DE60025011T2

DE60025011T2 - Dna polymerase lambda und ihre verwendungen

Info

Publication number: DE60025011T2
Application number: DE60025011T
Authority: DE
Inventors: Davila Luis Blanco; Antonio Bernad Miana; Orlando Dominguez Lopez; Miguel Garcia Diaz
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date: 1999-10-01
Filing date: 2000-10-02
Publication date: 2006-08-31
Anticipated expiration: 2020-10-03
Also published as: CA2388363C; DE60025011D1; NZ518458A; ATE313631T1; JP2003511033A; AU770704B2; CA2388363A1; AU770704C; WO2001025442A1; US20120009648A1; AU7541500A; ES2189560A1; ES2189560B1; JP3801917B2; EP1218518B1; EP1218518A1; US7883880B1; ES2258474T3

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifikation und Isolation einer DNA-Polymerase und Verwendungen dieser Polymerase. Insbesondere beschreibt die vorliegende Erfindung die Nucleotidsequenz des menschlichen Gens für DNA-Polymerase λ (Pol-λ), die Aminosäuresequenz von Pol-λ und die Aminosäuresequenz von verschiedenen Isoformen, die aus alternativem Spleißen ihrer mRNA stammen. Die Assoziation mancher dieser Isoformen mit Tumorproben macht Pol-λ zu einem Marker für die Diagnose, Prognose und Entwicklung tumoraler Prozesse.
Hintergrund der Erfindung
Eine der ersten Hypothesen in Bezug auf das Bestehen von DNA-Reparaturmechanismen erwog, dass die in den Keimzellen von multizellulären Organismen vorhandene DNA durch eine wirksame DNA-Reparatur, die mit Meiose assoziiert ist, gegen Schädigung geschützt sei, und demzufolge auch gegen Altern. Andererseits würden Somazellen viel verletzlicher bezüglich DNA-Schädigung sein, da sie über eine geringere Fähigkeit zu DNA-Reparatur verfügen. Nun ist jedoch bekannt, dass es mehrere DNA-Reparaturmechanismen gibt, die ebenfalls auf Niveau der Somazellen wirken und die meisten der Schädigungen und Veränderungen, die am Genom auftreten, eliminieren, und dass exzessive Schädigung oder Dysfunktion dieser Schutzmechanismen zu verfrühtem Altern und Zelltod führen könnte oder auf andere Weise die Proliferation begünstigen könnte, die ein Charakteristikum tumoraler Prozesse ist.
Bei Säugetieren gibt es eine eindeutige Korrelation zwischen der Langlebigkeit verschiedener Spezies und ihrer Kapazität, DNA-Reparatur durchzuführen. Darüber hinaus kann Altern durch Behandlungen, die DNA beschädigen, oder aufgrund von genetischen Defekten an Genen, die in DNA-Reparatur eingebunden sind, beschleunigt werden. Bei Menschen ist einer der Gründe von Alterung die Degeneration des Zentralnervensystems (ZNS), und dies ist verbunden mit seiner extremen Empfindlichkeit gegenüber zytotoxischen Substanzen. Es ist durchwegs bekannt, dass die meisten degenerativen Erkrankungen, die manchmal Symptome frühzeitigen Alterns des ZNS aufweisen, auf eine Akkumulierung von DNA-Schädigung zurückzuführen sind.
Darüber hinaus kann die Fixierung von Mutationen, die auf DNA-Reparaturdefekte zurückzuführen sind (somatische Mutationen), zelluläre Transformation verursachen. Die Karzinogenese ist ein komplexer Prozess, der durch eine Schädigung in der DNA ausgelöst wird, woraufhin die Mutation oder Translokation eines DNA-Segments folgt, und der in einer phänotypischen Transformation der Zelle endet. Es ist umfassend dokumentiert, dass manche normalen Gene (Proto-Onkogene) durch die Wirkung mehrerer Mittel, die DNA-Strangbrüche hervorrufen, tumoral (Onkogene) werden können. Häufig beeinflussen diese Veränderungen direkt die Sequenz des Proto-Onkogens, das zu einer anderen Bruchstelle in einem anderen Chromosom transloziert wird. Wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, sind die meisten Zellen mit DNA-Reparaturmechanismen ausgestattet, die diese genomische Schädigung erkennen und eliminieren. Die Abwesenheit oder Dysfunktion dieser Systeme würde die Möglichkeit von Zelltransformation erhöhen. Poly-ADP-Ribosepolymerase (PARP) wurde als eines der ersten Enzyme erkannt, die in DNA-Reparatur von DNA-Strangbrüchen eingebunden sind. Ihre Aktivität erwies sich in den Nuclei von mit SV40 transformiertem Fibroblasten als höher als in den Kontrollen. In ähnlicher Weise wurde für die enzymatische Aktivität von PARP gezeigt, dass sie in leukämischen Zellen höher war als in normalen Zellen, und dieselbe Steigerung wurde in der Schleimhaut von Patienten mit Kolorektalkarzinom, im Vergleich zu jener, die gesunden Versuchspersonen entnommen wurde, beobachtet (Miwa et al., Arch. Biochem. Biophys. 181, 313-321 (1977); Burzio et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 149, 933-938 (1975); Hirai et al., Cancer Res. 43, 3441-3446 (1983)). Diese Arbeit lässt die Schlussfolgerung zu, dass die DNA-Polymeraseaktivität von PARP nach DNA-Schädigung erhöht ist. Weiters produzierte Inhibition der Polymerisationsaktivität von PARP durch Zusatz von spezifischen Wirkstoffen eine Steigerung von genomischer DNA-Schädigung und des Risikos von onkogener Transformation (Harris, Int. J. Radiat. Biol. 48, 675-690 (1985)). Diese Daten führten zum Vorschlag, PARP als einen tumoralen Marker und auch als einen Indikator für die Prädisposition, Krebs zu entwickeln, zu verwenden; siehe das US-Patent Nr. 5.449.605.
Andererseits wurde erst jüngst gezeigt, dass die nicht-vererblichen Kolorektalkarzinome und etwa 15 % von sporadischen Magentumoren durch die Instabilität repetitiver Sequenzen in der DNA (Mikrosatelliten) charakterisiert sind. Dieser Phänotyp, bezeichnet als Mutator-Phänotyp, geht einher mit einer mehrfach hundertfachen Steigerung spontaner Mutationen (Eshleman et al., Oncogene 10, 33-37 (1995); Eshleman et al., Oncogene 12, 1425-1432 (1996)), die auf die Dysfunktion von Genen zurückzuführen zu sein scheint, die in den Prozess von DNA-Fehlpaarungsreparatur eingebunden sind (Hoffman & Cazaux, Int. J. Oncol. 12, 377-382 (1998); Umar & Kunkel, Eur. J. Biochem. 238, 297-307 (1996)). Somit kann die Grundlage für eine Prädisposition zu Kolonkrebs auf das Bestehen einer Keimlinienmutation (erblich) in manchen jener Gene (hMSH2, hLMH1, PMS1, PMS2, hMSH3 und hMSH6), die für postreplikative Fehlpaarungsreparatur erforderlich sind, aufbauen (Prolla et al., Nature Genetics 18, 276-279 (1998)); eine zweite sporadische Mutation, die als eine Konsequenz einer defekten DNA-Reparatur auftreten könnte, könnte den Mutator-Phänotyp steigern, sofern sie auf das andere Allel desselben Gens oder auf ein anderes Gen, das in DNA-Reparatur eingebunden ist (zweiter Mutator), abzielt, was die weitere Selektion proliferativer Varianten ermöglichen und zu Tumorbildung führen würde. Mehrere Mutationen wurden bereits für zwei menschliche Gene, die in Fehlpaarungsreparatur eingebunden sind (hMSH3 und hMSH6), bei Patienten, die an einem erblichen Kolonkarzinom leiden, beschrieben, die häufig in Rasterverschiebungen bestehen, die an Reihen von aufeinander folgenden Adenin- und Cytosin-Resten auftreten (Yamamoto et al., Cancer Res. 58, 997-1003 (1998)).
Bis heute gibt es keinen Beweis, dass Pol-β an dem Prozess der "Fehlpaarungsreparatur" teilnimmt. Es wurde jedoch eine spezifische Deletion (Aminosäuren 208 bis 236) in der Nähe der aktiven Stelle in einem der Allele von Pol-β gefunden, die mit bestimmten Brust- und Kolorektalkarzinomen assoziiert wird (Battacharyya & Banerjee, P.N.A.S. USA 94, 10324-10329 (1997)). Darüber hinaus weisen 83 % der menschlichen Kolonkarzinome die Gegenwart von Mutationen im Pol-β-Gen auf (Wang et al., Cancer Res. 52, 4824-4827 (1992); Dobashi et al., Hum. Genet. 95, 389-390 (1995)). Auch wurde über Hinweise auf die Existenz von Pol-β-Mutationen in Verbindung mit Blasenkarzinom berichtet, wobei jedoch in diesem Fall auch zusätzliche Mutationen in Verbindung mit Tumor-Suppressorgenen wie p16 und RB vorhanden sind (Matsuzaki et al., Mol. Carcinog. 15, 38-43 (1996)). Die Versuche, die Bedeutung von Pol-β für Tumorgenese zu beweisen, waren nicht erfolgreich, da Keimlinien-Deletion von Pol-β in einem letalen Phänotyp resultierte (Gu et al., Science 265, 103-106 (1994)).
Bis heute wurden 10 eukaryotische zelluläre DNA-Polymerasen beschrieben (DNA-Polymerasen α, β, γ, δ, ε, ζ, η, θ, τ und κ). Von diesen sind die DNA-Polymerasen α, β und ε in DNA-Replikation eingebunden (Wood & Shivji, Carcinogenesis 18, 605-610 (1997)). Die meisten DNA-Reparaturmechanismen haben assoziierte DNA-Syntheseschritte, um die beschädigten Nucleotide zu ersetzen oder um die Enden von gebrochener DNA zu überbrücken. Einer dieser Mechanismen, der häufig in der Zelle verwendet wird, ist "Basenexzisionsreparatur", die leicht modifizierte Basen oder basenfreie Nucleotide eliminiert. Das DNA-Syntheseenzym, das in diesen Vorgang eingebunden ist, scheint Pol-β zu sein, das zusammen mit XRCC1 und DNA-Ligase III wirkt (Dianov & Lindahl, Nature 362, 709-715 (1994); Sobol et al., Nature 379, 183-186 (1996); Nicholl et al., Biochemistry 36, 7557-7566 (1997)). Es gab Vermutungen bezüglich der Existenz eines alternativen Verfahrens in größerem Maßstab, das den Prozessivitätsfaktor PCNA und DNA-Polymerasen δ und ε einbindet. Die Eliminierung von Thymidindimeren und sperrigen Addukten in der DNA, durchgeführt in einem Verfahren, das als "Nucleotidexzisionsreparatur" bezeichnet wird, scheint auch DNA-Polymerasen δ oder ε einzubinden. Auf dieselbe Weise werden DNA-Polymerasen δ oder ε zur Katalyse der postreplikativen Reparatur von Insertionsfehlern (Fehlpaarungsreparatur) zu Hilfe genommen, da dieses Verfahren in Pol-β-defizienten Zellen normal ist. Die Expression von Pol-β, einem Gen für Grundfunktionen, ist konstant und wird weder durch Zellwachstum stimuliert noch vom Zellzyklus gesteuert (Zmudzka et al., Nucleic Acids Res. 16, 9587-9596 (1988)). Da die Fehlpaarungsreparatur mit DNA-Replikation gekoppelt sein muss, sollten beide Vorgänge eindeutig zusammen reguliert werden. Die DNA-Polymerasen ζ, η und θ sind nicht geeignet, um Replikationsfehler zu korrigieren. Dahingegen unterstützen ihre biochemischen Eigenschaften, dass diese Enzyme in die Umgehung von DNA-Läsionen eingebunden sind, die eine Alternative zu DNA-Reparatur darstellt (Lawrence & Hinkle, Cancer Surv. 28, 21-31 (1996); Masutani et al., Nature 399, 700-704 (1999); Sharief et al., Genomics 1, 90-96 (1999)).
Daher bleibt es auf dem Gebiet der Erfindung ein Problem, weitere DNA-Polymerasen zu identifizieren, die in die Gewinnung eines Mutator-Phänotyps eingebunden sind. Diese Polymerasen können klinisch äußerst wichtig für die Bereitstellung von Mitteln zur Identifikation von Personen mit einer Prädisposition für die Entwicklung von Krebs sein, können die Wirksamkeit von klinischer Überwachung für eine frühe Erkennung und Intervention in frühen Stadien verbessern (de la Chapelle & Peltomaki, Annual Rev. Genet. 29, 329-348 (1995)) und neue Strategien für auf diesen Targets basierende Therapien entwickeln. Auch ist es möglich, dass manche dieser DNA-Polymerasen in neurodegenerative Erkrankungen des Zentralnervensystems eingebunden sind, da diese Vorgänge eventuell mit einer defekten oder fehlerauslösende DNA-Reparatur in Verbindung stehen.
Zusammenfassung der Erfindung
Allgemein gesagt offenbart die vorliegenden Erfindung die Nucleinsäuresequenz der menschlichen und Maus-Gene für DNA-Polymerase λ (Pol-λ), die Aminosäuresequenz von Pol-λ und die Aminosäuresequenz für mehrere Isoformen, die aus alternativem Spleißen ihrer mRNA stammen. Die Assoziation von manchen dieser Isoformen mit tumoralen Proben macht Pol-λ zu einem potenziellen Marker für Prognose, Diagnose und Entwicklung mancher tumoraler Prozesse. Eine Allelvariante, die einem einzelnen Nucleotidpolymorphismus, angeordnet in der Nähe der aktiven Stelle, entspricht, und eine Doppelmutation in der Nähe von polyA, die mit Tumorgenese in Verbindung stehen könnte, werden ebenfalls offenbart. Darüber hinaus eröffnet die Tatsache, dass Pol-λ eine DNA-Polymerase mit einer sehr geringen Insertionspräzision ist, die Möglichkeit, dass Fehlregulierung dieses Enzyms die Mutationshäufigkeit des Genoms steigern könnte, sowohl in Keim- als auch in Somazellen. Weiters könnte eine Änderung der Expression von Pol-λ in pathologischen Prozessen, die mit DNA-Reparaturmängeln in Verbindung stehen, die zum Auftreten eines Mutator-Phänotyps führen, relevant sein.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt isoliertes DNA-Polymerase-λ-(Pol-λ-)Polypeptid bereit, das die in Seq.-ID Nr. 4 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst. Dies ist die Wildtyp-Aminosäuresequenz von menschlicher Pol-λ. In anderen verwandten Aspekten stellt die vorliegende Erfindung isolierte Polypeptide bereit, die Isoformen von menschlicher Pol-λ sind, worin die Polypeptide die in den Seq.-ID Nr. 7, 9 und 11 gezeigten Aminosäuresequenzen aufweisen.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung isoliertes DNA-Polymerase-λ-(Pol-λ-)Polypeptid bereit, das die in Seq.-ID Nr. 2 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst. Dies ist die Wildtyp-Aminosäuresequenz von Maus-Pol-λ.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polypeptid bereit, das mehr als 60 % Aminosäuresequenz-Identität mit einer beliebigen der oben genannten Pol-λ-Aminosäuresequenzen aufweist. In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polypeptid bereit, für das Nucleinsäure kodiert, die in der Lage ist, unter stringenten Bedingungen an eine der Nucleinsäuresequenzen, die für menschliche oder Maus-Pol-λ kodieren, oder eine Isoform davon zu hybridisieren.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Substanz bereit, die ein Polypeptid ist, das eine Sequenzvariante oder ein Allel von einem beliebigen der oben genannten Polypeptide ist.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Substanz bereit, die ein Fragment oder ein aktiver Abschnitt eines der oben genannten Polypeptide mit DNA-Polymeraseaktivität ist.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung isolierte Nucleinsäuremoleküle bereit, die für eines der oben genannten Polypeptide kodieren. Die cDNA-Sequenz von menschlicher Pol-λ voller Länge ist in Seq.-ID Nr. 4 gezeigt. Die Maus-Pol-λ-cDNA-Sequenz voller Länge ist in Seq.-ID Nr. 1 gezeigt, und die entsprechende genomische Sequenz ist in Seq.-ID Nr. 3 gezeigt. Die Nucleinsäuresequenzen der menschlichen Isoformen sind in den Seq.-ID Nr. 6, 8 und 10 bereitgestellt.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Nucleinsäuremoleküle mit mehr als 90 % Sequenzidentität mit einer der oben genannten Nucleinsäuresequenzen. In anderen Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung Nucleinsäuresequenzen, die beispielsweise unter stringenten Bedingungen wie hierin offenbart an die in Seq.-ID Nr. 1, 5, 6, 8 oder 10 gezeigte Sequenz hybridisiert.
In weiteren Aspekten stellt die vorliegende Erfindung einen Expressionsvektor, der eine der oben genannten Nucleinsäuren, operabel an Kontrollsequenzen gebunden, um ihre Expression zu steuern, umfasst, und Wirtszellen, die mit den Vektoren transformiert sind, bereit. Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Herstellung von Pol-λ-Polypeptid oder einer Isoform, eines Fragments oder eines aktiven Abschnitts davon, umfassend das Kultivieren der Wirtszellen und das Isolieren des so hergestellten Polypeptids.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Expressionsvektor, der Pol-λ-Nucleinsäure umfasst, zur Verwendung in Verfahren der Gentherapie bereit.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung bereit, die ein Pol-λ-Nucleinsäuremolekül wie hierin definiert umfasst.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung bereit, die ein oder mehrere Pol-λ-Polypeptide wie oben definiert umfasst.
In weiteren Aspekten stellt die vorliegende Erfindung die obigen Pol-λ-Polypeptide oder Nucleinsäuremoleküle zur Verwendung in Verfahren medizinischer Behandlung bereit.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Pol-λ-Polypeptids zum Screenen auf mutmaßliche Verbindungen bereit, die (a) eine biologische Pol-λ-Aktivität gemeinsam haben oder (b) sich an das Pol-λ-Polypeptid binden oder (c) eine biologische Aktivität eines Pol-λ-Polypeptids inhibieren, z.B. um Peptidyl- oder Nicht-Peptidylmimetika der Pol-λ-Polypeptide zu finden, die in der pharmazeutischen Forschung zu Leitverbindungen entwickelt werden können.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Antikörper bereit, die in der Lage sind, sich spezifisch an die obigen Pol-λ-Polypeptide zu binden. Diese Antikörper können in Tests zur Detektion und Quantifizierung der Gegenwart von Pol-λ-Polypeptid, in Verfahren zur Reinigung von Pol-λ-Polypeptiden und als Inhibitoren von biologischer Pol-λ-Aktivität verwendet werden.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart von Pol-λ-Nucleinsäure und/oder Mutationen innerhalb einer Nucleinsäuresequenz in einer Testprobe bereit, das die Detektion der Hybridisierung von Testproben-Nucleinsäure an eine Nucleinsäurensonde, basierend auf den hierin bereitgestellten Pol-λ-Nucleinsäuresequenzen, umfasst.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Amplifikation einer Nucleinsäure-Testprobe bereit, umfassend das Primen einer Nucleinsäure-Polymerasereaktion mit Nucleinsäure, die für ein Pol-λ-Polypeptid wie zuvor definiert kodiert. Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung der obigen Nucleinsäure bei der Suche nach Mutationen in den Pol-λ-Genen, z.B, unter Verwendung von Verfahren wie beispielsweise Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus (SSCP), bereit.
Diese und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden nachstehend näher beschrieben. Als Beispiele werden nun Ausführungsform der vorliegenden Erfindung unter Verweis auf die beiliegenden Figuren näher beschrieben.
Kurzbeschreibung der Figuren
1: Schema des Verfahrens zum Klonieren von menschlichem POLL-Gen. Die verschiedenen Klonierungsschritte werden durch Abgleich der verschiedenen erhaltenen cDNA-Fragmente dargestellt. Die Fragmente 1–3 wurden aus Plazenta gewonnen. Die Fragmente 4–14 stellen Sequenzen dar, die aus der dbEST/GenBank-Datenbank erhalten wurden und die mit den Zugriffsnummern bezeichnet sind. Die als H11886 identifizierte EST wies eine interne Deletion auf. Die Sternchen geben die relative Position der Start- und Stoppcodons an.
2: RT-PCR-Amplifikation der mRNA, die dem menschlichen POLL-Gen entspricht. Spezifische Primer wurden verwendet, um den Abschnitt der mRNA selektiv zu amplifizieren, der Unterschiede in der Spleißung zeigt. M, Größenmarker. a) Amplifikation von Proben, die aus fötalem und erwachsenem Gehirn stammen. b) Amplifikation von Proben, die aus Zelllinien und menschlichen Tumoren erhalten wurden. c) Schematische Darstellung der Spleißvarianten der Pol-λ-mRNA, die durch RT-PCR-Amplifikation identifiziert wurden.
3: RT-PCR-Amplifikation der Spleißvariante D6, entsprechend Pol-λ-mRNA. Die Reaktion wurde unter Verwendung von Spleißungs-spezifischen Primern (die im Text beschrieben werden) durchgeführt, um die Spleißvariante D6 selektiv zu amplifizieren, sowohl in normalen als auch in Tumorgeweben. M, Größenmarker; N, normales Gewebe; T, Tumorgewebe; ?, nicht charakterisiertes Amplifikationsprodukt.
4: RT-PCR-Amplifikation der Spleißvariante D6+7, die Pol-λ-mRNA entspricht. Die Reaktion wurde unter Verwendung von Spleißungs-spezifischen Primern (die im Text beschrieben werden) durchgeführt, um die Spleißvariante D6+7 selektiv zu amplifizieren, sowohl in normalen als auch in Tumorgeweben. M, Größenmarker; N, normales Gewebe; T, Tumorgewebe; ?, nicht charakterisiertes Amplifikationsprodukt.
5: A. Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus-(SSCP-)Analyse, die das Auftreten einer möglichen Allelvariante in der Kodiersequenz von menschlicher Pol-λ aufzeigt. Diese Variante wurde anfangs in einer Ovarialkarzinom-Zelllinie von CLONTECH (Spuren 3 und 4) gefunden. Die Spuren 1 und 2 zeigen ein normales Ovarialgewebe. B. Nach Klonieren und Sequenzieren wurde ein einfacher Nucleotidpolymorphismus (C zu T), angeordnet an Position 1683 der menschlichen Pol-λ-cDNA, beobachtet. Dieser Polymorphismus, der innerhalb der Spanischen Bevölkerung bestätigt wurde, produziert eine Änderung eines Aminosäurerests (Arg438 zu Trp) in einem Abschnitt des Enzyms, der sehr nahe an der aktiven Stelle angeordnet ist.
6: Eine mutmaßliche Allelvariante von menschlicher Pol-λ, assoziiert mit Tumorgenese.
7: zeigt, dass Pol-λ-Polymerisation durch nicht-komplementäre dNTPs stark inhibiert wird (polydT/polydA, 1 mM MnCl₂, Pol λ (PC 0,5 M), 10 min bei 30 °C).
8: zeigt, dass Pol-λ-Polymerisation durch nicht-komplementäre dNTPs unter Verwendung einer polydA/dT-Matrix in Gegenwart von entweder Mangan- oder Magnesium-Ionen stark inhibiert wird.
Detaillierte Beschreibung
Klonieren, Expression und Charakterisierung von Pol λ
Es gilt anzumerken, dass in der Prioritätsanmeldung Pol λ als "Pol κ" bezeichnet wurde und dass im Sinne der einheitlichen Nomenklatur, die seit dem Prioritätsdatum angenommen wurde, die Polymerase der vorliegenden Erfindung auf dem Gebiet der Erfindung und hierin als "Pol λ" bezeichnet wird und das dafür kodierende Gen als "POLL". In der vorliegenden Erfindung bezieht sich "biologische Pol-λ-Aktivität" auf die Aktivität dieser Polypeptide als DNA-Polymerasen.
Die neue DNA-Polymerase (Pol-λ) der vorliegenden Erfindung wurde durch Ähnlichkeitssuchen unter Verwendung der Aminosäuresequenz der Pol X des Virus der Afrikanischen Schweinepest (ASFV) als Sonde identifiziert (Oliveros et al., J. Biol. Chem. 272, 30899-30911 (1997)). Diese virale DNA-Polymerase gehört zur Familie von Pol-β-ähnlichen DNA-Polymerasen, die als die Pol-X-Familie bezeichnet werden. Ein erster Hinweis auf das Bestehen dieser DNA-Polymerase wurde aus dem Fund eines genomischen DNA-Fragments gewonnen, dessen Translation eine geringe, doch signifikante Ähnlichkeit mit Pol-X-Familienmitgliedern zeigte, insbesondere in den am stärksten konservierten Regionen des katalytischen Kerns. Dieses DNA-Fragment (Klon CIT282B21: gb AC003694), das in der Karte der Maus bei Chromosom 19 liegt (Mus musculus), wurde aus den HTGS-(High Throughput Genome Sequences)Datenbanken gewonnen, die ein weiteres 1.849-DNA-Fragment enthielt, wenn Pol-λ identifiziert war. Nach Durchführung weiterer Ähnlichkeitssuchen in der EST-(dbEST/GenBank)Datenbank wurde der erste Beweis für Expression dieser potenziellen DNA-Polymerase erhalten. Unter den ESTs, die Maus-Pol-λ entspricht, wurde eine identifiziert, die möglicherweise für ihre gesamte cDNA kodiert. Diese EST (Klon 1162340; AA692052) wurde beim IMAGE Consortium am LLNL (Lawrence Livermore National Laboratory) erhalten und sequenziert.
Die resultierende Sequenz entsprach einem offenen Leseraster von 2.277 Nucleotiden, die für 573-Aminosäuren-Protein kodieren. Eine zusätzliche Sequenz (59 Nucleotide), die dem 5'-Ende der cDNA entspricht, wurde durch RACE 5', ausgehend von mRNA aus Maus-Hoden, gewonnen.
Somit besteht die dem Pol-λ-Gen (POLL) entsprechende cDNA aus insgesamt 2.336 bp (Seq.-ID Nr. 1) mit einer 5'-untranslatierten Region von 83 bp (Nucleotide 1 bis 83), einer Kodierregion von 1.722 bp (Nucleotide 84 bis 1.805) und einer 3'- untranslatierten Region von 531 bp (Nucleotide 1.806-2.336). Das abgeleitete Protein, Maus-Pol-λ, weist 573-Aminosäuren auf (Seq.-ID Nr. 1 oder 2).
Der Vergleich zwischen der cDNA-Sequenz und jener des genomischen Klons AC003694 ermöglichte es, die Exon-Intron-Organisierung des murinen POLL-Gens zu definieren (siehe Seq.-ID Nr. 3). Dieses Gen erstreckt sich über etwa 8 kb und liegt in der Maus-Karte an Chromosom 19. Diese genomische Sequenz enthält mehrere Mikrosatelliten, die in mehreren Intronen angeordnet sind; (A)12 an den Positionen 1079..1156 und 3088..3138; (CA)32 an den Positionen 3779..3823 und 4914..4982; (GCCTCT)40 an den Positionen 4017..4272; "AT-reich" an den Positionen 1565..1589 und (TGG)n an den Positionen 3874..3901. Das mRNA-Transkript besteht aus 9 Exonen. Das C-terminale Segment, das die Aminosäurereste 247 bis 573 umfasst, zeigt eine hohe Ähnlichkeit mit Mitgliedern der DNA-Polymerase-X-Familie (Ito & Braithwaite, Nucleic Acids Res. 19, 4045-4057 (1991)). Mitglieder dieser Familie sind: Pol-β, die einzige eukaryotische DNA-Polymerase, die selektiv in DNA-Reparatur eingebunden war; AFSV-Pol-X, eingebunden in virale DNA-Reparatur; terminale Desoxynucleotidyltransferase (TdT), eingebunden in die Bildung von Antigenrezeptor-Variabilität. Murine Pol-λ weist eine 32%ige Aminosäuresequenz-Identität mit Pol-β in dem Abschnitt, der abgeglichen werden kann (Aminosäurereste 240 bis 573), auf. Trotz dieses vergleichsweise geringen Werts war es möglich, die Struktur dieser DNA-Polymerase unter Verwendung der Struktur von Pol-β als Matrix zu modellieren und dabei alle Strukturelemente (α-Helices, Kehren und β-Stränge) und die Tertiärfaltung in den vier verschiedenen Unterdomänen, die in Pol-β als "8 kDa", "Finger", "Handteller" und "Daumen" beschrieben sind, beizubehalten. Zusammengefasst gesagt unterstützten sowohl die Primärsequenz als auch die strukturellen Vorhersagen die Hypothese, dass das neu identifizierte Protein eine neue DNA-Polymerase war, die als Pol-λ bezeichnet wurde und die Teil der vorliegenden Erfindung ist.
Andererseits enthalten die ersten 239 Aminosäuren von Pol-λ, die kein Gegenstück in Pol-β haben, eine BRCT-Domäne (Aminosäurereste 34 bis 125). Die BRCT- Domäne wurde erst jüngst als eine beschrieben, die in einfacher oder in Mehrfachkopien entweder im N-Terminus oder im C-Terminus von Proteinen vorhanden ist, die direkt in DNA-Reparatur eingebunden sind oder in Zellzyklussteuerungs-Kontrollpunkte als Reaktion auf DNA-Schädigung eingebunden sind. Es ist wichtig anzumerken, dass die BRCT-Domäne, die anfänglich im BRCA1-Protein identifiziert wurde, auch in anderen Proteinen vorhanden ist, die in Tumorgenese als ECT2-Onkogen, Protein p53BP und menschliches RB eingebunden sind. Bei der Verbindung der BRCT-Domäne mit der katalytischen Domäne (Pol-β-ähnlich) gibt es eine Region, die an den Aminosäureresten Ser und Pro (Reste 126 bis 239) angereichert ist, die keine Ähnlichkeit mit bekannten Proteinen hat und die als ein flexibler Angelpunkt dienen könnte, um die DNA-Polymeraseaktivität mit den verschiedenen Wechselwirkungen, Protein:Protein und Protein:DNA, zu verbinden, die während des Vorgangs der DNA-Reparatur erforderlich sein könnten.
In einem nächsten Schritt exprimierten die Erfinder Pol-λ in transformierten E.-coli-Zellen unter Verwendung eines Vektors, der die vollständige Sequenz der Maus-cDNA enthält, was es ihnen ermöglichte, große Mengen an gereinigter rekombinanter Pol-λ zu erhalten und spezifische polyklonale Antikörper zu erhalten, wobei die Expression des Proteins und die Bildung von Antikörpern, die in der Lage sind, sich spezifisch an Pol-λ-Protein zu binden, Teil der vorliegenden Erfindung ist (siehe unten). Die vorliegende Erfindung umfasst somit u.a. Pol-λ-Gensequenz; Pol-λ-cDNA-Sequenz; Pol-λ-Aminosäuresequenz; Vektor, der Pol-λ-Nucleinsäure umfasst; transformierte Zellen, die Pol-λ exprimieren; und monoklonale und polyklonale Antikörper, die für Pol-λ spezifisch sind.
Die intrinsische, mit Pol-λ assoziierte DNA-Polymeraseaktivität kann unter Verwendung einer In-situ-DNA-Polymerase-Analyse in SDS-Polyacrylamidgelen (Blanco & Salas, P.N.A.S. USA 81, 5325-5329 (1984)) und rohen E.-coli-Extrakten, in denen die Expression von Pol-λ induziert wurde, demonstriert werden. Die DNA-Polymeraseaktivität dieses neuen Enzyms, die die Grundlage für die Anwendung dieser neuen DNA-Polymerase als Werkzeug im Bereich der Molekularbiologie darstellt, bildet einen Teil der vorliegenden Erfindung.
Die Verfügbarkeit von 8 kb von genomischer Pol-λ-Sequenz ermöglichte es den Erfindern, die Sequenz der menschlichen cDNA für Pol-λ (Seq.-ID Nr. 4) zusammen mit der Aminosäuresequenz des kodierten Proteins (Seq.-ID Nr. 5) zu identifizieren und zu bestimmen, die beide einen Teil der vorliegenden Erfindung bilden. Die murinen und Mensch-Homologe von Pol-λ weisen mehr als 80 % Aminosäureidentität auf, die in den am stärksten konservierten Regionen 90 % und im Ser/Pro-reichen flexiblen Angelpunkt 57 % erreicht. Die Identifikation des menschlichen Homologs von Pol-λ basierte anfänglich auf Ähnlichkeitssuchen der dbEST/GeneBank-Datenbank. Unter insgesamt 1.323.073 nicht-redundanten Sequenzen wiesen 11 Einträge signifikante Ähnlichkeit mit Maus-Pol-λ auf. Diese 11 DNA-Fragmente entsprachen fötalen Geweben (Herz, Leber und Milz; 5 Fälle), Säuglingshirn (2 Fälle), Keimzentrum-B-Zellen (1 Fall) und manchen Tumorproben (Kolon-, Brust- und Keimzellen) in den drei verbleibenden Fällen. Hier scheint es wiederum bedeutend zu sein, dass alle ESTs, die Pol-λ entsprachen, aus (entweder normalen oder pathologischen) Geweben mit einem hohen Grad an Proliferation herrührten und daher entsprechend hohe Mengen an Enzymen, die in DNA-Reparatur eingebunden sind, erforderten.
Expression von Pol-λ-mRNA ist in Hoden (sowohl in menschlichen als auch in Maus-Hoden) sehr reichlich, obwohl es in den meisten Geweben eine Basisexpression gibt. Daher lassen die Expressionsdaten darauf schließen, dass die normale oder vorwiegende Funktion dieser DNA-Polymerase die sein könnte, die an Somazellen auftretenden DNA-Brüche zu reparieren und an Meiose, einem Vorgang, der durch programmierte Doppelstrangbrüche in der DNA von Keimzellen ausgelöst wird, teilzunehmen. Eine interessante Möglichkeit, die von der erhöhten Fehlerauslösung herrührt, die während In-vitro-DNA-Polymerisationstests beobachtet wurde, ist, dass die DNA-Synthese, die durch Pol-λ katalysiert wird, mutagen sein könnte, indem sie Mutationen in DNA einführt, die zum für Genomevolution erforderlichen Variabilitätshintergrund beitragen könnten.
Die biochemischen Eigenschaften dieser neuen DNA-Polymerase bilden die Grundlage für ihre mögliche Verwendung als ein neues DNA-Modifikationsenzym in der Molekularbiologie und stellen einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung dar.
Im Gegensatz zu ihrem Maus-Homolog weist menschliche Pol-λ eine signifikante Anzahl an Spleißvarianten auf, die in normalen Geweben, Tumorgeweben und Zelllinien nachgewiesen werden können. Eine dieser ESTs, die menschlicher Pol-λ entspricht (H11886), gewonnen aus Säuglingshirn, scheint die Konsequenz eines alternativen Spleißereignisses zu sein, das bei der Pol-λ-prä-mRNA auftritt und zur Fusion der Exone 5 und 8 sowie zum darauf folgenden Verlust der Exone 6 und 7 führt (Übergehen bestimmter Exone). RT-PCR-Amplifikation unter Verwendung von Primern, die diesen Exonen entsprechen, zeigte die Existenz von zwei Hauptspleißvarianten, die in fötaler cDNA, jedoch nicht in erwachsener cDNA, vorhanden sind, wobei eine von diesen der Auslassung von Exon 6 (D6) und die andere der gleichzeitigen Auslassung der Exone 6 und 7 (D6+7) entspricht (2a). Darüber hinaus wurden dieselben Spleißvarianten und andere größerer Größe durch Amplifikation von cDNA, die aus tumoralen Zelllinien stammt, und von biologischen Proben, die aus menschlichen Tumoren stammen (wie beispielsweise Ovarialkarzinom, Kolon-Adenokarzinom und Brustkrebs), beobachtet (2b). Insgesamt fünf Spleißvarianten wurden charakterisiert. Drei von diesen behalten den ursprünglichen Leseraster bei, und das resultierende Protein ist daher nicht trunkiert. Gemäß der Exon-Intron-Organisation des murinen Gens für Pol-λ entspricht eine der nicht-trunkierten Varianten der Auslassung von Exon 6, und die andere entspricht der gleichzeitigen Auslassung der Exone 6 und 7. Die dritte, nicht-trunkierte Variante wird unter Verwendung einer kryptischen Spleißstelle hergestellt, die innerhalb von Exon 5 der menschlichen Sequenz vorhanden ist. Diese Varianten, die am häufigsten exprimiert werden, sind nachstehend genannt und im Detail beschrieben:

hPOLλdelta5 (Klon-Typ a60b4): weist eine Deletion der Nucleotide 987–1.262 in der cDNA auf; es verliert 87 % von Exon 5, wobei 277 Basen von Position 607 deletiert werden (Seq.-ID Nr. 6); die resultierende Aminosäuresequenz ist in Seq.-ID Nr. 7 gezeigt.
hPOLλdelta6 (Klon-Typ a31m): weist eine Deletion der Nucleotide 1.263–1.436 in der cDNA auf; es verliert Exon 6 vollständig, 175 Basen von Position 26 (Seq.-ID Nr. 8); die resultierende Aminosäuresequenz ist in Seq.-ID Nr. 9 gezeigt.
hPOLλdelta6+7 (Klon-Typ a31c): weist eine Deletion der Nucleotide 1.263–1.565 auf; es verliert die Exone 6 und 7 vollständig (304 Basen von Position 26 (Seq.-ID Nr. 10)); seine resultierende Aminosäuresequenz ist in Seq.-ID Nr. 11 gezeigt.

Die anderen zwei Spleißvarianten sind "a priori" weniger interessant, da sie eine frühe Trunkierung des offenen Leserasters hervorbringen. Um eine selektive Expressionsanalyse von jeder Spleißvariante von Pol-λ in normalen Geweben im Vergleich zu Tumorgeweben durchzuführen, wurden Spleißungs-spezifische Paare von PCR-Primern entworfen. Diese Primer, die in der Lage sind, jede Spleißvariante selektiv zu amplifizieren (siehe Beispiel 2), dienen zur Identifikation derer Gegenwart und derer relativen Menge in verschiedenen biologischen Proben. Verfahren zur Bewertung der relativen Mengen der Varianten sind ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung.
Somit wurde beobachtet, dass Variante D6, die in erwachsenem Gehirn fehlt, in fötalem Gehirn jedoch vorhanden ist, auch in den meisten der analysierten normalen Gewebe (unter Ausnahme von Pankreas) fehlte, dahingegen jedoch in Primärtumoren der entsprechenden Gewebe nachgewiesen werden kann (3).
Die selektive Amplifikation von Variante D6+7 zeigte, dass, da sie in fötalem Gehirn auftritt, jedoch nicht in erwachsenem Gehirn, diese Variante in den meisten normalen Geweben vorhanden ist und in ähnlichen oder leicht größeren Mengen in den entsprechenden Tumoren vorhanden ist (4). Interessanterweise wurde eine neue Variante in erwachsenem Gehirn beobachtet, die der zusätzlichen Beibehaltung von Intron 8 entspricht. Diese neue Isoform ist nur in normalem Pankreas nachweisbar und scheint in Tumorproben auf, die Geweben entsprechen, in denen sie normalerweise fehlt. Das signifikanteste Beispiel ist Kolon, in dem es beim Vergleich von einem normalen Gewebe mit Tumorgewebe zu einer vollständigen Substitution von Isoformen kommt.
Auf der Ebene der Aminosäure führt die Deletion D6+7 zum Verlust eines Teils der Unterdomäne 8 kDa und zum vollständigen Verlust der "Finger"-Unterdomäne, die den Verlust der zwei wichtigen DNA-Bindungsdomänen des Enzyms, der so genannten "Helix-Haarnadel-Helix-Motive", nach sich zieht (Doherty et al., Nucleic Acids Res. 24, 2488-2497 (1996)). Die drei Varianten D5, D6 und D6+7 lassen keine Trunkierung des Proteins entstehen und halten die Unterdomänen aufrecht, die die katalytische Stelle bilden. Daher ist es wahrscheinlich, dass die vorliegenden funktionellen Versionen der Polymerasen, da ihre Polymerisationsdomäne, reduziert auf den minimalen Kern, jenen von ASFV Pol X sehr ähnlich ist, deren Funktionalität bei DNA-Reparatur erst jüngst aufgezeigt wurde (Oliveros et al., J. Biol. Chem. 272, 30899-30911 (1997)). Wie zuvor beschrieben kann das Erhalten eines Mutatorphänotyps, der zu tumoraler Transformation führt, primär auf Änderungen in DNA-Reparaturmechanismen zurückzuführen sein. In der vorliegenden Erfindung wird eine neue menschliche DNA-Polymerase beschrieben, die entweder durch Prävention von DNA-Schädigungsakkumulierung als ein Tumorsuppressor wirken kann oder durch Einführen von Mutationen in die DNA als eine Nebenwirkung ihrer Beteiligung an einem fehlerauslösenden DNA-Reparaturmechanismus direkt zur Tumorgenese beitragen kann. Letztere Annahme wird durch die geringe Insertionspräzision von Pol-λ unterstützt, wenn diese in vitro an unbeschädigten DNA-Matrices getestet wurde. Darüber hinaus können spezifische Isoformen von Pol-λ funktionell sein, indem sie einen Mutatorphänotyp aufweisen, der zur Tumorgenese beitragen könnte. Diese Idee wird durch die spezifische Gegenwart, die durch selektive PCR-Amplifikation identifiziert wurde, von manchen dieser Varianten in Tumorproben unterstützt. Daher können Pol-λ und ihre Isoformen als potenzielle tumorale Marker in Menschen erachtet werden, mit den damit verbundenen Vorteilen sowohl für die Prognose als auch die Diagnose dieser Malignitäten. Andererseits ermöglicht die Expression von jeder dieser Isoformen, die gereinigten Polypeptide zu erhalten, um spezifische Antikörper zu bilden, die dazu dienen könnten, noch spezifischere Verfahren zur Identifikation und Diagnose zu entwickeln, und die ein Teil der vorliegenden Erfindung sind. Weiters ermöglicht die Kenntnis der cDNA-Sequenz, die jeder Isoform entspricht, die Bildung spezifischer Sonden zur Identifikation und Diagnose, die ein Teil der vorliegenden Erfindung sind.
Eine interessante Hypothese, die hierin vorgeschlagen wird, ist, dass die DNA-Polymerasevarianten, die durch alternatives Spleißen hergestellt werden, "Mutator"-DNA-Polymerasen darstellen, die als dominante, fehlerauslösende Versionen wirken könnten, die in der Lage sind, das normale Ausmaß an DNA-Reparatur zu stören und/oder zu verändern und dadurch zelluläre Transformation von jenen Zellen zu induzieren, in denen diese Varianten exprimiert werden, oder andere Vorgänge zu begünstigen, die mit einer defizienten DNA-Reparaturkapazität verbunden sind, wie dies in neurodegenerativen Erkrankungen und bei Alterung der Fall ist.
Das Wissen der Erfinder bezüglich des POLL-Gens (das für Pol-λ kodiert) und seiner Expressionsvarianten ermöglicht die Entwicklung von Vorgehensweisen, um die Funktion dieser Enzyme entweder bei der Aufrecherhaltung der normalen zellulären Physiologie oder bei der Förderung von zellulärer Transformation zu testen. Diese Vorgehensweisen basieren auf der Transformation normaler Zellen mit unterschiedlichen Kombinationen von Plasmiden, die spezifische Varianten von Pol-λ überexprimieren, um die Wirkung dieser exprimierten Isoformen auf den zellulären Phänotyp zu untersuchen.
Die Identifikation einer bestimmten Pol-λ-Isoform (oder einer Kombination von Isoformen), die in der Lage ist, pathologischen Phänotyp zu induzieren, liefert ein neues Target zur Störung jener Prozesse, die mit Defekten der DNA-Reparatur (neurodegenerative Erkrankungen, Krebs) zusammenhängen, und stellt einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung dar. Andererseits ermöglicht die Verfügbarkeit von Pol-λ-transformierten Zellen, die einen tumoralen Phänotyp aufweisen, die Entwicklung spezifischer Inhibitoren, die als therapeutische Verbindungen dienen könnten.
Weiters dient die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte Offenbarung von Pol-λ dazu, ein Modell von Pol-λ-Defizienz in einer Maus (Knock-out) zu bilden, in der dieses Gen selektiv deletiert sein kann (Schawartzberg et al., Science 246, 799-803 (1989)), das zur Untersuchung der Induktion von Pathologien und zur Identifikation neuer therapeutischer Verbindungen sehr nützlich sein kann.
In Ähnlichkeitssuchen, die in der dbEST/GeneBank durchgeführt werden, um nach jenen ESTs zu suchen, die der menschlichen Pol-λ entsprechen und die Information entsprechend dem 3'-Ende der mRNA enthalten, wurden zahlreiche ESTs gefunden. Die bestehenden ESTs trugen die Identifikationszahlen: AI970471; AA576526; AI199486; AI123218; AA989195; AI091150; AA922738; W69567; AI560660; AI612820; AA927738; AA742404; R16877; H11524; T81488; R71372; AI538103; AA807380; AA991853; AA468875.
Unter diesen 20 Sequenzen entsprechen 9 normalen Geweben, während die verbleibenden 11 Sequenzen Tumoren unterschiedlichen Ursprungs entsprechen.
Der Nucleotidsequenzabgleich dieser 20 ESTs zeigte die Existenz einer Doppelmutation in 7 Fällen. Diese Doppelmutation trat in allen Fällen in den Nucleotiden T2576 und G2579 auf, die nur durch zwei Nucleotide getrennt sind (Seq.-ID Nr. 12). Ebenfalls in allen Fällen waren diese zwei Nucleotide identisch substituiert: T2576 → C und G2579 → T. Keine der 7 mutierten Sequenzen entspricht den aus normalen Geweben gewonnenen ESTs (insgesamt 9 ESTs), während alle von diesen den ESTs entsprechen, die aus Tumoren gewonnen wurden (7 Sequenzen, die Mutationen aus 11 Proben sind). Die mutierten ESTs trugen die Identifikationsnummer: AI970471; AA576526; AA922738; AI612820; AA927738; AI538103; AA468875. Drei der letztgenannten stammen aus Keimzelltumoren, eine aus Ovarialtumor, eine aus Uterus-Adenokarzinom und die zwei anderen aus Brust- und Kolonkarzinomen. In manchen Nucleinsäure-Ausführungsformen der Erfindung sind diese ESTs von der vorliegenden Erfindung ausgenommen.
Daher, und ohne ausführlichere und signifikantere statistische Analyse, erreicht die Häufigkeit dieser Doppelmutation in Tumorproben unterschiedlicher Natur den überraschend hohen Wert an 64 %. Die vernünftigste Interpretation ist, dass diese Doppelmutation einer Allelvariante mit einer hohen Verbindung oder Wahrscheinlichkeit, Tumoren zu entwickeln, entspricht. Diese Korrelation könnte die Konsequenz einer veränderten Stabilität der Pol-λ-mRNA bei jenen Individuen sein, die die Allelvariante in sich tragen, was eine defiziente Pol-λ-Funktion und daher eine mangelhafte Kapazität der Zelle mit sich bringen könnte, spezifische Prozesse der DNA-Reparatur durchzuführen. Die Identifikation dieser Doppelmutation in menschlichen biologischen Proben durch verschiedene molekularbiologische Verfahren, wie beispielsweise In-situ-Hybridisierung oder PCR, ermöglicht die frühe Erkennung jener Individuen, die die Mutation in sich tragen, was die Definition geeigneter Kontroll- und Überwachungsstrategien in einer Risikobevölkerung erleichtert.
Unter Verwendung einer Gruppe somatischer Zellhybride (Maus/Mensch) wurde das menschliche Pol-λ-Gen anfänglich in der Karte an Chromosom 10 festgelegt. Mittels Radiation-Hybriden wurde diese Kartenposition noch genauer als Position 10q24 bestimmt. Diese Region weist eine sehr hohe Häufigkeit an molekularen Veränderungen, hauptsächlich Deletionen und Neuanordnungen, auf.
Die Existenz von mehr als 7 Bruchstellen in einer Region von nur 9 kb lässt auf die Gegenwart eines benachbarten Gens schließen, dessen Aktivierung selektive Vorteile verleihen würde. Dieselbe Region, 10q24, ist in Translokationen in akuter lymphoblastischer T-Zellen-Leukämie eingebunden (Park et al., Genes Chromosomes Cancer 4, 32-40 (1992)) und ist in einem hohen Anteil von Prostata-Tumoren (Ford et al., Cancer Genet. Cytogenet. 102, 6-11 (1998)) und menschlichem Gliom (Chernova et al., Cancer Genet. Cytogenet. 105, 60-68 (1998)) häufig deletiert. Schließlich gilt es anzumerken, dass Pol-λ ein signifikantes Expressionsniveau in menschlichem Gehirn, insbesondere in Neuronen, aufweist. Darüber hinaus unterscheidet sich das Muster von Isoformen im Vergleich verschiedener Entwicklungsstadien (fötal im Vergleich zu erwachsen) (2a). Unter Annahme einer Rolle von Pol-λ in der DNA-Reparatur und der Tatsache, dass eine DNA-Reparaturdefizienz die Grundalge für neurodegenerative Erkrankungen darstellen könnte, kann angenommen werden, dass sporadische oder erbliche Veränderungen der neuen, in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Polymerase für das Auftreten und die Entwicklung der Erkrankung maßgeblich sein kann. Daher eröffnet ein umfassendes Wissen bezüglich der Funktion und Regulation von Pol-λ neue Wege für die Diagnose und Therapie dieser Krankheitsbilder.
Pol-λ-Nucleinsäure
"Pol-λ-Nucleinsäure" umfasst ein Nucleinsäuremolekül, das eine Nucieotidsequenz aufweist, die für ein Polypeptid kodiert, das die in Seq.-ID Nr. 1 oder Nr. 4 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst. Die Pol-λ-Kodiersequenz kann die in Seq.-ID Nr. 1 oder Nr. 4 gezeigte Sequenz voller Länge sein, eine komplementäre Nucleinsäuresequenz, oder sie kann eine Mutante, ein Derivat oder Allel dieser Sequenzen sein. Die Sequenz kann sich von jener abgebildeten durch eine Änderung unterscheiden, die eine oder mehrere Änderungen, ausgewählt aus Insertion, Deletion und Substitution, von einem oder mehreren Nucleotiden der gezeigten Sequenz darstellt. Änderungen an einer Nucleotidsequenz können in einer Aminosäureänderung auf Proteinebene resultieren oder nicht, wie durch den genetischen Code bestimmt wird. Somit kann Nucleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung eine Sequenz umfassen, die sich von der in Seq.-ID Nr. 1 oder Nr. 4 gezeigten Sequenz unterscheidet und dennoch für ein Polypeptid mit derselben Aminosäuresequenz kodiert.
Andererseits kann das kodierte Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfassen, die sich in einem oder mehreren Aminosäureresten von der in Seq.-ID Nr. 1 oder Nr. 4 gezeigten Aminosäuresequenz unterscheidet. Nucleinsäure, die für ein Polypeptid kodiert, das ein(e) Aminosäuresequenz-Mutante, -Variante, -Derivat oder -Allel der in Seq.-ID Nr. 1 oder Nr. 4 gezeigten Sequenz mit zumindest 60 % Sequenzidentität mit der in Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 4 gezeigten Aminosäuresequenz ist, ist weiters durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt. Solche Polypeptide werden nachstehend erläutert. Nucleinsäure, die für solch ein Polypeptid kodiert, weist vorzugsweise zumindest 80 % Sequenzidentität mit der in Seq.-ID Nr. 1 oder Nr. 4 gezeigten Kodiersequenz, noch bevorzugter zumindest 90 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 95 % Sequenzidentität und am meisten bevorzugt zumindest 98 % Sequenzidentität, auf.
Im Allgemeinen wird Nucleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung als ein Isolat, in isolierter und/oder gereinigter Form oder frei oder im Wesentlichen frei von Material, mit dem es natürlich assoziiert ist, wie beispielsweise frei oder im Wesentlichen frei von Nucleinsäure, die das Gen im menschlichen Genom flankiert, bereitgestellt, unter Ausnahme von möglicherweise einer oder mehreren Regulationssequenz(en) zur Expression. Nucleinsäure kann vollständig oder teilweise synthetisch sein und kann genomische DNA, cDNA oder RNA umfassen. Umfasst Nucleinsäure gemäß der Erfindung RNA, so gilt ein Verweis auf die Sequenz ebenfalls als ein Verweis auf die äquivalente RNA zu verstehen, wobei T durch U substituiert ist.
Nucleinsäuresequenzen, die für das gesamte POLL-Gen oder einen Teil davon kodieren, und/oder seine Regulationselemente können von Fachleuten unter Verwendung der hierin enthaltenen Information und Verweise sowie von Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, leicht hergestellt werden (siehe beispielsweise Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), und Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1992)). Diese Verfahren umfassen (i) die Verwendung von Polymerasekettenreaktion (PCR), um Proben von solcher Nucleinsäure, z.B. aus genomischen Quellen, zu amplifizieren, (ii) chemische Synthese oder (iii) Amplifikation in E. coli. Modifikationen an den Pol-λ-Sequenzen können z.B. unter Verwendung von ortsgerichteter Mutagenese vorgenommen werden, um Expression von modifiziertem Pol-λ-Polypeptid bereitzustellen oder um Codonpräferenz in den Wirtszellen, die zur Expression der Nucleinsäure verwendet werden, zu berücksichtigen.
Um Expression der Pol-λ-Nucleinsäuresequenzen zu erhalten, können die Sequenzen in einen Vektor inkorporiert werden, in dem Kontrollsequenzen operabel an die Pol-λ-Nucleinsäure gebunden sind, um ihre Expression zu steuern. Die Vektoren können andere Sequenzen wie beispielsweise Promotoren oder Enhancer, um die Expression der insertierten Nucleinsäure zu steuern, Nucleinsäuresequenzen, sodass das Pol-λ-Polypeptid als eine Fusion produziert wird, und/oder Nucleinsäure umfassen, die für Sekretionssignale kodiert, sodass das in der Wirtszelle produzierte Polypeptid aus der Zelle sekretiert wird. Pol-λ-Polypeptid kann dann durch Transformieren der Vektoren in Wirtszellen, in denen der Vektor funktionell ist, Kultivieren der Wirtszellen, sodass das Pol-λ-Polypeptid produziert wird, und Gewinnen des Pol-λ-Polypeptids aus den Wirtszellen oder dem umgebenden Medium erhalten werden. Prokaryotische und eukaryotische Zellen werden für diesen Zweck auf dem Gebiet der Erfindung verwendet, umfassend Stämme von E. coli, Hefe und eukaryotische Zellen wie beispielsweise COS- oder CHO-Zellen. Die Auswahl an Wirtszellen kann verwendet werden, um die Eigenschaften des in jenen Zellen exprimierten Pol-λ-Polypeptids zu steuern, z.B. um zu steuern, wo das Polypeptid in den Wirtszellen abgelagert wird, oder um Eigenschaften wie seine Glykosylierung und Phosphorylierung zu beeinflussen.
PCR-Verfahren zur Amplifikation von Nucleinsäure werden im US-Patent Nr. 4.683.195 beschrieben. Im Allgemeinen erfordern solche Verfahren, dass Sequenzinformation von den Enden der Targetsequenz bekannt ist, um solch einen Entwurf geeigneter Vorwärts- und Rückwärts-Oligonucleotidprimer zu ermöglichen, dass sie mit der Polynucleotidsequenz, die das Target für die Amplifikation darstellt, identisch oder ihr ähnlich sind. PCR umfasst Schritte der Denaturierung von Matrix-Nucleinsäure (sofern doppelsträngig), des Anellierens von Primer an Target und der Polymerisation. Die sondierte oder als Matrix in der Amplifikationsreaktion verwendete Nucleinsäure kann genomische DNA, cDNA oder RNA sein. PCR kann verwendet werden, um spezifische Sequenzen aus genomischer DNA, spezifische RNA-Sequenzen und cDNA, die aus mRNA transkribiert ist, Bakteriophagen- oder Plasmidsequenzen zu amplifizieren. Die hierin bereitgestellten Pol-λ-Nucleinsäuresequenzen ermöglichen es Fachleuten, PCR-Primer einfach zu entwerfen. Verweise für die allgemeine Verwendung von PCR-Verfahren umfassen Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51, 263 (1987), Ehrlich (Hrsg.), PCR Technology, Stockton Press, NY (1989), Ehrlich et al., Science 252, 1643-1650 (1991), "PCR protocols; A Guide to Methods and Applications", Innis et al. (Hrsg.), Academic Press, New York (1990).
Die hierin bereitgestellten Nucleinsäuresequenzen sind zur Identifikation von Nucleinsäure von Interesse (und die gemäß der vorliegenden Erfindung sein kann) in einer Testprobe nützlich. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Gewinnung von Nucleinsäure von Interesse bereit, wobei das Verfahren das Hybridisieren einer Sonde, die die gesamte, hierin bereitgestellte Sequenz oder einen Teil davon aufweist, oder eine komplementäre Sequenz, an die Target-Nucleinsäure umfasst.
Der Hybridisierung folgt im Allgemeinen die Identifikation von erfolgreicher Hybridisierung und Isolierung von Nucleinsäure, die an die Sonde hybridisiert hat, was einen oder mehr PCR-Schritte umfassen kann.
Nucleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung ist unter Verwendung einer/s oder mehrerer Oligonucleotid-Sonden oder -Primer, die entworfen wurden, um mit einem oder mehreren Fragmenten der hierin gezeigten Nucleinsäuresequenz zu hybridisieren, insbesondere mit Fragmenten von relativ seltenen Sequenzen, basierend auf Codon-Verwendung oder statistischer Analyse, erhältlich. Ein Primer, der entworfen wurde, um mit einem Fragment der in den beiliegenden Figuren gezeigten Nucleinsäuresequenz zu hybridisieren, kann in Verbindung mit einem oder mehr Oligonucleotiden, die entworfen wurden, um an eine Sequenz in einem Klonierungsvektor zu hybridisieren, innerhalb dessen Target-Nucleinsäure kloniert wurde, oder in einer so genannten "RACE" (rasche Amplifikation von cDNA-Enden), in der cDNAs in einer Bibliothek an einen Oligonucleotid-Linker ligiert wird, verwendet werden, und PCR er folgt unter Verwendung eines Primers, der mit der hierin gezeigten Sequenz hybridisiert, und eines Primers, der an den Oligonucleotid-Linker hybridisiert.
Solche Oligonucleotid-Sonden oder -Primer sowie die Sequenz voller Länge (und Mutanten, Allele, Varianten und Derivate) sind auch zum Screenen einer Testprobe, die Nucleinsäure enthält, auf die Gegenwart von Allelen, Mutanten und Varianten nützlich, insbesondere auf jene, die zur Produktion von inaktiven oder dysfunktionellen Formen von Pol-λ-Protein führen, wobei die Sonden mit einer Targetsequenz aus einer Probe hybridisieren, die aus der zu testenden Person gewonnen wurde. Die Hybridisierungsbedingungen können so gesteuert werden, dass nicht-spezifische Bindung minimiert wird, und vorzugsweise stringente bis mäßig stringente Hybridisierungsbedingungen sind bevorzugt. Fachleute werden mithilfe von Fachliteratur wie beispielsweise Sambrook et al. (1989) und Ausubel et al. (1992) gut in der Lage sein, solche Sonden zu entwerfen, sie zu markieren und geeignete Bedingungen für die Hybridisierungsreaktionen festzulegen.
Die Sonden können sowohl zur Bestimmung des Vorhandenseins von Polymorphismen oder Mutationen in der Pol-λ-Sequenz verwendet werden als auch zur Bestimmung, ob für Pol-λ kodierende mRNA in einer Zelle oder einem Gewebe vorhanden ist. Ein Beispiel für Polymorphismus ist der einfache Nucleotid-Polymorphismus an Position 1389, der in Beispiel 5 im Detail erläutert wird.
Nucleinsäure, die aus einer oder mehreren Zellen (z.B. menschlichen) isoliert und/oder gereinigt ist, oder eine Nucleinsäurebibliothek, die von Nucleinsäure hergeleitet ist, die aus Zellen isoliert und/oder gereinigt wurde (z.B. eine cDNA-Bibliothek, die von aus den Zellen isolierter mRNA hergeleitet ist), kann unter Bedingungen für selektive Hybridisierung sondiert werden und/oder einer spezifischen Nucleinsäure-Amplifikationsreaktion wie beispielsweise Polymerasekettenreaktion (PCR) unterzogen werden.
Im Zusammenhang mit Klonieren kann es für ein oder mehrere Genfragmente erforderlich sein, ligiert zu werden, um eine Kodiersequenz voller Länge zu bilden. Auch wenn ein kodierendes Nucleinsäuremolekül voller Länge nicht erhalten wurde, kann ein kleineres Molekül, das ein Teil des vollständigen Moleküls ist, verwendet werden, um Klone voller Länge zu erhalten. Inserts können aus Teil-cDNA-Klonen hergestellt und verwendet werden, um cDNA-Bibliotheken zu screenen. Die isolierten Klone voller Länge können in Expressionsvektoren subkloniert und die Aktivität durch Transfektion in geeignete Wirtszellen, z.B. mit einem Reporterplasmid, getestet werden.
Ein Verfahren kann Hybridisierung von einer oder mehreren (z.B. zwei) Sonden oder Primern umfassen, um auf eine Nucleinsäure zu zielen. Ist die Nucleinsäure doppelsträngige DNA, so geht der Hybridisierung im Allgemeinen Denaturierung voraus, um einzelsträngige DNA zu bilden. Die Hybridisierung kann Teil eines PCR-Verfahrens darstellen oder Teil eines Sondierverfahrens sein, das keine PCR einbindet. Ein Beispielverfahren wäre eine Kombination von PCR und Hybridisierung bei niedriger Stringenz. Ein Screening-Verfahren, ausgewählt aus den zahlreichen, Fachleuten zur Verfügung stehenden Verfahren, wird verwendet, um Hybridisierungsereignisse und isolierte hybridisierte Nucleinsäure erfolgreich zu identifizieren.
Bindung einer Sonde an Target-Nucleinsäure (z.B. DNA) kann unter Verwendung jedes beliebigen Verfahrens, ausgewählt aus den zahlreichen Verfahren, die Fachleuten zur Verfügung stehen, gemessen werden. Sonden können beispielsweise radioaktiv, fluoreszierend oder enzymatisch markiert werden. Andere Verfahren, die keine Markierung der Sonde einsetzen, umfassen die Untersuchung von Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus, Amplifikation mittels PCR, RNAse-Spaltung und Allelspezifisches Oligonucleotid-Sondieren.
Zum Sondieren kann das herkömmliche Southern-Blotting-Verfahren eingesetzt werden. DNA kann beispielsweise aus Zellen extrahiert und mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut werden. Restriktionsfragmente können anschließend durch Elektrophorese auf einem Agarosegel getrennt werden, bevor Denaturierung und Transfer auf ein Nitrocellulose-Filter erfolgen. Eine markierte Sonde kann an die DNA-Fragmente am Filter hybridisiert und die Bindung bestimmt werden. DNA zum Sondieren kann aus RNA-Präparaten aus Zellen hergestellt werden.
Vorbereitende Versuche können durch Hybridisieren verschiedener Sonden an Southern-Blots von DNA, die mit Restriktionsenzymen verdaut wurde, unter wenig stringenten Bedingungen durchgeführt werden. Geeignete Bedingungen wären erreicht, wenn eine große Anzahl an Hybridisierungsfragmenten erhalten werden würde, während die Hintergrund-Hybridisierung gering bliebe. Unter Verwendung dieser Bedingungen können Nucleinsäurebibliotheken, z.B. cDNA-Bibliotheken, die für exprimierte Sequenzen repräsentativ sind, durchsucht werden.
Fachleute werden durchwegs in der Lage sein, geeignete Bedingungen der erwünschten Stringenz für selektive Hybridisierung, unter Berücksichtigung von Faktoren wie Oligonucleotidlänge und Basenzusammensetzung, Temperatur usw., zu verwenden.
Auf Grundlage von Aminosäuresequenz-Information können Oligonucleotid-Sonden oder -Primer unter Berücksichtigung der Degeneration des genetischen Codes entworfen werden, und, sofern angebracht, wird die Codon-Verwendung des Organismus aus der Kandidaten-Nucleinsäure abgeleitet. Ein Oligonucleotid zur Verwendung bei Nucleinsäure-Amplifikation kann etwa 10 oder weniger Codons (z.B. 6, 7 oder 8) aufweisen, d.h. etwa 30 oder weniger Nucleotide (z.B. 18, 21 oder 24) lang sein. Im Allgemeinen weisen spezifische Primer eine Länge von 14 Nucleotiden oder mehr, jedoch nicht mehr als von 18–20 Nucleotiden, auf. Fachleute sind im Bereich des Entwerfens von Primern zur Verwendung in Verfahren wie beispielsweise PCR durchwegs versiert.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Oligonucleotid- oder Polynucleotidfragment einer der hierin offenbarten Sequenzen oder einer komplementären Sequenz, insbesondere zur Verwendung in einem Verfahren zur Gewinnung und/oder zum Screenen von Nucleinsäure, bereit. Die Sequenzen, auf die oben Bezug genommen wurde, können durch Addition, Substitution, Insertion oder Deletion von einem oder mehreren Nucleotiden modifiziert sein, vorzugsweise jedoch ohne Aufhebung ihrer Fähigkeit, selektiv mit Nucleinsäure mit der hierin gezeigten Sequenz zu hybridisieren, d.h. worin der Grad der Sequenzidentität des Oligonucleotids oder Polynucleotids mit einer der angegebenen Sequenzen ausreichend hoch ist.
In manchen bevorzugten Ausführungsformen sind Oligonucleotide gemäß der vorliegenden Erfindung, die Fragmente von einer der hierin bereitgestellten Nucleinsäuresequenzen sind oder komplementäre Sequenzen davon sind, zumindest etwa 10 Nucleotide lang, vorzugsweise zumindest etwa 15 Nucleotide lang, noch bevorzugter zumindest etwa 20 Nucleotide lang. Solche Fragmente stellen selbst individuell Aspekte der vorliegenden Erfindung dar. Fragmente und andere Oligonucleotide können wie erläutert als Primer oder Sonden verwendet werden, können jedoch auch (z.B. durch PCR) in Verfahren gebildet werden, die sich mit der Bestimmung der Gegenwart von Pol-λ-Nucleinsäure in einer Testprobe befassen.
Nucleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung kann in Verfahren der Gentherapie verwendet werden, beispielsweise bei der Behandlung von Individuen mit dem Ziel, den oben genannten Leiden vorzubeugen oder sie (ganz oder teilweise) zu heilen. Dies wird ebenfalls nachstehend erläutert.
Ein geeigneter Weg zur Herstellung eines Polypeptids gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Expression von Nucleinsäure, die dafür kodiert, durch die Verwendung der Nucleinsäure in einem Expressionssystem. Die Verwendung von Expressionssystemen ist mittlerweile schon sehr ausgereift.
Demgemäß umfasst die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids (wie offenbart), wobei das Verfahren die Expression aus Nucleinsäure, die für das Polypeptid kodiert (im Allgemeinen Nucleinsäure gemäß der Erfindung), umfasst. Dies kann gut durch Züchten einer Wirtszelle in Kultur, die solch einen Vektor enthält, unter geeigneten Bedingungen, die Expression des Polypeptid verursachen oder ermöglichen, erreicht werden. Polypeptide können auch in In-vitro-Systemen wie beispielsweise Retikulozytenlysat exprimiert werden.
Systeme zum Klonieren und zur Expression eines Polypeptids in zahlreichen verschiedenen Wirtszellen sind bekannt. Geeignete Wirtszellen umfassen Bakterien, eukaryotische Zellen wie beispielsweise Säugetier- und Hefezellen und Baculovirus-Systeme. Säugetier-Zelllinien, die auf dem Gebiet der Erfindung zur Expression eines heterologen Polypeptids erhältlich sind, umfassen Chinahamster-Eierstockzellen, HeLa-Zellen, Babyhamster-Nierenzellen, COS-Zellen und zahlreiche andere. Ein üblicher, bevorzugter bakterieller Wirt ist E. coli.
Geeignete Vektoren, die geeignete Regulationssequenzen, umfassend Promotorsequenzen, Terminatorfragmente, Polyadenylierungssequenzen, Enhancersequenzen, Markergene und andere Sequenzen je nach Bedarf, enthalten, können ausgewählt oder konstruiert werden. Vektoren können Plasmide, virale, z.B. 'Phage oder Phagemid, je nach Eignung, sein. Weitere Details hierzu sind beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), zu finden. Zahlreiche bekannte Verfahren und Arbeitsvorschriften zur Manipulation von Nucleinsäure, beispielsweise bei der Herstellung von Nucleinsäure-Konstrukten, bei Mutagenese, Sequenzieren, Einführen von DNA in Zellen und Genexpression sowie Analyse von Proteinen, sind detailliert in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. (Hrsg.), John Wiley & Sons (1992), beschrieben.
Somit stellt ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Wirtszelle bereit, die Nucleinsäure wie hierin offenbart enthält. Die Nucleinsäure der Erfindung kann in das Genom (z.B. Chromosom) der Wirtszelle integriert werden. Integration kann durch Einschluss von Sequenzen, die Rekombination mit dem Genom unterstützen, gemäß herkömmlichen Verfahren gefördert werden. Die Nucleinsäure kann an einem extrachromosomalen Vektor innerhalb der Zelle liegen.
Wiederum ein weiterer Aspekt stellt ein Verfahren bereit, das das Einführen der Nucleinsäure in eine Wirtszelle umfasst. Zum Einführen, das (insbesondere bei In-vitro-Einführung) im Allgemeinen auch ohne Einschränkung als "Transformation" bezeichnet werden kann, kann jedes beliebige verfügbare Verfahren eingesetzt werden. Für eukaryotische Zellen können geeignete Verfahren Calciumphosphattransfektion, DEAE-Dextran, Elektroporation, Liposomen-vermittelte Transfektion und Transduktion unter Verwendung von Retrovirus oder einem anderen Virus, z.B. Vaccinia oder, für Insektenzellen, Baculovirus, umfassen. Für Bakterienzellen können geeignete Verfahren Galciumchlorid-Transformation, Elektroporation und Transfektion unter Verwendung von Bakteriophagen umfassen. Als eine Alternative könnte auch direkte Injektion der Nucleinsäure verwendet werden.
Markergene wie beispielsweise antibiotische Resistenz- oder Empfindlichkeitsgene können zur Identifikation von Klonen, die Nucleinsäure von Interesse enthaften, verwendet werden, wie auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt ist.
Dem Einführen kann das Verursachen oder Ermöglichen von Expression von der Nucleinsäure folgen, z.B. durch Kultivieren von Wirtszellen (die tatsächlich transformierte Zellen umfassen können, obwohl die Zellen wahrscheinlicher Nachkommen der transformierten Zellen sind) unter für Expression des Gens geeigneten Bedingungen, sodass das kodierte Polypeptid produziert wird. Wird das Polypeptid gebunden an ein geeignetes Signalleaderpeptid exprimiert, so kann es aus der Zelle in das Kulturmedium sekretiert werden. Nach der Produktion durch Expression kann ein Polypeptid aus der Wirtszelle und/oder dem Kulturmedium, je nachdem, isoliert und/oder gereinigt und daraufhin wie erwünscht verwendet werden, z.B. bei der Formulierung einer Zusammensetzung, die eine oder mehrere zusätzliche Komponenten umfassen kann, wie beispielsweise einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die einen oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Arzneimittelträger, Vehikel oder Träger umfasst (siehe z.B. unten).
Eine Wirtszelle, die Nucleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung enthält, z.B. als ein Resultat von Einführung der Nucleinsäure in die Zelle oder in einen Vorgänger der Zelle und/oder von genetischer Veränderung der Sequenz, die endogen zu der Zelle oder einer Vorgängerzelle ist (wobei diese Einführung oder Änderung in vivo oder ex vivo stattfinden kann), kann (z.B. im Soma) innerhalb eines Wirtsorganismus, der ein Tier, insbesondere ein Säugetier, das menschlich oder nicht-menschlich sein kann, wie beispielsweise Kaninchen, Meerschweinchen, Ratte, Maus oder andere Nagetiere, Katze, Hund, Schwein, Schaf, Ziege, Rind oder Pferd, oder das ein Vogel, wie z.B. ein Huhn, ist, enthalten sein. Gentechnisch veränderte oder transgene Tiere oder Vögel, die solch eine Zelle in sich tragen, werden ebenfalls als weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bereitgestellt.
Dies kann einen therapeutischen Zweck haben. (Gentherapie wird nachstehend erläutert.) Die Gegenwart einer Mutanten-, Allel- oder Varianten-Sequenz innerhalb der Zellen eines Organismus, insbesondere, wenn diese anstelle einer homologen endogenen Sequenz vorliegt, kann die Verwendung des Organismus als ein Modell in Tests und/oder Untersuchungen zur Rolle des Pol-λ-Gens oder von Substanzen, die Aktivität des kodierten Polypeptids in vitro modulieren, ermöglichen.
Anstelle der Verwendung oder parallel zur Verwendung bei der Herstellung eines Polypeptids, für das ein Transgen kodiert, können Wirtszellen als eine "Nucleinsäure-Fabrik" verwendet werden, um die Nucleinsäure von Interesse zu replizieren, um davon große Mengen herzustellen. Mehrfachkopien von Nucleinsäure von Interesse können innerhalb einer Zelle gebildet werden, wenn sie an ein amplifizierbares Gen wie beispielsweise DHFR gebunden ist. Wirtszellen, die mit Nucleinsäure von Interesse transformiert sind oder die Nachkommen aus Wirtszellen sind, in die Nucleinsäure eingeführt wurde, können unter geeigneten Bedingungen, z.B. in einem Fermentor, kultiviert, aus der Kultur genommen und Verarbeitung unterzogen werden, um die Nucleinsäure zu reinigen. Nach der Reinigung können die Nucleinsäure oder ein oder mehrere Fragmente davon wie erwünscht verwendet werden, beispielsweise in einem diagnostischen oder prognostischen Test, wie an anderer Stelle hierin erläutert wird.
Pol-λ-Polypeptide
Fachleute können die hierin beschriebenen Verfahren oder andere, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, verwenden, um große Mengen des Pol-λ-Polypeptids oder von Fragmenten oder aktiven Abschnitten davon zur Verwendung als Pharmazeutika, bei der Entwicklung von Wirkstoffen und für weitere Untersuchungen seiner Eigenschaften und seiner Rolle in vivo herzustellen.
Somit stellt ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Polypeptid bereit, das die in Seq.-ID Nr. 1 oder Nr. 4 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist und das eine isolierte und/oder gereinigte Form sein kann, frei oder im Wesentlichen frei von Material, mit dem es in der Natur assoziiert ist, wie beispielsweise anderen Polypeptiden oder menschlichen Polypeptiden, die nicht Pol-λ-Polypeptid sind oder (beispielsweise, wenn sie durch Expression in einer prokaryotischen Zelle hergestellt wurden) denen native Glykosylierung fehlt, die z.B. unglykosyliert sind.
Polypeptide, die Aminosäuresequenz-Varianten, -Allele, -Derivate oder -Isoformen mit zumindest 60 % Sequenzidentität mit den in Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 4 gezeigten Aminosäuresequenzen sind, werden von der vorliegenden Erfindung auch bereitgestellt. Ein Polypeptid, das eine Variante, ein Allel, ein Derivat oder eine Isoform ist, kann eine Aminosäuresequenz aufweisen, die sich von jener hierin bereitgestellten um eine oder mehrere von Addition, Substitution, Deletion und Insertion von einer oder mehreren Aminosäuren unterscheidet. Polypeptide weisen Pol-λ-Polymerasefunktion wie zuvor definiert auf.
Ein Polypeptid, das eine) Aminosäuresequenz-Variante, -Allel, -Derivat oder -Mutante der in Seq.-ID Nr. 1 oder Nr. 4 gezeigten Aminosäuresequenz ist, weist zumindest 60 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 70 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 80 % Sequenzidentität, noch bevorzugter zumindest 90 % Sequenzidentität und am meisten bevorzugt zumindest 95 % Sequenzidentität, mit den in Seq.-ID Nr. 1 oder Nr. 4 gezeigten Sequenzen auf.
Fachleute können leicht Sequenzvergleiche erstellen und Identität unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren, z.B. unter Verwendung des GCG-Programms, das bei Genetics Computer Group, Oxford Molecular Group, Madison, Wisconsin, USA, erhältlich ist, Version 9.1, bestimmen. Bestimmte Aminosäu resequenz-Varianten können sich von jenen, die in Seq.-ID Nr. 1 oder 4 gezeigt sind, durch Insertion, Addition, Substitution oder Deletion von 1 Aminosäure, 2, 3, 4, 5–10, 10–20, 20–30, 30–50, 50–100, 100–500 oder mehr als 150 Aminosäuren unterscheiden.
"Stringenz" von Hybridisierungsreaktionen ist von gewöhnlichen Fachleuten leicht zu bestimmen und beruht im Allgemeinen auf einer empirischen Berechnung, die von Sondenlänge, Waschtemperatur und Salzkonzentration abhängt. Im Allgemeinen erfordern längere Sonden höhere Temperaturen für korrektes Anellieren, während kürzere Sonden niedrigere Temperaturen erfordern. Hybridisierung hängt im Allgemeinen von der Fähigkeit von denaturierter DNA ab, neuerlich zu anellieren, wenn komplementäre Stränge in einer Umgebung vorhanden sind, die unter ihrer Schmelztemperatur liegt. Je höher der Grad an erwünschter Homologie zwischen der Sonde und der hybridisierbaren Sequenz, umso höher die relative Temperatur, die verwendet werden kann. Daraus folgt, dass höhere relative Temperaturen dazu neigen, die Reaktionsbedingungen stringenter zu machen, während niedrigere Temperaturen weniger dazu neigen. Weitere Details und Erklärungen zu Stringenz von Hybridisierungsbedingungen sind in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995), zu finden.
"Stringente Bedingungen" oder "hochstringente Bedingungen" wie hierin definiert können durch jene identifiziert werden, die: (1) geringe Ionenstärke und hohe Temperatur zum Waschen verwenden, z.B. 0,015 M Natriumchlorid/0,0015 M Natriumcitrat 10,1 % Natriumdodecylsulfat bei 50 °C; (2) während der Hybridisierung eines denaturierenden Mittels, wie beispielsweise Formamid, z.B. 50 Vol.-% Formamid mit 0,1 % Rinderserumalbumin/0,1 % Ficoll/0,1 % Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 760 mM Natriumchlorid, 75 mM Natriumcitrat bei 42 °C verwenden; oder (3) 50 % Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 0,1 Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardt-Lösung, beschallte Lachssperma-DNA (50 lg/ml), 0,1 % SDS und 10 % Dextransulfat bei 42 °C verwenden, mit Waschschritten bei 42 °C in 0,2 × SSC (Natriumchlo rid/Natriumcitrat) und 50 % Formamid bei 55 °C, gefolgt von einem hochstringenten Waschschritt, bestehend aus 0,1 × SSC, das EDTA enthält, bei 55 °C.
"Prozent (%) Aminosäuresequenz-Identität" in Bezug auf die hierin identifizierten Pol-λ-Polypeptidsequenzen wird definiert als der Prozentsatz an Aminosäureresten in einer Kandidatensequenz, die mit den Aminosäureresten in der Pol-λ-Sequenz, nach Abgleich der Sequenzen und Einführen von Lücken, sofern erforderlich, um die maximale prozentuelle Sequenzidentität zu erhalten, und ohne Berücksichtigung jeglicher konservativer Substitutionen als Teil der Sequenzidentität, identisch sind. Die hierin verwendeten %-Identitätswerte werden durch WU-BLAST-2 gebildet, das von Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460-480 (1996); (http://blast.wustl.edu/blast/README.html) erhalten wurde. WU-BLAST-2 verwendet mehrere Suchparameter, wovon die meisten auf die Standardwerte eingestellt werden. Die veränderlichen Parameter werden wie folgt eingestellt: overlap span = 1, overlap fraction = 0,125, word threshold (T) = 11. Die HSP-S- und HSPS2-Parameter sind dynamische Werte und werden vom Programm selbst je nach der Zusammensetzung der bestimmten Sequenz und der Zusammensetzung der bestimmten Datenbank, gegen die die Sequenz von Interesse durchsucht wird, erstellt; die Werte können jedoch eingestellt werden, um die Empfindlichkeit zu erhöhen. Ein %-Aminosäuresequenz-Identitätswert wird durch die Anzahl an übereinstimmenden identischen Resten, dividiert durch die Gesamtzahl an Resten der "längeren" Sequenz in der Abgleichregion, bestimmt. Die "längere" Sequenz ist die eine, die die meisten tatsächlichen Reste in der Abgleichregion aufweist (durch WU-BLAST-2 eingeführte Lücken zur Maximierung des Abgleichergebnisses werden nicht berücksichtigt).
In ähnlicher Weise ist "Prozent (%) Nucleinsäuresequenzidentität" in Bezug auf die Kodiersequenz der hierin identifizierten Pol-λ-Polypeptide definiert als der Prozentsatz an Nucleotidresten in einer Kandidatensequenz, die mit den Nucleotidresten in der in Seq.-ID Nr. 1 oder Nr. 4 bereitgestellten Pol-λ-Kodiersequenz identisch sind. Die hierin verwendeten identischen Werte werden durch das BLASTN-Modul von WU-BLAST-2, eingestellt auf Standard-Parameter, mit einer Überlappungs-Spanne von 1 und einer Überlappungs-Fraktion von 0,125 errechnet.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch aktive Abschnitte und Fragmente der Pol-λ-Polypeptide der Erfindung.
Ein "aktiver Abschnitt" von Pol-λ-Polypeptid bezeichnet ein Peptid, das kürzer als das Pol-λ-Polypeptid voller Länge ist, das jedoch zumindest eine gewisse seiner wesentlichen biologischen Aktivität beibehält, wie z.B. eine DNA-Polymerase. Kleinere Fragmente von Pol-λ können beispielsweise als Sequestratoren oder als kompetitive Antagonisten durch Wechselwirkung mit anderen Proteinen wirken.
Ein "Fragment" des Pol-λ-Polypeptids bezeichnet einen Abschnitt von Aminosäureresten von zumindest 5 zusammenhängenden Aminosäuren aus den in Seq.-ID Nr. 1, 4, 7, 9 oder 11 gezeigten Sequenzen, oder noch bevorzugter von zumindest 7 zusammenhängenden Aminosäuren, oder noch bevorzugter von zumindest 10 zusammenhängenden Aminosäuren, oder noch bevorzugter von zumindest 20 zusammenhängenden Aminosäuren, oder noch bevorzugter von zumindest 40 zusammenhängenden Aminosäuren. Fragmente der Pol-λ-Polypeptidsequenzen können als Antigen-Determinanten oder Epitope zum Züchten von Antikörpern gegen einen Abschnitt der Pol-λ-Aminosäuresequenz nützlich sein.
Ein "Derivat" des Pol-λ-Polypeptids oder eines Fragments davon bezeichnet ein Polypeptid, das durch Variieren der Aminosäuresequenz des Proteins, z.B. durch Manipulation der Nucleinsäure, die für das Protein kodiert, oder durch Ändern des Proteins selbst, modifiziert wird. Solche Derivate der natürlichen Aminosäuresequenz können Insertion, Addition, Deletion oder Substitution von einer, zwei, drei, fünf oder mehr Aminosäuren, ohne grundlegende Änderung der wesentlichen Aktivität des Pol-λ-Polypeptids, umfassen.
Ein Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise nach Produktion durch Expression aus kodierender Nucleinsäure (was nachstehend noch erläutert wird) isoliert und/oder gereinigt (z.B. unter Verwendung eines Antikörpers) werden. Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung können auch vollständig oder teilweise durch chemische Synthese gebildet werden. Das isolierte und/oder gereinigte Polypeptid kann bei der Formulierung einer Zusammensetzung verwendet werden, die zumindest eine zusätzliche Komponente umfassen kann, beispielsweise einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die einen) pharmazeutisch annehmbaren/s Arzneimittelträger, Vehikel oder Träger umfasst. Eine Zusammensetzung, die ein Polypeptid gemäß der Erfindung umfasst, kann in prophylaktischer und/oder therapeutischer Behandlung wie nachstehend erläutert verwendet werden.
Ein Polypeptid, Peptidfragment, Allel, eine Mutante oder Variante gemäß der vorliegenden Erfindung kann als ein Immunogen oder auch anders zur Gewinnung spezifischer Antikörper verwendet werden. Antikörper sind zur Reinigung und zu anderen Manipulationen von Polypeptiden und Peptiden, für diagnostisches Screenen und in therapeutischen Zusammenhängen nützlich. Dies wird nachstehend noch näher erläutert.
Ein Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung kann zum Screenen auf Moleküle verwendet werden, die seine Aktivität oder Funktion beeinflussen oder modulieren. Solche Moleküle können in einem therapeutischen (möglicherweise auch prophylaktischen) Zusammenhang nützlich sein.
Die Pol-λ-Polypeptide können auch an einen Bindungspartner, z.B. ein Effektormolekül, eine Markierung, einen Wirkstoff, ein Toxin und/oder einen Träger oder ein Transportmolekül, gebunden sein. Verfahren zur Bindung der Peptide der Erfindung sowohl an Peptidyl- als auch Nicht-Peptidyl-Bindungspartner sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
Antikörper, die zur Bindung von Pol-λ-Polypeptiden in der Lage sind Eine weitere wichtige Verwendung der Pol-λ-Polypeptide ist das Züchten von Antikörpern, die die Eigenschaft spezifischer Bindung an die Pol-λ-Polypeptide oder Fragmente oder aktive Abschnitte davon aufweisen.
Es ist möglich, monoklonale Antikörper gegen Pol-λ-Protein herzustellen, und die Verfahren hierzu sind auf dem Gebiet der Erfindung bereits Routine. Monoklonale Antikörper können den Verfahren der DNA-Rekombinationstechnologie unterzogen werden, um andere Antikörper oder chimäre Moleküle herzustellen, die die Spezifität des ursprünglichen Antikörpers beibehalten. Solche Verfahren können das Einführen von DNA umfassen, die für die variable Immunglobulinregion oder die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) eines Antikörpers gegen die konstanten Regionen oder konstanten Regionen plus Gerüstregionen eines anderen Immunglobulins kodiert. Siehe beispielsweise die EP-A-184187, GB-A-2188638 oder EP-A-239400. Ein Hybridom, das einen monoklonalen Antikörper produziert, kann genetischer Mutation oder anderen Änderungen unterzogen werden, die die Bindungsspezifität hergestellter Antikörper beeinflussen können oder nicht.
Die Bereitstellung der neuen Pol-λ-Polypeptide ermöglicht zum ersten Mal die Herstellung von Antikörpern, die in der Lage sind, sich spezifisch zu binden: Demgemäß stellt ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung Anti-Pol-λ-Antikörper bereit. Solch ein Antikörper kann bezüglich seiner Fähigkeit spezifisch sein, zwischen dem Polypeptid, an das es sich binden kann, und anderen menschlichen Polypeptiden, für die es keine oder im Wesentlichen keine Bindungsaffinität aufweist (z.B. eine Bindungsaffinität, die um etwa das 1.000fache schlechter ist), zu unterscheiden. Spezifische Antikörper binden ein Epitop am Molekül, das an anderen Molekülen entweder nicht vorhanden oder anderen Molekülen nicht zugänglich ist. Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung können für das Wildtyp-Polypeptid spezifisch sein. Antikörper gemäß der Erfindung können für ein bestimmtes Mutanten-, Varianten-, Allel- oder Derivat-Polypeptid wie zwischen diesem Molekül und dem Wildtyp-Pol-λ-Polypeptid spezifisch sein, um in Diagnose- und Prognoseverfahren wie nachstehend erläutert nützlich zu sein. Antikörper sind auch beim Reinigen des Polypeptids oder der Polypeptide, an die sie sich binden, z.B. nach Produktion durch rekombinante Expression aus kodierender Nucleinsäure, nützlich.
Bevorzugte Antikörper gemäß der Erfindung sind isoliert, dahingehend dass sie frei von Verunreinigungen sind, wie beispielsweise Antikörper, die in der Lage sind, andere Polypeptide zu binden, und/oder frei von Serumkomponenten sind. Monoklonale Antikörper werden für gewisse Zwecke bevorzugt, wobei jedoch polyklonale Antikörper ebenfalls im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung liegen.
Antikörper können unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung Standard sind, gewonnen werden. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern umfassen das Immunisieren eines Säugetiers (z.B. Maus, Ratte, Kaninchen, Pferd, Ziege, Schaf oder Affe) mit dem Protein oder einem Fragment davon. Antikörper können aus immunisierten Tieren unter Verwendung jedes beliebigen der zahlreichen, auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren gewonnen und gescreent werden, vorzugsweise unter Verwendung von Bindung des Antikörpers an ein Antigen von Interesse. Western-Blotting-Verfahren oder Immunfällung können beispielsweise verwendet werden (Armitage et al., Nature 357, 80-82 (1992)). Isolierung von Antikörpern und/oder Antikörper-produzierenden Zellen aus einem Tier kann verbunden sein mit der Tötung des Tiers.
Als eine Alternative oder Ergänzung zur Immunisierung eines Säugetiers mit einem Peptid kann ein Antikörper, der spezifisch für ein Protein ist, aus einer rekombinant produzierten Bibliothek von exprimierten variablen Immunglobulindomänen, z.B. unter Verwendung von λ-Bakteriophagen oder filamentösen Bakteriophagen, die funktionelle Immunglobulin-Bindungsdomänen an ihrer Oberfläche aufweisen, gewonnen werden; siehe beispielsweise die WO 92/01047. Die Bibliothek kann naiv sein, d.h. dass sie aus Sequenzen konstruiert ist, die aus einem Organismus gewonnen wurden, der mit keinem der Proteine (oder Fragmente) immunisiert wurde, oder sie kann unter Verwendung von Sequenzen aus einem Organismus, der dem Antigen von Interesse ausgesetzt wurde, konstruiert werden.
Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung können auf zahlreiche Arten modifiziert werden. Die Bezeichnung "Antikörper" gilt so zu verstehen, dass sie jegliche Bindungssubstanz abdeckt, die eine Bindungsdomäne mit der erwünschten Spezifität aufweist. Somit umfasst die Erfindung Antikörperfragmente, Derivate, funktionelle Äquivalente und Homologe von Antikörpern, einschließlich synthetischer Moleküle und Moleküle, deren Form jene eines Antikörpers nachahmt, was ihm die Möglichkeit verleiht, ein Antigen oder Epitop zu binden.
Beispiele für Antikörperfragmente, die in der Lage sind, ein Antigen oder einen anderen Bindungspartner zu binden, sind das Fab-Fragment, das aus den VL-, VL- C1-und CH1-Domänen besteht; das Fd-Fragment, das aus der VH- und der CH1-Domäne besteht; das Fv-Fragment, das aus der VL- und der VH-Domäne eines einzelnen Arms eines Antikörpers besteht; das dAb-Fragment, das aus einer VH-Domäne besteht; isolierte CDR-Regionen und F(ab')₂-Fragmente, ein zweiwertiges Fragment, das zwei Fab-Fragmente umfasst, die durch eine Disulfidbrücke an der Gelenksregion aneinander gebunden sind. Einkettige Fv-Fragmente sind ebenfalls eingebunden.
Humanisierte Antikörper, in denen CDRs aus einer nicht-menschliche Quelle auf menschliche Gerüstregionen aufgepfropft sind, typischerweise mit gleichzeitiger Änderung mancher der Gerüst-Aminosäurereste, um Antikörper bereitzustellen, die weniger immunogen sind als die verwandten, nicht-menschlichen Antikörper, liegen ebenfalls im Bereich der vorliegenden Erfindung.
Ein Hybridom, das einen monoklonalen Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung produziert, kann genetischer Mutation oder anderen Änderungen unterzogen werden. Fachleuten wird darüber hinaus bekannt sein, dass ein monoklonaler Antikörper den Verfahren der DNA-Rekombinationstechnologie unterzogen werden kann, um andere Antikörper oder chimäre Moleküle zu bilden, die die Spezifität des ursprünglichen Antikörpers beibehalten. Solche Verfahren können das Einführen von DNA umfassen, die für die variable Immunglobulinregion oder die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) eines Antikörpers kodiert, in die konstanten Regionen oder konstanten Regionen plus Gerüstregionen eines anderen Immunglobulins. Siehe beispielsweise die EP-A-184187, GB-A-2188638 oder EP-A-0239400. Klonieren und Expression chimärer Antikörper sind in der EP-A-0120694 und der EP-A-0125023 beschrieben.
Hybridome, die in der Lage sind, Antikörper mit erwünschten Bindungseigenschaften zu bilden, liegen im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, wie auch eukaryotische oder prokaryotische Wirtszellen, die für Antikörper (einschließlich Antikörperfragmente) kodierende Nucleinsäure enthalten und zu ihrer Expression in der Lage sind. Die Erfindung stellt auch Verfahren zur Herstellung der Antikörper bereit, umfassend das Züchten einer Zelle, die in der Lage ist, den Antikörper zu produzieren, unter Bedingungen, unter denen der Antikörper produziert und vorzugsweise sekretiert wird.
Die Reaktionsfähigkeiten von Antikörpern auf einer Probe können durch jegliches geeignete Mittel bestimmt werden. Markieren mit einzelnen Reportermolekülen ist eine Möglichkeit. Die Reportermoleküle können nachweisbare, und vorzugsweise messbare, Signale direkt oder indirekt abgeben. Die Bindung von Reportermolekülen kann direkt oder indirekt, kovalent, z.B. über eine Peptidbindung, oder nicht-kovalent sein. Bindung über eine Peptidbindung kann ein Resultat von rekombinanter Expression einer Genfusion, die für Antikörper und Reportermolekül kodiert, sein.
Eine bevorzugte Art von Bindung ist kovalente Bindung von jedem Antikörper mit einem individuellen Fluorochrom-, Phosphor- oder Laseranregungs-Farbstoff mit spektral isolierten Absorptions- oder Emissionscharakteristika. Geeignete Fluorochrome umfassen Fluorescein, Rhodamin, Phycoerythrin und Texas-Rot. Geeignete chromogene Farbstoffe umfassen Diaminobenzidin.
Andere Reporter umfassen makromolekulare kolloidale Partikel oder Teilchenmaterial wie Latexperlen, die gefärbt, magnetisch oder paramagnetisch sind, und biologisch oder chemisch aktive Mittel, die direkt oder indirekt nachweisbare Signale hervorrufen, die visuell beobachtet, elektrisch nachgewiesen oder auf andere Weise aufge zeichnet werden können. Diese Moleküle können Enzyme sein, die Reaktionen katalysieren, die beispielsweise Farben entwickeln oder ändern oder Änderungen elektrischer Eigenschaften bewirken. Sie können molekular anregbar sein, sodass elektrische Übergänge zwischen Energiezuständen in charakteristischen spektralen Absorptionen oder Emissionen resultieren. Sie können chemische Einheiten umfassen, die in Verbindung mit Biosensoren verwendet werden. Biotin/Avidin- oder Biotin/Streptavidin- und alkalische Phosphatase-Detektionssysteme können verwendet werden.
Die Art der Bestimmung von Bindung ist keine Eigenschaft der vorliegenden Erfindung, und Fachleute sind in der Lage, eine geeignete Art je nach ihrer Präferenz und ihrem allgemeinen Wissen zu wählen.
Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung können beim Screenen auf die Gegenwart eines Polypeptids, beispielsweise in einer Testprobe, die Zellen oder Zelllysat wie erläutert enthält, verwendet werden und können beim Reinigen und/oder Isolieren eines Polypeptids gemäß der vorliegenden Erfindung, beispielsweise nach der Herstellung des Polypeptids durch Expression aus dafür kodierender Nucleinsäure, verwendet werden. Antikörper können die Aktivität des Polypeptids, an das sie sich binden, modulieren und können so, sofern dieses Polypeptid eine schädliche Wirkung auf ein Individuum zeigt, in einem therapeutischen Zusammenhang (der auch Prophylaxe umfassen kann) nützlich sein.
Ein Antikörper kann in einem Set bereitgestellt werden, das Anweisungen zur Verwendung des Antikörpers, z.B. bei der Bestimmung der Gegenwart einer bestimmten Substanz in einer Testprobe, umfassen kann. Ein oder mehrere andere Reagenzien können eingebunden sein, wie beispielsweise markierende Moleküle, Pufferlösungen, Elutionsmittel und dergleichen. Reagenzien können in Behältern bereitgestellt werden, die sie vor der äußeren Umgebung schützen, wie beispielsweise in einer versiegelten Phiole.
Diagnoseverfahren
Zahlreiche Diagnoseverfahren sind auf dem Gebiet der Erfindung zur Analyse biologischer Proben aus Individuen bekannt, um zu bestimmen, ob das Individuum ein Pol-λ-Allel, das Wildtyp ist oder das einen Polymorphismus umfasst, in sich trägt. Der Zweck einer solchen Analyse kann Diagnose oder Prognose sein, insbesondere die Diagnose oder Prognose von Tumoren oder Tumormalignität, um einem Arzt die Bestimmung der Schwere oder des wahrscheinlichen Verlaufs des Leidens zu erleichtern und/oder die Behandlung davon zu optimieren.
Allgemein gesprochen lassen sich die Verfahren in jene, die Screenen auf die Gegenwart von Pol-λ-Nucleinsäuresequenzen umfassen, und jene, die auf der Detektion der Gegenwart oder Abwesenheit des Pol-λ-Polypeptids oder von Isoformen davon beruhen, einteilen. Die Verfahren verwenden biologische Proben aus Individuen, von denen angenommen wird, dass sie die Nucleinsäuresequenzen oder das Polypeptid in sich tragen. Beispiele für biologische Proben umfassen Blut, Plasma, Serum, Gewebeproben, Tumorproben, Speichel und Urin.
Beispiele für Ansätze zur Detektion von Pol-λ-Nucleinsäure oder Polypeptiden umfassen:

(a) das Vergleichen der Nucleinsäuresequenz in der Probe mit der Pol-λ-Nucleinsäuresequenz, um zu bestimmen, ob die Probe aus dem Patienten eine oder mehrere Mutationen enthält; oder
(b) das Bestimmen der Gegenwart des Polypeptids, für das das POLL-Gen kodiert, in einer Probe aus einem Patienten und, sofern es vorhanden ist, das Bestimmen, ob das Polypeptid ein Polypeptid voller Länge und/oder Wildtyp und/oder eine Isoform des Wildtyp-Polypeptids ist und/oder auf normalem Niveau exprimiert wird; oder
(c) die Verwendung von DNA-Fingerprinting, um das produzierte Restriktionsmuster, wenn ein Restriktionsenzym eine Probe von Nucleinsäure aus dem Patienten schneidet, mit dem Restriktionsmuster, das aus normalem POLL-Gen oder aus bekannten Mutationen davon erhalten wird, zu vergleichen; oder
(d) die Verwendung eines spezifischen Bindungselements, das in der Lage ist, sich an eine Pol-λ-Nucleinsäuresequenz (entweder eine normale Sequenz oder eine bekannte mutierte Sequenz) zu binden, wobei das spezifische Bindungselement Nucleinsäure umfasst, die mit der Pol-λ-Nucleinsäuresequenz hybridisierbar ist, oder Substanzen, die eine Antikörperdomäne mit Spezifität für eine native oder mutierte Pol-λ-Nucleinsäuresequenz oder für das von dieser kodierte Polypeptid umfassen, wobei das spezifische Bindungselement so markiert ist, dass Bindung des spezifischen Bindungselements an seinen Bindungspartner nachweisbar ist; oder
(e) die Verwendung von PCR, die einen oder mehrere Primer umfasst, basierend auf normaler oder mutierter POLL-Gensequenz, um in einer Probe aus einem Patienten auf normales oder mutiertes POLL-Gen zu screenen.

Ein "spezifisches Bindungspaar" umfasst ein spezifisches Bindungselement (sbm) und einen Bindungspartner (bp), die eine bestimmte Spezifität füreinander aufweisen und die sich unter normalen Bedingungen bevorzugt aneinander und weniger an andere Moleküle binden. Beispiele für spezifische Bindungspaare sind Antigene und Antikörper, Moleküle und Rezeptoren und komplementäre Nucleotidsequenzen. Fachleute sind in der Lage, hierzu zahlreiche andere Beispiele zu finden, die daher hier nicht aufgelistet werden müssen. Weiters ist die Bezeichnung "spezifisches Bindungspaar" auch passend, wenn einer oder beide von spezifischem Bindungselement und Bindungspartner einen Teil eines größeren Moleküls umfassen. In Ausführungsformen, in denen das spezifische Bindungspaar aus Nucleinsäuresequenzen gebildet wird, weisen diese eine Länge auf, um aneinander unter den Bedingungen des Tests zu hybridisieren, und sind vorzugsweise mehr als 10 Nucleotide lang, noch bevorzugter mehr als 15 oder 20 Nucleotide lang.
In den meisten Ausführungsformen der Erfindung, die das Screenen für Pol-λ-Nucleinsäure betreffen, wird die Probe anfänglich amplifiziert, z.B. unter Verwendung von PCR, um die Menge des Analyten im Vergleich zu anderen Sequenzen, die in der Probe vorhanden sind, zu steigern. Dies ermöglicht es, die Target-Sequenzen mit einem bestimmten Grad an Empfindlichkeit nachzuweisen, sofern sie in der Probe vorhanden sind. Dieser anfängliche Schritt kann unter Verwendung von hochempfindlichen Anordnungsverfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung immer wichtiger werden, umgangen werden.
Eine variable Form des POLL-Gens kann im Vergleich zur Wildtyp-Sequenz eine oder mehrere Insertionen, Deletionen, Substitutionen und/oder Additionen von einem oder mehr Nucleotiden enthalten, die die Genfunktion stören können oder nicht. Unterschiede auf Niveau der Nucleinsäure spiegeln sich nicht notwendigerweise in einem Unterschied der Aminosäuresequenz des kodierten Polypeptids wider, können jedoch mit einer bekannten Dysfunktion verbunden werden. Eine Mutation oder ein anderer Unterschied in einem Gen kann nun aber zu einer Rasterverschiebung oder einem Stoppcodon führen, die/das die Beschaffenheit des produzierten Polypeptids (sofern eines produziert wird) erheblich beeinträchtigen kann, oder zu einer Punktmutation oder einer umfassenden Mutationsänderung am kodierten Polypeptid, einschließlich Insertion, Deletion, Substitution und/oder Addition von einer oder mehreren Aminosäuren oder Regionen im Polypeptid. Eine Mutation in einer Promotorsequenz oder einer anderen Regulationsregion kann Expression aus dem Gen unterbinden oder reduzieren oder die Verarbeitung oder Stabilität des mRNA-Transkripts beeinflussen. Ein Beispiel für einen einfachen Nucleotidpolymorphismus in Verbindung mit Tumorgenese ist die einfache Basenpaaränderungs-Transition (C zu T) an Position 1683 von Pol-λ-cDNA, die zu einer Änderung des Aminosäurerests 488 (Arg) zu Tryptophan (Trp) in der Kodierregion von Pol-λ führt.
Es gibt verschiedene Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit einer bestimmten Nucleinsäuresequenz oder einer Mutante, Variante oder eines Allels davon in einer Testprobe. Beispiele für Tests umfassen Nucleotidsequenzierung, Hybridisierung unter Verwendung von Nucleinsäure, die an Plättchen immobilisiert ist, molekulare Phänotyptests, Proteintrunkierungstests (PTT), Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus-(SSCP-)Tests, Fehlpaarungsspaltungsnachweis und denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE). Diese Verfahren und ihre Vorteile und Nachteile werden in Nature Biotechnology 15, 422-426 (1997), erläutert.
Tests können an Präparaten, die genomische DNA, cDNA und/oder mRNA enthalten, durchgeführt werden. Das Testen von cDNA oder mRNA hat den Vorteil, dass die Komplexität der Nucleinsäure durch die Abwesenheit von Intronsequenzen reduziert wird, trägt jedoch auch den möglichen Nachteil in sich, zusätzliche Zeit und größeren Aufwand bei der Herstellung der Präparate zu erfordern. RNA ist aufgrund des weitverbreiteten Auftretens von RNAsen schwieriger zu manipulieren als DNA.
Nucleinsäure in einer Testprobe kann sequenziert und die Sequenz mit der in Seq.-ID Nr. 4 gezeigten Sequenz verglichen werden, um zu bestimmen, ob ein Unterschied vorhanden ist oder nicht. Ist dies der Fall, so kann der Unterschied mit bekannten Anfälligkeits-Allelen verglichen werden, um zu bestimmen, ob die Test-Nucleinsäure eine oder mehrere der angegebenen Variationen enthält.
Da es im Allgemeinen nicht zeit- oder arbeitseffizient ist, die gesamte Nucleinsäure in einer Testprobe oder sogar das gesamte POLL-Gen zu sequenzieren, kann eine spezifische Amplifikationsreaktion wie beispielsweise PCR unter Verwendung von einem oder mehreren Primerpaaren eingesetzt werden, um die Region von Interesse in der Nucleinsäure zu amplifizieren, beispielsweise das POLL-Gen oder eine bestimmte Region, in der Mutationen, die mit einer Anfälligkeit gegenüber einem der oben genannten Leiden assoziiert sind, vorhanden sind. Die amplifizierte Nucleinsäure kann dann wie oben beschrieben sequenziert werden und/oder auf jegliche andere Weise getestet werden, um die Gegenwart oder Abwesenheit einer bestimmten Eigenschaft zu bestimmen. Nucleinsäure zum Testen kann aus Nucleinsäure, die aus Zellen entfernt wurde, oder in einer Bibliothek unter Verwendung zahlreicher an derer Verfahren wie beispielsweise Restriktionsenzymverdau und Elektrophorese hergestellt werden.
Nucleinsäure kann unter Verwendung einer Varianten- oder Allel-spezifischen Sonde gescreent werden. Solch eine Sonde entspricht in ihrer Sequenz einer Region des POLL-Gens oder ist ein Komplement davon, das eine Sequenzänderung enthält, die dafür bekannt ist, mit einer Anfälligkeit gegenüber den oben genannten Leiden assoziiert zu sein. Unter geeignet stringenten Bedingungen ist spezifische Hybridisierung solch einer Sonde an die Test-Nucleinsäure ein Hinweis auf die Gegenwart der Sequenzänderung in der Test-Nucleinsäure. Um effizient screenen zu können, kann mehr als eine Sonde an derselben Testprobe verwendet werden.
Allel- oder Varianten-spezifische Oligonucleotide können ähnlich in PCR verwendet werden, um bestimmte Sequenzen spezifisch zu amplifizieren, sofern diese in einer Testprobe vorhanden sind. Eine Bewertung, ob eine PCR-Bande eine Genvariante enthält, kann auf zahlreiche, Fachleuten vertraute Weisen durchgeführt werden. Das PCR-Produkt kann beispielsweise auf eine Weise behandelt werden, die die Möglichkeit gibt, die Mutation oder den Polymorphismus an einem denaturierenden Polyacrylamid-DNA-Sequenzierungsgel mit spezifischen Banden zu präsentieren, die an die zu selektierenden Genvarianten gebunden sind.
Eine Alternative oder Ergänzung zur Suche nach der Gegenwart von Sequenz-Varianten in einer Testprobe ist, auf die Gegenwart der normalen Sequenz zu untersuchen, beispielsweise unter Verwendung einer/s geeignet spezifischen Oligonucleotid-Sonde oder -Primers.
Ansätze, die auf der Hybridisierung zwischen einer Sonde und einer Test-Nucleinsäure und der darauf folgenden Detektion einer Fehlpaarung basieren, können verwendet werden. Unter geeigneten Bedingungen (Temperatur, pH usw.) hybridisiert eine Oligonucleotid-Sonde mit einer Sequenz, die nicht vollständig komplementär ist. Der Grad an Basenpaarung zwischen den zwei Molekülen ist für sie ausreichend, trotz einer Fehlpaarung zu anellieren. Verschiedene Ansätze sind auf dem Gebiet der Erfindung zur Detektion einer vorhandenen Fehlpaarung zwischen zwei anellierenden Nucleinsäuremolekülen bekannt.
RNAse A spaltet beispielsweise an der Stelle einer Fehlpaarung. Spaltung kann durch Elektrophorese an einer Test-Nucleinsäure, an die die relevante Sonde oder Sonde anelliert hat, und durch Suchen nach kleineren Molekülen (d.h. Molekülen mit höherer elektrophoretischer Mobilität) als die Volllängen-Sonde/Testhybrid nachgewiesen werden. Andere Ansätze beruhen auf der Verwendung von Enzymen wie beispielsweise Resolvasen oder Endonucleasen.
Somit kann eine Oligonucleotid-Sonde, die die Sequenz einer Region des normalen POLL-Gens (entweder Sense- oder Antisense-Strang) aufweist, in der das Auftreten von Mutationen bekannt ist, an Test-Nucleinsäure anelliert und die Gegenwart oder Abwesenheit einer Fehlpaarung bestimmt werden. Detektion der Gegenwart einer Fehlpaarung kann die Gegenwart einer Mutation in der Test-Nucleinsäure aufzeigen. Andererseits kann eine Oligonucleotid-Sonde, die die Sequenz einer Region des POLL-Gens einschließlich einer Mutation aufweist, an Test-Nucleinsäure anelliert und die Gegenwart oder Abwesenheit einer Fehlpaarung bestimmt werden. Die Abwesenheit einer Fehlpaarung kann ein Hinweis darauf sein, dass die in der Testprobe vorhandene Nucleinsäure die normale Sequenz aufweist. In beiden Fällen kann eine ganze Reihe an Sonden an verschiedenen Regionen des Gens eingesetzt werden.
Die Gegenwart von Unterschieden in der Sequenz von Nucleinsäuremolekülen kann mittels Restriktionsenzymverdau nachgewiesen werden, wie beispielsweise in einem DNA-Fingerprinting-Verfahren, in dem das Restriktionsmuster, das produziert wird, wenn ein oder mehrere Restriktionsenzyme verwendet werden, um eine Nucleinsäure-Probe so schneiden, mit dem Muster verglichen wird, das erhalten wird, wenn eine Probe, die das normale Gen oder eine Variante oder ein Allel enthält, mit demselben Enzym oder denselben Enzymen verdaut wird.
Die Gegenwart oder Abwesenheit eines wichtigen Regulationselements in einem Promotor oder einer anderen Regulationssequenz, die in Intronen angeordnet ist, kann auch durch Bestimmen des Grades an mRNA-Produktion durch Transkription oder des Grades an Polypeptidproduktion durch Translation aus der mRNA bewertet werden.
Eine Nucleinsäure-Testprobe kann beispielsweise durch Extrahieren von Nucleinsäure aus Zellen, z.B. in Speichel oder vorzugsweise Blut, oder für pränatale Tests aus dem Amnion, der Plazenta oder dem Fötus selbst bereitgestellt werden.
Es existieren verschiedene Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit eines bestimmten Polypeptids in einer Testprobe, wie beispielsweise des Polypeptids mit der in Seq.-ID Nr. 4 gezeigten Aminosäuresequenz oder einer Aminosäuresequenz-Mutante, -Variante, -Isoform oder eines Allels davon.
Eine Probe kann auf die Gegenwart eines Bindungspartners für ein spezifisches Bindungselement wie beispielsweise einen Antikörper (oder ein Gemisch aus Antikörpern), der spezifisch für eine oder mehrere bestimmte Varianten des Pol-λ-Polypeptids ist, getestet werden.
Eine Probe kann auf die Gegenwart eines Bindungspartners für ein spezifisches Bindungselement wie beispielsweise einen Antikörper (oder ein Gemisch von Antikörpern), der für das Polypeptid spezifisch ist, getestet werden.
In solchen Fällen kann die Probe durch Kontaktiertwerden mit einem spezifischen Bindungselement wie beispielsweise einem Antikörper unter geeigneten Bedingungen für spezifische Bindung, bevor Bindung bestimmt wird, beispielsweise unter Verwendung eines Reportersystems wie bereits erläutert, getestet werden. Wird eine Reihe von Antikörpern verwendet, so können verschiedene hinweisende Markierungen für jeden Antikörper verwendet werden, sodass Bindung von jedem einzelnen bestimmt werden kann.
Ein spezifisches Bindungselement wie beispielsweise ein Antikörper kann verwendet werden, um sein Bindungspartner-Polypeptid aus einer Testprobe zu isolieren und/oder zu reinigen, um Sequenz- und/oder biochemische Analyse des Polypeptids zu ermöglichen, um zu bestimmen, ob es die Sequenz und/oder Eigenschaften des Pol-λ-Polypeptids besitzt oder ob es eine Mutanten- oder Variantenform ist. Sequenzieren von Aminosäure ist auf dem Gebiet der Erfindung unter Verwendung automatisierter Sequenzierungsapparate ein Routineverfahren.
Pharmazeutika und Peptidtherapien
Pol-λ-Polypeptide und Antagonisten und Agonisten können zur Behandlung eines breiten Bereichs an Störungen nützlich sein. Insbesondere Inhibitoren des Pol-λ-Enzyms könnten verwendet werden, um Krebs zu behandeln, insbesondere in Kombination mit Wirkstoffen, die DNA-Schädigung hervorrufen, z.B. um die Apoptose von Zellen herbeizuführen und dadurch die erkrankten Zellen daran zu hindern, Schädigung, die durch die Behandlung mit dem Wirkstoff verursacht wurde, zu reparieren. Weiters kann die Rolle von Pol-λ in den fehlerauslösenden DNA-Reparaturprozessen zur Auslösung der sekundären Immunantwort führen, wie beispielsweise zu Klassenwechselrekombination und somatischer Hypermutation. Somit könnten Pol-λ-Inhibitoren bei der Behandlung von Immunsuppression, Psoriasis, Arthritis und Transplantatabstoßung verwendet werden.
Pol-λ-Polypeptide, Inhibitoren, Antagonisten (z.B. Antikörper), Peptide und Nucleinsäure der Erfindung können zu pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert werden. Diese Zusammensetzungen können zusätzlich zu einer der oben genannten Substanzen einen pharmazeutisch annehmbaren Arzneimittelträger, Träger, Puffer, Stabilisator oder andere Materialien, die Fachleuten bekannt sind, umfassen. Solche Materialien sollten nicht-toxisch sein und sollten die Wirksamkeit des Wirkstoffs nicht beeinträchtigen. Die exakte Beschaffenheit des Trägers oder des anderen Materials kann von der Art der Verabreichung, z.B. auf oralem, intravenösem, kutanem oder subkutanem, nasalem, intramuskulärem oder intraperitonealem Weg, abhängen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung kann in Tabletten-, Kapsel-, Pulver- oder Flüssigform vorliegen. Eine Tablette kann einen festen Träger wie beispielsweise Gelatine oder ein Adjuvans umfassen. Flüssige pharmazeutische Zusammensetzungen umfassen im Allgemeinen einen flüssigen Träger wie beispielsweise Wasser, Petroleum, tierische oder pflanzliche Öle, Mineralöl oder synthetisches Öl. Physiologische Kochsalzlösung, Dextrose oder eine andere Saccharidlösung oder Glykole wie beispielsweise Ethylenglykol, Propylenglykol oder Polyethylenglykol können ebenfalls eingebunden werden.
Für intravenöse, kutane oder subkutane Injektion oder Injektion an der erkrankten Stelle kann der Wirkstoff in Form einer parenteral annehmbaren, wässrigen Lösung vorliegen, die pyrogenfrei ist und geeignete(n) pH, Isotonie und Stabilität aufweist. Fachleute werden in der Lage sein, geeignete Lösungen unter Verwendung von beispielsweise isotonischen Vehikeln, wie beispielsweise Natriumchlorid-Injektion, Ringer-Injektion oder laktierter Ringer-Injektion, herzustellen. Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Puffer, Antioxidanzien und/oder andere Additive können, wie erforderlich, eingebunden werden.
Unabhängig davon, ob es ein Polypeptid, Antikörper, Peptid, Nucleinsäuremolekül, kleines Molekül oder eine andere pharmazeutisch nützliche Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung ist, die es einem Individuum zu verabreichen gilt, erfolgt die Verabreichung vorzugsweise in einer "prophylaktisch wirksamen Menge" oder einer "therapeutisch wirksamen Menge" (je nachdem, wobei jedoch Prophylaxe auch als Therapie betrachtet werden kann), die ausreichend ist, um dem Individuum Nutzen zu bringen. Die tatsächliche verabreichte Menge und die Häufigkeit und zeitliche Planung der Verabreichung hängen von der Beschaffenheit und Schwere des zu behandelnden Leidens ab. Die Verschreibung einer Behandlung, z.B. die Entscheidung über die Dosierung usw., liegt innerhalb des Kompetenzbereichs des Allgemeinmediziners und anderer Ärzte und berücksichtigt typischerweise die zu behandelnde Erkrankung, den Zustand des einzelnen Patienten, den Ort der Verabreichung, das Verabreichungsverfahren und andere Faktoren, die Ärzten bekannt sind. Beispiele für die oben erwähnten Verfahren und Arbeitsvorschriften sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, A. Osol (Hrsg.) (1980), zu finden.
Alternativ dazu können Targeting-Therapien verwendet werden, um den aktiven Wirkstoff durch die Verwendung von Targeting-Systemen wie beispielsweise Antikörper oder zellspezifischen Liganden noch spezifischer bestimmten Zelltypen zuzuführen. Targeting kann aus zahlreichen verschiedenen Gründen wünschenswert sein; beispielsweise, wenn das Mittel beispielsweise unannehmbar toxisch ist oder wenn es zu hohe Dosierungen erfordern würde oder wenn es anders nicht in der Lage sein würde, in die Target-Zellen einzudringen.
Anstelle einer direkten Verabreichung dieser Mittel könnten sie in den Target-Zellen durch Expression aus einem kodierenden Gen, das in die Zellen eingeführt wird, z.B. in einem Virus-Vektor (eine Variante des VDEPT-Verfahrens – siehe unten), gebildet werden. Der Vektor könnte auf die spezifischen zu behandelnden Zellen gerichtet werden oder er könnte Regulationselemente enthalten, die mehr oder weniger selektiv durch die Target-Zellen angeschaltet werden.
Alternativ dazu könnte das Mittel in einer Vorläuferform zur Umsetzung in die aktive Form durch ein aktivierendes Mittel, das in den zu behandelnden Zellen produziert wird oder auf diese Zellen gerichtet wird, verabreicht werden. Diese Art von Ansatz ist manchmal als ADEPT oder VDEPT bekannt; Ersteres bindet das Targeting des aktivierenden Mittels auf die Zellen durch Konjugation an einen zellspezifischen Antikörper ein, während Letzteres die Produktion des aktivierenden Mittels, z.B. eines Enzyms, in einem Vektor durch Expression aus kodierender DNA in einem viralen Vektor umfasst (siehe beispielsweise die EP-A-415731 und WO90/07936).
Eine Zusammensetzung kann alleine oder in Kombination mit anderen Behandlungen, entweder gleichzeitig oder nacheinander, je nach dem zu behandelnden Leiden, verabreicht werden.
Verfahren zum Screenen auf Pol-λ-Inhibitoren und -Wirkstoffe
Ein Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung kann beim Screenen auf Moleküle, die seine Aktivität oder Funktion beeinflussen oder modulieren, verwendet werden. Solche Moleküle können in einem therapeutischen (möglicherweise einschließlich prophylaktischen) Zusammenhang nützlich sein.
Es ist durchwegs bekannt, dass pharmazeutische Forschung, die zur Identifikation eines neuen Wirkstoffs führt, das Screenen sehr großer Mengen an vermutlichen Substanzen umfassen kann, bevor und sogar nachdem eine Leitverbindung gefunden wurde. Dies ist ein Faktor, der pharmazeutische Forschung sehr kostspielig und zeitaufwendig macht. Mittel zur Unterstützung von Screeningverfahren können daher beachtliche wirtschaftliche Bedeutung und Nützlichkeit tragen.
Ein Verfahren zum Screenen auf eine Substanz, die Aktivität eines Polypeptids moduliert, kann das Kontaktieren einer oder mehrerer Testsubstanzen mit dem Polypeptid in einem geeigneten Reaktionsmedium, das Testen der Aktivität des behandelten Polypeptids und das Vergleichen dieser Aktivität mit der Aktivität des Polypeptids im Vergleichs-Reaktionsmedium, das nicht mit der/n Testsubstanzen) behandelt wurde, umfassen. Ein Unterschied bezüglich der Aktivität zwischen den behandelten und unbehandelten Polypeptiden ist ein Hinweis auf eine modulierende Wirkung der relevanten Testsubstanz oder -substanzen.
Kombinatorische Bibliothekstechnologie liefert einen wirksamen Weg zum Testen einer möglicherweise großen Menge an verschiedenen Substanzen auf die Fähigkeit, Aktivität eines Polypeptids zu modulieren. Solche Bibliotheken und ihre Verwendung sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Die Verwendung von Peptidbibliotheken wird bevorzugt.
Bevor oder während Testsubstanzen auf Aktivitätsmodulation gescreent werden, können sie auf ihre Fähigkeit, mit dem Polypeptid wechselzuwirken, z.B. in einem Hefe-Zwei-Hybrid-System (das erfordert, dass sowohl das Polypeptid als auch die Testsubstanz in Hefe aus kodierender Nucleinsäure exprimiert werden), gescreent werden. Dies kann als ein Grob-Screen vor dem Testen einer Substanz auf die tatsächliche Fähigkeit, Aktivität des Polypeptids zu modulieren, verwendet werden. Alternativ dazu könnte der Screen verwendet werden, um Testsubstanzen auf Bindung an einen Pol-λ-spezifischen Partner zu screenen, um Mimetika des Pol-λ-Polypeptids, z.B. zum Testen als Therapeutika, zu finden.
Nach der Identifikation einer Substanz, die Polypeptidaktivität moduliert oder beeinflusst, kann die Substanz näher untersucht werden. Darüber hinaus kann sie bei der Herstellung, d.h. Bildung oder Formulierung, einer Zusammensetzung solch eines Medikaments, einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder eines Wirkstoffs gebildet und/oder verwendet werden. Diese können Individuen verabreicht werden.
Beispiele
Beispiel 1: Klonieren der cDNA, die menschlicher Pol-λ entspricht.
Klonieren des menschlichen POLL-Gens wurde durch Identifikation in der öffentlichen Datenbank dbEST/GeneBank einer Sammlung von ESTs, die eine hohe Ähnlichkeit mit der cDNA-Sequenz des Maus-POLL-Gens zeigten, das vorher im Labor der Erfinder erhalten wurde, initiiert. Diese ESTs tragen die folgenden Identifikationsnummern: AA742404, AA 922738, AI091150, AA 989195, W69567, AI123218, AI199486, AA576526, W69888, T81701 und H11886. Alle von diesen entsprachen der 3'-untranslatierten Region mit Ausnahme der EST H11886, die einen Teil der Kodierregion von Pol-λ zu enthalten schien. Beginnend bei Gesamt-cDNA, die aus menschlicher Plazenta gewonnen wurde, wurde die Pol-λ entsprechende cDNA durch PCR-Amplifikation als eine Reihe von überlappenden Fragmenten (1) erhalten. Das erste Fragment (a136-20, 1) wurde durch spezifische PCR unter Verwendung von Primern erhalten, die aus den oben beschriebenen ESTs stammen. Dieses Fragment überlappte mit der Sequenz der EST H11886 und mit der Sammlung an ESTs, die dem 3'-Ende entsprachen. Dieses Fragment, 1419 bp lang, erstreckt sich über die Positionen 1107 bis 2525 der hier beschriebenen vollständigen cDNA. Das 3'-terminale Segment, von 2526 bis 2678, wurde aus dem Consensus der ESTs abgeleitet.
Das zweite Fragment (a60-a, 1) wurde durch semi-spezifische PCR mit einem Sense-Primer, der aus der murinen Sequenz in der Nähe des Startcodons stammt, und einem Antisense-Primer, der aus dem menschlichen PCR-Fragment a136-20 stammt, erhalten. Dieses zweite Fragment, 996 bp lang, enthält die Kodiersequenz, die den Positionen 380 und 1375 von menschlicher Pol-λ-cDNA entspricht. Die cDNA-Sequenz wurde mit Fragment a91 (1), erhalten durch RACE 5', einem 504 bp langem Fragment, das die untranslatierte 5'-Region enthält, und dem anfänglichen Abschnitt der Kodierregion vervollständigt. Daher enthält die vollständige cDNA von menschlicher Pol-λ insgesamt 2678 bp mit einer 5'-untranslatierten Region von 371 bp (1–371), einer Kodiersequenz, die sich über 1728 bp (372–2099) erstreckt, und einer 3'-untranslatierten Region von 579 bp (2100–2678). Das entsprechende Protein, Pol λ, weist 575 Aminosäurereste auf. Die den Maus-Homologen und menschlichen Homologen von Pol-λ entsprechenden Kodiersequenzen haben eine 84%ige Identität auf DNA-Niveau gemeinsam. Auf Proteinniveau weisen die Maus- und menschliche Pol-λ insgesamt eine Identität von 80 % auf, die in den am stärksten konservierten Domänen 90 % erreicht und in der Region, die die BRCT-Domäne und den Pol-β-Kern verbindet, auf 57 % reduziert ist.
Beispiel 2: PCR-Analyse für Pol-λ-Varianten in cDNA verschiedenen Ursprungs, normal und tumoral.
Um die Expression der Spleißvarianten hPOLLdelta6 und hPOLLdelta(6+7) in verschiedenen Geweben zu berechnen, entwickelten die Erfinder einen Test zur Detektion dieser Varianten auf cDNA-Niveau. Dieser Test beruht auf der Verwendung spezifischer Primer, die es ermöglichen, cDNA-Fragmente entsprechend jeder bestimmten Variante von Pol-λ zu amplifizieren. Als spezifische Primer, die in der Lage sind, unter den verschiedenen Varianten zu unterscheiden, wurden Spleiß-spezifische Sense-Primer verwendet, während ein gewöhnlicher Antisense-Primer in allen Fällen verwendet wurde.
Antisense-Primer für beide Varianten, genannt 2B2, der einer gemeinsamen, an Exon 9 angeordneten Region entspricht:
2B2 5'-GGA GCG GTT GAA GTG TGC-3'
Sense-Primer, der für die Variante hPOLLdelta6 spezifisch ist, genannt 2B3, wurde auf solch eine Weise entworfen, dass seine ersten 11 5'-Nucleotide dem Ende von Exon 5 entsprechen, während der Rest des Primers den Anfangssequenzen von Exon 7 entsprechen:
2B3 5'-CCT CGT ACG AGG GCT TCC-3'
Andererseits, und gemäß identischen Kriterien, wurde der spezifische Primer, der der Variante hPOLLdelta(6+7), genannt 2B4, entspricht, auf solch eine Weise entworfen, dass seine ersten 5'-Nucleotide dem Ende von Exon 5 entsprechen und die verbleibenden Nucleotide der Anfangssequenz von Exon 8 entsprechen:
2B4 5'-CAC CTC GTA CCA GGT CCA GA-3'.
Um den Test durchzuführen, enthielten getrennte Reaktionsröhrchen cDNA-Proben unterschiedlicher Abstammung und die folgenden Primer-Kombinationen: 1) 2B3 und 2B2 (2 und 3) und 2B4 und 2B2 (4) bei einer individuellen Konzentration von 1 μM. Das Reaktionsgemisch enthielt 10 mM Tris-HCl, pH 9,50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,2 mM von jedem Nucleotid (dATP, dCTP, dGTP und dTTP) und 0,025 U/ml Taq-DNA-pol. Die Reaktionen fanden im Laufe von 40 PCR-Zyklen statt, wobei jeder Zyklus festgelegt war auf: 10 s bei 94 °C und 20 s bei 60 °C. Die Identität der Fragmente wurde durch Klonieren und Sequenzieren bestätigt.
Beispiel 3: Expression und Reinigung von Maus-Pol-λ und Bildung spezifischer Antikörper.
Die cDNA-Region, die für Pol-λ kodiert, wurde aus dem Plasmid, das vom LLNL bereitgestellt wurde, unter Verwendung von Primern, die für ein weiteres Klonieren in die Stellen EcoRI und NdeI von Vektor pT7 oder in die Stellen EcoRI und BamHI von Expressionsplasmid pRSET-A (Invitrogen) entworfen waren, PCR-amplifiziert. Im letzten Fall wurde eine 6 × Histidinmarkierung am N-Terminus des rekombinanten Proteins hinzugefügt.
Zur Transformation wurde der E.-coli-Stamm TOP10F' verwendet. Nach Überprüfen aller Konstrukte durch Sequenzieren wurde Transformation im E.-coli-Stamm BL21 (DE3) pLysS durchgeführt, der das T7-RNA-Polymerasegen unter der Steuerung des lacUV5-Promotors, induzierbar durch IPTG, trägt. Induktion von Pol-λ-Expression wurde bei 30, 32 und 37 °C bei einer optischen Dichte von 0,6 (A600) durchgeführt. IPTG (Sigma) in einer Konzentration von 0,5 mM wurde zugesetzt. Wenn induziert, wurde Rifampicin (Sigma) 20 min nach Induktion in einer Konzentration von 120 μg/ml zugesetzt. Die optimale Induktionsdauer erwies sich als 2 h. Alternativ dazu wurde Induktion in der Gegenwart von 2,5 mM Betaina (Sigma) und 1 M Sorbit (BDH) durchgeführt. Unter allen getesteten Bedingungen war die Maus-Pol-λ unlöslich. Im Gegensatz dazu resultierte Expression der menschlichen Pol-λ in E. coli unter Einhaltung derselben Vorgehensweise in einem löslichen und aktiven Protein.
Die unlösliche Fraktion, entsprechend der Maus-Pol-λ, die in E. coli exprimiert wurde, wurde zur Bildung polyklonaler Antikörper verwendet. Nach Trennung durch Elektrophorese in Gegenwart von SDS wurde die Pol-λ entsprechende Bande aus dem Gel geschnitten und unter Verwendung einer "French-Presse" trituriert. Aliquoten, die 100 μg von Pol-λ entsprachen, wurden als ein Antigen zur Immunisierung von Kaninchen durch mehrfache intradermale Inokulationen verwendet. Das unter Einhaltung standardmäßiger Arbeitsvorschriften erhaltene Serum war in der Lage, Pol-λ durch Western-Blot-Analyse spezifisch zu erkennen.
Beispiel 5: PCR/SSCP-Screenen der gesamten Kodierregion von menschlicher Pol-λ.
Eine Gruppe von cDNA-Bibliotheken aus normalen Geweben gegenüber tumoralen menschlichen Geweben (Clontech) wurde als eine Matrix verwendet, um auf mögliche genetische Veränderungen im menschlichen Pol-λ-Gen zu suchen. Primer-Sets wurden so ausgewählt, dass sie die gesamte Kodiersequenz des menschlichen Pol-λ-Gens abdeckten. Die erhaltenen Amplimere wurden getrennt mittels SSCP gescreent. Unter Verwendung der Primer:
Sense 5' GGC ATG TGG TTC ATA CCG AC und
Antisense 5' GGA GCG GTT GAA GTG TGC wurde ein Abschnitt der katalytischen Domäne (~ 320 bp) von Pol-λ amplifiziert, wobei das PCR-Produkt aus dieser Region die polymorphe Variante einschließt.
Matrix-Aliquoten wurden 5 × verdünnt, und die resultierende Aliquote wurde als ein 5 × Material für PCR verwendet. Alle PCR-Reaktionen wurden bei Standardbedingungen unter Verwendung von 10 pmol von jedem Primer, 0,25 mM dNTPs, 1 × Taq-Puffer (10 mM Tris, 50 mM KCl, Gelatine, 0,2 mg/ml BSA, pH 8,5), 0,25 U Taq-Polymerase zu einem Gesamtvolumen des PCR-Gemischs von 10 ml durchgeführt. PCR-Parameter waren wie folgt im Laufe von 35 Zyklen: 94 °C/15 s zur Denaturierung; 60 °C/30 s zum Primer-Anellieren; und 72 °C/15 s zur Extension. PCR-Produkte wurden dann SSCP-Analyse unterzogen.
Genomische DNA von 12 nicht verwandten Individuen wurde aus peripheren Blutlymphozyten wie beschrieben hergestellt. PCRs wurden mit etwa 20–50 ng genomischer DNA unter Standardbedingungen durchgeführt: 10 pmol von jedem Primer, 0,25 M dNTPs, 1 × Taq-Puffer (10 mM Tris, 50 mM KCl, Gelatine, 0,2 mg/ml BSA, pH 8,5), 0,25 U Taq-Polymerase zu einem Gesamtvolumen des PCR-Gemischs von 10 ml. Die Sequenz der Primer zur Amplifikation des Abschnitts der katalytischen Domäne von menschlicher Pol-λ (gesamtes Exon 8) lautete: Sense 5' GGC ATG TGG TTC ATA CCG AC; Antisense 5' TTC CTG CCG AAG ACT GTC A. PCR-Parameter lauteten wie folgt im Laufe von 35 Zyklen: 94 °C/15 s zur Denaturierung; 60 °C /30 s zum Primer-Anellieren; und 72 °C/15 s zur Extension. PCR-Produkte wurden in TA-Klonierungsvektor pCRII (Invitrogen) kloniert und durch automatisiertes Didesoxy-Terminations-Farbstoffverfahren an einem automatischen Sequenzierungsautomaten ABI 373 (Applied Biosystems) sequenziert.
Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus-(SSCP-)Analyse wurde wie beschrieben (Orita et al. (1989)) durchgeführt. PCR-Produkte wurden in 1× Formamid-Ladungsfarbstoff verdünnt und bei 95 °C 3 min lang denaturiert. Proben wurden dann auf 8 % Polyacrylamidgel, das 15 % Glycerin enthielt, aufgetragen. Nach dem Durchgang wurde das Gel wie beschrieben silbergefärbt: 15 min Fixierung in 10 % Ethanol, 10 min Inkubation mit 1 % HNO₃, 30 min Inkubation mit 0,2 % AgNO₃, das 0,1 % Formaldehyd enthält, und Entwicklung mit 3 % Na₂CO₃, das 0,05 % Formaldehyd enthält, bis die Banden aufscheinen; 10 min Fixierung mit 10 % Essigsäure.
Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus (SSCP) und DNA-Sequenzieren wurden verwendet, um überlappende PCR-Produkte, die die vollständige cDNA von menschlicher Pol-λ abdecken, auf der Suche nach vorhandenen Mutationen, die mit Krebs assoziiert sind, zu analysieren. Anfänglich wurde eine Gruppe von normalen Geweben im Vergleich zu tumoralen menschlichen Geweben (Clontech) verwendet. Wie in 5 gezeigt, wurde eine veränderte Mobilität in der SSCP-Analyse im Fall von Ovarialkarzinom-cDNA-Bibliothek in einem Abschnitt von menschlicher Pol-λ nahe der katalytischen Stelle beobachtet. Klonieren und Sequenzieren dieser Fragmente identifizierte eine einfache Basenpaarsubstitution, die in einer homozygoten Form in Ovarialkarzinom-cDNA vorhanden war, während eine heterozygote Konstitution in den SSCP-Profilen nachgewiesen wurde, die normaler Ovarialgewebe-cDNA-Bibliothek entsprachen. Eine einfache Basenpaaränderungs-Transition (C zu T) an Position 1683 von Pol-λ-cDNA resultiert in einer Änderung des Aminosäurerests 438 (Arg) zu Tryptophan (Trp) in der Kodierregion von Pol-λ. Die Erfinder analysierten das Auftreten dieses bestimmten Polymorphismus in der Bevölkerung durch Scree nen der genomischen DNA von 12 nicht verwandten Individuen. Die Resultate zeigten eine Mendel-Spaltung dieses Polymorphismus mit einer geringfügigen Dominanz des Allels, das für die Version mit Arg kodiert. Aktivitätstests von menschlicher Pol-λ für jede bestimmte Allelvariante wurden anschließend untersucht.
Beispiel 6: In-situ-Hybridisierung
Nicht-radioaktive In-situ-Hybridisierung wurde an Gewebeschnitten mit einer Dicke von 12–14 μm, die auf Poly-L-Lysin-beschichtete Glasobjektträger platziert wurden, durchgeführt. Hoden von 20 Tage alten Säuglingen und Erwachsenen wurden seziert und unverzüglich in 4%igem Paraformaldehyd in DEPC-behandelter PBS bei 4 °C über Nacht fixiert. In Agar gebettete Schnitte wurden mit 0,1 μg/ml Digoxigeninmarkierten Sense- oder Antisense-Ribosonden (Boehringer Mannheim) hybridisiert. Schließlich wurden die Schnitte mit Hoechst 33258 gefärbt, unter Fluoreszenz- und Hellfeldmikroskopie beobachtet und mit CCD-Kamera aufgezeichnet. Dann wurden die Deckgläser entfernt, die Schnitte dehydratisiert und in DePeX (Serva) eingedeckt.
Diese Versuche zeigten, dass Pol-λ-mRNA in proliferierenden Spermatogonia nicht nachweisbar war, jedoch im Zytoplasma von Spermatozyten des Pachytän-Stadiums reichlich vorhanden war, ein Stadium, in dem meiotische Rekombination auftritt.
Beispiel 7: Biochemische Charakterisierung von menschlicher Pol-λ
Die Detektion von Spleißvarianten (nicht trunkiert) von menschlicher Pol-λ, die funktionelle Versionen der DNA-Polymerase aufweisen könnten, zeigte verblüffende Resultate, da manche dieser Formen in Tumorproben spezifisch exprimiert zu werden scheinen. Die Erfinder untersuchten daher, ob diese Formen veränderte (Mutator-) Varianten der Polymerase darstellen könnten, die für Tumorgenese folgenreich sein könnten.
Den Erfindern gelang es auch, die menschliche Pol-λ in E. coli in einer löslichen und aktiven Form zu exprimieren. Vorläufige Daten weisen darauf hin, dass Pol-λ hoch fehlerauslösend ist, und dies unterstützt die Tatsache, dass Pol-λ-Funktion mit DNA-Reparatur während der Meiose assoziiert werden könnte und muss nachgeprüft werden. Pol-λ wird vorzugsweise in Keimzellen exprimiert, die mit dem Prozess assoziiert sind, der die Gameten hervorbringt. Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass dieses Enzym in der Lage ist, Mutationen einzuführen, wenn es an unbeschädigten Matrices polymerisiert wird, könnte die Funktion von Pol-λ auch jene sein, einen bestimmten Grad an Variabilität in unseren Keimlinien zu produzieren, und solch ein Mutagenese-Hintergrund könnte für die Genomevolution maßgeblich sein.
Die Beweise für solch eine mutmaßliche Funktion stammen aus der In-vitro-Analyse der DNA-Polymerisation, die durch menschliche Pol-λ katalysiert wird. Um zu zeigen, dass sich Pol-λ als eine Mutase verhält, verwendeten die Erfinder einen eindeutigen In-vitro-Test, in dem der Matrix-Strang homopolymer (poly-dT) ist und der Primer-Strang (oligo-dA) daher mit dATP als dem einzigen Korrekten (komplementäres Nucleotid) verlängert werden kann. Nicht wie bei einem Kontrollenzym mit signifikanter Insertionspräzision (Klenow) war die Inkorporation von markiertem dATP durch menschliche Pol-λ durch den Zusatz einer relativ geringen Konzentration (1 μM) von jedem der nicht-komplementären Desoxynucleotide stark inhibiert. Der Inhibitionsgrad war sogar höher als jener, der zuvor für Pol-mu (eine Mutase) festgehalten wurde (siehe 7).
8 zeigt auch, dass die Inhibition von Pol-λ nicht von der Beschaffenheit der im Test verwendeten aktivierenden Magnesium- oder Mangan-Ionen abhängt.
Somit ist es wahrscheinlich, dass die Neigung zur Fehlerauslösung von Pol-λ dieses Enzym zu einem guten Kandidaten zur Schaffung/Änderung von DNA-Information während Prozesse macht, die dazu konzipiert sind, Variabilität zu schaffen, beispielsweise somatische Hypermutation und/oder vielleicht vorwiegend als ein spezifischer Prozess, der während der Gametogenese auftritt. Die letzte Annahme wurde durch die vorwiegende Expression von Pol-λ in Pachytän-Spermatozyten und runden Spermatiden untermauert.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes DNA-Polymerase-λ-(Pol-λ-)Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß Seq.-ID Nr. 5.
Pol-λ-Polypeptid nach Anspruch 1, worin der Argininrest an Position 438 durch Tryptophan substituiert ist.
Isoliertes DNA-Polymerase-λ-(Pol-λ-)Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz gemäß Seq.-ID Nr. 2.
Isolierte DNA-Polymerase-λ-Polypeptidisoform, umfassend Aminosäuresequenzen gemäß einer der Seq.-ID Nr. 7, 9 oder 11.
Isoliertes Polypeptid, das DNA-Polymeraseaktivität aufweist und das zumindest 60 % Aminosäuresequenzidentität mit dem Pol-λ-Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 aufweist.
Isoliertes Polypeptid, das DNA-Polymeraseaktivität aufweist und durch Nucleinsäure kodiert ist, die in der Lage ist, unter stringenten Bedingungen an eine Nucleinsäuresequenz zu hybridisieren, die für das Pol-λ-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 kodiert.
Isoliertes Polypeptid, das DNA-Polymeraseaktivität aufweist und eine Sequenzvariante oder ein Allel eines Pol-λ-Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 mit zumindest 60 % Sequenzidentität zu einer der Aminosäuresequenzen, die in den Seq.-ID Nr. 1 oder 4 gezeigt sind, ist.
Isoliertes Fragment oder aktiver Abschnitt eines Pol-λ-Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin der aktive Abschnitt oder das Fragment DNA-Polymeraseaktivität aufweist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das für ein Pol-λ-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8 kodiert.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, umfassend die Pol-λ-Kodiersequenz gemäß Seq.-ID Nr. 1 oder 4.
Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 10, das einen einzelnen Nucleotidpolymorphismus (C zu T) an Position 1683 von Pol-λ-cDNA aufweist, was zu einer Änderung des Aminosäurerestes 438 (Arg) zu Tryptophan (Trp) führt.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, umfassend Nucleinsäure, die eine Sequenz gemäß Seq.-ID Nr. 6, 8 oder 10 aufweist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das DNA-Polymeraseaktivität aufweist und zumindest 90 % Sequenzidentität mit der Pol-λ-Kodiersequenz gemäß Seq.-ID Nr. 1 oder 4 aufweist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid mit DNA-Polymeraseaktivität kodiert und das in der Lage ist, unter wie hierin offenbarten stringenten Bedingungen an eine Nucleinsäuresequenz gemäß Seq.-ID Nr. 1, 4, 6, 8 oder 10 zu hybridisieren.
Expressionsvektor, umfassend eine Nucleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 8 bis 14, operabel an Kontrollsequenzen gebunden, um ihre Expression zu steuern.
Vektor nach Anspruch 15, worin der Vektor ein Plasmid, Cosmid, Bakteriophage oder viraler Vektor ist.
Wirtszelle, transformiert mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 15 oder Anspruch 16.
Verfahren zur Herstellung eines Pol-λ-Polypeptids oder einer Isoform, eines Fragments oder eines aktiven Abschnitts davon, umfassend das Kultivieren der Wirtszellen nach Anspruch 17 und das Isolieren des so hergestellten Pol-λ-Polypeptids.
Vektor, umfassend die Nucleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 10 bis 14 zur Verwendung in einem Verfahren der Gentherapie.
Zusammensetzung, umfassend ein Pol-λ-Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 10 bis 14.
Zusammensetzung, umfassend ein Pol-λ-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
Pol-λ-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Verwendung in einem Verfahren zur medizinischen Behandlung.
Antikörper, der in der Lage ist, sich spezifisch an ein Pol-λ-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zu binden.
Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 23 zur (a) Detektion oder Quantifizierung der Gegenwart oder Menge eines Pol-λ-Polypeptids in einem Test oder (b) Reinigung eines Pol-λ-Polypeptids oder (c) als ein Inhibitor der biologischen Pol-λ-Aktivität.
Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers, der in der Lage ist, sich spezifisch an Pol λ zu binden, wobei das Verfahren die Verwendung des Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 8 als ein Immunogen umfasst.
Verwendung eines Pol-λ-Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zum Screenen von Kandidatenverbindungen, die (a) eine biologische Pol-λ-Aktivität ge meinsam haben oder (b) sich an das Pol-λ-Polypeptid binden oder (c) eine biologische Aktivität eines Pol-λ-Polypeptids hemmen.
Verwendung eines Pol-λ-Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 8, das DNA-Polymeraseaktivität aufweist, zur Reparatur oder Rekonstruktion eines DNA-Moleküls.
Verwendung des Nucleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 10 bis 14 zum Entwurf von Primern für die Amplifikation einer Pol-λ-Nucleinsäuresequenz.
Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart von Pol-λ-Nucleinsäure oder einer mutierten Form davon und/oder von Mutationen innerhalb einer Nucleinsäuresequenz in einer Testprobe, umfassend: (a) Kontaktieren einer Nucleinsäuretestprobe mit einer Sonde, die in der Lage ist, an die Nucleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 10 bis 14 zu hybridisieren; und (b) Bestimmen, ob sich die Nucleinsäurensonde an die Nucleinsäure bindet, die in der Testprobe vorhanden ist.
Verfahren zur Amplifikation einer Pol-λ-Nucleinsäuresequenz in einer Testprobe, umfassend: (a) Amplifizieren der Pol-λ-Nucleinsäuresequenz mit einem Primer, der auf der Nucleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 10 bis 14 basiert; und (b) Trennen der so hergestellten, amplifizierten Pol-λ-Nucleinsäure.
Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart von Pol-λ-Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 9 bis 14 oder von Pol-λ-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in einer Testprobe, wobei das Verfahren einen oder mehrere der folgenden Schritte umfasst: (a) Vergleichen der Nucleinsäuresequenz in der Probe mit der ganzen Pol-λ-Nucleinsäuresequenz gemäß Seq.-ID Nr. 4 oder mit einem Teil davon, um zu bestimmen, ob die Probe des Patienten eine oder mehrere Mutationen enthält; oder (b) Bestimmen der Gegenwart des Pol-λ-Polypeptids in einer Probe von einem Patienten und, sofern dieses vorhanden ist, Bestimmen, ob das Polypeptid ein Volllängenpolypeptid und/oder vom Wildtyp und/oder eine Isoform des Wildtyp-Polypeptids ist und/oder bei normalen Konzentrationen exprimiert wird; oder (c) Verwenden von DNA-Fingerprinting zum Vergleichen des Restriktionsmusters, das produziert wird, wenn ein Restriktionsenzym eine Nucleinsäureprobe von einem Patienten schneidet, mit dem Restriktionsmuster, das aus der Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 9 bis 14 erhalten wird; oder (d) Verwenden eines spezifischen Bindungselements, das in der Lage ist, sich an eine Pol-λ-Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 9 bis 14 zu binden, worin das spezifische Bindungselement Nucleinsäure umfasst, die mit der Pol-λ-Nucleinsäuresequenz hybridisierbar ist, oder von Substanzen, die eine Antikörperdomäne mit Spezifität für eine native oder mutierte Pol-λ-Nucleinsäuresequenz oder das durch diese kodierte Polypeptid umfasst, wobei das spezifische Bindungselement so markiert ist, dass Bindung des spezifischen Bindungselements an seinen Bindungspartner nachweisbar ist; oder (e) Verwenden von PCR, die einen oder mehrere Primer einbindet, der auf der Sequenz nach einem der Ansprüche 9 bis 14 basiert, zum Screenen auf normales oder mutiertes POLL-Gen in einer Probe von einem Patienten.
Verfahren nach Anspruch 31, worin die Pol-λ-Nucleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 9 bis 14 eine Mutation an Position 2576, um Cytosin für Thymidin zu substituieren, und eine Mutation an Position 2579, um Thymidin für Guanidin zu substituieren, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 31 oder Anspruch 32, worin das Verfahren zur Diagnose der Prognose eines Tumors dient, der mit Pol-λ oder einer Isoform davon assoziiert ist.
Verfahren zur Identifikation einer Verbindung, die in der Lage ist, DNA-Reparatur zu modulieren, umfassend: (a) Kontaktieren eines Pol-λ-Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 8 mit einer Kandidatenverbindung; und (b) Bestimmen, ob sich die Kandidatenverbindung an das Pol-λ-Polypeptid bindet und/oder ob sie die DNA-Polymeraseaktivität des Pol-λ-Polypeptids moduliert.
Verfahren nach Anspruch 34, worin das Verfahren in einer Zelllinie durchgeführt wird, die das Pol-λ-Polypeptid exprimiert.
Verfahren nach Anspruch 34 oder Anspruch 35, worin die durch die Verbindung verursachte Modulation in einem Test für DNA-Polymeraseaktivität bestimmt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 34 bis 36, weiters umfassend: (c) Selektieren einer Kandidatenverbindung, die in der Lage ist, die DNA-Polymeraseaktivität von Pol-λ zu hemmen.
Verwendung der Wirtszellen nach Anspruch 17 zur Entwicklung von transgenen, nicht-menschlichen Tieren, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression des Pol-λ-Polypeptids im Gewebe stattfindet oder für das Gewebe spezifisch ist oder da sie einen pathologischen Prozess darstellt, der auf einem Defekt der DNA-Reparatur basiert.