ES2529451T3 - Compuestos polipeptídicos para inhibir la angiogénesis y el crecimiento tumoral - Google Patents

Abstract

Polipéptido soluble aislado que comprende un dominio extracelular de una proteína EphB4 fusionado a una proteína albúmina o fragmento de la misma, en el que el polipéptido es un monómero, se une específicamente a un polipéptido de efrina B2, tiene una semivida sérica in vivo aumentada en comparación con la del dominio extracelular sin modificar de EphB4, e inhibe la señalización que resulta de la interacción entre EphB4 y efrina B2.

Description

Compuestos polipeptídicos para inhibir la angiogénesis y el crecimiento tumoral

Antecedentes de la invención

La angiogénesis, el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos a partir del endotelio de una vasculatura preexistente, es un proceso crítico en el crecimiento, la progresión y la metástasis de tumores sólidos dentro del huésped. Durante la angiogénesis fisiológicamente normal, las interacciones autocrinas, paracrinas y anficrinas del endotelio vascular con sus componentes estromales circundantes están estrechamente reguladas tanto espacial como temporalmente. Además, los niveles y las actividades de citocinas proangiogénicas y angiostáticas y factores de crecimiento se mantienen en equilibrio. En cambio, la angiogénesis patológica necesaria para el crecimiento tumoral activo es sostenida y persistente, representando una desregulación del sistema angiogénico normal. Los tipos de tumores sólidos y hematopoyéticos están asociados particularmente con un alto nivel de angiogénesis anómala.

Generalmente se piensa que el desarrollo del tumor consiste en etapas secuenciales e interrelacionadas que conducen a la generación de un clon autónomo con potencial de crecimiento agresivo. Estas etapas incluyen crecimiento sostenido y autorrenovación ilimitada. Las poblaciones celulares en un tumor se caracterizan generalmente por la autosuficiencia en señales de crecimiento, sensibilidad reducida a señales supresoras del crecimiento y resistencia a la apoptosis. Eventos genéticos o citogenéticos que inician el crecimiento aberrante mantienen a las células en un estado “listo” prolongado impidiendo la apoptosis.

Un objetivo de la presente divulgación es proporcionar agentes y tratamientos terapéuticos para inhibir la angiogénesis y el crecimiento tumoral.

Sumario de la invención

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido soluble aislado que comprende un dominio extracelular de una proteína EphB4 fusionado a una proteína albúmina o fragmento de la misma, en el que el polipéptido es un monómero, se une específicamente a un polipéptido de efrina B2, tiene una semivida sérica in vivo aumentada en comparación con la del dominio extracelular sin modificar de EphB4, e inhibe la señalización que resulta de la interacción entre EphB4 y efrina B2.

En el presente documento se dan a conocer agentes polipeptídicos que inhiben funciones mediadas por EphB4 o efrina B2, incluyendo partes de unión a ligando monomérico de las proteínas EphB4 y efrina B2. Tal como se demuestra en el presente documento, EphB4 y efrina B2 participan en diversos estados patológicos, incluyendo cánceres y enfermedades relacionadas con angiogénesis no deseada o excesiva. Por consiguiente, determinados agentes polipeptídicos dados a conocer en el presente documento pueden usarse para tratar tales enfermedades. La divulgación se refiere al descubrimiento de que EphB4 y/o efrina B2 se expresan, con frecuencia a altos niveles, en una variedad de tumores. Por tanto, agentes polipeptídicos que regulan por disminución la función de EphB4 o efrina B2 pueden afectar a los tumores mediante un efecto directo sobre las células tumorales así como un efecto indirecto sobre los procesos angiogénicos reclutados por el tumor. La divulgación proporciona la identidad de tipos tumorales particularmente adecuados para el tratamiento con un agente que regula por disminución la función de EphB4 o efrina B2. Los polipéptidos según la invención se modifican para tener una semivida sérica in vivo aumentada.

En la presente invención los polipéptidos de EphB4 solubles comprenden una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular de una proteína EphB4. Los polipéptidos de EphB4 solubles se unen específicamente a un polipéptido de efrina B2. El término “soluble” se usa simplemente para indicar que esos polipéptidos no contienen un dominio transmembrana o una parte de un dominio transmembrana suficiente como para comprometer la solubilidad del polipéptido en una solución salina fisiológica. Según la invención, los polipéptidos solubles se preparan como monómeros que compiten con EphB4 por la unión a ligandos tales como efrina B2 e inhiben la señalización que resulta de la activación de EphB4. En determinadas realizaciones el polipéptido de EphB4 soluble comprende un dominio globular de una proteína EphB4. Un polipéptido de EphB4 soluble puede comprender una secuencia idéntica en al menos el 90% a los residuos 1-522 de la secuencia de aminoácidos definida por la figura 65 (SEQ ID NO: 10). Un polipéptido de EphB4 soluble puede comprender una secuencia idéntica en al menos el 90% a los residuos 1-412 de la secuencia de aminoácidos definida por la figura 65 (SEQ ID NO: 10). Un polipéptido de EphB4 soluble puede comprender una secuencia idéntica en al menos el 90% a los residuos 1-312 de la secuencia de aminoácidos definida por la figura 65 (SEQ ID NO: 10). Un polipéptido de EphB4 soluble puede comprender una secuencia que abarca el dominio globular (G) (aminoácidos 29-197 de la figura 65, SEQ ID NO: 10), y opcionalmente dominios adicionales, tales como el dominio rico en cisteína (aminoácidos 239-321 de la figura 65, SEQ ID NO: 10), el primer dominio de fibronectina tipo 3 (aminoácidos 324-429 de la figura 65, SEQ ID NO: 10) y el segundo dominio de fibronectina tipo 3 (aminoácidos 434-526 de la figura 65, SEQ ID NO: 10). Los polipéptidos preferidos descritos en el presente documento y que se demuestra que tienen actividad de unión a ligando incluyen polipéptidos que corresponden a 1-537, 1-427 y 1-326, respectivamente, de la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 65 (SEQ ID NO: 10). Un polipéptido de EphB4 soluble puede comprender una secuencia tal como se

expone en la figura 1 ó 2 (SEQ ID NO: 1 ó 2). Tal como se conoce bien en la técnica, la expresión de tales polipéptidos de EphB4 en una célula adecuada, tal como línea celular HEK293T, dará como resultado la escisión de un péptido líder. Aunque tal escisión no siempre es completa o perfectamente sistemática en un único sitio, se sabe que EphB4 tiende a escindirse de manera que se retiran los primeros 15 aminoácidos de la secuencia mostrada en la figura 65 (SEQ ID NO: 10). Por consiguiente, como ejemplos específicos, la divulgación proporciona polipéptidos de EphB4 solubles sin procesar que se unen a efrina B2 y comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del siguiente grupo (la numeración es con respecto a la secuencia de la figura 65, SEQ ID NO: 10): 1-197, 29-197, 1312, 29-132, 1-321, 29-321, 1-326, 29-326, 1-412, 29-412, 1-427, 29-427, 1-429, 29-429, 1-526, 29-526, 1-537 y 29

537. Adicionalmente, las secuencias líder endógenas pueden sustituirse por péptidos líder heterólogos. Los polipéptidos pueden usarse en una forma procesada, teniendo tales formas una secuencia de aminoácidos predicha seleccionada del siguiente grupo (la numeración es con respecto a la secuencia de la figura 65, SEQ ID NO: 10): 16197, 16-312, 16-321, 16-326, 16-412, 16-427, 16-429, 16-526 y 16-537. Adicionalmente, un polipéptido de EphB4 soluble puede ser uno que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 90%, y opcionalmente el 95% o el 99%, a cualquiera de las secuencias de aminoácidos anteriores al tiempo que conserva actividad de unión a efrina B2. Preferiblemente, cualquier variación en la secuencia de aminoácidos con respecto a la secuencia mostrada en la figura 65 (SEQ ID NO: 10) son cambios o deleciones conservativos de no más de 1, 2, 3, 4 ó 5 aminoácidos, particularmente en una región de bucle de superficie. En la presente invención, el polipéptido de EphB4 soluble inhibe la señalización que resulta de la interacción entre efrina B2 y EphB4. El polipéptido de EphB4 soluble puede inhibir la agrupación o fosforilación de efrina B2 o EphB4. Generalmente se considera que la fosforilación de efrina B2 o EphB4 es uno de los eventos iniciales en la activación de rutas de señalización intracelulares reguladas por estas proteínas. Tal como se indicó anteriormente, el polipéptido de EphB4 soluble es una proteína de fusión monomérica. El polipéptido soluble puede incluir uno o más aminoácidos modificados. Tales aminoácidos pueden contribuir a propiedades deseables, tales como resistencia aumentada a la digestión por proteasa.

La presente invención proporciona polipéptidos de EphB4 solubles que tienen un componente adicional que confiere semivida sérica aumentada al tiempo que todavía conserva actividad de unión a efrina B2, siendo el componente adicional una proteína albúmina o un fragmento de la misma.

En determinadas realizaciones, un polipéptido de EphB4 soluble está asociado de manera estable con una proteína albúmina o un fragmento de la misma que confiere semivida mejorada sin disminuir sustancialmente la unión a efrina B2. Una proteína o fragmento de la misma de este tipo será preferiblemente inmunocompatible con pacientes humanos (o pacientes animales, cuando se contemplen usos veterinarios) y tendrá poca o ninguna actividad biológica significativa.

En una realización preferida, la proteína albúmina es una albúmina sérica humana, o una parte de la misma. Una albúmina sérica humana puede estar asociada de manera estable con el polipéptido de EphB4 de manera covalente

o no covalente. La unión covalente puede lograrse mediante expresión del polipéptido de EphB4 como fusión cotraduccional con albúmina sérica humana. La secuencia de albúmina puede fusionarse en el extremo N-terminal, el extremo C-terminal o en una posición interna que no provoca alteraciones en el polipéptido de EphB4 soluble. Los bucles expuestos de EphB4 serán posiciones apropiadas para la inserción de una secuencia de albúmina. La albúmina también puede unirse de manera postraduccional al polipéptido de EphB4, por ejemplo, mediante reticulación química. Un polipéptido de EphB4 también puede asociarse de manera estable con más de un polipéptido de albúmina. En algunas realizaciones, la albúmina se selecciona del grupo que consiste en una albúmina sérica humana (HSA) y albúmina sérica bovina (BSA). En otras realizaciones, la albúmina es una variante que se produce de manera natural. En una realización preferida, la fusión EphB4-HSA inhibe la interacción entre efrina B2 y EphB4, la agrupación de efrina B2 o EphB4, la fosforilación de efrina B2 o EphB4, o combinaciones de las mismas. En otras realizaciones, la fusión EphB4-HSA tiene una estabilidad in vivo potenciada con respecto al polipéptido de tipo natural sin modificar.

En el presente documento se dan a conocer polipéptidos de efrina B2 solubles que comprenden una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular de una proteína efrina B2. Los polipéptidos de efrina B2 solubles se unen específicamente a un polipéptido de EphB4. El término “soluble” se usa simplemente para indicar que esos polipéptidos no contienen un dominio transmembrana o una parte de un dominio transmembrana suficiente como para comprometer la solubilidad del polipéptido en una solución salina fisiológica. Los polipéptidos solubles se preparan preferiblemente como monómeros que compiten con efrina B2 por la unión a ligando tal como EphB4 e inhiben la señalización que resulta de la activación de efrina B2. Opcionalmente, un polipéptido soluble puede prepararse en una forma multimérica, por ejemplo, mediante expresión como proteína de fusión con Fc o fusión con otro dominio de multimerización. Tales formas multiméricas pueden tener actividades complejas, que tienen efectos agonistas o antagonistas dependiendo del contexto. Un polipéptido de efrina B2 soluble puede comprender los residuos 1-225 de la secuencia de aminoácidos definida por la figura 66 (SEQ ID NO: 11). Un polipéptido de efrina B2 soluble puede comprender una secuencia definida por la figura 3. Tal como se conoce bien en la técnica, la expresión de tales polipéptidos de efrina B2 en una célula adecuada, tal como línea celular HEK293T, dará como resultado la escisión de un péptido líder. Aunque tal escisión no siempre es completa o perfectamente sistemática en un único sitio, se sabe que la efrina B2 tiende a escindirse de manera que se retiran los primeros 26 aminoácidos de la secuencia mostrada en la figura 66 (SEQ ID NO: 11). Por consiguiente, como ejemplos específicos, la divulgación

proporciona polipéptidos de efrina B2 solubles sin procesar que se unen a EphB4 y comprenden una secuencia de aminoácidos que corresponde a los aminoácidos 1-225 de la figura 66 (SEQ ID NO: 11). Tales polipéptidos pueden usarse en una forma sin procesar, teniendo tales formas una secuencia de aminoácidos predicha seleccionada del siguiente grupo (la numeración es con respecto a la secuencia de la figura 66, SEQ ID NO: 11): 26-225. El polipéptido de efrina B2 soluble puede inhibir la interacción entre efrina B2 y EphB4. El polipéptido de efrina B2 soluble puede inhibir la agrupación o fosforilación de efrina B2 o EphB4. Tal como se indicó anteriormente, el polipéptido de efrina B2 soluble puede prepararse como proteína de fusión monomérica o multimérica. El polipéptido soluble puede incluir uno o más aminoácidos modificados. Tales aminoácidos pueden contribuir a propiedades deseables, tales como resistencia aumentada a la digestión por proteasa.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica o cosmética que comprende un polipéptido de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Las formulaciones adicionales incluyen kits de diagnóstico.

En aspectos adicionales, la presente invención proporciona el polipéptido de la invención para su uso en (a) la reducción de la tasa de crecimiento de un tumor en un paciente, (b) el tratamiento de cáncer en un paciente, o (c) el tratamiento de un paciente que padece una enfermedad asociada con la angiogénesis seleccionada de cáncer dependiente de angiogénesis, tumores benignos, trastornos inflamatorios, reumatismo articular crónico, enfermedades angiogénicas oculares, síndrome de Osler-Webber, angiogénesis en el miocardio, neovascularización de placas, telangiectasia, articulaciones hemofílicas, angiofibroma, psoriasis, esclerodermia, granuloma piogénico, rubeosis, artritis y neovascularización diabética, así como el uso de un polipéptido de la invención para preparar un medicamento para su uso en (a) la reducción de la tasa de crecimiento de un tumor en un paciente, (b) el tratamiento de cáncer en un paciente, o (c) el tratamiento un paciente que padece una enfermedad asociada con la angiogénesis seleccionada de cáncer dependiente de angiogénesis, tumores benignos, trastornos inflamatorios, reumatismo articular crónico, enfermedades angiogénicas oculares, síndrome de Osler-Webber, angiogénesis en el miocardio, neovascularización de placas, telangiectasia, articulaciones hemofílicas, angiofibroma, psoriasis, esclerodermia, granuloma piogénico, rubeosis, artritis y neovascularización diabética.

Opcionalmente, el cáncer comprende células cancerosas que expresan efrina B2 y/o EphB4 a un nivel superior al de células no cancerosas de un tejido comparable. El cáncer puede ser un cáncer metastásico. El cáncer puede seleccionarse del grupo que consiste en carcinoma de colon, tumor de mama, mesotelioma, tumor de próstata, carcinoma de células escamosas, sarcoma de Kaposi y leucemia. Opcionalmente, el cáncer es un cáncer dependiente de angiogénesis o un cáncer independiente de angiogénesis.

En el presente documento se dan a conocer métodos de inhibición de la señalización a través de la ruta de efrina B2/EphB4 en una célula. Un método puede comprender poner en contacto la célula con una cantidad eficaz de un agente polipeptídico, tal como (a) un polipéptido soluble que comprende una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular de una proteína EphB4, en el que el polipéptido de EphB4 es un monómero y se une específicamente a un polipéptido de efrina B2; (b) un polipéptido soluble que comprende una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular de una proteína efrina B2, en el que el polipéptido de efrina B2 soluble es un monómero y se une con alta afinidad a un polipéptido de EphB4.

También se dan a conocer métodos para reducir la tasa de crecimiento de un tumor, que comprenden administrar una cantidad de un agente polipeptídico suficiente para reducir la tasa de crecimiento del tumor. El agente polipeptídico puede seleccionarse del grupo que consiste en: (a) un polipéptido soluble que comprende una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular de una proteína EphB4, en el que el polipéptido de EphB4 es un monómero y se une específicamente a un polipéptido de efrina B2, y opcionalmente comprende una modificación adicional para aumentar la semivida sérica, tal como una pegilación o albúmina sérica o ambas; (b) un polipéptido soluble que comprende una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular de una proteína efrina B2, en el que el polipéptido de efrina B2 soluble es un monómero y se une con alta afinidad a un polipéptido de EphB4. Opcionalmente, el tumor comprende células que expresan un nivel superior de EphB4 y/o efrina B2 al de células no cancerosas de un tejido comparable.

También se dan a conocer métodos para tratar a un paciente que padece un cáncer. Un método puede comprender administrar al paciente un agente polipeptídico. El agente polipeptídico puede seleccionarse del grupo que consiste en: (a) un polipéptido soluble que comprende una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular de una proteína EphB4, en el que el polipéptido de EphB4 es un monómero y se une específicamente a un polipéptido de efrina B2, y opcionalmente comprende una modificación adicional para aumentar la semivida sérica, tal como una pegilación o albúmina sérica o ambas; (b) un polipéptido soluble que comprende una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular de una proteína efrina B2, en el que el polipéptido de efrina B2 soluble es un monómero y se une con alta afinidad a un polipéptido de EphB4. El agente polipeptídico empleado puede inhibir la agrupación o fosforilación de efrina B2 o EphB4. Un agente polipeptídico puede administrarse conjuntamente con uno o más agentes quimioterápicos anticancerosos adicionales que inhiben células cancerosas de una manera aditiva o sinérgica con el agente polipeptídico.

También se dan a conocer métodos de inhibición de la angiogénesis. Un método puede comprender poner en contacto una célula con una cantidad de un agente polipeptídico suficiente para inhibir la angiogénesis. El agente polipeptídico puede seleccionarse del grupo que consiste en: (a) un polipéptido soluble que comprende una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular de una proteína EphB4, en el que el polipéptido de EphB4 es un monómero y se une específicamente a un polipéptido de efrina B2, y opcionalmente comprende una modificación adicional para aumentar la semivida sérica, tal como una pegilación o albúmina sérica o ambas; (b) un polipéptido soluble que comprende una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular de una proteína efrina B2, en el que el polipéptido de efrina B2 soluble es un monómero y se une con alta afinidad a un polipéptido de EphB4.

También se dan a conocer métodos para tratar a un paciente que padece una enfermedad asociada con la angiogénesis, que comprenden administrar al paciente un agente polipeptídico. El agente polipeptídico puede seleccionarse del grupo que consiste en: (a) un polipéptido soluble que comprende una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular de una proteína EphB4, en el que el polipéptido de EphB4 es un monómero y se une específicamente a un polipéptido de efrina B2, y opcionalmente comprende una modificación adicional para aumentar la semivida sérica, tal como una pegilación o albúmina sérica o ambas; (b) un polipéptido soluble que comprende una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular de una proteína efrina B2, en el que el polipéptido de efrina B2 soluble es un monómero y se une con alta afinidad a un polipéptido de EphB4. El polipéptido soluble puede formularse con un portador farmacéuticamente aceptable. Una enfermedad relacionada con la angiogénesis o un proceso relacionado con la angiogénesis no deseada puede seleccionarse del grupo que consiste en cáncer dependiente de angiogénesis, tumores benignos, trastornos inflamatorios, reumatismo articular crónico y psoriasis, enfermedades angiogénicas oculares, síndrome de Osler-Webber, angiogénesis en el miocardio, neovascularización de placas, telangiectasia, articulaciones hemofílicas, angiofibroma, telangiectasia, psoriasis, esclerodermia, granuloma piogénico, rubeosis, artritis, neovascularización diabética, vasculogénesis. Un agente polipeptídico puede administrarse conjuntamente con al menos un agente anti-angiogénesis adicional que inhibe la angiogénesis de manera aditiva o sinérgica con el polipéptido soluble.

También se dan a conocer métodos para tratar a un paciente que padece un cáncer, que comprenden: (a) identificar en el paciente un tumor que tiene una pluralidad de células cancerosas que expresan EphB4 y/o efrina B2; y (b) administrar al paciente un agente polipeptídico. El agente polipeptídico puede seleccionarse del grupo que consiste en: (i) un polipéptido soluble que comprende una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular de una proteína EphB4, en el que el polipéptido de EphB4 es un monómero y se une específicamente a un polipéptido de efrina B2, y opcionalmente comprende una modificación adicional para aumentar la semivida sérica, tal como una pegilación o albúmina sérica o ambas; (ii) un polipéptido soluble que comprende una secuencia de aminoácidos de un dominio extracelular de una proteína efrina B2, en el que el polipéptido de efrina B2 soluble es un monómero y se une con alta afinidad a un polipéptido de EphB4.

También se dan a conocer métodos para identificar un tumor que es adecuado para el tratamiento con un antagonista de efrina B2 o EphB4. Un método puede comprender detectar en la célula tumoral una o más de las siguientes características: (a) expresión de proteína EphB4 y/o ARNm; (b) expresión de proteína efrina B2 y/o ARNm; (c) amplificación génica (por ejemplo, número de copias de genes aumentado) del gen de EphB4; o (d) amplificación génica del gen de efrina B2. Una célula tumoral que tiene una o más de las características (a)-(d) puede ser adecuada para el tratamiento con un antagonista de efrina B2 o EphB4, tal como un agente polipeptídico descrito en el presente documento.

De manera sorprendente, los solicitantes han encontrado que un polipéptido de EphB4 que carece del dominio globular puede de hecho inhibir el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto, inhibir la formación de tubos angiogénicos de células endoteliales vasculares e inhibir la actividad autocinasa de EphB4 activada por efrina B2. Sin desear limitarse a ningún mecanismo de acción, se espera que el polipéptido o bien impida al agregación de EphB4 o bien estimule la eliminación (por ejemplo mediante endocitosis) de EphB4 de la membrana plasmática. Por consiguiente, la divulgación proporciona polipéptidos solubles aislados que comprenden una secuencia de aminoácidos de un dominio de fibronectina tipo 3 de una proteína EphB4. Tales polipéptidos tendrán preferiblemente un efecto biológico, tal como inhibición de una actividad (por ejemplo actividad de agregación o cinasa) de una proteína EphB4 o efrina B2, y particularmente la inhibición del crecimiento tumoral en un ser humano o en un modelo de cáncer de xenoinjerto de ratón. Tales polipéptidos también pueden inhibir la angiogénesis in vivo o en un sistema de ensayo basado en células. Tales polipéptidos pueden no unirse a efrina B2 y pueden excluir específicamente la totalidad o las partes funcionales (por ejemplo, de unión a efrina B2) del dominio globular de una proteína EphB4. Un polipéptido de este tipo comprenderá preferiblemente aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 324-429 y/o 434-526 de la secuencia de la figura 65 (SEQ ID NO: 10), o secuencias idénticas en al menos el 90%, 95%, 98%, 99% a la misma. En SEQ ID NO: 15 se muestra un ejemplo de un polipéptido de este tipo. Un polipéptido de este tipo puede modificarse de cualquiera de las maneras descritas en el presente documento, y puede producirse como monómero o como dímero o multímero que comprende dos o más de tales polipéptidos, tales como un constructo de fusión con Fc. Los dímeros o multímeros pueden ser deseables para potenciar la eficacia de tales polipéptidos. Todos los métodos para producir y usar tales polipéptidos son similares a los descritos en el presente documento con respecto a otros polipéptidos de EphB4.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína B4ECv3 (se muestra la secuencia predicha del precursor incluyendo el péptido líder de Eph B4 sin escindir; SEQ ID NO: 1).

La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína B4ECv3NT (se muestra la secuencia predicha del precursor incluyendo el péptido líder de Eph B4 sin escindir; SEQ ID NO: 2).

La figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína B2EC (se muestra la secuencia predicha del precursor incluyendo el péptido líder de efrina B2 sin escindir; SEQ ID NO: 3).

La figura 4 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína B4ECv3-FC (se muestra la secuencia predicha del precursor incluyendo el péptido líder de Eph B4 sin escindir; SEQ ID NO: 4).

La figura 5 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína B2EC-FC (se muestra la secuencia predicha del precursor incluyendo el péptido líder de efrina B2 sin escindir; SEQ ID NO: 5).

La figura 6 muestra el ensayo de unión de B4EC-FC (basado en proteína A-agarosa).

La figura 7 muestra el ensayo de inhibición de B4EC-FC (inhibición en disolución).

La figura 8 muestra el ensayo de unión de B2EC-FC (ensayo basado en proteína A-agarosa).

La figura 9 muestra la quimiotaxis de HUAEC en respuesta a B4Ecv3.

La figura 10 muestra la quimiotaxis de HHEC en respuesta a B2EC-FC.

La figura 11 muestra la quimiotaxis de HHAEC en respuesta a B2EC.

La figura 12 muestra el efecto de B4Ecv3 sobre la formación de túbulos de HUAEC.

La figura 13 muestra el efecto de B2EC-FC sobre la formación de túbulos de HUAEC.

La figura 14 es una representación esquemática de constructos de efrina B2 humana.

La figura 15 es una representación esquemática de constructos de EphB4 humana.

La figura 16 muestra la estructura de dominios de las proteínas EphB4EC solubles recombinantes. La designación de los dominios es la siguiente: L - péptido líder, G - globular (dominio de unión a ligando), C – dominio rico en Cys, F1, F2 – repeticiones de fibronectina tipo III, H – cola de 6 x His.

La figura 17 muestra la purificación y propiedades de unión a ligando de las proteínas EphB4EC. A. electroforesis en gel de SDS-PAAG de proteínas solubles recombinantes derivadas de EphB4 purificadas (con tinción con Coomassie). B. Unión de fusión efrina B2-AP a proteínas recombinantes derivadas de EphB4 inmovilizadas sobre perlas de Ni-NTA-agarosa. Se muestran los resultados de tres experimentos independientes para cada proteína. Eje vertical – densidad óptica a 420 nm.

La figura 18 muestra que EphB4v3 inhibe la quimiotaxis.

La figura 19 muestra que EphB4v3 inhibe la formación de túbulos en Matrigel. A presenta visualmente la fuerte inhibición de la formación de túbulos mediante B4v3 en un experimento representativo. B muestra una cuantificación de la reducción de la longitud de tubo obtenida con B4v3 a concentraciones crecientes así como una reducción del número de uniones, en comparación con células sin proteína. Se presentan visualmente los resultados como valores medios ± D.E. obtenidos a partir de tres experimentos independientes realizados con pocillos por duplicado.

La figura 20 muestra que EphB4 soluble no tiene ningún efecto citotóxico detectable según se evalúa mediante ensayo de MTS.

La figura 21 muestra que B4v3 inhibe la invasión y formación de túbulos por células endoteliales en el ensayo de Matrigel. (A) Para detectar las células invasoras totales, fotografiadas a 20 aumentos o con tinción tricrómica de Masson, la parte superior izquierda de A B presenta visualmente la sección de un tapón de Matrigel sin GF, la parte superior derecha de A presenta visualmente la sección con B4IgG que contiene GF y la sección inferior izquierda contiene GF, y la parte inferior derecha muestra GF en presencia de B4v3. Sólo se observa invasión significativa de células endoteliales en Matrigel que contiene GF. La parte superior derecha presenta visualmente una zona con un alto número de células invadidas inducidas por B4IgG, lo cual significa la forma dimérica de B4v3. Las partes

superiores izquierdas de las imágenes corresponden a las capas de células formadas alrededor del tapón de Matrigel a partir del cual las células invaden hacia el centro del tapón situado en la dirección de la esquina inferior derecha. Se cuantificaron las células totales en las secciones de los tapones de Matrigel con software Scion Image. Se presentan visualmente los resultados obtenidos de dos experimentos con tapones por duplicado como valores medios ± D.E.

La figura 22 muestra la fosforilación de tirosina de receptor EphB4 en células PC3 en respuesta a la estimulación con fusión de efrina B2-Fc en presencia o ausencia de proteínas solubles recombinantes derivadas de EphB4.

La figura 23 muestra los efectos de EphB4ECD soluble sobre la viabilidad y el ciclo celular. A) Ensayo de viabilidad celular de 3 días de dos líneas celulares de HNSCC. B) Análisis mediante FACS del ciclo celular en células HNSCC15 tratadas como en A. El tratamiento de estas células dio como resultado la acumulación en fases subG0/G1 y S/G2 tal como se indica por las flechas.

La figura 24 muestra que B4v3 inhibe la respuesta endovascular en un ensayo de microbolsa de córnea murina con Hydron.

La figura 25 muestra que la inyección conjunta de sB4v3 en presencia de Matrigel y factores de crecimiento en SCC15, B16 y MCF-7, inhibe el crecimiento tumoral in vivo de estas células.

La figura 26 muestra que EphB4 soluble provoca apoptosis, necrosis y angiogénesis reducida en tres tipos tumorales, B16 (melanoma), SCC15 (carcinoma de cabeza de cuello) y MCF-7 (carcinoma de mama). En los tumores se inyectaron de manera premezclada Matrigel más factores de crecimiento y EphB4 soluble por vía subcutánea. Tras de 10 a 14 días, a los ratones se les inyectó por vía intravenosa FITC-lectina (verde) para evaluar la perfusión de vasos sanguíneos. Los tumores tratados con PBS de control presentaron visualmente densidad tumoral abundante y una respuesta angiogénica robusta. Los tumores tratados con sEphB4 presentaron visualmente una reducción de la densidad de células tumorales y una marcada inhibición de la angiogénesis tumoral en regiones con células tumorales viables, así como apoptosis y necrosis tumoral.

La figura 27 muestra la expresión de EphB4 en líneas celulares de próstata. A) Inmunotransferencia de tipo Western de lisados de células totales de diversas líneas celulares de cáncer de próstata, línea celular derivada de glándula de próstata normal (MLC) y células de linfoma mieloblástico agudo (AML) analizadas con sonda con anticuerpo monoclonal contra EphB4. B) Fosforilación de EphB4 en células PC-3 determinada mediante inmunotransferencia de tipo Western.

La figura 28 muestra la expresión de EphB4 en tejido de cáncer de próstata. Sección congelada de cáncer de próstata representativa teñida con anticuerpo monoclonal contra EphB4 (parte superior izquierda) o control específico del isotipo (parte inferior izquierda). Tejido de BPH adyacente teñido con anticuerpo monoclonal contra EphB4 (parte superior derecha). La señal positiva es de color marrón en las células tumorales. El estroma y los epitelios normales son negativos. Obsérvese la localización en la membrana de la tinción en el tejido tumoral, lo cual concuerda con la localización transmembrana de EphB4. QRT-PCR representativa de ARN extraído de muestras de cáncer y tejidos de BPH adyacentes (parte inferior derecha).

La figura 29 muestra la regulación por disminución de EphB4 en células de cáncer de próstata mediante supresores tumorales y expresión de RXR. A) Se transfectaron conjuntamente células PC3 con CD4 truncado y p53 o PTEN o sólo vector. 24 h después se recogieron las células clasificadas por CD4, se lisaron y se analizaron secuencialmente mediante inmunotransferencia de tipo Western para determinar la expresión de EphB4 y -actina, como proteína normalizadora. B) Inmunotransferencia de tipo Western como en (A) de diversas líneas celulares estables. LNCaP-FGF es un clon de transfección estable de FGF-8, mientras que CWR22R-RXR expresa de manera estable el receptor RXR. Se estableció BPH-1 a partir del epitelio prostático hipertrófico benigno.

La figura 30 muestra la regulación de EphB4 en células de cáncer de próstata mediante EGFR e IGFR-1. A) Inmunotransferencia de tipo Western de células PC3 tratadas con o sin inhibidor específico de EGFR, AG1478 (1 nM) durante 36 horas. Se observa una señal de EphB4 reducida tras el tratamiento con AG 1478. Se separó la membrana y volvió a analizarse con sonda con -actina, lo cual no se vio afectado. B) Inmunotransferencia de tipo Western de muestras por triplicado de células PC3 tratadas con o sin anticuerpo neutralizante específico de IGFR-1, MAB391 (2 g/ml; durante la noche). Se analizó con sonda secuencialmente la membrana con anticuerpos contra EphB4, IGFR-1 y -actina. La señal de IGFR-1 muestra la represión esperada de la señal con el tratamiento con MAB391.

La figura 31 muestra el efecto de ARNip y ODN-AS frente a EphB4 específicos sobre la expresión y las funciones de célula de próstata. A) Se usaron células 293 que expresaban de manera estable constructo de longitud completa de EphB4 para evaluar la capacidad de ARNip 472 para inhibir la expresión de EphB4. Se transfectaron las células con iARN 50 nM usando Lipofectamine 2000. Inmunotransferencia de tipo Western de lisados celulares 40 h tras la transfección con ARNip de control (proteína fluorescente verde; ARNip frente a GFP) o ARNip 472 de EphB4, analizados con sonda con anticuerpo monoclonal contra EphB4, separados y analizados con sonda de nuevo con

anticuerpo monoclonal contra -actina. B) Efecto de AS-10 frente a EphB4 sobre la expresión en 293 que expresan de manera transitoria EphB4 de longitud completa. Se expusieron las células a AS-10 o a ODN sentido durante 6 horas y se analizaron mediante inmunotransferencia de tipo Western tal como en (A). C) Ensayo de viabilidad de 48 h de células PC3 tratadas con ARNip tal como se describe en la sección de métodos. Se muestra la media ± e.e.m. de muestras por triplicado. D) Ensayo de viabilidad de 5 días de células PC3 tratadas con ODN tal como se describe en los métodos. Se muestra la media ± e.e.m. de muestras por triplicado. E) Ensayo de raspado de migración de células PC3 en presencia de ARNip 50 nM transfectadas como en (A). Se muestran fotomicrografías de campos 20x representativos tomados inmediatamente después de realizar el raspado en la monocapa (0 h) y tras 20 h de cultivo continuado. Un gran número de células había llenado el raspado tras 20 h con ARNip de control, pero ninguna con ARNip 472 de EphB4. F) Se muestra un ensayo similar para células tratadas con AS-10 u ODN sentido (ambos a 10 M). G) Ensayo de invasión de Matrigel de células PC3 transfectadas con ARNip o ARNip de control tal como se describe en los métodos. Se fijaron las células que migraban al lado inferior de la pieza de inserción recubierta con Matrigel en respuesta a fibronectina 5 mg/ml en la cámara inferior y se tiñeron con Giemsa. Se muestran fotomicrografías representativas de células tratadas con ARNip de control y ARNip 472. Se contaron los números de células en 5 campos de alta potencia individuales y en el gráfico (parte inferior derecha) se muestra el promedio ±

e.e.m.

La figura 32 muestra el efecto de ARNip 472 de EphB4 sobre la apoptosis y el ciclo celular. A) Se analizaron células PC3 transfectadas con ARNip tal como se indica 24 h tras la transfección para determinar el estado del ciclo celular mediante citometría de flujo tal como se describe en los métodos. Se muestran las representaciones gráficas del número de células frente a la intensidad de fluorescencia de yoduro de propidio. El 7,9% de la población celular es apoptótica (en el pico sub G0) cuando se tratan con ARNip 472 en comparación con el 1% con ARNip de control. B) Apoptosis de células PC3 detectada mediante kit ELISAplus de detección de muerte celular tal como se describe en los métodos. La absorbancia a 405 nm aumenta en proporción a la cantidad de histona y ADN-POD en la fracción celular libre de núcleos. Se muestra la media ± e.e.m. de muestras por triplicado a las concentraciones indicadas de ARNip 472 y ARNip frente a GFP (control).

La figura 33 muestra que EphB4 y efrina B2 se expresan en líneas celulares de mesotelioma tal como se muestra mediante RT-PCR (A) e inmunotransferencia de tipo Western (B).

La figura 34 muestra la expresión de efrina B2 y EphB4 mediante hibridación in situ en células de mesotelioma. Se cultivaron líneas celulares de mesotelioma NCI H28 en portaobjetos con cámaras hibridadas con sonda antisentido frente a efrina B2 o EphB4 (fila superior). El control para cada hibridación fue sentido (fila inferior). La reacción positiva es una tinción citoplasmática de color azul oscuro.

La figura 35 muestra la expresión celular de EphB4 y efrina B2 en cultivos de mesotelioma. Tinción por inmunofluorescencia de aislado celular primario derivado de efusión pleural de un paciente con mesotelioma maligno y líneas celulares NCI H28, NCI H2373 y NCI H2052 para detectar efrina B2 y EphB4. El color verde es una señal positiva para anticuerpo secundario marcado con FITC. Se demostró la especificidad de la tinción por inmunofluorescencia mediante ausencia de señal sin anticuerpo primario (primera fila). Se contratiñeron los núcleos celulares con DAPI (color azul) para revelar la ubicación de todas las células. Se muestran imágenes fusionadas de fluorescencia de DAPI y FITC. Aumento original de 200.

La figura 36 muestra la expresión de efrina B2 y EphB4 en tumor de mesotelioma. Inmunohistoquímica de biopsia de mesotelioma maligno. La sección teñida con H&E revela la arquitectura tumoral; el panel inferior izquierdo es el control de fondo sin anticuerpo primario. La tinción específica de EphB4 y efrina B2 es de color marrón. Aumento original de 200.

La figura 37 muestra los efectos de sondas antisentido frente a EPHB4 (A) y ARNip frente a EPHB4 (B) sobre el crecimiento de células H28.

La figura 38 muestra los efectos de sondas antisentido frente a EPHB4 (A) y ARNip frente a EPHB4 (B) sobre la migración celular.

La figura 39 muestra que EphB4 se expresa en metástasis y tejidos primarios de HNSCC. A) Parte superior: inmunohistoquímica de una sección de archivo representativa teñida con anticuerpo monoclonal contra EphB4 tal como se describe en los métodos y visualizada con DAB (color marrón) localizado en células tumorales. Parte inferior: tinción con hematoxilina y eosina (H&E) de una sección adyacente. La tinción púrpura densa indica la presencia de células tumorales. La columna a la derecha son secciones congeladas de metástasis en ganglios linfáticos teñidas con anticuerpo policlonal contra EphB4 (parte superior derecha) y visualizadas con DAB. El control (parte central) fue la incubación con suero de cabra y H&E (parte inferior) revela la ubicación de los focos metastásicos rodeados por estroma que no se tiñe. B) La hibridación in situ de secciones congeladas en serie de un caso de HNSCC analizado con sonda con EphB4 (columna izquierda) y efrina B2 (columna derecha), sondas antisentido o sentido marcadas con DIG generadas mediante transcripción de separación (“run-off”). Se detectó la señal de hibridación (azul oscuro) usando anticuerpos anti-DIG conjugados con fosfatasa alcalina y se contratiñeron secciones con rojo rápido nuclear. Se muestra una sección en serie teñida con H&E (parte inferior izquierda) para

ilustrar la arquitectura tumoral. C) Inmunotransferencia de tipo Western de extracto de proteína de muestras de paciente que consisten en tumor (T), tejido normal no implicado (N) y biopsias de ganglios linfáticos (LN). Se fraccionaron las muestras mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en el 4-20% de geles de tris-glicina y posteriormente se sometieron a electrotransferencia sobre membranas de nailon. Se analizaron con sonda secuencialmente las membranas con anticuerpo monoclonal contra EphB4 y AcM contra -actina. Se detectó la señal quimioluminiscente sobre una película de autorradiografía. Se muestra la banda específica de EphB4 que migró a 120 kD y -actina que migró a 40 kD. Se usó la señal de -actina para el control para la carga y transferencia de cada muestra.

La figura 40 muestra que EphB4 se expresa en líneas celulares de HNSCC y se regula mediante EGF: A) Estudio de expresión de EphB4 en líneas celulares de SCC. Inmunotransferencia de tipo Western de lisados de células totales analizados con sonda secuencialmente con anticuerpo monoclonal contra EphB4, separados y analizados con sonda de nuevo con anticuerpo monoclonal contra -actina tal como se describió para la figura 39C. B) Efecto del inhibidor de EGFR específico, AG1478, sobre la expresión de EphB4: inmunotransferencia de tipo Western de lisados celulares en bruto de SCC15 tratadas con AG 1478 0-1000 nM durante 24 h en medios complementados con el 10% de FCS (parte izquierda) o con AG 1478 1 mM durante 4, 8, 12 ó 24 h (parte derecha). Se muestran membranas analizadas con sonda secuencialmente para detectar EphB4 y -actina. C) Efecto de la inhibición de la señalización de EGFR sobre la expresión de EphB4 en líneas celulares de SCC: Se trataron células, mantenidas en medios de crecimiento que contenían el 10% de FCS, durante 24 h con AG 1478 1 M, tras lo cual se analizaron lisados celulares en bruto mediante inmunotransferencias de tipo Western de lisados celulares analizados con sonda secuencialmente para detectar anticuerpos contra EGFR, EphB4, efrina B2 y -actina. Se detectó la señal específica para EGFR a 170 kD y efrina B2 a 37 kD además de EphB4 y -actina tal como se describió en la figura 1C. -actina sirve como control de carga y transferencia.

La figura 41 muestra el mecanismo de regulación de EphB4 mediante EGF: A) Esquema de las rutas de señalización de EGFR, que muestra en rojo los sitios de acción y nombres de inhibidores de cinasa específicos usados. B) Se privaron de suero células SCC15 durante 24 h antes de una incubación adicional de 24 tal como se indica con o sin EGF (10 ng/ml), U73122 3 M, o SH-5 5 M, SP600125 5 M, LY294002 25 nM, PD098095 -- M o SB203580 5 M. N/A indica cultivos que sólo recibieron un volumen igual de diluyente (DMSO). Se sometieron los lisados celulares a inmunotransferencia de tipo Western con anticuerpo monoclonal contra EphB4. La señal de actina sirve como control de carga y transferencia de proteína.

La figura 42 muestra que ARNip frente a EphB4 específicos inhiben la expresión de EphB4, la viabilidad celular y provocan la detención del ciclo celular. A) Se transfectaron células 293 que expresaban de manera estable EphB4 de longitud completa con iARN 50 nM usando LipofectamineTM2000. Se recogieron las células 40 h tras la transfección, se lisaron y se procesaron para la inmunotransferencia de tipo Western. Se analizaron con sonda las membranas con anticuerpo monoclonal contra EphB4, se separaron y volvieron a analizarse con sonda con anticuerpo monoclonal contra -actina como control para la carga y transferencia de proteína. El control de reactivo negativo fue iARN frente a secuencia de proteína fluorescente verde (GFP) desorganizada y el control es la transfección con LipofectamineTM2000 sola. B) Ensayos de viabilidad celular con MTT de líneas celulares de SCC tratadas con ARNip durante 48 h tal como se describe en la sección de métodos. Se muestra la media + e.e.m. de muestras por triplicado. C) Se analizaron células SCC 15 transfectadas con ARNip tal como se indica 24 h tras la transfección para determinar el estado del ciclo celular mediante citometría de flujo tal como se describe en los métodos. Se muestran las representaciones gráficas del número de células frente a la intensidad de fluorescencia de yoduro de propidio. Las filas superior y central muestran representaciones gráficas par a células 16 h tras la transfección con ARNip, la fila inferior muestra representaciones gráficas para células 36 h tras la transfección. Para cada representación gráfica se indican el ARNip específico y la concentración. Lipo = transfección simulada con LipofectamineTM200.

La figura 43 muestra los efectos in vitro de ODN-AS frente a EphB4 específicos sobre células SCC. A) Se trataron células 293, transfectadas de manera transitoria con plásmido de expresión de longitud completa de EphB4, 6 h tras la transfección con ODN antisentido tal como se indica. Se recogieron los lisados celulares 24 h tras el tratamiento con ODN-AS y se sometieron a inmunotransferencia de tipo Western. B) Se sembraron células SCC25 en placas de 48 pocillos a densidades iguales y se trataron con ODN-AS frente a EphB4 a 1, 5 y 10 M en los días 2 y 4. Se midió la viabilidad celular mediante ensayo con MTT en el día 5. Se muestra la media + e.e.m. de muestras por triplicado. Obsérvese que los ODN-AS que eran activos para inhibir los niveles de proteína EphB4 también eran inhibidores eficaces de la viabilidad celular de SCC15. C) Análisis del ciclo celular de células SCC15 tratadas durante 36 h con AS-10 (parte inferior) en comparación con células que no se trataron (parte superior). D) Cultivos confluentes de células SCC15 raspadas con una pipeta Pasteur de plástico para producir roturas de 3 mm de ancho en la monocapa. Se sometió a ensayo la capacidad de las células para migrar y cerrar la herida en presencia de ODN-AS frente a EphB4 inhibidor (AS-10) y ODN-AS no inhibidor (AS-1) tras 48 h. Se incluye ODN desorganizado como ODN de control negativo. El cultivo marcado “sin tratamiento” no se expuso a ODN. Al inicio del experimento, todos los cultivos mostraron raspados de igual ancho y similares al observado en AS-10 de EphB4 1 M tras 48 h. Los corchetes rojos indican el ancho del raspado original. E) Migración de células SCC15 en respuesta a EGF 20 mg/ml en un ensayo en dos cámaras tal como se describe en los métodos. Se muestran fotomicrografías representativas

de células no tratadas (NT), tratadas con AS-6 y con AS-10 y Taxol 10 ng/ml como control positivo de la inhibición de la migración. F) Se contaron los números de células en 5 campos de alta potencia individuales y en el gráfico se muestra el promedio + e.e.m.

La figura 44 muestra que ODN-AS frente a EphB4 inhibe el crecimiento tumoral in vivo. Curvas de crecimiento para xenoinjertos de tumor subcutáneos de SCC 15 en ratones desnudos Balb/C tratados con AS-10 frente a EphB4 u ODN desorganizado a 20 mg/kg/día comenzando el día siguiente a la implantación de 5 x 106 células. Los ratones control recibieron un volumen igual de diluyente (PBS). Se muestra la media + e.e.m. de 6 ratones/grupo. * P = 0,0001 mediante la prueba de la t de Student en comparación con el grupo tratado con ODN desorganizado.

La figura 45 muestra que efrina B2, pero no EphB4, se expresa en tejido de biopsia de KS. (A) Hibridación in situ con sondas antisentido para efrina B2 y EphB4 con sección teñida con H&E correspondiente para mostrar la arquitectura tumoral. El color azul oscuro en la ISH indica una reacción positiva para efrina B2. No se detectó ninguna señal para EphB4 en la biopsia de sarcoma de Kaposi. Como contraste, la señal de ISH para EphB4 es fuerte en células tumorales de carcinoma de células escamosas. También se detectó efrina B2 en KS usando proteína de fusión EphB4-AP (parte inferior izquierda). (B) Detección de efrina B2 con proteína de fusión EphB4/Fc. Se tiñeron secciones adyacentes con H&E (parte izquierda) para mostrar la arquitectura tumoral, el rectángulo negro indica la zona mostrada en la sección tratada con EphB4/Fc (parte central) detectada con anticuerpo anti-Fc humano marcado con FITC tal como se describe en la sección de métodos. Como control se trató una sección adyacente con fragmento Fc humano (parte derecha). La señal específica que surge de la unión de EphB4/Fc a la sección sólo se observa en zonas de células tumorales. (C) Expresión conjunta de efrina B2 y la proteína de latencia de HVH8, LANA1. La microscopía confocal de inmunofluorescencia de doble marcador con anticuerpos frente a efrina B2 (rojo) LANA1 (verde) o EphB4 (rojo) de material de biopsia de KS congelado demuestra directamente la expresión conjunta de LANA1 y efrina B2 en biopsia de KS. La expresión conjunta se observa como color amarillo. La imagen confocal de doble marcador de biopsia con anticuerpos frente a PECAM-1 (verde) en células con tinción con yoduro de propidio nuclear (rojo) demuestra la naturaleza vascular del tumor.

La figura 46 muestra que HVH-8 induce expresión de marcador arterial en células endoteliales venosas. (A) Inmunofluorescencia de cultivos de HUVEC y HUVEC/BC-1 para determinar marcadores de arterias/venas y proteínas virales. Se hicieron crecer cultivos en portaobjetos con cámaras y se procesaron para la detección de inmunofluorescencia de efrina B2 (a, e, i), EphB4 (m, q, u), CD148 (j, v) y las proteínas de HVH-8, LANA1 (b, f, m) o ORF59 (r), tal como se describe en los materiales y métodos. El color amarillo en las imágenes fusionadas del mismo campo demuestra la expresión conjunta de efrina B2 y LANA o efrina B2 y CD148. Las posiciones de células viables se revelaron mediante tinción nuclear con DAPI (azul) en la tercera columna (c, g, k, o, s, w). Las fotomicrografías son de campos representativos. (B) RT-PCR de HUVEC y dos cultivos infectados por HVH-8 (HUVEC/BC-1 y HUVEC/BC-3) para detectar efrina B2 y EphB4. Se observa producto de efrina B2 (200 pb) en HUVEC/BC-1, HUVEC/BC-3 y se observa producto de EphB4 (400 pb) en HUVEC. También se muestra RT-PCR de -actina como control de la cantidad e integridad de ARN introducido.

La figura 47 muestra que HVH-8 induce expresión de marcador arterial en células de sarcoma de Kaposi. (A) Inmunotransferencia de tipo Western para efrina B2 en diversos lisados celulares. SLK-vGPCR es un clon estable de SLK que expresa vGPCR de HVH-8, y SLKpCEFL es un clon estable de control transfectado con vector de expresión vacío. Las células SLK transfectadas con LANA o LANA�440 son SLK-LANA y SLK-�440, respectivamente. Se determinó la cantidad de carga y transferencia de proteína volviendo a analizar con sonda las membranas con anticuerpo monoclonal contra -actina. (B) La transfección transitoria de células KS-SLK con vector de expresión pvGPCR-CEFL dio como resultado la expresión de efrina B2 tal como se muestra mediante tinción por inmunofluorescencia con FITC (verde), mientras que el vector de control pCEFL no tuvo ningún efecto. Se transfectaron células KS-SLK (0,8 x 105/pocillo) con 0,8 g de ADN usando Lipofectamine 2000. 24 h después, se fijaron las células y se tiñeron con anticuerpo policlonal contra efrina B2 y anticuerpo secundario conjugado con FITC tal como se describe en los métodos. (C) La transfección transitoria de HUVEC con vGPCR induce la transcripción a partir de constructos de efrina B2-luciferasa. Se transfectaron 8 x 103 HUVEC en placas de 24 pocillos usando Superfect con 0,8 g/pocillo de constructos de promotor de efrina B2 que contenían secuencias desde -2941 hasta -11 con respecto al sitio de inicio de la traducción, o dos deleciones en 5’ tal como se indica, junto con 80 ng/pocillo de pCEFL o pvGPCR-CEFL. Se determinó la luciferasa 48 h tras la transfección y se muestran las razones de inducción a la derecha del gráfico. pGL3Basic es un vector de control de luciferasa sin promotor. Se normalizó la luciferasa con respecto a proteína dado que GPCR inducía la expresión de la -galactosidasa cotransfectada. Se representa en el gráfico la media + EEM de 6 repeticiones. Se muestra uno de tres experimentos similares.

La figura 48 muestra que VEGF y VEGF-C regulan la expresión de efrina B2. A) Inhibición de efrina B2 mediante anticuerpos neutralizantes. Se cultivaron células en medio de crecimiento completo y se expusieron a anticuerpo (100 ng/ml) durante 36 h antes de la recogida y lisis para la inmunotransferencia de tipo Western. B) Para la inducción de expresión de efrina B2, se cultivaron células en medio de crecimiento EBM que contenía el 5% de suero que carece de factores de crecimiento. Se añadieron factores de crecimiento individuales tal como se indica y se recogieron las células tras 36 h. Se determinó la cantidad de carga y transferencia de proteína volviendo a analizar con sonda las membranas con anticuerpo monoclonal contra -actina.

La figura 49 muestra que el silenciamiento de efrina B2 con ARNip específico inhibe la viabilidad en células de KS y HUVEC que se hacen crecer en presencia de VEGF pero no de IGF, EGF o bFGF. A) Se transfectaron células KS-SLK con diversos ARNip frente a efrina B2 y controles. Tras 48 h se recogieron las células y se fraccionaron lisados celulares en bruto en el 4-20% de SDS-PAGE. Se realizó la inmunotransferencia de tipo Western con anticuerpo monoclonal frente a efrina B2 generado de manera interna. Se separó la membrana y volvió a analizarse con sonda con anticuerpo monoclonal contra -actina (Sigma) para ilustrar la carga y transferencia equivalentes. B) Ensayo de viabilidad celular de 3 días de cultivos de KS-SLK en presencia de ARNip frente a efrina B2 y de EphB4. Se trataron 1 x 105 células/pocillo en placas de 24 pocillos con ARNip 0, 10 y 100 ng/ml tal como se indica en el gráfico. Se determinó la viabilidad de cultivos mediante ensayo con MTT tal como se describe en la sección de métodos. Se muestra la media + desviación estándar de muestras por duplicado. C) Se sembraron células HUVE en portaobjetos con cámaras de ocho pocillos recubiertos con fibronectina. Se hicieron crecer las células HUVE durante la noche en medios EGM-2, que contenían todos los suplementos de crecimiento. Al día siguiente, se sustituyeron los medios por medios que contenían VEGF (10 ng/ml) o EGF, FGF e IGF tal como se indica. Tras 2 h de incubación a 37ºC, se transfectaron las células usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) en medio Opti-MEM que contenía 10 nM de ARNip frente a efrina B2, Eph B4 o proteína fluorescente verde (GFP) como control. Se incubaron las células durante 2 h y después se añadieron los medios nuevos que contenían factores de crecimiento o VEGF solo a sus respectivos pocillos. Tras 48 h, se tiñeron las células con cristal violeta y se tomaron las imágenes inmediatamente mediante cámara digital con 10 aumentos.

La figura 50 muestra que EphB4 soluble inhibe la formación de cordón de EC y KS y la angiogénesis in vivo. Ensayo de formación de cordón de HUVEC en MatrigelTM (fila superior). Se trataron células en fase de crecimiento exponencial durante la noche con las concentraciones indicadas de dominio extracelular de EphB4 (ECD) antes de sembrar en placas en MatrigelTM. SE tripsinizaron las células y se sembraron en placas (1 x 105 células/pocillo) en una placa de 24 pocillos que contenía 0,5 ml de MatrigelTM. Se muestran campos de contraste de fase 20X representativos de formación de cordón tras 8 h de siembra en placa en MatrigelTM en presencia continuada de los compuestos de prueba tal como se muestra. Aumento original de 200. Se trataron células KS-SLK de una manera similar (fila central) en un ensayo de formación de cordón en MatrigelTM. La fila inferior muestra el ensayo en MatrigelTM in vivo: Se implantaron tapones de MatrigelTM que contenían factores de crecimiento y ECD de EphB4 o PBS por vía subcutánea en la región mesoventral de ratones. Tras 7 días se extirparon los tapones, se cortaron en secciones y se tiñeron con H&E para visualizar células que migraban al interior de la matriz. Se observan vasos intactos con grandes luces en el control, mientras que ECD de EphB4 inhibía casi completamente la migración de células al interior de Matrigel.

La figura 51 muestra la expresión de EPHB4 en líneas celulares de cáncer de vejiga (A), y la regulación de la expresión de EPHB4 mediante la ruta de señalización de EGFR (B).

La figura 52 muestra que la transfección de p53 inhibe la expresión de EPHB4 en células 5637.

La figura 53 muestra la inhibición del crecimiento de una línea celular de cáncer de vejiga (5637) tras el tratamiento con ARNip 472 de EPHB4.

La figura 54 muestra los resultados del estudio de apoptosis de células 5637 transfectadas con ARNip 472 de EPHB4.

La figura 55 muestra los efectos de sondas antisentido contra EPHB4 sobre la migración celular. Se trataron células 5637 con AS-10 frente a EPHB4 (10 M) (paneles inferiores). Los paneles superiores muestran células de control.

La figura 56 muestra los efectos de ARNip frente a EPHB4 sobre la invasión celular. Se transfectaron células 5637 con ARNip 472 o ARNip de control.

La figura 57 muestra la comparación de anticuerpos monoclonales contra EphB4 mediante G250 y en ensayo de coinmunoprecipitación (“pull-down”).

La figura 58 muestra que anticuerpos contra EphB4 inhiben el crecimiento de tumores de xenoinjerto de SCC15.

La figura 59 muestra que anticuerpos contra EphB4 provocan apoptosis, necrosis y angiogénesis reducida en SCC15, un tipo de tumor de carcinoma de cabeza de cuello.

La figura 60 muestra que la administración sistémica de anticuerpos contra EphB4 conduce a regresión tumoral.

La figura 61 muestra una secuencia de nucleótidos genómica de EphB4 humana (SEQ ID NO: 6).

La figura 62 muestra una secuencia de nucleótidos de ADNc de EphB4 humana (SEQ ID NO: 7).

La figura 63 muestra una secuencia de nucleótidos genómica de efrina B2 humana (SEQ ID NO: 8).

La figura 64 muestra una secuencia de nucleótidos de ADNc de efrina B2 humana (SEQ ID NO: 9).

La figura 65 muestra una secuencia de aminoácidos de EphB4 humana (SEQ ID NO: 10). 5 La figura 66 muestra una secuencia de aminoácidos de efrina B2 humana (SEQ ID NO: 11).

La figura 67 muestra una comparación de las propiedades de unión a efrina B2 de la proteína de fusión HSA-EphB4 y otros polipéptidos de EphB4.

10 La figura 68 muestra una comparación entre la estabilidad in vivo de una proteína de fusión EphB4-HSA y un polipéptido de EphB4 en ratones.

La figura 69 muestra la actividad de unión a efrina B2 de polipéptidos de EphB4 solubles pegilados en condiciones 15 de pH específicas.

La figura 70 muestra la separación cromatográfica de derivados de PEG de proteína EphB4 en columnas de SP-Sepharose. Se analizó mediante PAGE la pureza de la proteína EphB4 modificada con PEG. También se muestra la unión a efrina B2 de los productos de reacción de pegilación.

20 La figura 71 muestra la pureza, determinada mediante SDS-PAGE, de fracciones de EphB4 sin pegilar, monopegiladas y polipegiladas, separadas por cromatografía.

La figura 72 muestra la actividad de unión a efrina B2 de las fracciones de cromatografía a partir de la reacción de 25 pegilación de EphB4.

La figura 73 muestra la retención de actividad de unión a efrina B2 de las fracciones de cromatografía a partir de la reacción de pegilación de EphB4 tras la incubación en suero de ratón a 37ºC durante tres días.

30 La figura 74 muestra la estabilidad in vivo de EphB4 sin pegilar, monopegilada y polipegilada en ratones a lo largo del tiempo.

Descripción detallada de la invención

35 I. Visión general

La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de que la señalización a través de la ruta de efrina/receptor de efrina (efrina/eph) contribuye a tumorigénesis. Los solicitantes detectaron expresión de efrina B2 y EphB4 en tejidos tumorales y desarrollaron agentes terapéuticos antitumorales para bloquear la señalización a 40 través de efrina/eph. Además, la divulgación proporciona agentes terapéuticos polipeptídicos y métodos para la inhibición basada en polipéptidos de la función de EphB4 y/o efrina B2. Por consiguiente, la divulgación proporciona numerosos compuestos polipeptídicos (agentes) que pueden usarse para tratar cáncer así como trastornos relacionados con la angiogénesis y procesos relacionados con la angiogénesis no deseada. Los solicitantes han generado formas modificadas de polipéptidos de efrina B2 y de EphB4 y han demostrado que tales formas

45 modificadas tienen propiedades farmacocinéticas notablemente mejoradas. Por consiguiente, la divulgación proporciona numerosos compuestos polipeptídicos (agentes) que pueden usarse para tratar cáncer así como trastornos relacionados con la angiogénesis y procesos relacionados con la angiogénesis no deseada.

Tal como se usan en el presente documento, los términos efrina y Eph se usan para hacer referencia,

50 respectivamente, a ligandos y receptores. Pueden proceder de cualquiera de una variedad de animales (por ejemplo, mamíferos/no mamíferos, vertebrados/no vertebrados, incluyendo seres humanos). La nomenclatura en este campo ha cambiado rápidamente y la terminología usada en el presente documento es la propuesta como resultado del trabajo del Eph Nomenclature Committee, al cual puede accederse, junto a nombres anteriormente usados, en el sitio web http://www.ephnomenclature.com.

55 El trabajo descrito en el presente documento, particularmente en los ejemplos, se refiere a efrina B2 y EphB4. Sin embargo, la presente divulgación contempla cualquier ligando efrina y/o receptor Eph dentro de su respectiva familia, que se expresa en un tumor. Las efrinas (ligandos) son de dos tipos estructurales, que pueden subdividirse adicionalmente basándose en relaciones de secuencias y, funcionalmente, basándose en la unión preferencial que

60 muestran por dos subgrupos de receptores correspondientes. Estructuralmente, hay dos tipos de efrinas: las que están ancladas a membrana mediante una unión glicerofosfatidilinositol (GPI) y las ancladas a través de un dominio transmembrana. Convencionalmente, los ligandos se dividen en la subclase de efrina A, que son proteínas unidas por GPI que se unen preferentemente a receptores EphA, y la subclase de efrina B, que son proteínas transmembrana que generalmente se unen preferentemente a receptores EphB.

Los receptores de la familia de Eph son una familia de receptores proteína-tirosina cinasas que están relacionados con Eph, un receptor nombrado por su expresión en una línea celular de carcinoma hepatocelular humano productora de eritropoyetina. Se dividen en dos subgrupos basándose en la relación de sus secuencias de dominio extracelular y su capacidad para unirse preferentemente a proteínas efrina A o proteínas efrina B. Los receptores que interaccionan preferentemente con proteínas efrina A son receptores EphA y los que interaccionan preferentemente con proteínas efrina B son receptores EphB.

Los receptores Eph tienen un dominio extracelular compuesto por el dominio globular de unión a ligando, una región rica en cisteína seguida por un par de repeticiones de fibronectina tipo III (por ejemplo, véase la figura 16). El dominio citoplasmático consiste en una región yuxtamembrana que contiene dos residuos de tirosina conservados; un dominio proteína-tirosina cinasa; un motivo � estéril (SAM) y un motivo de unión a dominio PDZ. EphB4 es específica para el ligando unido a membrana efrina B2 (Sakano, S. et al 1996; Brambilla R. et al 1995). La efrina B2 pertenece a la clase de ligandos de Eph que tienen un dominio transmembrana y una región citoplasmática con cinco residuos de tirosina conservados y un dominio PDZ. Los receptores Eph se activan mediante unión de efrinas unidas a membrana, agrupadas (Davis S et al, 1994), lo que indica que se requiere el contacto entre células que expresan los receptores y células que expresan los ligandos para la activación de Eph.

Tras la unión a ligando, un receptor Eph dimeriza y autofosforila los residuos de tirosina yuxtamembrana para adquirir la activación completa (Kalo MS et al, 1999, Binns KS, 2000). Además de la señalización directa a través del receptor Eph, puede producirse señalización inversa a través de la efrina Bs. El contacto de Eph con efrinas da como resultado una rápida fosforilación de las tirosinas intracelulares conservadas (Bruckner K, 1997) y el reclutamiento algo más lento de proteínas de unión a PDZ (Palmer A 2002). Recientemente, varios estudios han mostrado que la alta expresión de Eph/efrinas puede estar asociada con potenciales aumentados de crecimiento tumoral, tumorigenicidad y metástasis (Easty DJ, 1999; Kiyokawa E, 1994; Tang XX, 1999; Vogt T, 1998; Liu W, 2002; Stefenson SA, 2001; Steube KG 1999; Berclaz G, 1996).

En el presente documento se dan a conocer agentes terapéuticos polipeptídicos que inhiben la actividad de efrina B2, EphB4 o ambas. Tal como se usa en el presente documento, el término “agente terapéutico polipeptídico” o “agente polipeptídico” es un término genérico que incluye cualquier polipéptido que bloquea la señalización a través de la ruta de efrina B2/EphB4. Un agente terapéutico polipeptídico de la invención es un polipéptido soluble de efrina B2 o EphB4. Otro agente terapéutico polipeptídico preferido de la invención es un anticuerpo antagonista que se une a efrina B2 o a EphB4. Por ejemplo, tal agente terapéutico polipeptídico puede inhibir la función de efrina B2 o EphB4, inhibir la interacción entre efrina B2 y EphB4, inhibir la fosforilación de efrina B2 o EphB4, o inhibir cualquiera de los eventos de señalización posteriores tras la unión de efrina B2 a EphB4. Tales polipéptidos pueden incluir EphB4 o efrina B2 que están modificadas para mejorar la semivida sérica, tal como mediante pegilación o asociación estable con una proteína albúmina sérica.

II. Polipéptidos solubles

Un polipéptido soluble puede comprender un dominio extracelular de una proteína efrina B2 (denominado en el presente documento polipéptido soluble de efrina B2) o comprender un dominio extracelular de una proteína EphB4 (denominado en el presente documento un polipéptido soluble de EphB4). Preferiblemente, el polipéptido soluble objeto es un monómero y puede unirse con alta afinidad a efrina B2 o EphB4. El polipéptido soluble de EphB4 de la invención puede comprender un dominio globular de una proteína EphB4. Se proporcionan ejemplos específicos de polipéptidos solubles de EphB4 en las figuras 1, 2 y 15. Se proporcionan ejemplos específicos de polipéptidos solubles de efrina B2 en las figuras 3 y 14.

Tal como se usa en el presente documento, los polipéptidos solubles incluyen fragmentos, variantes funcionales y formas modificadas del polipéptido soluble de EphB4 o un polipéptido soluble de efrina B2. Estos fragmentos, variantes funcionales y formas modificadas de los polipéptidos solubles objeto antagonizan la función de EphB4, efrina B2 o ambas.

Pueden obtenerse fragmentos aislados de los polipéptidos solubles objeto examinando polipéptidos producidos de manera recombinante a partir del fragmento correspondiente del ácido nucleico que codifica para polipéptidos solubles de EphB4 o de efrina B2. Además, pueden sintetizarse químicamente fragmentos usando técnicas conocidas en la técnica tales como química de f-Moc o t-Boc en fase sólida de Merrifield convencional. Los fragmentos pueden producirse (de manera recombinante o mediante síntesis química) y someterse a prueba para identificar aquellos fragmentos de peptidilo que pueden funcionar para inhibir la función de EphB4 o efrina B2, por ejemplo, sometiendo a prueba la capacidad de los fragmentos para inhibir la angiogénesis o el crecimiento tumoral.

Una variante funcional de un polipéptido soluble de EphB4 comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 90%, 95%, 97%, 99% o el 100% a los residuos 1-197, 29-197, 1-312, 29-132, 1-321, 29-321, 1-326, 29-326, 1-412, 29-412, 1-427, 29-427, 1-429, 29-429, 1-526, 29-526, 1-537 y 29-537 de la secuencia de aminoácidos definida por la figura 65 (SEQ ID NO: 10). Tales polipéptidos pueden usarse en una forma procesada, y por consiguiente, un polipéptido soluble de EphB4 comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al

menos el 90%, 95%, 97%, 99% o el 100% a los residuos 16-197, 16-312, 16-321, 16-326, 16-412, 16-427, 16-429, 16-526 y 16-537 de la secuencia de aminoácidos definida por la figura 65 (SEQ ID NO: 10).

Una variante funcional de un polipéptido soluble de efrina B2 comprende una secuencia idéntica en al menos el 90%, 95%, 97%, 99% o el 100% a los residuos 1-225 de la secuencia de aminoácidos definida por la figura 66 (SEQ ID NO: 11) o una forma procesada, tal como una que comprende una secuencia idéntica en al menos el 90%, 95%, 97%, 99% o el 100% a los residuos 26-225 de la secuencia de aminoácidos definida por la figura 66 (SEQ ID NO: 11).

Pueden prepararse variantes funcionales modificando la estructura del polipéptido soluble objeto para fines tales como potenciar la eficacia terapéutica o profiláctica, o la estabilidad (por ejemplo, semivida ex vivo y resistencia a la degradación proteolítica in vivo). Tales polipéptidos solubles modificados se consideran equivalentes funcionales del polipéptido soluble de EphB4 o de efrina B2 que se produce de manera natural. Pueden producirse polipéptidos solubles modificados, por ejemplo, mediante sustitución, deleción o adición de aminoácidos. Por ejemplo, resulta razonable esperar, por ejemplo, que una sustitución aislada de una leucina por una isoleucina o valina, un aspartato por un glutamato, una treonina por una serina, o una sustitución similar de un aminoácido por un aminoácido estructuralmente relacionado (por ejemplo, mutaciones conservativas) no tendrá un efecto principal sobre la actividad biológica de la molécula resultante. Las sustituciones conservativas son aquellas que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales.

En el presente documento se da a conocer un método de generación de conjuntos de mutantes combinatorios de los polipéptidos solubles de EphB4 o de efrina B2, así como mutantes de truncamiento, y es especialmente útil para identificar secuencias variantes funcionales. El propósito de examinar tales bibliotecas combinatorias puede ser generar, por ejemplo, variantes de polipéptidos solubles que pueden actuar como antagonistas de EphB4, EphB2, o ambas. Pueden generarse variantes derivadas de manera combinatoria que tienen una potencia selectiva con respecto a un polipéptido soluble que se produce de manera natural. Tales proteínas variantes, cuando se expresan a partir de constructos de ADN recombinante, pueden usarse en protocolos de terapia génica. Asimismo, la mutagénesis puede dar lugar a variantes que tienen semividas intracelulares drásticamente diferentes del polipéptido soluble de tipo natural correspondiente. Por ejemplo, puede hacerse que la proteína alterada sea o bien más estable o bien menos estable frente a la degradación proteolítica u otros procesos celulares que dan como resultado la destrucción, o inactivación de otro modo, de la proteína de interés (por ejemplo, un polipéptido soluble). Tales variantes, y los genes que codifican para las mismas, pueden usarse para alterar los niveles de polipéptido soluble objeto modulando su semivida. Por ejemplo, una semivida corta puede dar lugar a efectos biológicos más transitorios y, cuando es parte de un sistema de expresión inducible, puede permitir un control más estrecho de los niveles de polipéptido soluble recombinante dentro de la célula. Igual que anteriormente, tales proteínas, y particularmente sus constructos de ácido nucleico recombinante, pueden usarse en protocolos de terapia génica.

Hay muchas maneras mediante las cuales puede generarse la biblioteca de posibles homólogos a partir de una secuencia de oligonucleótidos degenerados. Puede llevarse a cabo síntesis química de una secuencia génica degenerada en un sintetizador de ADN automático, y entonces ligarse los genes sintéticos en un gen apropiado para la expresión. El propósito de un conjunto degenerado de genes es proporcionar, en una mezcla, todas las secuencias que codifican para el conjunto deseado de posibles secuencias de polipéptido soluble. La síntesis de oligonucleótidos degenerados se conoce bien en la técnica (véase, por ejemplo, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al., (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier págs. 273-289; Itakura et al., (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science

198: 1056; Ike et al., (1983) Nucleic Acid Res. 11:477). Tales técnicas se han empleado en la evolución dirigida de otras proteínas (véase, por ejemplo, Scott et al., (1990) Science 249:386-390; Roberts et al., (1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin et al., (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al., (1990) PNAS USA 87: 6378-6382; así como las patentes estadounidenses n.os: 5.223.409, 5.198.346 y 5.096.815).

Alternativamente, pueden usarse otras formas de mutagénesis para generar una biblioteca combinatoria. Por ejemplo, pueden generarse variantes de polipéptidos solubles (por ejemplo, las formas antagonistas) y aislarse a partir de una biblioteca mediante examen usando, por ejemplo, mutagénesis mediante barrido de alanina y similares (Ruf et al., (1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balint et al., (1993) Gene 137:109-118; Grodberg et al., (1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601; Nagashima et al., (1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892; Lowman et al., (1991) Biochemistry 30:10832-10838; y Cunningham et al., (1989) Science 244:1081-1085), por mutagénesis mediante barrido de ligador (Gustin et al., (1993) Virology 193:653-660; Brown et al., (1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652; McKnight et al., (1982) Science 232:316); por mutagénesis mediante saturación (Meyers et al., (1986) Science 232:613); por mutagénesis mediante PCR (Leung et al., (1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19); o por mutagénesis al azar, incluyendo mutagénesis química, etc. (Miller et al., (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; y Greener et al., (1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34). La mutagénesis mediante barrido de ligador, particularmente en un entorno combinatorio, es un método atractivo para identificar formas truncadas (bioactivas) del polipéptido soluble objeto.

En la técnica se conoce una amplia gama de técnicas para examinar productos génicos de bibliotecas combinatorias realizadas mediante mutaciones puntuales y truncamientos, y, de hecho, para examinar bibliotecas de ADNc para

detectar productos génicos que tienen una determinada propiedad. Tales técnicas serán generalmente adaptables para examinar rápidamente las bibliotecas génicas generadas mediante la mutagénesis combinatoria de los polipéptidos solubles objeto. Las técnicas más ampliamente usadas para examinar grandes bibliotecas génicas comprenden normalmente clonar la biblioteca génica en vectores de expresión replicables, transformar células apropiadas con la biblioteca resultante de vectores, y expresar los genes combinatorios en condiciones en las que la detección de una actividad deseada facilita un aislamiento relativamente fácil del vector que codifica para el gen cuyo producto se detectó. Cada uno de los ensayos ilustrativos descritos a continuación es apropiado para un análisis de alto rendimiento según sea necesario para examinar grandes números de secuencias degeneradas creadas mediante técnicas de mutagénesis combinatoria.

En determinadas realizaciones, los polipéptidos solubles objeto de la invención incluyen una molécula pequeña tal como un péptido y un peptidomimético. Tal como se usa en el presente documento, el término “peptidomimético” incluye péptidos modificados químicamente y moléculas similares a péptidos que contienen aminoácidos que no se producen de manera natural, peptoides y similares. Los peptidomiméticos proporcionan diversas ventajas con respecto a un péptido, incluyendo estabilidad potenciada cuando se administran a un sujeto. En la técnica se conocen bien métodos para identificar un peptidomimético e incluyen el examen de bases de datos que contienen bibliotecas de peptidomiméticos posibles. Por ejemplo, la base de datos estructural de Cambridge contiene una colección de más de 300.000 compuestos que tienen estructuras cristalinas conocidas (Allen et al., Acta Crystallogr. Sección B, 35:2331 (1979)). Cuando no está disponible ninguna estructura cristalina de una molécula diana, puede generarse una estructura usando, por ejemplo, el programa CONCORD (Rusinko et al., J. Chem. Inf. Comput. Sci.

29:251 (1989)). Otra base de datos, el Available Chemicals Directory (Molecular Design Limited, Informations Systems; San Leandro Calif.), contiene aproximadamente 100.000 compuestos que están comercialmente disponibles y también pueden hacerse búsquedas para identificar peptidomiméticos posibles de los polipéptidos solubles de EphB4 o de efrina B2.

En determinadas realizaciones, los polipéptidos solubles de la invención pueden comprender además modificaciones postraduccionales. Las modificaciones de proteínas postraduccionales a modo de ejemplo incluyen fosforilación, acetilación, metilación, ADP-ribosilación, ubiquitinación, glicosilación, carbonilación, sumoilación, biotinilación o adición de una cadena lateral polipeptídica o de un grupo hidrófobo. Como resultado, los polipéptidos solubles modificados pueden contener elementos distintos de aminoácidos, tales como lípidos, poli o monosacáridos, y fosfatos. Pueden someterse a prueba los efectos de tales elementos distintos de aminoácidos sobre la funcionalidad de un polipéptido soluble para determinar su papel antagonista sobre la función de EphB4 o efrina B2, por ejemplo, su efecto inhibidor sobre la angiogénesis o sobre el crecimiento tumoral.

Las formas modificadas de los polipéptidos solubles objeto comprenden unir los polipéptidos solubles objeto a polímeros no proteicos. El polímero puede ser polietileno (“PEG”), polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera expuesta en las patentes estadounidenses n.os 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 ó 4.179.337. Los ejemplos del polipéptido modificado incluyen efrina B2 soluble pegilada y EphB4 soluble pegilada.

PEG es un polímero soluble en agua, bien conocido, que está comercialmente disponible o puede prepararse mediante polimerización con apertura de anillo de etilenglicol según métodos bien conocidos en la técnica (Sandler y Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, Nueva York, vol. 3, páginas 138-161). El término “PEG” se usa ampliamente para abarcar cualquier molécula de polietilenglicol, independientemente del tamaño o la modificación en un extremo del PEG, y puede representarse por la fórmula:

X-O(CH2CH2O)n-1CH2CH2OH (1)

en la que n es de 20 a 2300 y X es H o una modificación terminal, por ejemplo, un alquilo C1-4. El PEG puede terminar en un extremo con hidroxilo o metoxilo, es decir, X es H o CH3 (“metoxi-PEG”). Un PEG puede contener grupos químicos adicionales que son necesarios para reacciones de unión; que resultan de la síntesis química de la molécula; o que son un espaciador para obtener una distancia óptima de partes de la molécula. Además, un PEG de este tipo puede consistir en una o más cadenas laterales de PEG que están unidas entre sí. Los PEG con más de una cadena de PEG se denominan PEG ramificados o de múltiples brazos. Pueden prepararse PEG ramificados, por ejemplo, mediante adición de poli(óxido de etileno) a diversos polioles, incluyendo glicerol, pentaeritritol y sorbitol. Por ejemplo, puede prepararse un PEG ramificado de cuatro brazos a partir de pentaeritritol y óxido de etileno. Se describen PEG ramificados, por ejemplo, en el documento EP-A 0 473 084 y la patente estadounidense n.º 5.932.462. Una forma de PEG incluye dos cadenas laterales de PEG (PEG2) unidas mediante los grupos amino primario de una lisina (Monfardini, C., et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69).

La conjugación de PEG con péptidos o proteínas implica generalmente la activación de PEG y el acoplamiento de los productos intermedios de PEG activado directamente a proteínas/péptidos diana o a un ligador, que posteriormente se activa y se acopla a proteínas/péptidos diana (véase Abuchowski, A. et al, J. Biol. Chem., 252, 3571 (1977) y J. Biol. Chem., 252, 3582 (1977), Zalipsky, et al., y Harris et al., en: Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications; (J. M. Harris ed.) Plenum Press: Nueva York, 1992; cap. 21 y 22). Se

indica que una EphB4 que contiene una molécula de PEG también se conoce como proteína conjugada, mientras que la proteína que carece de una molécula de PEG unida puede denominarse no conjugada.

Puede usarse cualquier masa molecular para un PEG según se desee desde un punto de vista práctico, por ejemplo, de desde aproximadamente 1.000 Dalton (Da) hasta 100.000 Da (n es de 20 a 2300), para conjugarse con péptidos solubles de Eph4 o de efrina B2. El número de unidades de repetición “n” en el PEG es aproximado para la masa molecular descrita en Dalton. Se prefiere que la masa molecular combinada de PEG en un ligador activado sea adecuada para su uso farmacéutico. Por tanto, la masa molecular de las moléculas de PEG no puede superar

100.000 Da. Por ejemplo, si se unen tres moléculas de PEG a un ligador, en las que cada molécula de PEG tiene la misma masa molecular de 12.000 Da (cada n es de aproximadamente 270), entonces la masa molecular total de PEG en el ligador es de aproximadamente 36.000 Da (n total es de aproximadamente 820). Las masas moleculares de los PEG unidos al ligador también pueden ser diferentes, por ejemplo, de tres moléculas en un ligador dos moléculas de PEG pueden tener 5.000 Da cada una (cada n es de aproximadamente 110) y una molécula de PEG puede tener 12.000 Da (n es de aproximadamente 270).

Un polipéptido de EphB4 puede unirse de manera covalente a un grupo polietilenglicol de fórmula: -CO-(CH2)x(OCH2CH2)m-OR, formando el -CO (es decir carbonilo) del grupo polietilenglicol un enlace amida con uno de los grupos amino de EphB4; siendo R alquilo inferior; siendo x 2 ó 3; siendo m desde aproximadamente 450 hasta aproximadamente 950; y eligiéndose n y m de tal manera que el peso molecular del conjugado menos la proteína EphB4 es de desde aproximadamente 10 hasta 40 kDa.

Un grupo -amino de EphB4 de una lisina puede ser el grupo amino disponible (libre).

Los conjugados anteriores pueden presentarse más específicamente mediante la fórmula (II): P-NHCO-(CH2)x(OCH2CH2)m-OR (II), en la que P es el grupo de una proteína EphB4 tal como se describe en el presente documento, (es decir sin el grupo amino o grupos amino que forman un enlace amida con el carbonilo mostrado en la fórmula (II)); y en la que R es alquilo inferior; x es 2 ó 3; m es desde aproximadamente 450 hasta aproximadamente 950 y se elige de tal manera que el peso molecular del conjugado menos la proteína EphB4 es de desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 40 kDa. Tal como se usa en el presente documento, los intervalos dados de “m” tienen un significado orientativo. Los intervalos de “m” se determinan en cualquier caso, y de manera exacta, mediante el peso molecular del grupo PEG.

Un experto en la técnica puede seleccionar una masa molecular adecuada para PEG, por ejemplo, basándose en cómo se usará la EphB4 pegilada de manera terapéutica, la dosificación deseada, el tiempo de circulación, la resistencia a la proteólisis, inmunogenicidad, y otras consideraciones. Para una discusión de PEG y su uso para potenciar las propiedades de proteínas, véase N. V. Katre, Advanced Drug Delivery Reviews 10: 91-114 (1993).

Pueden activarse moléculas de PEG para reaccionar con grupos amino en EphB4, tal como con lisinas (Bencham C.

O. et al., Anal. Biochem., 131, 25 (1983); Veronese, F. M. et al., Appl. Biochem., 11, 141 (1985); Zalipsky, S. et al., Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, adrs 9-110 ACS Symposium Series 469 (1999); Zalipsky, S. et al., Europ. Polym. J., 19, 1177-1183 (1983); Delgado, C. et al., Biotechnology and Applied Biochemistry, 12, 119-128 (1990)).

Pueden usarse ésteres de carbonato de PEG para formar los conjugados de PEG-EphB4. Puede usarse carbonato de N,N’-disuccinimidilo (DSC) en la reacción con PEG para formar carbonato de PEG-succinimidilo mezclado activo que posteriormente puede hacerse reaccionar con un grupo nucleófilo de un ligador o un grupo amino de EphB4 (véanse la patente estadounidense n.º 5.281.698 y la patente estadounidense n.º 5.932.462). En un tipo similar de reacción, pueden hacerse reaccionar carbonato de 1,1’-(dibenzotriazolilo) y carbonato de di-(2-piridilo) con PEG para formar carbonato mixto de PEG-benzotriazolilo y PEG-piridilo (patente estadounidense n.º 5.382.657), respectivamente.

Pueden introducirse sitios adicionales para la pegilación mediante mutagénesis dirigida al sitio introduciendo uno o más residuos de lisina. Por ejemplo, pueden mutarse uno o más residuos de arginina para dar un residuo de lisina. Pueden introducirse químicamente sitios de pegilación adicionales modificando aminoácidos en EphB4. Pueden conjugarse grupos carboxilo en EphB4 con diaminobutano, dando como resultado amidación de carboxilo (véase Li et al., Anal Biochem. 2004; 330(2):264-71). Esta reacción puede catalizarse mediante 1-etil-3-(3dimetilaminopropil)carbodiimida, una carbodiimida soluble en agua. Entonces pueden conjugarse las amidas resultantes con PEG.

Puede realizarse la pegilación de EphB4 según los métodos del estado de la técnica, por ejemplo mediante reacción de EphB4 con PEG electrófilamente activos (proveedor: Shearwater Corp., EE.UU., www.shearwatercorp.com). Reactivos de PEG preferidos son, por ejemplo, propionatos de N-hidroxisuccinimidilo (PEG-SPA), butanoatos (PEG-SBA), propionato de PEG-succinimidilo o N-hidroxisuccinimidas ramificadas tales como mPEG2-NHS (Monfardini, C., et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69). Tales métodos pueden usarse para la pegilación en un grupo amino de una lisina de EphB4 o el grupo amino N-terminal de EphB4.

Pueden acoplarse moléculas de PEG a grupos sulfhidrilo en EphB4 (Sartore, L., et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 27, 45 (1991); Morpurgo et al., Biocon. Chem., 7, 363-368 (1996); Goodson et al., Bio/Technology (1990) 8, 343; patente estadounidense n.º 5.766.897). Las patentes estadounidenses n.os 6.610.281 y 5.766.897 describen especies de PEG reactivas a modo de ejemplo que pueden acoplarse a grupos sulfhidrilo.

Cuando se conjugan moléculas de PEG con residuos de cisteína en EphB4, los residuos de cisteína son nativos para Eph4, mientras que alternativamente, pueden modificarse uno o más residuos de cisteína por ingeniería genética para introducirlos en EphB4. Pueden introducirse mutaciones en una secuencia codificante de EphB4 para generar residuos de cisteína. Esto podría lograrse, por ejemplo, mutando uno o más residuos de aminoácido para dar cisteína. Los aminoácidos preferidos para su mutación para dar un residuo de cisteína incluyen serina, treonina, alanina y otros residuos hidrófilos. Preferiblemente, el residuo que va a mutarse para dar cisteína es un residuo expuesto en la superficie. En la técnica se conocen bien algoritmos para predecir la accesibilidad en superficie de residuos basándose en la secuencia primaria de una proteína. Alternativamente, pueden predecirse residuos de superficie comparando las secuencias de aminoácidos de EphB4 y EphB2, dado que se ha resuelto la estructura cristalina de EphB2 (véase Himanen et al., Nature. (2001) 20-27; 414(6866):933-8) y por tanto se han identificado los residuos expuestos en la superficie. Pueden introducirse residuos de cisteína en EphB4 en o cerca del extremo N y/o C-terminal, o dentro de regiones de bucle. Las regiones de bucle pueden identificarse comparando la secuencia de EphB4 con la de EphB2.

La EphB4 pegilada puede comprender una molécula de PEG unida de manera covalente al grupo amino alfa del aminoácido N-terminal. La aminación reductora N-terminal específica del sitio se describe en Pepinsky et al., (2001) JPET, 297,1059, y la patente estadounidense n.º 5.824.784. El uso de un PEG-aldehído para la aminación reductora de una proteína usando otros grupos amino nucleófilos disponibles en la patente estadounidense n.º 4.002.531, en Wieder et al., (1979) J. Biol. Chem. 254,12579, y en Chamow et al., (1994) Bioconjugate Chem. 5, 133.

La EphB4 pegilada puede comprender una o más moléculas de PEG unidas de manera covalente a un ligador, que a su vez se une al grupo amino alfa del residuo de aminoácido en el extremo N-terminal de EphB4. Tal enfoque se da a conocer en la publicación de patente estadounidense n.º 2002/0044921 y en el documento WO94/01.451.

EphB4 puede pegilarse en el extremo C-terminal. Puede pegilarse una proteína en el extremo C-terminal mediante la introducción de azido-metionina C-terminal y la posterior conjugación de un compuesto de metil-PEG-triarilfosfina mediante la reacción de Staudinger. Este método de conjugación C-terminal se describe en Cazalis et al., C-Terminal Site-Specific PEGilation of a Truncated Thrombomodulin Mutant with Retention of Full Bioactivity, Bioconjug Chem. 2004; 15(5):1005-1009.

También puede producirse la monopegilación de EphB4 según los métodos generales descritos en el documento WO 94/01451. El documento WO 94/01451 describe un método para preparar un polipéptido recombinante con un grupo reactivo de carbono alfa de aminoácido terminal modificado. Las etapas del método implican formar el polipéptido recombinante y protegerlo con uno o más grupos protectores añadidos biológicamente en la amina alfa N-terminal y el carboxilo alfa C-terminal. Entonces puede hacerse reaccionar el polipéptido con agentes protectores químicos para proteger selectivamente grupos de cadena lateral reactivos y así impedir que se modifiquen los grupos de cadena lateral. Entonces se escinde el polipéptido con un reactivo de escisión específico para el grupo protector biológico para formar un grupo reactivo de carbono alfa de aminoácido terminal no protegido. El grupo reactivo de carbono alfa de aminoácido terminal no protegido se modifica con un agente de modificación químico. Entonces el polipéptido de copia individual modificado en el extremo terminal, protegido en la cadena lateral, se desprotege en los grupos de cadena lateral para formar un polipéptido de copia individual recombinante modificado en el extremo terminal. El número y la secuencia de etapas en el método pueden variarse para lograr una modificación selectiva en el aminoácido N y/o C-terminal del polipéptido.

La razón de EphB4 (o efrina B2) con respecto a PEG activado en la reacción de conjugación puede ser de desde aproximadamente 1:0,5 hasta 1:50, desde aproximadamente 1:1 hasta 1:30, o desde aproximadamente 1:5 hasta

1:15. Pueden usarse diversos tampones acuosos para catalizar la adición covalente de PEG a EphB4. El pH de un tampón usado puede ser de desde aproximadamente 7,0 hasta 9,0.

Alternativamente, el pH puede estar en un intervalo ligeramente básico, por ejemplo, de desde aproximadamente 7,5 hasta 8,5. Pueden usarse tampones que tienen un pKa próximo al intervalo de pH neutro, por ejemplo, tampón fosfato.

El intervalo de temperatura para preparar una mono-PEG-EphB4 puede ser de desde aproximadamente 4ºC hasta 40ºC, o desde aproximadamente 18ºC hasta 25ºC. Alternativamente, la temperatura puede ser la temperatura ambiente.

La reacción de pegilación avanzar durante desde 3 hasta 48 horas, o desde 10 hasta 24 horas. La reacción puede monitorizarse usando SE-HPLC para distinguir EphB4, mono-PEG-EphB4 y poli-PEG-EphB4. Se indica que monoPEG-EphB4 se forma antes que di-PEG-EphB4. Cuando la concentración de mono-PEG-EphB4 alcanza una

meseta, puede terminarse la reacción añadiendo un agente de extinción para que reaccione con PEG sin proteger. El agente de extinción puede ser un aminoácido libre, tal como glicina, cisteína o lisina.

Pueden usarse técnicas de separación y purificación convencionales conocidas en la técnica para purificar productos de EphB4 o efrina B2 pegilados, tales como cromatografía de exclusión molecular (por ejemplo filtración en gel) e intercambio iónico. También pueden separarse productos usando SDS-PAGE. Los productos que pueden separarse incluyen EphB4 mono, di, tri y polipegilada y sin pegilar, así como PEG libre. El porcentaje de conjugados de mono-PEG puede controlarse combinando fracciones más amplias alrededor del pico de elución para aumentar el porcentaje de mono-PEG en la composición. Aproximadamente un noventa por ciento de conjugados de mono-PEG representa un buen equilibrio de rendimiento y actividad. Pueden desearse composiciones en las que, por ejemplo, al menos el noventa y dos por ciento o al menos el noventa y seis por ciento de los conjugados son especies de mono-PEG. El porcentaje de conjugados de mono-PEG puede ser de desde el noventa por ciento hasta el noventa y seis por ciento.

Las proteínas EphB4 pegiladas pueden contener uno, dos o más restos PEG. El/los resto(s) PEG puede(n) estar unido(s) a un residuo de aminoácido que está en la superficie de la proteína y/o lejos de la superficie que entra en contacto con efrina B2. La masa molecular combinada o total de PEG en PEG-EphB4 puede ser de desde aproximadamente 3.000 Da hasta 60.000 Da, opcionalmente desde aproximadamente 10.000 Da hasta 36.000 Da. El PEG en la EphB4 pegilada puede ser PEG de cadena recta, sustancialmente lineal.

El PEG en EphB4 o efrina B2 pegilada puede no hidrolizarse del residuo de aminoácido pegilado usando un ensayo de hidroxilamina, por ejemplo, hidroxilamina 450 mM (pH 6,5) a lo largo de 8 a 16 horas a temperatura ambiente, y por tanto ser estable. Más del 80% de la composición puede ser mono-PEG-EphB4 estable, más preferiblemente al menos el 90%, y lo más preferiblemente al menos el 95%.

Las proteínas EphB4 pegiladas conservarán preferiblemente al menos el 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% o el 100% de la actividad biológica asociada con la proteína sin modificar. La actividad biológica puede referirse a su capacidad para unirse a efrina B2. La proteína EphB4 pegilada puede mostrar un aumento de la unión a efrina B2 con respecto a EphB4 sin pegilar.

La PEG-EphB4 puede tener una semivida (t1/2) que está potenciada con respecto a la semivida de la proteína sin modificar. Preferiblemente, la semivida de PEG-EphB4 se potencia en al menos el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 400% o el 500% o incluso en el 1000% con respecto a la semivida de la proteína EphB4 sin modificar. La semivida de la proteína puede determinarse in vitro, tal como en una solución salina tamponada o en suero. La semivida de la proteína puede ser una semivida in vivo, tal como la semivida de la proteína en el suero u otro líquido corporal de un animal.

Las variantes funcionales o formas modificadas de los polipéptidos solubles objeto pueden incluir proteínas de fusión que tienen al menos una parte del polipéptido soluble y uno o más dominios de fusión. Los ejemplos bien conocidos de tales dominios de fusión incluyen, pero no se limitan a, polihistidina, Glu-Glu, glutatión-S transferasa (GST), tiorredoxina, proteína A, proteína G, y una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina (Fc), proteína de unión a maltosa (MBP), que son particularmente útiles para el aislamiento de las proteínas de fusión mediante cromatografía de afinidad. Para el fin de la purificación por afinidad, se usan matrices relevantes para la cromatografía de afinidad, tales como resinas conjugadas con glutatión, amilasa y níquel o cobalto. Otro dominio de fusión bien conocido en la técnica es la proteína fluorescente verde (GFP). Los dominios de fusión también incluyen “etiquetas de epítopo”, que son habitualmente secuencias peptídicas cortas para las que está disponible un anticuerpo específico. Las etiquetas de epítopo bien conocidas para las que están fácilmente disponibles anticuerpos monoclonales específicos incluyen FLAG, hemaglutinina de virus influenza (HA) y etiquetas c-myc. En algunos casos, los dominios de fusión tienen un sitio de escisión por proteasa, tal como para factor Xa o trombina, que permite que la proteasa relevante digiera parcialmente las proteínas de fusión y de ese modo libere las proteínas recombinantes a partir de las mismas. Entonces pueden aislarse las proteínas liberadas del dominio de fusión mediante separación cromatográfica posterior.

En determinadas realizaciones, los polipéptidos solubles de la presente invención contienen una o más modificaciones que pueden estabilizar los polipéptidos solubles. Por ejemplo, tales modificaciones potencian la semivida in vitro de los polipéptidos solubles, potencian la semivida en circulación de los polipéptidos solubles o reducen la degradación proteolítica de los polipéptidos solubles.

En una realización adicional, se fusiona un polipéptido soluble de la presente invención con un agente citotóxico. En este método, la fusión actúa para dirigir el agente citotóxico a una célula o tejido específico (por ejemplo, una célula

o tejido tumoral), dando como resultado una reducción del número de células afectadas. Un enfoque de este tipo puede reducir de ese modo los síntomas asociados con cáncer y trastornos asociados con la angiogénesis. Los agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, cadena A de difteria, cadena A de exotoxina, cadena A de ricina, cadena A de abrina, curcina, crotina, fenomicina, enomicina y similares, así como compuestos radioquímicos.

En determinadas realizaciones, los polipéptidos solubles de la presente invención pueden fusionarse con otras proteínas terapéuticas o con otras proteínas tales como Fc o albúmina sérica con fines farmacocinéticos. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 5.766.883 y 5.876.969. Los péptidos solubles dados a conocer en el presente documento pueden fusionarse con variantes de Fc. El polipéptido soluble puede fusionarse con una variante de Fc que no se homodimeriza, tal como una que carece de los residuos de cisteína que forman enlaces de cisteína con otras cadenas de Fc.

Las proteínas modificadas dadas a conocer en el presente documento pueden comprender proteínas de fusión con una región de Fc de una inmunoglobulina. Tal como se sabe, cada región constante de cadena pesada de inmunoglobulina comprende cuatro o cinco dominios. Los dominios se denominan secuencialmente de la siguiente manera: CH1-bisagra-CH2-CH3(-CH4). Las secuencias de ADN de los dominios de cadena pesada tienen homología cruzada entre las clases de inmunoglobulinas, por ejemplo, el dominio CH2 de IgG es homólogo al dominio CH2 de IgA e IgD, y al dominio CH3 de IgM e IgE. Tal como se usa en el presente documento, se entiende que el término “región Fc de inmunoglobulina” significa la parte carboxilo-terminal de una región constante de cadena de inmunoglobulina, preferiblemente una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, o una parte de la misma. Por ejemplo, una región Fc de inmunoglobulina puede comprender 1) un dominio CH1, un dominio CH2, y un dominio CH3, 2) un dominio CH1 y un dominio CH2, 3) un dominio CH1 y un dominio CH3, 4) un dominio CH2 y un dominio CH3, o 5) una combinación de dos o más dominios y una región bisagra de inmunoglobulina. La región Fc de inmunoglobulina puede comprender al menos una región bisagra de inmunoglobulina, un dominio CH2 y un dominio CH3, y preferiblemente carece del dominio CH1.

La clase de inmunoglobulina a partir de la cual se deriva la región constante de cadena pesada puede ser IgG (Igy) (subclases Y 1, 2, 3 ó 4). Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de Fc.gamma.-1 humano se exponen en las SEQ ID NO: 5 y 6. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de Fc�-2a murino se exponen en SEQ ID NO: 7 y 8. Pueden usarse otras clases de inmunoglobulina, IgA (Ig�), IgD (Ig�), IgE (Ig) e IgM (Ig). La elección de las regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina apropiadas se comenta en detalle en las patentes estadounidenses n.os 5.541.087 y 5.726.044. Se considera que la elección de las secuencias de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina particulares a partir de determinadas clases y subclases de inmunoglobulina para lograr un resultado particular está dentro del nivel de experiencia en la técnica. La parte del constructo de ADN que codifica para la región Fc de inmunoglobulina comprende preferiblemente al menos una parte de un dominio de bisagra, y preferiblemente al menos una parte de un dominio CH3 de Fc� o los dominios homólogos de cualquiera de IgA, IgD, IgE o IgM.

Además, se contempla que la sustitución o deleción de aminoácidos dentro de las regiones constantes de cadena pesada de inmunoglobulina puede ser útil en la práctica de la invención. Un ejemplo será introducir sustituciones de aminoácido en la parte superior de la región CH2 para crear una variante de Fc con afinidad reducida por receptores de Fc (Cole et al. (1997) J. IMMUNOL. 159:3613). Un experto habitual en la técnica puede preparar tales constructos usando técnicas de biología molecular bien conocidas.

En la presente invención, las formas modificadas de los polipéptidos solubles objeto comprenden un dominio extracelular de una proteína EphB4 fusionado a albúmina o un fragmento de la misma. Tal como se usa en el presente documento, “albúmina” se refiere de manera colectiva a proteína o secuencia de aminoácidos de albúmina,

o a un fragmento o variante de albúmina, que tiene una o más actividades funcionales (por ejemplo, actividades biológicas) de albúmina. En particular, “albúmina” se refiere a albúmina humana o fragmentos de la misma (véanse los documentos EP 201 239, EP 322 094, WO 97/24445, WO95/23857) especialmente la forma madura de albúmina humana, o albúmina de otros vertebrados o fragmentos de la misma, o análogos o variantes de esas moléculas o fragmentos de las mismas.

La presente invención describe que tales proteínas de fusión son más estables con respecto a la proteína soluble de tipo natural correspondiente. Por ejemplo, el polipéptido soluble objeto (por ejemplo, un ectodominio de EphB4) puede fusionarse con albúmina sérica humana (HSA), albúmina sérica bovina (BSA), o cualquier fragmento de una proteína albúmina que tiene actividad de estabilización. Tales dominios estabilizantes incluyen albúmina sérica humana (HSA) y albúmina sérica bovina (BSA).

En particular, las proteínas de fusión con albúmina de la invención pueden incluir variantes polimórficas que se producen de manera natural de albúmina humana y fragmentos de albúmina humana (véase el documento WO 95/23857), por ejemplo los fragmentos dados a conocer en el documento EP 322094 (concretamente HA (Pn), en el que n es de 369 a 419). La albúmina puede derivarse de cualquier vertebrado, especialmente cualquier mamífero, por ejemplo ser humano, vaca, oveja o cerdo. Las albúminas no de mamífero incluyen, pero no se limitan a, gallina y salmón. La parte de albúmina de la proteína de fusión con albúmina puede ser de un animal diferente de la EphB4.

En algunas realizaciones, la parte de proteína albúmina de una proteína de fusión con albúmina corresponde a un fragmento de albúmina sérica. Los fragmentos de polipéptidos de albúmina sérica incluyen polipéptidos que tienen uno o más residuos delecionados del extremo amino-terminal o del extremo C-terminal. De manera general, un fragmento o variante de HA tendrá al menos 100 aminoácidos de longitud, preferiblemente al menos 150 aminoácidos de longitud. La variante de HA puede consistir en, o alternativamente comprender, al menos un

dominio completo de HA. Los dominios, con referencia a SEQ ID NO: 18 en la publicación de patente estadounidense n.º 2004/0171123, son los siguientes: dominios 1 (aminoácidos 1-194), 2 (aminoácidos 195-387), 3 (aminoácidos 388-585), 1+2 (1-387), 2+3 (195-585) o 1+3 (aminoácidos 1-194 + aminoácidos 388-585). Cada dominio está constituido a su vez por dos subdominios homólogos, concretamente 1-105, 120-194, 195-291, 316387, 388-491 y 512-585, con regiones de ligador entre subdominios flexibles que comprenden los residuos Lys106 a Glu119, Glu292 a Va1315 y Glu492 a Ala511.

En una realización, la fusión EphB4-HSA tiene un polipéptido soluble de EphB4 unido a una molécula de HSA, pero otras conformaciones se encuentran dentro de la invención. Por ejemplo, las proteínas de fusión EphB4-HSA pueden tener cualquiera de las siguientes fórmulas: R1-L-R2; R2-L-R1; R1-L-R2-L-R1; o R2-L-R1-L-R2; R1-R2; R2-R1; R1-R2-R1; o R2-R1-R2; en las que R1 es una secuencia de EphB4 soluble, R2 es HSA, y L es una secuencia de ligador peptídico.

En una realización específica, los dominios de EphB4 y de HSA están unidos entre sí, preferiblemente mediante una secuencia de ligador, que separa los dominios de EphB4 y de HSA una distancia suficiente como para garantizar que cada dominio se pliega apropiadamente para dar sus estructuras secundaria y terciaria. Las secuencias de ligador preferidas (1) deben adoptar una conformación extendida flexible, (2) no deben mostrar propensión a desarrollar una estructura secundaria ordenada que pueda interaccionar con los dominios de EphB4 y de HSA funcionales, y (3) debe tener un carácter hidrófobo o cargado mínimo, que pueda fomentar la interacción con los dominios de proteína funcionales. Los aminoácidos de superficie típicos en regiones de proteínas flexibles incluyen Gly, Asn y Ser. Se esperaría que permutaciones de secuencias de aminoácidos que contienen Gly, Asn y Ser satisfagan los criterios anteriores para una secuencia de ligador. También pueden usarse otros aminoácidos casi neutros, tales como Thr y Ala, en la secuencia de ligador.

En una realización específica, puede usarse una longitud de secuencia de ligador de aproximadamente 20 aminoácidos para proporcionar una separación adecuada de dominios de proteína funcionales, aunque también pueden usarse secuencias de ligador más largas o más cortas. La longitud de la secuencia de ligador que separa EphB4 y HSA puede ser de desde 5 hasta 500 aminoácidos de longitud, o más preferiblemente desde 5 hasta 100 aminoácidos de longitud. Preferiblemente, la secuencia de ligador tiene desde aproximadamente 530 aminoácidos de longitud. En realizaciones preferidas, la secuencia de ligador tiene desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 20 aminoácidos, y tiene ventajosamente desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 20 aminoácidos. Las secuencias de aminoácidos útiles como ligadores de EphB4 y HSA incluyen, pero no se limitan a, (SerGly4)y en la que y es mayor que, o igual a, 8, o Gly4SerGly5Ser. Una secuencia de ligador preferida tiene la fórmula (SerGly4)4. Otro ligador preferido tiene la secuencia ((Ser-Ser-Ser-Ser-Gly)3-Ser-Pro).

En una realización, los polipéptidos de la presente invención y las proteínas HSA están directamente fusionados sin una secuencia de ligador. En realizaciones preferidas, el extremo C-terminal de un polipéptido de EphB4 soluble puede estar directamente fusionado con el extremo N-terminal de HSA o el extremo C-terminal de HSA puede estar directamente fusionado con el extremo N-terminal de EphB4 soluble.

En algunas realizaciones, la inmunogenicidad de la unión de fusión entre HSA y EphB4 puede reducirse identificando un epítopo de célula T candidato dentro de una región de unión que abarca una proteína de fusión y cambiando un aminoácido dentro de la región de unión tal como se describe en la publicación de patente estadounidense n.º 2003/0166877.

En determinadas realizaciones, pueden producirse polipéptidos solubles (sin modificar o modificados) de la invención mediante una variedad de técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, tales polipéptidos solubles pueden sintetizarse usando técnicas de química de proteína convencionales tales como las descritas en Bodansky,

M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlín (1993) y Grant G. A. (ed.), Synthetic Peptides: A User’s Guide, W. H. Freeman and Company, Nueva York (1992). Además, hay sintetizadores peptídicos automáticos disponibles comercialmente (por ejemplo, Advanced ChemTech modelo 396; Milligen/Biosearch 9600). Alternativamente, los polipéptidos solubles, fragmentos o variantes de los mismos, puede producirse de manera recombinante usando diversos sistemas de expresión tal como se conoce bien en la técnica (véase también a continuación).

III. Ácidos nucleicos que codifican para polipéptidos solubles

En el presente documento se dan a conocer ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes que codifican para un polipéptido soluble de EphB4 o de efrina B2. Los ácidos nucleicos objeto pueden ser moléculas de ADN o ARN, de cadena sencilla o de cadena doble. Estos ácidos nucleicos son útiles como agentes terapéuticos. Por ejemplo, estos ácidos nucleicos son útiles en la preparación de polipéptidos solubles recombinantes que se administran a una célula o un individuo como productos terapéuticos. Alternativamente, estos ácidos nucleicos pueden administrarse directamente a una célula o un individuo como productos terapéuticos tal como en terapia génica.

Se dan a conocer secuencias de ácido nucleico aisladas o recombinantes que son idénticas en al menos el 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o el 100% a una región de la secuencia de nucleótidos representada en SEQ ID

NO: 6-9. Un experto habitual en la técnica apreciará que también se dan a conocer secuencias de ácido nucleico complementarias a los ácidos nucleicos objeto, y variantes de los ácidos nucleicos objeto. Las secuencias de ácido nucleico pueden estar aisladas, ser recombinantes y/o estar fusionadas con una secuencia de nucleótidos heteróloga, o en una biblioteca de ADN.

Los ácidos nucleicos dados a conocer en el presente documento también incluyen secuencias de nucleótidos que se hibridan en condiciones de alta rigurosidad con la secuencia de nucleótidos representada en SEQ ID NO: 6-9, o secuencias complementarias de la misma. Tal como se comentó anteriormente, un experto habitual en la técnica entenderá fácilmente que las condiciones de rigurosidad apropiadas que fomentan la hibridación de ADN pueden variarse. Un experto habitual en la técnica entenderá fácilmente que las condiciones de rigurosidad apropiadas que fomentan la hibridación de ADN pueden variarse. Por ejemplo, puede realizarse la hibridación a 6,0 x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido por un lavado con 2,0 x SSC a 50ºC. Por ejemplo, la concentración de sal en la etapa de lavado puede seleccionarse de desde un baja rigurosidad de aproximadamente 2,0 x SSC a 50ºC hasta una alta rigurosidad de aproximadamente 0,2 x SSC a 50ºC. Además, la temperatura en la etapa de lavado puede aumentarse desde condiciones de baja rigurosidad a temperatura ambiente, a aproximadamente 22ºC, hasta condiciones de alta rigurosidad a aproximadamente 65ºC. Tanto la temperatura como la sal pueden variarse, o la temperatura o la concentración de sal pueden mantenerse constantes mientras se cambia la otra variable. Se dan a conocer ácidos nucleicos que se hibridan en condiciones de baja rigurosidad de 6 x SSC a temperatura ambiente seguido por un lavado a 2 x SSC a temperatura ambiente.

También se dan a conocer ácidos nucleicos aislados que se diferencian de los ácidos nucleicos objeto debido a degeneración en el código genético. Por ejemplo, varios aminoácidos se designan por más de un triplete. Codones que especifican el mismo aminoácido, o sinónimos (por ejemplo, CAU y CAC son sinónimos para histidina), pueden dar como resultado mutaciones “silenciosas” que no afectan a la secuencia de aminoácidos de la proteína. Sin embargo, se espera que existan entre células de mamífero polimorfismos de la secuencia de ADN que sí conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos de las proteínas objeto. Un experto en la técnica apreciará que estas variaciones de uno o más nucleótidos (hasta aproximadamente el 3-5% de los nucleótidos) de los ácidos nucleicos que codifican para una proteína particular pueden existir entre individuos de una especie dada debido a variación alélica natural. Se contemplan todas y cada una de tales variaciones de nucleótido y polimorfismos de aminoácidos resultantes.

Los ácidos nucleicos recombinantes pueden estar operativamente unidos a una o más secuencias de nucleótidos reguladoras en un constructo de expresión. Las secuencias de nucleótidos reguladoras serán generalmente apropiadas para una célula huésped usada para la expresión. En la técnica se conocen numerosos tipos de vectores de expresión apropiados y secuencias reguladoras adecuadas para una variedad de células huésped. Normalmente, dichas una o más secuencias de nucleótidos reguladoras pueden incluir, pero no se limitan a, secuencias promotoras, secuencias líder o señal, sitios de unión al ribosoma, secuencias de inicio y terminación de la transcripción, secuencias de inicio y terminación de la traducción, y secuencias potenciadoras o activadoras. La invención contempla promotores constitutivos o inducibles tal como se conocen en la técnica. Los promotores pueden ser o bien promotores que se producen de manera natural o bien promotores híbridos que combinan elementos de más de un promotor. Un constructo de expresión puede estar presente en una célula en un episoma, tal como un plásmido, o el constructo de expresión puede insertarse en un cromosoma. El vector de expresión puede contener un gen de marcador de selección para permitir la selección de células huésped transformadas. Los genes de marcador de selección se conocen bien en la técnica y variarán con la célula huésped usada.

El ácido nucleico objeto puede proporcionarse en un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido soluble de EphB4 o de efrina B2 y operativamente unida a al menos una secuencia reguladora. Las secuencias reguladoras se reconocen en la técnica y se seleccionan para dirigir la expresión del polipéptido soluble. Por consiguiente, el término secuencia reguladora incluye promotores, potenciadores, y otros elementos de control de la expresión. Se describen secuencias reguladoras a modo de ejemplo en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990). Por ejemplo, puede usarse cualquiera de una amplia variedad de secuencias de control de la expresión que controlan la expresión de una secuencia de ADN cuando se unen operativamente a la misma en estos vectores para expresar secuencias de ADN que codifican para un polipéptido soluble. Tales secuencias de control de la expresión útiles incluyen, por ejemplo, los promotores temprano y tardío de SV40, promotor tet, promotor temprano inmediato de adenovirus o citomegalovirus, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC o TRC, promotor de T7 cuya expresión se dirige mediante ARN polimerasa de T7, las regiones principales de operador y promotor de fago lambda, las regiones de control para la proteína de recubrimiento fd, el promotor para 3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glicolíticas, los promotores de fosfatasa ácida, por ejemplo, Pho5, los promotores de los factores de apareamiento � de levadura, el promotor poliédrico del sistema de baculovirus y otras secuencias conocidas que se sabe que controlan la expresión de genes de células procariotas o eucariotas o sus virus, y diversas combinaciones de los mismos. Debe entenderse que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que va a transformarse y/o el tipo de proteína que se desea expresar. Además, también deben considerarse el número de copias del vector, la capacidad para controlar el número de copias y la expresión de cualquier otra proteína codificada por el vector, tal como marcadores antibióticos.

En el presente documento también se da a conocer una célula huésped transfectada con un gen recombinante que incluye una secuencia codificante para uno o más de los polipéptidos solubles objeto. La célula huésped puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, un polipéptido soluble de la invención puede expresarse en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto (por ejemplo, usando un sistema de expresión de baculovirus), levaduras o células de mamífero. Los expertos en la técnica también conocen otras células huésped adecuadas.

También se dan a conocer métodos de producción de los polipéptidos solubles objeto. Por ejemplo, una célula huésped transfectada con un vector de expresión que codifica para un polipéptido soluble de EphB4 puede cultivarse en condiciones apropiadas para permitir que se produzca la expresión del polipéptido soluble de EphB4. El polipéptido soluble de EphB4 puede secretarse y aislarse a partir de una mezcla de células y medio que contiene los polipéptidos solubles. Alternativamente, los polipéptidos solubles pueden retenerse en el citoplasma o en una fracción de membrana y recogerse las células, someterse a lisis y aislarse la proteína. Un cultivo celular incluye células huésped, medios y otros subprodutos. En la técnica se conocen bien medios adecuados para cultivo celular. Los polipéptidos solubles pueden aislarse del medio de cultivo celular, células huésped o ambos usando técnicas conocidas en la técnica para purificar proteínas, incluyendo cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel, ultrafiltración, electroforesis y purificación por inmunoafinidad con anticuerpos específicos para epítopos particulares de los polipéptidos solubles. El polipéptido soluble puede ser una proteína de fusión que contiene un dominio que facilita su purificación.

Puede producirse un ácido nucleico recombinante ligando el gen clonado, o una parte del mismo, en un vector adecuado para la expresión o bien en células procariotas, células eucariotas (levaduras, células de ave, de insecto o de mamífero), o bien ambas. Los vehículos de expresión para la producción de un polipéptido soluble recombinante incluyen plásmidos y otros vectores. Por ejemplo, los vectores adecuados incluyen plásmidos de los tipos: plásmidos derivados de pBR322, plásmidos derivados de pEMBL, plásmidos derivados de pEX, plásmidos derivados de pBTac y plásmidos derivados de pUC para la expresión en células procariotas, tales como E. coli.

Los vectores de expresión de mamífero preferidos contienen tanto secuencias procariotas para facilitar la propagación del vector en bacterias como una o más unidades de transcripción eucariotas que se expresan en células eucariotas. Los vectores derivados de pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo y pHyg son ejemplos de vectores de expresión de mamífero adecuados para la transfección de células eucariotas. Algunos de estos vectores se modifican con secuencias de plásmidos bacterianos, tales como pBR322, para facilitar la replicación y selección por resistencia a fármacos en células tanto procariotas como eucariotas. Alternativamente, pueden usarse derivados de virus tales como el virus del papiloma bovino (BPV-1) o el virus de Epstein-Barr (pHEBo, derivado de pREP y p205) para la expresión transitoria de proteínas en células eucariotas. Puede encontrarse ejemplos de otros sistemas de expresión virales (incluyendo retrovirales) a continuación en la descripción de sistemas de administración de terapia génica. Los diversos métodos empleados en la preparación de los plásmidos y la transformación de organismos huésped se conocen bien en la técnica. Para otros sistemas de expresión adecuados para células tanto procariotas como eucariotas, así como procedimientos recombinantes generales, véase Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2ª ed., ed. por Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), capítulos 16 y 17. En algunos casos, puede ser deseable expresar el polipéptido SLC5A8 recombinante mediante el uso de un sistema de expresión de baculovirus. Los ejemplos de tales sistemas de expresión de baculovirus incluyen vectores derivados de pVL (tales como pVL1392, pVL1393 y pVL941), vectores derivados de pAcUW (tales como pAcUW1), y vectores derivados de pBlueBac (tales como pBlueBac III que contiene -gal).

Se conocen bien técnicas para preparar genes de fusión. Esencialmente, la unión de diversos fragmentos de ADN que codifican para diferentes secuencias de polipéptido se realiza según técnicas convencionales, empleando extremos terminales romos o en bisel para la ligación, digestión por enzimas de restricción para proporcionar extremos terminales apropiados, relleno de extremos cohesivos según sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar la unión no deseada, y ligamiento enzimático. El gen de fusión puede sintetizarse mediante técnicas convencionales incluyendo sintetizadores de ADN automáticos. Alternativamente, puede llevarse a cabo la amplificación por PCR de fragmentos génicos usando cebadores de anclaje que dan lugar a proyecciones complementarias entre dos fragmentos génicos consecutivos que posteriormente pueden hibridarse para generar una secuencia génica quimérica (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992).

IV. Ensayos de selección de fármacos

Hay numerosos enfoques para seleccionar agentes terapéuticos polipeptídicos como antagonistas de EphB4, efrina B2 o ambas. Por ejemplo, puede llevarse a cabo selección de alto rendimiento de compuestos o moléculas para identificar agentes o fármacos que inhiben la angiogénesis o inhiben el crecimiento tumoral. Los agentes de prueba pueden ser cualquier producto químico (elemento, molécula, compuesto, fármaco), preparado de manera sintética, preparado mediante técnicas recombinantes o aislado de una fuente natural. Por ejemplo, los agentes de prueba pueden ser péptidos, polipéptidos, peptoides, azúcares, hormonas o moléculas de ácido nucleico. Además, los agentes de prueba pueden ser moléculas pequeñas o moléculas de mayor complejidad preparadas mediante

química combinatoria, por ejemplo, y compiladas en bibliotecas. Estas bibliotecas pueden comprender, por ejemplo, alcoholes, haluros de alquilo, aminas, amidas, ésteres, aldehídos, éteres y otras clases de compuestos orgánicos. Los agentes de prueba también pueden ser productos naturales o modificados por ingeniería genética aislados de lisados o medios de crecimiento de células (bacterianas, de animales o vegetales) o pueden ser los propios lisados o medios de crecimiento de células. La presentación de compuestos de prueba al sistema de prueba puede ser o bien en forma aislada o bien como mezclas de compuestos, especialmente en etapas de selección iniciales.

Por ejemplo, puede llevarse a cabo un ensayo para seleccionar compuestos que inhiben específicamente la unión de efrina B2 (ligando) a EphB4 (receptor), o viceversa, por ejemplo, mediante inhibición de la unión de proteínas de fusión ligando- o receptor-Fc marcadas a células inmortalizadas. Entonces pueden someterse a prueba los compuestos identificados mediante esta selección en animales para evaluar su actividad anti-angiogénesis o antitumoral in vivo.

En un ensayo para identificar una sustancia que interfiere con la interacción de dos moléculas de superficie celular (por ejemplo, efrina B2 y EphB4), se ponen en contacto muestras de células que expresan un tipo de molécula de superficie celular (por ejemplo, EphB4) o bien con ligando marcado (por ejemplo, efrina B2, o una parte soluble de la misma, o una proteína de fusión tal como una fusión del dominio extracelular y el dominio Fc de IgG) o bien ligando marcado más un compuesto de prueba (o grupo de compuestos de prueba). Se determina la cantidad de ligando marcado que se ha unido a las células. Una menor cantidad de marcador (en la que el marcador puede ser, por ejemplo, un isótopo radiactivo, un marcador fluorescente o colorimétrico) en la muestra que se pone en contacto con el/los compuesto(s) de prueba es una indicación de que el/los compuesto(s) de prueba interfiere(n) con la unión. El ensayo recíproco usando células que expresan un ligando (por ejemplo, un ligando efrina B2 o una forma soluble del mismo) puede usarse para someter a prueba una sustancia que interfiere con la unión de un receptor Eph o parte soluble del mismo.

Puede realizarse un ensayo para identificar una sustancia que interfiere con la interacción entre un receptor Eph y una efrina con el componente (por ejemplo, células, proteína purificada, incluyendo proteínas de fusión y partes que tienen actividad de unión) que no va a entrar en competencia con un compuesto de prueba, unido a un soporte sólido. El soporte sólido puede ser cualquier matriz o fase sólida adecuada, tal como una perla, la pared de una placa u otra superficie adecuada (por ejemplo, un pocillo de una placa de microtitulación), vidrio poroso de columna (CPG) o un pasador que puede sumergirse en una disolución, tal como en un pocillo. La unión de células o proteína purificada al soporte sólido puede ser o bien directa o bien a través de una o más moléculas ligadoras.

Una proteína aislada o purificada (por ejemplo, un receptor Eph o una efrina) puede inmovilizarse sobre una matriz de afinidad adecuada mediante técnicas convencionales, tales como reticulación química, o mediante un anticuerpo preparado contra la proteína aislada o purificada, y unido a un soporte sólido. La matriz puede empaquetarse en una columna u otro recipiente adecuado y se pone en contacto con uno o más compuestos (por ejemplo, una mezcla) que van a someterse a prueba en condiciones adecuadas para la unión del compuesto a la proteína. Por ejemplo, puede hacerse que una disolución que contiene compuestos fluya a través de la matriz. Puede lavarse la matriz con un tampón de lavado adecuado para eliminar compuestos no unidos y compuestos unidos de manera no específica. Pueden liberarse los compuestos que siguen unidos mediante un tampón de elución adecuado. Por ejemplo, un cambio en la concentración iónica o el pH del tampón de elución puede conducir a una liberación de compuestos. Alternativamente, el tampón de elución puede comprender un componente o componentes de liberación diseñados para alterar la unión de compuestos (por ejemplo, uno o más ligandos o receptores, según sea apropiado, o análogos de los mismos que pueden alterar la unión o inhibir de manera competitiva la unión del compuesto de prueba a la proteína).

Pueden prepararse proteínas de fusión que comprenden la totalidad, o una parte, de una proteína (por ejemplo, un receptor Eph o una efrina) unida a un segundo resto que no se produce en esa proteína tal como se encuentra en la naturaleza, para su uso en otro método. Las proteínas de fusión adecuadas para este fin incluyen aquellas en las que el segundo resto comprende un ligando de afinidad (por ejemplo, una enzima, un antígeno, un epítopo). Las proteínas de fusión pueden producirse insertando la proteína (por ejemplo, un receptor Eph o una efrina) o una parte de la misma en un vector de expresión adecuado que codifica para un ligando de afinidad. El vector de expresión puede introducirse en una célula huésped adecuada para la expresión. Se rompen las células huésped y el material celular, que contiene proteína de fusión, puede unirse a una matriz de afinidad adecuada poniendo en contacto el material celular con una matriz de afinidad en condiciones suficientes para la unión de la parte de ligando de afinidad de la proteína de fusión a la matriz de afinidad.

Puede inmovilizarse una proteína de fusión en una matriz de afinidad adecuada en condiciones suficientes para unir la parte de ligando de afinidad de la proteína de fusión a la matriz, y se pone en contacto con uno o más compuestos (por ejemplo, una mezcla) que van a someterse a prueba, en condiciones adecuadas para la unión de compuestos a la parte de proteína de receptor o ligando de la proteína de fusión unida. A continuación, puede lavarse la matriz de afinidad con proteína de fusión unida con un tampón de lavado adecuado para eliminar compuestos no unidos y compuestos unidos de manera no específica sin alterar significativamente la unión de compuestos unidos específicamente. Los compuestos que permanecen unidos pueden liberarse poniendo en contacto la matriz de afinidad que tiene proteína de fusión unida a la misma con un tampón de elución adecuado (un tampón de elución

de compuesto). El tampón de elución de compuesto puede formularse para permitir la retención de la proteína de fusión mediante la matriz de afinidad, pero puede formularse para interferir con la unión del/de los compuesto(s) sometido(s) a prueba con la parte de proteína de receptor o ligando de la proteína de fusión. Por ejemplo, un cambio en la concentración iónica o el pH del tampón de elución puede conducir a la liberación de compuestos, o el tampón de elución puede comprender un componente o componentes de liberación diseñados para alterar la unión de compuestos a la parte de proteína de receptor o ligando de la proteína de fusión (por ejemplo, uno o más ligandos o receptores o análogos de los mismos que pueden alterar la unión de compuestos a la parte de proteína de receptor

o ligando de la proteína de fusión). La inmovilización puede realizarse antes de, simultáneamente con, o después de la puesta en contacto de la proteína de fusión con compuesto, según sea apropiado. Son posibles diversas permutaciones del método, dependiendo de factores tales como los compuestos sometidos a prueba, la matriz de afinidad seleccionada y la formulación del tampón de elución. Por ejemplo, tras la etapa de lavado, puede eluirse la proteína de fusión con compuesto unido a la misma de la matriz de afinidad con un tampón de elución adecuado (un tampón de elución de matriz). Cuando la proteína de fusión comprende un ligador escindible, tal como un sitio de escisión de trombina, la escisión del ligando de afinidad puede liberar una parte de la fusión con compuesto unido a la misma. Entonces puede liberarse compuesto unido de la proteína de fusión o su producto de escisión mediante un método apropiado, tal como extracción.

V. Métodos de tratamiento

En determinados aspectos, la presente invención se refiere a inhibir la angiogénesis, tratar determinadas enfermedades asociadas con la angiogénesis, inhibir o reducir el crecimiento tumoral y tratar a un individuo que padece cáncer. Esto puede implicar administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más agentes terapéuticos polipeptídicos de la invención. Estos aspectos de la invención pueden referirse particularmente a tratamientos terapéuticos y profilácticos de animales, y más particularmente, seres humanos.

Las enfermedades asociadas con la angiogénesis que van a tratarse según la invención son cáncer dependiente de angiogénesis, incluyendo, por ejemplo, tumores sólidos, tumores de origen sanguíneo tales como leucemias, y metástasis tumorales; tumores benignos, por ejemplo hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas y granulomas piogénicos; trastornos inflamatorios tales como inflamación inmunitaria y no inmunitaria; reumatismo articular crónico y psoriasis; enfermedades angiogénicas oculares, por ejemplo, retinopatía diabética, retinopatía de la prematuridad, degeneración macular, rechazo de injerto de córnea, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolenticular, rubeosis; síndrome de Osler-Webber; angiogénesis en el miocardio; neovascularización de placas; telangiectasia; articulaciones hemofílicas; angiofibroma; telangiectasia, psoriasis, esclerodermia, granuloma piogénico, rubeosis, artritis y neovascularización diabética.

Se entiende que las composiciones de la invención también son útiles para tratar cualquier cáncer independiente de angiogénesis (tumores). Tal como se usa en el presente documento, el término “cáncer independiente de angiogénesis” se refiere a un cáncer (tumor) en el que no hay ninguna, o hay poca, neovascularización en el tejido tumoral.

En particular, los agentes terapéuticos polipeptídicos de la presente invención son útiles para tratar o prevenir un cáncer (tumor), incluyendo, pero sin limitarse a, carcinoma de colon, cáncer de mama, mesotelioma, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, carcinoma de células escamosas de la cabeza y el cuello (HNSCC), sarcoma de Kaposi y leucemia.

Uno o más agentes terapéuticos polipeptídicos pueden administrarse juntos (simultáneamente) o en momentos diferentes (secuencialmente). Además, pueden administrarse agentes terapéuticos polipeptídicos con otro tipo de compuestos para tratar cáncer o para inhibir la angiogénesis.

En determinadas realizaciones, los polipéptidos de la invención pueden usarse solos. Alternativamente, los polipéptidos pueden usarse en combinación con otros enfoques terapéuticos anticancerosos convencionales dirigidos al tratamiento o la prevención de trastornos proliferativos (por ejemplo, tumor). Por ejemplo, tales polipéptidos pueden usarse en la prevención profiláctica de cáncer, prevención de recidiva de cáncer y metástasis tras la cirugía, y como adyuvante de otra terapia contra el cáncer convencional. La presente invención reconoce que la eficacia de las terapias contra el cáncer convencionales (por ejemplo, quimioterapia, radioterapia, fototerapia, inmunoterapia y cirugía) puede potenciarse mediante el uso de un agente terapéutico polipeptídico objeto.

Se ha mostrado que una amplia variedad de compuestos convencionales tienen actividades antineoplásicas. Estos compuestos se han usado como agentes farmacéuticos en quimioterapia para reducir tumores sólidos, prevenir metástasis y crecimiento adicional, o disminuir el número de células malignas en tumores malignos leucémicos o de médula ósea. Aunque la quimioterapia ha sido eficaz en el tratamiento de diversos tipos de tumores malignos, muchos compuestos antineoplásicos inducen efectos secundarios no deseados. Se ha mostrado que cuando se combinan dos o más tratamientos diferentes, los tratamientos pueden funcionar de manera sinérgica y permitir la reducción de la dosificación de cada uno de los tratamientos, reduciendo así los efectos secundarios perjudiciales producidos por cada compuesto a dosificaciones superiores. En otros casos, los tumores malignos que son resistentes a un tratamiento pueden responder a una terapia de combinación de dos o más tratamientos diferentes.

Cuando se administra un agente terapéutico polipeptídico de la presente invención en combinación con otro agente antineoplásico convencional, ya sea de manera concomitante o secuencial, se muestra que tal agente terapéutico potencia el efecto terapéutico del agente antineoplásico o supera la resistencia celular frente a tal agente antineoplásico. Esto permite la disminución de la dosificación de un agente antineoplásico, reduciendo así los efectos secundarios no deseados, o restablece la eficacia de un agente antineoplásico en células resistentes.

Los compuestos farmacéuticos que pueden usarse para la terapia antitumoral combinatoria incluyen, simplemente para ilustrar: aminoglutetimida, amsacrina, anastrozol, asparaginasa, bcg, bicalutamida, bleomicina, buserelina, busulfano, camptotecina, capecitabina, carboplatino, carmustina, clorambucilo, cisplatino, cladribina, clodronato, colchicina, ciclofosfamida, ciproterona, citarabina, dacarbazina, dactinomicina, daunorubicina, dienestrol, dietilstilbestrol, docetaxel, doxorubicina, epirubicina, estradiol, estramustina, etopósido, exemestano, filgrastim, fludarabina, fludrocortisona, fluorouracilo, fluoximesterona, flutamida, gemcitabina, genisteína, goserelina, hidroxiurea, idarubicina, ifosfamida, imatinib, interferón, irinotecán, ironotecán, letrozol, leucovorina, leuprolida, levamisol, lomustina, mecloretamina, medroxiprogesterona, megestrol, melfalán, mercaptopurina, mesna, metotrexato, mitomicina, mitotano, mitoxantrona, nilutamida, nocodazol, octreotida, oxaliplatino, paclitaxel, pamidronato, pentostatina, plicamicina, porfímero, procarbazina, raltitrexed, rituximab, estreptozocina, suramina, tamoxifeno, temozolomida, tenipósido, testosterona, tioguanina, tiotepa, dicloruro de titanoceno, topotecán, trastuzumab, tretinoína, vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina.

Estos compuestos antitumorales quimioterápicos pueden clasificarse por su mecanismo de acción, por ejemplo, en los siguientes grupos: anti-metabolitos/agentes anticancerosos, tales como análogos de pirimidina (5-fluorouracilo, floxuridina, capecitabina, gemcitabina y citarabina) y análogos de purina, antagonistas de folato e inhibidores relacionados (mercaptopurina, tioguanina, pentostatina y 2-clorodesoxiadenosina (cladribina)); agentes antiproliferativos/antimitóticos incluyendo productos naturales tales como alcaloides de la vinca (vinblastina, vincristina y vinorelbina), alteradores de microtúbulos tales como taxano (paclitaxel, docetaxel), vincristina, vinblastina, nocodazol, epotilonas y navelbina, epidipodofilotoxinas (etopósido, tenipósido), agentes de daño del ADN (actinomicina, amsacrina, antraciclinas, bleomicina, busulfano, camptotecina, carboplatino, clorambucilo, cisplatino, ciclofosfamida, Cytoxan, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina, epirubicina, hexametilmelamina, oxaliplatino, ifosfamida, melfalán, mecloretamina, mitomicina, mitoxantrona, nitrosourea, plicamicina, procarbazina, taxol, Taxotere, tenipósido, trietilentiofosforamida y etopósido (VP16)); antibióticos tales como dactinomicina (actinomicina D), daunorubicina, doxorubicina (adriamicina), idarubicina, antraciclinas, mitoxantrona, bleomicinas, plicamicina (mitramicina) y mitomicina; enzimas (L-asparaginasa que metaboliza de manera sistémica L-asparagina y priva a las células que no tienen la capacidad de sintetizar su propia asparagina); agentes antiplaquetarios; agentes alquilantes antiproliferativos/antimitóticos tales como mostazas nitrogenadas (mecloretamina, ciclofosfamida y análogos, melfalán, clorambucilo), etileniminas y metilmelaminas (hexametilmelamina y tiotepa), alquilsulfonatos, busulfano, nitrosoureas (carmustina (BCNU) y análogos, estreptozocina), tracenos - dacarbazinina (DTIC); antimetabolitos antiproliferativos/antibióticos tales como análogos de ácido fólico (metotrexato); complejos de coordinación de platino (cisplatino, carboplatino), procarbazina, hidroxiurea, mitotano, aminoglutetimida; hormonas, análogos de hormonas (estrógeno, tamoxifeno, goserelina, bicalutamida, nilutamida) e inhibidores de aromatasa (letrozol, anastrozol); anticoagulantes (heparina, sales de heparina sintéticas y otros inhibidores de trombina); agentes fibrinolíticos (tales como activador de plasminógeno tisular, estreptocinasa y urocinasa), aspirina, dipiridamol, ticlopidina, clopidogrel, abciximab; agentes antimigración; agentes antisecretores (breveldina); inmunosupresores (ciclosporina, tacrolimús (FK-506), sirolimús (rapamicina), azatioprina, micofenolato de mofetilo); compuestos antiangiogénicos (TNP-470, genisteína) e inhibidores de factor de crecimiento (inhibidores de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), inhibidores de factor de crecimiento de fibroblastos (FGF)); bloqueante del receptor de angiotensina; donadores de óxido nítrico; oligonucleótidos antisentido; anticuerpos (trastuzumab); inhibidores del ciclo celular e inductores de la diferenciación (tretinoína); inhibidores de mTOR, inhibidores de topoisomerasa (doxorubicina (adriamicina), amsacrina, camptotecina, daunorubicina, dactinomicina, enipósido, epirubicina, etopósido, idarubicina y mitoxantrona, topotecán, irinotecán), corticosteroides (cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisona y prenisolona); inhibidores de cinasa de transducción de señales de factor de crecimiento; inductores de disfunción mitocondrial y activadores de caspasa; y alteradores de cromatina.

En determinadas realizaciones, los compuestos farmacéuticos que pueden usarse para la terapia anti-angiogénesis combinatoria incluyen: (1) inhibidores de la liberación de “moléculas angiogénicas”, tales como bFGF (factor de crecimiento de fibroblastos básico); (2) neutralizantes de moléculas angiogénicas, tales como anticuerpos antibFGF; y (3) inhibidores de respuesta de células endoteliales a estímulos angiogénicos, incluyendo inhibidor de colagenasa, inhibidores de renovación de membrana basal, esteroides angiostáticos, inhibidores de la angiogénesis derivados de hongos, factor de plaquetas 4, trombospondina, fármacos contra la artritis tales como D-penicilamina y tiomalato de oro, análogos de vitamina D3, alfa-interferón, y similares. Para inhibidores de angiogénesis propuestos adicionales, véase Blood et al., Bioch. Biophys. Acta., 1032:89-118 (1990), Moses et al., Science, 248:1408-1410 (1990), Ingber et al., Lab. Invest., 59:44-51 (1988), y las patentes estadounidenses n.os 5.092.885, 5.112.946, 5.192.744, 5.202.352 y 6573256. Además, hay una amplia variedad de compuestos que pueden usarse para inhibir la angiogénesis, por ejemplo, péptidos o agentes que bloquean la ruta de angiogénesis mediada por VEGF, proteína endostatina o derivados, fragmentos de unión a lisina de angiostatina, melanina o compuestos promotores de melanina, fragmentos de plasminógeno (por ejemplo, Kringles 1-3 de plasminógeno), subunidades de tropoína,

antagonistas de vitronectina �v3, péptidos derivados de saposina B, antibióticos o análogos (por ejemplo, tetraciclina o neomicina), composiciones que contienen dienogest, compuestos que comprenden un núcleo inhibidor de MetAP-2 acoplado a un péptido, el compuesto EM-138, chalcona y sus análogos, e inhibidores de naaladasa. Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 6.395.718, 6.462.075, 6.465.431, 6.475.784, 6.482.802, 6.482.810, 6.500.431, 6.500.924, 6.518.298, 6.521.439, 6.525.019, 6.538.103, 6.544.758, 6.544.947, 6.548.477,

6.559.126 y 6.569.845.

Dependiendo de la naturaleza de la terapia combinatoria, puede continuarse la administración de los agentes terapéuticos polipeptídicos de la invención mientras está administrándose la otra terapia y/o después de ello. La administración de los agentes terapéuticos polipeptídicos puede realizarse en una única dosis o en múltiples dosis. En algunos casos, la administración de los agentes terapéuticos polipeptídicos se comienza al menos varios días antes de la terapia convencional, mientras que en otros casos la administración se comienza o bien inmediatamente antes o bien en el momento de la administración de la terapia convencional.

VI. Métodos de administración y composiciones farmacéuticas

En determinadas realizaciones, los agentes terapéuticos polipeptídicos objeto de la presente invención se formulan con un portador farmacéuticamente aceptable. Tales agentes terapéuticos pueden administrarse solos o como un componente de una formulación farmacéutica (composición). Los compuestos pueden formularse para su administración de cualquier manera conveniente para su uso en medicina para seres humanos o veterinaria. También pueden estar presentes en las composiciones agentes de humectación, emulsionantes y lubricantes, tales como laurilsulfato de sodio y estearato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, edulcorantes, aromatizantes y agentes perfumantes, conservantes y antioxidantes.

Las formulaciones de los agentes terapéuticos polipeptídicos objeto incluyen aquellas adecuadas para la administración oral/nasal, tópica, parenteral, rectal y/o intravaginal. Las formulaciones pueden presentarse de manera conveniente en forma farmacéutica unitaria y pueden prepararse mediante cualquier método bien conocido en la técnica de la farmacia. La cantidad de principio activo que puede combinarse con un material portador para producir una forma farmacéutica individual variará dependiendo del huésped que está tratándose, el modo de administración particular. La cantidad de principio activo que puede combinarse con un material portador para producir una forma farmacéutica individual será generalmente la cantidad del compuesto que produce un efecto terapéutico.

Los métodos de preparación de estas formulaciones o composiciones pueden incluir combinar otro tipo de agente terapéutico antitumoral o anti-angiogénesis y un portador y, opcionalmente, uno o más componentes auxiliares. En general, las formulaciones pueden prepararse con un portador líquido, o un portador sólido finamente dividido, o ambos, y después, si es necesario, conformar el producto.

Las formulaciones para administración oral pueden estar en forma de cápsulas, sellos, píldoras, comprimidos, pastillas para chupar (usando una base aromatizada, habitualmente sacarosa y goma arábiga o tragacanto), polvos, gránulos, o como disolución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, o como emulsión líquida de aceite en agua o de agua en aceite, o como elixir o jarabe, o como pastillas (usando una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y goma arábiga) y/o como enjuagues bucales y similares, conteniendo, cada una, una cantidad predeterminada de un agente terapéutico polipeptídico objeto como principio activo.

En formas farmacéuticas sólidas para administración oral (cápsulas, comprimidos, píldoras, grageas, polvos, gránulos y similares), pueden mezclarse uno o más agentes terapéuticos polipeptídicos de la presente invención con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables, tales como citrato de sodio o fosfato de dicalcio y/o cualquiera de los siguientes: (1) cargas o extendedores, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y/o ácido silícico; (2) aglutinantes, tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y/o goma arábiga; (3) humectantes, tales como glicerol; (4) agentes disgregantes, tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, determinados silicatos y carbonato de sodio; (5) agentes retardantes de la disolución, tales como parafina; (6) aceleradores de la absorción, tales como compuestos de amonio cuaternario; (7) agentes de humectación, tales como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol; (8) absorbentes, tales como caolín y arcilla bentonita; (9) lubricantes, tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato de sodio, y mezclas de los mismos; y (10) agentes colorantes. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, las composiciones farmacéuticas también pueden comprender agentes tamponantes. También pueden emplearse composiciones sólidas de tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina rellenas blandas y duras usando excipientes tales como lactosa o azúcares de la leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.

Las formas farmacéuticas líquidas para administración oral incluyen emulsiones, microemulsiones, disoluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además del principio activo, las formas farmacéuticas líquidas pueden contener diluyentes inertes comúnmente usados en la técnica, tales como agua u otros disolventes, agentes de solubilización y emulsionantes, tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites

(en particular, aceites de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurílico, polietilenglicoles y ésteres de sorbitano de ácidos grasos, y mezclas de los mismos. Además de diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes tales como agentes de humectación, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, aromatizantes, colorantes, perfumantes y conservantes.

Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspensión tales como alcoholes isoestearílicos etoxilados, polioxietilensorbitol y ésteres de sorbitano, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, y mezclas de los mismos.

En particular, los polipéptidos de la invención pueden administrarse por vía tópica, o bien a la piel o bien a membranas mucosas tales como las del cuello uterino y la vagina. Esto ofrece la mayor oportunidad para una administración directa al tumor con la menor posibilidad de inducir efectos secundarios. Las formulaciones tópicas pueden incluir además uno o más de la amplia variedad de agentes que se sabe que son eficaces como potenciadores de la penetración de la piel o el estrato córneo. Ejemplos de los mismos son 2-pirrolidona, N-metil-2pirrolidona, dimetilacetamida, dimetilformamida, propilenglicol, alcohol metílico o isopropílico, dimetilsulfóxido y Azone. Pueden incluirse agentes adicionales para hacer que la formulación sea cosméticamente aceptable. Ejemplos de los mismos son grasas, ceras, aceites, colorantes, fragancias, conservantes, estabilizadores y agentes tensioactivos. También pueden incluirse agentes queratolíticos tales como los conocidos en la técnica. Ejemplos son ácido salicílico y azufre.

Las formas farmacéuticas para la administración tópica o transdérmica incluyen polvos, pulverizaciones, pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, disoluciones, parches e inhalantes. Los agentes terapéuticos polipeptídicos objeto pueden mezclarse en condiciones estériles con un portador farmacéuticamente aceptable, y con cualquier conservante, tampón o propelente que pueda requerirse. Las pomadas, pastas, cremas y geles pueden contener, además de un agente polipeptídico objeto, excipientes, tales como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidón, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco y óxido de zinc, o mezclas de los mismos.

Los polvos y las pulverizaciones pueden contener, además de un agente terapéutico polipeptídico objeto, excipientes tales como lactosa, talco, ácido silícico, hidróxido de aluminio, silicatos de calcio y polvo de poliamida, o mezclas de estas sustancias. Las pulverizaciones pueden contener adicionalmente propelentes habituales, tales como clorofluorohidrocarburos e hidrocarburos volátiles no sustituidos, tales como butano y propano.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para administración parenteral pueden comprender uno o más agentes terapéuticos polipeptídicos en combinación con una o más disoluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas, isotónicas, estériles, farmacéuticamente aceptables, o polvos estériles que pueden reconstituirse para dar disoluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes de usarse, que pueden contener antioxidantes, tampones, agentes bacteriostáticos, solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto o agentes de suspensión o espesantes. Los ejemplos de portadores acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Puede mantenerse una fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos.

Estas composiciones también pueden contener adyuvantes, tales como conservantes, agentes de humectación, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la acción de microorganismos puede garantizarse mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenol-sórbico, y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio, y similares en las composiciones. Además, puede provocarse la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable mediante la inclusión de agentes que retrasan la absorción, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

Se preparan formas de depósito inyectables formando matrices microencapsuladas de uno o más agentes terapéuticos polipeptídicos en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicolida. Dependiendo de la razón de fármaco con respecto a polímero, y la naturaleza del polímero particular empleado, puede controlarse la tasa de liberación de fármaco. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poliortoésteres y polianhídridos. También se preparan formulaciones inyectables de depósito atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con tejido corporal.

Pueden presentarse formulaciones para administración intravaginal o rectal como un supositorio, que puede prepararse mezclando uno o más compuestos de la invención con uno o más excipientes o portadores no irritantes adecuados que comprenden, por ejemplo, manteca de cacao, polietilenglicol, una cera para supositorios o un

salicilato, y que son sólidos a temperatura ambiente, pero líquidos a temperatura corporal y, por tanto, se fundirán en el recto o la cavidad vaginal y liberarán el compuesto activo.

Los agentes terapéuticos polipeptídicos de la presente invención pueden expresarse dentro de células a partir de

5 promotores eucariotas. Por ejemplo, un polipéptido soluble de EphB4 o efrina B2 puede expresarse en células eucariotas a partir de un vector apropiado. Los vectores son preferiblemente plásmidos de ADN o vectores virales. Pueden construirse vectores virales basándose en, pero sin limitarse a, virus adenoasociados, retrovirus, adenovirus

o alfavirus. Preferiblemente, los vectores se introducen de manera estable, y persisten, en células diana. Alternativamente, pueden usarse vectores virales que proporcionan una expresión transitoria. Tales vectores pueden

10 administrarse de manera repetida según sea necesario. La administración de vectores que codifican para el agente terapéutico polipeptídico objeto puede ser sistémica, tal como mediante administración intravenosa o intramuscular, mediante administración a células diana explantadas del paciente seguido por su reintroducción en el paciente, o mediante otros medios que permitirán la introducción en la célula diana deseada (para una revisión, véase Couture et al., 1996, TIG., 12, 510).

Ejemplos

La invención que se ha descrito hasta ahora en general, se entenderá más fácilmente haciendo referencia a los ejemplos siguientes, que se incluyen simplemente para fines de ilustración de determinados aspectos y

20 realizaciones de la presente invención, y no pretenden limitar la invención.

EJEMPLO DE REFERENCIA 1. Derivados solubles de los dominios extracelulares de las proteínas efrina B2 y EphB4 humanas

25 Los derivados solubles de los dominios extracelulares de las proteínas efrina B2 y EphB4 humanas representan o bien dominios extracelulares predichos de longitud completa truncados de efrina B2 (B4ECv3, B2EC) o bien fusiones traducionales de los dominios con la región constante de inmunoglobulinas humanas (fragmento Fc de IgG1), tal como B2EC-FC, B4ECv2-FC y B4ECv3-FC. Constructos de efrina B2 humana y constructos de EphB4 humana representativos se muestran en las figuras 14 y 15.

30 Se subclonaron los fragmentos de ADNc que codifican para estas proteínas recombinantes en vectores de expresión de mamíferos, expresados en líneas celulares de mamífero transfectadas de manera transitoria o estable y se purificaron hasta la homogeneidad tal como se describe en detalle en la sección de materiales y métodos (véase a continuación). Las secuencias de aminoácidos predichas de las proteínas se muestran en las figuras 1-5. Se

35 confirmaron la alta pureza de las proteínas aisladas y su reconocimiento por los anticuerpos monoclonales o policlonales anti-efrina B2 y anti-EphB4 correspondientes. Las proteínas recombinantes presentan las propiedades esperadas de unión de alta afinidad, competencia de unión y especificidad con sus parejas de unión correspondientes tal como se corroboró mediante los ensayos bioquímicos (véanse por ejemplo, las figuras 6-8).

40 Tales proteínas derivadas solubles efrina B2 y EphB4 humanas presentan actividad biológica potente en varios ensayos basados en células y ensayos in vivo que miden las actividades de angiogénesis o anticancerosas, y por tanto son candidatos de fármacos en perspectiva para terapia antiangiogénica y anticancerosa. B4ECv3 así como las proteínas B2EC y B2EC-FC bloquearon la quimiotaxis de células endoteliales humanas (tal como se somete a prueba con AEC o VEC de cordón umbilical y hepáticas), con una disminución en la degradación de la matriz

45 extracelular, Matrigel, y una disminución en la migración en respuesta a estímulos de factores de crecimiento (figuras 9-11). Las proteínas B4ECv3 y B2EC-FC tienen un efecto antiangiogénico potente tal como se demuestra por su inhibición de la formación de tubos de células endoteliales (figuras 12-13).

Puede encontrarse una descripción detallada de los materiales y métodos para este ejemplo en la publicación de 50 patente estadounidense n.º 20050084873.

La secuencia del dominio globular + dominio rico en Cys (B4EC-GC), proteína precursora es (SEQ ID NO: 12):

Para muchos usos, incluyendo el uso terapéutico, la secuencia líder (primeros 15 aminoácidos, de modo que la forma procesada comienza en Leu-Glu-Glu...) y la cola de hexahistidina C-terminal puede eliminarse u omitirse.

La secuencia de la proteína precursora GCF (SEQ ID NO: 13):

Para muchos usos, incluyendo el uso terapéutico, la secuencia líder (primeros 15 aminoácidos, de modo que la forma procesada comienza en Leu-Glu-Glu...) y la cola de hexahistidina C-terminal puede eliminarse u omitirse.

La secuencia de aminoácidos del precursor FL-hB4EC codificado (con cola de His) (SEQ ID NO: 14):

15 Para muchos usos, incluyendo el uso terapéutico, la secuencia líder (primeros 15 aminoácidos, de modo que la forma procesada comienza en Leu-Glu-Glu...) y la cola de hexahistidina C-terminal puede eliminarse u omitirse.

La proteína EphB4 CF2, precursora (SEQ ID NO: 15):

La secuencia precursora de la proteína GCF2 preferida (también denominada en el presente documento GCF2F) es (SEQ ID NO: 16):

La secuencia procesada (SEQ ID NO: 17):

Ensayos bioquímicos

10 A. Ensayo de unión

Se incubaron 10 l de Ni-NTA-agarosa en tubos de microcentrífuga con 50 l de cantidad indicada de B4ECv3 diluidos en tampón de unión BB (Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,15 M, albúmina sérica bovina al 0,1% pH 8). Tras la incubación durante 30 min en la plataforma de agitación, se lavaron las perlas de Ni-NTA dos veces con 1,4 ml de

15 BB, seguido por la aplicación de 50 l de B2-AP en la concentración final de 50 nM. Se realizó la unión durante 30 min en la plataforma de agitación, y entonces se centrifugaron los tubos y se lavaron una vez con 1,4 ml de BB. Se midió colorimétricamente la cantidad de AP precipitada tras la aplicación de PNPP.

B. Ensayo de inhibición

20 Inhibición en disolución. Se preincubaron diferentes cantidades de B4ECv3 diluidas en 50 l de BB con 50 l de reactivo B2EC-AP 5 nM (fusión proteica del ectodominio de efrina B2 con fosfatasa alcalina placentaria). Tras la incubación durante 1 h, se precipitó la B2EC-AP no unida con 5.000 células HEK293 que expresan EphB4 de longitud completa asociada a membrana durante 20 min. Se detuvo la reacción de unión mediante dilución con

25 1,2 ml de BB, seguido por centrifugación durante 10 min. Se desecharon los sobrenadantes y se midieron las actividades fosfatasa alcalina asociadas con las células recogidas añadiendo sustrato de fosfato de paranitrofenilo (PNPP).

Inhibición basada en células. Se diluyó en serie B4ECv3 en Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,15 M, BSA al 0,1%, pH 8 y se

30 mezcló con 5.000 células HEK293 que expresan efrina B2 de longitud completa asociada a membrana. Tras la incubación durante 1 h, se añadieron 50 l de reactivo B4EC-AP 5 nM (fusión proteica del ectodominio de EphB4 con fosfatasa alcalina placentaria) a cada tubo durante 30 min para detectar los sitios de unión a efrina B2 no

ocupados. Se detuvieron las reacciones de unión mediante dilución con 1,2 ml de BB y centrifugación. Se desarrolló la reacción colorimétrica de la AP precipitada de células con sustrato PNPP.

C. Ensayo de unión de B4EC-FC

Ensayo basado en proteína A-agarosa. Se incubaron 10 l de proteína A-agarosa en tubos Eppendorf con 50 l de cantidad indicada de B4EC-FC diluida en tampón de unión BB (Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,15 M, BSA al 0,1%, pH 8). Tras la incubación durante 30 min en la plataforma de agitación, se lavaron las perlas de proteína A-agarosa dos veces con 1,4 ml de BB, seguido por la aplicación de 50 l de reactivo B2ECAP a la concentración final de 50 nM. Se realizó la unión durante 30 min en la plataforma de agitación, y entonces se centrifugaron los tubos y se lavaron una vez con 1,4 ml de BB. Se midió la reacción colorimétrica de la AP precipitada tras la aplicación de PNPP (figura 6).

Ensayo basado en nitrocelulosa. Se diluyó en serie B4EC-FC en Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,15 M, BSA 50 g/ml, pH 8. Se aplicaron 2 l de cada fracción sobre la tira de nitrocelulosa y se secaron los puntos durante 3 min. Se bloqueó la tira de nitrocelulosa con leche desnatada al 5% durante 30 min, seguido por incubación con reactivo B2EC-AP 5 nM. Tras una incubación de 45 min para la unión, se lavó la nitrocelulosa dos veces con Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,15 M, BSA 50 g/ml, pH 8 y se desarrolló color mediante la aplicación del sustrato de fosfatasa alcalina Sigma Fast (Sigma).

D. Ensayo de inhibición de B4EC-FC

Inhibición en disolución. Véase anteriormente, para B4ECv3. Los resultados se muestran en la figura 7.

Inhibición basada en células. Véase anteriormente, para B4ECv3.

E. Ensayo de unión de B2EC-FC

Ensayo basado en proteína A-agarosa. Véase anteriormente, para B4EC-FC. Los resultados se muestran en la figura 8.

Ensayo basado en nitrocelulosa. Véase anteriormente, para B4EC-FC.

6) Ensayos basados en células

A. Ensayo de inhibición del crecimiento

Se siembran en placa células endoteliales de vena de cordón umbilical humanas (HUVEC) (1,5x03) en una placa de 96 pocillos en 100 l de EBM-2 (Clonetic n.º CC3162). Tras 24 horas (día 0), se añade la proteína recombinante de prueba (100 l) a cada pocillo a 2X la concentración deseada (5-7 niveles de concentración) en medio EBM-2. En el día 0, se tiñe una placa con cristal violeta al 0,5% en metanol al 20% durante 10 minutos, se aclara con agua y se seca al aire. Se incuban las placas restantes durante 72 h a 37ºC. Tras 72 h, se tiñen las placas con cristal violeta al 0,5% en metanol al 20%, se aclaran con agua y se secan al aire. Se eluye la tinción con disolución 1:1 de etanol: citrato de sodio 0,1 M (incluyendo la placa del día 0) y se mide la absorbancia a 540 nm con un lector de ELISA (Dynatech Laboratories). La absorbancia del día 0 se resta de las placas de 72 h y se representan gráficamente los datos como el porcentaje con respecto a la proliferación control (células tratadas con vehículo). Se calcula la CI50 (concentración de fármaco que produce una inhibición del 50%) a partir de los datos representados gráficamente.

B. Ensayo de formación de cordón (ensayo de formación de tubos de células endoteliales)

Se coloca Matrigel (60 l de 10 mg/ml; Collaborative Lab n.º 35423) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos helada. Se permite que la placa se asiente a temperatura ambiente durante 15 minutos, luego se incuba a 37ºC durante 30 minutos para permitir que el Matrigel polimerice. Mientras tanto, se preparan HUVEC en EGM-2 (Clonetic n.º CC3162) a una concentración de 2X105 células/ml. Se prepara el compuesto de prueba a 2X la concentración deseada (5 niveles de concentración) en el mismo medio. Se mezclan las células (500 l) y 2X fármaco (500 l) y se colocan 200 l de esta suspensión por duplicado en el Matrigel polimerizado. Tras una incubación de 24 h, se toman imágenes por triplicado para cada concentración usando un sistema de análisis de imágenes Bioquant. Se evalúa el efecto del fármaco (CI50) en comparación con los controles no tratados midiendo la longitud de los cordones formados y el número de uniones.

C. Ensayo de migración celular

Se evalúa la migración usando la cámara de Boyden de 48 pocillos y filtros de policarbonato (Osmonics, Inc.) de 8 m de tamaño de poro recubiertos con colágeno (colágeno de cola de rata 10 g/ml; Collaborative Laboratories). Los pocillos de cámara inferior reciben 27-29 l de medio DMEM solo (nivel inicial) o medio que contiene

quimioatrayentes (medio condicionado con células bFGF, VEGF o Swiss 3T3). Las cámaras superiores reciben 45 l de suspensión de células HUVEC (1X106 células/ml) preparada en DMEM+BSA al 1% con o sin compuesto de prueba. Tras una incubación de 5 h a 37ºC, se aclara la membrana en PBS, se fija y se tiñe en disoluciones de Diff-Quick. Se coloca el filtro en un portaobjetos de vidrio con las células migradas orientadas hacia abajo y se retiran las células en la parte superior usando una toallita Kimwipe. Las pruebas se realizan en 4-6 repeticiones y se cuentan cinco campos de cada pocillo. Se restan los valores de control sin estímulo negativos de los valores de control con estímulo y tratados con fármaco y se representan gráficamente los datos como la media de células migradas  D.E. Se calcula la CI50 a partir de los datos representados gráficamente.

EJEMPLO DE REFERENCIA 2. Los fragmentos de dominio extracelular del receptor EphB4 inhiben la angiogénesis y el crecimiento tumoral.

A. Se requiere el dominio globular de EphB4 para la unión a efrina B2 y para la actividad de proteínas solubles derivadas de EphB4 en un ensayo de formación de tubos endoteliales.

Para identificar el/los subdominio(s) de la parte ectópica de EphB4 necesaria y suficiente para la actividad antiangiogénica de los derivados recombinantes solubles del receptor, se produjeron y se sometieron a prueba cuatro variantes de deleción recombinantes de EphB4EC (figura 16). La parte extracelular de EphB4, de manera similar a los otros miembros de la familia de receptores EphB y EphA, contiene un dominio globular de unión a ligando N-terminal seguido por un dominio rico en cisteína y dos repeticiones de fibronectina tipo III (FNIII). Además de la proteína B4-GCF2 recombinante que contiene la parte ectópica completa de EphB4, se construyeron tres variantes de deleción de EphB4EC que contenían el dominio globular y un dominio rico en Cys (B4-GC); el dominio globular, el dominio rico en Cys y el primer dominio FNIII (GCF1) así como la versión de ECD con el dominio globular delecionado (CF2).Los intentos por producir varias versiones de la proteína EphB4EC truncada que contiene el dominio globular solo no fueron satisfactorios debido a la falta de secreción de proteínas expresadas a partir de todos estos constructos y a la ausencia de unión a ligando por las proteínas recombinantes expresadas intracelularmente. Además, se expresó una versión de B4-GCF2 sin cola, denominada GCF2-F, que contenía el dominio extracelular completo de EphB4 sin aminoácidos fusionados adicionales, se purificó y se usó en algunos de los experimentos descritos en el presente documento.

Se expresaron de manera preparativa las cuatro proteínas recombinantes con cola de 6xHis C-terminal en células de mamífero en cultivo transfectadas de manera transitoria y se purificaron por afinidad hasta la homogeneidad a partir de medios de crecimiento condicionados usando cromatografía en resina de quelato de Ni2+ (figura 17). Aparentemente debido a su glicosilación, las proteínas migran sobre el SDS-PAAG de manera algo superior a lo sugerido por sus pesos moleculares predichos de 34,7 kDa (GC), 41,5 (CF2), 45,6 kDa (GCF1) y 57,8 kDa (GCF2). La secuencia del dominio extracelular de la EphB4 humana contiene tres sitios de N-glicosilación predichos (NXS/T) que están ubicados en el dominio rico en Cys, dentro de la primera repetición de fibronectina tipo III y entre la primera y la segunda repeticiones de fibronectina.

Para confirmar la capacidad de las proteínas recombinantes purificadas para unirse a efrina B2, se sometieron a prueba en un ensayo de unión in vitro. Tal como se esperaba, GC, GCF1 y GCF2, pero no CF2 se unen al ligando relacionado efrina B2 tal como se confirmó mediante la interacción entre la proteína de fusión efrina B2 - fosfatasa alcalina (efrina B2-AP) con las proteínas B4 inmovilizadas en la resina de Ni2+ o en la membrana de nitrocelulosa (figura 17).

También se sometieron a prueba las cuatro proteínas para determinar su capacidad para bloquear la dimerización y activación dependientes de ligando de la cinasa de receptor EphB4 en células PC3. Se sabe que la línea de células cancerosas de próstata humana PC3 expresa niveles elevados de EphB4 humano. La estimulación de células PC3 con la proteína de fusión efrina B2-Fc de IgG conduce a una rápida inducción de fosforilación de tirosina del receptor. Sin embargo, la preincubación del ligando con las proteínas GCF2, GCF1 o GC, pero no con CF2 suprime la posterior autofosforilación de EphB4. La adición de las proteínas solo a las células PC3 o la preincubación de las células con las proteínas seguido por el cambio de los medios y la adición del ligando no afecta al estado de fosforilación de EphB4.

Además, se encontró que se requiere el dominio globular de EphB4 para la actividad de las proteínas solubles derivadas de EphB4 en el ensayo de formación de tubos endoteliales.

B. Efectos de EphB4 soluble sobre HUV/AEC in vitro

Se realizaron experimentos iniciales para determinar si EphB4 soluble afectaba a las tres fases principales en la rutade angiogénesis. Éstos se llevaron a cabo estableciendo los efectos de EphB4 soluble sobre la migración / invasión, proliferación y formación de túbulos por HUV/AEC in vitro. La exposición a EphB4 soluble inhibió significativamente la migración inducida tanto por bFGF como por VEGF en el ensayo de cámara de Boyden de manera dependiente de la dosis, logrando significación a nivel nM (figura 18). La formación de túbulos por HUV/AEC en pocillos recubiertos con Matrigel se inhibió significativamente por EphB4 soluble de manera dependiente de la dosis en ausencia y presencia de bFGF y VEGF (figura 19). También se evaluó in vitro, si los nM de EphB4 soluble eran

citotóxicos para HUVEC. Se encontró que EphB4 no tiene ningún efecto citotóxico detectable a estas dosis, tal como se evaluó mediante ensayo de MTS (figura 20).

C. El receptor EphB4 soluble inhibe la vascularización de tapones de Matrigel, in vivo

Para demostrar que EphB4 soluble puede inhibir directamente la angiogénesis in vivo, se realizó un experimento en tampón de Matrigel murino. Se inyectó por vía s.c. Matrigel complementado con bFGF y VEGF con y sin EphB4 soluble en ratones Balb/C nu/nu, formando tapones semisólidos, durante seis días. Los tapones sin factores de crecimiento prácticamente no tenían vascularización o estructuras de vasos tras 6 días (figura 21). En contraposición, los tapones complementados con bFGF y VEGF tenían amplia vascularización y vasos a través de todo el tapón. Los tapones tomados de ratones tratados con g de EphB4 soluble tenían vascularización marcadamente reducida de los tapones, de manera comparable a los tapones sin factor de crecimiento (figura 21). Además, el examen histológico de los tapones mostró tinción de vasos disminuida (figura 21). El tratamiento a 0 g/dosis inhibió significativamente la cantidad de infiltración en tampones de Matrigel en comparación con el control (figura 21).

Se examinó la fosforilación del receptor EphB4 en HUVEC realizando análisis de inmunotransferencia de tipo Western con lisados de células tratadas con EphB4 soluble y anticuerpos contra fosfotirosina. Se encontró que el tratamiento con EphB4 soluble de HUVEC privadas de suero estimuló una disminución rápida y transitoria en el nivel de EphB4 fosforilado, en presencia de efrina B2Fc, dímero de ligando de EphB4. La efrina B2Fc sin la proteína EphB4 soluble indujo la fosforilación del receptor EphB4 (figura 22).

D. Efectos de EphB4 soluble sobre el crecimiento tumoral, in vitro

Se encontró que EphB4 soluble inhibe el crecimiento de tumores de SCC15 crecidos en ratones Balb/C Nu/Nu (figura 23).

E. EphB4 soluble inhibió la neovascularización de la córnea

Para investigar adicionalmente la actividad antiangiogénica de EphB4 soluble in vivo, se estudió el efecto inhibidor de la administración de EphB4 soluble sobre la neovascularización en la córnea de ratón inducida por bFGF. Gránulos de Hydron implantados en la microbolsa de la córnea podían inducir angiogénesis, en presencia de factores de crecimiento, en una zona normalmente avascular. La respuesta a la angiogénesis en la córnea de ratones fue moderada, la aparición de los brotes vasculares se retrasó y los nuevos capilares fueron escasos y crecían lentamente. En comparación con el grupo control, en el día 7 de la implantación, la neovascularización inducida por bFGF en córnea de ratones se inhibió marcadamente en el grupo tratado con EphB4 soluble (figura 24).

F. Efectos de EphB4 soluble sobre el crecimiento tumoral, in vivo

Se usó el mismo modelo para determinar los efectos de EphB4 soluble in vivo. Se obtuvieron tumores de SCC15 implantados por vía subcutánea, se preincubaron con Matrigel y con o sin factores de crecimiento, así como implantados por vía s.c. solo, y se trataron los ratones por vía s.c. o i.p. diariamente con 1-5 ug de EphB4 soluble.

Los tumores en el grupo control continuaron creciendo de manera constante a lo largo del periodo de tratamiento, alcanzando un volumen tumoral final de mm3. Sin embargo, los animales a los que se inyectó EphB4 soluble mostraron una tasa de crecimiento significativamente (p<0,0/) reducida, alcanzando un volumen tumoral final de sólo mm3 (figura 25). Se obtuvieron resultados similares en dos cohortes adicionales de tales ratones portadores de tumores. La administración de EphB4 soluble pareció tolerarse bien in vivo, sin efecto significativo sobre el peso corporal o sobre el bienestar general de los animales (tal como se determina por la ausencia de letargia, encorvamiento intermitente, temblores o patrones de respiración alterada).

G. Efectos de EphB4 soluble sobre la histología tumoral

El análisis histológico reveló la presencia de una zona central de necrosis en todos los tumores de SCC15, que estaba rodeada habitualmente por un borde viable de células tumorales de um de anchura. Las zonas necróticas centrales frecuentemente eran grandes y confluentes y mostraban pérdida de detalle celular. La necrosis, evaluada como un porcentaje del área de sección tumoral, era significativamente (p<0,02) más amplia en el grupo tratado con EphB4 soluble (% de necrosis en el grupo tratado frente al control). Para determinar si el volumen reducido de los tumores tratados con EphB4 se debía a un efecto de esta proteína sobre el aporte vascular tumoral, se identificaron células endoteliales en vasos sanguíneos en secciones tumorales usando inmunotinción con un anticuerpo antimolécula de adhesión celular plaquetaria (PECAM-1; CD31) (figura 26) y se evaluó la densidad de los microvasos. La densidad de los microvasos fue similar en el borde viable exterior de las células tumorales (la capa uniforme de células adyacentes a la periferia tumoral con núcleos bien definidos) en los tumores control y los tratados con EphB4 soluble. La densidad de los microvasos fue significativamente en la región menos viable, interior, de las células tumorales colindantes con zonas centrales necróticas en los tumores tratados con EphB4 que en los tumores control. La deposición de fibrina, tal como se identifica mediante tinción tricrómica de Masson, estaba aumentada en

y alrededor de los vasos sanguíneos en el borde viable interior y el núcleo necrótico central de los tumores tratados con EphB4 soluble que en los tumores control. En el borde viable exterior de los tumores tratados con EphB4 soluble, aunque la luz del vaso seguía siendo permeable y contenía glóbulos rojos, la deposición de fibrina era evidente alrededor de muchos vasos. Se encontró que EphB4 soluble no tenía tales efectos sobre el endotelio en los tejidos normales examinados (pulmones, hígado y riñones).

H. Materiales y métodos

Puede encontrarse una descripción detallada de los materiales y métodos para este ejemplo en la publicación de patente estadounidense n.º 20050084873.

Ensayo de tirosina cinasa de EphB4 basado en células

Se mantuvieron células de la línea celular PC3 de carcinoma de próstata humano en medio RPMI con suero de ternero fetal dializado al 10% y mezcla de los antibióticos penicilina/estreptomicina/neomicina al 1%. Se mantuvieron las células a 37ºC en una atmósfera humidificada del 5% de CO2/95% de aire. Normalmente, se hicieron crecer las células en placas de 60 mm hasta la confluencia y se trataron o bien con fusión efrina B2-Fc de ratón a 1 g/ml en RPMI durante 10 min para activar el receptor EphB4 o bien con medio común como control. Para estudiar el efecto de diferentes derivados de proteínas ECD de EphB4 soluble sobre la activación del receptor EphB4, se usaron tres conjuntos de células. En el primer conjunto, se trataron las células con diversas proteínas (5 proteínas; GC, GCF1, GCF2, GCF2-F, CF2) a 5 g/ml durante 20 min. En el segundo conjunto de células, antes de la aplicación, se mezclaron previamente las proteínas con efrina B2-Fc a una razón molar de 1:5 (proteína EphB4 : B2-Fc), se incubaron durante 20 min y se aplicaron sobre las células durante 10 min. En el tercer conjunto de células, se trataron en primer lugar las células con las proteínas durante 20 min a 5 g/ml, se reemplazaron los medios con medios recientes que contenían 1 g/ml de efrina B2-Fc y se incubaron durante otros 10 min.

Tras la estimulación, se recogieron inmediatamente las células con tampón de extracción de proteínas que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, Triton X100 al 1% (v/v), EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, vanadato de sodio 1 mM. Se aclararon los extractos de proteínas mediante centrifugación a 14.000 rpm durante 20 min a 4ºC. Se incubaron las muestras de proteínas aclaradas incubadas durante la noche con perlas de agarosa acopladas a proteína A/G recubiertas previamente con anticuerpos monoclonales anti-EphB4. Se lavaron los complejos de IP dos veces con el mismo tampón de extracción que contenía Triton X100 al 0,1%. Se solubilizaron las proteínas inmunoprecipitadas en tampón de carga de muestra de 1X SDS-PAGE y se separaron en SDS-PAGE al 10%. Para los estudios de activación del receptor EphB4, se estudió mediante sonda la membrana sometida a electroinmunotransferencia con el anticuerpo específico anti-pTyr 4G10 a una dilución 1:1000 seguido por conjugado de proteína G-HRP a diluciones 1:5000.

Ensayo de formación de tubos de células endoteliales

Se colocó Matrigel (60 l de 10 mg/ml; Collaborative Lab, n.º de cat. 35423) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos helada. Se permitió que la placa se asentara a temperatura ambiente durante 15 minutos, luego se incubó a 37ºC durante 30 minutos para permitir que el Matrigel polimerizara. Mientras tanto, se prepararon células endoteliales de vena umbilical humana en EGM-2 (Clonetic n.º de cat. CC3162) a una concentración de 2x105 células/ml. Se preparó la proteína de prueba a 2x la concentración deseada (5 niveles de concentración) en el mismo medio. Se mezclaron las células (500 l) y 2X fármaco (500 l) y se colocaron 200 l de esta suspensión por duplicado en el Matrigel polimerizado. Tras una incubación de 24 h, se tomaron imágenes por triplicado para cada concentración usando un sistema de análisis de imágenes Bioquant. Se evaluó el efecto de adición de proteína (CI50) en comparación con los controles no tratados midiendo la longitud de los cordones formados y el número de uniones.

Ensayo de migración celular

Se evaluó la quimiotaxis de HUVEC a VEGF usando una cámara de Boyden modificada, piezas de inserción de filtro de membrana Transwell en placas de 24 pocillos, membranas de policarbonato de 6,5 mm de diámetro, 8 m de tamaño de poro, recubiertas con Matrigel de 10 m de grosor (BD Biosciences). Las suspensiones celulares de HUVEC (2x 105 células/ml) en 200 l de EBM se sembraron en la cámara superior y la proteína EphB4 soluble se añadió simultáneamente con estimulante (VEGF o bFGF) al compartimento inferior de la cámara y se investigó su migración a través de un filtro de policarbonato en respuesta a 10-20 ng/ml de VEGF con o sin compuesto de prueba 100 nM-1 M. Tras la incubación durante 4-24 h a 37ºC, se raspó la superficie superior del filtro con un hisopo y se fijaron los filtros y se tiñeron con Diff Quick. Se contaron diez campos aleatorios a 200 aumentos y se expresaron los resultados como n.º de media por campo. Se restaron los valores de control sin estímulo negativos de los valores control con estímulo y muestra tratada con la proteína y se representaron gráficamente los datos como la media de células migradas  D.E. Se calculó la CI50 a partir de los datos representados gráficamente.

Ensayo de inhibición del crecimiento

Se sembraron en placa HUVEC (1,5x103 células) en una placa de 96 pocillos en 100 l de EBM-2 (Clonetic, n.º de cat. CC3162). Tras 24 horas (día 0), se añade la proteína recombinante de prueba (100 l) a cada pocillo a 2x la concentración deseada (5-7 niveles de concentración) en medio EBM-2. En el día 0, se tiñó una placa con cristal violeta al 0,5% en metanol al 20% durante 10 minutos, se aclaró con agua y se secó al aire. Se incubaron las placas restantes durante 72 h a 37ºC. Tras 72 h, se tiñeron las placas con cristal violeta al 0,5% en metanol al 20%, se aclararon con agua y se secaron al aire. Se eluyó la tinción con disolución 1:1 de etanol: citrato de sodio 0,1 M (incluyendo la placa del día 0) y se midió la absorbancia a 540 nm con un lector de ELISA (Dynatech Laboratories). La absorbancia del día 0 se restó de las placas de 72 h y se representaron gráficamente los datos como el porcentaje con respecto a la proliferación control (células tratadas con vehículo). Se calculó el valor de CI50 a partir de los datos representados gráficamente.

Ensayo de angiogénesis en tapón de Matrigel murino

Se sometió a ensayo la angiogénesis in vivo en ratones como crecimiento de vasos sanguíneos de tejido subcutáneo en un tapón de Matrigel que contenía la muestra de prueba. Matrigel forma rápidamente un gel sólido a la temperatura corporal, atrapando los factores para permitir la liberación lenta y la exposición prolongada a los tejidos circundantes. Se mezcló Matrigel (8,13 mg/ml, 0,5 ml) en forma líquida a 4ºC con complemento de crecimiento de células endoteliales (ECGS), proteínas de prueba más ECGS o Matrigel más vehículo solo (PBS que contenía BSA al 0,25%). Se inyectó Matrigel (0,5 ml) en el tejido subcutáneo abdominal de ratones nu/nu hembra (de 6 semanas de edad) a lo largo de la línea media peritoneal. Había 3 ratones en cada grupo. Se cuidó de los animales según las directrices institucionales y del NIH. En el día 6, se sacrificaron los ratones y se recuperaron los tapones y se procesaron para determinar la histología. Normalmente, se retiró la piel que recubría y se cortaron los geles conservando el revestimiento peritoneal para soporte, se fijaron en formalina tamponada al 10% en PBS y se incluyeron en parafina. Se cortaron secciones de 3 m y se tiñeron con H&E o tinción tricrómica de Masson y se examinaron al microscopio óptico.

Ensayo de microbolsa de córnea de ratón

Se realizó un ensayo de microbolsa de córnea de ratón según el detallado por Kenyon et al., 1996. En resumen, se prepararon gránulos de Hydron (poli(metacrilato de hidroxietilo) [poliHEMA], Interferon Sciences, New Brunswick, NJ, EE.UU.) que contenían o bien 90 ng de bFGF (R&D) o bien 180 ng de VEGF (R&D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.) y 40 g de sacarosa-sulfato de aluminio (Sigma). Usando un microscopio quirúrgico, se realizó queratotomía lineal estromal con una cuchilla quirúrgica (Bard-Parker n.º 15) paralela a la inserción del músculo recto lateral en el animal anestesiado. Se diseccionó una microbolsa instraestromal usando un cuchillo de von Graefe modificado (2”30 mm). Se implantó un único gránulo y se avanzó hacia el limbo de la córnea temporal (dentro de 0710 mm para los gránulos de bFGF y 05 mm para los gránulos de VEGF). Se determinó que era necesaria la diferencia en la ubicación de los gránulos para cada factor de crecimiento dada la estimulación angiogénica relativamente más débil de VEGF en este modelo. Entonces se aplicó una pomada de antibiótico (eritromicina) al ojo operado para prevenir la infección y para disminuir las irregularidades de la superficie. Se midió la respuesta vascular posterior que se extiende desde la vasculatura del limbo hacia el gránulo y la zona de neovascularización circunferencial continua. Los datos y las fotos clínicas presentadas en el presente documento se obtuvieron en el día 6 tras la implantación de los gránulos, que se encontró que era el día de máxima respuesta angiogénica.

Ensayo de invasión in vitro

Se fijaron piezas de inserción de cultivo celular de 9 mm recubiertas con matriz de “Matrigel” (tamaño de poro, 8 m; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) en una placa de 24 pocillos. Se sembraron las células HUVEC a una densidad de 5x103 células por pocillo en la capa superior de la pieza de inserción de cultivo y se cultivaron con EBM libre de suero en presencia de ECD de EphB4 durante 24 h. Se cultivó el grupo control en los mismos medios sin EphB4. Entonces se introdujeron 0,5 ml de medio condicionado de la línea celular SCC15 humana en la capa inferior de la pieza de inserción de cultivo como un quimioatrayente. Se incubaron las células durante 24 h, entonces se limpiaron con hisopo las células restantes en la capa superior con algodón y se fijaron las células penetrantes en la capa inferior con glutaraldehído al 5% y se tiñeron con Diff Quick. Se contó el número total de células que pasaba a través de la matriz de Matrigel y cada poro de 8 m de la pieza de inserción de cultivo usando microscopía óptica y se designaron como el índice de invasión (número de células/área).

Crecimiento tumoral de SCC15 en ratones

Se inyecta por vía subcutánea la línea celular de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello SCC15 que crece logarítmicamente, a una densidad celular de 5X106; con o sin ECD de EphB4 en presencia o ausencia de bFGF humano, en ratones desnudos Balb/c atímicos, junto con membrana basal sintética de Matrigel (BD Bioscience) (1:1 v/v), y se examinan los tumores en el plazo de 2 semanas. Los volúmenes tumorales en el grupo de ECD de EphB4, en presencia y ausencia de factor de crecimiento tras la implantación eran tres veces más pequeños

que los de los grupos con vehículo. No hubo diferencia en el peso corporal entre los grupos. Se realizará el examen inmunohistoquímico de secciones transversales de tumores resecados y necrosis o apoptosis positiva para TUNEL, inmunotinción con CD34 y tasa de proliferación de BrdU, después se desparafina, se rehidrata y se extingue para determinar la actividad peroxidasa endógena, y tras 10 min se realiza permeabilización con proteinasa K. También se realizará la evaluación cuantitativa de las densidades vasculares. También se realizará la administración intratumoral local o la administración i.v. de ECD de EphB4 dos veces a semana.

Se inyectaron a cada uno de 30 ratones desnudos atímicos, BALB/c (nu/nu), 1 x 106 células de melanoma B16 con 0,1 ml de PBS mezcladas con 0,1 ml de Matrigel o 1,5 x 106 células SCC15 resuspendidas en 200 l de medio DMEM libre de suero y se inyectaron por vía subcutánea en el día 0 en la región del hombro derecho de los ratones. Se inyectaron proteínas por vía intravenosa o por vía subcutánea, alrededor del tumor comenzando en el día 1 a una dosis de carga de 4 g/mg, con inyecciones semanales de 2 ug/mg. (10 g/g, 50 g/kg/día), y a las 2 semanas tras la inoculación. Se sacrificaron los ratones en el día 14. Los ratones control recibieron 50 l de PBS cada día.

Formación de tumores en ratones desnudos

Se trató a todos los animales según protocolos aprobados por los comités institucionales de cuidado animal. Se inocularon por vía subcutánea células cancerosas (5x106) en la piel dorsal de ratones desnudos. Cuando el tumor había crecido hasta un tamaño de aproximadamente 100 mm3 (habitualmente tardó 12 días), se inyectó sEphB4 o bien por vía intraperitoneal o bien por vía subcutánea una vez/día, y se monitorizó la tumorigénesis durante 2 semanas. Se calculó el volumen tumoral según la fórmula a2xb, en la que a y b son los diámetros menor y mayor, respectivamente. Se usó una prueba de la t de Student para comparar los volúmenes tumorales, considerándose significativo P<0,05.

Cuantificación de la densidad de microvasos

Se fijaron los tumores en formaldehido al 4%, se incluyeron en parafina, se obtuvieron secciones de 5 m y se tiñeron con hematoxilina-eosina. Se semicuantificó la densidad de los vasos usando un analizador de imágenes basado en ordenador (cinco campos por sección de tres ratones en cada grupo).

EJEMPLO DE REFERENCIA 3. EphB4 se regula por incremento y confiere ventaja de crecimiento en cáncer de próstata

Se examinó en primer lugar la expresión de la proteína EphB4 en una variedad de líneas celulares de cáncer de próstata mediante inmunotransferencia de tipo Western. Se encontró que las líneas celulares de cáncer de próstata muestran una marcada variación en la abundancia de la EphB4 de 120 kD. Los niveles eran relativamente altos en PC3 e incluso superiores en PC3M, un clon metastásico de PC3, mientras que las líneas celulares derivadas de glándula de próstata normal (MLC) mostraron poca o ninguna expresión de EphB4 (figura 27A). Se comprobó a continuación el estado de activación de EphB4 en células PC3 mediante un estudio de fosforilación. Se encontró que incluso en condiciones de cultivo normales, EphB4 se fosforila aunque puede inducirse adicionalmente por su ligando, efrina B2 (figura 27B).

B. Expresión de EphB4 en muestras de cáncer de próstata clínicas

Para determinar si EphB4 se expresa en muestras de próstata clínicas, se examinaron tejidos tumorales y tejido normal adyacente de muestras quirúrgicas de cáncer de próstata. Se determinó la distribución histológica de EphB4 en las muestras de próstata mediante inmunohistoquímica. Claramente, la expresión de EphB4 está confinada al epitelio neoplásico (figura 28, parte superior izquierda), y está ausente en el epitelio de próstata estromal y normal (figura 28, parte superior derecha). En la serie de tejido de próstata, 24 de los 32 cánceres de próstata examinados fueron positivos. Se encontró mediante RT-PCR cuantitativa que el ARNm de EphB4 se expresa tanto en el tejido normal como en el tumoral de muestras clínicas. Sin embargo, los niveles de ARNm de EphB4 tumoral fueron al menos 3 veces superiores que en el normal en este caso (figura 28, parte inferior derecha).

C. p53 y PTEN inhibieron la expresión de EphB4 en células PC3

Se sabe que las células PC3 carecen de expresión de PTEN (Davis, et al., 1994, Science. 266:816-819) y función de p53 de tipo natural (Gale, et al., 1997, Cell Tissue Res. 290:227-241). Se investigó si la expresión relativamente alta de EphB4 se refiere a p53 y/o PTEN mediante la reintroducción de p53 de tipo natural y/o PTEN en las células PC3. Para compensar la eficacia de transfección y el efecto de dilución, se clasificaron las células transfectadas para el marcador CD4 truncado cotransfectado. Se encontró que la expresión de EphB4 en células PC3 estaba reducida por la reintroducción de o bien p53 de tipo natural o bien PTEN. La cotransfección de p53 y PTEN no inhibió adicionalmente la expresión de EphB4 (figura 29A).

D. El receptor X retinoide (RXR) regula la expresión de EphB4

Se encontró previamente que RXR se regulaba por disminución en líneas celulares de cáncer de próstata (Zhong, et al., 2003, Cancer Biol Ther. 2:179-184) y en este caso se encontró que la expresión de EphB4 tiene el patrón de expresión inversa cuando se observa en próstata “normal” (MLC), cáncer de próstata (PC3) y cáncer de próstata metastásico (PC3M) (figura 27A). Se consideró si RXR regula la expresión de EphB4. Para confirmar la relación, se comparó la expresión de EphB4 entre CWR22R y CWR22R-RXR, que expresa de manera constitutiva RXR. Se encontró una modesta disminución en la expresión de EphB4 en la línea celular que sobreexpresa RXR, mientras que FGF8 no tiene efecto sobre la expresión de EphB4. De manera consecuente con los resultados iniciales, no se encontró EphB4 en la línea celular hipertrófica de próstata benigna “normal” BPH-1 (figura 29B).

E. La ruta de señalización de factores de crecimiento de EGFR e IGF-1R regula la expresión de EphB4

Se ha mostrado que EGFR e IGF-1R tienen ambos acción autocrina y paracrina sobre el crecimiento de células PC3. Puesto que se encontró que la expresión de EphB4 es superior en las líneas celulares más agresivas, se postuló que la expresión de EphB4 podría correlacionarse con estos factores de crecimiento de pro-supervivencia. Se sometió a prueba la relación bloqueando independientemente las señalizaciones de EGFR e IGF-1R. EphB4 se reguló por disminución tras el bloqueo de la señalización de EGFR usando el inhibidor de cinasa de EGFR, AG 1478 (figura 30A) o con el bloqueo de la ruta de señalización de IGF-1R usando el anticuerpo neutralizante IGF-1R (figura 30B).

F. ARNip frente a EphB4 y ODN antisentido inhiben la viabilidad celular de PC3

Para definir la significación de esta sobreexpresión de EphB4 en el modelo de cáncer de próstata, se concentró el estudio en células PC3, que tienen una expresión relativamente alta de EphB4. Los dos enfoques para disminuir la expresión de EphB4 fueron ARNip y ODN-AS. Se sometieron a prueba varios ODN-AS modificados mediante fosforotioato diferentes complementarios a diferentes segmentos de la región codificante de EphB4 para determinar la especificidad y la eficacia de la inhibición de EphB4. Usando células 293 transfectadas de manera transitoria con el vector de expresión de EphB4 de longitud completa se encontró que AS-10 era el más eficaz (figura 31B). Se aplicó un enfoque similar a la selección de ARNip específico. ARNip 472 frente a EphB4 silencia eficazmente la expresión de la proteína EphB4 (figura 31A). Tanto ARNip 472 y como ODN AS-10 antisentido redujeron la viabilidad de las células PC3 de manera dependiente de la dosis (figura 31C, D). El oligonucleótido sentido o ARNip no relacionado no tuvo efecto sobre la viabilidad.

G. Los ODN antisentido y ARNip frente a EphB4 inhiben la movilidad de las células PC3

Las células PC3 pueden crecer de manera agresiva localmente y pueden formar metástasis de ganglios linfáticos cuando se inyectan ortotópicamente en ratones. En un esfuerzo para estudiar el papel de EphB4 sobre la migración de células PC3 in vitro, se realizó un ensayo de cicatrización de heridas. Cuando se introdujo una herida en una monocapa de células PC3, a lo largo del transcurso de las siguientes 20 horas las células migraron progresivamente hacia la zona aclarada. Sin embargo, cuando se transfectaron las células con ARNip 472 y se introdujo la herida, esta migración se inhibió significativamente (figura 31E). El pretratamiento de las células PC3 con AS-10 10 M frente a EphB4 durante 12 horas generó el mismo efecto (figura 31F). Además, el silenciamiento de la expresión de EphB4 en células PC3 con ARNip 472 redujo drásticamente la capacidad de estas células para invadir Matrigel tal como se evaluó mediante un ensayo de invasión de doble cámara (figura 31G), en comparación con el ARNip de control.

H. El ARNip frente a EphB4 induce la detención del ciclo celular y la apoptosis en células PC3

Puesto que el silenciamiento de EphB4 dio como resultado una viabilidad celular disminuida (figura 31C) se buscó determinar si esto se debía a efectos sobre el ciclo celular. En comparación con las células transfectadas con ARNip de control, ARNip 472 dio como resultado una acumulación de células en las fracciones de fase sub G0 y S en comparación con las células tratadas con ARNip de control. La fracción sub G0 aumentó desde el 1% hasta el 7,9%, y la fracción de fase S desde el 14,9% hasta el 20,8% en células tratadas con ARNip 472 en comparación con células tratadas con ARNip de control (figura 32A). La detención del ciclo celular en sub G0 y G2 es indicativa de apoptosis. La apoptosis como resultado del silenciamiento de EphB4 se confirmó mediante ensayo ELISA. Se observó un aumento dependiente de la dosis en la apoptosis cuando se transfectaron las células PC3 con ARNip 472, pero no con ARNip de control (figura 32B). A 100 nM hubo 15 veces más apoptosis en células PC3 transfectadas con ARNip 472 que en las transfectadas con ARNip de control.

I. Materiales y métodos

Puede encontrarse una descripción detallada de los materiales y métodos para este ejemplo en la publicación de patente estadounidense n.º 20050084873.

EJEMPLO DE REFERENCIA 4. Expresión de EphB4 en mesotelioma: una diana candidata para terapia

El mesotelioma maligno (MM) es una neoplasia poco común que con la mayor frecuencia surge de la superficie serosa de la cavidad pleural y peritoneal. La cavidad pleural es con mucho el sitio más frecuentemente afectado (> 90%), seguido por el peritoneo (6-10%) (Carbone et al., 2002, Semin Oncol. 29:2-17). Hay una fuerte asociación con la exposición al amianto, aproximadamente el 80% de los casos de mesotelioma maligno se producen en individuos que han ingerido o inhalado amianto. Este tumor es particularmente resistente a las terapias actuales y hasta ahora, el pronóstico de estos pacientes es considerablemente malo (Lee et al., 2000, Curr Opin Pulm Med. 6:267-74).

Varios problemas clínicos relativos al diagnóstico y el tratamiento del mesotelioma maligno siguen sin resolverse. Realizar un diagnóstico de mesotelioma a partir de líquido pleural o abdominal es notoriamente difícil y a menudo requiere una biopsia toracoscópica o laparoscópica o abierta y tinción inmunohistoquímica para determinados marcadores tales como mesotelina expresada preferentemente en este tumor. Hasta ahora, la no intervención ha demostrado ser curativa, pese a los regímenes quimioterapéuticos agresivos y a la radioterapia prolongada. La mediana de la supervivencia en la mayoría de los casos es sólo de 12-18 meses tras el diagnóstico.

Con el fin de identificar nuevos marcadores de diagnóstico y dianas que van a usarse para enfoques diagnósticos y terapéuticos novedosos, se evaluó la expresión de EphB4 y su ligando efrina B2 en líneas celulares de mesotelioma y muestras clínicas.

A. EphB4 y efrina B2 se expresa en líneas celulares de mesotelioma

Se determinó la expresión de efrina B2 y EphB4 en líneas celulares de mesotelioma maligno al nivel de ARN y proteína mediante una variedad de métodos. RT-PCR mostró que las cuatro líneas celulares expresan efrina B2 y EphB4 (figura 33A). Se determinó la expresión de proteínas mediante inmunotransferencia de tipo Western en estas líneas celulares. Se observaron bandas específicas para EphB4 a 120 kD. Además, se detectó efrina B2 en todas las líneas celulares sometidas a prueba como una banda de 37 kD en inmunotransferencia de tipo Western (figura 33B). No se observó ninguna banda específica para efrina B2 en células de riñón embrionarias humanas 293, que se incluyeron como control negativo.

Para confirmar la presencia de transcripción de EphB4 en células de mesotelioma, se llevó a cabo hibridación in situ en líneas celulares de NCI H28 cultivadas en portaobjetos con cámaras. Se detectó una señal específica para EphB4 usando una sonda antisentido. También se detectaron transcritos de efrina B2 en la misma línea celular. Las sondas sentido tanto para EphB4 como para efrina B2 sirvieron como controles negativos y no se hibridaron con las células (figura 34). Se confirmó la expresión de proteínas EphB4 y efrina B2 en las líneas celulares mediante análisis de inmunofluorescencia (figura 35). Tres líneas celulares mostraron fuerte expresión de EphB4, mientras que estaba presente expresión de efrina B2 en H28 y H2052, y era débilmente detectable en H2373.

B. Evidencia de expresión de EphB4 y efrina B2 en muestras clínicas

Se aislaron células tumorales cultivadas a partir de efusión pleural de un paciente diagnosticado con mesotelioma maligno pleural y mostraron tinción positiva tanto para EphB4 como para efrina B2 en el pase 1 (figura 35, fila inferior). Estos resultados confirman la coexpresión de EphB4 y efrina B2 en líneas celulares de mesotelioma. Para determinar si estos resultados observados en las líneas celulares tumorales eran un reflejo real de la expresión en el estado patológico, se sometieron muestras de biopsia tumoral a tinción inmunohistoquímica para EphB4 y efrina B2. Anticuerpos frente a ambas proteínas revelaron tinción positiva en las células tumorales. En la figura 36 se muestran datos representativos.

C. EphB4 está implicada en el crecimiento y la migración celulares del mesotelioma

Se sometió a prueba el papel de EphB4 en la proliferación celular usando ARNip y oligonucleótidos antisentido específicos contra EphB4. El tratamiento de H28 cultivadas con antisentido contra EphB4 redujo la viabilidad celular. Uno de los inhibidores más activos de la expresión de EphB4 es EphB4AS-10 (figura 37A). La transfección de ARNip 472 frente a EphB4 generó el mismo efecto (figura 37B).

El MM es una enfermedad que avanza localmente con extensión y crecimiento frecuentes en estructuras vitales adyacentes tales como la pared torácica, el corazón y el esófago. En un esfuerzo por estudiar este proceso in vitro, se realizó un ensayo de cicatrización de heridas usando las técnicas descritas anteriormente (3:36). Cuando se introdujo una herida en células H28 subconfluentes, a lo largo del transcurso de las siguientes 28 horas las células migraron progresivamente hacia la zona de la herida. Sin embargo, cuando se pretrataron las células con EphB4AS10 durante 24 horas, y se introdujo la herida, esta migración se evitó de manera prácticamente completa (figura 38A). El estudio de migración con el ensayo de cámara de Boyden con ARNip frente a EphB4 mostró que la migración celular se inhibía en gran manera con la inhibición de la expresión de EphB4 (figura 38B).

D. Materiales y métodos

Puede encontrarse una descripción detallada de los materiales y métodos para este ejemplo en la publicación de patente estadounidense n.º 20050084873.

EJEMPLO DE REFERENCIA 5. EphB4 se expresa en carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello: Regulación de la ruta de señalización del factor de crecimiento epidérmico y ventaja de crecimiento

El carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC) es el sexto cáncer más frecuente en todo el mundo, con 900.000 casos estimados diagnosticados cada año. Comprende casi el 50% de todos los tumores malignos en algunos países en vías de desarrollo. En los Estados Unidos, se notifican cada año 50.000 nuevos caos y 8.000 muertes. Se cree que los carcinógenos del tabaco son los principales agentes etiológicos de la enfermedad, siendo factores contribuyentes el consumo de alcohol, la edad, el sexo y los antecedentes étnicos.

Las diferencias entre el epitelio normal del tracto aerodigestivo superior y las células cancerosas que surgen de ese tejido son el resultado de mutaciones en genes específicos y la alteración de su expresión. Estos genes controlan la reparación del ADN, la proliferación, la inmortalización, la apoptosis, la invasión y la angiogénesis. Para el cáncer de cabeza y cuello, se producen alteraciones de tres rutas de señalización con suficiente frecuencia y producen tales cambios fenotípicos drásticos que se consideran los acontecimientos de transformación críticos de la enfermedad. Estos cambios incluyen mutación del supresor tumoral p53, sobreexpresión del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) e inactivación del inhibidor de cinasa dependiente de ciclina p16. Otros cambios tales como mutación de Rb, activación de ras, amplificación de ciclina D y sobreexpresión de myc son menos frecuentes en HNSCC.

Aunque se ha notificado alta expresión de EphB4 en tumores malignos hematológicos, carcinoma de mama, carcinoma endometrial y carcinoma de colon, hay datos limitados en cuanto a los niveles de proteína de EphB4, y una falta completa de datos en cuanto a la importancia biológica de esta proteína en la biología tumoral tal como HNSCC.

A. Los tumores HNSCC expresan EphB4

Se estudió la expresión de EphB4 en tejidos tumorales humanos mediante inmunohistoquímica, hibridación in situ e inmunotransferencia de tipo Western. Se han evaluado veinte tejidos tumorales recogidos prospectivamente tras la aprobación de la IRB con anticuerpos monoclonales específicos contra EphB4 que no reaccionan con otros miembros de la familia de EphB y EphA. Se observa expresión de EphB4 en todos los casos, con intensidad de tinción variable. La figura 39A (parte superior izquierda) ilustra un caso representativo, que muestra que EphB4 se expresa en la región tumoral únicamente, tal como se revela por la arquitectura tumoral con H&E (figura 39A, parte inferior izquierda). Debe observarse la ausencia de tinción para EphB4 en el estroma. En segundo lugar, un sitio de tumor metastásico en el ganglio linfático muestra tinción positiva mientras que el resto del ganglio linfático es negativo (figura 39A, parte superior derecha).

Se llevó a cabo hibridación in situ para determinar la presencia y la ubicación de transcritos de EphB4 en el tejido tumoral. Se detectó una fuerte señal para la sonda antisentido específica contra EphB4 indicando la presencia de transcritos (figura 39B, parte superior izquierda). La comparación con la tinción de H&E (figura 39B, parte inferior izquierda) para ilustrar la arquitectura tumoral revela que la señal estaba localizada para las células tumorales, y estaba ausente de las zonas estromales. También se detectaron transcritos de efrina B2 en la muestra tumoral, y al igual que con EphB4, la señal estaba localizada para las células tumorales (figura 39B, parte superior derecha). Ni las sondas sentido de EphB4 ni las de efrina B2 hibridaron con las secciones, demostrando especificidad de las señales.

B. Alta expresión de EphB4 en sitios primarios y metastásicos de HNSCC

Se llevaron a cabo inmunotransferencias de tipo Western de tejido procedente de tumor primario, metástasis de ganglios linfáticos y tejido no implicado para determinar los niveles relativos de expresión de EphB4 en estos sitios. Se recogieron tejidos adyacentes tumorales y normales en 20 casos, mientras que se recogieron ganglios linfáticos positivos para el tumor en 9 de esos 20 casos. En la figura 39C se muestran casos representativos. Se observa expresión de EphB4 en cada una de las muestras tumorales. De manera similar, todos los ganglios linfáticos positivos para tumor muestran expresión de EphB4 que era igual a o mayor que la del tumor primario. No se observa expresión o se observa expresión mínima en el tejido adyacente normal.

C. Expresión de EphB4 y regulación por la actividad de EGFR en líneas celulares de HNSCC

Habiendo demostrado la expresión de EphB4 limitada a células tumorales, se buscó a continuación determinar si había un modelo in vitro de expresión de EphB4 en HNSCC. Se estudiaron seis líneas celulares de HNSCC para determinar la expresión de la proteína EphB4 mediante inmunotransferencia de tipo Western (figura 40A). La mayoría mostró fuerte expresión de EphB4 y por tanto establecieron la base para estudios posteriores. Puesto que EGFR está fuertemente implicado en HNSCC se cuestionó si la expresión de EphB4 está asociada con la activación de EGFR. Los experimentos piloto en SCC-15, que es una línea celular positiva para EGFR, establecieron un tiempo

óptimo de 24 h y una concentración de 1 mM del inhibidor de cinasa de EGFR específico AG 1478 (figura 40B) para inhibir la expresión de EphB4. Cuando se estudiaron todas las líneas celulares, se observó expresión robusta de EGFR en todas menos en SCC-4, donde es detectable pero no fuerte (figura 40C, fila superior). En respuesta al inhibidor de EGFR, AG1478, se observó una marcada pérdida en la cantidad total de EphB4 en determinadas líneas celulares (SCC-15 y SCC-25) mientras que no se observó efecto en otras (SCC-9, -12, -13 y - 71). Por tanto SCC-15 y -25 sirven como modelos para EphB4 que está regulado por la actividad de EGFR, mientras que SCC-9, -12, -13 y -71 son modelos para la regulación de EphB4 en HNSCC de manera independiente de la actividad de EGFR, donde pueden intervenir otros factores tales como p53, PTEN, IL-6, etc. También se observó la expresión del ligando de EphB4, concretamente efrina B2, en todas las líneas celulares sometidas a prueba. Al igual que con EphB4, en algunas líneas la expresión de efrina B2 parece estar regulada por la actividad de EGFR, mientras que es independiente en otras líneas celulares.

Claramente, la inhibición de la señalización de EGFR constitutiva reprimió los niveles de EphB4 en células SCC15. Se estudió a continuación si EGF podía inducir EphB4. Se encontró que se inducían los niveles de EphB4 en células SCC15 que habían estado privadas de suero durante 24 h antes del tratamiento de 24 h con EGF 10 ng/ml tal como se muestra en la figura 41B (carriles 1 y 2). Se investigaron entonces las rutas de señalización posteriores conocidas para la activación de EGFR mostradas en la figura 41A, (para revisión véase Yarden & Slikowski 2001) para determinar su intervención en la inducción mediada por EGF de EphB4. El bloqueo de la fosforilación de PLCg, AKT y JNK con los inhibidores de cinasa específicos U73122, SH-5 y SP600125, respectivamente, redujo los niveles basales y bloqueó la inducción estimulada por EGF de EphB4 (figura 41B, carriles 3-8). En contraposición, la inhibición de ERK1/2 con PD098095 y de PI3-K con LY294002 o wortmannin no tuvo efecto apreciable sobre la inducción con EGF de los niveles de EphB4. Sin embargo, los niveles basales de EphB4 se redujeron cuando se inhibió la fosforilación de ERK1/2. De manera interesante, la inhibición de la activación de la MAPK P38 con SB203580 aumentó los niveles de EphB4 basales, pero no los inducidos por EGF. Se observan resultados similares en la línea celular SCC25 (datos no mostrados).

D. La inhibición de EphB4 en líneas celulares de alta expresión da como resultado viabilidad reducida y produce detención del ciclo celular

Se volvió de nuevo al papel de la expresión de EphB4 en HNSCC investigando el efecto de eliminar la expresión usando métodos de ARNip u ODN-AS. Se desarrollaron varios ARNip para la secuencia de EphB4 (tabla 1) que silenciaban la expresión de EphB4 en diversos grados tal como se observa en la figura 42A. Se redujo la viabilidad en las líneas celulares SCC-15, -25 y -71 transfectadas con ARNip 50 y 472, que eran los más eficaces en bloquear la expresión de EphB4 (figura 42B). Se observó poco efecto sobre la viabilidad con ARNip 1562 y 2302 frente a EphB4 o ARNip 254 frente a efrina B2. Obsérvese que en SCC-4, que no expresa EphB4 (véase la figura 40A) no hubo reducción en la viabilidad celular. La viabilidad celular disminuida observada con tratamiento con ARNip 50 y 472 fue atribuible a la acumulación de células en sub G0, indicativo de apoptosis. Este efecto fue tanto dependiente del tiempo como de la dosis (figura 42C y tabla 2). En contraposición, ARNip 2302 que no era eficaz en reducir los niveles de EphB4 y sólo tenía efectos menores sobre la viabilidad, no produjo ningún cambio en el ciclo celular cuando se comparó con la transfección simulada de Lipofectamine™2000.

Puede encontrarse una descripción detallada de los constructos de ARNip para este ejemplo en la publicación de patente estadounidense n.º 20050084873.

Tabla: Efecto de diferentes ARNip frente a EphB4 sobre el ciclo celular Tratamiento Sub G0 G1 S G2

36 h

Lipo solo

1,9 39,7 21,3 31,8

2302 100 nM

2,0 39,3 21,2 31,2

50 100 nM

18,1 31,7 19,7 24,4

472 100 nM

80,2 10,9 5,2 2,1

16 h

Lipo solo

7,8 55,7 15,2 18,5

2302 100 nM

8,4 57,3 14,3 17,3

50 10 nM

10,4 53,2 15,7 17,7

50 100 nM

27,7 31,3 18,1 19,6

472 10 nM

13,3 50,2 15,8 17,5

472 100 nM

30,7 31,9 16,4 18,0

Además, se sintetizaron más de 50 ODN-AS modificados mediante fosforotioato complementarios a las secuencias codificantes de EphB4 humana y se sometieron a prueba para determinar su capacidad para inhibir la expresión de EphB4 en células 293 transfectadas de manera transitoria con el plásmido de expresión de EphB4 de longitud completa. La figura 43A muestra una muestra representativa del efecto de algunos de estos ODN-AS sobre la expresión de EphB4. Obsérvese que la expresión queda totalmente anulada con AS-10, mientras que AS-11 sólo tiene un efecto menor. El efecto sobre la viabilidad celular en células SCC15 fue el más marcado con los ODN-AS que son más eficaces en inhibir la expresión de EphB4 tal como se muestra en la figura 43B. La CI50 para AS-10 fue de aproximadamente 1 M, mientras que incluso AS-11 10 M no fue suficiente para lograr una reducción de la viabilidad del 50%. Cuando se investigó el efecto que tenía AS-10 sobre el ciclo celular, se encontró que la fracción sub G0 aumentaba desde el 1,9% hasta el 10,5% en comparación con células no tratadas, lo que era indicativo de apoptosis (figura 43C).

E. EphB4 regula la migración celular

A continuación se deseó determinar si EphB4 participa en la migración de HNSCC. La implicación en la migración puede tener implicaciones para el crecimiento y la metástasis. Se evaluó la migración usando el ensayo de cicatrización de heridas/raspado. Se realizaron heridas en cultivos confluentes de SCC15 y SCC25 mediante un único raspado con una pipeta Pasteur de plástico estéril, que dejó una banda de 3 mm con bordes claramente definidos. Se evaluó la migración de células a la zona despejada en presencia de compuestos de prueba y se cuantificó tras 24, 48 y 72 h. La migración celular disminuyó marcadamente en respuesta a AS-10 que bloquea la expresión de EphB4 mientras que los compuestos inactivos, AS-1 y ODN desorganizado tenían poco o ningún efecto tal como se muestra en la figura 43D. También se demostró inhibición de migración con AS-10 usando el ensayo de doble cámara de Boyden (figura 43E).

F. Actividad antitumoral de AS-10 frente a EphB4 in vivo

Se determinó el efecto de AS-10 frente a EphB4, que reduce la motilidad y la viabilidad celular, en xenoinjertos de tumor de SCC15 en ratones desnudos Balb/C. El tratamiento diario de los ratones con AS-10 20 mg/kg, ODN sentido o volumen igual de PBS mediante inyección i.p. se inició el día tras la implantación de las células tumorales. El crecimiento de tumores en los ratones que recibieron AS-10 se retrasó significativamente en comparación con los ratones que recibieron o bien ODN sentido o bien el diluyente PBS solo (figura 44). No se observaron efectos no específicos atribuibles a ODN, ya que no hubo diferencia entre los grupos tratados con ODN sentido y los tratados con PBS.

G. Materiales y métodos

Puede encontrarse una descripción detallada de los materiales y métodos para este ejemplo en la publicación de patente estadounidense n.º 20050084873.

EJEMPLO DE REFERENCIA 6. La expresión de efrina B2 en sarcoma de Kaposi se induce mediante el herpesvirus humano de tipo 8: Cambio de fenotipo de endotelio venoso a arterial

El sarcoma de Kaposi (KS) se manifiesta como una enfermedad angioproliferativa multifocal, lo más comúnmente de la piel y las membranas mucosas, con extensión posterior a órganos viscerales (1). Las características distintivas de la enfermedad son angiogénesis, edema, infiltración de células linfomononucleares y crecimiento de células tumorales con forma de uso. Patológicamente, las lesiones establecidas presentan una amplia red vascular de espacios de tipo rendija. La red vascular del KS difiere de los vasos normales en que carece de membranas basales y en las células endoteliales con forma de huso anómalas (células tumorales) que revisten estos vasos. La vasculatura defectuosa da como resultado una acumulación de componentes sanguíneos incluyendo albúmina, glóbulos rojos y células mononucleares en las lesiones (1). El tumor del KS es de origen endotelial; las células tumorales expresan muchos marcadores endoteliales, incluyendo sitios de unión a lectina para aglutinina-1 de Ulex europeaus (UEA-1), CD34, EN-4, PAL-E (2) y los receptores de tirosina cinasa específicos de células endoteliales, VEGFR-1 (Flt-1), VEGFR-2 (Flk-1/KDR), VEGFR-3 (Flt-4), Tie-1 y Tie-2 (3, RM & PSG, datos no publicados). Las células de KS coexpresan proteínas relacionadas con células endoteliales linfáticas incluyendo LYVE y podoplanina (4).

El herpesvirus HVH-8 se considera el agente etiológico para la enfermedad. En 1994, se identificaron secuencias de este nuevo virus herpes en tejido tumoral de KS (5), y los estudios moleculares-de epidemiología posteriores han mostrado que casi todos los tumores de KS contienen genoma viral. Los estudios de sero-epidemiología muestran que los pacientes infectados por VIH con KS tienen la mayor prevalencia de HVH-8 y en segundo lugar que aquéllos con infección por VIH pero sin KS tienen un riesgo aumentado de desarrollar KS a lo largo de los siguientes años si también son seropositivos para HVH-8 (6). La evidencia directa para el papel del HVH-8 en el KS es la transformación de células endoteliales de la médula ósea tras la infección con HVH-8 (7). Varios genes codificados de HVH-8 podrían contribuir a la transformación celular (revisado en 8). Sin embargo, la mayor evidencia se ha acumulado para el receptor acoplado a proteína G (vGPCR) en este papel (9).

Se investigó si las células tumorales del KS se derivan de endotelio arterial o venoso. Además, se investigó si el HVH-8 tiene efecto sobre la expresión de marcadores arteriales o venosos en un modelo de KS. Se encontró que las células tumorales del KS expresan el marcador arterial efrina B2. Además, la expresión de efrina B2 se inducía por vGPCR de HVH-8 en KS y líneas de células endoteliales. La efrina B2 es una posible diana para el tratamiento del KS porque la inhibición de la expresión o señalización de efrina B2 era perjudicial para la función y la viabilidad celular en KS.

A. Los tumores de KS expresan efrina B2, pero no EphB4

La elevada naturaleza vascular de las lesiones del KS y el probable origen endotelial de las células tumorales impulsaron la investigación de la expresión de EphB4 y efrina B2 que son marcadores para células endoteliales venosas y arteriales, respectivamente. Se detectaron transcritos de efrina B2, pero no de EphB4, en células tumorales de biopsias de KS mediante hibridación in situ (figura 45A). La comparación de la señal positiva con las células tumorales y la sonda antisentido contra efrina B2 tal como se muestra mediante tinción con H&E muestra que la expresión de efrina B2 está limitada a las zonas de la biopsia que contienen células tumorales. La falta de señal en KS con sonda antisentido contra EphB4 no se debe a un defecto en la sonda, ya que detectó transcritos en carcinoma de células escamosas, que se ha mostrado que expresa esta proteína (18). La evidencia adicional para la expresión de efrina B2 en tejido tumoral de KS se proporciona por la localización de señal de EphB4/Fc para células tumorales, detectada mediante el anticuerpo anti-Fc humano conjugado con FITC. Puesto que la efrina B2 es el único ligando para EphB4, este reactivo es específico para la expresión de efrina B2 (figura 45B, izquierda). Una sección adyacente tratada sólo con el reactivo secundario no muestra señal específica. La microscopía confocal de dos colores demostró la presencia de la proteína de latencia del HVH-8, LANA1 en las células positivas para efrina B2 (figura 45C, izquierda), lo que indica que son las células tumorales, no los vasos tumorales, las que expresan este marcador arterial. La tinción de la biopsia tumoral con anticuerpos frente a PECAM-1 reveló la naturaleza altamente vascular de este tumor (figura 45C, derecha). Se realizó un estudio piloto de la prevalencia de este patrón de expresión de efrina B2 y EphB4 sobre biopsias de KS mediante análisis de RT-PCR. Las seis muestras fueron positivas para efrina B2, mientras que sólo 2 fueron débilmente positivas para EphB4 (datos no mostrados).

B. La infección de células endoteliales venosas con HVH-8 produce un cambio de fenotipo para marcadores arteriales

A continuación, se cuestionó si HVH-8, el supuesto agente etiológico para KS, podría inducir por sí mismo la expresión de efrina B2 y reprimir la expresión de EphB4 en células endoteliales. El cocultivo de células de linfoma BC-1 y HUVEC, que se infectan de manera productiva con HVH-8, da como resultado la infección efectiva de las células endoteliales (16). Se examinaron las monocapas unidas de células endoteliales que permanecen tras el lavado exhaustivo para efrina B2 y EphB4 mediante RT-PCR e inmunofluorescencia. HUVEC expresan el marcador venoso EphB4 fuertemente a nivel del ARN, pero no efrina B2 (figura 46B). En contraposición, los cultivos infectados por HVH-8 (HUVEC/BC-1 y HUVEC/BC-3) expresan efrina B2, mientras que los transcritos de EphB4 están casi ausentes.

Se emprendió el análisis de inmunofluorescencia de cultivos de HUVEC y HUVEC/HVH-8 para marcadores arteriales/venosos y proteínas virales para determinar si los cambios en la expresión de proteínas reflejaban los observados en el ARN. Además, pudo determinarse la ubicación celular de las proteínas. De manera compatible con los datos de RT-PCR, HUVEC son negativas para efrina B2 y positivas para EphB4 (figura 46A (a y m)). Tal como se esperaba, no expresan ningún antígeno nuclear asociado a latencia de HVH-8 (LANA1) (figura 46A (b, n)). El cocultivo de células BC-1, que están infectadas productivamente con HVH-8, dio como resultado la infección de HUVEC tal como se muestra por la presencia de las proteínas virales LANA1 y ORF59 (figura 46A (f, r)). HUVEC infectadas por HVH-8 expresan ahora efrina B2 pero no EphB4 (figura 46A (e, q, u), respectivamente). La expresión de efrina B2 y LANA1 se coagrupan tal como se muestra por la señal amarilla en la imagen fusionada (figura 46A (h)). HUVEC infectadas por HVH-8 positivas para efrina B2 y negativas para EphB4 también expresan el marcador arterial CD148 (19) (figura 46A (j, v)). La expresión de efrina B2 y CD148 se coagrupan tal como se muestra por la señal amarilla en la imagen fusionada (figura 46A (l)). HUVEC no infectadas que expresan EphB4 fueron negativas para CD148 (no mostrado).

C. vGPCR de HVH-8 induce la expresión de efrina B2

Para someter a prueba si las proteínas virales individuales podían inducir la expresión de efrina B2 observada con el virus completo, se transfectaron de manera estable células KS-SLK con LANA o LANA440 o vGPCR de HVH-8. La inmunotransferencia de tipo Western de clones estables reveló una inducción de cinco veces de efrina B2 en KS-SLK transfectadas con vGPCR en comparación con SLK-LANA o SLK-LANA440 (figura 47A). Se usaron SLK transfectadas con el vector solo (pCEFL) como control. También se examinaron células SLK-vGPCR y SLK-pCEFL para determinar la expresión de efrina B2 y EphB4 mediante inmunofluorescencia en células KS-SLK transfectadas de manera transitoria. La figura 47B muestra la expresión superior de efrina B2 en las células SLK-vGPCR en comparación con SLK-pCEFL. No se observaron cambios en EphB4 en SLK-vGPCR en comparación con SLKpCEFL. Esto demuestra claramente que las células SLK-vGPCR expresaban altos niveles de efrina B2 en comparación con las células SLK-pCEFL. Esto sugiere que vGPCR de HVH-8 está implicado directamente en la

inducción de efrina B2 y el cambio de fenotipo arterial en el KS. Puesto que se había mostrado que HVH-8 inducía la expresión de efrina B2 en HUVEC, a continuación se cuestionó si esto podría estar mediado por un efecto transcripcional. Se construyeron plásmidos indicadores de ADN-luciferasa flanqueante en 5’ de efrina B2 tal como se describe en los materiales y métodos y se transfectaron de manera transitoria en HUVEC. Las secuencias de ADN flanqueante en 5’ de efrina B2 -2491/-11 tienen actividad mínima en células HUVEC (figura 47C). Esto concuerda con que la efrina B2 es un marcador arterial, no venoso. Sin embargo, se ha observado que HUVEC en cultivo sí expresan algo de efrina B2 a nivel del ARN. La cotransfección de vGPCR de HVH-8 induce la transcripción de efrina B2 aproximadamente 10 veces en comparación con el vector de expresión control pCEFL. Se observó una inducción aproximadamente igual con las secuencias de efrina B2 -2491/-11, -1242/-11, o - 577/-11, lo que indica que los elementos entre -577 y -11 son suficientes para mediar la respuesta a vGPCR, aunque se observa actividad máxima con el constructo de luciferasa -1242/-11.

D. La expresión de efrina B2 está regulada por VEGF y VEGF-C

A continuación se cuestionó si factores de crecimiento conocidos de KS podrían estar implicados en la inducción mediada por vGPCR de la expresión de efrina B2. Se trataron células SLK-vGPCR con anticuerpos neutralizantes frente a oncostatina-M, IL-6, IL-8, VEGF o VEGF-C durante 36 h. La figura 48A muestra que la neutralización de VEGF bloqueó completamente la expresión de efrina B2 en células SLK-vGPCR. Se observó una disminución inferior, pero significativa en efrina B2 con la neutralización de VEGF-C y IL-8. No se observó ningún efecto apreciable con la neutralización de oncostatina-M o IL-6. Para verificar que VEGF y VEGF-C son fundamentales para la inducción de la expresión de efrina B2, se trataron HUVEC con VEGF, VEGF-C o EGF. Se hicieron crecer HUVEC en medios EBM-2 que contenían FBS al 5% con dos concentraciones diferentes del factor de crecimiento individual (10 ng, 100 ng/ml) durante 48 h. Sólo VEGF-A o VEGF-C indujo expresión de efrina B2 de manera dependiente de la dosis (figura 48B). En contraposición, EGF no tuvo efecto sobre la expresión de efrina B2.

E. El ARNip frente a efrina B2 inhibe la expresión de efrina B2 en KS

Se sintetizaron tres ARNip frente a efrina B2 tal como se describe en la sección de métodos. Se transfectaron células KS-SLK con ARNip y 48 h después se determinó la expresión de efrina B2 mediante inmunotransferencia de tipo Western. Los ARNip 137 ó 254 frente a efrina B2 inhibieron aproximadamente el 70% de la expresión de efrina B2 en comparación con el ARNip de control tal como ARNip 50 frente a EphB4 o ARNip GFP. El ARNip 63 frente a efrina B2 fue menos eficaz que los dos ARNip anteriores frente a efrina B2 (figura 49A).

F. La efrina B2 es necesaria para la viabilidad de EC y KS completa, formación de cordón y actividades de angiogénesis in vivo

Entonces se usó el ARNip (254) frente a efrina B2 más eficaz para determinar si la inhibición de la expresión de efrina B2 tiene algún efecto sobre el crecimiento de células KS-SLK o HUVEC. La viabilidad de las células KS-SLK se disminuyó por los mismos ARNip que inhibieron los niveles de la proteína efrina B2 (figura 49B). KS-SLK expresa altos niveles de efrina B2 y este resultado muestra que el mantenimiento de la expresión de efrina B2 es fundamental para la viabilidad celular en este entorno. HUVEC no expresan efrina B2, excepto cuando se estimulan por VEGF tal como se muestra en la figura 48B. ARNip 264 frente a efrina B2 redujo drásticamente el crecimiento de HUVEC cultivadas con VEGF como el único factor de crecimiento. En contraposición, no se observó ningún efecto significativo cuando se cultivaron HUVEC con IGF, EGF y bFGF. Como control, ARNip 50 frente a EphB4 no tuvo ningún efecto perjudicial sobre HUVEC en ninguna condición de cultivo (figura 49C).Además de la inhibición de la viabilidad de células endoteliales primarias y con KS, EphB4-ECD inhibe la formación de cordón en HUVEC y KS-SLK y la angiogénesis in vivo en el ensayo de tapón de Matrigel™ (figura 50).

G. Métodos y materiales

Puede encontrarse una descripción detallada de los materiales y métodos para este ejemplo en la publicación de patente estadounidense n.º 20050084873.

EJEMPLO DE REFERENCIA 7. Expresión de EphB4 en cáncer de vejiga: un objetivo candidato para terapia

La figura 51 muestra la expresión de EphB4 en líneas celulares de cáncer de vejiga (A), y la regulación de la expresión de EphB4 mediante la ruta de señalización de EGFR (B).

La figura 52 muestra que la transfección de p53 inhibe la expresión de EphB4 en células 5637.

La figura 53 muestra la inhibición del crecimiento de una línea celular de cáncer de vejiga (5637) tras el tratamiento con ARNip 472 frente a EphB4.

La figura 54 muestra los resultados del estudio de apoptosis de células 5637 transfectadas con ARNip 472 frente a EphB4.

La figura 55 muestra los efectos de sondas antisentido contra EphB4 sobre la migración celular. Se trataron células 5637 con AS-10 frente a EphB4 (10 M).

La figura 56 muestra los efectos de ARNip frente a EphB4 sobre la invasión celular. Se transfectaron células 5637 con ARNip 472 o ARNip de control.

EJEMPLO DE REFERENCIA 8. Inhibición de la expresión del gen EphB4 mediante sondas antisentido contra EphB4 y sondas de iARN

Se trataron líneas celulares que expresan EphB4 con oligonucleótidos modificados mediante fosforotioato sintéticos y se recogieron tras 24 h. Se prepararon lisados celulares y se estudiaron mediante sonda mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western para determinar las cantidades relativas de EphB4 en comparación con células control no tratadas.

Se realizaron estudios sobre la inhibición de la proliferación celular en líneas celulares de HNSCC caracterizadas por expresar EphB4. Se mostró pérdida de viabilidad celular tras el silenciamiento de la expresión de EphB4. Se trataron las células in vitro y se cultivaron en placas de 48 pocillos, sembradas con 10 mil células por pocillo. Se añadió los compuestos de prueba y se sometió a prueba la viabilidad celular en el día 3. Los resultados sobre las sondas antisentido contra EphB4 se resumen a continuación en la tabla 6. Los resultados sobre las sondas de iARN frente a EphB4 se resumen a continuación en la tabla 7.

Puede encontrarse una descripción detallada de los constructos de ARNip y antisentido para este ejemplo en la publicación de patente estadounidense n.º 20050084873.

EJEMPLO DE REFERENCIA 9. Inhibición de la expresión génica de efrina B2 mediante sondas antisentido contra efrina B2 y sondas de iARN

KS-SLK, una línea celular que expresa un alto nivel endógeno de efrina B2. Se sometió a prueba la viabilidad celular usando una dosis fija de cada oligonucleótido (5 uM). Se realizó regulación por disminución de la expresión génica usando la línea celular 293 modificada por ingeniería genética para expresar de manera estable efrina B2 de longitud completa. También se usó KS-SLK que expresa efrina B2 para someter a prueba la viabilidad en respuesta a sondas de iARN sometidas a prueba a la dosis fija de 50 nM. Se midieron los niveles de expresión de proteínas usando células 293 que expresan de manera estable efrina B2 de longitud completa, en lisados celulares tras el tratamiento de 24 h con 50 nM fijado de sondas de iARN.

Los resultados sobre las sondas antisentido contra efrina B2 se resumieron a continuación en la tabla 8. Los resultados sobre las sondas de iARN frente a efrina B2 se resumieron a continuación en la tabla 9.

Puede encontrarse una descripción detallada de los constructos de ARNip y antisentido para este ejemplo en la publicación de patente estadounidense n.º 20050084873.

EJEMPLO DE REFERENCIA 10. Los anticuerpos contra EphB4 inhiben el crecimiento tumoral

La figura 57 muestra los resultados de la comparación de anticuerpos monoclonales contra EphB4 mediante G250 y en ensayo de co-inmunoprecipitación (“pull-down”).

La figura 58 muestra que anticuerpos contra EphB4, en presencia de Matrigel y factores de crecimiento, inhiben el crecimiento tumoral in vivo de células SCC15.

Se inyectaron a ratones desnudos BaIbC por vía subcutánea 2,5 x 106 células tumorales viables. SCC15 es una línea de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello. Se iniciaron los tumores en ratones nu/nu inyectando 2,5-5x106 células premezcladas con Matrigel y factores de crecimiento, y Ac por vía subcutánea para iniciar xenoinjertos de tumor. Se abrieron los ratones 14 días tras las inyecciones. SCC15 es una línea de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, B16 es una línea de células de melanoma y MCF-7 es una línea de carcinoma de mama. Se compararon las respuestas de los tumores a estos tratamientos con ratones tratados con control, que reciben inyecciones de PBS. Se observó a los animales diariamente para determinar el crecimiento tumoral y se midieron los tumores subcutáneos usando un calibre cada 2 días. Los anticuerpos n.º 1 y n.º 23 mostraron regresión significativa del tamaño tumoral de SCC15 en comparación con el control, especialmente sin factor de crecimiento adicional añadido.

La figura 59 muestra que anticuerpos contra EphB4 provocan apoptosis, necrosis y angiogénesis reducida en SCC15, un tipo de tumor de carcinoma de cabeza de cuello.

Se evaluó la angiogénesis mediante inmunohistoquímica de CD31. Se tiñeron secciones de tejido tumoral de ratones tratados y no tratados para determinar la presencia de CD31. Se evaluó la apoptosis mediante TUNEL inmunohistoquímico y la proliferación mediante ensayo de BrdU. Tras la extirpación quirúrgica, se cortaron los

tumores inmediatamente en secciones en serie de 2 mm y se incluyeron en parafina usando procedimientos convencionales. Se seccionó el tejido incluido en parafina a 5 m, se retiró la cera y se rehidrató el tejido. Se sometieron a microondas los tejidos rehidratados irradiados en disolución de recuperación antigénica. Se aclararon los portaobjetos en PBS, y se añadieron mezcla de reacción de TUNEL (disolución de nucleótidos marcados con fluoresceína y desoxinucleotidil transferasa terminal) y BrdU en una cámara de humedad protegida completamente de la luz. Entonces se retiraron la mezcla de reacción de TUNEL y BrdU, se aclararon los portaobjetos y se añadió anticuerpo anti-fluoresceína conjugado con peroxidasa de rábano. Tras la incubación y el aclarado, se añadió 3,3’diaminobencidina. También se usaron tinción tricrómica de Masson y hematoxilina y eosina para teñir los portaobjetos para visualizar la morfología. La tinción tricrómica de Masson permite visualizar necrosis y fibrosis. El tumor obtiene aporte de sangre del límite muscular, tumor/piel. A medida que crece el tumor, las regiones internas se agotan en nutrientes. Esto conduce a necrosis (muerte celular), preferiblemente en el centro del tumor. Una vez que mueren las células, el tejido (tumor) se reemplaza por tejido fibroblástico. Se visualizaron portaobjetos bajo aumentos de 20 veces, adquiriéndose imágenes digitales. Se obtuvo una morfología diferente en tumores de SCC con cada anticuerpo administrado. El Ac n.º 1 mostró un aumento en necrosis y fibrosis pero no en apoptosis. El Ac n.º 23 mostró un aumento en apoptosis, necrosis y fibrosis y una disminución en la infiltración de vasos. El Ac n.º 35 mostró un aumento en necrosis y fibrosis, y un pequeño aumento en apoptosis y una disminución en la infiltración de vasos. El Ac n.º 79 mostró un gran aumento en apoptosis y necrosis y fibrosis. El Ac n.º 91 no mostró ningún cambio en apoptosis, pero sí un aumento en proliferación. Y el Ac n.º 138 mostró un aumento en apoptosis, necrosis, fibrosis y una disminución en proliferación e infiltración de vasos. Los tumores tratados con PBS control mostraron densidad tumoral abundante y una respuesta angiogénica robusta. Los tumores tratados con anticuerpos contra EphB4 mostraron una disminución en la densidad de células tumorales una marcada inhibición de la angiogénesis tumoral en regiones con células tumorales viables, así como necrosis tumoral y apoptosis.

La figura 60 muestra que la administración sistémica de anticuerpos en xenoinjertos conduce a regresión tumoral en xenoinjertos de tumor de SCC15.

Se inició el tratamiento en días alternos con anticuerpo monoclonal contra EphB4 o un volumen igual de PBS como control en el día 4, una vez que los tumores se han establecido, y se continuó durante 14 días. Se aplicó administración sistémica o bien por vía i.p. o bien por vía s.c. sin diferencia significativa. Todos los experimentos se llevaron a cabo de manera doble ciego para eliminar el sesgo del investigador. Se sacrificó a los ratones a la conclusión del periodo de tratamiento de dos semanas. Se recogieron los tumores inmediatamente post mórtem y se fijaron y se procesaron para inmunohistoquímica. Se administraron 40 mg de anticuerpos contra EphB4 por kg de peso corporal. El tratamiento con anticuerpo contra EphB4 inhibió significativamente el crecimiento tumoral de SCC en comparación con los ratones tratados con control (p<0,05). El tratamiento con anticuerpo contra EphB4 inhibió significativamente el peso tumoral en comparación con los ratones tratados con control (p<0,05).

EJEMPLO 1. Fusión HSA-ectodominio de EphB4 y ectodominio de EphB4 modificado con PEG

A. Generación de fusión HSA-ectodominio de EphB4

Se amplificó por PCR un fragmento de albúmina sérica humana en forma XbaI-NotI para crear una fusión con GCF2, y se sometió a clonación TA en pEF6. En la siguiente etapa, se cortó el vector resultante con Xba I (digestión parcial) y se clonó el fragmento de HSA (1,8 kb) en el sitio Xba I de pEF6-GCF2-Xba para crear un vector de expresión de fusión. El vector resultante tenía una mutación puntual de C a T que conduce a sustitución de Thr por Ile en la posición 4 de la proteína madura. Se denominó pEF6-GCF2-HSAmut. En la siguiente etapa de clonación, se eliminó la mutación sustituyendo el fragmento mutado por el KpnI de tipo natural de pEF6-GCF2-IF (que contiene el fragmento del vector y la parte N-terminal de GCF2), este vector final se denominó pEF6-GCF2. Se confirmó la secuencia de ADN de pEF6-GCF2.

El aminoácido predicho de la proteína precursora HSA-EphB4 fue el siguiente (SEQ ID NO: 8):

La secuencia de aminoácidos predicha de la forma madura de la proteína HSA-EphB4 fue la siguiente (SEQ ID NO: 5 19):

La secuencia de ácido nucleico del plásmido pEF6-GCF2 fue la siguiente (SEQ ID NO: 20):

B. Cultivo celular y transfecciones

5 Se mantuvo la línea de células de riñón embrionarias humanas, células 293T, en DMEM con suero de ternero fetal dializado al 10% y los antibióticos penicilina/estreptomicina/neomicina al 1%. Se mantuvieron las células a 37ºC en una atmósfera humidificada del 5% de CO2/95% de aire.

Se realizaron transfecciones de plásmidos que codifican para el ectodominio de EphB4, fragmentos de los mismos y

10 fusiones EphB4-HSA usando el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según el protocolo sugerido. Un día antes de las transfecciones, se sembraron las células 293T a una alta densidad hasta alcanzar el 80% de confluencia en el momento de la transfección. Se diluyeron ADN de plásmido y el reactivo Lipofectamine a una razón 1:3 en medio sérico reducido Opti-MEM I (Invitrogen) durante 5 min y se mezclaron juntos para formar el complejo ADN -Lipofectamine. Por cada placa de cultivo de 10 cm, se usaron 10 g de ADN de plásmido. Tras 20 min, se añadió el

15 complejo anterior directamente a las células en medio de cultivo. Tras 16 horas de transfección, se aspiró el medio, se lavó una vez con DMEM libre de suero y se reemplazó con DMEM libre de suero. Se recogieron las proteínas secretadas tras 48 horas recogiendo el medio condicionado. Se aclaró el medio condicionado mediante centrifugación a 10.000 g durante 20 min y se filtró a través de un filtro de 0,2  y se usó para su purificación.

20 C. Separación cromatográfica del ectodominio de EphB4 y la proteína de fusión ectodominio de EphB4-HSA

Se purificó el ectodominio de EphB4 fusionado a HSA de la siguiente forma: se recogieron 700 ml de medios de células 293 transfectadas de manera transitoria que se hicieron crecer en medios libres de suero y se concentraron hasta un volumen final de 120 ml. Membrana: (Omega, 76 mm), punto de corte de 50 kDa. Tras la concentración, se

25 ajustó el pH de la muestra añadiendo 6 ml de NaAc 1 M, pH 5,5. Entonces se dializó la muestra frente a tampón de partida (SB): NaAc 20 mM, NaCl 20 mM, pH 5,5 durante la noche. Se equilibraron 5 ml de SP-Sepharose con SB y se cargó la muestra. Lavado: 100 ml de SB. Elución mediante NaCl: 12 ml/fracción e incrementos de 20 mM. La mayor parte de la actividad de unión a efrina B2 eluyó en las fracciones de 100 mM y 120 mM.

30 Se usaron fracciones, activas en el ensayo de unión a efrina B2 (véase cromatografía en SP, fracciones n.º 100120 mM) en una segunda etapa de purificación en la columna Q. Se dializaron las fracciones extraídas frente a tampón de partida n.º 2 (SB2): Tris-HCl 20 mM, NaCl 20 mM, pH 8 durante la noche y se cargaron en 2 ml de Q-Sepharose. Tras el lavado con 20 ml de SB2, se eluyó la proteína absorbida mediante NaCl: 3 ml/fracción con un incremento de concentración de 25 mM. Se analizaron las fracciones obtenidas mediante PAGE y en el ensayo de

unión a efrina-B2. Se encontró que las fracciones de 200 mM y 225 mM contenían la mayor parte de la proteína y la mayor parte de la actividad de unión de B2.

Se purificó la proteína de ectodominio soluble de EphB4 de la siguiente forma: se concentraron 300 ml de medio condicionado (véase: Cultivo celular y transfecciones) hasta un volumen final de 100 ml, usando una membrana de ultrafiltración con punto de corte de 30 kDa. Tras la concentración, se ajustó el pH de la muestra añadiendo 5 ml de acetato de Na 1 M, pH 5,5. Entonces se dializó la muestra frente a tampón de partida (StB): acetato de Na 20 mM, NaCl 20 mM, pH 5,5 para O/IN. Se equilibraron 5 ml de SP-Sepharose con StB y se cargó la muestra. Tras lavar la columna con 20 ml de StB, se eluyeron las proteínas absorbidas mediante gradiente lineal de concentración de NaCl (20-250 mM y volumen de elución total de 20 volúmenes de columna). Se analizó la pureza de las proteínas mediante PAGE.

D. Biotinilación de sB4 y la proteína de fusión sB4-HSA.

Se marcaron con biotina tanto la proteína de ectodominio de EphB4 soluble (sB4) como el ectodominio de EphB4 fusionado a HSA (HSA-sB4) a través de cadenas de hidrato de carbono usando meta-peryodato de sodio como oxidante y biotina-hidrazida EZ-Link (PIERCE, n.º de cat. 21339) según el protocolo del fabricante. Se sometió a prueba la estabilidad in vitro de la proteína sB4 biotinilada incubando 2,0x10-9 con 40 l de suero de ratón a 37ºC durante 0, 0,5, 1, 2 y 3 días. Se añadieron dos l de perlas magnéticas y B2-AP durante una hora extra a temperatura ambiente. Tras lavarla dos veces con tampón, se añadió pnPP durante 1 hora. Se encontró que la proteína sB4 biotinilada era muy estable a lo largo de tres días, perdiéndose menos del 10% de la actividad de unión de B2 a lo largo del tiempo.

E. Propiedades de unión a efrina-B2 de B4-HSA

Para someter a prueba si la propiedad de fusión B4-HSA conservaba la capacidad del dominio extracelular de EphB4 para unirse a efrina B2, se comparó la capacidad de la fusión B4-HSA purificada con la de la fusión GCF2F, GCF2, GC, CF y B4-Fc, que comprende el dominio extracelular de B4 fusionado a Fc de IgG1h tal como se describe en el ejemplo 1. Se inocularon muestras de la proteína biotilinada o con cola de His con las perlas magnéticas de afinidad correspondiente y B2-AP durante una hora a temperatura ambiente, antes de la adición de PnPP. Los resultados de los ensayos de unión se muestran en la figura 67. Se encontró que B4-HSA conservaba la mayor parte de su actividad de unión hacia efrina B2. Sorprendentemente, la proteína B4-HSA era superior a la fusión B4-Fc en la unión a efrina B2.

También se generó una fusión del ectodominio de EphB4 al extremo C-terminal de HSA y se encontró que conservaba la capacidad para unirse a efrina B2 y se encontró que tenía estabilidad potenciada in vivo con respecto al ectodominio de EphB4.

F. Estabilidad de B4-HSA frente a sB4 en ratones

Se sometió a ensayo la estabilidad de sB4-HSA y sB4 biotiniladas purificadas in vivo. Cada una de las proteínas se inyectó por vía intravenosa en la cola de ratones en la cantidad de 0,5 nmoles por ratón. Se extrajo sangre del ojo de cada ratón en intervalos de tiempo de 15 min (0 días), 1, 2, 3 y 6 días. Se usaron 10 ml del suero obtenido en el ensayo de unión con la proteína de fusión efrina-B2-fosfatasa alcalina y perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina como fase sólida. La estabilidad de las dos proteínas se muestra en la figura 68. Se encontró que sB4-HSA tenía estabilidad superior con respecto a sB4. Por ejemplo, un día tras la inyección, los niveles de sB4-HSA en la sangre de los ratones fueron 5 veces mayores que los de sB4.

G. Pegilación de sB4 biotinilada

Antes de la pegilación, se concentró la proteína sB4 biotinilada generada tal como se describió anteriormente hasta la concentración final de 2 mg/ml usando una ultramembrana de MWCO de 30 kDa. Se dializó la muestra durante la noche frente a tampón de acoplamiento: fosfato 30 mM, NaCl 75 mM, pH 8,00. Se realizó el acoplamiento a PEG a 4ºC durante 18 horas en un exceso molar de 10 veces de reactivo PEG lineal a menos que se indique otra cosa. El reactivo PEG usado fue PEG-propionato de succinimidilo, que tiene un peso molecular de aproximadamente 20 kDa. El acoplamiento a PEG puede realizarse de manera similar usando PEG ramificados, tales como de 10 kDa, 20 kDa

o 40 kDa. También pueden usarse otras moléculas de PEG lineales de 10 ó 40 kDa.

Tras la pegilación, se dializó la muestra de proteínas que contiene el ectodominio de EphB4 frente a StB durante la noche. Se equilibraron tres ml de SP-Sepharose con StB y se cargó la muestra. Se realizó el lavado y la elución de las proteínas absorbidas igual que anteriormente (véase: Purificación de ectodominio de EphB4 soluble y su fusión a HSA) con sólo una modificación: el volumen de elución total fue 40 volúmenes de columna. La figura 69 muestra la separación cromatográfica de derivados PEG de la proteína EphB4 en columnas de SP-Sepharose. Se analizó la pureza de la proteína EphB4 modificada con PEG mediante SDS-PAGE.

Se usó sB4 modificada de manera doble (pegilada biotinilada) en cromatografía de intercambio iónico para separar proteínas no pegiladas, monopegiladas y polipegiladas entre sí. Se dializó la muestra pegilada durante la noche frente a acetato de Na 20 mM, NaCl 20 mM, pH 5,5 y se cargó en 2 ml de SP-Sepharose. Tras lavar con 10 ml de tampón, se separaron las proteínas absorbidas mediante elución gradual de NaCl: 3 ml/fracción e incremento de NaCl 25 mM. Se analizaron las fracciones obtenidas mediante PAGE y en el ensayo de unión a efrina-B2.

H. Efecto de las condiciones de pegilación sobre la unión de sB4 a efrina B2

Se determinaron los efectos de sB4 pegilada biotinilada en diferentes condiciones de pH. Se pegiló sB4 a pH 6, 7 u 8, y se sometieron a prueba los productos pegilados para determinar su unión a efrina B2 tal como se muestra en la figura 69. Se conservaba la actividad de unión a efrina B2 cuando la pegilación se realizaba a pH 6 y pH 7, pero se perdía parcialmente a pH 8.

Se sometieron a prueba combinaciones de parámetros adicionales, incluyendo temperatura, pH y razón molar de agente de pegilación con respecto a proteína sB4 y la capacidad de los productos de la reacción de pegilación para unirse a efrina-B2. Los resultados del experimento de optimización se muestran en la figura 70. Estos resultados confirman la disminución gradual en la actividad de unión a B2 a pH básico.

I. Purificación de las especies de sB4 pegiladas

Se concentró la proteína sB4 biotinilada hasta la concentración final de 2 mg/ml usando una ultramembrana de MWCO de 30 kDa. Se dializó la muestra durante la noche frente a tampón de acoplamiento: fosfato 30 mM, NaCl 75 mM, pH 8,00. Se realizó el acoplamiento a PEG a 4ºC durante 18 horas en un exceso molar de 10 veces de reactivo PEG. Se usó sB4 modificada de manera doble (pegilada biotinilada) en cromatografía de intercambio iónico para separa proteínas no pegiladas, monopegiladas y polipegiladas entre sí. Se dializó la muestra durante la noche frente a acetato de Na 20 mM, NaCl 20 mM, pH 5,5 y se cargó en 2 ml de SP-Sepharose. Tras lavar con 10 ml de tampón, se separaron las proteínas absorbidas mediante elución gradual de NaCl: 3 ml/fracción e incremento de NaCl 25 mM. Se analizaron las fracciones obtenidas mediante PAGE tal como se muestra en la figura 71. Se encontró que las fracciones 1, 2 y 3 correspondían a sB4 biotinilada polipegilada, monopegilada y no pegilada.

J. Propiedades in vitro de derivados de EphB4 pegilados

Se sometieron a prueba las fracciones 1, 2 y 3 de sB4 biotinilada y pegilada de la purificación en columna de SP, correspondientes a sB4 biotinilada polipegilada, monopegilada y no pegilada, para determinar su capacidad para unirse a efrina B2 usando el ensayo convencional. Los resultados de este experimento se muestran en la figura 72. Se encontró que el orden de la actividad de unión era no pegilada > monopegilada > polipegilada.

También se sometieron a prueba las fracciones para determinar su estabilidad in vitro. Se sometieron a prueba las fracciones para determinar la conservación de la actividad de unión a efrina B2 tras la incubación en suero de ratón a 37ºC durante tres días. Los resultados de este experimento se muestran en la figura 73. Se encontró que el orden de estabilidad in vitro era monopegilada > no pegilada > polipegilada.

K. Análisis de estabilidad in vivo de derivados pegilados del ectodominio de EphB4 en ratones

Se introdujeron las fracciones 1, 2 y 3 de sB4 biotinilada y pegilada de la purificación en columna de SP, correspondientes a sB4 biotinilada polipegilada, monopegilada y no pegilada, mediante inyección intravenosa en ratones en la cantidad de 0,5 nmoles/ratón. Se extrajo sangre de cada ratón en el intervalo de tiempo de 10 min, 1, 2 y 3 días. Se usaron 10 ml del suero obtenido en el ensayo de unión con la proteína de fusión efrina-B2-fosfatasa alcalina y perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina como fase sólida. Las señales, obtenidas a los 10 min, se consideraron como el 100%. Los dos ratones para cada proteína eran de una variedad diferente. Los resultados se muestran en la figura 74. Se encontró que la pegilación aumentaba la estabilidad de EphB4 in vivo en relación con EphB4 no pegilada

Aunque se han comentado realizaciones específicas de la invención objeto, la memoria descriptiva anterior es ilustrativa y no limitativa. Resultarán evidentes muchas variaciones de la invención para los expertos en la técnica con la revisión de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones a continuación. El alcance completo de la invención debe determinarse haciendo referencia a las reivindicaciones y la memoria descriptiva.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1. Polipéptido soluble aislado que comprende un dominio extracelular de una proteína EphB4 fusionado a una proteína albúmina o fragmento de la misma, en el que el polipéptido es un monómero, se une específicamente a un

   5 polipéptido de efrina B2, tiene una semivida sérica in vivo aumentada en comparación con la del dominio extracelular sin modificar de EphB4, e inhibe la señalización que resulta de la interacción entre EphB4 y efrina B2.
2. 2. Polipéptido según la reivindicación 1, que comprende una secuencia idéntica en al menos el 90% a los residuos

   29-197 de la secuencia de aminoácidos definida por la figura 65. 10
3. 3. Polipéptido según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende una secuencia idéntica en al menos el 90% a los residuos 29-526 de la secuencia de aminoácidos definida por la figura 65.
4. 4. Polipéptido según cualquier reivindicación anterior, en el que dicha proteína albúmina se selecciona del grupo que 15 consiste en una albúmina sérica humana (HSA) y albúmina sérica bovina (BSA).
5. 5. Polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la albúmina es una variante que se produce de manera natural.

   20 6. Polipéptido según cualquier reivindicación anterior, en el que el polipéptido comprende uno o más residuos de aminoácido modificados.
6. 7. Composición farmacéutica que comprende un polipéptido según cualquier reivindicación anterior, y un portador

   farmacéuticamente aceptable. 25

7. 8.

   Composición cosmética que comprende el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y un portador farmacéuticamente aceptable.

8. 9.

   Polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para su uso en (a) la reducción de la tasa de

   30 crecimiento de un tumor en un paciente, (b) el tratamiento de cáncer en un paciente, o (c) el tratamiento de un paciente que padece una enfermedad asociada con la angiogénesis seleccionada de cáncer dependiente de angiogénesis, tumores benignos, trastornos inflamatorios, reumatismo articular crónico, enfermedades angiogénicas oculares, síndrome de Osler-Webber, angiogénesis en el miocardio, neovascularización de placas, telangiectasia, articulaciones hemofílicas, angiofibroma, psoriasis, esclerodermia, granuloma piogénico, rubeosis, artritis y

   35 neovascularización diabética.
9. 10. Uso de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para preparar un medicamento para su uso en (a) la reducción de la tasa de crecimiento de un tumor en un paciente, (b) el tratamiento de cáncer en un paciente, o (c) el tratamiento de un paciente que padece una enfermedad asociada con la angiogénesis

   40 seleccionada de cáncer dependiente de angiogénesis, tumores benignos, trastornos inflamatorios, reumatismo articular crónico, enfermedades angiogénicas oculares, síndrome de Osler-Webber, angiogénesis en el miocardio, neovascularización de placas, telangiectasia, articulaciones hemofílicas, angiofibroma, psoriasis, esclerodermia, granuloma piogénico, rubeosis, artritis y neovascularización diabética.

   45 11. Polipéptido para su uso según la reivindicación 9 o uso según la reivindicación 10, en el que el cáncer comprende células cancerosas que expresan efrina B2 y/o EphB4 a un nivel superior al de células no cancerosas de un tejido comparable.
10. 12. Polipéptido para su uso o uso según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que el cáncer es cáncer 50 metastásico.
11. 13. Polipéptido para su uso o uso según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en carcinoma de colon, tumor de mama, mesotelioma, tumor de próstata, carcinoma de células escamosas, sarcoma de Kaposi y leucemia.
12. 14. Polipéptido para su uso o uso según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en el que el cáncer es un cáncer dependiente de angiogénesis.
13. 15. Polipéptido para su uso o uso según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, en el que el cáncer es un 60 cáncer independiente de angiogénesis.