollias et al., 1986, Cell 46: 89–94); Myelinbasisproteingen-Kontrollregion, die in Oligodendrozytzellen im Gehirn aktiv ist (Readhead et al., 1987, Cell 48: 703–712); Myosin-Leichtketten-2-Gen-Kontrollregion, die in dem Skelettmuskel aktiv ist (Sani, 1985, Nature 314: 283–286); neuronspezifische Enolase (NSE), die in Neuronenzellen aktiv ist (Morelli et al., 1999, Gen. Vi rol. 80: 571–83); hirnabstammender Wachstumsfaktor (BDNF) Genkontrollregion, die in Neuronenzellen aktiv ist (Tabuchi et al., 1998, Biochem. Biophysic. Res. Com. 253: 818–823); Gliafibrillensäureprotein-(GFAP)-Promotor, der in Astrozyten aktiv ist (Gomes et al., 1999, Braz J Med Biol Res 32(5): 619–631; Morelli et al., 1999, Gen. Virol. 80: 571–83) und gonadotropes Freisetzungshormongen-Kontrollregion, die in dem Hypothalamus aktiv ist (Mason et al., 1986, Science 234: 1372–1378).
  • In einer speziellen Ausführungsform wird ein Vektor verwendet, der einen Promotor, der funktionsfähig mit einer BCMP-kodierenden Nukleinsäure verbunden ist, ein oder mehrere Replikationsursprünge und gegebenenfalls ein oder mehrere selektierbare Marker (z. B. ein Antibiotika-Resistenzgen) umfaßt.
  • In einer speziellen Ausführungsform wird ein Expressionskonstrukt durch Subklonen einer BCMP-Sequenz oder einer Sequenz, die ein BCMP-verwandtes Polypeptid kodiert, in die EcoRI-Restriktionsstelle von jedem der drei pGEX-Vektoren hergestellt (Glutathion S-Transferase-Expressionsvektoren; Smith and Johnson, 1988, Gene 7: 31–40). Dies ermöglicht die Expression des BCMP-Produktes oder BCMP-verwandten Polypeptids aus dem Subklon in dem korrekten Ableserahmen.
  • Bei Säugetierwirtszellen kann eine Vielzahl von Virus-basierenden Expressionssystemen verwendet werden. In Fällen, wo ein Adenovirus als ein Expressionsvektor verwendet wird, kann die BCMP-kodierende Sequenz oder die Sequenz, die BCMP-verwandtes Polypeptidkodiert, an einen Adenovirus-Transkriptions/Translations-Kontrollkomplex ligiert werden, z.B. der späte Promotor und die Tripartit-Leitsequenz. Dieses chimäre Gen kann dann in das Adenovirusgenom durch In-vitro- oder In-vivo-Rekombination eingeführt werden. Die Einführung in eine nicht essentielle Region des viralen Genoms (z. B. Region E1 oder E3) wird zu einem rekombinanten Virus führen, der lebensfähig ist und das Antikörpermolekül in infizierten Wirten exprimieren kann (z. B. siehe Logen & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 355–359). Spezifische Initiierungssignale können ebenso für die effiziente Translation von eingeführten Antikörper-kodierenden Sequenzen erforderlich sein. Diese Signale umfassen das ATG-Initiatorcodon und benachbarte Sequenzen. Außerdem muß das Initiatorcodon in der Phase mit dem Ableserahmen der gewünschten kodierenden Sequenz sein, um die Translation des gesamten Inserts sicherzustellen. Diese exogenen translationellen Kon trollsignale und Initiatorcodone können von einer Vielzahl von Ursprüngen sein, sowohl natürlich als auch synthetisch. Die Wirksamkeit der Expression kann durch ein Einschluß von geeigneten Transkriptionsenhancerelementen, Transkriptionsterminatoren usw. verbessert werden (siehe Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol 153: 51–544).
  • Expressionsvektoren, die Inserts eines Gens enthalten, das für ein BCMP oder ein BCMP-verwandtes Polypeptid kodiert, können durch drei allgemeine Ansätze identifiziert werden: (a) Nukleinsäurehybridisierung, (b) Gegenwart oder Abwesenheit von „Marker"-Genfunktionen und (c) Expression von eingeführten Sequenzen. In dem ersten Ansatz kann die Gegenwart eines Gens, das für ein BCMP kodiert, eingeführt in einen Expressionsvektor, durch Nukleinsäurehybridisierung unter Verwendung von Sonden, die Sequenzen umfassen, die zu einem eingeführten Gen, das für ein BCMP kodiert, homolog sind, detektiert werden. In dem zweiten Ansatz kann das rekombinante Vektor/Wirts-System basierend auf der Gegenwart oder Abwesenheit von bestimmten „Marker"-Genfunktionen identifiziert und ausgewählt werden (z. B. Thymidinkinaseaktivität, Resistenz gegen Antibiotika, Transformations-Phänotyp, Okklusionskörperbildung in Baculovirus usw.), die durch die Einführung eines Gens, das für ein BCMP kodiert, in den Vektor verursacht werden. Beispielsweise können, wenn das Gen, das für das BCMP kodiert, innerhalb der Markergensequenz des Vektors eingeführt wird, Rekombinanten, enthaltend das Insert des Gens, das für die BCMP-kodiert, durch die Abwesenheit der Markergenfunktion identifiziert werden. In dem dritten Ansatz können rekombinante Expressionsvektoren durch Analysieren des Genproduktes (d. h. BCMP), das durch die Rekombinante exprimiert wird, identifiziert werden. Diese Assays können beispielsweise auf den physikalischen oder funktionellen Eigenschaften des BCMP in In-vitro-Assaysystemen, z. B. Bindung mit einem Anti-BCMP-Antikörper, basieren.
  • Außerdem kann ein Wirtszellenstamm ausgewählt werden, der die Expression der eingeführten Sequenzen moduliert, oder das Genprodukt in der gewünschten spezifischen Weise modifiziert und verarbeitet. Die Expression aus bestimmten Promotoren kann in Gegenwart von bestimmten Inducern erhöht werden; daher kann die Expression des genetisch konstruierten BCMP oder BCMP-verwandten Polypeptids gesteuert werden. Außerdem haben unterschiedliche Wirtszellen charakteristische und spezifische Mechanismen für die translatorische und posttranslatorische Verarbeitung und Modifikationen (z. B. Glycosylierung, Phosphorylierung von Proteinen). Geeignete Zellinien oder Wirtssysteme können ausgewählt werden, um die gewünschte Modifikation und Verarbeitung des exprimierten Fremdproteins sicherzustellen. Beispielsweise wird die Expression in einem bakteriellen System ein nicht glycosyliertes Produkt erzeugen und die Expression in Hefe wird ein glycosyliertes Produkt erzeugen. Eukaryotische Wirtszellen, die die zelluläre Machinerie für die richtige Verarbeitung des primären Transkripts, Glycosylierung und Phosphorylierung des Genproduktes besitzen, können verwendet werden. Diese Säugetierwirtszellen umfassen CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3 und WI38, sind aber nicht darauf beschränkt. Außerdem können unterschiedliche Vektor/Wirts-Expressionssysteme Verarbeitungsreaktionen in unterschiedlichen Ausmaßen bewirken.
  • Für die ergiebige Langzeitherstellung von rekombinanten Proteinen ist die stabile Expression bevorzugt. Beispielsweise können Zellinien, die stabil das unterschiedlich exprimierte oder Weggenprotein exprimieren, konstruiert werden. Eher als die Verwendung von Expressionsvektoren, die virale Replikationssursprünge enthalten, können Wirtszellen mit DNA transformiert werden, kontrolliert durch geeignete Expressionskontrollelemente (z. B. Promotor, Enhancer, Sequenzen, Transkriptionsterminatoren, Polyadenylierungsstellen usw.), und einen selektierbaren Marker. Nach der Einführung der Fremd-DNA können konstruierte Zellen für 1 bis 2 Tage in einem angereicherten Medium wachsen, und werden dann auf ein selektives Medium umgestellt. Der selektierbare Marker in dem rekombinanten Plasmid verleiht Beständigkeit gegen die Selektion und ermöglicht den Zellen, das Plasmid stabil in ihre Chromosomen zu integrieren und wachsen unter Bildung von Fokussen, die wiederum geklont und zu Zellinien erweitert werden können. Dieses Verfahren kann vorteilhafterweise verwendet werden, um Zellinien zu konstruieren, die das unterschiedlich exprimierte oder Weggenprotein exprimieren. Diese konstruierten Zellinien können beim Screening und der Bewertung von Verbindungen, die die endogene Aktivität des unterschiedlich exprimierten oder Weggenproteins beeinflussen, besonders nützlich sein.
  • Eine Vielzahl von Selektionssystemen kann verwendet werden, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, das Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase- (Wigler, et al., 1977, Cell 11: 223), Hypoxanthin-Guaninphosphoribosyltransferase- (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026) und Adeninphosphoribosyltransferase- (Lowy, et al., 1980, Cell 22: 817) -Gen, die in tk-, hgprt- bzw. apri-Zellen eingesetzt werden können. Ebenso kann die Antimetabolitresistenz als die Grundlage für die Selektion auf der Basis von dhfr-, das Resistenz gegen Methotrexat verleiht (Wigler, et al., 1980; Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hare, et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527); gpt-, das Resistenz gegen Mycophenolsäure verleiht (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072); neo-, das Resistenz gegen das Aminoglycosid G-418 verleiht (Colberre-Garapin, et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1); und hygro-, das Resistenz gegen Hygromycin (Santerre, et al., 1984, Gene 30: 147) verleiht, -Gene verwendet werden.
  • In anderen speziellen Ausführungsformen kann das BCMP, Fragment, Analogon oder Derivat als ein Fusions- oder chimäres Proteinprodukt exprimiert werden (umfassend das Protein, Fragment, Analogon oder Derivat, verbunden über eine Peptidbindung mit einer heterologen Proteinsequenz). Beispielsweise können die Polypeptide mit der konstanten Domäne von Immunoglobulinen (IgA, IgE, IgG, IgM) oder Teilen davon (CH1, CH2, CH3 oder jede Kombination davon und Teile davon) fussioniert werden, was zu chimären Polypeptiden führt. Diese Fusionsproteine können die Reinigung erleichtern, die Halbwertszeit In vivo erhöhen und die Abgabe eines Antigens über eine Epithelbarriere an das Immunsystem verbessern. Eine Erhöhung der Halbwertszeit in vivo und eine erleichterte Reinigung sind für chimäre Proteine gezeigt worden, die aus den ersten zwei Domänen des menschlichen CD4-Polypeptids und verschiedenen Domänen der konstanten Regionen der Schwer- oder Leichtketten von Säugetierimmunoglobulinen bestehen. Siehe z. B. EP 394,827 ; Traunecker et al., Nature, 331: 84–86 (1988). Die verbesserte Abgabe eines Antigens über die Epithelbarriere an das Immunsystem ist für Antigene (z. B. Insulin) gezeigt worden, die an einen FcRn-Bindungspartner, wie IgG oder Fc-Fragmente konjugiert wurden (siehe z.B. PCT-Veröffentlichungen WO 96/22024 und WO 99/04813).
  • Nukleinsäuren, die für ein BCMP, ein Fragment eines BCMP, ein BCMP-verwandtes Polypeptid oder ein Fragment eines BCMP-verwandten Polypeptids kodieren, können an eine Epitop-Tag fusioniert werden (z. B. Hämagglutinin-Tag („HA"-Tag) oder flag-Tag), um die Detektion und Reinigung des exprimierten Polypeptids zu unterstützen. Beispielsweise ermöglicht ein System, beschrieben von Janknecht et al., die schnelle Reinigung von nicht denaturierten Fusionsproteinen, die in menschlichen Zellinien exprimiert werden (Janknecht et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8972–897).
  • Fusionsproteine können durch Ligieren der geeigneten Nukleinsäuresequenzen, die die gewünschten Aminosäuresequenzen kodieren, miteinander durch in der Technik bekannte Verfahren in dem richtigen Kodierungsrahmen und Exprimieren des chimären Produktes durch in der Technik allgemein bekannte Verfahren hergestellt werden. Alternativ kann ein Fusionsprotein durch Proteinsynthesetechniken, beispielsweise durch die Verwendung einer Peptidsynthesevorrichtung hergestellt werden.
  • Sowohl cDNA- als auch Genomsequenzen können geklont und exprimiert werden.
  • Domänenstruktur von BCMPs
  • Domänen von einigen BCMPs sind in der Technik bekannt und sind in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben worden. Außerdem können Domänen eines BCMP unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren identifiziert werden. Beispielsweise können eine oder mehrere Domänen eines BCMP unter Verwendung von einem oder mehreren der folgenden Programme identifiziert werden: ProDom, TMpred und SAPS. ProDom vergleicht die Aminosäuresequenz eines Polypeptids mit einer Datenbank aus gesammelten Domänen (siehe z. B. http://www.toulouse.inra.fr/prodom.html: Corpet F., Gouzy J. & Kahn D., 1999, Nukleinsäuren Res., 27: 263–267). TMpred sagt membrandurchdringende Regionen eines Polypeptids und ihre Orientierung voraus. Dieses Programm nutzt einen Algorithmus, der auf der statistischen Analyse von TMbase basiert, einer Datenbank von natürlich vorkommenden Transmembranproteinen (siehe z. B. http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html: Hofmann & Stoffel. (1993) „TMbase - A database of membrane spanning proteins segments." Biol. Chem. Hoppe-Seyler 347, 166). Das SAPS-Programm analysiert Polypeptide nach statistisch signifikanten Merkmalen, wie Ladungs-Clustern, Wiederholungen, hydrophoben Regionen, Zusammensetzungsdomänen (siehe z. B. Brendel et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2002–2006). Daher kann der Fachmann basierend auf der vorliegenden Beschreibung Domänen eines BCMP mit enzymatischer oder Bindungsaktivität identifizieren, und kann außerdem Nukleotidsequenzen, die für diese Domänen kodieren, identifizieren. Diese Nukleotidsequenzen können dann für die rekombinante Expression eines BCMP-Fragments verwendet werden, das die enzymatische oder Bindungsaktivität des BCMP behält.
  • Basierend auf der vorliegenden Beschreibung kann der Fachmann Domänen eines BCMP mit enzymatischer oder Bindungsaktivität identifizieren und kann außerdem Nukleotidsequenzen, die für diese Domänen kodieren, identifizieren. Diese Nukleotidsequenzen können dann für die rekombinante Expression des BCMP-Fragments verwendet werden, das die enzymatische oder Bindungsaktivität des BCMP behält.
  • In einer Ausführungsform weist ein BCMP eine Aminosäuresequenz auf, die einer identifizierten Domäne eines bekannten Polypeptids ausreichend ähnlich ist. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „ausreichend ähnlich" auf eine erste Aminosäure- oder Nukleotidsequenz, die eine ausreichende Anzahl an identischen oder äquivalenten (z. B. mit einer ähnlichen Seitenkette) Aminosäureresten oder Nukleotiden gegenüber einer zweiten Aminosäure- oder Nukleotidsequenz enthält, so daß die erste und die zweite Aminosäure- oder Nukleotidsequenz eine gemeinsame Strukturdomäne oder gemeinsame funktionelle Aktivität oder beides aufweisen oder kodieren.
  • Eine BCMP-Domäne kann hinsichtlich ihrer Funktion unter Verwendung von dem Fachmann allgemein bekannten Techniken analysiert werden. Beispielsweise kann eine Domäne hinsichtlich ihrer Kinaseaktivität oder hinsichtlich ihrer Fähigkeit, an DNA zu binden, unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Techniken analysiert werden. Die Kinaseaktivität kann beispielsweise durch Messen der Fähigkeit eines Polypeptids, ein Substrat zu phosphorylieren, analysiert werden. Die DNA-Bindungsaktivität kann beispielsweise durch Messen der Fähigkeit eines Polypeptids, an ein DNA-Bindungselement zu binden, in einem Assay für elektrophoretische Beweglichkeitsverschiebung analysiert werden.
  • Herstellung von Antikörpern für BCMPs
  • Gemäß der Erfindung kann ein BCMP, BCMP-Analogon, BCMP-verwandtes Protein oder ein Fragment oder Derivat von jedem der Vorhergehenden als ein Immunogen verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, die immunospezifisch ein solches Immunogen binden. Diese Immunogene können isoliert werden durch jedes günstige Mittel, einschließlich den oben beschriebenen Verfahren. Antikörper umfassen polyklonale, monoklonale, bispezifische, humanisierte oder chimärere Antikörper, einkettige Antikörper, Fab-Fragmente und F(ab')-Fragmente, Fragmente, hergestellt durch eine Fab-Expressionsbibliothek, anti-idiotypische (anti-Id) Antikörper und Epitop-bindende Fragmente von jedem der obigen, sind aber nicht darauf beschränkt. Der Ausdruck „Antikörper", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Immunoglobulinmoleküle und immunologisch aktive Teile von Immunoglobulinmolekülen, d. h., Moleküle, die eine Antigenbindungsstelle enthalten, die speziell ein Antigen bindet. Die Immunoglobulinmoleküle können von jeder Klasse (z. B. IgG, IgE, IgM, IgD und IgA) oder Unterklasse eines Immunoglobulinmoleküls sein.
  • In einer Ausführungsform sind Antikörper, die Genprodukte von Genen, die für BCMPs kodieren, öffentlich zugänglich. In einer anderen Ausführungsform werden Verfahren, die dem Fachmann bekann sind, verwendet, um Antikörper herzustellen, die ein BCMP, ein BCMP-Analogon, ein BCMP-verwandtes Polypeptid oder ein Fragment oder Derivat von jedem der Vorhergehenden erkennen.
  • In einer Ausführungsform werden Antikörper für eine spezifische Domäne eines BCMP hergestellt. In einer speziellen Ausführungsform werden hydrophile Fragmente eines BCMP als Immunogene für die Antikörperherstellung verwendet.
  • Bei der Herstellung von Antikörpern kann das Screening für den gewünschten Antikörper durch Techniken, die in der Technik bekannt sind, erreicht werden, z. B. ELISA (heterologer Enzym-Immunassay). Um beispielsweise Antikörper zu selektieren, die eine spezifische Domäne eines BCMP erkennen, kann man generierte Hybridome für ein Produkt testen, die an ein BCMP-Fragment binden, das eine solche Domäne enthält. Für die Selektion eines Antikörpers, der spezifisch an ein erstes BCMP-Homologon bindet, aber der nicht spezifisch an ein zweites BCMP-Homologon bindet (oder weniger stark daran bindet), kann man auf der Basis der positiven Bindung an das erste BCMP-Homologon und einem Mangel an Bindung (oder verringerter Bindung) an das zweite BCMP-Homologon selektieren. Ebenso kann man für die Selektion eines Antikörpers, der spezifisch ein BCMP bindet, aber der nicht spezifisch an eine andere Isoform desselben Proteins (wie eine andere Glycoform mit demselben Kernpeptid wie das BCMP) bindet (oder weniger stark daran bindet), auf der Basis der positiven Bindung an das BCMP und einem Mangel an Bindung (oder verringerter Bindung) an die andere Isoform (z. B. eine andere Glycoform) selektieren. Daher stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Antikörpers bereit (bevorzugt eines monoklonalen Antikörpers), der mit größerer Affinität (bevorzugt mindestens 2fach, stärker bevorzugt mindestens 5fach, noch stärker bevorzugt mindestens 10fach größerer Affinität) an ein BCMP als an eine andere Isoform oder Isoformen (beispielsweise Glycoformen) des BCMP bindet.
  • Polyklonale Antikörper, die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind heterogene Populationen von Antikörpermolekülen, abgeleitet von den Seren von immunisierten Tieren. Nicht fraktioniertes Immunserum kann ebenso verwendet werden. Verschiedene Verfahrensweisen, die in der Technik bekannt sind, können für die Herstellung von polyklonalen Antikörpern für einem BCMP, ein Fragment eines BCMP, ein BCMP-verwandtes Polypeptid oder ein Fragment eines BCMP-verwandten Polypeptids verwendet werden. In einer speziellen Ausführungsform können Kaninchen-polyklonale Antikörper für ein Epitop eines BCMP oder eines BCMP-verwandten Polypeptids erhalten werden. Beispielsweise können für die Herstellung von polyklonalen oder monoklonalen Antikörper verschiedene Wirtstiere durch Injektion mit der nativen oder einer synthetischen (beispielsweise rekombinanten) Version eines BCMP, eines Fragments eines BCMP, eines BCMP-verwandten Polypeptids oder eines Fragments eines BCMP-verwandten Polypeptids, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Kaninchen, Mäuse, Ratten usw., immunisiert werden. Die hierin beschriebene Bevorzugte Technologie stellt isolierte BCMPs bereit, die für eine solche Immunisierung geeignet sind. Wenn das BCMP durch Gelelektrophorese gereinigt wird, kann das BCMP zur Immunisierung mit oder ohne vorherige Extraktion aus dem Polyacrylamidgel verwendet werden. Verschiedene Hilfsmittel können in Abhängigkeit der Wirtsspezies verwendet werden, um die immunologische Antwort zu verbessern, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, komplettes oder nicht-komplettes Freundsches Adjuvans, ein Mineralgel, wie Aluminumhydroxid, oberflächenaktive Substanz, wie Lysolecithin, Pluronsäure-Polyol, ein Polyanion, ein Peptid, eine Ölemulsion, Schlüssellochnapfschnecke-Hämocyanin, Dinitrophenol und ein Hilfsmittel, wie BCG (Bazillus Calmette Guérin) oder Corynebacterium acnes. Zusätzliche Hilfsmittel sind in der Technik ebenso bekannt.
  • Zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern (mAbs), die gegen ein BCMP, ein Fragment eines BCMP, ein BCMP-verwandtes Polypeptid oder ein Fragment eines BCMP-verwandten Polypeptids gerichtet sind, kann jede Technik, die für die Herstellung von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zellinien in Kultur bereitgestellt wird, verwendet werden. Beispielsweise die Hybridom-Technik, ursprünglich entwickelt von Kohler and Milstein (1975, Nature 256: 495–497), sowie die Trioma-Technik, die humane B-Zell-Hybridom-Technik (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72) und die EBV-Hybridom-Technik zur Herstellung menschlicher monoklonaler Antikörper (Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapie, Alan R. Liss, Inc., S. 77–96). Diese Antikörper können von jeder Immunoglobulinklasse sein, einschließlich IgG, IgM, IgE, IgA, IgD und jeder Unterklasse davon. Die Hybridomen, die das mAbs herstellen, können in vitro oder in vivo kultiviert werden. In einer zusätzlichen Ausführungsform können monoklonale Antikörper in keimfreien Tieren unter Verwendung bekannter Technologie hergestellt werden (PCT/US90/02545).
  • Die monoklonalen Antikörper umfassen menschliche monoklonale Antikörper und chimäre monoklonale Antikörper (z. B. Mensch-Maus-Chimäre), sind aber nicht darauf beschränkt. Ein chimärer Antikörper ist ein Molekül, bei dem unterschiedliche Teile von unterschiedlichen Tierspezies stammen. wie die mit einer menschlichen Immunoglobulin konstanten Region und einer variablen Region, abgeleitet von einem Maus-mAb. (Siehe z. B. Cabilly et al., US-Patent-Nr.: 4,816,567; und Boss et al., US-Patent-Nr. 4,816,397. Humanisierte Antikörper sind Antikörpermoleküle aus nichtmenschlichen Spezies mit einem oder mehreren komplementaritätsbestimmende Region (CDRs) aus der nichtmenschlichen Spezies und einer Gerüstregion aus einem menschlichen Immunoglobulinmolekül. (Siehe z. B. Queen, US-Patent Nr. 5,585,089).
  • Chimäre und humanisierte monoklonale Antikörper können hergestellt werden durch rekombinante DNA-Verfahren, die in der Technik bekannt sind, beispielsweise unter Verwendung von Verfahren, beschrieben in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 87/02671; europäischen Patentanmeldung 184.187; europäischen Patentanmeldung 171.496; europäischen Patentanmeldung 173.494; PCT-Veröffentlichung Nr. WO 86/01533; US-Patent-Nr. 4,816,567; europäischen Patentanmeldung 125.023; Better et al., 1988, Science 240: 1041–1043; Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439–3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139: 3521–3526; Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214–218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47: 999–1005; Wood et al., 1985, Nature 314: 446–449; und Shaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553–1559; Morrison, 1985, Science 229: 1202–1207; Oi et al., 1986, Bio/Techniques 4: 214; US-Patent 5,225,539; Jones et al., 1986, Nature 321: 552–525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239: 1534; und Beidler et al., 1988, J. Immunol. 141: 4053–4060.
  • Vollständig menschliche Antikörper sind besonders wünschenswert für die therapeutische Behandlung von menschlichen Subjekten. Diese Antikörper können unter Verwendung von transgenen Mäusen hergestellt werden, die endogene Immunoglobulin-Schwer- und Leichtkettengene nicht exprimieren können, aber die menschliche Schwer- und Leichtkettengene exprimieren können. Die transgenen Mäuse werden in der normalen Weise mit einem ausgewählten Antigen immunisiert, z. B. das gesamte oder ein Teil eines BCMP. Monoklonale Antikörper, die gegen das Antigen gerichtet sind, können unter Verwendung der konventionellen Hybridomtechnik erhalten werden. Die menschlichen Immunoglobulintransgene, die von den transgenen Mäusen beherbergt werden, lagern sich während der B-Zelldifferenzierung um, und unterliegen anschließend einem Klassenwechsel und somatischer Mutation. Daher ist es unter Verwendung einer solchen Technik möglich, therapeutisch nützliche IgG-, LgA-, IgM- und IgE-Antikörper herzustellen. Für einen Überblick dieser Technologie zur Herstellung menschlicher Antikörper siehe Lonberg and Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13: 65–93). Für eine ausführliche Erörterung dieser Technik zur Herstellung menschlicher Antikörper und menschlicher monoklonaler Antikörper und Protokolle zur Herstellung dieser Antikörper siehe z. B. US-Patent 5,625,126; US-Patent 5,633,425; US-Patent 5,569,825; US-Patent 5,661,016; und US-Patent 5,545,806. Außerdem können Firmen wie Abgenix, Inc. (Freemont, CA) und Genpharm (San Jose, CA) verpflichtet werden, menschliche Antikörper, die gegen ein ausgewähltes Antigen gerichtet sind, unter Verwendung einer Technik, die der oben beschriebenen ähnlich ist, bereitzustellen.
  • Vollständig menschliche Antikörper, die ein ausgewähltes Epitop erkennen, können unter Verwendung einer Technik erzeugt werden, bezeichnet als „gesteuerte Selektion". Bei diesem Ansatz wird ein gewählter nichtmenschlicher monoklonaler Antikörper, z. B. ein Maus-Antikörper, verwendet, um die Selektion eines vollständig menschlichen Antikörpers zu steuern, der dasselbe Epitop erkennt. (Jespers et al. (1994) Bio/technology 12: 899–903).
  • Die Antikörper können ebenso unter Verwendung verschiedener Phagendisplayverfahren, die in der Technik bekannt sind, erzeugt werden. Bei Phagendisplayverfahren werden funktionelle Antikörperdomänen auf der Oberfläche der Phagenteilchen gezeigt, welche die Polynukleotidsequenzen, die diese kodieren, tragen. Insbesondere kann ein solcher Phage verwendet werden, um Antigenbindungsdomänen zu zeigen, die aus einer Repertoire- oder kombinatorischen Antikörperbibliothek (z. B. Mensch oder Maus) exprimiert wird. Ein Phage, der eine Antigenbindungsdomäne exprimiert, die das Antigen von Interesse bindet, kann mit dem Antigen, z. B. unter Verwendung von markiertem Antigen oder Antigen, das an eine feste Oberfläche oder Kügelchen gebunden oder eingefangen ist, ausgewählt oder identifiziert werden. Phagen, die in diesen Verfahren verwendet werden, sind typischerweise filamentöse Phagen, umfassend fd- und M13-Bindungsdomänen, exprimiert aus Phage mit Fab-, Fv- oder Disulfid-stabilisierten Fv-Antikörperdomänen, rekombinant fusioniert an entweder das Phagen-Gen-III- oder -Gen-VIII-Protein. Phagendisplayverfahren, die verwendet werden können, um die Antikörper herzustellen, umfassen die, die in Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182: 41–50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184: 177–186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24: 952–958 (1994); Persic et al., Gene 187 9–18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57: 191–280 (1994); PCT-Anmeldung Nr. PCT/GB91/01134; PCT-Veröffentlichungen WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401 und US-Patente Nr. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 und 5,969,108 offenbart sind.
  • Wie in den obigen Verweisen beschrieben, können nach der Phagenselektion die Antikörperkodierenden Regionen aus dem Phagen isoliert und verwendet werden, um ganze Antikörper, einschließlich menschliche Antikörper, oder jedes andere gewünschte Antigen-bindende Fragment herzustellen, und in jedem gewünschten Wirt, einschließlich z. B. Säugetierzellen, Insektenzellen, Pflanzenzellen, Hefe und Bakterien, exprimiert werden, wie nachstehend ausführlich beschrieben. Beispielsweise können Techniken, um Fab-, Fab'- und F(ab')2-Fragmente rekombinant herzustellen, ebenso unter Verwendung der Verfahren, die in der Technik bekannt sind, eingesetzt werden, wie die, die in der PCT-Veröffentlichung WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6): 864–869 (1992); und Sawai et al., AJRI 34 26–34 (1995); und Better et al., Science 240: 1041–1043 (1988) offenbart sind.
  • Beispiele von Techniken, die verwendet werden können, um einkettige Fvs und Antikörper herzustellen, umfassen die, die in den US-Patenten 4,946,778 und 5,258,498; Huston et al., Methods in Enzymology 203: 46–88 (1991); Shu et al., PNAS 90: 7995–7999 (1993); und Skerra et al., Science 240: 1038–1040 (1988) beschrieben sind.
  • Die Erfindung stellt ferner die Verwendung von bispezifischen Antikörpern bereit, die durch in der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden können. Die traditionelle Herstellung von bispezifischen Voll-Längen-Antikörpern basiert auf der Coexpression von zwei Immunoglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paaren, wobei die zwei Ketten unterschiedliche Spezifitäten aufweisen (Milstein et al., 1983, Nature 305: 537–539). Aufgrund der zufälligen Verteilung von Immunoglobulin-Schwer- und -Leichtketten erzeugen diese Hybridome (Quadrome) ein mögliches Gemisch aus 10 verschiedenen Antikörpermolekülen, von denen nur eines die korrekte bispezifische Struktur aufweist. Die Reinigung des korrekten Moleküls, die normalerweise durch Affinitätschromatographieschritte durchgeführt wird, ist eher umständig, und die Produktausbeuten sind gering. Ähnliche Verfahrensweisen sind in WO 93/08829, veröffentlicht 13. Mai 1993, und in Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10: 3655–3659 offenbart.
  • Gemäß einem anderen und stärker bevorzugten Ansatz werden Antikörper-variable Domänen mit den gewünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-Bindungsstellen) an Immunoglobulin-konstante Domänsequenzen anelliert. Die Fusion erfolgt bevorzugt mit einer Immunoglobulin-Schwerketten konstanten Domäne, umfassend mindestens einen Teil der Gelenk-, CH2- und CH3-Regionen. Es ist bevorzugt, daß die erste Schwerketten-konstante Region (CH1), die die Stellte enthält, die für das Binden der leichten Kette notwendig ist, in mindestens einer der Fusionen vorliegt. DNAs, die die Immunoglobulin-Schwerketten-Fusionen und wenn gewünscht, die Immunoglobulin-Leichtkette kodieren, werden in separate Expressionsvektoren eingeführt, und in einen geeigneten Wirtsorganismus co-transfektiert. Dies stellt große Flexibilität bei der Einstellung der wechselseitigen Anteile der drei Polypeptidfragmente in Ausführungsformen bereit, wenn ungleiche Verhältnisse der drei Polypeptidketten, die bei der Konstruktion verwendet werden, die optimalen Ausbeuten bereitstellen. Es ist jedoch möglich, die kodierenden Sequenzen für zwei oder alle drei Polypeptidketten in einem Expressionsvektor einzuführen, wenn die Expression von mindestens zwei Polypeptidketten in gleichen Verhältnissen zu hohen Ausbeuten führt oder wenn die Verhältnisse von keiner besonderen Signifikanz sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Ansatzes bestehen die bispezifischen Antikörper aus einer Hybrid-Immunoglobulin-Schwerkette mit einer ersten Bindungsspezifität in einem Arm und einem Hybrid-Immunoglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paar (das eine zweite Bindungsspezifität bereitstellt) in dem anderen Arm. Es wurde herausgefunden, daß diese asymmetrische Struktur die Trennung der gewünschten bispezifischen Verbindung von ungewünschten Immunoglobulinkettenkombinationen erleichtert, wenn die Gegenwart einer Immunoglobulinleichtkette in nur einer Hälfte des bispezifischen Moleküls einen leichten Weg der Trennung bereitstellt. Dieser Ansatz wird in WO 94/04690, veröffentlicht am 3. März 1994, offenbart. Für weitere Einzelheiten zum Erzeugen bispezifischer Antikörper siehe beispielsweise Suresh et al., Methods in Enzymology, 1986, 121: 210.
  • Die Erfindung stellt die Verwendung von funktionell aktiven Fragmenten, Derivaten oder Analoga der Anti-BCMP-Immunoglobulinmoleküle bereit. Funktionell aktiv bedeutet, daß das Fragment, Derivat oder Analogon fähig ist, Anti-Anti-idiotyp-Antikörper (d. h. tertiäre Antikörper) hervorzurufen, die dasselbe Antigen erkennen, welches durch den Antikörper erkannt wird, von dem das Fragment, Derivat oder Analogon abgeleitet ist. Speziell kann in einer bevorzugten Ausführungsform die Antigenität des Idiotyps des Immunoglobulinmoleküls durch die Deletion der Gerüst- und CDR-Sequenzen, die zu der CDR-Sequenz, die das Antigen spezifisch erkennt, C-terminal sind, verbessert werden. Um zu bestimmen, welche CDR-Sequenzen das Antigen binden, können synthetische Peptide, die die CDR-Sequenzen enthalten, in Bindungsassays mit dem Antigen durch jedes in der Technik bekannte Bindungsassayverfahren verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung von Antikörperfragmenten bereit, wie F(ab')2-Fragmente und Fab-Fragmente, sind aber nicht darauf beschränkt. Antikörperfragmente, die spezifische Epitope erkennen, können durch bekannte Techniken erzeugt werden. F(ab')2-Fragmente bestehen aus der variablen Region, der Leichtketten-konstanten Region und der CH1-Domäne der Schwerkette und werden durch Pepsindigestion des Antikörpermoleküls erzeugt. Fab-Fragmente werden durch Reduzieren der Disulfidbrücken der F(ab')2-Fragmente erzeugt. Die Erfindung stellt ebenso die Verwendung von Schwerketten- und Leichtkettendimeren der Antikörper bereit, oder jedes minimale Fragment davon, wie Fvs oder Einzelketten-Antikörper (SCAs), (z. B. wie in US-Patent 4,946,778; Bird, 1988, Science 242: 423–42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879–5883; und Ward et al., 1989, Nature 334: 544–54 beschrieben), oder jedes andere Molekül mit derselben Spezifität wie der Antikörper. Einkettige Antikörper werden durch Verknüpfen der Schwer- und Leichtkettenfragmente der Fv-Region über eine Aminosäurebrücke gebildet, was zu einem einkettigen Polypeptid führt. Techniken für die Zusammenlagerung von funktionellen Fv-Fragmenten in E. coli können verwendet werden (Skerra et al., 1988, Science 242: 1038–1041).
  • In anderen Ausführungsformen stellt die Erfindung die Verwendung von Fusionsproteinen der Immunoglobuline (oder funktionell aktiver Fragmenten davon) bereit, in dem beispielsweise das Immunoglobulin über eine kovalente Bindung (z. B. eine Peptidbindung) entweder am N-Terminus oder am C-Terminus an eine Aminosäuresequenz von einem anderen Protein (oder Teil davon, bevorzugt mindestens 10, 20 oder 50 Aminosäureteile des Proteins), das nicht das Immunoglobulin ist, fusioniert. Bevorzugt ist das Immunoglobulin oder das Fragment davon mit dem anderen Protein an dem N-Terminus der konstanten Domäne kovalent verknüpft. Wie oben erläutert, können diese Fusionsproteine die Reinigung erleichtern, die Halbwertszeit in vivo erhöhen und die Abgabe eines Antigens über einer Epithelsperre an das Immunsystem verbessern.
  • Die Immunoglobuline, die in der Erfindung nützlich sind, umfassen Analoga und Derivate davon, die beide modifiziert sind, beispielsweise durch die kovalente Anlagerung von jedem Molekültyp, so lange wie die kovalente Anlagerung die immunospezifische Bindung nicht beeinträchtigt. Beispielsweise umfassen die Derivate und Analoga der Immunoglobuline, ohne Einschränkung, die, die außerdem modifiziert worden sind, beispielsweise durch Glykosylierung, Acetylierung, Pegylierung, Phosphylierung, Amidierung, Derivatisierung durch bekannte Schutz-/Blockiergruppen, proteolytische Spaltung, Verknüpfung mit einem zellulären Liganden oder einem anderen Protein usw. Jede von zahlreichen chemischen Modifikationen kann durch bekannte Techniken durchgeführt werden, einschließlich spezifischer chemischer Spaltung, Acetylierung, Formylierung usw., ist aber nicht darauf beschränkt. Außerdem kann das Analogon oder Derivat ein oder mehrere nicht klassische Aminosäuren enthalten.
  • Die vorstehenden Antikörper können in den in der Technik bekannten Verfahren, die sich auf die Lokalisierung und Aktivität der BCMPs beziehen, z. B. zum Abbilden dieser Proteine, Messen deren Niveaus in geeigneten physiologischen Proben bei diagnostischen Verfahren usw. verwendet werden.
  • Expression von Antikörpern
  • Die Antikörper, die gemäß der Erfindung verwendet werden sollen, können durch jedes Verfahren, das in der Technik für die Synthese von Antikörpern bekannt ist, insbesondere durch chemische Synthese oder durch rekombinante Expression hergestellt werden, und werden bevorzugt durch rekombinante Expressionstechniken hergestellt.
  • Rekombinante Expression von Antikörpern oder Fragmenten, Derivaten oder Analoga davon erfordert die Konstruktion einer Nukleinsäure, die den Antikörper kodiert. Wenn die Nukleotidsequenz des Antikörpers bekannt ist, kann eine Nukleinsäure, die den Antikörper kodiert, aus chemisch synthetisierten Oligonukleotiden zusammengefügt werden (z. B. wie in Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17:242 beschrieben), was kurz gesagt die Synthese von überlappenden Oligonukleotiden, die Teile der Sequenz, die den Antikörper kodiert, enthalten, Annealing und Ligation von diesen Oligonukleotiden und dann Amplifikation der ligierten Oligonukleotide durch PCR umfaßt.
  • Alternativ kann die Nukleinsäure, die den Antikörper kodiert, durch Klonen des Antikörpers erhalten werden. Wenn ein Klon, enthaltend die Nukleinsäure, die den speziellen Antikörper kodiert, nicht verfügbar ist, aber die Sequenz des Antikörpermoleküls bekannt ist, kann eine Nukleinsäure, die den Antikörper kodiert, aus einer geeigneten Quelle (z. B. einer Antikörper-cDNA-Bibliothek oder cDNA-Bibliothek, erzeugt aus jeglichem Gewebe oder Zellen, die den Antikörper exprimieren) durch PCR-Amplifikation unter Verwendung von synthetischen Primern, die zu den 3'- und 5'-Enden der Sequenz hybridisierbar sind, oder durch Klonen unter Verwendung einer Oligonukleotidsonde, die für eine spezielle Gensequenz spezifisch ist, erhalten werden.
  • Wenn ein Antikörpermolekül, das ein spezielles Antigen spezifisch erkennt, nicht verfügbar ist (oder eine Quelle für eine cDNA-Bibliothek zum Klonen einer Nukleinsäure, die einen solchen Antikörper kodiert), können Antikörper, die für ein spezielles Antigen spezifisch sind, durch jedes in der Technik bekannte Verfahren erzeugt werden, beispielsweise durch Immunisieren eines Tieres, wie ein Kaninchen, um polyklonale Antikörper zu erzeugen, oder stärker bevorzugt durch Erzeugen monoklonaler Antikörper. Alternativ kann ein Klon, der mindestens den Fab-Teil des Antikörpers kodiert, durch Screening der Fab-Expressionsbibliotheken (z. B. wie in Huse et al., 1989, Science 246: 1275–1281 beschrie ben) nach Klonen von Fab-Fragmenten, die das spezielle Antigen binden, oder durch Screening von Antikörperbibliotheken (siehe z. B. Clackson et al., 1991, Nature 352 : 624 ; Hane et al., 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 : 4937) erhalten werden.
  • Sobald eine Nukleinsäure, die mindestens die variable Domäne des Antikörpermoleküls kodiert, erhalten wird, kann sie in einen Vektor eingeführt werden, der die Nukleotidsequenz enthält, die die konstante Region des Antikörpermoleküls kodiert (siehe z. B. PCT-Veröffentlichung WO 86/05807; PCT-Veröffentlichung WO 89/01036; und US-Patent Nr. 5,122,464). Vektoren, enthaltend die vollständige leichte oder schwere Kette zur Co-Expression mit der Nukleinsäure, um die Expression eines vollständigen Antikörpermoleküls zu ermöglichen, sind ebenso erhältlich. Dann kann die Nukleinsäure, die den Antikörper kodiert, verwendet werden, um die Nukleotidsubstitution(en) oder -deletion(en) einzuführen, die notwendig ist/sind, um den oder die Cysteinreste der variablen Region zu substituieren (oder zu löschen), die in einer Disulfidspange mit einem Aminosäurerest, der keine Sulfhydrylgruppe enthält, beteiligt sind. Diese Modifikationen können durch jede in der Technik bekannte Verfahren zur Einführung von speziellen Mutationen oder Deletionen in eine Nukleotidsequenz durchgeführt werden, beispielsweise chemische Mutagenese, ortsgerichtete in-vitro-Mutagenese (Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551), PCT-basierende Verfahren, usw., sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Außerdem können Techniken, die für die Herstellung von „chimären Antikörpern" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 851–855; Neuberger et al., 1984, Nature 312: 604–608; Takeda et al., 1985, Nature 314: 452–454) durch Splicen von Genen aus einem Maus-Antikörper-Molekül mit geeigneter Antigenspezifität zusammen mit Genen aus einem menschlichen Antikörpermolekül mit geeigneter biologischer Aktivität entwickelt werden, verwendet werden. Wie oben beschrieben, ist ein chimärer Antikörper ein Molekül, bei dem unterschiedliche Teile von unterschiedlichen Tierspezies abgeleitet werden, wie die mit einer variablen Region, abgeleitet von einem Maus-mAb und einem menschlichen Antikörper konstanten Region, z. B. humanisierte Antikörper.
  • Sobald eine Nukleinsäure, die ein Antikörpermolekül kodiert, erhalten worden ist, kann der Vektor für die Herstellung des Antikörpermoleküls durch rekombinante DNA-Technik unter Verwendung von in der Technik allgemein bekannten Techniken hergestellt werden. Daher werden Verfahren zur Herstellung des Proteins durch Exprimieren von Nukleinsäure, die die Antikörpermolekülsequenzen enthält, hierin beschrieben. Verfahren, die dem Fachmann allgemein bekannt sind, können verwendet werden, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die Sequenzen, die ein Antikörpermolekül kodieren, und geeignete transkriptionelle und translatorische Kontrollsignale enthalten. Diese Verfahren umfassen beispielsweise in vitro rekombinante DNA-Techniken, Synthesetechniken und genetische in-vivo-Rekombination. Siehe beispielsweise die Techniken, beschrieben in Sambrook et al. (1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), und Ausubel et al. (Hrsg., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY).
  • Der Expressionsvektor wird in eine Wirtszelle durch konventionelle Techniken übertragen, und die transfektierten Zellen werden dann durch konventionelle Techniken kultiviert, um einen Antikörper herzustellen.
  • Die Wirtszellen, die verwendet werden, um einen rekombinanten Antikörper zu exprimieren, können entweder Bakterienzellen, wie Escherichia coli, oder bevorzugt eukaryotische Zellen, speziell für die Expression des gesamten rekombinanten Antikörpermoleküls sein. Insbesondere sind Säugerzellen, wie Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO), zusammen mit einem Vektor, wie das Hauptintermediat-Frühgen-Promotorelement („major intermediate early gene promoter element") aus menschlichem Cytomegalovirus, ein wirksames Expressionssystem für Antikörper (Foecking et al., 1986, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2).
  • Eine Vielzahl von Wirts-Expressions-Vektorsystemen können verwendet werden, um ein Antikörpermolekül zu exprimieren. Diese Wirts-Expressions-Systeme stellen Vehikel dar, durch die die kodierenden Sequenzen von Interesse hergestellt und anschließend gereinigt werden können, aber stellen ebenso Zellen dar, die, wenn sie mit den geeigneten Nukleotidkodierenden Sequenzen transformiert oder transfektiert werden, das Antikörpermolekül in situ exprimieren. Diese umfassen Mikroorganismen, wie Bakterien (z.B. E. coli, B. subtilis) transformiert mit rekombinanten Bakteriophagen-DNA-, Plasmid-DNA- oder Kosmid-DNA-Expressionsvektoren, enthaltend Antikörper-kodierende Sequenzen; Hefe (z. B. Saccharomyces, Pichia), transformiert mit rekombinanten Hefe-Expressionsvektoren, enthaltend Antikör per-kodierende Sequenzen; Insektenzellsysteme, infiziert mit rekombinanten Virusexpressionsvektoren (z. B. Baculovirus), enthaltend die Antikörper-kodierenden Sequenzen; Pflanzenzellsysteme, infiziert mit rekombinanten Virusexpressionsvektoren (z. B. Blumenkohlmosaik-Virus, CaMV; Tabakmosaikvirus, TMV) oder transformiert mit rekombinanten Plasmid-Expressionsvektoren (z. B. Ti-Plasmid), enthaltend Antikörper-kodierende Sequenzen; oder Säugetierzellsysteme (z. B. COS-, CHO-, BHK-, 293-, 3T3-Zellen), die rekombinante Expressionskonstrukte beherbergen, enthaltend Promotoren, abgeleitet aus dem Genom von Säugetierzellen (z. B. Metallothionein-Promotor) oder von Säugetierviren (z. B. den Adenovirus-Late-Promotor; der Vakzinevirus-7.5K-Promotor), sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Bei bakteriellen Systemen kann eine Anzahl von Expressionsvektoren in Abhängigkeit der Verwendung, die für das zu exprimierende Antikörpermolekül vorgesehen ist, vorteilhaft ausgewählt werden. Beispielsweise können, wenn eine große Menge eines solchen Proteins für die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, umfassend ein Antikörpermolekül, hergestellt werden soll, Vektoren, die sich auf die Expression von hohen Niveaus an Fusionsproteinprodukten, die leicht gereinigt werden, richten, wünschenswert sein. Diese Vektoren umfassen den E. coli-Expressionsvektor pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791), bei dem die Antikörper-kodierende Sequenz individuell in den Vektor im Rahmen mit der lac Z-kodierenden Region ligiert werden kann, so daß ein Fusionsprotein hergestellt wird; pIN-Vektoren (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101–3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24: 5503–5509); und dergleichen, sind aber nicht darauf beschränkt. pGEX-Vektoren können ebenso verwendet werden, um fremde Polypeptide als Fusionsproteine mit Glutathion-S-transferase (GST) zu exprimieren. Im allgemeinen sind solche Fusionsproteine löslich und können leicht aus lysierten Zellen durch Adsorption und Binden an Matrixglutathion-Agarosekügelchen, gefolgt von Elution in Gegenwart von freiem Glutathion, gereinigt werden. Die pGEX-Vektoren sind so konstruiert, daß sie Thrombin- oder Faktor-Xa-Protease-Spaltstellen umfassen, so daß das geklonte Zielgenprodukt aus der GST-Einheit freigesetzt werden kann.
  • In einem Insektensystem wird der Kern-Polyhedrosevirus (AcNPV) von Autographa californica als ein Vektor verwendet, um fremde Gene zu exprimieren. Das Virus wächst in Spodoptera frugiperda-Zellen. Die Antikörper-kodierende Sequenz kann einzeln in nicht-essenziellen Regionen (beispielsweise das Polyhedringen) des Virus geklont und unter die Kontrolle eines AcNPV-Promotors (beispielsweise des Polyhedrinpromotors) gestellt werden. In Säugetierwirtszellen kann eine Vielzahl von Virus-basierenden Expressionssystemen (z. B. ein Adenovirus-Expressionssystem) verwendet werden.
  • Wie oben erläutert, kann ein Wirtszellstamm ausgewählt werden, der die Expression der eingeführten Sequenzen moduliert oder das Genprodukt in der gewünschten speziellen Weise modifiziert und verarbeitet. Diese Modifikationen (z. B. Glycosylierung) und Verarbeitung (z. B. Spaltung) von Proteinprodukten können für die Funktion des Proteins wichtig sein.
  • Für die ergiebige Langzeitherstellung von rekombinanten Antikörpern ist die stabile Expression bevorzugt. Beispielsweise können Zellinien, die einen Antikörper von Interesse stabil exprimieren, durch Transfektieren der Zellen mit einem Expressionsvektor, umfassend die Nukleotidsequenz des Antikörpers und die Nukleotidsequenz eines selektierbaren Markers (z. B. Neomycin oder Hygromycin), und Selektieren hinsichtlich der Expression des selektierbaren Markers hergestellt werden. Diese konstruierten Zellinien können beim Screening und Bewertung von Verbindungen, die direkt oder indirekt mit dem Antikörpermolekül interagieren, besonders nützlich sein.
  • Die Expressionsniveaus des Antikörpermoleküls können durch Vektoramplifikation erhöht werden (für einen Überblick siehe Bebbington and Hentschel, the use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Bd. 3. (Academic Press, New York, 1987)). Wenn ein Marker in dem Vektorsystem, das den Antikörper exprimiert, amplifizierbar ist, wird eine Erhöhung des Niveaus an Inhibitor, der in der Kultur der Wirtzelle vorliegt, die Anzahl an Kopien des Markergens erhöhen. Da die amplifizierte Region mit dem Antikörpergen assoziiert ist, wird sich die Herstellung von Antikörper ebenso erhöhen (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257).
  • Die Wirtszelle kann mit zwei Expressionsvektoren co-transfektiert werden, wobei der erste Vektor ein Schwerketten-abgeleitetes Polypeptid kodiert und der zweite Vektor ein Leichtketten-abgeleitetes Polypeptid kodiert. Die zwei Vektoren können identische selektierbare Marker enthalten, die gleiche Expression von Schwer- und Leichtkettenpolypeptiden ermöglichen. Alternativ kann ein einzelner Vektor verwendet werden, der sowohl Schwer- als auch Leichtkettenpolypeptide kodiert. In solchen Situationen sollte die Leichtkette vor der Schwerkette plaziert sein, um einen Überschuß an toxischer freier Schwerkette zu vermeiden (Proudfoot, 1986, Nature 322: 52; Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2197). Die kodierenden Sequenzen für die Schwer- und Leichtketten können cDNA oder genomische DNA umfassen.
  • Sobald das Antikörpermolekül rekombinant exprimiert worden ist, kann es durch jedes Verfahren, das in der Technik zur Reinigung eines Antikörpermoleküls bekannt ist, gereinigt werden, beispielsweise durch Chromatographie (z.B. Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie wie mit Protein A oder spezifischem Antigen, und Größensäulenchromatographie), Zentrifugation, unterschiedliche Löslichkeit oder durch ein anderes Standardverfahren zur Reinigung von Proteinen.
  • Alternativ kann jedes Fusionsprotein ohne weiteres durch die Nutzung eines Antikörpers gereinigt werden, der für das zu exprimierende Fusionsprotein spezifisch ist. Beispielsweise ermöglicht ein System, beschrieben von Janknecht et al., die schnelle Reinigung von nicht-denaturierten Fusionsproteinen, die in menschlichen Zellinien exprimiert werden (Janknecht et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8972–897). Bei diesem System wird das Gen von Interesse in ein Vakzine-Rekombinationsplasmid subgeklont, so daß der offene Leserahmen des Gens translationell an einen Amino-terminalen Tag, bestehend aus sechs Histidinresten, fusioniert wird. Das Tag dient als eine Matrixbindungsdomäne für das Fusionsprotein. Extrakte aus Zellen, infiziert mit rekombinantem Vakzinevirus, werden auf Ni2+-Nitrilessigsäure-Agarose-Säulen geladen, und Histidin-markierte Proteine werden selektiv mit Imidazol-enthaltenden Puffern eluiert.
  • Konjugierte Antikörper
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden Anti-BCMP-Antikörper oder Fragmente davon an eine diagnostische oder therapeutische Komponente konjugiert. Die Antikörper können für die Diagnose oder zur Bestimmung der Wirksamkeit eines vorgegebenen Behandlungsregimes verwendet werden. Die Detektion kann durch Verknüpfen des Antikörpers mit einer detektierbaren Substanz erleichtert werden. Beispiele von detektierbaren Substanzen umfassen verschiedene Enzyme, prosthetische Gruppen, fluoreszierende Stoffe, lumineszierende Stoffe, biolumineszierende Stoffe, radioaktive Nuklide, Positronen-emittierende Metalle (zur Verwendung in der Positronenemissionstomographie) und nichtradioaktive parama gnetische Metallionen. Siehe im allgemeinen US-Patent Nr. 4,741,900 für Metallionen, die an Antikörper zur Verwendung als Diagnostika gemäß der vorliegenden Erfindung konjugiert werden können. Geeignete Enzyme umfassen Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, Beta-Galaktosidase oder Acetylcholinesterase; geeignete prosthetische Gruppen umfassen Streptavidin, Avidin und Biotin; geeignete fluoreszierende Materialien umfassen Umbelliferon, Fluorescein, Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Dichlortriazinylaminfluorescein, Dansylchlorid und Phycoerythrin; geeignete lumineszierende Materialien umfassen Luminol; geeignete biolumineszierende Materialien umfassen Luciferase, Luciferin und Aequorin; und geeignete radioaktive Nuklide umfassen 125I, 131I, 111In und 99Tc.
  • Anti-BCMP-Antikörper oder Fragmente davon können an eine Therapeutika- oder Arzneimittelkomponente konjugiert werden, um eine gegebene biologische Reaktion zu modifizieren. Die Therapeutika- oder Arzneimittelkomponente ist nicht so konstruiert, daß sie auf die klassischen chemischen Therapeutika eingeschränkt ist. Beispielsweise kann die Arzneimittelkomponente ein Protein oder Polypeptid sein, das eine gewünschte biologische Aktivität besitzt. Diese Proteine können beispielsweise ein Toxin, wie Abrin, Ricin A, Pseudomonas exotoxin oder Diphtherietoxin; ein Protein, wie Tumornekrosefaktor, α-Interferon, β-Interferon, Nervenwachstumsfaktor, aus Blutplättchen gewonnener Wachstumsfaktor, Gewebe-Plasminogen-Aktivator, ein Thrombosemittel oder ein anti-angiogenetisches Mittel, z.B. Angiostatin oder Endostatin; oder einen Biological Response Modifier, wie ein Lymphokin, Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-2 (IL-2), Interleukin-6 (IL-6), Granulozytenmakrophagenkolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF), Granulozytenkolonie-stimulierenden Faktor (G-CSF), Nervenwachstumsfaktor (NGF) oder anderen Wachstumsfaktor umfassen.
  • Techniken zum Konjugieren dieser therapeutischen Komponente an Antikörper sind allgemein bekannt, siehe z. B. Arnon et al., „Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (Hrsg.), S. 243–56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., „Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2. Aufl.), Robinson et al. (Hrsg.), S. 623–53 (Marcel Decker, Inc. 1987); Thorpe, „Antibodies Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (Hrsg.), S. 475–506 (1985); „Analyse, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy"; in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (Hrsg.), S. 303–16 (Academic Press 1985), und Thorpe et al., „The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119–58 (1982).
  • Alternativ kann ein Antikörper an einem zweiten Antikörper konjugiert werden, um ein Antikörperheterokonjugat zu bilden, wie durch Segal in US-Patent Nr. 4,676,980 beschrieben.
  • Ein Antikörper mit oder ohne eine therapeutische Komponente, die daran konjugiert ist, kann als ein Therapeutikum verwendet werden, das allein oder in Kombination mit zytotoxischen Faktoren) und/oder Zytokin(en) verabreicht wird.
  • Diagnose von Brustkrebs
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung können Testproben von Brustgewebe, Serum, Plasma oder Urin, erhalten aus einem Subjekt, bei dem ein Verdacht von Brustkrebs vorliegt oder von dem bekannt ist, daß es Brustkrebs hat, zur Diagnose oder Überwachung verwendet werden. In einer Ausführungsform gibt eine Veränderung in der Häufigkeit von ein oder mehreren BCMPs in einer Testprobe in bezug auf eine Kontrollprobe (aus einem Subjekt oder Subjekten ohne Brustkrebs) oder einem zuvor bestimmten Referenzbereich die Gegenwart von Brustkrebs an. In einer anderen Ausführungsform gibt die relative Häufigkeit von ein oder mehreren BCMPs in einer Testprobe im Vergleich zu einer Kontrollprobe oder einem zuvor bestimmten Referenzbereich einen Subtyp von Brustkrebs an (z. B. familiärer oder sporadischer Brustkrebs). In noch einer anderen Ausführungsform gib die relative Häufigkeit von ein oder mehreren BCMPs in einer Testprobe in bezug auf eine Kontrollprobe oder einen zuvor bestimmten Referenzbereich den Grad an Schwere von Brustkrebs an (z. B. die Wahrscheinlichkeit von Metastasen). In jedem der zuvor genannten Verfahren kann die Detektion von ein oder mehreren BCMPs gegebenenfalls mit der Detektion von ein oder mehreren zusätzlichen Biomarkern für Brustkrebs kombiniert werden. Jedes geeignete Verfahren in der Technik kann eingesetzt werden, um das Niveau an BCMPs zu messen, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, der hierin beschriebenen bevorzugten Technologie, Kinaseassays, Immunoassays zur Detektion und/oder Visualisierung der BCMPs (z.B. Western-Blot, Immunopräzipitation, gefolgt von Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-Gelelektrophorese, Immunozytochemie usw.). In Fällen, wo ein BCMP eine bekannte Funktion aufweist, kann ein Assay für diese Funktion verwendet werden, um die BCMP-Expression zu messen. In einer weiteren Aus führungsform gibt eine Veränderung in der Häufigkeit von mRNA, die für ein oder mehrere BCMPs kodiert, in einer Testprobe in bezug auf eine Kontrollprobe oder einen zuvor bestimmten Referenzbereich die Gegenwart von Brustkrebs an. Jeder geeignete Hybridisierungsassay kann verwendet werden, um die BCMP-Expression durch Detektieren und/oder Visualisieren von mRNA, die für das BCMP kodiert, zu detektieren (z. B. Northern-Assays, Dot-Blots, In-situ-Hybridisierung usw.).
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung können markierte Antikörper, Derivate und Analoga davon, die spezifisch an ein BCMP binden, für diagnostische Zwecke verwendet werden, um Brustkrebs zu detektieren, diagnostizieren oder zu überwachen. Bevorzugt wird Brustkrebs in einem Tier, stärker bevorzugt in einem Säugetier und am stärksten bevorzugt in einem Mensch detektiert.
  • Screening-Assays
  • Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Identifizieren von Mitteln bereit (z. B. mögliche Verbindungen oder Testverbindungen), die an BCMP binden oder eine stimulierende oder inhibierende Wirkung auf die Expression oder Aktivität eines BCMP aufweisen. Die Erfindung stellt ebenso Verfahren zum Identifizieren von Agenzien, Wirkstoffkandidaten oder Testverbindungen bereit, die an ein BCMP-verwandtes Polypeptid oder ein BCMP-Fusionsprotein binden oder eine stimulierende oder inhibierende Wirkung auf die Expression oder Aktivität eines BCMP-verwandten Polypeptids oder eines BCMP-Fusionsproteins aufweisen. Beispiele von Agenzien, Wirkstoffkandidaten oder Testverbindungen umfassen Nukleinsäuren (z.B. DNA und RNA), Kohlenhydrate, Lipide, Proteine, Peptide, Peptidomimetics, kleine Moleküle und andere Arzneimittel, sind aber nicht darauf beschränkt. Agenzien können unter Verwendung von jedem der zahlreichen Ansätze in kombinatorischen Bibliotheksverfahren, die in der Technik bekannt sind, erhalten werden, einschließlich: biologische Bibliotheken: räumlich adressierbare parallele Festphasen- oder Lösungsphasenbibliotheken; synthetische Bibliotheksverfahren, die Dekonvolution erfordern; das „Ein-Kügelchen-eine-Verbindung"-Bibliotheksverfahren; und synthetische Bibliotheksverfahren unter Verwendung von Affinitätschromatographieselektion. Der biologische Bibliotheksansatz ist auf Peptidbibliotheken begrenzt, während die anderen vier Ansätze auf Peptid-, Nicht-Peptidoligomer- oder niedermolekulare Bibliotheken von Verbindungen (Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12: 145; US-Patent Nr. 5,738,996 und US-Patent Nr. 5,807,683) anwendbar sind.
  • Beispiele von Verfahren für die Synthese von molekularen Bibliotheken können in der Technik gefunden werden, beispielsweise in: DeWitt et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909; Erb et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al., 1994, J. Med. Chem. 37: 2678; Cho et al., 1993, Science 261: 1303; Carrell et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al., 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; und Gallop et al., 1994, J. Med. Chem. 37: 1233.
  • Bibliotheken von Verbindungen können vorliegen, z. B. in Lösung (z.B. Houghten, 1992, Bio/Techniques 13: 412–421), oder auf Kügelchen (Lam, 1991, Nature 354: 82–84), Chips (Fodor, 1993, Nature 364: 555–556), Bakterien (US-Patent Nr. 5,223,409), Sporen (Patente Nr. 5,571,698; 5,403,484 und 5,223,409), Plasmiden (Cull et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865–1869) oder Phagen (Scott and Smith, 1990, Science 249: 386–390; Devlin, 1990, Science 249: 404–406; Cwirla et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378–6382; und Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222: 301–310).
  • In einer Ausführungsform werden die Mittel, die mit einem BCMP, einem BCMP-Fragment (z. B. ein funktionell aktives Fragment), einem BCMP-verwandten Polypeptid, einem Fragment eines BCMP-verwandten Polypeptids oder einem BCMP-Fusionsprotein interagieren (d. h. daran binden), in einem Zell-basierenden Assaysystem identifiziert. Gemäß dieser Ausführungsform werden die Zellen, die ein BCMP, ein Fragment eines BCMP, ein BCMP-verwandtes Polypeptid, ein Fragment des BCMP-verwandten Polypeptids oder ein BCMP-Fusionsprotein exprimieren, mit einem Wirkstoffkandidat oder einer Kontrollverbindung kontaktiert, und die Fähigkeit des Wirkstoffkandidaten, mit dem BCMP zu interagieren, wird bestimmt. Wenn gewünscht, kann dieser Assay verwendet werden, um eine Vielzahl von (z. B. eine Bibliothek) Wirkstoffkandidaten zu screenen. Die Zelle kann beispielsweise von prokaryotischem Ursprung (z.B. E.-coli) oder eukaryotischem Ursprung (z.B. Hefe oder Säugetier) sein. Ferner können die Zellen das BCMP, Fragment des BCMP, BCMP-verwandte Polypeptid, ein Fragment des BCMP-verwandten Polypeptids oder ein BCMP-Fusionsprotein endogen exprimieren oder genetisch konstruiert werden, um das BCMP, Fragment des BCMP, BCMP-verwandte Polypeptid, ein Fragment des BCMP-verwandten Polypeptids oder ein BCMP-Fusionsprotein zu exprimieren. In bestimmten Fällen wird das BCMP, Fragment des BCMP, BCMP-verwandte Polypeptid, ein Fragment des BCMP-verwandten Polypeptids oder ein BCMP-Fusionsprotein oder der Wirkstoffkandidat markiert, beispielsweise mit einer radioaktiven Markierung (wie 32P, 35S und 125I) oder einer fluoreszierenden Markierung (wie Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthalaldehyd oder Fluorescamin), um die Detektion einer Interaktion zwischen einem BCMP und einem Wirkstoffkandidaten zu ermöglichen. Die Fähigkeit des Wirkstoffkandidaten, direkt oder indirekt mit einem BCMP, einem Fragment eines BCMP, einem BCMP-verwandten Polypeptid, einem Fragment eines BCMP-verwandten Polypeptids oder einem BCMP-Fusionsprotein zu interagieren, kann durch dem Fachmann bekannte Verfahren bestimmt werden. Beispielsweise kann die Interaktion zwischen einem Wirkstoffkandidaten und einem BCMP, einem BCMP-verwandten Polypeptid, einem Fragment eines BCMP-verwandten Polypeptids oder einem BCMP-Fusionsprotein mittels Durchflußzytometrie, eines Szintillationsassays, Immunopräzipitation oder Western-Blot-Analyse bestimmt werden. fq
  • In einer anderen Ausführungsform werden Agenzien, die mit einem BCMP, einem BCMP-Fragment (z. B. einem funktionell aktiven Fragment), einem BCMP-verwandten Polypeptid, einem Fragment eines BCMP-verwandten Polypeptids oder einem BCMP-Fusionsprotein interagieren (d. h. daran binden), in einem zellfreien Assaysystem identifiziert. Gemäß dieser Ausführungsform wird ein natives oder rekombinantes BCMP oder Fragment davon, oder ein natives oder rekombinantes BCMP-verwandtes Polypeptid oder Fragment davon oder ein BCMP-Fusionsprotein oder Fragment davon mit einem Wirkstoffkandidaten oder einer Kontrollverbindung kontaktiert, und die Fähigkeit des Wirkstoffkandidaten, mit dem BCMP oder BCMP-verwandten Polypeptid oder BCMP-Fusionsprotein zu interagieren, wird bestimmt. Wenn gewünscht, kann dieser Assay verwendet werden, um eine Vielzahl (z. B. eine Bibliothek) von Wirkstoffkandidaten zu screenen. Bevorzugt wird das BCMP, BCMP-Fragment, BCMP-verwandte Polypeptid, ein Fragment eines BCMP-verwandten Polypeptids oder ein BCMP-Fusionsprotein zunächst immobilisiert, durch beispielsweise Kontaktieren des BCMP, BCMP-Fragments, BCMP-verwandten Polypeptids, einem Fragment eines BCMP-verwandten Polypeptids oder einem BCMP-Fusionsprotein mit einem immobilisierten Antikörper, der es spezifisch erkennt und bindet, oder durch Kontaktieren eines gereinigten Präparats des BCMP, BCMP-Fragments, BCMP-verwandten Polypeptids, Fragments eines BCMP-verwandten Polypeptids oder eines BCMP-Fusionsproteins mit einer Oberfläche, die so gestaltet ist, daß sie das Protein bindet. Das BCMP, BCMP-Fragment, BCMP-verwandte Polypeptid, ein Fragment eines BCMP-verwandten Polypeptids oder ein BCMP-Fusionsprotein kann teilweise oder vollständig gereinigt sein (z. B. teilweise oder vollständig frei von anderen Polypeptiden) oder Teil eines Zellysats sein. Ferner kann das BCMP, BCMP-Fragment, BCMP-verwandte Polypeptid, Fragment eines BCMP-verwandten Polypeptids ein Fusionsprotein sein, umfassend das BCMP oder einen biologisch aktiven Teil davon, oder BCMP-verwandtes Polypeptid und eine Domäne, wie Glutathionin-S-transferase. Alternativ kann das BCMP, BCMP-Fragment, BCMP-verwandte Polypeptid, Fragment eines BCMP-verwandten Polypeptids oder BCMP-Fusionsproteins unter Verwendung von Techniken, die dem Fachmann allgemein bekannt sind, biotinyliert werden (z. B. Biotinylierungskit, Pierce Chemicals; Rockford, IL). Die Fähigkeit des Wirkstoffkandidaten, mit einem BCMP, BCMP-Fragment, BCMP-verwandten Polypeptid, einem Fragment eines BCMP-verwandten Polypeptids oder einem BCMP-Fusionsprotein zu interagieren, kann durch dem Fachmann bekannte Verfahren bestimmt werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird ein zellbasierendes Assaysystem verwendet, um Agenzien zu identifizieren, die an ein Protein, wie ein Enzym, oder einen biologisch aktiven Teils davon binden oder deren Aktivität verändern, welche für die Herstellung oder den Abbau eines BCMP verantwortlich sind oder welche für die posttranslationelle Modifikation eines BCMP verantwortlich sind. In einem primären Screen wird eine Vielzahl (z. B. eine Bibliothek) von Verbindungen mit Zellen kontaktiert, die natürlich oder rekombinant exprimieren: (i) ein BCMP, eine Isoform eines BCMP, ein BCMP-Homologon, ein BCMP-verwandtes Polypeptid, ein BCMP-Fusionsprotein oder ein biologisch aktives Fragment von irgendeinem der Vorhergehenden; und (ii) ein Protein, das für das Verarbeiten des BCMP, der BCMP-Isoform, BCMP-Homologons, BCMP-verwandten Polypeptids, BCMP-Fusionsproteins oder Fragments verantwortlich ist, um Verbindungen zu identifizieren, die die Herstellung, den Abbau oder posttranslationellen Modifikation des BCMP, der BCMP-Isoform, BCMP-Homologons, BCMP-verwandten Polypeptids, BCMP-Fusionsproteins oder Fragments modulieren. Wenn gewünscht, können Verbindungen, die in dem primären Screen identifiziert wurden, dann in einem sekundären Screen gegenüber Zellen analysiert werden, die die spezifischen BCMPs von Interesse natürlich oder rekombinant exprimieren. Die Fähigkeit des Wirkstoffkandidaten, die Herstellung, den Abbau oder die posttranslationelle Modifikation eines BCMP, Isoform, Homologons, BCMP-verwandten Polypeptids oder BCMP-Fusionsproteins zu modulieren, kann durch dem Fachmann bekannte Verfahren bestimmt werden, einschließlich, ohne Einschränkung, Durchflußzytometrie, eines Szintillationsassays, Immunopräzipitation und Western-Blot-Analyse.
  • In einer anderen Ausführungsform werden die Agenzien, die konkurrierend mit einem BCMP, BCMP-Fragment, BCMP-verwandten Polypeptid, einem Fragment eines BCMP-verwandten Polypeptids oder einem BCMP-Fusionsprotein interagieren (d. h. daran binden), in einem kompetitiven Bindungsassay identifiziert. Gemäß dieser Ausführungsform werden Zellen, die ein BCMP, BCMP-Fragment, BCMP-verwandtes Polypeptid, ein Fragment eines BCMP-verwandten Polypeptids oder ein BCMP-Fusionsprotein exprimieren, mit einem Wirkstoffkandidaten und einer Verbindung kontaktiert, die bekannt dafür ist, mit dem BCMP, BCMP-Fragment, BCMP-verwandten Polypeptid, einem Fragment eines BCMP-verwandten Polypeptids oder einem BCMP-Fusionsprotein zu interagieren; die Fähigkeit des Wirkstoffkandidaten, bevorzugt mit dem BCMP, BCMP-Fragment, BCMP-verwandten Polypeptid, Fragment eines BCMP-verwandten Polypeptids oder einem BCMP-Fusionsprotein zu interagieren, wird dann bestimmt. Alternativ werden die Agenzien, die bevorzugt mit einem BCMP, BCMP-Fragment, BCMP-verwandten Polypeptid oder Fragment eines BCMP-verwandten Polypeptids interagieren (d. h. daran binden), in einem zellfreien Assaysystem durch Kontaktieren eines BCMP, BCMP-Fragments, BCMP-verwandten Polypeptids, Fragments eines BCMP-verwandten Polypeptids oder eines BCMP-Fusionsproteins mit einem Wirkstoffkandidaten und einer Verbindung, die bekannt dafür ist, mit dem BCMP, BCMP-verwandten Polypeptid oder BCMP-Fusionsprotein zu interagieren, identifiziert. Wie oben angegeben, kann die Fähigkeit des Wirkstoffkandidaten, mit einem BCMP, BCMP-Fragment, BCMP-verwandten Polypeptid, einem Fragment eines BCMP-verwandten Polypeptids oder einem BCMP-Fusionsprotein zu interagieren, durch dem Fachmann bekannte Verfahren bestimmt werden. Diese Assays, ob zellbasierend oder zellfrei, können verwendet werden, um eine Vielzahl (z. B. eine Bibliothek) von Wirkstoffkandidaten zu screenen.
  • In einer anderen Ausführungsform werden die Agenzien, die die Expression oder Aktivität eines BCMP oder eines BCMP-verwandten Polypeptids modulieren (d. h. hochregulieren oder herunterregulieren), durch Kontaktieren von Zellen (z.B. Zellen von prokaryotischem Ursprung oder eukaryotischem Ursprung), die das BCMP oder BCMP-verwandte Polypeptid exprimieren, mit eines Wirkstoffkandidaten oder einer Kontrollverbindung (z.B. phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)) und Bestimmen der Expression des BCMP, BCMP- verwandten Polypeptids oder BCMP-Fusionsproteins, mRNA, die für das BCMP kodiert, oder mRNA, die für das BCMP-verwandte Polypeptid kodiert, identifiziert. Das Niveau an Expression eines gewählten BCMP, BCMP-verwandten Polypeptids, mRNA, die für das BCMP kodiert, oder mRNA, die für das BCMP-verwandte Polypeptid kodiert, in Gegenwart des Wirkstoffkandidaten wird mit dem Niveau an Expression des BCMP, BCMP-verwandten Polypeptids, mRNA, die für das BCMP kodiert, oder mRNA, die für das BCMP-verwandte Polypeptid kodiert, in Abwesenheit des Wirkstoffkandidaten (z. B. in Gegenwart einer Kontrollverbindung) verglichen. Der Wirkstoffkandidat kann dann als ein Modulator der Expression des BCMP oder des BCMP-verwandten Polypeptids basierend auf diesem Vergleich identifiziert werden. Beispielsweise wird, wenn die Expression des BCMP oder der mRNA signifikant größer in der Gegenwart des Wirkstoffkandidaten als bei seiner Abwesenheit ist, der Wirkstoffkandidat als ein Stimulator der Expression des BCMP oder der mRNA identifiziert. Alternativ wird, wenn die Expression des BCMP oder der mRNA signifikant kleiner in der Gegenwart des Wirkstoffkandidaten als bei seiner Abwesenheit ist, der Wirkstoffkandidat als ein Inhibitor der Expression des BCMP oder der mRNA identifiziert. Das Niveau an Expression eines BCMP oder der mRNA, die es kodiert, kann durch dem Fachmann bekannte Verfahren bestimmt werden. Beispielsweise kann die mRNA-Expression durch Northern-Blot-Analyse oder RT-PCR analysiert werden, und die Proteinniveaus können durch Western-Blot-Analyse analysiert werden.
  • In einer anderen Ausführungsform werden die Agenzien, die die Aktivität eines BCMP oder eines BCMP-verwandten Polypeptids modulieren, durch Kontaktieren eines Präparats, enthaltend das BCMP oder BCMP-verwandte Polypeptid oder Zellen (z. B. prokaryotische oder eukaryotische Zellen), die das BCMP oder BCMP-verwandte Polypeptid exprimieren, mit einer Testverbindung oder einer Kontrollverbindung und Bestimmen der Fähigkeit der Testverbindung, die Aktivität des BCMP oder BCMP-verwandten Polypeptids zu modulieren (z. B. zu stimulieren oder zu inhibieren), identifiziert. Die Aktivität eines BCMP oder eines BCMP-verwandten Polypeptids kann durch Detektieren der Induktion eines zellulären Signaltransduktionsweges des BCMP oder BCMP-verwandten Polypeptids (z. B. intrazelluläres Ca2+, Diacylglycerol, IP3 usw.), Detektieren katalytischer oder enzymatischer Aktivität des Targets auf einem geeigneten Substrat, Detektieren der Induktion eines Reportergens (z. B. ein regulatorisches Element, das auf ein BCMP oder ein BCMP-verwandtes Polypeptid reagiert, und funktionsfähig mit einer Nukleinsäure, die für einen detektierbaren Marker kodiert, z. B. Luciferase, verbunden ist) oder Detektieren einer zellulären Antwort, beispielsweise Zelldifferenzierung oder Zellpoliferation, analysiert werden. Basierend auf der vorliegenden Beschreibung können dem Fachmann bekannte Techniken zum Messen dieser Aktivitäten verwendet werden (siehe z. B. US-Patent Nr. 5,401,639, das hierin durch Verweis aufgenommen ist). Der Wirkstoffkandidat kann dann als ein Modulator der Aktivität eines BCMP oder eines BCMP-verwandten Polypeptids durch Vergleichen der Wirkungen des Wirkstoffkandidaten mit der Kontrollverbindung identifiziert werden. Geeignete Kontrollverbindungen umfassen phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und normale Kochsalzlösung (NS).
  • In einer anderen Ausführungsform werden die Agenzien, die die Expression, Aktivität oder sowohl die Expression als auch die Aktivität eines BCMP oder BCMP-verwandten Polypeptids modulieren (d. h. hochregulieren oder herunterregulieren), in einem Tiermodell identifiziert. Beispiele von geeigneten Tieren umfassen Mäuse, Ratten, Kaninchen, Affen, Meerschweinchen, Hunde und Katzen, sind aber nicht darauf beschränkt. Bevorzugt stellt das verwendete Tier ein Modell von Brustkrebs dar (z. B. Xenotransplantate von menschlichen Brustkrebszellinien, wie MDA-MB-345 in Östrogen-entzogenen Severe Combined Immunodeficient-Mäusen (SCID-Mäusen), Eccles et al. 1994 Cell Biophysics 24/25, 279). Diese können für Testverbindungen verwendet werden, die BCMP-Niveaus modulieren, da die Pathologie, die in diesen Modellen gezeigt wird, ähnlich der von Brustkrebs ist. Gemäß dieser Ausführungsform wird die Testverbindung oder eine Kontrollverbindung an ein geeignetes Tier verabreicht (z. B. oral, rektal oder parenteral, wie intraperitoneal oder intravenös), und die Wirkung auf die Expression, Aktivität oder sowohl die Expression als auch Aktivität des BCMP oder BCMP-verwandten Polypeptids wird bestimmt. Veränderungen in der Expression eines BCMP oder BCMP-verwandten Polypeptids können durch die oben dargestellten Verfahren analysiert werden.
  • In einer anderen Ausführungsform wird ein BCMP oder BCMP-verwandtes Polypeptid als ein „Köderprotein" in einem Zwei-Hybrid-Assay oder Drei-Hybrid-Assay verwendet, um andere Proteine zu identifizieren, die an ein BCMP oder BCMP-verwandtes Polypeptid binden oder damit interagieren (siehe z. B. US-Patent Nr. 5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72: 223–232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 12046–12054; Bartel et al. (1993) Bio/Techniges 14: 920–924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8: 1693–1696; und PCT-Veröffentlichung Nr. WO 94/10300). Der Fachmann wird einschätzen, daß solche Bindungs proteine wahrscheinlich auch an der Fortpflanzung von Signalen durch die BCMPs der Erfindung beteiligt sind, wie beispielsweise Aufwärts- oder Abwärtselemente eines Signalweges, an dem BCMPs beteiligt sind.
  • Die Agenzien, die durch die oben beschrieben Screening-Assays identifiziert wurden, können für die Behandlungen, wie hierin beschrieben, verwendet werden. Außerdem stellt die Erfindung ebenso die Verwendung eines Agens zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Brustkrebs bereit, das mit einem oder mehreren BCMPs der Erfindung interagiert oder deren Aktivität moduliert.
  • Therapeutische Verwendung von BCMPs
  • Die Erfindung ist für die Behandlung oder Vorbeugung von verschiedenen Krankheiten und Störungen durch Verabreichung einer therapeutischen Verbindung nützlich. Diese Verbindungen umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt: BCMPs, BCMP-Analoga, BCMP-verwandte Polypeptide und Derivate (einschließlich Fragmente) davon; Antikörper der vorhergehenden; Nukleinsäuren, die BCMPs, BCMP-Analoga, BCMP-verwandte Polypeptide und Fragmente davon kodierten; Antisense-Nukleinsäuren zu einem Gen, das ein BCMP oder BCMP-verwandtes Polypeptid kodiert; und Modulatoren (z. B. Agonisten und Antagonisten) eines Gens, das ein BCMP oder BCMP-verwandtes Polypeptid kodiert. Die vorliegende Erfindung basiert auf der Identifizierung von Genen, die BCMPs kodierten, die an Brustkrebs beteiligt sind. Brustkrebs kann behandelt werden (z. B. um Symptome zu lindern oder den Ausbruch oder das Fortschreiten zu verzögern), oder ihm kann vorgebeugt werden, indem eine therapeutische Verbindung verabreicht wird, die die Funktion oder Expression von ein oder mehreren BCMPs beschleunigt, die in dem Brustgewebe von Subjekten mit Brustkrebs verringert werden, oder durch indem eine therapeutische Verbindung verabreicht wird, die die Funktion oder Expression von ein oder mehreren BCMPs verringert, die in dem Brustgewebe von Subjekten mit Brustkrebs erhöht werden.
  • In einer Ausführungsform werden ein oder mehrere Antikörper, die jeweils spezifisch an ein BCMP binden, allein oder in Kombination mit einem oder mehreren zusätzlichen therapeutischen Verbindungen oder Behandlungen verabreicht. Beispiele solcher therapeutischen Verbindungen oder Behandlungen umfassen Taxol, Cyclophosphamid, Tamoxifen und Doxorubacin, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Bevorzugt ist ein biologisches Produkt, wie ein Antikörper, allogen zu dem Subjekt, an das es verabreicht werden soll. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein menschliches BCMP oder ein menschliches BCMP-verwandtes Polypeptid, eine Nukleotidsequenz, die für ein menschliches BCMP oder ein menschliches BCMP-verwandtes Polypeptid kodiert, oder ein Antikörper für ein menschliches BCMP oder ein menschliches BCMP-verwandtes Polypeptid an ein menschliches Subjekt zur Therapie (z. B. um die Symptome zu lindern oder den Ausbruch und das Fortschreiten zu verzögern) oder Prophylaxe verabreicht.
  • Behandlung und Vorbeugung von Brustkrebs
  • Brustkrebs wird durch Verabreichung an ein Subjekt, bei dem ein Verdacht von Brustkrebs vorliegt oder von dem bekannt ist, daß es Brustkrebs hat oder ein Risiko zur Entwicklung von Brustkrebs aufweist, einer Verbindung, die das Niveau oder die Aktivität (d. h. Funktion) von ein oder mehreren BCMPs moduliert (d. h. erhöht oder verringert), die unterschiedlich in dem Brustgewebe von Subjekten mit Brustkrebs im Vergleich zu Brustgewebe von Subjekten ohne Brustkrebs vorliegen, behandelt oder vorgebeugt. In einer Ausführungsform wird Brustkrebs durch Verabreichen an ein Subjekt, bei dem ein Verdacht von Brustkrebs vorliegt oder von dem bekannt ist, daß es Brustkrebs hat oder ein Risiko zur Entwicklung von Brustkrebs aufweist, einer Verbindung, die das Niveau oder die Aktivität (d. h. Funktion) von ein oder mehreren BCMPs hochreguliert (d. h. erhöht), die in dem Brustgewebe von Subjekten mit Brustkrebs verringert werden, behandelt oder vorgebeugt. In einer anderen Ausführungsform wird eine Verbindung verabreicht, die das Niveau oder die Aktivität (d. h. Funktion) von ein oder mehreren BCMPs herunterreguliert, die in dem Brustgewebe von Subjekten mit Brustkrebs erhöht werden. Beispiele einer solchen Verbindung umfassen: BCMPs, BCMP-Fragmente und BCMP-verwandte Polypeptide; Nukleinsäuren, die für ein BCMP, ein BCMP-Fragment und ein BCMP-verwandtes Polypeptid kodieren (z. B. zur Verwendung in der Gentherapie); und für die BCMPs oder BCMP-verwandten Polypeptide mit enzymatischer Aktivität, Verbindungen oder Moleküle, die bekanntermaßen die enzymatische Aktivität modulieren, sind aber nicht darauf beschränkt. Andere Verbindungen, die verwendet werden können z. B. BCMP-Agonisten, können unter Verwendung von In-vitro-Assays identifiziert werden.
  • Brustkrebs wird ebenso behandelt oder vorgebeugt durch die Verabreichung an ein Subjekt, bei dem ein Verdacht von Brustkrebs vorliegt oder von dem bekannt ist, daß es Brustkrebs hat oder ein Risiko zur Entwicklung von Brustkrebs aufweist, einer Verbindung, die das Niveau oder die Aktivität von ein oder mehreren BCMPs herunterreguliert, die in dem Brustgewebe von Subjekten mit Brustkrebs erhöht werden. In einer anderen Ausführungsform wird eine Verbindung verabreicht, die das Niveau oder die Aktivität von ein oder mehreren BCMPs hochreguliert, die in dem Brustgewebe von Subjekten mit Brustkrebs verringert werden. Beispiele für eine solche Verbindung umfassen BCMP-Antisense-Oligonukleotide, Ribozyme, Antikörper, die gegen BCMPs gerichtet sind, und Verbindungen, die die enzymatische Aktivität eines BCMP inhibieren, sind aber nicht darauf beschränkt. Andere nützliche Verbindungen, z. B. BCMP-Antagonisten und BCMP-Antagonisten mit kleinem Molekül, können unter Verwendung von In-vitro-Assays identifiziert werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Therapie oder Prophylaxe auf die Bedürfnisse eines einzelnen Patienten zugeschnitten. Daher werden in speziellen Ausführungsformen Verbindungen, die das Niveau oder die Funktion von ein oder mehreren BCMPs fördern, an ein Subjekt therapeutisch oder prophylaktisch verabreicht, bei dem ein Verdacht von Brustkrebs vorliegt oder von dem bekannt ist, daß es Brustkrebs hat, und bei dem keine Niveaus oder Funktionen von ein oder mehreren BCMPs vorliegen oder diese in bezug auf eine Kontrolle oder einen normalen Referenzbereich verringert sind. In anderen Ausführungsformen werden Verbindungen, die das Niveau oder die Funktion von ein oder mehreren BCMPs fördern, an ein Subjekt therapeutisch oder prophylaktisch verabreicht, bei dem ein Verdacht von Brustkrebs vorliegt oder von dem bekannt ist, daß es Brustkrebs hat, und bei dem die Niveaus oder Funktionen von ein oder mehreren BCMPs in bezug auf eine Kontrolle oder einen Referenzbereich erhöht sind. In anderen Ausführungsformen werden Verbindungen, die das Niveau oder die Funktion von ein oder mehreren BCMPs verringern, an ein Subjekt therapeutisch oder prophylaktisch verabreicht, bei dem ein Verdacht von Brustkrebs vorliegt oder von dem bekannt ist, daß es Brustkrebs hat, und bei dem die Niveaus oder Funktionen von ein oder mehreren BCMPs in bezug auf eine Kontrolle oder einen Referenzbereich erhöht sind. In anderen Ausführungsformen werden Verbindungen, die das Niveau oder die Funktion von ein oder mehreren BCMPs verringern, an ein Subjekt therapeutisch oder prophylaktisch verabreicht, bei dem ein Verdacht von Brustkrebs vorliegt oder von dem bekannt ist, daß es Brustkrebs hat, und bei dem die Niveaus oder Funktionen von ein oder mehreren BCMPs in bezug auf eine Kontrolle oder einen Referenzbereich verringert sind. Die Veränderung der BCMP-Funktion oder des Niveaus aufgrund der Verabreichung solcher Verbindungen kann ohne weiteres detektiert werden, z. B. durch Erhalt einer Probe (z. B. einer Probe von Brustgewebe, Blut oder Urin oder einer Gewebeprobe wie Biopsiegewebe) und Analysieren in vitro der Niveaus oder Aktivitäten der BCMPs, oder der Niveaus von mRNA, die für die BCMPs kodieren, oder jede Kombination des Vorhergehenden. Diese Assays können vor und nach der Verabreichung der Verbindung, wie hierin beschrieben, durchgeführt werden.
  • Die Verbindungen umfassen jede Verbindung, z. B. ein kleines organisches Molekül, Protein, Peptid, Antikörper, Nukleinsäure usw., die das BCMP-Profil zum normalen hin wiederherstellt, mit der Maßgabe, daß diese Verbindungen oder Behandlungen kein Taxol, Cyclophosphamid, Tamoxifen und Doxorubacin umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Verbindungen der Erfindung können in Kombination mit jeder anderen Verbindung, einschließlich Taxol, Cyclophosphamid, Tamoxifen und Doxorubacin, gegeben werden.
  • Vakzintherapie
  • BCMPs können als Antigenmaterial nützlich sein, und können bei der Herstellung von Impfstoffen zur Behandlung oder Prophylaxe von Brustkrebs verwendet werden. Dieses Material kann „antigen" und/oder „immunogen" sein. Im allgemeinen wird „antigen" in der Bedeutung verwendet, daß das Protein verwendet werden kann, um Antikörper hervorzurufen, oder es tatsächlich eine Antikörperreaktion in einem Subjekt induzieren kann. „Immunogen" wird in der Bedeutung verwendet, daß das Protein eine Schutzimmunreaktion in einem Subjekt hervorrufen kann. Daher kann in dem letzteren Fall das Protein befähigt sein, nicht nur eine Antikörperreaktion, sondern zusätzlich nicht-Antikörper-basierende Immunreaktionen zu erzeugen.
  • Der Fachmann wird erkennen, daß Homologe oder Derivate der BCMPs ebenso Verwendung als antigenes/immunogenes Material finden werden. Daher sind beispielsweise Proteine, die ein oder mehrere Additionen, Deletionen, Substitutionen oder dergleichen umfassen, in der vorliegenden Erfindung nützlich. Außerdem kann es möglich sein, eine Aminosäure mit einer anderen ähnlichen „Typs" zu ersetzen. Beispielsweise das Ersetzen einer hydrophoben Aminosäure mit einer anderen. Man kann ein Programm verwenden, wie das CLUSTAL Programm, um Aminosäuresequenzen zu vergleichen. Dieses Programm vergleicht Aminosäuresequenzen und findet die optimale Anordnung durch Einfügen von Abständen in jeder Sequenz, wenn geeignet. Es ist möglich, die Aminosäureidentität oder -ähnlichkeit (Identität plus Konservierung des Aminosäuretyps) für eine optimale Anordnung zu berechnen. Ein Programm wie BLASTx wird das längste Stück von ähnlichen Sequenzen zugeordnet und der Übereinstimmung einen Wert zugeteilt. Es ist daher möglich, einen Vergleich zu erhalten, wo mehrere Regionen mit Ähnlichkeit gefunden werden, wobei jede einen unterschiedlichen Kern aufweist. Beide Typen der Analyse werden in Betracht gezogen.
  • Bei den Homologa und Derivaten ist der Identitätsgrad mit einem Protein, wie hierin beschrieben, weniger wichtig als daß, das Homologon oder Derivat seine Antigenität und/oder Immunogenität beibehält. Jedoch werden geeigneterweise Homologa oder Derivate mit mindestens 60 % Ähnlichkeit (wie oben erläutert) mit den hierin beschriebenen Proteinen oder Polypeptiden bereitgestellt. Bevorzugt werden Homologa oder Derivate mit mindestens 70 % Ähnlichkeit, stärker bevorzugt mindestens 80 % Ähnlichkeit bereitgestellt. Am stärksten bevorzugt werden Homologa oder Derivate mit mindestens 90 % oder sogar 95 % Ähnlichkeit bereitgestellt.
  • In einem alternativen Ansatz könnten die Homologa oder Derivate Fusionsproteine sein, die Komponenten einführen, die die Reinigung leichter machen, beispielsweise durch effektives Tagging des gewünschten Proteins oder Polypeptids. Es kann notwendig sein, den „Tag" zu entfernen, oder es kann der Fall sein, daß das Fusionsprotein selbst ausreichend Antigenität behält, um nützlich zu sein.
  • Es ist allgemein bekannt, daß es möglich ist, ein antigenes Protein oder Polypeptid zu screenen, um epitope Regionen zu identifizieren, d. h. die Regionen, die für die Antigenität oder Immunogenität des Proteins oder Polypeptids verantwortlich sind. Verfahren, die dem Fachmann allgemein bekannt sind, können verwendet werden, um Fragmente und/oder Homologa und/oder Derivate hinsichtlich der Antigenität zu testen. Daher sollten die Fragmente ein oder mehrere dieser epitopen Regionen umfassen oder zu den Regionen ausreichend ähnlich sein, um ihre antigenen/immunogenen Eigenschaften zu erhalten. Daher ist für Fragmente, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, der Identitätsgrad vielleicht irrelevant, da sie mit einem speziellen Teil eines Proteins oder Polypeptids, Homologons oder Derivats 100%ig identisch sein können, wie hierin beschrieben. Noch einmal: das Schlüsselmerkmal ist, daß das Fragment die antigenen/immunogenen Eigenschaften des Proteins, von dem es abgeleitet ist, beibehält.
  • Was für die Homologa, Derivate und Fragmente wichtig ist, ist, daß sie mindestens einen Grad an Antigenität/Immunogenität des Protein oder Polypeptids, von dem sie abgeleitet werden, besitzen. Daher wird in einem zusätzlichen Aspekt der Erfindung die Verwendung von antigenen/ oder immunogenen Fragmenten eines BCMP oder von Homologa oder Derivaten davon bereitgestellt.
  • Die BCMPs oder antigenen Fragmente davon können allein als ein gereinigtes oder isoliertes Präparat bereitgestellt werden. Sie können als Teil eines Gemisches mit ein oder mehreren anderen Proteinen oder antigenen Fragmenten davon bereitgestellt werden. In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung daher die Verwendung einer Antigenzusammensetzung bereit, umfassend ein oder mehrere BCMPs und/oder ein oder mehrere antigene Fragmente davon. Eine solche Zusammensetzung kann für die Detektion und/oder Diagnose von Brustkrebs verwendet werden.
  • In einem sechsten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Detektieren und/oder Diagnostizieren von Brustkrebs bereit, umfassend:
    das Inkontaktbringen einer Probe, die getestet werden soll, mit einem antigenen BCMP, oder einem antigenen Fragment davon oder einer Antigenzusammensetzung; und
    Detektieren der Gegenwart von Antikörpern für Brustkrebs.
  • Insbesondere kann das Potein, antigene Fragment davon oder Antigenzusammensetzung verwendet werden, um IgA-, IgM- oder IgG-Antikörper zu detektieren. Geeigneterweise wird die Probe, die getestet werden soll, eine biologische Probe sein, beispielsweise eine Probe aus Blut oder Speichel.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines antigenen BCMP, antigenen Fragments davon oder einer antigenen Zusammensetzung beim Detektieren und/oder Diagnostizieren von Brustkrebs bereit. Bevorzugt wird das Detektieren und/oder Diagnostizieren in vitro durchgeführt.
  • Die antigenen BCMPs, antigenen Fragmente davon oder antigenen Zusammensetzung, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können als ein Kit zur Verwendung in der in-vitro- Detektion und/oder Diagnose von Brustkrebs bereitgestellt werden. Daher stellt in noch einem weiteren Aspekt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Kits zur Verwendung bei der Detektion und/oder Diagnose von Brustkrebs bereit, wobei das Kit ein antigenes BCMP, ein antigenes Fragment davon oder eine antigene Zusammensetzung umfaßt.
  • Außerdem kann das antigene BCMP, antigene Fragment davon oder die Antigenzusammensetzung verwendet werden, um eine Immunantwort gegen Brustkrebs zu induzieren. Daher stellt in noch einem weiteren Aspekt die Erfindung die Verwendung eines antigenen BCMP, eines antigenen Fragments davon oder einer Antigenzusammensetzung in der Medizin bereit.
  • In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Zusammensetzung bereit, die eine Immunantwort in einem Subjekt hervorrufen kann, wobei die Zusammensetzung ein BCMP, ein antigenes Fragment davon oder eine Antigenzusammensetzung der Erfindung umfaßt. Geeigneterweise wird die Zusammensetzung eine Impfstoffzusammensetzung sein, gegebenenfalls umfassend ein oder mehrere geeignete Hilfsmittel. Eine solche Impfstoffzusammensetzung kann entweder eine prophylaktische oder therapeutische Impfstoffzusammensetzung sein.
  • Die Impfstoffzusammensetzungen, die in der Erfindung nützlich sind, können ein oder mehrere Hilfsmittel umfassen. Beispiele, die in der Technik allgemein bekannt sind, umfassen anorganische Gele, wie Aluminiumhydroxid und Wasser-in-Öl-Emulsionen, wie nicht-komplettes Freundsches Adjuvans. Andere nützliche Hilfsmittel werden dem Fachmann bekannt sein.
  • In noch anderen Aspekten stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines BCMP, eines antigenen Fragments davon oder einer Antigenzusammensetzung bei der Herstellung einer immunogenen Zusammensetzung, bevorzugt eines Impfstoffes, bereit. Eine solche immunogene Zusammensetzung ist zum Induzieren einer Immunantwort bei einem Subjekt nützlich; und kann bei einem Verfahren zur Behandlung oder Prophylaxe von Brustkrebs bei einem Subjekt, oder Impfen eines Subjekts gegen Brustkrebs verwendet werden, umfassend den Schritt des Verabreichens an das Subjekt einer wirksamen Menge eines BCMP, mindestens eines antigenen Fragments davon oder einer Antigenzusammensetzung, bevorzugt als ein Impfstoff.
  • In einer speziellen Ausführungsform wird ein Präparat aus BCMPs oder BCMP-Peptidfragmenten, die oben definiert sind, als ein Impfstoff zur Behandlung von Brustkrebs verwendet. Diese Präparate können Hilfsmittel oder andere Vehikel umfassen.
  • In einer anderen Ausführungsform wird ein Präparat aus Oligonukleotiden, umfassend 10 oder mehr aufeinanderfolgende Nukleotide, komplementär zu einer Nukleotidsequenz, die für ein oder mehrere BCMPs oder BCMP-Peptidfragmente, die oben definiert sind, kodiert, zur Verwendung als Impfstoffe zur Behandlung von Brustkrebs bereitgestellt. Diese Präparate können Hilfsmittel oder andere Vehikel umfassen.
  • Gentherapie
  • In einer speziellen Ausführungsform werden Nukleinsäuren, umfassend eine Sequenz, die für ein BCMP, ein BCMP-Fragment, BCMP-verwandtes Polypeptid oder Fragment eines BCMP-verwandten Polypeptids kodiert, durch Gentherapie verabreicht, um die BCMP-Funktion zu fördern. Gentherapie bezieht sich auf die Verabreichung einer exprimierten oder exprimierbaren Nukleinsäure an ein Subjekt. In dieser Ausführungsform erzeugt die Nukleinsäure ihr kodiertes Polypeptid, das eine therapeutische Wirkung durch Fördern der BCMP-Funktion vermittelt.
  • Jedes der Verfahren zur Gentherapie, das in der Technik verfügbar ist, kann gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Exemplarische Verfahren werden nachstehend beschrieben.
  • Für allgemeine Überblicke der Verfahren der Gentherapie, siehe Goldspiel et al., 1993, Clinic Pharmacy 12: 488–505; Wu and Wu, 1991, Biotherapie 3: 87–95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573–596; Mulligan, 1993, Science 260: 926–932; und Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191–217; May, 1993, TIBTECH 11 (5):155–215. Verfahren, die in der Technik der rekombinanten DNA-Technik allgemein bekannt sind, die verwendet werden können, sind in Ausubel et al. (Hrsg.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; und Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY beschrieben.
  • In einem bevorzugten Aspekt umfaßt die Verbindung eine Nukleinsäure, die für ein BCMP oder Fragment oder chimäres Protein davon kodiert, wobei die Nukleinsäure ein Teil eines Expressionsvektors ist, der ein BCMP oder Fragment oder chimäres Protein davon in einem geeigneten Wirt exprimiert. Insbesondere weist eine solche Nukleinsäure einen Promotor auf, der funktionsfähig an die BCMP-kodierende Region gebunden ist, wobei der Promotor induzierbar oder konstitutiv ist (und gegebenenfalls Gewebe-spezifisch). In einer anderen speziellen Ausführungsform wird ein Nukleinsäuremolekül verwendet, bei dem die BCMP-kodierenden Sequenzen und jegliche andere gewünschten Sequenzen durch Regionen flankiert werden, die die homologe Rekombination an einer gewünschten Stelle in dem Genom beschleunigen, wodurch die intrachromosomale Expression der BCMP-Nukleinsäure bereitgestellt wird (Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932–8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342: 435–438).
  • Die Abgabe der Nukleinsäure an ein Subjekt kann direkt erfolgen, wobei in dem Fall das Subjekt direkt der Nukleinsäure oder dem die Nukleinsäure tragenden Vektor ausgesetzt ist; dieser Ansatz ist als In-vivo-Gentherapie bekannt. Alternativ kann die Abgabe der Nukleinsäure an das Subjekt indirekt erfolgen, wobei in diesem Fall die Zellen zuerst mit der Nukleinsäure in vitro transformiert werden und dann in das Subjekt transplantiert werden; dieser Ansatz ist als Ex-vivo-Gentherapie bekannt.
  • In einer speziellen Ausführungsform wird die Nukleinsäure direkt in vivo verabreicht, wo sie exprimiert wird, um das kodierte Produkt herzustellen. Dies kann durch jedes der zahlreichen Verfahren, die in der Technik bekannt sind, erreicht werden, z. B. durch deren Konstruieren als Teil eines geeigneten Nukleinsäureexpressionsvektors und deren Verabreichen, so daß es intrazellulär wird, z. B. durch Infektion unter Verwendung eines fehlerhaften oder abgeschwächten retroviralen oder anderen Virusvektors (siehe US-Patent Nr. 4,980,286); durch direkte Injektion von nackter DNA; durch die Verwendung von Mikroteilchenbeschuß (z. B. eine Genkanone; Biolistic, Dupont); durch Beschichten mit Lipiden, Zelloberflächenrezeptoren oder Transfektiermitteln; durch Einkapseln in Liposomen, Mikroteilchen oder Mikokapseln; durch Verabreichen in Verbindung mit einem Peptid, das bekanntermaßen in den Kern eindringt; oder durch Verabreichen in Verbindung mit einem Liganden, der der Rezeptor-vermittelten Endozytose unterliegt (siehe z. B. Wu und Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429–4432) und verwendet werden kann, um Zelltypen, die die Rezeptoren spezifisch ex primieren, zu targetieren. In einer anderen Ausführungsform kann ein Nukleinsäure-Ligand-Komplex gebildet werden, bei dem der Ligand ein fusogenes Viruspeptid umfaßt, um Endosomen aufzuspalten, wodurch die Nukleinsäure den Lysosomenabbau vermeiden kann. In noch einer anderen Ausführungsform kam die Nukleinsäure in vivo für die zellspezifische Aufnahme und Expression durch Targetieren eines spezifischen Rezeptors targetiert werden (siehe z. B. PCT-Veröffentlichungen WO 92/06180, datiert 16. April 1992 (Wu et al.); WO 92/22635, datiert 23. Dezember 1992 (Wilson et al.); WO 92/20316, datiert 26. November 1992 (Findeis et al.); WO 93/14188, datiert 22. Juli 1993 (Clarke et al.), WO 93/20221, datiert 14. Oktober 1993 (Young)). Alternativ kann die Nukleinsäure intrazellulär eingeführt und innerhalb der Wirtszellen-DNA zur Expression durch homologe Rekombination eingebaut werden (Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932–8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342: 435–438).
  • In einer speziellen Ausführungsform wird ein Virusvektor, der eine Nukleinsäure, die für ein BCMP kodiert, enthält, verwendet. Beispielsweise kann ein retroviraler Vektor verwendet werden (siehe Miller et al., 1993, Meth. Enzymol. 217: 581–599). Die retroviralen Vektoren sind modifiziert worden, um retrovirale Sequenzen zu löschen, die zum Verpacken des viralen Genoms und die Integration in Wirtszellen-DNA nicht notwendig sind. Die Nukleinsäure, die für das BCMP kodiert, die in der Gentherapie verwendet werden soll, wird in den Vektor geklont, was die Abgabe des Gens an ein Subjekt erleichtert. Mehr Einzelheiten über retrovirale Vektoren können in Boesen et al., 1994, Biotherapy 6: 291–302 gefunden werden, die die Verwendung eines retroviralen Vektors zur Abgabe des mdr1-Gens an hämatopoetische Stammzellen beschreiben, um die Stammzellen für die Chemotherapie resistenter zu machen. Andere Referenzen, die die Verwendung von retroviralen Vektoren in der Gentherapie darstellen, sind: Clowes et al., 1994, J. Clin. Invest. 93: 644–651; Kiem et al., 1994, Blood 83: 1467–1473; Salmons and Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4: 129–141; und Grossman and Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3: 110–114.
  • Adenoviren sind andere Virusvektoren, die in der Gentherapie verwendet werden können. Adenoviren sind besonders attraktive Vehikel für die Abgabe von Genen an Respirationsepithelien. Adenoviren infizieren Respirationsepithelien natürlich, wobei sie eine leichte Erkrankung verursachen. Andere Targets für Adenovirus-basierende Abgabesysteme sind Leber, das Zentralnervensystem, Endothelzellen und Muskel. Adenoviren haben den Vorteil, daß sie sich nicht teilende Zellen infizieren können. Kozarsky and Wilson, 1993, Current Opinion in Genetics and Development 3: 499–503 stellen einen Überblick über die Adenovirus-basierende Gentherapie bereit. Bout et al., 1994, Human Gene Therapy 5: 3–10 zeigt die Verwendung von Adenovirusvektoren, um Gene zu den Respirationsepithelien von Rhesusaffen zu übertragen. Andere Beispiele der Verwendung von Adenoviren in der Gentherapie können in Rosenfeld et al., 1991, Science 252: 431–434; Rosenfeld et al., 1992, Cell 68: 143– 155; Mastrangeli et al., 1993, J. Clin. Invest. 91: 225–234; PCT-Veröffentlichung WO 94/12649; und Wang, et al., 1995, Gene Therapy 2: 775–783 gefunden werden.
  • Es ist ebenso die Verwendung von Adeno-assoziierten Virus (AAV) in der Gentherapie vorgeschlagen worden (Walsh et al., 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204: 289–300; US-Patent Nr. 5,436,146).
  • Ein anderer Ansatz für die Gentherapie umfaßt das Übertragen eines Gens auf Zellen in Gewebekultur durch die Verfahren wie Elektroporation, Lipofektion, Calciumphosphatvermittelte Transfektion oder virale Infektion. Normalerweise umfaßt das Verfahren der Übertragung die Übertragung eines selektierbaren Markers auf die Zellen. Die Zellen werden dann unter Selektion gestellt, um die Zellen zu isolieren, die das übertragene Gen aufgenommen haben und exprimieren. Diese Zellen werden dann an das Subjekt abgegeben.
  • In dieser Ausführungsform wird die Nukleinsäure in eine Zelle vor der Verabreichung in vivo der resultierenden rekombinanten Zelle eingeführt. Eine solche Einführung kann durch jedes in der Technik bekannte Verfahren durchgeführt werden, einschließlich Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion, Infektion mit einem Virus- oder Bakteriophagenvektor, enthaltend die Nukleinsäuresequenzen, Zellfusion, Chromosom-vermittelten Gentransfer, Mikrozellen-vermittelten Gentransfer, Sphäroplastfusion usw., sind aber nicht darauf beschränkt. Zahlreiche Verfahren sind in der Technik für die Einführung von fremden Genen in Zellen bekannt (siehe z. B. Loeffler and Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217: 599–618; Cohen et al., 1993, Meth. Enzymol, 217: 618–644; Cline, 1985, Pharmac. Ther. 29: 69–92) und können gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, vorausgesetzt, daß die notwendigen Entwicklungs- und physiologischen Funktionen der Empfängerzellen nicht gestört werden. Die Technik sollte den stabilen Transfer der Nukleinsäure zu der Zelle bereitstellen, so daß die Nukleinsäure durch die Zelle exprimierbar und bevorzugt vererbbar ist und durch seine Zellennachkommenschaft exprimierbar ist.
  • Die resultierenden rekombinanten Zellen können an ein Subjekt durch verschiedene in der Technik bekannte Verfahren abgegeben werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Epithelzellen injiziert, z. B. subkutan. In einer anderen Ausführungsform können rekombinante Hautzellen als ein Hauttransplantat auf das Subjekt aufgetragen werden. Rekombinante Blutzellen (z. B. hämatopoetische Stamm- oder Vorläuferzellen) werden bevorzugt intravenös verabreicht. Die Menge an Zellen, die zur Verwendung vorgesehen sind, hängt von der gewünschten Wirkung, dem Zustand des Subjekts usw. ab, und kann durch den Fachmann bestimmt werden.
  • Zellen, in die eine Nukleinsäure für die Zwecke der Gentherapie eingeführt werden kann, umfassen jeden gewünschten, verfügbaren Zelltyp, und umfassen neuronale Zellen, Glialzellen (z. B. Oligodendrozyten oder Astrozyten), Epithelzellen, Endothelzellen, Keratinozyten, Fibroblasten, Muskelzellen, Hepatozyten; Blutzellen wie T-Lymphozyten, B-Lymphozyten, Monozyten, Makrophagen, Neutrophile, Eosinophile, Megakaryozyten, Granulozyten; verschiedene Stamm- oder Vorläuferzellen, insbesondere hämatopoetische Stamm- oder Vorläuferzellen, z. B. wie aus Knochenmark, Nabelschnurblut, peripherem Blut oder Fötusleber erhalten, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zelle, die zur Gentherapie verwendet wird, autolog zu dem Subjekt, das behandelt wird.
  • In einer Ausführungsform, in der rekombinante Zellen in der Gentherapie verwendet werden, wird eine Nukleinsäure, die für ein BCMP kodiert, in die Zellen eingeführt, so daß sie durch die Zellen oder ihre Nachkommen exprimierbar ist, und die rekombinanten Zellen werden darin in vivo für die therapeutische Wirkung verabreicht. In einer speziellen Ausführungsform werden Stamm- oder Vorläuferzellen verwendet. Jegliche Stamm- oder Vorläuferzellen, die in vitro isoliert und gehalten werden können, können gemäß dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet werden (siehe z. B. PCT-Veröffentlichung WO 94/08598, datiert 28. April 1994; Stemple and Anderson, 1992, Cell 71: 973–985; Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A: 229; und Pittelkow and Scott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61: 771).
  • In einer speziellen Ausführungsform umfaßt die Nukleinsäure, die für den Zweck der Gentherapie eingeführt werden soll, einen induzierbaren Promotor, der funktionsfähig mit der kodierenden Region verbunden ist, so daß die Expression der Nukleinsäure durch Kontrollieren der Gegenwart oder Abwesenheit des geeigneten Transkriptions-Inducers kontrollierbar ist.
  • Die direkte Injektion einer DNA, die für ein BCMP kodiert, kann ebenso gemäß beispielsweise der Techniken durchgeführt werden, die in US-Patent Nr. 5,589,466 beschrieben sind. Diese Techniken umfassen die Injektion der „nackten DNA", d. h. isolierten DNA-Molekülen in Abwesenheit von Liposomen, Zellen oder anderem Material, abgesehen von einem geeigneten Träger. Die Injektion von DNA, die für ein Protein kodiert und funktionsfähig mit einem geeigneten Promotor verbunden ist, führt zur Erzeugung des Proteins in Zellen nahe der Injektionsstelle und der Hervorrufung einer Immunantwort in dem Subjekt auf das Protein, das durch die injizierte DNA kodiert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird nackte DNA, umfassend (a) DNA, die für ein BCMP kodiert, und (b) einen Promotor, in ein Subjekt injiziert, um eine Immunantwort auf das BCMP hervorzurufen.
  • Inhibierung von BCMPs, um Brustkrebs zu behandeln
  • In einer Ausführungsform der Erfindung wird Brustkrebs durch Verabreichung einer Verbindung behandelt oder vorgebeugt, die dem/den Niveaus) und/oder der/den Funktion(en) von ein oder mehreren BCMPs, die in dem Brustgewebe von Subjekten mit Brustkrebs im Vergleich zu Brustgewebe von Subjekten ohne Brustkrebs erhöht sind, entgegenwirkt (inhibiert).
  • Verbindungen, die für diesen Zweck nützlich sind, umfassen Anti-BCMP-Antikörper (und Fragmente und Derivate, enthaltend die Bindungsregion davon), BCMP-Antisense- oder Ribozymnukleinsäuren und Nukleinsäuren, die für dysfunktionelle BCMPs kodieren, die verwendet werden, um endogene BCMP-Funktion durch homologe Rekombination „auszuschalten", sind aber nicht darauf beschränkt (siehe z. B. Capecchi, 1989, Science 244: 1288–1292). Andere Verbindungen, die die BCMP-Funktion inhibieren, können durch die Verwendung von bekannten In-vitro-Assays identifiziert werden, z. B. Assays für die Fähigkeit einer Testverbindung, das Binden eines BCMP an ein anderes Protein oder einen Bindungspartner zu inhibieren, oder eine bekannte BCMP-Funktion zu inhibieren. Bevorzugt wird eine solche Inhibierung in vitro oder in Zellkultur analysiert, aber genetische Assays können ebenso ein gesetzt werden. Die Bevorzugte Technologie kann ebenso verwendet werden, um Niveaus der BCMPs vor und nach der Verabreichung der Verbindung zu detektieren. Bevorzugt werden geeignete In-vitro- oder In-vivo-Assays verwendet, um die Wirkung einer speziellen Verbindung zu bestimmen, und ob ihre Verabreichung zur Behandlung des betroffenen Gewebes angezeigt ist, wie nachstehend ausführlicher beschrieben.
  • In einer speziellen Ausführungsform wird eine Verbindung, die eine BCMP-Funktion inhibiert, therapeutisch oder prophylaktisch an ein Subjekt verabreicht, bei dem ein erhöhtes Brustgewebeniveau oder eine erhöhte Funktionsaktivität des BCMP (z. B. höher als das normale Niveau oder das gewünschte Niveau) im Vergleich zu Brustgewebe von Subjekten ohne Brustkrebs oder einem vorbestimmten Referenzbereich detektiert wird. Verfahren, die in der Technik Standard sind, können eingesetzt werden, um die Erhöhung eines BCMP-Niveaus oder einer BCMP-Funktion zu messen, wie oben dargestellt. Bevorzugte BCMP-Inhibitorzusammensetzungen umfassen kleine Moleküle, z. B. Moleküle mit 1000 Dalton oder weniger. Diese kleinen Moleküle können durch hierin beschriebene Screeningverfahren identifiziert werden.
  • Antisense-Regulierung von BCMPs
  • In einer speziellen Ausführungsform wird die BCMP-Expression durch die Verwendung von BCMP-Antisense-Nukleinsäuren inhibiert. Die vorliegende Erfindung stellt die therapeutische oder prophylaktische Verwendung von Nukleinsäuren bereit, umfassend mindestens sechs Nukleotide, die antisense zu einem Gen oder cDNA, die für ein BCMP oder einen Teil davon kodieren, sind. Wie hierin verwendet, bezieht sich eine BCMP „Antisense"-Nukleinsäure auf eine Nukleinsäure, die aufgrund gewisser Sequenzkomplementarität zu einem Teil einer RNA (bevorzugt mRNA), die für ein BCMP kodiert, hybridisieren kann. Die Antisense-Nukleinsäure kann komplementär zu einer kodierenden und/oder nicht-kodierenden Region einer mRNA, die für ein BCMP kodiert, sein. Diese Antisense-Nukleinsäuren können als Verbindungen, die die BCMP-Expression inhibieren, genutzt und bei der Behandlung oder Vorbeugung von Brustkrebs verwendet werden.
  • Die Antisense-Nukleinsäuren sind doppelsträngige oder einzelsträngige Oligonukleotide, RNA oder DNA oder eine Modifikation oder ein Derivat davon, und können direkt an eine Zelle verabreicht werden oder intrazellulär durch Transkription von exogenen, eingeführten Sequenzen hergestellt werden.
  • Die Erfindung kann pharmazeutische Zusammensetzungen verwenden, die eine wirksame Menge an BCMP-Antisense-Nukleinsäuren in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen, wie unten beschrieben.
  • In einer anderen Ausführungsform ist die Erfindung bei Verfahren zum Inhibieren der Expression einer BCMP-Nukleinsäuresequenz in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle nützlich, umfassend das Bereitstellen der Zelle mit einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung, die eine BCMP-Antisense-Nukleinsäure der Erfindung umfaßt.
  • BCMP-Antisense-Nukleinsäuren und ihre Verwendungen werden nachstehend ausführlich beschrieben.
  • BCMP-Antisense-Nukleinsäuren
  • Die BCMP-Antisense-Nukleinsäuren haben mindestens sechs Nukleotide und sind bevorzugt Oligonukleotide, die zwischen 6 und etwa 50 Oligonukleotiden liegen. In speziellen Aspekten weist das Oligonukleotid mindestens 10 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide oder mindestens 200 Nukleotide auf. Die Oligonukleotide können DNA oder RNA oder chimäre Gemische oder Derivate oder modifizierte Versionen davon sein, und können einsträngig oder doppelsträngig sein. Das Oligonukleotid kann an der Basenkomponente, Zuckerkomponente oder Phosphathauptkette modifiziert werden. Das Oligonukleotid kann andere anhängende Gruppen wie Peptide; Mittel, die den Transport über die Zellmembran (siehe z. B. Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6553–6556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 648–652; PCT-Veröffentlichung Nr. WO 88/09810, veröffentlicht am 15. Dezember 1988), oder die Blut-Hirn-Schranke erleichtern (siehe z. B. PCT-Veröffentlichung Nr. WO 89/10134, veröffentlicht am 25. April 1988); Hybridisierungs-getriggerte Spaltungsmittel (siehe z. B. Krol et al., 1988, Biotechniques 6: 958–976) oder interkalierende Agenzien (siehe z. B. Zon, 1988, Pharm. Res. 5: 539–549) umfassen.
  • In einem bevorzugten Aspekt wird ein BCMP-Antisense-Oligonukleotid bereitgestellt, bevorzugt einsträngige DNA. Das Oligonukleotid kann an jeder Position seiner Struktur mit in der Technik allgemein bekannten Substituenten modifiziert werden.
  • Das BCMP-Antisense-Oligonukleotid kann mindestens eines der folgenden modifizierten Basenkomponenten umfassen: 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, Hypoxanthin, Xantin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, beta-D-Galactosylqueosin, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, beta-D-Mannosylqueosin, 5-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-Thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure (v), 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil, (acp3)w, 2,6--Diaminopurin und andere Basenanaloga.
  • In einer anderen Ausführungsform umfaßt das Oligonukleotid mindestens eine modifizierte Zuckereinheit, d. h. eine der folgenden Zuckereinheiten: Arabinose, 2-Fluorarabinose, Xylulose und Hexose.
  • In noch einer anderen Ausführungsform umfaßt das Oligonukleotid mindestens eine der folgenden modifizierten Phosphathauptketten: ein Phosphorthioat, ein Phosphordithioat, ein Phosphoramidothioat, ein Phosphoramidat, ein Phosphordiamidat, ein Methylphosphonat, ein Alkylphosphotriester, ein Formacetal oder ein Analogon von Formacetal.
  • In noch einer anderen Ausführungsform ist das Oligonukleotid ein α-anomeres Oligonukleotid. Ein α-anomeres Oligonukleotid bildet spezielle doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, wobei im Gegensatz zu üblichen β-Einheiten die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gautier et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 6625–6641).
  • Das Oligonukleotid kann an ein anderes Molekül konjugiert werden, z. B. ein Peptid, Hybridisierungs-getriggerte Vernetzungsmittel, Transportmittel oder Hybridisierungs-getriggerte Spaltungsmittel.
  • Oligonukleotide können durch Standardverfahren, die in der Technik bekannt sind synthetisiert werden, z. B. durch die Verwendung einer automatisierten DNA-Synthesevorrichtung (wie kommerziell erhältlich von Biosearch, Applied Biosystems usw.). Als Beispiele können Phosphorthioat-Oligonukleotide durch das Verfahren von Stein et al. (1988, Nuel. Acids Res 16: 3209) synthetisiert werden, und Methylphosphonat-Oligonukleotide können durch die Verwendung von Polymerträgern aus porösem Glas hergestellt werden (Sarin et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 7448–7451).
  • In einer speziellen Ausführungsform wird die BCMP-Antisense-Nukleinsäure intrazellulär durch Transkription aus einer exogenen Sequenz hergestellt. Beispielsweise kann ein Vektor in vivo eingeführt werden, so daß er durch eine Zelle aufgenommen wird, wobei innerhalb der Zelle der Vektor oder ein Teil davon transkribiert wird, was eine Antisense-Nukleinsäure (RNA) erzeugt. Ein solcher Vektor würde eine Sequenz, die für die BCMP-Antisense-Nukleinsäure kodiert, enthalten. Ein solcher Vektor kann episomal bleiben oder chromosomal integriert werden, so lange wie er transkribiert werden kann, um die gewünschte Antisense-RNA herzustellen. Solche Vektoren können durch rekombinante DNA-Technologie, die in der Technik Standard ist, konstruiert werden. Vektoren können Plasmid, Virus oder andere, die in der Technik bekannt sind, sein, die zur Replikation und Expression in Säugetierzellen verwendet werden. Die Expression der Sequenz, die für die BCMP-Antisense-RNA kodiert, kann durch jeden Promotor, von dem in der Technik bekannt ist, daß er in Säuger-, bevorzugt menschlichen Zellen agiert, erfolgen. Diese Promotoren können induzierbar oder konstitutiv sein. Beispiele von solchen Promotoren sind oben dargestellt.
  • Die Antisense-Nukleinsäuren umfassen eine Sequenz, komplementär zu mindestens einem Teil eines RNA-Transkripts eines Gens, das für ein BCMP kodiert, bevorzugt eines menschlichen Gens, das für ein BCMP kodiert. Jedoch ist die absolute Komplementarität, obwohl bevorzugt, nicht erforderlich. Eine Sequenz, „komplementär zu mindestens einem Teil einer RNA", wie hierin bezeichnet, bedeutet eine Sequenz mit ausreichend Komplementarität, um unter stringenten Bedingungen (z. B. hoch stringente Bedingungen, umfassend Hybridisie rung in 7 % Natriumdodecylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65°C und Waschen in 0,1 × SSC/0,1 % SDS bei 68°C, oder mäßig stringente Bedingungen, umfassend Waschen in 0,2 × SSC/0,1 % SDS bei 42°C) mit der RNA hybridisieren zu können, was einen stabilen Doppelstrang bildet; in dem Fall von doppelsträngigen BCMP-Antisense-Nukleinsäuren kann ein einzelner Strang der doppelsträngigen DNA daher getestet werden, oder die Triplexbildung kann analysiert werden. Die Fähigkeit zu hybridisieren wird von dem Grad der Komplementarität und der Länge der Antisense-Nukleinsäure abhängen. Im allgemeinen gilt, daß je länger die hybridisierende Nukleinsäure ist, desto mehr fehlende Basenübereinstimmungen mit einer RNA, die für ein BCMP kodiert, kann sie enthalten und dennoch einen stabilen Doppelstrang bilden (oder eine Triplex, wenn es der Fall sein kann). Der Fachmann kann einen tolerierbaren Grad an fehlenden Basenübereinstimmungen durch die Verwendung von Standardverfahren zur Bestimmung des Schmelzpunktes des hybridisierten Komplexes feststellen.
  • Therapeutische Verwendung von BCMP-Antisense-Nukleinsäuren
  • Die BCMP-Antisense-Nukleinsäuren können verwendet werden, um Brustkrebs zu behandeln oder vorzubeugen, wenn das Ziel-BCMP in dem Brustgewebe von Subjekten, bei denen ein Verdacht von Brustkrebs besteht oder die darunter leiden, überexprimiert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Einzelstrang-DNA-Antisense-BCMP-Oligonukleotid verwendet.
  • Zelltypen, die RNA, die für ein BCMP kodiert, exprimieren oder überexprimieren, können durch verschiedene in der Technik bekannte Verfahren identifiziert werden. Diese Zelltypen umfassen Leukozyten (z. B. Neutrophile, Makrophagen, Monozyten) und residente Zellen (z. B. Astrozyten, Gliazellen, neuronale Zellen und Ependymzellen), sind aber nicht darauf beschränkt. Diese Verfahren umfassen die Hybridisierung mit einer BCMP-spezifischen Nukleinsäure (z. B. durch Northern-Hybridisierung, Dot-blot-Hybridisierung, In-situ-Hybridisierung), Überwachen der Fähigkeit von RNA, aus dem Zelltyp in vitro in ein BCMP translatiert zu werden, Immunassay usw., sind aber nicht darauf beschränkt. In einem bevorzugten Aspekt kann das primäre Gewebe von einem Subjekt hinsichtlich der BCMP-Expression vor der Behandlung analysiert werden, z. B. durch Immunozytochemie oder In-situ-Hybridisierung.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine wirksame Menge einer BCMP-Antisense-Nukleinsäure in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen, können an ein Subjekt mit Brustkrebs verabreicht werden.
  • Die Menge an BCMP-Antisense-Nukleinsäure, die bei der Behandlung von Brustkrebs wirksam sein wird, kann durch klinische Standardtechniken bestimmt werden.
  • In einer speziellen Ausführungsform werden pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine oder mehrere BCMP-Antisense-Nukleinsäuren umfassen, über Liposomen, Mikroteilchen oder Mikrokapseln verabreicht. Bei verschiedenen Ausführungsformen können diese Zusammensetzungen verwendet werden, um die anhaltende Freisetzung der BCMP-Antisense-Nukleinsäuren zu erreichen. In einer speziellen Ausführungsform kann es wünschenswert sein, Liposomen zu verwenden, die über Antikörper zu spezifischen identifizierbaren Tumorantigenen targetiert werden (Leonetti et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2448–2451; Renneisen et al, 1990, J. Biol. Chem. 265: 16337–16342).
  • Inhibierende Ribozym- und Tripelhelix-Ansätze
  • In einer anderen Ausführungsform können die Symptome von Brustkrebs durch Verringern des Niveaus eines BCMP oder der BCMP-Aktivität unter Verwendung von Gensequenzen, die für das BCMP kodieren, zusammen mit allgemein bekannten Gen-„Ausschaltungs"-, Ribozym- oder Tripelhelix-Verfahren, um die Genexpression eines BCMPs zu verringern, gelindert werden. Bei diesem Ansatz werden Ribozym- oder Tripelhelixmoleküle verwendet, um die Aktivität, Expression oder Synthese des Gens, das für das BCMP kodiert, zu verändern, und um daher die Symptome von Brustkrebs zu lindern. Diese Moleküle können so konstruiert sein, daß sie die Expression eines mutanten oder nicht-mutanten Zielgens verringern oder inhibieren. Techniken für die Herstellung und Verwendung solcher Moleküle sind dem Fachmann allgemein bekannt.
  • Ribozymmoleküle, die so konstruiert sind, daß sie Gen-mRNA-Transkripte, die für ein BCMP kodieren, katalytisch spalten, können verwendet werden, um die Translation von Zielgen-mRNA und daher die Expresssion des Genproduktes zu verhindern. (Siehe z. B. internationale PCT-Veröffentlichung WO 90/11364, veröffentlicht am 4. Oktober 1990; Sarver et al., 1990, Science 247: 1222–1225).
  • Ribozyme sind enzymatische RNA-Moleküle, die die spezifische Spaltung von RNA katalysieren. können. (Für einen Überblick siehe Rossi, 1994, Current Biology 4, 469–471). Der Mechanismus der Ribozymwirkung umfaßt Sequenz-spezifische Hybridisierung des Ribozymmoleküls zu komplementärer Ziel-RNA, gefolgt von einem endonukleolytischem Spaltungsvorgang. Die Zusammensetzung von Ribozymmolekülen muß ein oder mehrere Sequenzen, komplementär zu der Zielgen-mRNA, umfassen und muß die allgemein bekannte katalytische Sequenz umfassen, die für die mRNA-Spaltung verantwortlich ist. Für diese Sequenz siehe z. B. US-Patent Nr. 5,093,246.
  • Während das Ribozym, das die mRNA an ortspezifischen Erkennungssequenzen spaltet, verwendet werden kann, um mRNAs, die für ein BCMP kodieren, zu zerstören, ist die Verwendung von Hammerkopf-Ribozymen bevorzugt. Hammerkopf-Ribozyme spalten mRNAs an Lokationen, die durch flankierende Regionen vorgegeben sind, die komplementäre Basenpaare mit der Ziel-mRNA bilden. Die einzige Anforderung ist, daß die Ziel-mRNA die folgende Sequenz aus zwei Basen hat: 5'-UG-3'. Die Konstruktion und Herstellung von Hammerkopf-Ribozymen ist in der Technik allgemein bekannt und wird vollständiger in Myers, 1995, Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, New York, (siehe speziell 4, S. 833) und in Haseloff und Gerlach, 1988, Nature, 334, 585–591 beschrieben.
  • Bevorzugt wird das Ribozym so konstruiert, daß die Spaltungserkennungsstelle nahe dem 5'-Ende der mRNA, die für das BCMP kodiert, lokalisiert ist, d. h. um die Wirksamkeit zu erhöhen und die intrazelluläre Akkumulation von nicht-funktionellen mRNA-Transkripten zu verringern.
  • Die Ribozyme umfassen ebenso RNA-Endoribonukleasen (nachstehend „Cech-Typ-Ribozyme"), wie die, die natürlich in Tetrahymena thermophila vorkommt (bekannt als IVS- oder L-19 IVS-RNA) und die ausführlich von Thomas Cech und Kollegen beschrieben worden ist (Zaug, et al., 1984, Science, 224, 574–578; Zaug und Cech, 1986, Science, 231, 470–475; Zaug, et al., 1986, Nature; 324, 429–433; veröffentlichte internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 88/04300 von University Patents Inc.; Been und Cech, 1986, Cell, 47, 207–216). Die Cech-Typ-Ribozymen haben eine aktive Stelle mit acht Basenpaaren, die an eine Ziel-RNA-Sequenz hybridisiert, wonach die Spaltung der Ziel-RNA statt- Ziel-RNA-Sequenz hybridisiert, wonach die Spaltung der Ziel-RNA stattfindet. Cech-Typ-Ribozyme, die Sequenzen der aktiven Stelle mit acht Basenpaaren targetieren, die in dem Gen, das für das BCMP kodiert, vorliegen, können gemäß der Erfindung verwendet werden.
  • Wie bei dem Antisenseansatz können die Ribozyme aus modifizierten Oligonukleotiden (z. B. für die verbesserte Stabilität, Targeting usw.) bestehen, und sollten an Zellen abgegeben werden, die das BCMP in vivo exprimieren. Ein bevorzugtes Verfahren zur Abgabe umfaßt die Verwendung eines DNA-Konstrukts, das das Ribozym unter Kontrolle eines stark konstitutiven pol-III- oder pol-II-Promotors „kodiert", so daß transfektierte Zellen ausreichende Mengen des Ribozyms erzeugen werden, um die endogene mRNA, die für das BCMP kodiert, zu zerstören und die Translation zu inhibieren. Da Ribozyme im Gegensatz zu Antisense-Molekülen katalytisch sind, ist eine niedrigere intrazelluläre Konzentration für die Wirksamkeit erforderlich.
  • Endogene BCMP-Expression kann ebenso durch Inaktivieren oder „Ausschalten" des Gens, das für das BCMP kodiert, oder des Promotors des Gens unter Verwendung von targetierter homologer Rekombination verringert werden (z. B. siehe Smithies, et al., 1985, Nature 317: 230–234; Thomas and Capecchi, 1987, Cell 51: 503–512; Thompson et al., 1989, Cell 5: 313–321; und Zijlstra et at., 1989, Nature 342: 435–438, wobei jedes hierin durch Verweis in seiner Gesamtheit aufgenommen wird). Beispielsweise kann ein mutantes Gen, das für ein nicht-funktionelles BCMP kodiert (oder eine vollständig nicht verwandte DNA-Sequenz), flankiert durch ein DNA-Homologon zu dem endogenen Gen (entweder die kodierenden Regionen oder Regulationsregionen des Gens, das für das BCMP kodiert), verwendet werden, mit oder ohne einem selektierbaren Marker und/oder einem negativen selektierbaren Marker, um Zellen zu transfektieren, die das Zielgen in vivo exprimieren. Die Einführung des DNA-Konstrukts über targetierte homologe Rekombination führt zur Inaktivierung des Zielgens. Diese Ansätze sind für den Landwirtschaftsbereich besonders geeignet, wo Modifikationen an ES-Zellen (Embryonalstamm-Zellen) verwendet werden können, um Tiernachkommen mit einem inaktiven Zielgen zu erzeugen (z. B. siehe Thomas and Capecchi, 1987 und Thompson, 1989, oben). Jedoch kann dieser Ansatz zur Verwendung bei Menschen angepaßt werden, vorausgesetzt, daß die rekombinanten DNA-Kontrukte direkt verabreicht oder zu der erforderlichen Stelle in vivo unter Verwendung der geeigneten Virusvektoren targetiert werden.
  • Alternativ kann die endogene Expression eines Gens, das für ein BCMP kodiert, durch Targetieren von Desoxyribonukleotidsequenzen, komplementär zu der Regulationsregion des Gens (d. h. der Genpromotor und/oder Enhancer) verringert werden, um dreisträngige Strukturen zu bilden, die die Transkription des Gens, das das BCMP kodiert, in Zielzellen in dem Körper zu verhindern. (Siehe im allgemeinen Helene, 1991, Anticancer Drug Des., 6(6), 569–584; Helene, et al., 1992, Ann. N.Y. Acad. Sci., 660, 27–36; und Maher, 1992, Bioassays 14(12), 807–815).
  • Nukleinsäuremoleküle, die bei der Triplexhelixbildung zur Inhibierung der Transkription verwendet werden sollen, sollten einsträngig sein und aus Desoxynukleotiden bestehen. Die Basenzusammensetzung dieser Oligonukleotide muß so konstruiert sein, daß sie die Tripelhelixbildung über Hoogsteen-Basenpaarungsregelungen beschleunigt, die im allgemeinen große Stücke von entweder Purinen oder Pyrimidinen erfordern, die auf einem Strang des Doppelstranges vorliegen sollen. Nukleotidsequenzen können Pyrimidin-basierend sein, was zu TAT- und CGC+-Tripletts über die drei assoziierten Stränge der resulierenden Tripelhelix führen wird. Die pyrimidinreichen Moleküle stellen Basenkomplementarität zu einer purinreichen Region eines Einzelstranges des Doppelstranges in einer parallelen Richtung zu dem Strang bereit. Außerdem können Nukleinsäuremoleküle ausgewählt werden, die purinreich sind, beispielsweise ein Stück von G-Resten enthalten. Diese Moleküle werden eine Tripelhelix mit einem DNA-Doppelstrang bilden, der reich an GC-Paaren ist, wobei die Mehrheit an Purinresten auf einem Einzelstrang des targetierten Doppelstranges lokalisiert ist, was zu GGC-Tripletts über die drei Stränge in dem Dreifachstrang führt.
  • Alternativ können die möglichen Sequenzen, die für die Tripelhelixbildung targetiert werden können, durch Erzeugen eines sogenannten „switchback"-Nukleinsäuremoleküls vergrößert werden. Switchback-Moleküle werden in einer abwechselnden 5'-3'-, 3'-5'-Weise synthetisiert, so daß sie zunächst mit einem Strang eines Doppelstrangs und dann mit dem anderen Paare bilden, was die Notwendigkeit für ein großes Stück von entweder Purinen oder Pyrimidinen, die auf einem Strang eines Doppelstrangs vorliegen sollen, beseitigt.
  • In Fällen, worin die hierin beschriebenen Antisense-, Ribozym- oder Tripelhelixmoleküle verwendet werden, um Mutantengenexpression zu inhibieren, ist es möglich, daß die Technik die Transkription (Tripelhelix) oder Translation (Antisense, Ribozym) von mRNA, die durch normale Genallele eines BCMPs erzeugt wurden, effizient verringert oder inhibiert, so daß die Situation auftreten kann, daß die Konzentration von vorhandenem BCMP niedriger sein kann, als sie für einen normalen Phänotyp notwendig ist. In solchen Fällen kann, um sicherzustellen, daß im wesentlichen normale Niveaus an Aktivität eines Gens, das für ein BCMP kodiert, gehalten werden, die Gentherapie verwendet werden, um in die Zellen Nukleinsäuremoleküle einzuführen, die das BCMP kodieren und expremieren, die normale Genaktivität zeigen und die keine Sequenzen enthalten, die empfindlich gegen verwendete Antisense-, Ribozym- oder Tripelhelixbehandlungen sind. Alternativ können in Fällen, wo das Gen ein extrazelluläres Protein kodiert, normale BCMPs co-verabreicht werden, um das erforderliche Niveau an BCMP-Aktivität aufrechtzuerhalten.
  • Anti-sense-RNA- und -DNA-, Ribozym- und Tripelhelixmoleküle können durch jedes in der Technik bekannte Verfahren zur Synthese von DNA- und RNA-Molekülen hergestellt werden, wie oben erörtert. Diese umfassen Techniken zum chemischen Synthetisieren von Oligodesoxyribonukleotiden und Oligoribonukleotiden, die in der Technik allgemein bekannt sind, wie beispielsweise chemische Festphasenphosphoramidit-Synthese. Alternativ können RNA-Moleküle durch In-vitro- und In-vivo-Transkription von DNA-Sequenzen, die für das Antisense-RNA-Molekül kodieren, erzeugt werden. Diese DNA-Sequenzen können in eine große Vielzahl von Vektoren eingeführt werden, die geeignete RNA-Polymerasepromotoren, wie die T7- oder SP6-Polymerasepromotoren einführen. Alternativ können Antisense-cDNA-Konstrukte, die Antisense-RNA konstitutiv oder induzierbar in Abhängigkeit des verwendeten Promotors synthetisieren, stabil in Zellinien eingeführt werden.
  • Assays für therapeutische oder prophylaktische Verbindungen
  • Die vorliegende Erfindung stellt ebenso Assays zur Verwendung bei der Entdeckung von Arzneimitteln bereit, um die Wirksamkeit von Verbindungen zur Behandlung oder Vorbeugung von Brustkrebs zu identifizieren oder verifizieren. Testverbindungen können hinsichtlich ihrer Fähigkeit analysiert werden, BCMP-Niveaus in einem Subjekt mit Brustkrebs auf Niveaus, die in Subjekten ohne Brustkrebs gefunden werden zurückzuführen, oder für ähnliche Veränderungen in experimentellen Tiermodellen von Brustkrebs zu sorgen. Verbindungen, die BCMP-Niveaus in einem Subjekt mit Brustkrebs auf Niveaus, die in Subjekten ohne Brustkrebs gefunden werden, wiederherstellen können oder für ähnliche Veränderungen in experimentellen Tiermodellen von Brustkrebs sorgen können, können als Leitverbindungen für die weitere Arzneimittelentdeckung oder therapeutisch verwendet werden. BCMP-Expression kann durch die Bevorzugte Technologie, Immunoassays, Gelelektrophorese, gefolgt von Visualisierung, Detektion der BCMP-Aktivität oder irgendein anderes hierin gelehrtes oder dem Fachmann bekanntes Verfahren analysiert werden. Diese Assays können verwendet werden, um mögliche Arzneimittel bei der klinischen Überwachung oder bei der Arzneimittelentwicklung zu screenen, wo die Häufigkeit eines BCMP als ein Ersatzmarker für die klinische Krankheit dienen kann.
  • In verschiedenen speziellen Ausführungsformen können In-vitro-Assays mit Zellen durchgeführt werden, die für Zelltypen repräsentativ sind, welche an der Erkrankung des Subjekts beteiligt sind, um zu bestimmen, ob eine Verbindung eine gewünschte Wirkung auf diese Zelltypen hat.
  • Verbindungen zur Verwendung in der Therapie können in geeigneten Tiermodellsystemen vor dem Test an Menschen getestet werden, umfassend Ratten, Mäusen, Hühnchen, Kühe Affen, Kaninchen usw., sind aber nicht darauf beschränkt. Für den In-vivo-Test vor der Verabreichung an Menschen kann jedes Tiermodellsystem, das in der Technik bekannt ist, verwendet werden. Beispiele von Tiermodellen von Brustkrebs umfassen xenogene Transplantate von menschlichen Brustkrebszellinien, wie MDA-MB-435 in Östrogenmangel-Mäusen mit schwerem kombinierten Immundefekt (SCID-Mäusen) (Eccles et al., 1994 Cell Biophysics 24/25, 279), sind aber nicht darauf beschränkt. Diese können für Testverbindungen verwendet werden, die die BCMP-Niveaus modulieren, da die Pathologie, die in diesen Tiermodellen gezeigt wird, ähnlich der von Brustkrebs ist. Es ist für den Fachmann ebenso offensichtlich, daß, basierend auf der vorliegenden Offenbarung, transgene Tiere mit „Ausschaltungs"-Mutationen des Gens oder der Gene, die für ein oder mehrere BCMPs kodieren, erzeugt werden können. Eine „Ausschaltungs"-Mutation eines Gens ist eine Mutation, die bewirkt, daß das Gen nicht exprimiert wird oder in einer abweichenden Form oder bei einem niedrigen Niveau exprimiert wird, so daß die Aktivität, die mit dem Genprodukt verbunden ist, nahezu oder vollständig fehlt. Bevorzugt ist das transgene Tier ein Säuger, stärker bevorzugt ist das transgene Tier eine Maus.
  • In einer Ausführungsform werden die Testverbindungen, die die Expression eines BCMP modulieren, in nicht-menschlichen Tieren (z. B. Mäusen, Ratten, Affen, Kaninchen und Meerschweinchen), bevorzugt nicht-menschlichen Tiermodellen für Brustkrebs, die das BCMP exprimieren, identifiziert. Gemäß dieser Ausführungsform wird eine Testverbindung oder eine Kontrollverbindung den Tieren verabreicht, und die Wirkung der Testverbindung auf die Expression von ein oder mehreren BCMPs wird bestimmt. Eine Testverbindung, die die Expression eines BCMPs (oder einer Vielzahl von BCMPs) verändert, kann durch Vergleichen des Niveaus des gewählten BCMP oder BCMPs (oder mRNA(s), das selbiges kodiert) in einem Tier oder Gruppe von Tieren, behandelt mit einer Testverbindung mit dem Niveau der BCMPs) oder mRNA(s) in einem Tier oder Gruppe von Tieren, behandelt mit einer Kontrollverbindung, identifiziert werden. Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, können verwendet werden, um die mRNA- und Proteinniveaus zu bestimmen, beispielsweise In-situ-Hybridisierung. Die Tiere können getötet werden oder nicht, um die Wirkungen einer Testverbindung zu analysieren.
  • In einer weiteren Ausführungsform werden die Testverbindungen, die die Aktivität eines BCMP oder eines biologisch aktiven Teils davon modulieren, in nicht-menschlichen Tieren (z. B. Mäusen, Ratten, Affen, Kaninchen und Meerschweinchen), bevorzugt nichtmenschlichen Tiermodellen für Brustkrebs, die die BCMPs exprimieren, identifiziert. Gemäß dieser Ausführungsform wird eine Testverbindung oder eine Kontrollverbindung den Tieren verabreicht, und die Wirkung einer Testverbindung auf die Aktivität eines BCMP wird bestimmt. Eine Testverbindung, die die Aktivität eines BCMP (oder einer Vielzahl von BCMPs) verändert, kann durch Analysieren der Tiere, die mit einer Kontrollverbindung behandelt wurden, und Tiere, die mit der Testverbindung behandelt wurden, identifiziert werden. Die Aktivität des BCMP kann durch Detektieren der Induktion eines zellulären zweiten Messengers des BCMP (z. B. intracelluläres Ca2+, Diacylglycerol, IP3 usw.), Detektieren der katalytischen oder enzymatischen Aktivität des BCMP oder Bindungspartners davon, Detektieren der Induktion eines Reportergens (z. B. ein regulatorisches Element, das auf ein BCMP reagiert, welches funktionsfähig mit einer Nukleinsäure verbunden ist, die einen detektierbaren Marker kodiert, wie Luciferase oder grünfluoreszierendes Protein) oder Detektieren einer zellulären Antwort (z. B. Zelldifferenzierung oder Zellproliferation) analysiert werden. Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, können verwendet werden, um Veränderungen der Aktivität eines BCMP zu detektieren (siehe z. B. US-Patent Nr. 5,401,639, das hierin durch Verweis aufgenommen ist).
  • In noch einer anderen Ausführungsform werden die Testverbindungen, die das Niveau oder die Expression eines BCMP (oder einer Vielzahl von BCMPs) modulieren, in menschlichen Subjekten mit Brustkrebs, bevorzugt denen mit schwerem Brustkrebs identifiziert. Gemäß dieser Ausführungsform wird eine Testverbindung oder eine Kontrollverbindung dem menschlichen Subjekt verabreicht, und die Wirkung einer Testverbindung auf die BCMP-Expression wird durch Analysieren der Expression des BCMP oder der mRNA, die selbiges kodiert, in einer biologischen Probe bestimmt (z. B. Brustgewebe, Serum, Plasma oder Urin). Eine Testverbindung, die die Expression eines BCMP verändert, kann durch Vergleichen des Niveaus des BCMP oder der mRNA, die selbiges kodiert, in einem Subjekt oder einer Gruppe von Subjekten, die mit einer Kontrollverbindung behandelt wurde, mit dem in einem Subjekt oder einer Gruppe von Subjekten, die mit einer Testverbindung behandelt wurde, identifiziert werden. Alternativ können die Veränderungen in der Expression eines BCMP durch Vergleichen des Niveaus des BCMP oder der mRNA, die selbiges kodiert, in einem Subjekt oder einer Gruppe von Subjekten vor und nach der Verabreichung einer Testverbindung identifiziert werden. Techniken, die in dem Fachmann bekannt sind, können verwendet werden, um die biologische Probe zu erhalten und die mRNA- oder Proteinexpression zu analysieren. Beispielsweise kam die hierin beschriebene Bevorzugte Technologie verwendet werden, um Veränderungen des Niveaus eines BCMP zu analysieren.
  • In einer weiteren Ausführungsform werden die Testverbindungen, die die Aktivität eines BCMP (oder einer Vielzahl von BCMPs) modulieren, in menschlichen Subjekten mit Brustkrebs identifiziert (bevorzugt denen mit schwerem Brustkrebs). In dieser Ausführungsform wird eine Testverbindung oder eine Kontrollverbindung an das menschliche Subjekt verabreicht, und die Wirkung einer Testverbindung auf die Aktivität eines BCMP wird bestimmt. Eine Testverbindung, die die Aktivität eines BCMP verändert, kann durch Vergleichen biologischer Proben von Subjekten, die mit einer Kontrollverbindung behandelt wurden, mit Proben von Subjekten, die mit der Testverbindung behandelt wurden, identifiziert werden. Alternativ können Veränderungen der Aktivität eines BCMP durch Vergleichen der Aktivität eines BCMP in einem Subjekt oder einer Gruppe von Subjekten vor und nach der Verabreichung einer Testverbindung identifiziert werden. Die Aktivität des BCMP kann durch Detektieren in einer biologischen Probe (z. B. Brustgewebe, Serum, Plasma oder Urin) der Induktion eines zellulären Signaltransduktionsweges des BCMP (z. B. intrazelluläres Ca2+, Diacylglycerol, IP3 usw.), katalytische oder enzymatische Aktivität des BCMP oder eines Bindungspartners davon oder einer zellulären Antwort, beispielsweise Zelldifferenzierung oder Zellproliferation analysiert werden. Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, können verwendet werden, um die Veränderungen der Induktion eines zweiten Messengers eines BCMP oder Veränderungen einer zellulären Antwort zu detektieren. Beispielsweise kann RT-PCR verwendet werden, um Veränderungen der Induktion eines zellulären zweiten Messengers zu detektieren.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Testverbindung, die das Niveau oder die Expression eines BCMP auf Niveaus, die in Kontrollsubjekten (z. B. Menschen ohne Brustkrebs) detektiert wurden, verändert, für weitere Tests oder die therapeutische Verwendung ausgewählt. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird eine Testverbindung, die die Aktivität eines BCMP auf die Aktivität, die in Kontrollsubjekten (z. B. Menschen ohne Brustkrebs) gefunden wird, verändert, für weitere Tests oder die therapeutische Verwendung ausgewählt.
  • In einer anderen Ausführungsform werden Testverbindungen, die die Schwere von ein oder mehreren Symptomen, die mit Brustkrebs in Verbindung stehen, verringern, in menschlichen Subjekten mit Brustkrebs, bevorzugt Subjekten mit schwerem Brustkrebs identifiziert. Gemäß dieser Ausführungsform wird eine Testverbindung oder eine Kontrollverbindung an die Subjekte verabreicht, und die Wirkung einer Testverbindung auf ein oder mehrere Symptome von Brustkrebs wird bestimmt. Eine Testverbindung, die ein oder mehrere Symptome verringert, kann durch Vergleichen der Subjekte, die mit einer Kontrollverbindung behandelt wurden, mit den Subjekten, die mit der Testverbindung behandelt wurden, identifiziert werden. Techniken, die dem Fachmann für Brustkrebs bekannt sind, können verwendet werden, um zu bestimmen, ob eine Testverbindung ein oder mehrere Symptome, die mit Brustkrebs in Verbindung stehen, verringert. Beispielsweise wird eine Testverbindung, die die Tumorbelastung bei einem Subjekt mit Brustkrebs verringert, für Subjekte mit Brustkrebs von Nutzen sein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Testverbindung, die die Schwere von ein oder mehreren Symptomen, die mit Brustkrebs in Verbindung stehen, bei einem Menschen mit Brustkrebs verringert, für weitere Tests und die therapeutische Verwendung ausgewählt.
  • Therapeutische und prophylaktische Zusammensetzungen und deren Verwendung
  • Die Erfindung ist bei Verfahren zur Behandlung (und Vorbeugung) nützlich, umfassend das Verabreichen an ein Subjekt einer wirksamen Menge einer aktiven Verbindung. In einem bevorzugten Aspekt wird die Verbindung im wesentlichen gereinigt (z. B. im wesentlichen frei von Substanzen, die ihre Wirkung einschränken oder unerwünschte Nebenwirkungen erzeugen). Das Subjekt ist bevorzugt ein Lebewesen, einschließlich Tiere wie Kühe, Schweine, Pferde, Hühner, Katzen, Hunde, usw., sind aber nicht darauf beschränkt, und ist bevorzugt ein Säuger, und stärker bevorzugt ein Mensch. In einer speziellen Ausführungsform ist ein nicht menschlicher Säuger das Subjekt.
  • Formulierungen und Verfahren zur Verabreichung, die eingesetzt werden können, wenn die Verbindung eine Nukleinsäure umfaßt, sind oben beschrieben; zusätzliche geeignete Formulierungen und Verabreichungswege sind nachstehend beschrieben.
  • Verschiedene Abgabesysteme sind bekannt und können verwendet werden, um die aktive Verbindung zu verabreichen, beispielsweise Einkapselung in Liposomen, Mikropartikel, Mikrokapseln, rekombinante Zellen, die die Verbindung exprimieren können, Rezeptorvermittelte Endozytose (siehe z. B. Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429–4432), Konstruktion einer Nukleinsäure als Teil eines retroviralen oder anderen Vektors usw. Verfahren zur Einführung können enteral oder parenteral sein und umfassen intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkutane, intranasale, epidurale und orale Wege, sind aber nicht darauf beschränkt. Die Verbindungen können durch jeden geeigneten Weg verabreicht werden, beispielsweise durch Infusion oder Bolusinjektion, durch Absorption durch Epithelial- oder Schleimhautauskleidungen (z. B. Mundschleimhaut, Mastdarm- und Darmschleimhaut usw.), und kann zusammen mit anderen biologische aktiven Mitteln verabreicht werden. Die Verabreichung kann systemisch oder lokal sein. Außerdem kann es wünschenswert sein, die pharmazeutischen Zusammensetzungen in das Zentralnervensystem durch einen geeigneten Weg einzuführen, einschließlich intraventrikuläre und intrathekale Injektion; intraventrikuläre Injektion kann durch einen intraventrikulären Katheter erleichtert werden, der beispielsweise mit einem Reservoir wie einem Ommaya-Reservoir verbunden ist. Pulmonale Verabreichung kann ebenso eingesetzt werden, z. B. durch Verwendung eines Inhalators oder Zerstäubers, und Formulierung mit einem Aerosolisierungsmittel.
  • In einer speziellen Ausführungsform kann es wünschenswert sein, die pharmazeutischen Zusammensetzungen lokal an dem Bereich, der einer solchen Behandlung bedarf, zu verabreichen; dies kann beispielsweise und ohne Einschränkung durch lokale Infusion während der chirurgischen Behandlung, topische Anwendung, z. B. durch Injektion, mittels eines Katheters oder mittels eines Implantats erreicht werden, wobei das Implantat ein poröses, nicht-poröses oder gelatineartiges Material ist, einschließlich Membranen, wie sialastische Membranen („sialastic membranes"), oder Fasern. In einer Ausführungsform kann die Verabreichung durch direkte Injektion in das Brustgewebe oder an der Stelle (oder früheren Stelle) eines bösartigen Tumors oder neoplastischen oder präneoplastischen Gewebes erfolgen.
  • In einer anderen Ausführungsform kann die Verbindung in einem Vesikel, insbesondere einem Liposom verabreicht werden (siehe Langer, 1990, Science 249: 1527–1533; Treat et al., in Liposomes in the Therapie of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (Hrsg.), Liss, New York, S. 353–365 (1989); Lopez-Berestein, ebenda, S. 317–327; siehe im allgemeinen ebenda)
  • In noch einer anderen Ausführungsform kann die Verbindung in einem System zur gesteuerten Freisetzung verabreicht werden. In einer Ausführungsform kann eine Pumpe verwendet werden (siehe Langer, oben; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88: 507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574). In einer anderen Ausführungsform können polymere Materialien verwendet werden (siehe Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (Hrsg), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball(Hrsg.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J., 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61; siehe ebenso Levy et al., 1985, Science 228: 190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25: 351; Howard et al., 1989, 1. Neurosurg. 71: 105). In noch einer anderen Ausführungsform kann ein System zur gesteuerten Freisetzung in die Nähe des therapeutischen Ziels, d. h. die Brust, gegeben werden, wodurch nur ein Bruchteil der systemischen Dosis erforderlich ist (siehe z. B. Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, oben, Bd. 2, S. 115–138 (1984)).
  • Andere Systeme zur gesteuerten Freisetzung werden in dem Überblick von Langer (1990, Science 249: 1527–1533) erläutert.
  • In einer speziellen Ausführungsform, bei der die Verbindung eine Nukleinsäure, die für ein Protein kodiert, ist, kann die Nukleinsäure durch Konstruieren als Teil eines geeigneten Nukleinsäureexpressionsvektors und Verabreichen, so daß sie intrazellulär wird, z. B. durch die Verwendung eines retroviralen Vektors (siehe US-Patent Nr. 4,980,286), oder durch direkte Injektion oder durch Verwendung von Mikroteilchenbeschuß (z. B. eine Genkanone; Biolistic, Dupont) oder durch Beschichtung mit Lipiden oder Zelloberflächenrezeptoren oder Transfektiermitteln oder durch Verabreichen in Verbindung mit einem Homöobox-artigen Peptid, das dafür bekannt ist, in den Kern einzudringen (siehe z. B. Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1864–1868) usw. in vivo verabreicht werden, um die Expression von seinem kodierten Protein zu beschleunigen. Alternativ kann eine Nukleinsäure intrazellulär oder in Wirtszell-DNA zur Expression durch homologe Rekombination eingeführt werden.
  • Die vorliegende Erfindung nutzt ebenso pharmazeutische Zusammensetzungen. Solche Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. In einer speziellen Ausführungsform bedeutet der Ausdruck „pharmazeutisch akzeptabel", daß er durch eine Bundes- oder bundesstaatliche Überwachungsbehörde oder eine Regierung zugelassen oder in dem US-Arzneimittelverzeichnis oder anderen allgemein anerkannten Arzneimittelverzeichnissen zur Verwendung bei Lebewesen und insbesondere bei Menschen aufgeführt ist. Der Ausdruck „Träger" bezieht sich auf ein Verdünnungsmittel, ein Hilfsmittel, einen Trägerstoff oder ein Vehikel, mit dem das Therapeutikum verabreicht wird. Diese pharmazeutischen Träger können sterile Flüssigkeiten, wie Wasser und Öle, einschließlich denen von Erdöl-, tierischen, pflanzlichen oder synthetischen Ursprungs, wie Erdnußöl, Sojaöl, Mineralöl, Sesamöl und dergleichen, sein. Wasser ist ein bevorzugter Träger, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung intravenös verabreicht wird. Kochsalzlösungen und wässerige Dextrose- und Glycerollösungen können ebenso als flüssige Träger, insbesondere für injizierbare Lösungen eingesetzt werden. Geeignete pharmazeutische Trägerstoffe umfassen Stärke, Glucose, Lactose, Saccharose, Gelatine, Malz, Reis, Mehl, Kreide, Kieselgel, Natriumstearat, Glycerolmonostearat, Talk, Natriumchlorid, Trockenmagermilch, Glycerol, Propylen, Glycol, Wasser, Ethanol und dergleichen. Die Zusammensetzung kann, wenn gewünscht, ebenso geringe Mengen an Benetzungsmitteln oder Emulgatoren oder pH-Puffern enthalten. Diese Zusammensetzungen können die Form von Lösungen, Suspensionen, einer Emulsion, Tabletten, Pillen, Kapseln, Pulvern, Formulierungen mit anhaltender Freisetzung und dergleichen annehmen. Die Zusammensetzung kann als Zäpfchen mit traditionellen Bindemitteln und Trägern wie Triglyceriden formuliert werden. Orale Formulierungen können Standardträger wie Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Cellulose, Magnesiumcarbonat usw. mit pharmazeutischer Qualität umfassen. Beispiele von geeigneten pharmazeutischen Trägern werden in „Remington's Pharmaceutical Sciences" von E. W. Martin beschrieben. Diese Zusammensetzungen werden eine therapeutisch wirksame Menge der Verbindung, bevorzugt in gereinigter Form, zusammen mit einer geeigneten Menge an Träger enthalten, um so die Form der geeigneten Verabreichung an das Subjekt bereitzustellen. Die Formulierung sollte der Verabreichungsweise entsprechen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Zusammensetzung gemäß der Routineverfahren als eine pharmazeutische Zusammensetzung formuliert, die zur intravenösen Verabreichung an Menschen angepaßt wird. Typischerweise sind Zusammensetzungen zur intravenösem Verabreichung Lösungen in sterilem, isotonischem, wässerigem Puffer. Wo es notwendig ist, kann die Zusammensetzung ebenso einen Lösungsvermittler und ein lokales Anäthetikum, wie Lidocain, umfassen, um den Schmerz an der Injektionsstelle zu lindern. Im allgemeinen werden die Inhaltsstoffe entweder separat oder zusammengemischt in einer Einheitsdosierungsform abgegeben, beispielsweise als ein trockenes lyophilisiertes Pulver oder wasserfreies Konzentrat in einem hermetisch verschlossenen Behälter, wie einer Ampulle oder einem Beutel, die die Menge an Wirkstoff abgibt. Wo die Zusammensetzung durch Infusion verabreicht werden soll, kann sie mit einer Infusionsflasche, die steriles Wasser oder Kochsalzlösung mit pharmazeutischer Qualität enthält, dispensiert werden. Wo die Zusammensetzung durch Injektion verabreicht wird, kann eine Ampulle mit sterilem Wasser zur Injektion oder Kochsalzlösung bereitgestellt werden, so daß die Inhaltsstoffe vor der Verabreichung gemischt werden können.
  • Die aktiven Verbindungen können in neutraler Form oder in Salzform formuliert werden. Pharmazeutisch akzeptable Salze umfassen die, die mit freien Aminogruppen gebildet sind, wie die, abgeleitet von Salz-, Phosphor-, Essig-, Oxal-, Weinsäure usw., und die, die mit freien Carboxylgruppen gebildet sind, wie die, abgeleitet von Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Eisen(III)-hydroxid, Isopropylamin, Triethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Prokain usw.
  • Die Menge der Verbindung, die bei der Behandlung von Brustkrebs wirksam sein wird, kann durch klinische Standardtechniken bestimmt werden. Außerdem können gegebenenfalls In-vitro-Assays eingesetzt werden, um die Identifizierung optimaler Dosierungsbereiche zu fördern. Die genaue Dosis, die in der Formulierung eingesetzt werden soll, wird ebenso von der Verabreichungsweise und der Ernsthaftigkeit der Krankheit oder Störung abhängen, und sollte gemäß dem Urteilsvermögen des Arztes und den Umständen des jeweiligen Patienten entschieden werden. Jedoch betragen geeignete Dosierungsbereiche für die intravenöse Verabreichung im allgemeinen etwa 20 bis 500 Mikrogramm der aktiven Verbindung pro Kilogramm Körpergewicht. Geeignete Dosierungsbereiche zur intranasalen Verabreichung betragen im allgemeinen etwa 0,01 pg/kg Körpergewicht bis 1 mg/kg Körpergewicht. Wirksame Dosierungen können aus Dosis-Wirkungs-Kurven, abgeleitet von in vitro oder Tiermodelltestsytemen, extrapoliert werden.
  • Zäpfchen enthalten den Wirkstoff im allgemeinen in dem Bereich von etwa 0,5 bis 10 Gew.-%; orale Formulierungen enthalten bevorzugt 10 % bis 95 % Wirkstoff.
  • Die Erfindung nutzt ebenso eine pharmazeutische Packung oder ein pharmazeutisches Kit, umfassen ein oder mehrere Behälter, gefüllt mit ein oder mehreren der Bestandteile der pharmazeutischen Zusammensetzung. Gegebenenfalls kann mit solchen Behälter(n) ein Hinweis verbunden sein, der durch eine Überwachungsbehörde vorgeschrieben ist, welche die Herstellung, die Verwendung und den Verkauf von Pharmazeutika oder biologischen Produkten reguliert, wobei der Hinweis (a) die behördliche Zulassung zur Herstellung, Verwendung oder zum Verkauf zur Verabreichung an Menschen, (b) Richtlinien zur Verwendung oder beides wiedergibt.
  • Beispiele 2, 3 und 4 sollen keinen Teil der Erfindung bilden.
  • BEISPIEL 1: IDENTIFIKATION VON MEMBRANPROTEINEN EXPRIMIERT IN BRUSTKREBSZELLINIEN
  • Unter Verwendung des folgenden Referenzprotokolls wurden die Proteine in Brustkrebszellinienmembranen durch SDS-PAGE getrennt und analysiert.
  • MATERIALIEN UND VERFAHREN
  • 1a – Rohfraktionierung von adhärenten Brustkarzinomzellinien
  • Die menschlichen Brustzellinien, MDA-MB-468 (ATCC:HTB-132), T47D (ATCC:HTB-133) und BT20 (ATCC:HTB-19), wurden unter verschiedenen Gewebekulturbedingungen kultiviert. (Für die BT20-Zellinie war das Kulturmedium Modified Eagle's Medium, 10 % fetales Kalbsserum, ein Gemisch nicht-essentieller Aminosäuren, 2 mM Glutamin, 1 % Penizillin + Streptomycin. Für T47D und MDA MB-468 Zellinien war das Kulturmedium DMF12, 10 % fetales Kalbsserum, 2 mM Glutamin, 1 % Penizillin + Streptomycin. Die Zellen wurden in den obigen Kulturmedien bei 37°C in 5 % CO2 kultiviert). Die Zellen wurden lysiert und gemäß den nachstehend beschriebenen Protokollen fraktioniert.
  • 5 ml kalter Homogenisierungspuffer (50 mM TrisHCl, 250 mM Saccharose, 1 mM EDTA pH 7,4) mit Anti-Proteinase (Sigma Proteinase Inhibitorcocktail P2714) wurde zu einer Reihe von zehn 15-cm2-Petrischalen, enthaltend 10E8 Brustkarzinomzellen (ungefähr 10 mg Protein) zugegeben. Die Zellen wurden von den Platten in kaltem Homogenisierungspuffer abgekratzt und in ein 5 ml Bijou übertragen (durchgeführt auf Eis). Die resultierende Probe wurde mit Ultraschall (auf Eis) unter Verwendung einer MSE Soniprep 150 mit einer Flachbodensonde für 10 Sekunden bei einer Amplitude von 5 Mikrometer behandelt. Die Proben wurden dann in ein 15 ml Falconröhrchen dekantiert und bei 1000 g für 5 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde vorsichtig in klare Ultrazentrifugationsröhrchen (11 × 60 mm) übertragen, ohne das Pellet (unlösliches Protein) zu beeinträchtigen, und das Röhrchen wurde mit Homogenisierungspuffer fast voll aufgefüllt. Das Röhrchen wurde dann bei 100.000 × g für 1 Stunde bei 4°C zentrifugiert und dann auf Eis gegeben, und der Überstand (Cytosol) entfernt.
  • Das Pellet (Membranfraktion) wurde vorsichtig dreimal mit eiskaltem PBS gewaschen und in Waschpuffer (50 mM TrisHCl, 1 mM EDTA pH 7,4), enthaltend Anti-Proteinase, resuspendiert. Es wurde dann vorsichtig in einem Glashomogenisator (5–10 Stöße) zerkleinert, in ein reines Ultrazentrifugationsröhrchen übertragen und bei 100.000 × g für 1 Stunde bei 4°C zentrifugiert. Dieser letzte Schritt wurde dann wiederholt, mit 0,5 M NaCl gewaschen, um die peripheren Proteine abzustreifen. Die Ausbeute des gewaschenen Membranproteins aus 10E8 Brustkarzinomzellen betrug ca. 1 bis 2 mg Protein.
  • 1b – Extraktion von gewaschenen Membranproteinen mit dem Detergens Tx114
  • Diese Extraktion stellt drei mögliche Fraktionen bereit: unlösliches Detergens, peripheres Membranprotein und integrales Membranprotein.
  • Rohe Zellmembranen wurden hergestellt, wie in 1a oben beschrieben, und in 50 mM Tris HCl, 1 mM EDTA 1,5 % Triton X114, Proteinaseinhibitoren, pH 7,4 über Homogenisierung unter Verwendung eines Dounce-Homogenisators resuspendiert.
  • Das Triton X114 (Tx114)-Membrangemisch wurde verwirbelt und auf Eis für 30 min inkubiert. Im Anschluß daran wurde das Tx114-Membrangemisch für 10 min bei 13000 g bei 4°C zentrifugiert und der Überstand von jedem Detergens-unlöslichen Proteinpellet vorsichtig extrahiert.
  • Der Tx114-Überstand wurde auf 37°C für 3 min in einem Wasserbad erwärmt und dann bei 13000 g für 3 min zentrifugiert. Die obere wässerige Schicht wurde entfernt und die untere Detergensphase in 1 ml Tris HCl, 0,2 mM EDTA pH 7,4 resuspendiert. Diese Extraktion wurde zwei weitere Male wiederholt.
  • Die wässerige Phase stellt hydrophile Membranproteine dar und die Detergensphase stellt hydrophobes Membranprotein dar.
  • Das Protein wurde aus den wässerigen und Detergensphasen durch Chloroform-Methanol-Extraktion extrahiert, wie in 1d nachstehend beschrieben. Die Ausbeute an hydrophilen Membranproteinen von 10E8 Zellen betrug ungefähr 0,5 mg und die Ausbeute an hydrophobem Membranprotein betrug ungefähr 0,1 bis 0,2 mg. Schließlich wurde das Membranprotein in ungefähr 30 Mikrolitern 1D-Lysepuffer (1–2 μg/μl) löslich gemacht.
  • 1c – Extraktion von gewaschenen Membranproteinen mit dem Detergens Digitonin
  • Das gewaschene Membranpellet von 1a wurde unter Verwendung eines Detergensenthaltenden Puffers folgendermaßen extrahiert.
  • Eiskalter Digitoninpuffer (0,01 % in 50 mM Tris HCl pH 7,4 ) wurde zu der Membranfraktion zugegeben, die resultierende Lösung mit 10 Stößen homogenisiert und auf Eis für 30 Minuten gegeben, um das Protein löslich machen zu können.
  • Die Probe wurde dann bei 13000 × g für 5 Minuten bei 4°C zentrifugiert, um jegliches unlösliche Protein zu pelletisieren, und der Überstand unter Verwendung der Chloroform-Methanol-Extraktion extrahiert, wie nachstehend in 1d beschrieben. Die Ausbeute an Digitonin-extrahiertem Protein von 10e8 Karzinomzellen betrug ungefähr 30 bis 50 Mikrogramm.
  • 1d – Extraktion von Protein aus wässeriger oder Detergenslösung unter Verwendung von Chloroform/Methanol
  • 400 μl Methanol, 100 μl Chloroform und 300 μl Wasser wurden zu 100 bis 200 μl einer Detergenslösung von 1b und 1c zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde für 60 Sekunden verwirbelt und geschüttelt und dann bei 13000 × g für 10 Minuten bei 20°C zentrifugiert.
  • Zwei Schichten wurden erzeugt, mit dem erforderlichen Protein in der Grenzfläche zwischen den zwei Schichten. Die obere Schicht wurde vorsichtig entfernt, 300 μl Methanol zugegeben und das Röhrchen umgekehrt, gefolgt von Zentrifugation für 5 Minuten bei 13.000 g bei 4°C, um das Protein zu pelletisieren. Das Methanol wurde entfernt und das Pellet konnte an der Luft für 5 bis 10 Minuten trocknen.
  • Im Anschluß daran wurde das Pellet unter Verwendung von 1D-Lysepuffer wieder löslich gemacht (63 mM Tris.HCl pH 7,4, 10 % Glycerol, 2 % SDS, 0,0025 % Bromphenol Blue, 2 % Mercaptoethanol).
  • 1e – 1D-Geltechnologie
  • Protein- oder Membranpellets wurden in 1D-Probenpuffer (1 bis 2 μg/μl) löslich gemacht. Der Probenpuffer und das Proteingemisch wurden dann für 3 min auf 95°C erhitzt.
  • Ein 9 bis 16%iges Acrylamidgradientengel wurde mit einem Sammelgel und einem Sammelkamm gemäß der Verfahrensweise gegossen, die in Ausubel F. M. et al., Hrsg., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Bd. II, Green Publishing Associates, Inc., und John Wiley & Sons, Inc., New York, Abschnitt 10.2, die hierin in ihrer Gesamtheit durch Verweis aufgenommen werden, beschrieben ist.
  • 30 bis 50 Mikrogramm des Proteingemisches, erhalten aus Detergens. und die Molekulargewichtsstandards (66, 45, 31, 21,14 kDa) wurden zu dem Sammelgellöchern unter Verwendung einer 10 Mikroliter Pipettenspitze zugegeben und die Proben liefen bei 40 mA für 5 Stunden.
  • Die Platten wurden dann aufgebrochen, das Gel in eine Schale mit Fixiermittel gegeben (10 % Essigsäure, 40 % Ethanol, 50 % Wasser) und über Nacht geschüttelt. Im Anschluß daran wurde das Gel durch 30 Minuten Schütteln in einer Primerlösung (7,5 % Essigsäure (75 ml), 0,05 % SDS (5 ml von 10 %)) vorbereitet. Das Gel wurde dann mit einem fluoreszierenden Farbstoff (7,5 % Essigsäure, 0,06 % OGS firmeneigener Farbstoff (600 μl) unter Schütteln für 3 h inkubiert. Sypro Red (Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon) ist ein geeigneter Farbstoff für diesen Zweck. Ein bevorzugter fluoreszierender Farbstoff wird in der US-Anmeldung Nr. 09/412,168, eingereicht am 5. Oktober 1999, die hierin in ihrer Gesamtheit durch Verweis aufgenommen ist, offenbart.
  • Eine computerlesbare Darstellung wurde durch Abbildung der fluoreszierend verfärbten Gele mit einem Apollo 3 Scanner hergestellt (Oxford Glycosciences, Oxford, UK). Dieser Scanner wurde aus dem Scanner entwickelt, der in WO 96/36882 und in den Ph.D.-Thesen von David A. Basiji, mit dem Titel „Development of a High-throughput Fluorescence Scanner Employing Internal Reflection Optics and Phase-sensitive Detection (Total Internal Reflection, Electrophoresis)", University of Washington (1997), Bd. 58/12-B of Dissertation Abstracts International, Seite 6686, dessen Inhalte hierin jeweils durch Verweis aufgenommen sind, beschrieben ist. Die jüngste Ausführungsform dieser Vorrichtung umfaßt die folgenden Verbesserungen: Das Gel wird durch den Scanner auf einem Meßspindel-Antriebssystem transportiert. Dies ist gegenüber dem Legen der Glasplatte auf das riemengetriebene System, das in den Basiji-Thesen beschrieben wird, bevorzugt, da es ein reproduzierbares Mittel zum genauen Transport des Gels hinter der Abbildungsoptik bereitstellt.
  • Das Gel wird in dem Scanner vor drei Ausrichtungsstopps gesichert, die die Glasplatte in einer bekannten Position fest halten. Dadurch kann zusammen mit dem obigen genauen Transportsystem und der Tatsache, daß das Gel an die Glasplatte gebunden wird, die absolute Position des Gels vorhergesagt und aufgezeichnet werden. Dies stellt sicher, daß die genauen Koordinaten von jedem Merkmal auf dem Gel einem Schneidroboter zur Exzision des Merkmals übermittelt werden können. Dieser Schneidroboter weist eine identische Montieranordnung für die Glasplatte auf, um die Positionsgenauigkeit zu halten.
  • Der Träger, der das Gel an der Stelle hält, weist integrale fluoreszierende Marker auf (bezeichnet als M1, M2, M3), die verwendet werden, um die Bildgeometrie zu korrigieren, und ein Qualitätskontrollmerkmal sind, um zu bestätigen, daß das Scannen korrekt durchgeführt worden ist.
  • Die optischen Komponenten des Systems sind umgekehrt worden. Der Laser, der Spiegel, der Wellenleiter und andere optische Bestandteile liegen nun über der Glasplatte, die gescannt wird. Die Ausführungsform der Basiji-Thesen weist diese darunter auf. Die Glasplatte wird daher auf der Scannergelseite nach unten montiert, so daß der optische Weg durch die Glasplatte bleibt. Dadurch werden jegliche Teilchen des Gels, die von der Glasplatte abbrechen können, eher auf den Grund der Vorrichtung als in die Optiken fallen.
  • Beim Scannen der Gele wurden sie aus dem Färbemittel entfernt, mit Wasser gespült und kurz in Luft getrocknet und auf dem Apollo 3 abgebildet. Nach der Abbildung wurden die Gele in Polyethylenbeuteln, die ein geringes Volumen an Färbelösung enthielten, eingeschlossen und dann bei 4°C gelagert.
  • Die scheinbaren Molekulargewichte wurden durch Interpolation von einer Gruppe von bekannten Molekulargewichtsmarkern, die längsseits der Proben liefen, berechnet.
  • 1f – Rückgewinnung und Analyse von ausgewählten Proteinen
  • Proteine wurden mittels eines Roboters von den Gelen durch das Verfahren, das in US-Patent Nr. 6,064,754, Abschnitte 5,4 und 5,6; 5,7; 5,8 beschrieben ist (hierin durch Verweis aufgenommen), entfernt, wie auf 1D-Elektrophorese anwendbar, unter folgender Modifikation der Roboter-Schneidmaschine: die Schneidmaschine beginnt an der Oberseite der Spur und schneidet eine Gelscheibe mit einem Durchmesser von 1,7 mm von der linken Kante der Spur. Die Schneidmaschine bewegt sich dann 2 mm nach rechts und 0,7 mm nach unten und schneidet eine weitere Scheibe. Dies wird dann wiederholt. Die Schneidmaschine bewegt sich dann zurück auf eine Position direkt unter dem ersten Gelschnitt, aber versetzt um 2,2 mm nach unten, und die Muster der drei diagonalen Schnitte werden wiederholt. Dies wird für die vollständige Länge des Gels fortgesetzt.
  • ANMERKUNG: Wenn beobachtet wird, daß sich die Spur signifikant verbreitert, dann kann eine Korrektur ebenso seitwärts gemacht werden, d. h. anstelle der Rückführung auf eine Position direkt unter einem vorhergehenden Gelschnitt, kann der Schnitt leicht versetzt nach links (auf der linken Seite der Spur) und/oder rechts (auf der rechten Seite der Spur) erfolgen. Die Proteine, die innerhalb der Gelfragmente enthalten sind, wurden verarbeitet, um tryptische Peptide zu erzeugen; partielle Aminosäuresequenzen von diesen Peptiden wurden durch Massenspektroskopie bestimmt, wie in WO 98/53323 und Anmeldung Nr. 09/094,996, eingereicht am 15. Juni 1998, beschrieben.
  • Proteine wurden verarbeitet, um tryptische Digestionspeptide zu erzeugen. Tryptische Peptide wurden durch Massenspektrometrie unter Verwendung eines PerSeptive Biosystems Voyager-DETM STR Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) Massenspektrometers analysiert, und ausgewählte tryptische Peptide wurden durch Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) unter Verwendung eines Micromass Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) Massenspektrometers (Micromass, Altrincham, U.K.), ausgestattet mit einer NanoflowTM Elektrosprüh-Z-Sprühquelle, analysiert. Für partielle Aminosäuresequenzierung und -identifikation von BCMPs wurden nicht ausgewertete Tandem-Massenspektren von tryptischen Peptiden unter Verwendung des SEQUEST Suchprogramms (Eng et al., 1994, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 5: 976–989), Version v.C.1, gesucht. Kriterien für die Datenbankidentifikation umfaßten: die Spaltungsspezifität von Trypsin; die Detektion einer Reihe von a-, b- und y-Ionen in Peptiden, die aus der Datenbank zurückkamen, und eine Massezunahme für alle Cys-Reste, die der Carbamidomethylierung zuzuordnen ist. Die durchsuchte Datenbank war eine Datenbank, erstellt aus Proteineinträgen in der nicht-redundanten Datenbank, gehalten von der National Centre for Biotechnology Information (NCBI), die unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ zugänglich ist. Nach der Identifikation von Proteinen durch Spektral-Spektral-Korrelation unter Verwendung des SEQUEST-Programms wurden die Massen, die in MALDI-TOF Massenspektren detektiert wurden, tryptischen Digestionspeptiden innerhalb der identifizierten Proteine zugeordnet. In Fällen, wo keine Aminosäuresequenzen durch Suchen mit nicht ausgewerteten MS/MS-Spektren von tryptischen Digestionspeptiden unter Verwendung des SEQUEST-Programms identifiziert werden konnten, wurden Tandem-Massenspektren der Peptide unter Verwendung von in der Technik bekannten Verfahren manuell ausgewertet. (In dem Fall der Auswertung von Niedirig-Energie-Fragmentationsmassenspektren von Peptidionen siehe Gaskell et al., 1992, Rapid Commun. Mass Spectrom. 6: 658–662).
  • BEISPIEL 2: Mapping von Genen in genomischen DNA-Sequenzen mittels Massenspektrometrie-abgeleiteten Tandemspektren von Trypsin-digerierten Proteinfragmentens
  • Massenspektrometrie
  • Für BCMP81 wurden tryptische Digestionen von Proteinen, ausgeschnitten aus dem 1D-Gel, durch MALDI-TOF-MS (Voyager STR, Applied Biosystems, Framingham, MA) unter Verwendung eines 337-nm-Wellenlängen-Lasers zur Desorption und des Analyse-Reflektronmodus analysiert. Eine gewählte Masse ([M+H] = 1557,81) wurde ferner durch Tandem-Massenspektrometrie unter Verwendung eines QTOF-MS, ausgestattet mit einer Nanosprühionenquelle (Micromass UK Ltd, Manchester), charakterisiert. Vor der MALDI-Analyse wurden die Proben entsalzen und unter Verwendung von C18 Zip TipsTM konzentriert (Millipore, Bedford, MA). Die Proben für Tandem-MS wurden unter Verwendung eines Nano-LC-Systems (LC Packings, Amsterdam, Niederlande), das C18-SPE-Material aufnimmt, gereinigt.
  • Das Tandemspektrum wurde manuell analysiert (Biemann K, Sequencing of Peptide by Tandem Maß Spectrometry and high energy collision induced dissociation, Methods Enzymol 1990; 193: 455–79), um die partielle Positionsaminosäuresequenz zusammen mit den Massen, die an den N- und C-Enden der Peptidfragmente verbleiben, zu bestimmen (Tabelle 4).
  • Tabelle 4 Aminosäuresequenzinformation, abgeleitet von Tandem-Massenspektrometrieanalvse von BCMP81
    Figure 00980001
    • aDie „Kernsequenz" ist eine partielle Aminosäuresequenz eines Peptids, ermittelt aus der Auswertung des Fragmentmassenspektrums des Peptids.
    • bDie N-terminale Masse des Peptids ist die Masse zwischen dem Start der Kernsequenz und dem N-Terminus des Peptids.
    • cDie C-terminale Masse ist die Masse zwischen dem Ende der Kernsequenz und dem C-Terminus des Peptids.
  • Es wurde festgestellt, daß die Sequenz, die aus dem Tandemspektrum abgelesen wird (MEQQQQLQQR), in einer Translation von menschlicher genomischer DNA aus der Zugangs-Nr. AL021707 vorliegt (zugänglich unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/), ausgehend an der Nukleotidposition 55443 (BLAST, Altschul, Stephen F., Gish, Warren, Miller, Webb, Myers, Eugene W. und Lipman, David J. (1990). Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215 403–410. Gapped BLAST ist beschrieben in Altschul, Stephen F., Madden, Thomas L., Schaffer, Alejandro A., Zhang, Jinghui, Zhang, Zheng, Miller, Webb und Lipman, David J. (1997). GappedBLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25(17); 3389–3402).
  • Eine weitere Untersuchung von Sequenzen, die um dieses Protein herum angeordnet sind, identifiziert DNA-Sequenzen, die so translatiert werden können, daß sie einem zusätzlichen MALDI-Massenspektrum entsprechen. Dieses Massenspektrum wurde in eine konzeptionelle Aminosäuresequenz (LWGLTEMFPER) umgewandelt, wobei die Masse davon dem potentiellen Trypsinfragment entspricht, das aus der DNA-Sequenz translatiert werden kann (1). Daher werden zwei Sektoren dieser Streckung von genomischer DNA hinsichtlich der Leserahmen definiert, z. B. folgt der Sequenz, die aus dem Tandem-Massenspektrum abgeleitet ist, eng ein Stoppcodon bei der Translation der genomischen DNA, was entweder angibt, daß dies das Ende des Gens ist, oder daß es ein Intron an dieser Position gibt. Jedoch muß jedes mögliche Intron nach dem R-Rest an dem C-Terminus des Tandemspektrums beginnen.
  • Die genomische DNA-Sequenz, die 2 kb von jeder Seite der Sequenzen, die das Tandemspektrum anpassen, entspricht, wurde verwendet in einer BLAST-Suche gegen Expressed Sequences Tags (ESTs) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). EST AA316462 entspricht zu > 99 % Regionen dieser genomischen Sequenz und unterstützt die Identifikation der Intron- und Exongrenzen. Diese Anordnung identifiziert 4 Exon, aber die EST-Sequenzen sind nicht von ausreichender Qualität, um die Proteinsequenz des gesamten Gens zu bestimmen, noch sind sie ausreichend gut genug, um die Intron-/Exongrenzen genau zu positionieren, insbesondere in Abwesenheit jeglicher homologer Sequenzen. Ein endgültiges Massenspektrum kann an eine Translation der genomischen Sequenz (GDAEKPEEELEEDDDEELDETLSER) angepaßt werden, sobald eine konzeptionelle Spleißstelle von 54575 (DDEe (ag)/gt) bis 54805 (e(ag)/LDET) in AL021707 gemacht wurde, die annähernden Positionen dieser Spleißstellen sind aus den ESTs bestimmt worden.
  • Es gibt eine CpG-Insel, ausgehend von Position 54283 in AL021707. CpG-Inseln in menschlichen genomischen DNA-Sequenzen geben oftmals Regionen an, wo Gene beginnen können (z. B. Kundu TK, Rao MR, CpG islands in chromatin organization and gene expression. J Biochem (Tokyo) 1999 Feb; 125 (2): 217–22). Ein offener Leserahmen ist aus Nukleotid 54461 von AL021707, beginnend mit ATG (Methionin), offensichtlich. Das Stoppcodon in Exon 4 von diesem Gen wird durch den folgenden Leserahmen definiert, der durch die Spektren durch die 3'-EST-Sequenzen aus AA316462 dargestellt ist. Diese Kombination von Spektren, genomischen DNA-Sequenzen und EST-Sequenzen ergibt die beanspruchte Proteinsequenz, die nachstehend angegeben wird (1). Die entsprechende DNA-Sequenz wird nachstehend angegeben (1). Die Positionen der Spektrensequenzen, Introns und Exons innerhalb des genomischen Fragments werden in 2 angegeben. Ein Voll-Längen-Klon wurde identifiziert.
  • Gesamt-RNA-Herstellung
  • Die gesamte RNA wurde aus ca. 108 Zellen von Kulturen von Zellinien MB-MDA468, BT20, PC3, PC3M, T47D und Cal51 unter Verwendung von Trizol (Life Technologies) hergestellt und bei ca. 1 μg μl resuspendiert.
  • cDNA-Klonen
  • Die vorhergesagte codierende Region von BCMP 81 wurde durch PCR unter Verwendung von Primern BCMP 81 F (5'cctacagtcatggctgccgc3') und BCMP 81 R (5'gagacagctcaaacagcaataac3'), 30 ng Brustdrüsen-cDNA (Clontech) und PCR-Reagenzien (Qiagen, UK) unter Verwendung der Kreislaufparameter: 40 Kreisläufe von 95°C für 15 s, 55°C für 1 min amplifiziert. Ein einzelnes 500-bp-Produkt wurde erhalten, von anderen PCR-Reagenzien (Qiagen, UK) säulengereinigt und mit Primern BCMP81 F und BCMP 81 R sequenziert (ABI377, Oxford University Contract Sequencing).
  • Das Voll-Längen-cDNA-Fragment, das für BCMP 81 kodiert, ist von einer Brustdrüsen-cDNA-Bibliothek geklont und sequenziert worden, um die Identität und den Leserahmen zu bestätigen. Das Molekulargewicht des Proteins, das aus dem 1D-Gel geschnitten wurde, betrug zwischen 14 und 19 kDa, bestimmt aus einer Proteinmasse-Leitersequenzierung, wobei die vorhergesehene Masse des konzeptionell translatierten Voll-Längen-Proteins 15,3 kDa beträgt.
  • Obwohl eine CpG-Insel ohne weiteres identifiziert wird und in der GenBank-Angabe in der Region der Peptid/genomische DNA-Entsprechung angegeben wird, wird kein Protein aus diesen DNA-Sequenzen vorhergesehen. Die Peptiddaten ermöglichten eine vollständige Beschreibung des Proteins, der mRNA, die translatiert wird, und der genomischen Struktur des Gens, das es kodiert.
  • mRNA-Profil von BCMP 81 in normalem menschlichem Gewebe und Brust- und Prostatakrebszellinien
  • Echtzeit-RT-PCR wurde verwendet, um BCMP-81-Expression in normalen menschlichen Gewebe-mRNAs (Clontech) und Brustkrebszellinien quantitativ zu messen. cDNAs wurden aus 1 bis 5 μg der gesamten RNA unter Verwendung eines Oligo-dT-Primers und dem Superscript-II-RT-Kit (Life technologies) synthetisiert. Reaktionen, enthaltend 10 ng cDNA, 10 pmol von Sense- (5'gagctagatgagaccctgtc3') und Antisense- (5'gatcataaaggaagtcccaa3') -Primern und SYBR-Grünsequenznachweisreagenzien (PE Biosystems, UK), wurden auf einem ABI7700-Sequenzdetektionssystem (PE Biosystems, UK) analysiert. Die PCR-Bedingungen waren 1 Kreislauf bei 50°C für 2 min, 1 Kreislauf bei 95°C für 10 min, gefolgt von 40 Kreisläufen bei 95°C für 15 s, 55°C für 1 min. Die Akkumulation des PCR-Produkts wurde in Echtzeit als Erhöhung der Reporter-Farbstofffluoreszenz gemessen, und die Daten wurden unter Verwendung des Sequence Detector-Programms v1.6.3 (PE Biosystems) analysiert. Standardkurven, die die anfängliche Matrixkopienzahl in Verhältnis zu der Fluoreszenz und der Amplifikationszyklenzahl setzen, wurden unter Verwendung des amplifizierten PCR-Produktes als Matrix erzeugt und verwendet, um die BCMP 81-mRNA-Kopiezahl in jeder Probe zu berechnen.
  • Die Analyse der mRNA-Gewebeverteilung durch quantitative RT-PCR (Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J. & Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986–994 (1996)) belegt die Quelle des Proteins (MDA-MB468) und sein Potential als ein Brustkrebsantigen, wobei sowohl BT20- als auch MDA-MB468-Zellinien signifikant erhöhte Expression gegenüber normaler Brustdrüse zeigen (3). Der Mangel an EST-Versionen dieses Proteins in öffentlichen Datenbanken spiegelt sich in den allgemein niedrigen mRNA-Kopien wider (im allgemeinen < 200 pro ng cDNA), die in diesen Proben zu sehen sind.
  • BEISPIEL 3: KLONEN DES NEUEN PROTEINS BCMP 11.
  • Massenspektrometrie
  • Proteine, die aus dem 1D-Gel herausgeschnitten wurden, wurden mit Trypsin digeriert und durch MALDI-TOF-MS (Voyager STR, Applied Biosystems) unter Verwendung eines 337-nm-Wellenlängen-Lasers zur Desorption und des Analyse-Reflektronmodus analysiert. Zwei ausgewählte Massen für BCMP 11 ([M+H] = 1245,65 und 941,47) wurden weiter durch Tandem-Massenspektrometrie unter Verwendung eines QTOF-MS, ausgestattet mit einer Nanosprühionengelle, charakterisiert (Micromass UK Ltd.). Vor der MALDI-Analyse wurden die Proben entsalzen und unter Verwendung von C18 Zip TipsTM konzentriert (Millipore). Proben für Tandem-MS wurden unter Verwendung eines Nano-LC-Systems (LC Packings), das C18-SPE-Material aufnimmt, gereinigt.
  • Die Tandemspektren wurden manuell analysiert (Biemann K, Sequencing of peptides by Tandem Mass Spectrometry und high energy collision induced dissociation, Methods Enzymol 1990; 193: 455–79), um die partielle positionale Aminosäuresequenz zusammen mit den Massen, die an den N- und C-Enden der Peptidfragmente verbleiben, zu bestimmen (Tabelle 5).
  • Es wurde festgestellt, daß drei Spektren von Protein BCMP 11 (ein Tandemspektrum, Tabelle 5 und ein MALDI-Massenspektrum, 4a), einer Translation eines EST von einer menschlichen Lungenkarzinombibliothek (Zugangsnummer AI458391) entsprechen, was einen offenen Leserahmen (ORF) von 166 Aminosäuren (4a) definiert. Eine BLAST-Suche einer menschlichen EST-Datenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) mit Zugang AI458391 identifizierte mehrere überlappende ESTs, was zusätzliche 5'- und 3'-UTR-Sequenzen bereitstellt. Ein zweites Peptidtandemspektrum von BCMP 11 (Tabelle 5) identifizierte eine Abweichung in diesen EST-Sequenzen: das vorhergesehene Codon 146 kodierte entweder für Glutamin oder Arginin in Abhängigkeit davon, welches EST translatiert wurde. Das Tandemspektrum zeigt deutlich, daß das Arginin in dem isolierten Protein vorliegt; wobei das Glutamin entweder ein Sequenzierfehler oder Polymorphismus ist. Tabelle 5. Aminosäuresequenzinformationen, abgeleitet von Tandem-Massenspektrometrieanalyse von BCMP 11
    Figure 01020001
    • aDie „Kernsequenz" ist eine partielle Aminosäuresequenz eines Peptids, ermittelt aus der Auswertung des Fragmentmassenspektrums des Peptids.
    • bDie N-terminale Masse des Peptids ist die Masse zwischen dem Start der Kernsequenz und dem N-Terminus des Peptids.
    • cDie C-terminale Masse ist die Masse zwischen dem Ende der Kernsequenz und dem C-Terminus des Peptids.
  • Ein Voll-Längen-Klon wurde durch PCR aus T-47D-cDNA (4A) amplifiziert.
  • Herstellung der Gesamte-RNA und cDNA-Synthese
  • Die gesamte RNA wurde aus kultivierten Zellen und Gewebeproben unter Verwendung eines Trizolreagens (Life Technologies) gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt und in RNAse-freiem Wasser bei einer Konzentration von 1 μg/μl resuspendiert. 1 bis 5 μg der gesamten RNA wurden als eine Matrize für die cDNA-Synthese unter Verwendung eines Oligo-dT-Primers und des Superscript II-reversen-Transkriptionskits (Life Technologies) verwen det. cDNAs wurden säulengereinigt (Qiagen) und bei einer Konzentration von 10 ng/μl eluiert.
  • Klonen von BCMP 11 cDNA
  • Das vorhergesehende Voll-Längen-BCMP 11 ORF wurde durch PCR aus T-47D-cDNAs unter Verwendung der folgenden Primer amplifiziert: F, 5'GGCCAAGTCAGCTTCTTCTG 3'; R, 5'GTATTTGTCAATGTGCCAGAGG 3'. Reaktionen, enthaltend 10 ng cDNA, und Reagenzien für PCR (Qiagen) verwendeten die folgenden Kreislaufparameter: 40 Kreisläufe von 94°C für 30 Sekunden, 60°C für 30 Sekunden. Die PCR-Produkte wurden säulengereinigt (Qiagen), in einem T/A-Vektor geklont (Invitrogen) und die Nukleotidsequenz anschließend verifiziert (University of Oxford, Sequencing Facility, UK).
  • Das vorhergesehene BCMP-11-Protein ist stark homolog zu hAG-2, ein neues menschliches Protein, kodiert durch eine cDNA, die aus der MCF-7-Brustkrebszellinie geklont wurde (Thompson, D. A. & Weigel, R. J. hAG-2, das menschliche Homologon des Xenopus laevis Zementdrüsengens XAG-2, wird mit Östrogenrezeptor in Brustkrebszellinien coexprimiert. Biochem. Biophys. Res. Commun. 251, 111–116 (1998)). hAG-2 ist das menschliche Homologon von XAG-2, ein Xenopus laevis Protein, das in der Zementdrüse während der Froschentwicklung exprimiert wird (Aberger, F., Weidinger, G., Grunz, H. & Richter, K. Anterior specification of embryonic ectoderm: the role of the Xenopus cement gland-specific gene XAG-2. Mech. Dev. 72, 115–130 (1998)). hAG-2- und BCMP-11-Proteine sind zu 71 % identisch mit relativ niedriger Sequenzähnlichkeit an den N-Enden (4b). Es ist vorhergesehen worden, daß BCMP 11, wie hAG-2, ein extrazelluläres Protein mit einer N-terminalen Signalsequenz ist (http://psort.nibb.ac.jp).
  • Expression von BCMP 11-mRNA in menschlichen Geweben
  • Wir verwendeten quantitative Echtzeit-RT-PCR (Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J. & Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986–994 (1996); Morrison, T. B., Weis, J. J. & Wittwer, C. T. Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification. Biotechniques 24, 954–958 (1998)), um die Verteilung von BCMP 11 mRNA in normalen menschlichen Geweben und Brustkrebszellinien zu analysieren (5). Die Primer, die für PCR verwendet wurden, waren folgende: Sense, 5' CTGGAGGATTGTCAATACTC 3', Antisense, 5' GCATAAGGTTTAGCATGATG 3'.
  • Reaktionen, enthaltend 10 ng cDNA, hergestellt wie oben beschrieben, SYBR-Grünsequenznachweisreagens (PE Biosystems) und Sense- und Antisense-Primer wurden auf einem ABI7700 Sequenzdetektionssystem (PE Biosystems) analysiert. Die PCR-Bedingungen waren 1 Kreislauf bei 50°C für 2 min, 1 Kreislauf bei 95°C für 10 min und 40 Kreisläufe bei 95°C für 15 s, 55°C für l min. Die Akkumulation des PCR-Produktes wurde in Echtzeit gemessen als Erhöhung der SYBR-Grünfluoreszenz, und die Daten wurden unter Verwendung des Sequence Detector-Programms v1.6.3 (PE Biosystems) analysiert. Standardkurven, die die anfängliche Matrixkopienzahl in Verhältnis zu der Fluoreszenz und dem Amplifikationskreislauf setzen, wurden unter Verwendung des amplifizierten PCR-Produktes als Matrix erzeugt und verwendet, um die BCMP 11-Kopienzahl in jeder Probe zu berechnen.
  • Die höchsten Niveaus an BCMP 11-Expression wurden im Dickdarm (2800 Kopien ng–1 cDNA) beobachtet, mit geringeren Niveaus an Expression in der Brustdrüse, Dünndarm und Luftröhre (295–435 Kopien ng–1 cDNA) (5). BCMP 11-mRNA wurde ebenso detektiert in T-47D-Zellen (1200 Kopien ng–1 cDNA), der Quelle an BCMP 11-Protein, die in dieser Studie verwendet wurde, und die Expression in dieser Zellinie war im Vergleich zu normalem Brustgewebe erhöht. Wenig oder keine BCMP 11-mRNA wurde in den anderen untersuchten Zellinien oder normalen Geweben detektiert.
  • Die Gewebeverteilung von BCMP 11- und hAG-2-mRNA ist sehr ähnlich. Beide Gene zeigen ein begrenztes Muster an Expression in normalen menschlichen Geweben, wobei der Dickdarm die Hauptstelle der Expression für beide Gene ist (5, Thompson, D. A. & Weigel, R. J. hAG-2, the human homologue of the Xenopus laevis cement gland gene XAG-2, is co-expressed with estrogen receptor in breast cancer cell lines. Biochem. Biophys. Res. Commun. 251, 111–116 (1998)). Es wurde gezeigt, daß die hAG-2-Expression koinzident mit der Expression von ER war, und hAG-2-mRNA-Niveaus in MCF7-Zellen erhöhten sich, wenn die Zellen mit Estradiol behandelt wurden (Thompson und Weigel, oben). Ebenso wurde BCMP 11-mRNA in ER-positiven T-47D-Zellen detektiert, aber es wurde keine Expression in den ER-negativen Zellinien CAL51, BT20 und MDA-MB-468 beobachtet (5). Die koinzidente Hochregulierung der zwei stark homologen Gene, die nebeneinander auf Chromosom 7 liegen (siehe Chromosomenlokalisierung nachstehend), läßt auf einen Mechanismus zur koordinierten Kontrolle schließen, der nicht nur mit dem ER-Status, sondern ebenso mit den auf ER gerichteten Therapien wie Tamoxifen verbunden sein kann.
  • Chromosomenlokalisierung
  • Eine BLAST-Suche einer menschlichen genomischen Datenbank mit der BCMP 11-cDNA Sequenz (4a) identifizierte zwei Einträge, AC004993 und AC073333, mit Identität zu den 5'- bzw. 3'-Enden von BCMP 11. Beide Klone sind auf Chromosom 7p21 kartiert worden. Das gesamte hAG-2 ORF kann ebenso auf demselben Contig wie BCMP 11 in Eintrag AC073333 kartiert werden, was zeigt, daß diese stark homologen Gene zusammen mit dem menschlichen Genom geclustert sind.
  • BEISPIEL 4: KLONEN DES NEUEN PROTEINS BCMP 84.
  • Massenspektrometrie
  • Proteine, die aus dem 1D-Gel herausgeschnitten wurden, wurden mit Trypsin digeriert und durch MALDI-TOF-MS (Voyager STR, Applied Biosystems) unter Verwendung eines 337-nm-Wellenlängen-Lasers zur Desorption und des Analyse-Reflektronmodus analysiert. Eine ausgewählte Masse für BCMP 84 ([M+H] = 1667,73) wurde weiter durch Tandem-Massenspektrometrie unter Verwendung eines QTOF-MS, ausgestattet mit einer Nanosprühionenquelle, charakterisiert (Micromass UK Ltd.). Vor der MALDI-Analyse wurden die Proben entsalzen und unter Verwendung von C18 Zip TipsTM konzentriert (Millipore). Die Proben für Tandem-MS wurden unter Verwendung eines Nano-LC-Systems (LC Packings), das C18-SPE-Material aufnimmt, gereinigt.
  • Das Tandemspektrum wurde manuell analysiert (Biemann K, Sequencing of peptides by Tandem Mass Spectrometry and high energy collision induced dissociation, Methods Enzymol 1990; 193: 455–79), um die partielle positionale Aminosäuresequenz zusammen mit den Massen, die an den N- und C-Enden der Peptidfragmente verbleiben, zu bestimmen (Tabelle 6). Tabelle 6 Aminosäuresequenzinformationen, abgeleitet von Tandem-Massenspektrometrieanalyse von BCMP 84
    Figure 01050001
    • aDie „Kernsequenz" ist eine partielle Aminosäuresequenz eines Peptids, ermittelt aus der Auswertung des Fragmentmassenspektrums des Peptids.
    • bDie N-terminale Masse des Peptids ist die Masse zwischen dem Start der Kernsequenz und dem N-Terminus des Peptids.
    • cDie C-terminale Masse ist die Masse zwischen dem Ende der Kernsequenz und dem C-Terminus des Peptids.
  • Es wurde festgestellt, daß die Tandemaminosäuresequenz und drei MALDI-Massespektren einer Translation eines EST aus einer menschlichen Dickdarmkarzinomzellinie entsprechen (Zugangsnummer AA315020) (6). Überlappende ESTs wurden identifiziert, was einen vollständigen ORF von 104 Aminosäuren etablierte. Ein Voll-Längen-Klon wurde durch PCR aus MDA-MB-468-cDNA amplifiziert.
  • Herstellung der Gesamt-RNA und cDNA-Synthese
  • Die Gesamt-RNA wurde aus kultivierten Zellen und Gewebeproben unter Verwendung eines Trizolreagens (Life Technologies) gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt und in RNAse-freiem Wasser bei einer Konzentration von 1 μg/μl resuspendiert. 1 bis 5 μg der gesamten RNA wurden als eine Matrix für die cDNA-Synthese unter Verwendung eines Oligo-dT-Primers und dem Superscript II-reversen-Transkriptionskits (Life Technologies) verwendet. cDNAs wurden säulengereinigt (Qiagen) und bei einer Konzentration von 10 ng/μl eluiert.
  • Klonen von BCMP 84-cDNA
  • Der vorhergesehene Voll-Längen-BCMP 84 ORF wurde durch PCR aus MDA-MB-468-cDNAs unter Verwendung der folgenden Primer amplifiziert: F, 5' ATAGGACAACAGAACTCTCACC3'; R, 5' GCTTCAACGGAACTTTGCAGAG 3'. Reaktionen, enthaltend 10 ng cDNA und Reagenzien für PCR (Qiagen), verwendeten die folgenden Kreislaufparameter: 40 Kreisläufe von 94°C für 30 Sekunden, 60°C für 30 Sekunden. Die PCR-Produkte wurden säulengereinigt (Qiagen), in einen T/A-Vektor geklont (Invitrogen) und die Nukleotidsequenz anschließend verifiziert (University of Oxford, Sequencing Facility, UK).
  • Das vorhergesehene BCMP 84-Protein zeigt Ähnlichkeit mit der S 100-Familie von Calciumbindungsproteinen (z. B. S100A13, Zugangsnummer Q99584, weist 36 % Identität und 67 % Homologie mit BCMP 84 auf), und eine kürzlich identifizierte cDNA (AAG01893), die mit BCMP 84 über den größten Teil ihrer Länge identisch ist, ist S100A14 genannt worden und als ein neues Mitglied der S100-Familie von Calciumbindungsproteinen bezeichnet worden. Jedoch gab es keine Darstellung, daß AAG01893/S100A14 Calcium bindet, und diesem Gen und dem BCMP 84 fehlt es an Calciumbindungsmotiven, die zwischen Mitgliedern dieser Proteinfamilie konserviert sind. Die 2 Aminosäureunterschiede zwischen BCMP 84 und S100A14 sind wahrscheinlich Polymorphismen und entsprechen interindividueller Variationen, die wir in BCMP 84 gefunden haben. Die Analyse der Proteinsequenz offenbart keine Proteinmotive, die eine spezielle Funktion oder zelluläre Lokalisierung für BCMP 84 angeben können.
  • Expression von BCMP 84-mRNA in menschlichen Geweben
  • Wir verwendeten quantitative Echtzeit-RT-PCR (Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J. & Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986–994(1996); Morrison, T. B., Weis, J.T. & Wittwer, C. T. Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification. Biotechniques 24, 954–958 (1998)), um die Verteilung von BCMP 84-mRNA in normalen menschlichen Geweben und Brustkrebszellinen zu analysierten (7). Die Primer, die für PCR verwendet wurden, waren folgende: Sense, 5' TCTGTGCACTCTGTCTTGGA 3', Antisense, 5' TAGCCAGCTCCTCTCTGTT 3'. Reaktionen, enthaltend 10 ng cDNA, hergestellt wie oben beschrieben, SYBR-Grünsequenznachweisreagenzien (PE Biosystems) und Sense- und Antisense-Primer, wurden auf einem ABI7700 Sequenzdetektionssystem (PE Biosystems) analysiert. Sie PCR-Bedingungen waren 1 Kreislauf bei 50°C für 2 min, 1 Kreislauf bei 95°C für 10 min und 40 Kreisläufe von 95°C für 15 s, 55°C für 1 min. Die Akkumulation des PCR-Produktes wurde in Echtzeit als Erhöhung der SYBR-Grünfluoreszenz gemessen, und die Daten wurden unter Verwendung des Sequence Detector-Programms v1.6.3 (PE Biosystems) analysiert. Standardkurven, die die anfängliche Matrixkopienzahl in Verhältnis zu der Fluoreszenz und dem Amplifikationskreislauf setzen, wurden unter Verwendung des amplifizierten PCR-Produktes als Matrix erzeugt und verwendet, um die BCMP-84-Kopienzahl in jeder Probe zu berechnen.
  • Die Verteilung von BCMP 84-mRNA war auf wenige Gewebe begrenzt, wobei die höchsten Niveaus an Expression im Dickdarm, Schilddrüse und Thymusdrüse (260–930 Kopien ng–1 cDNA), und nur geringen Niveaus an BCMP 84-Message in anderen normalen Geweben, einschließlich Brustdrüse, detektiert wurden. BCMP 84-mRNA wurde in BT-20- und MDA-MB-468 Zellen (300 bzw. 1600 Kopien ng–1 cDNA), aber nicht in T-47D- oder CAL51-Brustkarzinomlinien detektiert.
  • Chromosomenlokalisierung
  • Radiation-Hybrid-Mapping
  • Chromosomenlokalisierung des BCMP 84 Gens wurde durch Screening der Genebridge 4 Radiation Hybrid Platte (Research Genetics Inc.) unter Verwendung des folgenden Paars an Primern, abgeleitet von der 3'-untranslatierten Region, erreicht:
    Sense, 5' TCAGCTTCCTTCCCCAGGTC 3';
    Antisense, 5' CCCAGCTCCATTATTCA 3'.
  • Die PCR-Bedingungen zur Amplifikation von BCMP 84-Sequenzen waren Denaturierung bei 94°C für 30 s, gefolgt von Annealing und Extension bei 55°C für 30 s (40 Kreisläufe) unter Verwendung von Taq-DNA-Polymerase (Qiagen) und 25 ng DNA pro Reaktion. Die Primer amplifizierten das erwartete 215 bp Fragment von den positiven Hybridzellinien-DNAs und menschlicher genomischer DNA und amplifizieren nicht das Produkt aus genomischer Hamster-DNA (Kontrolle).
  • Die Radiation-hybrid-mapping-Daten wurden dem Whitehead Institute/MIT Centre for Genome research STS mapping server (http://carbon.wi.mit.edu:8000/cgi-bin/contig/rhmapper.pl) zur Analyse übermittelt.
  • Radiation-hybrid-mapping lokalisierte das BCMP 84-Gen auf Chromosom 1g21 zwischen den STS-Markern AFM291xh1 und AFM220xf8 innerhalb des S100-Calciumbindungsprotein-Genclusters. Daher bezieht es sich deutlich auf diese große Familie von Proteinen, obwohl BCMP 84 nur begrenzte Homologie zu den anderen S100-Familienmitgliedern zeigt und keine offensichtlichen Calciumbindungsdomänen aufweist.
  • BEISPIEL 5: GEWEBEVERTEILUNGSANALYSE
  • MATERIALIEN UND VERFAHREN
  • Quantitative mRNA-Analyse
  • BCMP 7 XAG (AF088867) und 23 NCAM2 (O15394) sollen keinen Teil der Erfindung bilden.
  • Das Niveau an mRNA von BCMPs 7, 17 und 23, d. h. mutmaßlichem sekretiertem Protein XAG (AF088867), BST2 (Q10589) und NCAM2 (O15394) in verschiedenen Zelltypen, wurde durch quantitative Echtzeit-PCR unter Verwendung des Farbstoffes für doppelsträngige DNA, SYBR Green I, unter Verwendung der Methoden und Reagenzien, wie in Morrison et al, Biotechniques (1998) 24: 954–8 beschrieben, unter Verwendung des ABI7700-Sequenzdetektionssystems (PE Biosystems, UK) bestimmt.
  • Zusammenfassend wurde die Quantifikation von mRNA-Niveaus durch Erzeugen einer Standardkurve unter Verwendung des gereinigten (Qiagen, UK) PCR-Produktes als eine Matrix erreicht. PCRs, enthaltend 104, 105, 106 und 107 Matrixmoleküle, wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt, um die Kreislaufanzahl zu bestimmen, bei der das Amplifikationssignal in den log linearen Bereich eintritt (der Schwellenwertkreislauf, Ct). Die Standardkurve definiert daher die Beziehung zwischen Ct und Matrizenkonzentration, und kann verwendet werden, um die anfängliche Matrizenkonzentration in einer unbekannten Probe aus ihrem entsprechenden Ct-Wert abzuleiten. Die Proben liefen in zweifacher Ausfertigung, jeweils unter Verwendung von 10 ng Erst-Strang-cDNA als das Ausgangsmaterial.
  • Die menschlichen Gewebe-cDNAs wurden abgeleitet durch Oligo-dT-geprimte Umkehrtranskription (Superscript II-Life Technologies, UK) von RNAs (Clontech, USA), gesammelt aus mehreren menschlichen Quellen. Die gesamten RNAs für menschliche Zellinien T47D, Cal51, MDA-MB468, PC3, PC3M, und BT20 wurden aus Gewebekulturproben, extrahiert mit Trizol (Life Technologies, UK), erzeugt.
  • Die Primersequenzen, die verwendet werden, um die Niveaus an mußmaßlichem sekretiertem Protein-XAG-, -BST2- und -NCAM2-mRNAs zu messen, waren:
    XAG
    vorwärts agataccacagtcaaacctg
    umgekehrt gcactcatccaagtgatgaa
    BST2
    vorwärts gatggagtgtcgcaatgtcacc
    umgekehrt agacgegtectgaagcttatgg
    NCAM2
    vorwärts gatcatagagctgtcgcagacc
    umgekehrt tgtagtctccttgtccctttcc
  • Ergebnisse
  • Die Ergebnisse werden in den 8 bis 10 gezeigt. In den Figuren bedeutet die Angabe „x10", daß der Wert für die Probe 10 Mal höher als angegeben ist.

Claims (19)

  1. Verwendung von einem Antikörper, der zur immunospezifischen Bindung an BST-2 (BCMP-17) oder an ein Fragment oder Derivat davon fähig ist, welches die Bindungsdomäne des Antikörpers umfasst, für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Brustkrebs.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Antikörper um einen monoklonalen oder humanisierten Antikörper handelt.
  3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Antikörper zu einem therapeutischen Agens oder einem Medikamentenanteil konjugiert ist.
  4. Verwendung von BST-2 (BCMP-17) und/oder einem oder mehreren antigenen oder immunogenen Fragmenten oder Derivat(en) davon, für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder Prophylaxe von Brustkrebs.
  5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei das Medikament dazu in der Lage ist, eine Immunantwort in einem Subjekt hervorzurufen.
  6. Verwendung nach Anspruch 5, wobei das Medikament ein Impfstoff ist.
  7. Verfahren für Screening, Diagnose oder Prognose von Brustkrebs in einem Subjekt, oder für das Überwachen der Wirkung eines Medikaments gegen Brustkrebs oder einer Therapie gegen Brustkrebs, welche(s) einem Subjekt verabreicht wird, welches den quantitativen Nachweis von BST-2 (BCMP-17) in einer Probe von dem Subjekt umfasst.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Probe eine Probe aus dem Brustgewebe ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei der Schritt des quantitativen Nachweises umfasst: a) In Kontakt bringen der Probe mit einem Antikörper, um BST-2 (BCMP-17) zu binden; und b) Nachweisen des gebundenen BST-2 mithilfe eines direkt oder indirekt markierten Nachweisreagens.
  10. Verfahren für Screening, Diagnose oder Prognose von Brustkrebs in einem Subjekt oder für das Überwachen der Wirkung eines Medikaments oder einer Therapie gegen Brustkrebs, welche(s) an ein Subjekt verabreicht wird, wobei das Verfahren umfasst: a) In Kontakt bringen einer oder mehrerer Oligonukleotidesonden, welche 10 oder mehr konsekutive Nukleotide umfassen, die komplementär zu einer Nukleotidsequenz sind, die für BST-2 (BCMP-17) kodiert, mit einer RNA, die aus einer biologischen Probe aus dem Subjekt gewonnen wurde, oder mit cDNA, die von der RNA kopiert wurde, wobei das in Kontakt bringen unter Bedingungen stattfindet, welche die Hybridisierung der Sonde zu der Nukleotidsequenz, falls diese vorliegt, ermöglichen; b) Nachweisen von Hybridisierung, falls stattfindend, zwischen der Sonde und der Nukleotidsequenz; und c) Vergleichen der Hybridisierung, falls stattfindend, wie nachgewiesen in Schritt b), wobei die Hybridisierung in einer Kontrollprobe nachgewiesen wird oder mithilfe eines zuvor festgelegten Referenzbereichs.
  11. Verfahren für Screening, Diagnose oder Prognose von Brustkrebs in einem Subjekt oder für das Überwachen der Wirkung eines Medikaments oder einer Therapie gegen Brustkrebs, welche (s) einem Subjekt verabreicht wird, wobei das Verfahren umfasst: a) In Kontakt bringen mit einer Probe, die auf BST-2 (BCMP-17) getestet werden soll, oder einem oder mehreren antigenen oder immunogenen Fragmenten oder Derivaten davon, und b) Nachweisen des Vorhandenseins von Antikörpern gegen BST-2.
  12. In-vitro-Verwendung von BST-2 (BCMP 17) und/oder einem oder mehreren antigenen oder immunogenen Fragmenten davon, oder einem Antikörper, der zu einer immunospezifischen Bindung an BST-2, oder an ein Fragment oder Derivat davon fähig ist, welches die Bindungsdomäne des Antikörpers umfasst, für Screening, Diagnose oder Prognose von Brustkrebs in einem Subjekt oder für das Überwachen der Wirkung eines Medikaments oder einer Therapie gegen Brustkrebs, welche (s) einem Subjekt verabreicht wird.
  13. Verfahren für Screening von Agenzien gegen Brustkrebs, die mit BST-2 (BCMP-17) oder einem biologisch aktiven Anteil davon interagieren, wobei das Verfahren umfasst: In Kontakt bringen von BST-2 oder einem biologisch aktiven Teil davon mit einem möglichen Agens, und Bestimmen der Fähigkeit des möglichen Agens, mit dem BST-2 oder einem biologisch aktiven Anteil davon zu interagieren.
  14. Verfahren für Screening für Agenzien gegen Brustkrebs, die die Aktivität von BST-2 (BCMP-17) oder einem biologisch aktiven Anteil davon verändern, wobei das Verfahren umfasst: in einem ersten Aliquot, in Kontakt bringen eines möglichen Agens mit BST-2 oder einem biologisch aktiven Anteil davon; und Vergleichen der Aktivität von BST-2 oder einem biologisch aktiven Anteil davon in dem ersten Aliquot nach Zugabe des möglichen Agens mit der Aktivität von BST-2 oder einem biologisch aktiven Anteil davon in einem Kontrollaliquot oder mithilfe eines zuvor festgelegten Referenzbereichs.
  15. Verfahren für Screening von Agenzien gegen Brustkrebs, die die Expression oder die Aktivität von BST-2 (BCMP-17) verändern, welches umfasst: In Kontakt bringen mit einem Enzym, welches verantwortlich ist für die Produktion oder den Abbau von BST-2 mit einem möglichen Agens; Nachweisen von Veränderung der Aktivität des Enzyms.
  16. Verfahren für Screening von Agenzien gegen Brustkrebs, die die Expression oder die Aktivität von BST-2 (BCMP-17) verändern, welches umfasst: In Kontakt bringen mit einer ersten Gruppe von Zellen, die BST-2 mit einem möglichen Agens exprimieren; In Kontakt bringen mit einer zweiten Gruppe von Zellen, die BST-2 mit einem Kontrollagens exprimieren, und Vergleichen des Ausmaßes an Expression oder Aktivität von BST-2 oder Expression von mRNA, die für BST-2 in der ersten und zweiten Gruppe von Zellen kodiert, oder Vergleichen des Ausmaßes an Induktion eines zellulären zweiten Messengers in der ersten und zweiten Gruppe von Zellen.
  17. Verfahren für Screening oder Identifizierung von Agenzien gegen Brustkrebs, die die Expression oder die Aktivität von BST-2 (BCMP-17) verändern, wobei das Verfahren umfasst: Verabreichen eines möglichen Agens an eine erste Gruppe von nicht menschlichen Säugetieren; Verabreichen eines Kontrollagens an eine zweite Gruppe von nicht menschlichen Säugetieren, und Vergleichen des Ausmaßes von Expression oder Aktivität von BST-2 oder Expression von mRNA, die für BST-2 in der ersten und zweiten Gruppe kodiert, oder Vergleichen des Ausmaßes an Induktion eines zellulären zweiten Messengers in der ersten und zweiten Gruppe.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Säugetiere Tiermodelle für Brustkrebs sind.
  19. Verwenden von einem BST-2 (BCMP-17)-Antisense-Nukleotid oder -ribozym, welches mit BST-2 (BCMP-17) bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Brustkrebs interagiert oder dessen Aktivität verändert.
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