DE69629181T2

DE69629181T2 - Wachstumsfaktor-b, spezifisch für vaskuläre endothelzellen

Info

Publication number: DE69629181T2
Application number: DE69629181T
Authority: DE
Inventors: Ulf Eriksson; Birgitta Olofsson; Kari Alitalo; Katri Pajusola
Original assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Licentia Oy; Ludwig Institute for Cancer Research New York
Current assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Licentia Oy; Ludwig Institute for Cancer Research New York
Priority date: 1995-03-01
Filing date: 1996-03-01
Publication date: 2004-05-13
Anticipated expiration: 2016-03-02
Also published as: CN1146440C; NZ305091A; NO973933D0; US5928939A; ATE245437T1; HK1008485A1; US7341996B2; JPH10510718A; PT814827E; CA2211687A1; CN1176603A; JP3297687B2; AU741856B2; CA2211687C; DK0814827T3; NO973933L; EP0814827A1; WO1996026736A1; US20030170253A1; AU5302196A

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Angiogenese, oder die Proliferation neuer Kapillaren aus bereits existierenden Blutgefäßen, ist ein fundamentaler Prozeß, der für normales Wachstum und normale Entwicklung von Gewebe notwendig ist. Sie ist eine Voraussetzung für die Entwicklung und Differenzierung des Gefäßbaums sowie für eine große Vielzahl fundamentaler physiologischer Prozesse einschließlich Embryogenese, somatischem Wachstum, Gewebe- und Organreparatur und -regeneration, cyclischem Wachstum des Corpus luteum und des Endometriums und Entwicklung und Differenzierung des Nervensystems. Im weiblichen Reproduktionssystem erfolgt Angiogenese zur Etablierung oder zum Erhalt der Schwangerschaft im Follikel während seiner Entwicklung, im Corpus luteum nach Ovulation und in der Plazenta. Zusätzlich erfolgt Angiogenese als Teil der Reparaturprozesse des Körpers, z. B. bei der Heilung von Wunden und Brüchen, Angiogenese ist auch ein Faktor beim Wachstum von Tumoren, da ein Tumor kontinuierlich Wachstum neuer Kapillarblutgefäße stimulieren muß, um zu wachsen.
Kapillarblutgefäße bestehen aus Endothelzellen und Perizyten. Diese beiden Zelltypen tragen alle genetische Information, um Röhren, Äste und ganze kapillare Netzwerke zu bilden. Spezifische angiogene Moleküle können diesen Prozeß initiieren. In Anbetracht der physiologischen Bedeutung der Angiogenese wurde viel Mühe auf die Isolierung, Charakterisierung und Reinigung von Faktoren verwendet, die die Angiogenese stimulieren können. Eine Reihe von Polypeptiden, die die Angiogenese stimulieren, wurden gereinigt und hinsichtlich ihrer molekularen, biochemischen und biologischen Eigenschaften charakterisiert. Für Übersichtsartikel solcher Angiogeneseregulatoren siehe Klagsbrun et al., "Regulators of Angiogenesis", Ann. Rev. Physiol., 53: 217–39 (1991); und Folkman et al., "Angiogenesis", J. Biol. Chem., 267: 10931–934 (1992). Neuere Ergebnisse bringen verschiedene endotheliale Rezeptortyrosinkinasen (RTKs) mit der Etablierung und dem Erhalt des Gefäßsystems in Zusammenhang.
Ein solcher Wachstumsfaktor, der als Mitogen für vaskuläre Endothelzellen hochspezifisch ist, wird vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) genannt. Siehe Ferrara et al., "The Vascular Endothelial Growth Factor Family of Polypeptides", J. Cellular Biochem., 47: 211–218 (1991); Connolly, "Vascular Permeability Factor: A Unique Regulator of Blood Vessel Function", J. Cellular Biochem., 47: 219–223 (1991). VEGF ist ein potentes vasoaktives Protein, das in Medien entdeckt wurde, die durch eine Reihe von Zellinien einschließlich bovinen hypophysären Follikelzellen konditioniert waren. VEGF ist ein glykosyliertes kationisches 46–48 kD-Dimer, das aus zwei 24 kD-Untereinheiten besteht. Es wird durch Sulfhydryl-Reduktionsmittel inaktiviert, ist gegen sauren pH und Erhitzen resistent und bindet an immobilisiertes Heparin. VEGF wird manchmal als vaskulärer Permeabilitätsfaktor (VPF) bezeichnet, weil er nach intradermaler Injektion den Flüssigkeitsaustritt aus Blutgefäßen fördert. Er wurde auch Vaskulotropin genannt.
Es wurden vier verschiedene Molekülspezien von VEGF gefunden. Die Spezies mit 165 Aminosäuren hat ein Molekulargewicht von etwa 46 kD und ist die Molekülform, die in normalen Zellen und Geweben überwiegende gefunden wird. Weiter ist eine weniger häufige, kürzere Form mit einer Deletion von 44 Aminosäuren zwischen den Positionen 116 und 159 (VEGF₁₂₁), eine längere Form mit einer Insertion von 24 stark basischen Resten an Position 116 (VEGF₁₈₉) und eine weitere längere Form mit einer Insertion von 41 Aminosäuren (VEGF₂₀₆), die die in VEGF₁₈₉ gefundene Insertion von 24 Aminosäuren umfaßt, bekannt. VEGF₁₂₁ und VEGF₁₆₅ sind lösliche Proteine. VEGF₁₈₉ und VEGF₂₀₆ scheinen hauptsächlich zellassoziiert zu sein. Alle Isoformen von VEGF sind biologisch aktiv. Beispielsweise ist jede Spezies, wenn sie intradermal appliziert wird, in der Lage, die Extravasation von Evans Blue zu induzieren.
Die verschiedenen VEGF-Spezien werden vom selben Gen codiert und entstehen durch alternatives Spleißen von Messenger-RNA. Diese Schlußfolgerung wird durch Southern Blot- Analyse humaner genomischer DNA gestützt, die zeigt, daß das Restriktionsmuster identisch ist, wenn man entweder eine Sonde für VEGF₁₆₅ verwendet oder eine, die die Insertion in VEGF₂₀₆ enthält. Analyse genomischer Klone in der Region des putativen mRNA-Spleißens zeigt auch eine Intron/Exon-Struktur, die mit alternativem Spleißen konsistent ist.
Die verschiedenen Isoformen von VEGF haben verschiedene chemische Eigenschaften, die zelluläre Freisetzung, Kompartimentalisierung und Bioverfügbarkeit regulieren und möglicherweise auch die Signaleigenschaften der Wachstumsfaktoren modulieren.
Analyse der Nukleotidsequenz des VEGF-Gens weist darauf hin, daß VEGF aus der Familie der Wachstumsfaktoren aus Blutplättchen (Platelet-Derived Growth Factor, PDGF) stammt. VEGF und PlGF sind Liganden für zwei endotheliale RTKs, flt-1 (VEGF-Rezeptor 1, VEGFR1) und flk-1/KDR (VEGF-Rezeptor 2, VEGFR2). Die Aminosäuresequenz von VEGF zeigt etwa 20% Homologie mit den Sequenzen der A- und B-Kette von PDGF sowie eine vollständige Konservierung der in beiden reifen PDGF-Ketten gefundenen Cysteinreste. VEGF₁₆₅, VEGF₁₈₉ und VEGF₂₀₆ enthalten ferner acht zusätzliche Cysteinreste in der carboxyterminalen Region. Der aminoterminalen Sequenz von VEGF gehen 26 Aminosäuren voraus, die einer typischen Signalsequenz entsprechen. Das reife Protein wird unmittelbar nach Abspaltung der Signalsequenz ohne irgendeine intervenierende Prosequenz generiert. Die Existenz einer potentiellen Glykosylierungsstelle an Asn⁷⁴ ist mit anderen Hinweisen konsistent, daß VEGF ein Glykoprotein ist, es wurde jedoch beschrieben, daß das Polypeptid sowohl als glykosylierte als auch als deglykosylierte Spezies vorkommt.
Wie andere Zytokine kann VEGF verschiedene Wirkungen haben, die vom spezifischen biologischen Kontext abhängen, in dem er gefunden wird. VEGF und seine hochaffinen Rezeptoren flt-1 und KDR/flk-1 sind für die Bildung und den Erhalt des Gefäßsystems und sowohl für die physiologische als auch die pathologische Angiogenese erforderlich. VEGF ist ein potentes Mitogen für Endothelzellen und trägt in vivo unmittelbar zur Induktion der Angiogenese bei, indem er das Wachstum der Endothelzellen während der normalen embryonalen Entwicklung, der Wundheilung und der Geweberegeneration und -reorganisation fördert. VEGF ist auch an pathologischen Prozessen wie Wachstum und Metastase solider Tumoren und Ischämie-induzierter Nierenerkrankungen beteiligt. Eine überaus hervorstechende Eigenschaft von VEGF ist seine Spezifität. Er ist in vitro bei 1 ng/ml für Kapillarzellen und humane umbilikale Venenendothelzellen, aber nicht für Nebennierenrindenzellen, Cornea- oder Linsenepithelzellen, vaskuläre glatte Muskelzellen, Corneaendothelzellen, Granulosazellen, Keratinozyten, BHK-21-Fibroblasten, 3T3-Zellen, Rattenembryofibroblasten, humane Plazentafibroblasten und humane Sarcomazellen mitogen. Die Targetzellen-Spezifität von VEGF ist also auf vaskuläre Endothelzellen beschränkt. VEGF kann die gesamte Sequenz von Ereignissen auslösen, die zur Angiogenese führen, und stimuliert Angiogenese in vivo in der Cornea und in einem Heilungsmodell für Knochengewebe. Er ist in der Lage, die Proliferation von sowohl aus kleinen als auch großen Gefäßen isolierten Endothelzellen zu stimulieren. Die Expression von VEGF-mRNR steht zeitlich und räumlich in Beziehung mit der physiologischen Proliferation von Kapillarblutgefäßen im ovarialen Corpus luteum oder im sich entwickelnden Gehirn. VEGF-Expression wird durch Hypoxie ausgelöst, so daß Endothelzellenproliferation und Angiogenese in ischämischen Bereichen besonders stimuliert zu werden scheinen. VEGF besitzt auch eine starke chemoattraktive Wirkung für Monozyten. Ferner induziert VEGF in Endothelzellen Plasminogenaktivator und Plasminogenaktivator-Inhibitor.
Tumorzellen setzen angiogene Moleküle wie VEGF frei, und es wurde gezeigt, daß monoklonale Antikörper gegen VEGF das Wachstum von bestimmten Tumorarten wie Rhabdomyosarkom inhibieren. Siehe Kim et al., "Inhibition of Vascular Endothelial Growth Factor-Induced Angiogenesis Suppresses Tumor Growth in vivo", Nature, 362: 841–844 (1993). Dies läßt vermuten, daß eine Hemmung der VEGF-Wirkung von potentieller therapeutischer Bedeutung bei der Behandlung von Tumoren im allgemeinen und von hochvaskularisierten aggressiven Tumoren im besonderen ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Eine Aufgabe der Erfindung ist es, einen neuen Wachstumsfaktor mit der Eigenschaft bereitzustellen, die Proliferation von Endothelzellen zu fördern.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, isolierte DNA-Sequenzen bereitzustellen, die für einen neuen Wachstumsfaktor codieren, der die Proliferation von Endothelzellen fördert.
Eine Aufgabe der Erfindung ist es ferner, neue Produkte bereitzustellen, die für diagnostische und/oder therapeutische Applikationen geeignet sind.
Diese und weitere Aufgaben werden erfindungsgemäß gelöst, indem eine isolierte DNA bereitgestellt wird, die für ein Protein codiert, das die folgende charakteristische Aminosäuresequenz besitzt (SEQ ID NO: 16):
und die Eigenschaft hat, die Proliferation von Endothelzellen oder Mesodermzellen zu fördern, wobei die DNA ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der DNA von 1 und 2 (SEQ ID NO: 1), der DNA von 3 (SEQ ID NO: 4), der DNA von 5 (SEQ ID NO: 6), der DNA von 7 (SEQ ID NO: 8), der DNA von 10 (SEQ ID NO: 10), der DNA von 12 (SEQ ID NO: 12), der DNA von 14 (SEQ ID NO: 14) und DNAs, die unter stringenten Bedingungen mit wenigstens einer der vorhergehenden DNA-Sequenzen hybridisieren.
Gemäß weiteren Aspekten der Erfindung werden die Aufgaben ebenfalls gelöst, indem ein Protein bereitgestellt wird, das die folgende charakteristische Aminosäuresequenz besitzt
(SEQ ID NO: 16) und die Eigenschaft hat, die Proliferation von Endothelzellen oder Mesodermzellen zu fördern, wobei das Protein eine Sequenz von Aminosäuren umfaßt, die im wesentlichen einer Aminosäuresequenz entspricht, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der Aminosäuresequenz von 1 (SEQ ID NO: 2), der Aminosäuresequenz von 2 (SEQ ID NO: 3), der Aminosäuresequenz von 4 (SEQ ID NO: 5), der Aminosäuresequenz von 6 (SEQ ID NO: 7), der Aminosäuresequenz von 8 (SEQ ID NO: 9), der Aminosäuresequenz von 11 (SEQ ID NO: 11), der Aminosäuresequenz von 13 (SEQ ID NO: 13) und der Aminosäuresequenz von 14 (SEQ ID NO: 15).
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung werden die Aufgaben gelöst, indem pharmazeutische Zubereitungen bereitgestellt werden, die solche Proteine umfassen; und indem Antikörper bereitgestellt werden, die mit solchen Proteinen reagieren oder diese erkennen.
Der neue Wachstumsfaktor der vorliegenden Erfindung, im folgenden als vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor B oder VEGF-B bezeichnet, besitzt hohe strukturelle Ähnlichkeiten mit VEGF und Plazenta-Wachstumsfaktor (PlGF). Alle Formen von VEGF-B enthalten die charakteristische Aminosäuresequenz
(SEQ ID NO: 16) (wobei Xaa einen variablen Rest darstellt), welche ein Kennzeichen der PDGF/VEGF-Familie der Wachstumsfaktoren ist. Diese charakteristische Aminosäuresequenz ist in den Aminosäuren 70 bis 82 in den 4, 6, 8, 11, 13 und 15 zu finden.
Klinische Applikationen der Erfindung umfassen diagnostische Applikationen, Beschleunigung der Angiogenese bei Wundheilung und Inhibierung von Angiogenese, Quantifizierung von VEGF-B bei Biopsieproben von Krebs kann als Indikator für zukünftiges Metastaserisiko nützlich sein. Topische Applikation von VEGF-B-Zubereitungen auf chronische Wunden kann Angiogenese und Wundheilung beschleunigen. VEGF-B kann in analoger Weise wie VEGF verwendet werden.
Gemäß weiteren Aspekten der Erfindung werden die Aufgaben gelöst, indem Mittel zur Diagnose/Prognose, üblicherweise in Form von Testkits, bereitgestellt werden. In einer Ausführungsform der Erfindung wird beispielsweise ein Testkit zur Diagnose/Prognose bereitgestellt, der Antikörper gegen den neuen Wachstumsfaktor der Erfindung und Mittel für den Nachweis und insbesondere zur Bestimmung einer Bindung zwischen den Antikörpern und dem neuen Wachstumsfaktor der Erfindung umfaßt. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Mittels zur Diagnose/Prognose ist entweder der Antikörper oder der neue Wachstumsfaktor markiert, und entweder der Antikörper oder der Wachstumsfaktor ist substratgebunden, so daß die Wechselwirkung Wachstumsfaktor-Antikörper nachgewiesen werden kann, indem man die Menge Marker bestimmt, die nach Bindung zwischen dem Antikörper und dem Wachstumsfaktor an das Substrat gebunden ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann das Mittel zur Diagnose/Prognose in Form eines herkömmlichen ELISA-Kits bereitgestellt werden.
In einer weiteren alternativen Ausführungsform können Mittel zur Diagnose/Prognose Mittel für eine PCR umfassen, um die genomische Sequenzstruktur eines VEGF-B-Gens eines Testidividuums festzustellen und diese Sequenzstruktur mit der in dieser Anmeldung offenbarten Struktur zu vergleichen, um Anomalien aufzufinden um festzustellen, ob Aberrationen bei der VEGF-B-Expression mit einem gegebenen Krankheitszustand in Zusammenhang stehen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen Antikörper, der VEGF-B erkennt und der in geeigneter Weise markiert ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die entweder VEGF-B-Protein oder Antikörper dagegen umfaßt. Zusammensetzungen, die VEGF-B-Protein umfassen, können gegebenenfalls darüber hinaus entweder VEGF oder Heparin oder beides umfassen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Herstellung eines Medikaments, das VEGF-B-Protein und Heparin umfaßt, zur Behandlung von Zuständen, die durch einen Mangel an oder eine Reduktion der Angiogenese gekennzeichnet sind.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Proteindimer, das VEGF-B-Protein umfaßt, insbesondere ein disulfid-verbrücktes Dimer. Die Proteindimere der Erfindung umfassen sowohl Homodimere von VEGF-B-Protein als auch Heterodimere aus VEGF-B und VEGF.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, um die Freisetzung von VEGF und/oder VEGF-B aus einer Zelle zu erleichtern, welches die Heparin-Exposition einer Zelle, die einen oder beide der oben genannten Wachstumsfaktoren exprimiert, umfaßt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung beinhaltet die Bereitstellung eines Vektors, der eine Antisense-Nukleotidsequenz umfaßt, die komplementär zu wenigstens einem Teil der hier offenbarten DNA-Sequenzen ist, die für den neuen Wachstumsfaktor der Erfindung codieren, der die Proliferation von Endothelzellen fördert. Gemäß noch einem weiteren Aspekt der Erfindung kann ein solcher Vektor, der eine Antisense-Sequenz umfaßt, verwendet werden, um die VEGF-B-Expression zu inhibieren oder wenigstens zu verlangsamen. Die Verwendung eines Vektors dieses Typs zur Inhibierung der VEGF-B-Expression wird in Fällen bevorzugt, in denen die VEGF-B-Expression mit einer Erkrankung in Zusammenhang steht, beispielsweise in Fällen, in denen Tumoren VEGF-B zur Angiogenese produzieren. Die Transformation solcher Tumorzellen mit einem Vektor, der eine Antisense-Nukleotidsequenz enthält, würde die Angiogenese supprimieren oder verlangsamen und so das Wachstum des Tumors inhibieren oder verlangsamen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Nukleotidsequenz des (partiellen) cDNA-Klons von VEGF-B (SEQ ID NO: 1) und die Aminosäuresequenz des Proteinsegments (SEQ ID NO: 2), das von dem ersten Leseraster der cDNA codiert wird;
2 wiederholt die Nukleotidsequenz des (partiellen) cDNA-Klons von VEGF-B (SEQ ID NO: 1) und zeigt die Aminosäure-sequenz des Proteinsegments (SEQ ID NO: 3), das vom zweiten Leseraster der cDNA codiert wird;
3 zeigt die Nukleotidsequenz der codierenden Region eines vollständigen cDNA-Klons von murinem VEGF-B₁₆₇ (SEQ ID NO: 4);
4 zeigt die Aminosäuresequenz von murinem VEGF-B₁₆₇ (SEQ ID NO: 5);
5 zeigt die Nukleotidsequenz der codierenden Region eines cDNA-Klons von VEGF-B₁₇₄ (SEQ ID NO: 6);
6 zeigt die Aminosäuresequenz von VEGF-B₁₇₄ (SEQ ID NO: 7);
7 zeigt die Nukleotidsequenz eines cDNA-Klons von VEGF-B₁₁₂ (SEQ ID NO: 8);
8 zeigt die Aminosäuresequenz von VEGF-B₁₁₂ (SEQ ID NO: 9);
9 zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenzen von mVEGF-B₁₆₇, mVEGF₁₆₄, hPlGF, mPDGF A und mPDGF B;
10 zeigt die Nukleotidsequenz eines Klons von humanem VEGF-B₁₆₇ (SEQ ID NO: 10);
11 zeigt die Aminosäuresequenz von humanem VEGF-B₁₆₇ (SEQ ID NO: 11); und
12 zeigt die Nukleotidsequenz von murinem VEGF-B₁₈₆ (SEQ ID NO: 12);
13 zeigt die Aminosäuresequenz von murinem VEGF-B₁₈₆ (SEQ ID NO: 13);
14 zeigt die Nukleotidsequenz von humanem VEGF-B₁₈₆ (SEQ ID NO: 14);
15 zeigt die Aminosäuresequenz von humanem VEGF-B₁₈₆ (SEQ ID NO: 15);
16 zeigt einen Aminosäuresequenzvergleich von Isoformen von murinem und humanem VEGF-B₁₆₇ und VEGF-B₁₈₆ (SEQ ID NO: 5, 11, 13 & 15).
17 zeigt die schematische Struktur der marinen und humanen Gene für VEGF-B;
18 zeigt eine Analyse der Hydrophilie von Isoformen von murinem VEGF-B₁₆₇ und VEGF-B₁₈₆;
19 zeigt eine phylogenetische Analyse der VEGF/PDGF-Familie von Wachstumsfaktoren;
20 ist eine Kurve, die die Induktion des [³H]Thymidin-Einbaus durch VEGF-B, VEGF und bFGF für humane umbilikale Venenendothelzellen (HUVEC) und bovine Kapillarendothelzellen (BCE) zeigt;
21 ist eine Northern Blot-Analyse der Expression von VEGF-B₁₈₆-Transkripten in verschiedenen murinen und humanen Geweben;
22 zeigt die Ergebnisse von Immunpräzipitation und SDS-PAGE-Analyse von Zellkulturmedien und mit Detergens solubilisierten Zellysaten von transient mit einer cDNA von murinem VEGF-B transfizierten Cos-1-Zellen;
23A zeigt die Ergebnisse von Immunpräzipitation und SDS-PAGE-Analyse von Zellkulturmedien von transfizierten Cos-1-Zellen, die getrennt murinen VEGF-B₁₈₆ und humanen VEGF₁₆₅ exprimieren;
23B zeigt die Ergebnisse von Immunpräzipitation und SDS-PAGE-Analyse von Zellkulturmedien (M) und mit Detergens solubilisierten Zellysaten (L) von Cos-1-Zellen, die murinen VEGF-B₁₈₆ und humanen VEGF₁₆₅ coexprimieren;
23C zeigt die Ergebnisse von Immunpräzipitation und SDS-PAGE-Analyse von Zellkulturmedien von Cos-1-Zellen, die murinen VEGF-B₁₈₆ und humanen VEGF entweder getrennt oder in Kombination exprimieren, und von scheintransfizierten Kontrollzellen;
24 ist eine schematische Darstellung der Abstammung von VEGF-B-Promotor-Reporter-Klonen; und
25 zeigt die Nukleotidsequenz eines 1,55 kb-Promotorfragments von humanem VEGF-B (SEQ ID NO: 17).
Ausführliche Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung betrifft demnach neue vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktoren, nachfolgend als VEGF-B-Wachstumsfaktoren bezeichnet, die die angiogenen und andere Eigenschaften von VEGF teilen, aber in anderen Geweben als VEGF verbreitet sind und exprimiert werden.
VEGF-B-Wachstumsfaktoren gehören zur Familie der Wachstumsfaktoren aus Blutplättchen und sind Wachstumsfaktoren, die die Mitose und die Proliferation vaskulärer Endothelzellen und/oder Mesodermzellen fördern. Sie werden durch Expression von DNA-Sequenzen produziert, die einer der DNA-Sequenzen entsprechen oder unter stringenten Bedingungen damit hybridisierbar sind, die in den 1 und 2 (SEQ ID NO: 1), 3 (SEQ ID NO: 4), 5 (SEQ ID NO: 6), 7 (SEQ ID NO: 8), 10 (SEQ ID NO: 10), 12 (SEQ ID NO: 12) oder 14 (SEQ ID NO: 14) dargestellt sind. Der Umfang der Erfindung soll alle angiogenen Proteine umfassen, die von DNA-Sequenzen codiert werden, die unter stringenten Bedingungen an irgendeine der vorhergehenden DNA-Sequenzen hybridisieren. Zweckmäßige Hybridisierungsbedingungen umfassen beispielsweise 50%iges Formamid, 5 × SSPE-Puffer, 5 × Denhardt-Lösung, 0,5% SDS und 100 μg/ml Lachssperma-DNA bei 42°C über Nacht, gefolgt von 2 × 30 Minuten Waschen in 2 × SSC bei 55°C.
Die Erfindung betrifft auch eine isolierte und/oder gereinigte DNA, die irgendeiner der vorhergehenden DNA-Sequenzen entspricht oder unter stringenten Bedingungen mit diesen hybridisiert.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Antikörper gegen VEGF-B-Wachstumsfaktoren und insbesondere monoklonale Antikörper.
Es ist anzunehmen, daß VEGF-B-Proteine mit Proteintyrosinkinase-Wachstumsfaktorrezeptoren interagieren. Einzelheiten von solchen Rezeptoren sind im Stand der Technik bekannt [siehe z. B. Wilks, A. F., "Protein Tyrosine Kinase Growth Factor Receptors and Their Ligands in Development, Differentiation, and Cancer", Adv. Cancer Res., 60: 43–73 (1993)].
Verschiedene Gewebe von adulten Mäusen wurden durch Northern-Blotting auf Expression von Transkripten getestet, die VEGF-B entsprechen. Die Größe der mRNA war 1,3–1,4 kb. Ein "Multiple Tissue Northern Blot" (MTN, Clontech) für Mäuse wurde mit dem ≈ 0,9 kb SalI/NotI-Fragment, das aus den oben beschriebenen pPC67-Hefeexpressionsvektoren stammte, als Sonde verwendet. Die Sonde wurde durch "Random Priming" mit ³²P-dCTP markiert (spezifische Aktivität 10⁸–10⁹ cpm/μg DNA). Der Blot wurde über Nacht bei 42°C mit 50%igem Formamid, 5 × SSPE-Puffer, 2% SDS, 10 × Denhardt-Lösung, 100 μg/ml Lachssperma-DNA und 1 × 10⁶ cpm/ml der markierten Sonde hybridisiert. Der Blot wurde bei Raumtemperatur 2 × 30 min in 2 × SSC mit 0,05% SDS und dann 2 × 20 min bei 52°C in 0,1 × SSC mit 0,1% SDS gewaschen. Der Blot wurde dann bei –70°C drei Tage mit Verstärkerfolien exponiert. Es wurde XAR-Film von Kodak verwendet. Die relative Expressionsstärke, wie sie durch visuelle Prüfung des Films bestimmt wurde, ist in der nachfolgenden Tabelle angegeben:
Tabelle 1 Verbreitung von VEGF-B-Transkripten in der adulten Maus
Ein humaner "Multiple Tissue Northern Blot" (MNT) von Clontech wurde mit der partiellen murinen cDNA als Sonde verwendet, um die relative Expressionsstärke von VEGF-B in verschiedenen humanen Geweben zu bestimmen. Die Größe des Transkripts war 1,3–1,4 kb. Die Bedingungen waren identisch mit denen, die für den oben beschriebenen Northern-Blot der Maus angewandt wurden. Die relativen Mengen von VEGF-B-Transkripten für den humanen Northern Blot sind in der nachfolgenden Tabelle 2 angegeben, Zum Vergleich gibt Tabelle 2 auch Werte aus der Literatur für die relative Expressionsstärke von VEGF in verschiedenen Säugersystemen an.
Tabelle 2
Einem Vergleich von Tabelle 1 und Tabelle 2 ist zu entnehmen, daß die Expressionsstärke für VEGF-B-Transkripte in Gewebe von Maus und Mensch relativ ähnlich ist, wobei die höchste Expressionsstärke in Herz und Skelettmuskel gefunden wurde. Signifikante Unterschiede sind in Hirn- und Nierengewebe zu sehen. Es ist ferner anzumerken, daß Gewebe, das einen großen Anteil sowohl an Muskel- als auch Epithelzellen enthält, beispielsweise Prostata, Pankreas und Kolon, aus denen einige der am häufigsten auftretenden humanen Tumoren hervorgehen, relativ hohe Mengen VEGF-B exprimieren.
Ein Vergleich der relativen Expressionsstärke von VEGF und VEGF-B in Humanegeweben zeigt einige auffallende Unterschiede. VEGF wird durch humanes Herzgewebe ziemlich schwach exprimiert, wogegen VEGF-B durch dasselbe Gewebe sehr stark exprimiert wird. Auf der anderen Seite wird VEGF durch humanes Lungengewebe stark exprimiert, wogegen VEGF-B durch humanes Lungengewebe nur schwach exprimiert wird. Ähnlich exprimiert humanes Lebergewebe VEGF in mittlerer Menge, wogegen VEGF-B nur sehr schwach exprimiert wird. Diese Daten belegen, daß die Wirkung von VEGF und VEGF-B trotz ihrer generellen Ähnlichkeit nicht vollkommen identisch ist.
Die Expression von VEGF-B-Transkripten wurde weiter mittels Northern Blotting in murinen und humanen Geweben analysiert und mit der Expression von VEGF-Transkripten verglichen. "Multiple Tissue Northern (MTN) Blots (Clontech) von Maus und Mensch wurden mit einer ³²P-markierten murinen VEGF-B-Sonde (≈ 0,9 kb-SalI/NotI-Insert des Klons pcif 2) hybridisiert. VEGF-Expression wurde mit ³²P-markierter cDNA von VEGF₁₆₅ als Sonde getestet. Die Hybridisierungen wurden bei 42°C in 50%igem deionisiertem Formamid, 5 × SSC, pH 7,0, 1% SDS, 5 × Denhardt-Lösung und 100 μg/ml denaturierter Lachssperma-DNA durchgeführt. Die Filter wurden 2 × 30 min bei 52°C in 2 × SSC mit 0,5% SDS gewaschen und mit XAR-Film von Kodak 2–5 Tage bei –70°C mit Verstärkerfolien exponiert. In situ-Hybridisierungstests mit Gewebe adulter Mäuse aus CBA-Mäusen und von Embryos, die aus Kreuzungen von CBA- und NMRI-Mäusen stammten, wurden im wesentlichen wie bereits von Korhonen et al., Blood, 80, 2548–55 (1992), beschrieben durchgeführt. Die RNA-Sonden (eine 383 bp-Antisense-Sonde und eine 169 bp-Sense-Sonde) wurden aus einem linearisierten Plasmid generiert, das ein 440 bp-SalI/SacI-Fragment enthielt, das aus dem cDNA-Klon pcif 2 stammte. Radiomarkierte RNA wurde mit T7- und SP6-RNA-Polymerase und [³⁵S]UTP (Amersham Inc.) synthetisiert. Alkalische Hydrolyse der Sonden wurde weggelassen. Zur Gegenfärbung wurde Hämatoxylin verwendet. Kontrollhybridisierungen mit Sinnstrang und mit RNAse A behandelten Abschnitten ergab keine Signale oberhalb des Backgrounds.
In Mäusegeweben wurde die meiste Expression des 1,4 kb-VEGF-B-Transkripts in Herz, Hirn, Skelettmuskel und Niere gefunden. Das wichtigste 3,7 kb-VEGF-Transkript wurde in Herz, Hirn, Lunge, Skelettmuskel und Niere exprimiert. In Humangeweben wurde die meiste Expression des 1,4 kb-VEGF-B-Transkripts und der wichtigsten 3,7 kb- und 4,5 kb-VEGF-Transkripte in Herz, Skelettmuskel, Pankreas und Prostata gefunden. Obwohl also deutliche quantitative Unterschiede bestehen, scheint es, daß VEGF-B und VEGF in vielen humanen und murinen Geweben coexprimiert werden.
Die Expression von VEGF-Transkripten wurde ferner durch in situ-Hybridisierung in Schnitten von Herz- und Skelettmuskel adulter Mäuse und aus dem frühen (E10) Mäuseembryo untersucht. Im adulten Herz werden VEGF-B-Transkripte überwiegend im Myokard exprimiert, während im arteriellen glatten Muskel kein spezifisches Signal gefunden wird. Im adulten gestreiften Muskel werden VEGF-B-Transkripte von einigen Myofibrillen exprimiert, während anderen das Transkript zu fehlen scheint. Im E10-Mäuseembryo werden VEGF-B-Transkripte hauptsächlich im sich entwickelnden Herz gefunden. Das Myokard des adulten Mäuseherzens zeigt ein auffallendes Signal. Im gestreiften Muskel ist VEGF-B-Expression in Subpopulationen von Myofibrillen zu sehen. Starke Signale wurden auch im sich entwickelnden Herz des E10-Mäuseembryos erhalten. Andere Embryonenstrukturen exprimierten niedrigere oder nicht nachweisbare Mengen von Transkripten für VEGF-B. Zusammengenommen zeigen diese Tests, daß VEGF-B-Transkripte primär in Muskelgeweben exprimiert werden. VEGF-B kommt besonders reichlich in Herz und in Skelettmuskel vor und wird in diesen und anderen Geweben mit VEGF coexprimiert. In transfizierten Zellen bildet VEGF-B mit der Zelloberfläche assoziierte, disulfid-verbrückte Homodimere und bei Coexpression mit VEGF Heterodimere. Eine Northern Blot-Analyse der Expression von VEGF-B₁₈₆-Transkripten in mehreren murinen und humanen Geweben mit einer für die VEGF-B₁₈₆-Isoform spezifischen Sonde ist in 21 gezeigt.
Die chromosomale Lage des VEGF-B-Gens wurde durch Analyse von somatischen Zellhybriden mittels Southern Blotting und Polymerasekettenreaktion und durch in situ-Fluoreszenzhybridisierung (FISH) von Metaphase-Chromosomen nachgewiesen. Das VEGF-B-Gen wurde auf Chromosom 11q13 proximal vom Cyclin D1-Gen gefunden. Es ist interessant, daß das VEGF-B-Gen in verschiedenen Karzinomzellinien von Säugern, die amplifiziertes Cyclin D1 enthielten, nicht amplifiziert wurde, obwohl das Cyclin D1-Gen in einer Reihe humaner Karzinome amplifiziert wird. Nichtsdestoweniger kann ein Zusammenhang zwischen Mutationen im VEGF-B-Gen und vaskulären Fehlbildungen und/oder kardiovaskulären Erkrankungen bestehen.
Falls nicht anders angegeben wurden in den folgenden Beispielen Standardmethoden und -verfahren der Molekularbiologie verwendet, wie sie bei Ausubel et al. (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1992), offenbart sind.
Beispiel 1: Partieller cDNA-Klon mit zwei Leserastern.
Ein partieller cDNA-Klon, der für murinen VEGF-B codierte, wurde wie folgt identifiziert. Eine cDNA-Bank (E 14.5), die sich von poly A+-mRNA ableitete, die aus 14,5 Tage alten Mäuseembryos isoliert worden war [Chevray P. und Nathans D., "Protein interaction cloning in yeast: Identification of mammalian Proteins that react with the leucine zipper of Jun", Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 89: 5789–93 (1992)], wurde auf zelluläre Proteine gescreent, die potentiell mit zellulärem Retinsäure bindendem Protein Typ 1 (CRABP-I) interagieren können, wobei eine "Interaction Trap Yeast Two-Hybrid"-Screeningmethode verwendet wurde, wie sie von Gyuris J., Golemis E., Chertkov H. und Brent R., " Cdi1, a Human G1 and S Phase Protein Phosphatase That Associates with Cdk2", Cell, 75: 791–803 (1993) beschrieben wurde. Diese Screeningmethode beinhaltet ein Fusionsprotein, das eine Bindungsdomäne enthält und das bekanntermaßen transkriptionell inert ist (der "Köder"); Reportergene, die keine Basaltranskription haben und die durch den Köder gebunden werden; und eine Expressionsgenbank, die für Proteine codiert, die als Chimäre exprimiert werden und deren aminoterminale Enden eine Aktivierungsdomäne und andere nützliche Elemente enthalten (die "Beute"). Die gescreente Genbank war eine Plasmid-Genbank von einem 14,5 Tage alten Mäuseembryo im Hefeexpressionsvektor pPC67, der von Dr. Pierre Chevray von der Johns Hopkins University, School of Medicine, 725 North Wolfe St., Baltimore, MD 21205, erhalten wurde. Durch das Screening wurde ein positiver cDNA-Klon (pcif-2) erhalten. Der positive Klon wurde mit allgemein bekannten herkömmlichen Methoden sequenziert, und es wurde gefunden, daß er für ein Protein codierte, das mit VEGF und den anderen Mitgliedern der PDGF-Familie von Wachstumsfaktoren stark homolog war. Das ≈ 0,9 kb SalI/NotI-Insert im Plasmid pPC67 wurde in pBluescript kloniert und mit T7- und T3-Vektorprimern zusammen mit internen Primern vollständig sequenziert. Das Plasmid pBluescript ist im Handel von Stratagene Inc., La Jolla, Kalifornien, erhältlich. Es wurde gefunden, daß das cDNA-Insert 886 Basenpaare lang war und für zwei Polypeptide in verschiedenen Leserastern codierte, die homolog zum N-terminalen Ende bzw. C-terminalen Ende von VEGF waren. Dieser neue Wachstumsfaktor wird nachfolgend als VEGF-B bezeichnet. Der Klon ist partiell und es fehlen mehrere Aminosäuren in der aminoterminalen Region und die gesamte Signalsequenz.
1 zeigt die Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 1) dieses partiellen cDNA-Klons von VEGF-B und die Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2), für die das erste Leseraster codiert. Die DNA-Sequenz von 1 wurde durch herkömmliche Sequenzierung eines Klons (pcif-2) im Hefeexpressionsvektor pPC67 erhalten. Der Klon umfaßte 886 Basenpaare und codierte einen Teil von murinem VEGF-B.
Die isolierte cDNA-Sequenz hybridisiert mit der genomischen Säuger-DNA, d. h. entweder der murinen oder humanen, die das VEGF-B-Gen enthält. Zusätzlich zu der codierenden Sequenz enthält die genomische DNA ein oder mehrere Promotorsequenzen, die zur Expression von VEGF-B in ein oder mehreren spezifischen Geweben führen und diese regulieren. Die codierende Sequenz von VEGF-B kann also mit muskelspezifischen Promotorelementen verknüpft sein, die wiederum spezifisch für bestimmte Arten von Muskelfasern sind.
Die Nukleotidsequenz wird in zwei unterschiedlichen Leserastern in zwei unterschiedliche Aminosäuresequenzen translatiert. Innerhalb der codierenden Sequenz gibt es bei den Basenpaaren 309-311 ein Stopcodon (TGA). VEGF-B kommt also in verschiedenen Spleißvarianten vor. Das 5'-Ende der klonierten cDNA-Sequenz codiert für ein 102 Aminosäuren langes Protein mit signifikanter Homologie zu den N-terminalen Domänen von VEGF, PlGF und PDGF A und B. Insbesondere sind innerhalb dieser Gruppe von Proteinen eine Reihe von Cysteinresten vollkommen konserviert. Zusätzlich zu der Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 1) stellt 1 außerdem die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2) dieses ersten Proteins dar.
Translation des C-terminalen Endes der cDNA (Basenpaare 308–475) in einem unterschiedlichen Leseraster führt zu einem Protein, das mit dem C-terminalen Teil von VEGF₁₆₅, VEGF₁₈₉ und VEGF₂₀₆ stark homolog ist. 2 zeigt wiederum die Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 1) von 1, enthält dieses Mal aber die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 3) des zweiten Proteins, das vom zweiten Leseraster codiert wird und 54 Aminosäuren lang ist. Es scheint daher, daß das VEGF-B-Gen für unterschiedliche Proteine codiert, wobei alternatives Spleißen des Primärtranskripts erfolgt. Der letzte Teil des Klons, der für das zweite Peptid codiert, könnte in anderen Spleißvarianten von VEGF-B als ein funktionelles Protein exprimiert werden.
Die oben beschriebenen Proteine können kombiniert in Assoziation mit einer weiteren N-terminalen Sequenz von etwa fünf (5) bis zehn (10) Aminosäuren sowie einer weiteren Leadersequenz von etwa einundzwanzig (21) bis achtundzwanzig (28) Aminosäuren vorliegen. Soweit solche kombinierten Aminosäuresequenzen die Eigenschaft zeigen, die Proliferation von Endothelzellen zu fördern, und soweit die DNA-Sequenzen, die für solche kombinierten Peptidsequenzen codieren, unter stringenten Bedingungen mit den DNA-Sequenzen der 1 und 2 hybridisieren, versteht sich ausdrücklich, daß solche Aminosäuresequenzen und die DNA, die für sie codiert, innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegen.
Beispiel 2: Klonierung von vollständigen cDNA's für murinen VEGF-B
Unter Verwendung des etwa 0,9 kb langen SalI/NotI-cDNA-Inserts des zuvor identifizierten cDNA-Klons von Beispiel 1 als Sonde wurde eine Lambda ZAP-II-cDNA-Genbank vom Herz adulter Mäuse, die von Stratagene Inc., La Jolla, Kalifornien, erhalten worden war, mittels Standardmethoden gescreent. Die Genbank wurde titriert und wie empfohlen ausplattiert, und es wurden Filter präpariert. Nach Vorhybridisieren bei 42°C in 50%igem Formamid, 5 × SSPE, 5 × Denhardt-Lösung, 1 SDS und 100 μg% Lachssperma-DNA/ml wurden die Filter bei der gleichen Temperatur und in der gleichen Lösung, die die denaturierte radiomarkierte Sonde enthielt, hybridisiert, wobei 106 cpm/ml Hybridisierungslösung eingesetzt wurden. Die Sonde wurde mit einem "Random Priming Kit" (Amersham) markiert. Nach 16 Stunden wurden die Filter in 2 × SSC mit 0,5% SDS 2 × 30 min bei 52°C gewaschen. Die Filter wurden über Nacht mit Verstärkerfolien bei –70°C exponiert. Positive Klone wurden erneut zweimal gescreent, bis alle Plaques auf einer Platte positiv waren. Die Inserts aus mehreren positiven Klonen wurden wie vom Hersteller empfohlen durch in vivo-Exzision in das Plasmid pBluescript SK+ subkloniert.
Mehrere Klone wurden durch Analyse mit Restriktionsenzymen kartiert, und es wurde gefunden, daß sie in zwei verschiedene Gruppen fielen, die durch die Länge eines SpeI/BamHI-Restriktionsfragments gekennzeichnet waren. Die erste dieser Gruppen umfaßte drei der restriktionskartierten Klone, von denen jeder ein 240 bp-SpeI/BamHI-Restriktionsfragment aufwies. Die andere Gruppe umfaßte einen Klon, der ein 340 bp-SpeI/BamHI-Fragment aufwies. Die Analyse dieses Fragments wird in Beispiel 5 beschrieben.
Die drei Klone, die das 240 bp SpeI/BamHI-Restriktionsfragment aufwiesen, wurden vollständig oder partiell sequenziert (Sequenase 2.0, U.S. Biochemicals) und die charakteristischen Eigenschaften der Klone sind wie folgt zusammengefaßt: Nukleotidsequenzanalyse ergab, daß zwei der cDNA-Klone im wesentlichen identisch waren, obwohl sie sich in der Länge unterschieden, und einer eine Mutation besaß. Einer der Klone wies die vollständige Länge auf und enthielt ein offenes Leseraster, das für 188 Aminosäurereste codierte, von denen die ersten 21 Aminosäuren eine abspaltbare Signalsequenz darstellen. Der andere der beiden im wesentlichen identischen Klone endete an dem G des Start-Inititationscodons. Durch Sequenzanalyse weiterer Klone konnte abgeleitet werden, daß die dem G vorausgehende Sequenz ACCAT lautet. Es wurde gefunden, daß beide Klone in der codierenden Region die gleiche Nukleotidsequenz aufwiesen, die in 3 (SEQ ID NO: 4) dargestellt ist. In der Figur fehlen das Thymin und Adinin zu Beginn des Startcodons (TAG), die in den isolierten Klonen nicht vorhanden waren. Die abgeleitete Aminosäuresequenz des offenen Leserasters der codierenden Region von diesen beiden cDNA-Klonen ist in 4 gezeigt (SEQ ID NO: 5). Das resultierende Protein, das von dieser Sequenz codiert wird, wird im folgenden als VEGF-B₁₆₇ bezeichnet. Bei jedem der hier verwendeten Proteinnamen bezieht sich die tiefgestellte Zahl auf die Zahl der Aminosäuren im reifen Protein ohne die Signalsequenz.
Wie zu erwarten, zeigte ein Vergleich der von diesen beiden Klonen codierten Aminosäuresequenz mit der aus dem cDNA-Klon von Beispiel 1 abgeleiteten Aminosäuresequenz eine auffallende Ähnlichkeit. Die zwei offenen Leseraster in dem Klon von Beispiel 1, von denen jedes für eine Aminosäuresequenz codierte, die zu einem unterschiedlichen Teil von VEGF homolog ist, liegen jedoch beide in jedem dieser zwei Klone von Beispiel 2 im gleichen Leseraster. Die Leserasterverschiebung in dem Klon von Beispiel 1 kommt durch eine Insertion von zwei zusätzlichen Adenineinheiten zustande, die den C-terminalen Teil des Klons von Beispiel 1 aus dem Raster bringen. Der Grund hierfür ist zur Zeit nicht klar, kann jedoch auf ein Klonierungsartefakt zurückzuführen sein.
Der codierende Teil des dritten Klons wies eine Nukleotidsequenz auf, die mit Ausnahme einer 21 bp-Insertion mit denen der vorhergehenden zwei Klone identisch war. 5 zeigt die Nukleotidsequenz dieses dritten Klons (SEQ ID NO: 6). Zur leichteren Identifizierung sind die 21 Extrabasen in der Figur unterstrichen. Diese Insertion führt zu 7 zusätzlichen Aminosäureresten im reifen Protein. Das resultierende Protein, das von dieser längeren cDNA codiert wird, wird demzufolge als VEGF-B₁₇₄ bezeichnet. Die Aminosäuresequenz des von der cDNA von 5 codierten Proteins ist in 6 dargestellt (SEQ ID NO: 7). Zur leichteren Identifizierung sind die sieben zusätzlichen Aminosäuren in der Figur ebenfalls unterstrichen. Die zusätzlichen Aminosäuren sind in der Sequenz an einer Spleißstelle inseriert, und die Sequenzierung von Klonen genomischer DNA von Mäusen deutet darauf hin, daß diese zusätzlichen Aminosäuren das Ergebnis von echtem alternativen Spleißen sind. Auf Basis dessen, was von der Lage der Rezeptorbindungsstelle von PDGF bekannt ist, erfolgt die Insertion außerdem an einer Stelle im Protein, die wahrscheinlich Teil einer Rezeptorbindungsstelle ist. Die Insertion wirkt sich daher vermutlich auf die Rezeptorbindung aus und könnte von funktioneller Bedeutung bei der Beeinflussung der Antagonistenspezifität und/oder anderen Rezeptorspezifitäten sein.
Beispiel 3: cDNA-Hybridklon.
Wie zuvor betont, war dieser ursprüngliche cDNA-Klon von Beispiel 1 nicht vollständig und kann ein Artefakt enthalten. Wenn jedoch die 5'-Nukleotidsequenz am äußersten Ende der Klone, die für VEGF-B₁₆₇ und/oder VEGF-B₁₇₄ codieren, hinzugenommen wird, codiert das offene Leseraster für ein Protein mit 133 Aminosäuren, das ein reifes Protein mit einer Länge von 112 Aminosäuren ergibt und daher VEGF-B₁₁₂ genannt wird. Die cDNA-Hybridsequenz, die für VEGF-B₁₁₂ codiert (SEQ ID NO: 8), ist in 7 gezeigt, und die Aminosäuresequenz des entsprechenden Proteins (SEQ ID NO: 9) ist in 8 dargestellt.
9 zeigt ein Alignment mehrerer Aminosäuresequenzen zum Zweck des Vergleichs der Variante mit 167 Aminosäuren des murinen vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors B (mVEGF-B₁₆₇), des murinen vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (mVEGF₁₆₄), des humanen Plazenta-Wachstumsfaktors (hPlGF), des murinen Wachstumsfaktors A aus Blutplättchen (mPDGF A), und des murinen Wachstumsfaktors B aus Blutplättchen (mPDGF B). Aminosäurereste, die mit dem murinen VEGF-B₁₆₇ identisch sind, sind eingerahmt. Die Homologieverwandtschaft der Sequenzen ist offensichtlich, und die Figur zeigt deutlich die konservierte Struktur der Wachstumsfaktoren, die zu der PDGF/VEGF-Familie von Wachstumsfaktoren gehören, und daß VEGF-B ein Strukturhomologes der anderen Wachstumsfaktoren dieser Gruppe ist. Paarweise Vergleiche der Aminosäuresequenzen zeigen, daß muriner VEGF-B etwa 43% identisch mit Maus-VEGF₁₆₄, etwa 30% identisch mit humanem PlGF und etwa 20% identisch mit murinem PDGF A und B ist. Die konservierten Cysteinreste sind besonders bemerkenswert. Es ist zu sehen, daß die ersten acht Cysteinreste in den N-terminalen Domänen (d. h, den PDGF-ähnlichen Domänen) der fünf Wachstumsfaktoren allen Mitgliedern dieser Familie gemeinsam sind, und es ist daher offensichtlich, daß die acht Cysteinreste, die an der intramolekularen und intermolekularen Disulfidbindung beteiligt sind, bei diesen Wachstumsfaktoren invariant sind. Ferner zeigen auch die C-terminalen Domänen von murinem VEGF-B₁₆₇ und VEGF₁₆₄ eine signifikante Ähnlichkeit mit acht weiteren konservierten Cysteinresten und mehreren Strängen basischer Aminosäuren.
Beispiel 4: Klonierung von cDNA von humanem VEGF-B.
10⁶ λ-Klone der cDNA-Bank HT1080 von humanem Fibrosarkom in λgt11 (Clontech) wurden mit dem ≈ 0,9 kb-Insert des murinen VEGF-B-Klons pcif 2 nach Standardmethoden gescreent. Von mehreren positiven Klonen wurde einer, H.1 genannt, genauer untersucht und seine Nukleotidsequenz bestimmt. Die Nukleotidsequenz zeigte an, daß sie für eine Isoform von humanem VEGF-B mit 207 Aminosäuren codierte. Die Analyse dieser Isoform wird nachfolgend in Beispiel 6 beschrieben. Auf Basis der H.1-Sequenz wurden zwei Oligonukleotide entworfen, mit denen sich die gesamte codierende Region der putativen humanen cDNA, die der murinen VEGF-B₁₆₇-Isoform entspricht, amplifizieren lassen sollte:
Diese Oligonukleotide wurden verwendet, um mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) mit Oligo-dT als Primer die gesamte codierende Region von humanem VEGF-B aus RNA von humanen Erythroleukämiezellen (HEL) zu amplifizieren. Das amplifizierte Produkt wurde in den pCR II-Vektor des TA-Klonierungskits (Invitrogen) kloniert und mit Standardmethoden sequenziert. Die Nukleotidsequenz des cDNA-Klons von humanem VEGF-B ist in 10 gezeigt (SEQ ID NO: 10), und die abgeleitete Aminosäuresequenz von humanem VEGF-B₁₆₇ ist in 11 gezeigt (SEQ ID NO: 11).
Der vollständige murine cDNA-Klon von Beispiel 2 und der vollständige humane cDNA-Klon von Beispiel 4 codieren jeweils für ein Polypeptid mit 188 Aminosäuren, das eine N-terminale hydrophobe putative Signalsequenz enthält. In Analogie mit VEGF ist anzunehmen, daß die Spaltstelle für die Signalpeptidase zwischen Ala 21 und Pro 22 liegt. Die putative Spaltstelle für die Signalpeptidase ist in 16 durch einen Pfeil angezeigt. Dementsprechend enthalten die prozessierten VEGF-B-Polypeptide dieser zwei Klone jeweils 167 Aminosäuren.
Beispiel 5:
Der Klon, der das in Beispiel 2 isolierte 340 bp-SpeI/BamHI-Fragment aufwies, wurde analysiert, und es wurde gefunden, daß der größte Teil identisch mit den ersten beiden Klonen aus Beispiel 2 war, die das 240 bp-SpeI/BamHI-Fragment aufwiesen. Der Unterschied geht auf eine Insertion im C-terminalen Teil der Sequenz zurück.
Dieses 340 bp SpeI/BamHI-DNA-Fragment codiert für eine weitere Isoform von murinem VEGF-B mit 207 Aminosäuren. Der codierende Teil der für dieses Protein codierenden DNA (SEQ ID NO: 12) ist in 12 dargestellt, und die translatierte Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 13) ist in 13 dargestellt. Nach Abspaltung der Leadersequenz mit 21 Aminosäuren enthält das reife Protein 186 Aminosäuren und wird als mVEGF-B₁₈₆ bezeichnet. Diese Isoform ist klarerweise ein Ergebnis von alternativem DNA-Spleißen, wie nachfolgend unter Bezug auf 17 beschrieben wird.
Beispiel 6:
Es wurde gefunden, daß der wie in Beispiel 4 beschrieben isolierte H.1-Klon für eine Isoform von humanem VEGF-B mit 207 Aminosäuren codierte. Der codierende Teil der für dieses Protein codierenden DNA (SEQ ID NO: 14) ist in 14 dargestellt und die translatierte Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 15) ist in 15 dargestellt. Auch hier scheint diese Isoform, die als hVEGF-B₁₈₆ bezeichnet wird, ein Produkt von alternativem Spleißen zu sein.
Sowohl der mVEGF-B₁₈₆ von Beispiel 5 als auch der hVEGF-B₁₈₆ von Beispiel 6 enthalten zwischen den Nukleotiden 414 und 515 der für VEGF-B₁₆₇ codierenden Sequenz eine Insertion von 101 Basenpaaren. Nach der Insertion waren die Nukleotidsequenzen dieser cDNA-Klone mit den entsprechenden VEGF-B₁₆₇-Sequenzen identisch. Die Position der Insertion mit 101 Basenpaaren entspricht der Exon 5-Exon 6-Verbindungsstelle in VEGF. Die Insertion ergibt eine Leserasterverschiebung, die dazu führt, daß die C-terminalen Domänen der beiden Isoformen von VEGF-B vollkommen verschieden sind.
Die Divergenz der C-terminalen Aminosäuresequenzen, die mit Aminosäure 116 in SEQ ID NO: 11 und 15 beginnt, die den beiden hauptsächlichen Isoformen von VEGF-B, VEGF-B₁₆₇ und VEGF-B₁₈₆, entsprechen, spiegelt sich in den unterschiedlichen biochemischen Eigenschaften der beiden Isoformen wider. Die C-terminale Domäne von VEGF-B₁₆₇ ist stark basisch (Nettoladung +13) und bindet Heparin. Die C-terminale Domäne von VEGF-B₁₈₆ ist schwach basisch (Nettoladung +5) und weist in ihrem C-Terminus einen langen Strang hydrophober Aminosäurereste auf. Es ist unwahrscheinlich, daß sich der hydrophobe Schwanz in VEGF-B₁₈₆ wie eine Transmembrandomäne verhält, da diese VEGF-B-Variante von Zellen sekretiert wird. Daher haben diese beiden Hauptisoformen von VEGF-B trotz einer identischen N-terminalen Domäne sehr verschiedene biochemische Eigenschaften. Die Abwesenheit der stark basischen Heparin-bindenden Domäne in VEGF-B₁₈₆ erlaubt es, daß das Proteins frei aus Zellen sekretiert wird. Die Sekretion von VEGF-B₁₈₆ ist jedoch bemerkenswert langsam; in einem "Pulse Chase"-Experiment mit transfizierten Zellen wurden Homodimere von VEGF-B₁₈₆ im Medium nicht vor 1 Stunde gefunden. Im Gegensatz dazu treten VEGF-Homodimere und VEGF-B₁₈₆·VEGF-Dimere im Medium innerhalb von 30 Minuten auf.
16 zeigt die ausgerichteten Aminosäuresequenzen von murinem und humanem VEGF-B₁₆₇ und VEGF-B₁₈₆ (SEQ ID NO: 5, 11, 13 und 15) im Ein-Buchstaben-Code. Identische Reste sind eingerahmt, während sich die zwischen den Isoformen von murinem und humanem VEGF-B₁₆₇ und VEGF-B₁₈₆ unterschiedlichen Aminosäurereste außerhalb der Rahmen befinden. Muriner und humaner VEGF-B zeigen etwa 88% Aminosäuresequenzidentität von und sind stark basisch, insbesondere in ihren C-terminalen Regionen. Die C-terminalen Domänen von murinem und humanem VEGF-B₁₈₆ sind auf Aminosäureebene zu etwa 85% identisch. Die C-terminalen Domänen von murinem und humanem VEGF-B₁₆₇ sind auf Aminosäureebene zu etwa 84% identisch. Beiden Polypeptiden fehlt die Konsensussequenz für eine N-verknüpfte Glykosylierung (N-X-T/S). Der Pfeil gibt die putative Spaltstelle für die Signalpeptidase zwischen Ala²¹ und Pro²² an. Wenn man die Signalsequenzen ausnimmt, sind die Aminosäuresequenzen von murinem und humanem VEGF-B₁₆₇ stark homolog und weisen bei 167 Resten nur 20 Austausche auf. Die Austausche sind im N-Terminus in zwei Regionen um die Aminosäuren 60 und 145 geclustert. Alle Cysteinreste in beiden VEGF-B₁₆₇-Proteinen sind invariant, aber die acht Cysteinreste am C-terminalen Ende von VEGF-B₁₆₇ sind in den Isoformen von VEGF-B₁₈₆ nicht konserviert. Es ist bemerkenswert, daß die murinen und humanen Sequenzen in der Region zwischen den Resten 66 und 129, abgesehen von einem evolutionär konservierten Austausch (Q105R), identisch sind. Dies ist von Bedeutung, da sich die Rezeptorbindungsdomänen innerhalb dieses Teils des Proteins befinden (verglichen mit der PDGF-Struktur). Daraus läßt sich schließen, daß muriner und humaner VEGF-B auf Rezeptorebene kreuzreaktive Bindung zeigen und daher identische oder ähnliche biologische Aktivität zeigen.
Beispiel 7: Exon-Intron-Strukturen muriner und humaner VEGF-B-Gene.
Die Struktur des humanen VEGF-B-Gens wurde durch Restriktionskartierung und Nukleotidsequenzanalyse von klonierten PCR-Fragmenten bestimmt, die aus PCR-Reaktionen mit humaner genomischer DNA als Template erhalten worden waren, außer im Fall des ersten Exons und Introns, die aus einem genomischen λ-Klon identifiziert wurden. Die Struktur des Mausgens wurde durch Restriktionskartierung und Nukleotidsequenzanalyse klonierter PCR-Fragmente bestimmt, die mit verschiedenen Kombinationen von Primern amplifiziert wurden. Als Template bei diesen PCR-Amplifikationen wurde ein isolierter genomischer λ-Klon verwendet, der das gesamte VEGF-B-Gen der Maus enthielt.
Methode.
Mehrere λ-Klone für das murine VEGF-B-Gen wurden aus einer genomischen 129/Sw λFIX-Genbank wie vom Hersteller (Stratagene, Inc.) empfohlen isoliert. Das ≈ 0,9 kb-SalI/NotI-Insert der pcif2-cDNA für VEGF-B (SEQ ID NO: 1) wurde als Sonde verwendet. λ-DNA aus verschiedenen positiven Klonen wurde von Plattenlysaten isoliert. Einer der positiven λ-Klone (Klon 10) wurde in Form von BamHI-Fragmenten in pBluescript SK (Stratagene Inc.) subkloniert. Isolierte DNA aus eben demselben Klon wurde auch als das Template in PCR-Reaktionen verwendet (100 ng λ-DNA/Reaktion), und die codierenden Teile des murinen VEGF-B-Gens wurden mit verschiedenen Kombinationen von Primern amplifiziert. Die Nukleotidsequenzen dieser Primer wurden aus den cDNA-Klonen abgeleitet, die für murinen VEGF-B₁₆₇ und murinen VEGF-B₁₈₆ codierten. Es wurde DNA-Polymerase Taq (2,5 U/Reaktion) verwendet. Die generierten PCR-Fragmente wurden direkt in den TA-Klonierungsvektor pCR II (Invitrogen Inc.) kloniert. Die Exon-Intron-Struktur des murinen VEGF-B-Gens wurde durch Nukleotidsequenzanalyse des subklonierten genomischen BamHI-Fragments und der klonierten PCR-Produkte nachgeweisen.
Ein humaner genomischer λ-Klon wurde durch Screenen von 1 × 10⁶ Klonen einer humanen genomischen Genbank in EMBL-3 SP6/T7 (Clontech) unter hochstringenten Bedingungen mit einem 90 bp-PCR-Fragment als Sonde isoliert, das 5'-Sequenzen von cDNA von humanem VEGF-B umfaßte. Die Waschbedingungen waren: einmal 30 Minuten Waschen mit 1 × SSC bei Raumtemperatur und zweimal 30 Minuten Waschen mit 1 × SSC bei 65°C. Primer für die PCR waren:
Der positive λ-Klon wurde in Form von SacI-Fragmenten in den Vektor pGEM 3Z (Promega) subkloniert, und es wurde gefunden, daß er die 5'-Region des Gens trug. Die restlichen Teile des humanen VEGF-B-Gens wurden mittels PCR unter Verwendung genomischer DNA als Template amplifiziert. Es wurden verschiedene Kombinationen von Primern, die sich von der humanen cDNA-Sequenz ableiteten, eingesetzt. Es wurde Dynazym-DNA-Polymerase (2,5 U/Reaktion, Finnzymes) eingesetzt. Die amplifizierten PCR-Fragmente wurden direkt in den TA-Klonierungsvektor PCR II (Invitrogen Inc.) kloniert. Die Exon-Intron-Grenzen und die Länge der kurzen Introns der murinen und humanen VEGF-B-Gene wurden mittels Nukleotidsequenzanalyse unter Verwendung vektorspezifischer Primer oder geeigneter, von den cDNA-Sequenzen abgeleiteten Primern bestimmt. Die Länge der größeren Introns wurde auf Basis der Länge der amplifizierten PCR-Fragmente bei der Analyse durch Agarose-Gelelektrophorese berechnet.
Ergebnisse.
Die Ergebnisse zeigten, daß die codierenden Teile der murinen und humanen VEGF-B-Gene etwa 4 kb DNA umfassen und beide Gene in sieben codierende Exons mit Längen zwischen 19 bp (E7) und 236 bp (E6) unterteilt sind. 17 ist eine schematische Darstellung der Strukturen der murinen und humanen Gene für VEGF-B. Die Exongrößen in Basenpaaren sind innerhalb der Rahmen angegeben, und die Größen der Introns sind zwischen den Rahmen angegeben. Die Introns sind nicht maßstabsgetreu gezeigt. Die Strukturen der untranslatierten flankierenden Regionen von murinen und humanen VEGF-B-Genen wurden nicht bestimmt und sind durch graue Kästen dargestellt. Die Exon-Intron-Verbindungsstellen in beiden Genen sind in der nachfolgenden Tabelle 3 angegeben: Tabelle 3
Wie bereits festgestellt enthält Exon 6 eine alternative Akzeptor-Spleißstelle, die es ermöglicht, daß das Gen zwei verschiedene Transkripte für VEGF-B-Isoformen produziert. VEGF-B₁₆₇ benutzt die Exons 1–5, den letzten Teil von Exon 6 und Exon 7 (TGA). VEGF-B₁₈₆ benutzt die Exons 1–5, den ersten Teil von Exon 6 und endet im letzten Teil von Exon 6 (TAG). Exon 7 wird in VEGF-B₁₈₆ nicht translatiert, da die Insertion des ersten Teils von Exon 6 eine Leserasterverschiebung mit sich bringt und zu einem Stopcodon im letzten Teil von Exon 6 führt. Die Position des Stopcodons (TAG) für VEGF-B₁₈₆ ist in Exon 6B gekennzeichnet, und das Stopcodon (TGA) für VEGF-B₁₆₇ ist in Exon 7 gekennzeichnet.
Die Introns in beiden Genen schwanken zwischen 161 bp bis etwa 2,6 kb. Die Länge von jedem Exon und die Lage der Spleißverbindungsstellen in den beiden Genen waren identisch, und alle Donor- und Akzeptor-Spleißstellen folgen den kanonischen GT/AG-Regeln, Padgett et al., Annual Rev. of Biochemistry, 55: 1119–50 (1986). Der einzige bemerkenswerte Unterschied zwischen den Genen der Maus und des Menschen ist die Länge der Introns 1, 4 und 6, die im Mausgen länger sind. Es wurde gefunden, daß alle Exon-Intron-Grenzen zwischen VEGF-B und VEGF konserviert sind, daß aber die Introns in den VEGF-B-Genen im allgemeinen kleiner als im VEGF-Gen waren.
Das 300 bp-Intron nach dem Exon 5 in VEGF-B unterscheidet sich von dem entsprechenden Exon in VEGF, das eine Länge von 3 kb aufweist und ein alternativ gespleißtes Exon enthält, das in den Transkripten für VEGF₁₈₉ und VEGF₂₀₆ gefunden wird und für viele basische Aminosäuren codiert. Als dieses Intron in VEGF-B genauer untersucht wurde, konnte kein dem sechsten Exon von VEGF entsprechendes Exon gefunden werden. Statt dessen wurde gefunden, daß das 3'-Ende dieses Introns und das folgende Exon identisch mit den entsprechenden Sequenzen der für VEGF-B₁₈₆ codierenden cDNA-Klone waren. Dies läßt sich aus der Tatsache erklären, daß die mRNA für VEGF-B₁₈₆ beim mRNA-Spleißen unter Verwendung einer alternativen Akzeptor- Spleißstelle gebildet wird, was zu einer Insertion von einer 101 bp-Intronsequenz in diese mRNAs führt.
18 zeigt eine vergleichende Analyse der Hydrophilie von murinem VEGF-B₁₆₇ und VEGF-B₁₈₆. Die Profile wurden nach Kyle und Dolittle mit einem Fenster von neun (9) Resten generiert. Wie zu erwarten ist das Hydrophilie/Hydrophobie-Muster im wesentlichen von Aminosäure 1 bis Aminosäure 115 identisch. Nach Aminosäure 115 divergieren die Hydrophilie/Hydrophobie-Muster wegen der Leserasterverschiebung, die durch den ersten Teil von Exon 6 eingeführt wird. Es ist daher zu erwarten, daß VEGF-B₁₆₇ und VEGF-B₁₈₆ sowohl ähnliche als auch verschiedene Aktivitäten zeigen.
19 ist ein Dendrogramm, das die phylogenetische Beziehung der Aminosäuresequenzen von fünf Mitgliedern der VEGF/PDGF-Familie von Wachstumsfaktoren zeigt. Die Zahl der Austausche oder Substitutionen nimmt in dem Diagramm von links nach rechts ab. Wie zu sehen, liegt VEGF-B zwischen VEGF und der Gruppe der Wachstumsfaktoren aus Blutplättchen (PDGF).
Die zahlreichen Alignments von Aminosäuresequenzen der 9 und 16 und die phylogenetische Analyse von 19 erfolgten gemäß Hein, Methods in Enzymology, Vol. 183, S. 626–45, Academic Press Inc., San Diego (1990) unter Verwendung der PAM 250-Abstandstabelle.
Beispiel 8: Antikörperproduktion
a. Antiserum gegen murinen VEGF-B.
Antiseren gegen murinen VEGF-B wurden durch Immunisierung von Kaninchen mit einem 18-mer-Oligopeptid erzeugt, das die N-terminale Region von prozessiertem VEGF-B gekoppelt an Keyhole Limpet-Hämocyanin umfaßte. Cysteinreste wurden als N-terminale und C-terminale Aminosäurereste eingeführt, um eine Kopplung des Peptids mit SPDP (Pharmacia) an das Trägerprotein zu ermöglichen. Die Sequenz des Oligopeptids war
Jedes Kaninchen erhielt eine subkutane Injektion mit 300 μg des Peptidkonjugats, emulgiert in komplettem Freund-Adjuvans. Alle zwei Wochen wurden subkutane Booster-Injektionen mit der gleichen Menge Antigen, emulgiert in inkomplettem Freund-Adjuvans, gegeben. Seren wurden nach den zweiten Booster-Injektionen erhalten.
b. Antiserum gegen humanen VEGF-B.
Antipeptid-Antiserum gegen humanen VEGF-B wurde durch Immunisierung von Kaninchen mit einem verzweigten 23-mer-Oligopeptid generiert, das in der N-terminalen Region die folgende Aminosäurereste-Sequenz umfaßte (SEQ ID NO: 22):
Das verzweigte 23-mer-Oligopeptid wurde entsprechend Tam, "Synthetic peptide vaccine design: synthesis and properties of a high-density multiple antigenic peptide system", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 85. S. 5409–413 (1988), synthetisiert. Bei der ersten Immunisierung wurde den Kaninchen subkutan 500 μg des verzweigten, in komplettem Freund-Adjuvans emulgierten Peptids injiziert. Bei den nachfolgenden Boosterungen wurden 200 μg des in inkomplettem Freund-Adjuvans emulgierten Antigens injiziert. Antiseren wurden nach der zweiten und dritten Boosterung mittels üblicher Methoden gesammelt.
Beispiel 9: Biochemische Eigenschaften von VEGF-B₁₆₇, Homodimerisierung und Heterodimerisierung mit VEGF.
Die biochemischen Eigenschaften von humanem VEGF-B₁₆₇ wurden in transfizierten humanen Embryo-Nierenzellen 293EBNA (Invitrogen, Inc.) untersucht. cDNA-Inserts, die für humanen VEGF-B₁₆₇ und humanen VEGF₁₆₅ codierten [siehe Keck et al., Science, Vol. 246, S. 1309–312 (1989)], wurden einzeln in den Expressionsvektor pREP7 (Invitrogen, Inc.) kloniert. Humane Embryo-Nierenzellen 293EBNA (die das nukleäre Antigen-1 von Epstein-Barr-Virus exprimierten) wurden durch transiente Transfektion mittels Calciumphosphatpräzipitation mit den jeweiligen Expressionsplasmiden transfiziert, und die Zellen wurden 48 Stunden inkubiert. Als Kontrolle wurden Zellen auch mit einem Expressionsvektor transfiziert, der die cDNA von VEGF-B167 in umgekehrter Orientierung enthielt. Monolayer von Zellen wurden in Methionin-freiem und Cystein-freiem Medium 30 Minuten inkubiert und anschließend im gleichen Medium 2 Stunden mit 100 μCi/ml [³⁵S]Methionin und [³⁵S]Cystein (Promix, Amersham Inc.) markiert. Das Markierungsmedium wurde gegen normales Medium ohne Serum ausgetauscht und es erfolgte ein Chase der markierten Proteine über 6 Stunden. Während des Chase wurde Heparin, wenn angezeigt, zugegeben (100 μg/ml). Nach der Chase-Dauer wurden die Medien gesammelt und die Zellen in 10 mM Tris, pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,5% Natriumdeoxycholat, 0,5% Nonidet P-40, 0,1% SDS und 0,1 U/ml Aprotinin solubilisiert.
In den mit den die VEGF-B₁₆₇-DNA enthaltenden Plasmiden transfizierten Zellen wurde VEGF-B₁₆₇ exprimiert. Aliquote der Kulturüberstände aus mit Heparin behandelten oder unbehandelten Zellen und mit Detergens solubilisierten Zellysaten wurden einer Immunpräzipitation mit dem gegen VEGF-B spezifischen Antipeptid-Antiserum unterworfen, das wie in Beispiel 8 beschrieben erhalten worden war, und, wenn nicht anders angegeben, durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen getestet. Die Daten zeigen, daß durch Heparin VEGF-B₁₆₇-Homodimere und VEGF-B₁₆₇-VEGF₁₆₅-Heterodimere aus den Zellen freigesetzt werden. Durch Heparinbehandlung (1–100 μg/ml) oder 1,2 M NaCl wurde VEGF-B₁₆₇ aus Zellen freigesetzt und im Überstand gefunden. Wenn Zellen nicht mit Heparin behandelt wurden, blieb VEGF-B₁₆₇ zellassoziiert und wurde nicht in das Kulturmedium freigesetzt. Unter den gleichen Bedingungen werden VEGF₁₆₅-Homodimere von den Zellen sekretiert und ohne Heparinbehandlung in den Kulturüberständen gefunden.
Unter reduzierenden Bedingungen migrierte humanes VEGF-B₁₆₇ mit einem Mr von 21 kDa. Tests von Kulturüberständen unter nicht-reduzierenden Bedingungen zeigten, daß VEGF-B₁₆₇ als eine Spezies mit einem Mr von 42 kDa migrierte, was eine dimere Struktur anzeigte. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß VEGF-B₁₆₇ disulfid-verbrückte Dimere bildet, die mit der Zelloberfläche assoziiert sind, wahrscheinlich durch ionische Wechselwirkungen mit extrazellulären Heparansulfat-Proteoglykanen. Es ist wahrscheinlich, daß die Assoziation durch die basische C-terminale Domäne vermittelt wird, wie es für die längeren Spleißvarianten von VEGF beobachtet wird.
Da gezeigt wurde, daß VEGF mit PlGF Heterodimere bildet, wurde entschieden zu testen, ob VEGF₁₆₅ auch Heterodimere mit VEGF-B₁₆₇ bilden konnte. Zu diesem Zweck wurden 293EBNA-Zellen mit Expressionsvektoren cotransfiziert, die sowohl für humanen VEGF₁₆₅ als auch humanen VEGF-B₁₆₇ codierten, und VEGF-B₁₆₇ wurde zusammen mit VEGF₁₆₅ exprimiert. Es wurde ein Chase metabolisch markierter Proteine in Gegenwart von Heparin durchgeführt, und Immunpräzipitationen erfolgten mit Antiseren entweder gegen VEGF-B₁₆₇ oder VEGF₁₆₅. Das Antiserum gegen humanen VEGF war von R&D Systems. Unter nicht-reduzierenden Bedingungen migrierten die VEGF-B₁₆₇·VEGF₁₆₅-Heterodimere als Spezien mit Mr 42–46 kDa. Die Ergebnisse zeigen, daß VEGF-B mit VEGF disulfid-verbrückte Heterodimere bilden kann, die in Abwesenheit von Heparin zellassoziiert bleiben. Da Homodimere von VEGF₁₆₅ effizient in das Medium sekretiert werden, scheint VEGF-B die Sekretion des Heterodimers zu bestimmen.
VEGF-B wird normalerweise im endoplasmatischen Retikulum der Ursprungszelle zum anschließenden Export synthetisiert. Rekombinanter VEGF-B kann produziert werden, indem man eine DNA-Sequenz, die für das VEGF-B-Protein codiert, zusammen mit geeigneten, funktionsfähig verknüpften Promotor- und Kontrollsequenzen in einen geeigneten Vektor wie das allgemein bekannte Plasmid pBR322 oder ein Derivat davon inseriert, eine geeignete Wirtszelle wie E. coli oder eine Cos-Zelle mit dem resultierenden Vektor oder anderen dem Fachmann allgemein bekannten Systemen transformiert oder transfiziert, die resultierenden Transformanten oder Transfektanten auf VEGF-B-Expression screent und dann Zellinien oder Zellen von Bakterienstämmen, die hinsichtlich Expression von VEGF-B positiv sind, kultiviert. Es kann sowohl ein eukaryontischer Vektor als auch ein prokaryontischer Vektor verwendet werden, abhängig vom Zelltyp, der damit transfiziert oder transformiert werden soll. Ein besonders bevorzugtes System zur Produktion von rekombinantem VEGF-B ist das Baculovirus-Insektenzellensystem, das sich als in der Lage erwiesen hat, ausgezeichnete Ausbeuten an rekombinantem Protein zu liefern.
Beispiel 10: VEGF-B-Expression mit dem Baculovirus-System
10.1 VEGF-B mit seinem eigenen Signalpeptid.
a) Klonierung und Transfektion
Das vollständige humane VEGF-B₁₆₇-Gen wurde in ein im Handel erhältliches Plasmid pCRII (Invitrogen Corp.) inseriert. Das HindIII-XbaI-Fragment aus dem resultierenden Plasmid pCRII-VEGF-B₁₆₇, das für das gesamte offene Leseraster von VEGF-B167 codiert, wurde dann in pFASTBACI cloniert und es wurden sowohl die 3'- als auch die 5'-Verknüpfungsstellen sequenziert. Bacmid-DNA wurde nach den Vorschriften des Herstellers für das "Bac-To-Bac^TM-Baculovirus-Expressionssystem" (Life Technologies Inc.) präpariert und in Sf900II-adaptierte Sf9-Zellen (erhalten von Dr. Christian Oker-Blom) lipofiziert. Sf9-Zellen sind von der American Type Culture Collection Cell Repository Line Bank, Rockville MD (ATCC CRL-1711). Die transfizierten Zellen wurden dann mit Standard TMN-FH-Medium auf 25 cm²-Kulturplatten kultiviert.
b) Test auf Proteinexpression.
Etwa 72 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen lysiert und 1 ml Kulturüberstand und das Zellysat wurden durch Immunpräzipitation wie in Beispiel 9 beschrieben und durch Western Blotting auf exprimierten VEGF-B getestet. Es wurde gefunden, daß Lysate aus drei von vier unabhängig transfizierten Zellkulturen positiv für VEGF-B waren, obwohl die Intensität des Signals im Western Blot variierte. Es wurde gefunden, daß das exprimierte VEGF-B-Polypeptid in jedem Fall in seiner Größe dem in Beispiel 9 in Säugerzellen exprimierten Protein entsprach.
Das virale Ausgangsmaterial aus den Zellen, die beim Western Blotting das stärkste Signal lieferten, wurde zwei Runden durch Infizieren von Zellen und Ernten von neuem Virus aus dem Medium amplifiziert. Der resultierende Überstand wurde getestet. Nicht-infizierte Zellen als negative Kontrolle wurden ebenfalls getestet. Zeitabhängige Analyse zeigte, daß Zellen, die zwischen 48 und 72 Stunden nach Infektion geerntet worden waren, die größte Menge VEGF-B enthielten. 96 Stunden nach Infektion konnte VEGF-B als Folge Virus-induzierter Zellyse durch Immunpräzipitation und Western Blotting auch im Kulturüberstand nachgewiesen werden. Rekombinanter VEGF-B konnte aus dem Lysat mit 20% bis 40% (NH₄)₂SO₄ präzipitiert werden.
10.2 VEGF-B mit dem Melittin-Signalpeptid (pVTBac).
a) Klonierung und Transfektion
Ein Fragment mit den Nukleotidpositionen 68 bis 141 aus einer Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde dazu verwendet, unmittelbar nach der Signalspaltstelle in dem Plasmid pCRII-VEGF-B₁₆₇ aus Beispiel 10.1 eine BamHI-Restriktionsstelle einzubauen. Das BamHI-Fragment aus diesem modifizierten pCRII-VEGF-B₁₆₇-Konstrukt wurde in mit BamHI geöffnetes pVTBac [Tessier et al., "Enhanced secretion from insect cells of a foreign protein fused to the honeybee mellitin signal peptide", Gene, Vol. 98, S. 177 (1991)] kloniert. Sowohl die 3'- als auch die 5'-Verknüpfungsstellen wurden sequenziert. Sf9-Zellen wurden mit dem oben beschriebenen pVTBac-Vektor, der das humane VEGF-B₁₆₇-Gen enthielt, und mit linearisierter Baculovirus-DNA (Insectin^TM, Invitrogen Corp.) cotransfiziert. Die transfizierten Zellen wurden dann in TMN-FH-Medium kultiviert.
b) Test auf Proteinexpression
Achtundvierzig Stunden nach Transfektion wurde der Überstand gesammelt und durch Immunpräzipitation einem primären Screening unterzogen. Es wurden vier positive Plaques isoliert.
10.3 Ein cDNA-Insert, das für murinen VEGF-B₁₈₆ codierte (mit EcoRI geschnittenes cDNA-Fragment aus einem cDNA-Klon für murinen VEGF-B₁₈₆ (SEQ ID NO: 12)) wurde in pFASTBAC 1 kloniert. Ein mit EcoRI geschnittenes cDNA-Fragment aus murinem VEGF-B₁₆₇ (SEQ ID NO: 4) wurde ebenfalls in pFASTBAC 1 kloniert. Die resultierenden Plasmide wurden wie oben in 10.1 beschrieben in Bakterien transformiert und rekombinierte Plasmide wurden isoliert und in Sf9- und Sf21-Zellen lipofiziert. Überstände, die rekombinantes Baculovirus enthielten, wurden durch mehrere Runden Reinfektion von Sf21-Zellen amplifiziert. Die Endtiter der Baculovirus-Stocks wurden durch Plaquetitration bestimmt, und es wurde gefunden, daß sie zwischen 4 × 10⁸ und 2 × 10⁹ Baculovirus-Partikeln pro Milliliter Stock-Überstand schwankten.
Beispiel 11: Produktion von rekombinantem VEGF-B im Großmaßstab.
Sf21-Zellen [siehe Vaughn et al., In Vitro, 13: 213–17 (1977)] wurden mit den Baculovirus-Stocks von Beispiel 10 mit einer Infektionsmultiplizität von 10 Viruspartikeln pro Zelle infiziert. Die infizierten Sf21-Zellen wurden in Rollerflaschen wachsen gelassen und 96 Stunden mit einer Dichte von 2 × 10⁶ Zellen pro ml serumfreies Medium (Sf900II, Gibco-BRL) ausgesäht. Dann wurden Kulturmedien und Zellen geerntet. Aliquote der Zellysate und der Medien wurden mittels SDS-PAGE getestet. Gesamtproteinmuster wurden durch Färben der Gele mit Coomassie-Brilliantblau sichtbar gemacht, und die Gegenwart von exprimierten VEGF-B-Isoformen wurde durch Immunblotting mit gegen humanen und murinen VEGF-B spezifischen Antipeptid-Antikörpern wie oben in Beispiel 8 beschrieben sichtbar gemacht. Der Test ergab, daß sowohl humane als auch murine VEGF-B₁₆₇-Polypeptide die erwartete Größe von 21,5 kDa aufwiesen. Beide Proteine wurden in den infizierten Zellen intrazellulär zurückgehalten und nicht in das Medium freigesetzt. Im Gegensatz dazu wurde muriner VEGF-B₁₈₆ in einer dimeren Form leicht in das Medium sekretiert. Die VEGF-B₁₈₆-Homodimeren migrierten als eine 52–54 kDa-Spezies, was vermuten ließ, daß an von Insektenzellen produziertem Protein nicht die gleichen kovalenten Modifikationen erfolgten wie sie für VEGF-B₁₈₆ gefunden wurden, der von transfizierten Cos-1-Zellen sekretiert wurde.
Beispiel 12: Transfektion und Analyse von Cos-1-Zellen, die VEGF-B₁₈₆ exprimieren.
cDNA-Inserts, die für murinen VEGF-B₁₈₆ und humanen VEGF₁₆₅ codierten, wurden in den Expressionsvektor pSG5 [Green et al., Nucleic Acid Res., 16: 369 (1988)] kloniert. Cos-1-Zellen wurden in sog. "Minimal Essential Medium" (MEM) gehalten, das 10% fötales Kälberserum, 2 mM Glutamin und geeignete Antibiotika enthielt. Zur Transfektion wurden die Zellen erneut auf 90 mm-Petrischalen ausplattiert. Die Zellen wurden durch Calciumphosphatpräzipitation mit den Expressionsvektoren einzeln oder in Kombination transfiziert und 36–48 Stunden inkubiert. Monolayer von Zellen wurden in Methionin- und Cystein-freiem Medium 30 min inkubiert und dann im gleichen Medium mit 100 uCi/ml [³⁵S]Methionin und [³⁵S]Cystein 2 Stunden inkubiert (Promix Amersham Inc.).
Für die Puls-Chase-Experimente wurden die Zellen 30 Minuten markiert, zweimal mit normalem Medium gewaschen und dann bis zu 6 Stunden in MEM ohne fötales Kälberserum inkubiert. Medien wurden nach der Chase-Dauer gesammelt und die Zellen wurden in 10 mM Tris-Puffer, pH 7,5, mit 50 mM NaCl, 0,5% Deoxycholat, 0,5% Nonidet P-40 und 0,1% SDS solubilisiert. Aliquote der Medien und der Zellysate wurden mit dem spezifischen Antiserum gegen murinen VEGF-B von Beispiel 8a und einem spezifischen Antiserum gegen humanen VEGF, das im Handel von R&D Systems erhältlich ist, einer Immunpräzipitation unterworfen. Die Präzipitate wurden mittels SDS-PAGE getestet.
Beispiel 13: Biochemische Eigenschaften von in transfizierten Cos-1-Zellen exprimiertem VEGF-B₁₈₆.
Die biochemischen Eigenschaften von murinem VEGF-B₁₈₆ wurden in Cos-1-Zellen untersucht, die wie in Beispiel 12 beschrieben mit einem geeigneten Expressionsvektor transient transfiziert waren. Die Zellen wurden metabolisch markiert und Proteine aus den markierten Zellen wurden mit einem Antipeptid-Antikörper gegen VEGF-B immunpräzipitiert. Das präzipitierte Material wurde unter reduzierenden Bedingungen mittels SDS-PAGE getestet. Sowohl das Zellkulturmedium (M) als auch ein mit Detergens solubilisiertes Zellysat (L) wurden getestet. Die Ergebnisse sind in 22 gezeigt. Wie zu sehen migrierte zellassoziierter VEGF-B₁₈₆ unter reduzierten Bedingungen als ein Polypeptid mit etwa M_r 24.000. Im Gegensatz dazu migrierte VEGF-B₁₈₆, der im Medium transfizierter Zellen vorlag, als Spezies mit M_r 32.000, was vermuten ließ, daß das Protein während seines intrazellulären Transports und seiner Sekretion kovalent modifiziert war. Die entsprechenden Moleküle wurden in Zellysaten oder Medien von scheintransfizierten Cos-1-Zellen, die als Kontrolle verwendet wurden, nicht nachgewiesen.
Immunpräzipitation von Medien und SDS-PAGE-Analyse unter nicht-reduzierenden Bedingungen zeigten eine Spezies mit etwa M_r 60.000, was vermuten ließ, daß VEGF-B₁₈₆ disulfid-verbrückte Homodimere bildete. Die Zugabe von 100 μg/ml Heparin während der Markierung beeinträchtigte die Sekretion oder Freisetzung von VEGF-B₁₈₆-Homodimeren aus den transfizierten Zellen nicht.
Beispiel 14: Biosynthese von VEGF-B₁₈₆-Homodimeren.
Die Biosynthese von VEGF-B₁₈₆-Homodimeren wurde durch Puls-Chase-Experimente untersucht. Transfizierte Cos-1-Zellen wurden 30 Minuten metabolisch markiert, gefolgt von einem Chase von bis zu 4 Stunden. Immunpräzipitation und SDS-PAGE-Analyse von mit Detergens solubilisierten Zellysaten und Medien zeigte, daß die zellassoziierte Spezies von etwa M_r 24.000 über die Chase-Dauer leicht nachgewiesen wurde. Die Abnahme in der Intensität dieser Molekülspezies war mit einer Zunahme des Proteins mit M_r 32.000 im Medium verbunden. Die Spezies mit M_r 32.000 trat im Medium nach 1 Stunde Chase auf. Die größten Mengen an sekretiertem VEGF-B₁₈₆ wurden nach Chase-Dauer von 4 Stunden erhalten. Es wurden keine Zwischenprodukte in den Zellysaten nachgewiesen, das sekretierte Protein mit M_r 32.000 erschien jedoch leicht heterogen. Die Natur der Modifikation ist zur Zeit unbekannt, jedoch läßt sich eine N-verknüpfte Glykosylierung in Abwesenheit von Konsensusstellen für diese Modifikation ausschließen.
Beispiel 15: Bildung von Heterodimeren durch VEGF-B₁₈₆.
Wie oben angemerkt werden VEGF-B und VEGF in vielen Geweben coexprimiert und VEGF-B₁₆₇·VEGF₁₆₅-Heterodimere bilden sich leicht, wenn sie in transfizierten Zellen coexprimiert werden. Zur Untersuchung, ob VEGF-B₁₈₆ auch mit VEGF₁₆₅ Heterodimere bilden konnte, wurden Cos-1-Zellen wie oben beschrieben entweder allein oder in Kombination mit den geeigneten Expressionsvektoren transfiziert. Metabolisch markierte Proteine aus den transfizierten Zellen, die in den Medien vorhanden waren, wurden Immunpräzipitationen mit Antiseren gegen VEGF-B und VEGF unterworfen. 23A zeigt die Ergebnisse der SDS-PAGE-Analyse der Immunpräzipitate aus den Zellkulturmedien transient transfizierter Cos-1-Zellen, die VEGF-B₁₈₆ bzw. VEGF getrennt exprimierten, unter reduzierenden Bedingungen. Wie zu sehen, waren die Antiseren ohne nachweisbare Kreuzreaktivität spezifisch für VEGF-B bzw. VEGF.
Cos-1-Zellen wurden mit Expressionsvektoren für VEGF-B₁₈₆ und VEGF₁₆₅ cotransfiziert. Zellkulturmedien (M) und mit Detergens solubilisierte Lysate (L) aus den resultierenden Zellen, die VEGF-B₁₈₆ und VEGF₁₆₅ coexprimierten, wurden einer Immunpräzipitation und einer SDS-PAGE-Analyse unter reduzierenden Bedingungen unterworfen. Die Ergebnisse sind in 23B gezeigt. Der Test zeigte, daß muriner VEGF-B₁₈₆ und humaner VEGF₁₆₅ intrazelluläre und sekretierte Heterodimere bilden.
Kulturmedien von Zellen, die murinen VEGF-B₁₈₆ und humanen VEGF₁₆₅ entweder getrennt oder in Kombination exprimierten, wurden einer Immunpräzipitation mit Antikörpern gegen VEGF-B und VEGF unterworfen und mittels SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen analysiert. Als Kontrolle wurde Zellkulturmedium von scheintransfizierten Zellen getestet. Die Ergebnisse sind in 23C gezeigt. Es wurde gefunden, daß VEGF-B₁₈₆ sekretierte disulfid-verbrückte Homodimere bildet und daß VEGF-B₁₈₆ und VEGF₁₆₅ zusammen sekretierte disulfidverbrückte Heterodimere bilden.
Um zu testen, ob die Bildung von Heterodimeren mit VEGF die Sekretion und Freisetzung von VEGF-B₁₈₆ beeinträchtigte, wurden Puls-Chase-Experimente mit Cos-1-Zellen durchgeführt, die transient mit Expressionsvektoren für VEGF-B₁₈₆ und VEGF₁₆₅ transfiziert waren. Nach einer Markierungsdauer von 30 Minuten konnten zellassoziierte disulfid-verbrückte Heterodimere erhalten werden, und sekretierte Heterodimere wurden bereits nach einer Chase-Dauer von 30 Minuten aus dem Medium erhalten. Die sekretierten Heterodimere akkumulierten im Medium bis zu 2 Stunden nach der Markierung. Zum Zeitpunkt von 4 Stunden Chase erfolgte eine Abnahme der Menge von Heterodimeren im Medium, möglicherweise als Folge des Abbaus des Komplexes. Einige VEGF-B₁₈₆·VEGF-Heterodimere blieben während der Dauer des Chase zellassoziiert. Diese Ergebnisse ließen vermuten, daß die Bildung von Heterodimeren mit VEGF die Sekretion von VEGF-B₁₈₆, verglichen mit der Sekretion von VEGF-B₁₈₆-Homodimeren, förderte. Außerdem legte die Anwesenheit von Heterodimeren schon nach einer Markierungsdauere von 30 Minuten nahe, daß die langsame Freisetzung von VEGF-B₁₈₆-Homodimeren nicht auf eine beeinträchtigte Fähigkeit von VEGF-B₁₈₆ zur Dimerisierung zurückzuführen war.
Beispiel 16: Reinigung von sekretierten VEGF-B₁₈₆-Homodimeren
Sekretierte VEGF-B₁₈₆-Homodimere wurden aus serumfreien Kulturmedien von mit Baculovirus infizierten Sf21-Zellen wie folgt isoliert:
a. Anfängliche Auftrennung
Die größte Proteinkontamination in den Kulturmedien war das Baculovirus-Protein gp64/67, ein saures Protein, das von Baculovirus-infizierten Zellen sekretiert wird. Zur Entfernung dieses Proteins wurden die Kulturmedien durch Ultrafiltration zwanzigfach konzentriert und dann über eine Sephadex G-25-Säule laufen gelassen, die mit 20 mM Phosphatpuffer, pH 6,5, mit 20 mM NaCl äquilibriert war. Die eluierten Proteine wurden dann über eine CM-Sepharose-Ionenaustauschersäule (Pharmacia) laufen gelassen, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert war. Die Säule wurde mit dem Phosphatpuffer gewaschen, um ungebundene Proteine zu entfernen, und gebundene Proteine wurden durch allmähliches Erhöhen der NaCl-Konzentration des Elutionspuffers eluiert. Das von Baculovirus codierte Hauptprotein gp64/67 band unter diesen Bedingungen nicht an die Ionenaustauschersäule, während VEGF-B₁₈₆-Homodimere bei einer NaCl-Konzentration von 90 mM eluierten. Nach Beurteilung der eluierten Fraktion durch SDS-PAGE-Analyse waren die VEGF-B₁₈₆-Homodimeren nach dieser Methode 5–15% rein.
b. Reinigung zur Homogenität
Die VEGF-B₁₈₆-Homodimeren werden an einer an ein FLPC-System (Pharmacia) gekoppelten MonoS-Säule bis zur Homogenität auf gereinigt. Gebundenes Protein wird mit einem linearen NaCl-Gradienten in 20 mM Phosphatpuffer, pH 6,5, eluiert.
Beispiel 17:
Um herauszufinden, ob die beiden Spleiß-Isoformen von VEGF-B eine differentielle Gewebeverteilung aufwiesen und ob weitere Isoformen existierten, wurde eine RT-PCR-Analyse mit Gesamt-RNA durchgeführt, die aus Hirn, Herz, Leber und Niere von Mäusen und aus humanem Embryoherz und Skelettmuskel extrahiert worden war. Die Transkripte wurden mittels PCR analysiert, wobei vier Paare von spezifischen Primern verwendet wurden, die Exons 4 bis 7 und Exons 3 bis 7 in den VEGF-B-Genen der Maus bzw. des Menschen abdeckten.
Methode.
Gesamt-RNA aus murinen und humanen Geweben wurde mit Standardmethoden wie bei Chirgwin et al., Biochemistry, 18: 5294–99 (1979) beschrieben isoliert. Zur Synthese des ersten cDNA-Strangs mit Reverser Transkriptase von Avian Myelostosis-Virus (20 U/Reaktion) wurden 2–5 μg Gesamt-RNA eingesetzt. Die Reaktionen wurden mit Oligo-(dT)₁₈ als Primer gestartet. Aliquote dieser Reaktionen wurden als Templates für PCR-Reaktionen mit DNA-Polymerase Taq (2,5 U/Reaktion) eingesetzt. Zur Amplifikation von Maus-cDNA wurden zwei Primerpaare verwendet. Diese Paare wurden erhalten, indem ein üblicher 5'-Primer 5'-CACAGCCAATGTGAATGCA (vorwärts) (SEQ ID NO: 23), der in Exon 3 lokalisiert war, mit zwei verschiedenen 3'-Primern, 5'-GCTCTAAGCCCCGCCCTTGGCAATGGAGGAA (rückwärts) (SEQ ID NO: 24) und 5'-ACGTAGATCTTCACTTTCGCGGCTTCCG (rückwärts) (SEQ ID NO: 25) (dieser letztgenannte Primer weist eine Bgl II-Stelle und 4 Extrabasen am 5'-Ende auf), die in Exons 6B bzw. 7 lokalisiert sind, kombiniert wurde. Nach Analyse mittels Agarose-Gelelektrophorese wurden die amplifizierten Banden auf ein Nylonfilter (Genescreen Plus) überführt und nacheinander mit Oligonukleotidsonden, die für die Exons 6A und 6B spezifisch waren, hybridisiert. Die Oligonukleotidsonden waren 5'-CTCTGTTCCGGGCTGGGACTCTA (Exon 6A) (SEQ ID NO: 26) und 5'-TCAGGGCGTTGACGGCGCTGGGTGCAA (Exon 6B) (SEQ ID NO: 27). Die Oligonukleotidsonden wurden mit [³²P]dCTP mittels terminaler Transferase zu einer hohen spezifischen Aktivität markiert. Hybridisierungen wurden bei 37°C in 6 × SSC mit 5 × Denhardt-Lösung, 0,5% SDS und 100 μg/ml Lachssperma-DNA durchgeführt, wobei 1 × 10⁶ cpm markierte Sonde/ml Lösung eingesetzt wurden.
Die Filter wurden bei der gleichen Temperatur in 6 × SSC mit 0,5% SDS 2 × 15 min gewaschen und mit einem Film exponiert.
Die beiden Primerpaare, die zur Amplifikation humaner cDNA verwendet wurden, wurden erhalten, indem zwei verschiedene 5'-Primer, 5'-CCTGACGATGGCCTGGAGTGT (vorwärts) (SEQ ID NO: 28), lokalisiert in Exon 3, und 5'-TGTCCCTGGAAGAACACAGCC (vorwärts) (SEQ ID NO: 29), lokalisiert in Exon 4, mit einem üblichen 3'-Primer, 5'-GCCATGTGTCACCTTCGCAG (rückwärts) (SEQ ID NO: 19), lokalisiert in Exon 7, kombiniert wurden. Aliquote der amplifizierten Produkte wurden mittels Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Die Aliquote wurden direkt in den TA-Klonierungsvektor pCR II (Invitrogen, Inc.) kloniert, und generierte Plasmide wurden durch Nukleotidsequenzierung analysiert. Die Amplifikation von GAPDH diente als Kontrolle.
Ergebnisse.
Die Analyse amplifizierter PCR-Produkte mittels Agarose-Gelelektrophorese zeigte zwei Hauptbanden von 215 bzw. 316 bp. Diese Größen sind mit den zwei mRNAs konsistent, die VEGF-B₁₆₇ und VEGF-B₁₈₆ entsprechen. Diese beiden Banden waren von gleicher Intensität, was vermuten ließ, daß die beiden Isoformen in allen untersuchten Geweben von Maus und Mensch in etwa gleichen Mengen exprimiert wurden.
Um die Identität der amplifizierten Produkte aus Mausgeweben zu verifizieren, wurde die PCR-amplifizierte DNA auf ein Filter überführt und mit spezifischen Oligonukleotidsonden für Exons 6A bzw. 6B hybridisiert. Die Autoradiogramme zeigten, daß eine Exon 6-spezifische Sonde mit der 316 bp-Bande hybridisierte, während die Exon 6B-spezifische Sonde sowohl mit der amplifizierten 215 bp- als auch der 316 bp-Bande hybridisierte. Diese Ergebnisse sind mit der alternativen Verwendung der Akzeptorstelle in Exon 6 zur Bildung der beiden Isoformen von VEGF-B konsistent, und daher entsprechen alle amplifizierten Produkte den Produkten, die auf Basis der Sequenzen für die VEGF-B₁₆₇- und die VEGF-B₁₈₆-Isoform vorhergesagt wurden.
Agarose-Gelelektrophorese von Produkten der PCR-Analyse von Gesamt-RNA, die aus humanem Embryoherz und Muskel isoliert worden war, machte zwei amplifizierte Hauptbanden mit 329 bp und 430 bp sichtbar.
Zusammengenommen zeigen diese Daten, daß VEGF-B₁₆₇ und VEGF-B₁₈₆ die beiden wichtigsten Isoformen von VEGF-B in Geweben sind. Die Muster der PCR-Produkte und die Lage der Primer zeigen an, daß, falls noch irgendwelche längeren Spleiß-Isoformen für VEGF-B existieren, bei solchen Transkripten eine Akzeptor-Spleißstelle benutzt wird, die etwas weiter 5' liegt als im Fall von VEGF-B₁₈₆. Außerdem wurden keine PCR-Produkte gefunden, die VEGF₁₂₁ entsprechen, dem Heparinbindungsdomänen fehlen, d. h. Sequenzen, die Exon 6 in VEGF-B entsprechen. Spleißen von Exon 5 bis Exon 7 würde jedoch zu einem Transkript führen, das für eine Isoform von VEGF-B codiert, die VEGF₁₂₁ entspricht, und diese putative Isoform von VEGF-B könnte in anderen Geweben exprimiert werden, als sie in diesem Beispiel analysiert wurden.
Beispiel 18: Stimulation der Zellproliferation.
Die Fähigkeit von VEGF-B₁₆₇ zur Stimulierung der Proliferation von Endothelzellen wurde durch Analyse des [³H]Thymidin-Einbaus in humane umbilikale Venenendothelzellen (HUVEC) und in bovine Kapillarendothelzellen (BCE) nachgewiesen.
293EBNA-Zellen wurden wie oben beschrieben mit Expressionsvektoren für VEGF-B₁₆₇, VEGF₁₆₅ oder mit leerem Vektor ("mock") in Gegenwart von 1 μg/ml Heparin transfiziert. Konditionierte Medien für diese Zellen wurden in den jeweiligen Medien verdünnt, die für humane umbilikale Venenendothelzellen (HUVEC) und bovine Kapillarendothelzellen (BCE) verwendet werden, und Einbau von [³H]Thymidin wurde gemessen. Als positive Kontrolle wurde rekombinanter bFGF zu BCE-Zellen gegeben.
Im einzelnen wurden konditionierte Medien, die humanen VEGF-B und humanen VEGF₁₆₅ enthielten, von 293EBNA-Zellen, die mit den jeweiligen Expressionsvektoren oder mit leerem Vektor ("mock") in Gegenwart von Heparin (1 μg/ml) transfiziert worden waren, 48 Stunden nach Transfektion gesammelt. HUVEC der zweiten Passage wurden in M-199-Medium, das mit 10% fötalem Rinderserum supplementiert war, in Platten mit 96 Vertiefungen plattiert (4 × 10³ Zellen/Vertiefung) und 24 Stunden inkubiert. Konditionierte Medien wurden mit dem Wachstumsmedium verdünnt und Zellen wurden 48 Stunden stimuliert. Es wurden frische konditionierte Medien mit 10 uCi/ml [³H]Thymidin (Amersham Inc.) zu den Zellen gegeben, und die Stimulierung wurde weitere 48 Stunden fortgesetzt. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und trypsiniert, und die eingebaute Radioaktivität wurde durch Flüssigszintillationszählung bestimmt. BCE-Zellen wurden in Platten mit 24 Vertiefungen ausgesät und in "Minimal Essential Medium" (MEM), das mit 10% fötalem Kälberserum supplementiert war, bis zur Konfluenz wachsen gelassen. Die Zellen wurden in mit 3% fötalem Kälberserum supplementiertem MEM 72 Stunden gehungert, wonach konditionierte Medien, die in serumfreiem Medium verdünnt worden waren, zu den Zellen gegeben wurden, und die Zellen wurden 24 Stunden stimuliert. Während der letzten 4 Stunden der Stimulierung wurde [³H]Thymidin zugesetzt (1 uCi/ml). Stimulierungen mit bFGF erfolgten wie oben beschrieben mit 6 ng/ml rekombinantem bFGF (Synergen Inc.). Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, mit NaOH lysiert, und die eingebaute Radioaktivität wurde durch Flüssigszintillationszählung bestimmt.
20 ist ein Balkendiagramm, das die Vervielfachung der Induktion des [³H]Thymidin-Einbaus durch VEGF-B₁₆₇ in humanen umbilikalen Venenendothelzellen (HUVEC) und in bovinen Kapillarendothelzellen (BCE) verglichen mit der Basalaktivität zeigt, die durch konditioniertes Medium von scheintransfizierten Zellen ("mock") induziert wird. Für Vergleichszwecke ist auch die Induktion durch VGEF₁₆₅ und bFGF gezeigt. Die Balken zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung paralleler Proben. Ähnliche Ergebnisse wurden in mehreren anderen unabhängigen Experimenten erhalten. Die Testergebnisse zeigen deutlich, daß VEGF-B den [³H]Thymidin-Einbau sowohl in HUVEC- als auch in BCE-Zellen induzierte und die Proliferation von Endothelzellen in vitro stimulierte, wodurch gezeigt wird, daß VEGF-B ein endothelialer Wachstumsfaktor ist.
Beispiel 19: Identifizierung von Klonen mit Promotor-DNA für humanen VEGF-B und Aktivität
Es wurde eine humane genomische DNA-Genbank im Bakteriophagen λ EMBL gescreent, wobei ein 5'-PCR-Fragment verwendet wurde, das die Sequenzen aus dem ersten und zweiten Exon von VEGF-B als Sonde enthielt. Es wurden zwei positive Klone erhalten, und einer von diesen wurde in Form von SacI-Fragmenten in das Plasmid Bluescript SKII subkloniert. Es wurde ein 1,4 kb-Fragment erhalten, das etwa 0,4 kb Sequenzen stromaufwärts von einer in der cDNA vorhandenen NcoI-Stelle enthielt (lokalisiert weniger als 100 bp stromaufwärts von der ATG-Stelle für die Translationsinitiation).
Ferner wurde ein XhoI-Fragment mit etwa 6 kb aus dem anderen λ-Klon in das Plasmid pGEMEX kloniert. Dieser Subklon enthielt etwa 1,5 kb Sequenzen stromaufwärts der NcoI-Stelle. Das SacI/NcoI-Fragment und ein EcoRI (Polylinker)-NcoI-Fragment wurden in der jeweiligen transkriptionellen Orientierung in den Grundvektor pGL3 (Promega) kloniert. DNA dieser Subklone und aus dem Kontrollvektor pGL3, der den SV40-Promotor enthielt, wurde mittels Calciumphosphatpräzipitation in HeLa-Zellen transfiziert. Zwei Tage nach Transfektion wurde die Luciferaseaktivität in Lysaten der transfizierten Zellen bestimmt. Die Ergebnisse zeigten an, daß das 400 bp-SacI/NcoI-Fragment eine Promotoraktivität besitzt, die etwa 30% der Aktivität des Kontrollvektors pGL3 beträgt, während das 1,5 kb Fragment nur Backgroundaktivität lieferte. Die Verwendung eines stärkeren oder aktiveren Promotors, beispielsweise des CMV-Promotors oder des Promotors für den Elongationsfaktor 1-alpha, ergäbe wahrscheinlich höhere Aktivität in humanen Zellen und Geweben. Die Struktur der klonierten Fragmente ist in 24 dargestellt.
Das 1,5 kb-Fragment stromaufwärts der NcoI-Stelle wurde sequenziert. Die resultierende Sequenz (SEQ ID NO: 17) ist in 25 dargestellt. Die erhaltene Sequenz ergab ein putatives Silencerelement [Weissman und Singer, Molecular and Cellular Biology, 11: 4228–234 (1991)], das aus zwei Strängen mit acht Basenpaaren zwischen den Nukleotiden 166–187 bestand (in der Abbildung eingerahmt). Dieser Silencer könnte für den relativen Mangel an Aktivität des 1,5 kb-Fragments verantwortlich sein.
Beispiel 20: Analyse von VEGF-B-mRNA in Melanomen, normaler Haut und Muskel durch RT-PCR.
Gewebe von normaler Haut und von Melanomen wurde von Patienten des Department of Radiotherapy and Oncology, Helsinki University Central Hospital, erhalten. Vier Proben metastatischer Melanome wurden frisch nach operativer Exzision erhalten, sofort in Tissue-tek (Miles) eingelegt und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Proben normaler Haut wurden von freiwilligen Patienten mit Mammakarzinom-Operation und Exzision eines Hautmals erhalten. Alle Proben wurden zur Bestätigung der Diagnose von einem Pathologen untersucht.
Gesamt-RNA wurde nach der Guanidiumisothiocyanat-Methode isoliert [Chomczynski et al., Anal. Biochem., 162: 156–159 (1987)]. cDNA wurde mit 0,2 μg Hexadeoxynukleotid-Primern mit Zufallssequenz, 5 Einheiten muriner reverser Transkriptase, 5 μg Gesamt-RNA als Template und einem First Strand cDNA Synthesis Kit (Pharmacia) synthetisiert. Nach 1 Stunde Inkubation bei 37°C wurde die Reaktionsmischung bei –70°C aufbewahrt. Negative Kontrollproben für die PCR-Amplifikation wurden in ähnlicher Weise präpariert, außer daß keine reverse Transkriptase zugegeben wurde. Auch β-Actin wurde als interner Standard getestet, da es in einer konstitutiven hohen Menge exprimiert wird und seine Expression in verschiedenen Zellen keinen großen Schwankungen unterliegt.
Die Primersequenzen für die PCR-Amplifikation wurden wie folgt aus den VEGF-B- und β-Actin-Genen ausgewählt:
[β-Actinsequenzen umfassen die Nukleotide 2105–2125 und 2411–2432 von Ng et al., Mol. Cell Biol., 5: 2720–732 (1985)].
Ein 4 μl-Aliquot des cDNA-Reaktionsprodukts wurde 5 Minuten auf 94°C erhitzt und mit 20 pmol Primern, 10 × PCR-Puffer, 1 μl 20 mM dNTPs und 2,5 U Taq-Polymerase als Template für die PCR-Amplifikation verwendet. Das Endvolumen wurde mit DEPC-behandeltem Wasser auf 100 μl eingestellt. Denaturierung erfolgte 1 Minute bei 95°C, Hybridisierung 45 Sekunden bei 62°C und Polymerisation 50 Sekunden bei 72°C über insgesamt 35 Zyklen für VEGF-B und 25 Zyklen für β-Actin. Nach jeweils 5 Zyklen wurden 15 μl-Aliquote zur Analyse entnommen.
Die Elektrophorese von 5 ml der PCR-Reaktionsmischung erfolgte auf einem 2%igen Agarosegel mit Ethidiumbromid. Die DNA-Fragmente, die als Größenmarker verwendet wurden, hatten eine Länge von 24 bis 726 Basenpaaren (ΦX174 DNA/HinfI-Marker von Promega, Madison, WI, USA). Die getesteten Proben umfaßten also vier metastatische Melanome, Muskel, normale Haut, eine negative Kontrolle (ohne reverse Transkriptase) und den ΦX174 DNA/HinfI-Größenmarker. Die Ergebnisse der RT-PCR-Analyse für VEGF-B (PCR-Produktlängen 323 und 234 bp) und für β-Actin zeigen, daß VEGF-B in allen untersuchten Melanomen stark exprimiert wird, und zwar in Mengen, die in etwa der Expression im Muskelgewebe gleichen. Andererseits weist normale Haut sehr wenig VEGF-B-RNA auf. Ähnliche Schlußfolgerungen lassen sich aus der Analyse mittels Northern Blotting und Hybridisierung ziehen.
Die vorangehenden Ergebnisse zeigen an, daß VEGF-B ein neuer Wachstumsfaktor für Endothelzellen ist, der bei der Vaskularisierung, insbesondere von Muskel, eine Rolle spielt. Kollaterales Arterienwachstum in ischämischem Herz oder Gliedmaßen kann durch arterielle Verabreichung eines VEGF-B-Bolus mittels Methoden gefördert werden, die bei Takeshita et al., Am. J. Pathol., 147: 1649–60 (1995), beschrieben sind. Die Zellassoziation von VEGF-B kann mehrere Implikationen für die Regulation von Vaskularisierung und Endothelzellenwachstum haben. In sich entwickelnden Embryos und in kontraktilen Geweben kann zellassoziierter VEGF-B während bei Etablierung und Erhalt des Gefäßbaums räumliche Signale an auswachsende Endothelzellen abgeben. Er kann durch seine Zellassoziation auch die Regeneration von geschädigtem Endothel in adulten Gefäßen unterstützen, Reendothelialisierung arterieller Verletzungen kann durch Direktapplikation von VEGF-B mittels Methoden gefördert werden, die bei Asahara et al., Circulation, 91(11): 2793–802 (1995) beschrieben sind. Die Fähigkeit von VEGF-B, die Sekretion von VEGF durch Bildung von Heterodimeren zu modulieren, legt eine indirekte Rolle von VEGF-B bei der VEGF-Signalgebung nahe, wodurch die Rezeptorbindung und/oder -aktivierung reguliert wird, wie von Potgens et al., J. Biol. Chem., 269(52): 32879–85 (1994) beschrieben. Die Bildung multipler heterodimerer Komplexe dieser Wachstumsfaktoren kann eine Basis für eine ganze Reihe von Regulationssignalen für Endothelzellen liefern.
VEGF-B kann in vitro als Wachstumsfaktor für Endothelzellenpopulationen verwendet werden. VEGF-B kann verwendet werden, um erwünschte Angiogenese, d. h. die Bildung neuer Blutgefäße und Kapillaren, zu fördern; siehe Takeshita et al., supra. Er kann beispielsweise nützlich sein, um die Entwicklung des Corpus luteum und des Endometrium als Hilfe bei der Initiierung und/oder dem Erhalt einer Schwangerschaft zu begünstigen. Wegen seiner Wirkung auf Endothelzellen kann er auch zur Knochenheilung nützlich sein. Verabreichung von VEGF-B kann auch zur Unterstützung der Embryogenese sowie des somatischen Wachstums und der Gefäßentwicklung und Differenzierung dienen. Topische Applikation von VEGF-B auf Wunden kann nützlich sein, um Wundheilung zu fördern, und orale Verabreichung von VEGF-B kann nützlich sein, um die Heilung von Magen- und/oder Duodenalgeschwüren zu beschleunigen. Die Fähigkeit von VEGF-B, die Sekretion von VEGF durch Bildung von Heterodimeren zu modulieren, könnte zu einer Rolle von VEGF-B bei der Therapie von Krankheiten führen, bei denen VEGF-Agonisten nützlich wären; siehe Potgens et al., supra.
VEGF-B kann entweder direkt oder über Verbesserungen bei der Blutzufuhr proliferative Wirkungen auf Mesodermzellen ausüben.
Es wurde gefunden, daß VEGF-B in Tumoren, beispielsweise Melanomen, überexprimiert wird. Folglich können Tests auf VEGF-B-Expression als Werkzeuge bei der Tumordiagnose eingesetzt werden, und eine Suppression der VEGF-B-Expression, beispielsweise mit monoklonalen Antikörpern, kann dazu dienen, das Tumorwachstum zu hemmen.
Tumorassays für VEGF-B können als Indikatoren für Metastaserisiko dienen. Beispielsweise kann die Verwendung von VEGF-B-Antikörpern analog den von Takahashi et al., Cancer Res., 55: 3964–68 (1995), beschriebenen Methoden zur Quantifizierung von Neovaskularisation und Proliferation als Indikator für das Metastasenrisiko bei Dickdarmkrebs verwendet werden, Assays für VEGF-B in Körperflüssigkeiten oder im Tumor selbst mittels Histochemie können als Faktor bei der Tumorprognose dienen. Ein ELISA analog zu der bei Kondo et al., Biochemica et Biophysica Acta, 1221(2): 211–14 (1994) beschriebenen Methode kann als Tumor-Screen dazu dienen, die Hochregulierung von VEGF-B nachzuweisen, Ein Enzym-verknüpfter Immunoabsorbentassay für die VEGF-B-Expression mit Methoden, die bei Boocock et al., J. Natl. Cancer Inst., 87: 506–16 (1995) beschrieben sind, kann als Diagnoseindex für Ovarialkarzinome dienen. Ein Assay für die VEGF-B-Expression ähnlich dem von Weindel et al., Neurosurgery, 35: 439–48 (1994), beschriebenen VEGF-Assay kann als Indikator für die Bösartigkeit bei Hirntumoren nützlich sein.
Weil das Tumorwachstum Angiogenese benötigt, kann die Verabreichung von VEGF-B ferner auch nützlich sein, um das Tumorwachstum in Labortieren zu fördern, um Antitumorwirkstoffe zu testen. VEGF-B kann auch nützlich sein, um die Mikrovaskularität hypoxischer Bereiche von Tumoren zu erhöhen und sie gegenüber Bestrahlung, bestrahlungssensibilisierenden Wirkstoffen usw. empfindlicher zu machen.
Die angiogene Wirkung von VEGF-B kann bei der Behandlung ischämischer Zustände nützlich sein. Verabreichung eines intraarteriellen VEGF-B-Bolus mittels Methoden, die bei Bauters et al., American Journal of Physiology, 267(4 Pt 2): H 1263–71 (1994), beschrieben sind, kann nützlich sein, um die Ischämie unterer Extremitäten zu behandeln und die Perfusion in den Extremitäten zu erhöhen. Mit Methoden, die bei Mesri et al., Circulation Research, 76: 161–67 (1995), beschrieben sind, kann in Gewebe, dem Fibroblastenzellen injiziert wurden, die mit einem Virus transduziert sind, das VEGF-B exprimiert, eine angiogene Reaktion erzeugt werden, um Gewebeischämie (z. B. Myokardischämie) zu behandeln. VEGF-B oder Agonisten könnten verwendet werden, um die Entwicklung kollateraler Zirkulation in Fällen von arterieller und/oder venöser Obstruktion zu stimulieren, z. B. bei Myokardinfarkten, ischämischen Gliedmaßen, tiefer venöser Thrombose und/oder vaskulären Problemen nach der Entbindung; siehe Takeshita et al., supra.
Ein VEGF-B/VEGF-B-Rezeptorsystem kann als Assaysystem zum Auffinden kleiner Moleküle als Agonisten/Antagonisten zur Entwicklung neuer Wirkstoffe verwendet werden. Beispiele für kleine Moleküle, die aufgefunden werden könnten, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, organische Chemikalien, Peptide und RNA-Moleküle.
Pharmazeutische Zusammensetzungen können hergestellt werden, indem eine pharmazeutisch wirksame Menge VEGF-B-Protein mit ein oder mehreren geeigneten Trägerstoffen oder Adjuvantien wie Wasser, Mineralöl, Polyethylenglykol, Stärke, Talkum, Lactose, Verdickungsmitteln, Stabilisatoren, Suspensionsmitteln usw. vermischt werden. Solche Zusammensetzungen können in Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Kapseln, Cremes, Salben, Pasten oder anderen üblichen Formen vorliegen.
Wie in Beispiel 7 gezeigt, kann das VEGF-B-Protein auch zur Erzeugung von Antikörpern verwendet werden. Im allgemeinen können übliche Produktionsmethoden für Antikörper zur Herstellung von VEGF-B-Antikörpern verwendet werden. Beispielsweise können spezifische monoklonale Antikörper via Immunisierung mit durch rekombinante DNA-Expression erhaltenen Fusionsproteinen erzeugt werden.
Insbesondere sollten markierte monoklonale Antikörper zum Screening auf Zustände nützlich sein, die mit abnormen Mengen VEGF-B im Körper assoziiert sind. Beispielsweise kann ein Assay für VEGF-B in Synovialflüssigkeiten und/oder Bindegewebe mit immunfluorometrischen Methoden analog zu dem von Fava et al., Journal of Experimental Medicine, 180: 341–46 (1994), beschriebenen Verfahren als diagnostischer Indikator für rheumatoide Arthritis geeignet sein. Ein Radioimmunassay für VEGF-B in Augenflüssigkeit mit Hilfe der von Aiello et al., New England Journal of Medicine, 331(22): 1480–87 (1994), beschriebenen Methoden kann als diagnostischer Indikator für diabetische Retinopathie, Neovaskularisation der Iris oder Netzhautvenenverschluß dienen. Immunassays für VEGF-B-Spiegel im Blut, Urin oder anderen Körperflüssigkeiten können sich ebenfalls als Tumormarker eignen; siehe Kondo et al., supra. Diese monoklonalen Antikörper gegen VEGF-B können auch bei der Inhibierung von mit hohen VEGF-B-Spiegeln im Körper assoziierter Angionese nützlich sein, z. B. bei schnell proliferierenden, Angiogenese-abhängigen Tumoren in Säugern, und können dadurch das Wachstum solcher Tumoren hemmen. Behandlung mit einem monoklonalen, für VEGF-B spezifischen Antikörper mit Methoden analog zu den von Kim et al., Nature, 362(6243): 841–44 (1993), beschriebenen Methoden kann dazu dienen, das Tumorwachstum in vivo zu supprimieren oder zu inhibieren. Intravenöse und/oder subkutane Injektion von monoklonalen Antikörpern gegen VEGF-B mit Methoden, wie sie von Asano et al., Cancer Research, 55: 5296–5301 (1995), beschrieben werden, kann nützlich sein, um Neovaskularisation und primäres und metastatisches Wachstum solider Tumoren zu inhibieren. Für die Therapie von Menschen ist eine Chimerisierung oder Humanisierung solcher monoklonaler Antikörper zu bevorzugen. Die Behandlung kann zum Beispiel durch zweimal wöchentliche intraperitoneale Injektion von 10 bis 500 μg, vorzugsweise 50-100 μg monoklonalem Antikörper erfolgen.
VEGF-B-Antagonisten, wie Antikörper, können auch dazu dienen, neue Blutgefäße bei diabetischer Retinopathie, Psoriasis, Arthropathien und/oder vaskulären Tumoren wie Hämangiomen zu inhibieren; siehe Aiello et al., supra.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierte Nukleinsäure, welche ausgewählt ist aus: i) SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 14; und ii) Sequenzen, die: a) unter stringenten Bedingungen an die Sequenzen unter (i) hybridisieren; b) ein Protein codieren, welches eine charakteristische Aminosäuresequenz Pro-Xaa-Cys-Val-Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Cys-Xaa-Gly-Cys-Cys (SEQ ID NO: 16) umfaßt; und c) ein Protein codieren, das die Eigenschaft besitzt, Proliferation von Endothelzellen oder Mesodermzellen zu fördern.
Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure eine cDNA ist.
Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, welche eine der DNA der 1 und 2 (SEQ ID NO: 1) entsprechende cDNA umfaßt.
Nukleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 1–3, wobei die Nukleinsäuresequenz eine Säuger-DNA ist.
Nukleinsäure nach Anspruch 4, wobei die Nukleinsäure eine murine DNA ist.
Nukleinsäure nach Anspruch 4, wobei die Nukleinsäure eine humane DNA ist.
Nukleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 1–6, wobei die Nukleinsäure für ein Protein codiert, das Proliferation von vaskulären Endothelzellen fördert.
Nukleinsäure nach Anspruch 1, umfassend eine der DNA von SEQ ID NO: 4 entsprechende cDNA.
Nukleinsäure nach Anspruch 1, umfassend eine der DNA von SEQ ID NO: 6 entsprechende cDNA.
Nukleinsäure nach Anspruch 1, umfassend einer der DNA von SEQ ID NO: 8 entsprechende cDNA.
Nukleinsäure nach Anspruch 1, umfassend eine der DNA von SEQ ID NO: 10 entsprechende cDNA.
Nukleinsäure nach Anspruch 1, umfassend eine der DNA von SEQ ID NO: 12 entsprechende cDNA.
Nukleinsäure nach Anspruch 1, umfassend eine der DNA von SEQ ID NO: 14 entsprechende cDNA.
Vektor, umfassend eine Nukleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 1–13 in funktionsfähiger Verknüpfung mit einer Promotorsequenz.
Vektor nach Anspruch 14, wobei der Vektor ein eukaryontischer Vektor ist.
Vektor nach Anspruch 14, wobei der Vektor ein prokaryontischer Vektor ist.
Vektor nach Anspruch 14, wobei der Vektor ein Plasmid ist.
Isoliertes Protein, welches eine charakteristische Sequenz
(SEQ ID NO: 16) aufweist und die Eigenschaft besitzt, Proliferation von Endothelzellen oder Mesodermzellen zu fördern, wobei das Protein eine Sequenz von Aminosäuren umfaßt, die einer Aminosäuresequenz entspricht, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der Aminosäuresequenz von 1 (SEQ ID NO: 2), der Aminosäuresequenz von 2 (SEQ ID NO: 3), der Aminosäuresequenz von 4 (SEQ ID NO: 5), der Aminosäuresequenz von 6 (SEQ ID NO: 7), der Aminosäuresequenz von 8 (SEQ ID NO: 9), der Aminosäuresequenz von 11 (SEQ ID NO: 11), der Aminosäuresequenz von 13 (SEQ ID NO: 13) und der Aminosäuresequenz von 15 (SEQ ID NO: 15).
Isoliertes Protein nach Anspruch 18, wobei das Protein eine der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 entsprechende Sequenz von Aminosäuren umfaßt.
Isoliertes Protein nach Anspruch 18, wobei das Protein eine der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 3 entsprechende Sequenz von Aminosäuren umfaßt.
Isoliertes Protein nach Anspruch 18, wobei das Protein eine der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 5 entsprechende Sequenz von Aminosäuren umfaßt.
Isoliertes Protein nach Anspruch 18, wobei das Protein eine der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 7 entsprechende Sequenz von Aminosäuren umfaßt.
Isoliertes Protein nach Anspruch 18, wobei das Protein eine der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 9 entsprechende Sequenz von Aminosäuren umfaßt.
Isoliertes Protein nach Anspruch 18, wobei das Protein eine der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 11 entsprechende Sequenz von Aminosäuren umfaßt.
Isoliertes Protein nach Anspruch 18, wobei das Protein eine der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 13 entsprechende Sequenz von Aminosäuren umfaßt.
Isoliertes Protein nach Anspruch 18, wobei das Protein eine der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 15 entsprechende Sequenz von Aminosäuren umfaßt.
Isoliertes Protein nach irgendeinem der Ansprüche 18–26, wobei das Protein ein Säugerprotein ist.
Isoliertes Protein nach Anspruch 27, wobei das Protein ein murines Protein ist.
Isoliertes Protein nach Anspruch 27, wobei das Protein ein Humanprotein ist.
Isoliertes Protein nach irgendeinem der Ansprüche 18–29, wobei das Protein Proliferation von vaskulären Endothelzellen fördert.
Isoliertes Protein, hergestellt durch Expression einer DNA, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der DNA der 1 und 2 (SEQ ID NO: 1), der DNA von 3 (SEQ ID NO: 4), der DNA von 5 (SEQ ID NO: 6), der DNA von 7 (SEQ ID NO: 8), der DNA von 10 (SEQ ID NO: 10), der DNA von 12 (SEQ ID NO: 12), der DNA von 14 (SEQ ID NO: 14) und DNA, die unter stringenten Bedingungen mit wenigstens einer der vorstehenden DNA-Sequenzen hybridisiert.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Protein nach den Ansprüchen 18–30 und wenigstens einen üblichen pharmazeutischen Träger oder wenigstens ein übliches pharmazeutisches Verdünnungsmittel.
Antikörper, welcher an ein Protein nach den Ansprüchen 18-30 bindet, wobei der Antikörper kein VEGF-2 bindet.
Antikörper nach Anspruch 33, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Wirtszelle, die mit einem Vektor nach Anspruch 14 transformiert oder transfiziert ist, so daß die Wirtszelle ein Protein exprimiert, das die Eigenschaft besitzt, Proliferation von Endothel- oder Mesodermzellen zu fördern.
Transfizierte Wirtszelle nach Anspruch 35, wobei die Wirtszelle eine Eukaryontenzelle ist.
Transfizierte Wirtszelle nach Anspruch 35 oder 36, wobei die Wirtszelle eine COS-Zelle ist.
Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 35, wobei die Wirtszelle eine Prokaryontenzelle ist.
Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 35, wobei die Wirtszelle eine 293EBNA-Zelle ist.
Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 35 oder 36, wobei die Wirtszelle eine Insektenzelle ist.
Diagnostisches Mittel zum quantitativen Bestimmen eines Proteins nach irgendeinem der Ansprüche 18–29 in einer Testprobe, wobei das Mittel einen Antikörper nach Anspruch 33 oder 34 umfaßt, der an das Protein bindet, um die Menge des Proteins in der Probe zu bestimmen.
Diagnostisches Mittel nach Anspruch 41, wobei der Antikörper ein markierter Antikörper ist.
Diagnostisches Mittel zum Bestimmen einer Nukleinsäure in einer Testprobe, wobei das Mittel wenigstens ein Primerpaar umfaßt, das dafür ausgelegt ist, spezifisch an eine Nukleinsäuresequenz nach irgendeinem der Ansprüche 1-13 zu binden und die Testnukleinsäure durch eine Polymerase-Kettenreaktion zu amplifizieren.
Diagnostisches Mittel nach Anspruch 43, wobei die Polymerase-Kettenreaktion einen Sequenzvergleich zwischen einer Nukleinsäure in einer Testprobe und einer Nukleinsäure nach irgendeinem der Ansprüche 1–13 erleichtert.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend Antikörper nach Anspruch 33 oder 34 und wenigstens einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder wenigstens ein pharmazeutisch verträgliches Adjuvans.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Protein nach irgendeinem der Ansprüche 18–30 und VEGF.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 46, welche außerdem Heparin umfaßt.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 32, welche außerdem Heparin umfaßt.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Protein nach irgendeinem der Ansprüche 18–30.
Isoliertes Proteindimer, umfassend ein Protein nach irgendeinem der Ansprüche 18–30.
Isoliertes Proteindimer nach Anspruch 50, wobei das Proteindimer ein Homodimer dieses Proteins ist.
Isoliertes Proteindimer nach Anspruch 50, wobei das Proteindimer ein Heterodimer aus diesem Protein und VEGF ist.
Isoliertes Proteindimer nach Anspruch 50, wobei das Proteindimer ein disulfid-verbrücktes Dimer ist.
In-vitro-Verfahren zur Förderung der Freisetzung wenigstens eines Proteins, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Proteinen nach irgendeinem der Ansprüche 18-30 besteht, aus einer Zelle, die das wenigstens eine Protein exprimiert, wobei das Verfahren das Exponieren der Zelle mit Heparin umfaßt.
Vektor, umfassend eine Antisens-Nukleotidsequenz, die zu wenigstens einem Teil einer Nukleinsäuresequenz nach irgendeinem der Ansprüche 1–13 komplementär ist.
In-vitro-Verfahren zum Hemmen der Expression eines Proteins nach irgendeinem der Ansprüche 18–29 in einer Zelle, die das Protein exprimiert, wobei das Verfahren die Transfektion der Zelle mit einem Vektor nach Anspruch 55 umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 56, wobei die Zelle eine Tumorzelle ist.
Isolierte Nukleinsäure, umfassend eine der Sequenz von SEQ ID NO: 17 entsprechende Nukleotidsequenz oder eine Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit dieser Nukleotidsequenz hybridisiert.
Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor transformiert oder transfiziert ist, der eine Nukleinsäuresequenz nach irgendeinem der Ansprüche 1–13 umfaßt, so daß die Wirtszelle ein Protein nach irgendeinem der Ansprüche 18-29 exprimiert.
Wirtszelle nach Anspruch 59, wobei das Protein eine Sequenz von Aminosäuren umfaßt, die einer Aminosäuresequenz entspricht, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der Aminosäuresequenz von 1 (SEQ ID NO: 2), der Aminosäuresequenz von 2 (SEQ ID NO: 3), der Aminosäuresequenz von 4 (SEQ ID NO: 5), der Aminosäuresequenz von 6 (SEQ ID NO: 7), der Aminosäuresequenz von 8 (SEQ ID NO: 9), der Aminosäuresequenz von 11 (SEQ ID NO: 11), der Aminosäuresequenz von 13 (SEQ ID NO: 13) und der Aminosäuresequenz von 15 (SEQ ID NO: 15).
Diagnostischer Test, bestehend aus einer Polymerase-Kettenreaktion zum Nachweis einer Nukleinsäure in einer Testprobe, wobei die Reaktion wenigstens ein zu einer Nukleinsäuresequenz nach irgendeinem der Ansprüche 1–13 komplementäres Primerpaar umfaßt.
In-vitro-Verfahren zum Fördern der Freisetzung wenigstens eines Proteins, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Proteinen nach den Ansprüchen 18–30 und VEGF besteht, aus einer Zelle, die dieses wenigstens eine Protein exprimiert, wobei das Verfahren die Heparinexposition der Zelle umfaßt, um die Freisetzung des wenigstens einen Proteins zu induzieren.
Verfahren zur Herstellung eines zur Expression eines Proteins nach irgendeinem der Ansprüche 18–29 geeigneten Vektors, wobei das Verfahren den Einbau einer Nukleotidsequenz nach irgendeinem der Ansprüche 1–13 umfaßt.