DE60207043T2

DE60207043T2 - Histidin-reiches glykoprotein (hrgp) zur inhibierung der angiogenese

Info

Publication number: DE60207043T2
Application number: DE60207043T
Authority: DE
Inventors: Claesson Lena WELSH; Helena Larsson; Anna-Karin Olsson
Original assignee: Innoventus Project AB
Current assignee: Innoventus Project AB
Priority date: 2001-02-05
Filing date: 2002-02-04
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2022-02-05
Also published as: US20020165131A1; CA2436340A1; DE60207043D1; ATE308335T1; US7563765B2; WO2002076486A3; JP2004527242A; EP1357930A2; ES2252461T3; EP1357930B1; US20050042201A1; WO2002076486A2; US7205392B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Inhibierung der Angiogenese, und insbesondere die Verwendung von Histidin-reichem Glykoprotein (HRGP), für die Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung von Angiogenese.
BESCHREIBUNG DES STANDES DER TECHNIK
HRGP ist ein Heparin-bindendes Plasmaprotein, das durch Heimburger et al. identifiziert wurde. Siehe Heimburger et al. (1972) Physiol. Chem. 353:1133-1140. Die durchschnittliche Konzentration von HRGP in Plasma ist etwa 100 μg/ml. Siehe Drasin und Sahud (1996) Thrombosis Research 84:179-188. Die Aminosäuresequenzen von Maus-, Ratte-, (Hulett und Parish (2000) Immunology and Cell Biology 78: 280-287), Kaninchen- (Borza et al. (1996) Biochemistry 35:1925-1934) und humanem (Koide et al. (1986) Biochemistry 25:2220-2225) HRGP wurden geklärt. Strukturell kann das HRGP-Molekül in drei Hauptdomänen eingeteilt werden. Die Amino-terminale Domäne, die etwa 250 Aminosäurereste umfasst, enthält zwei Cysteinprotease-Inhibitor (Cystatin)-artige "Stretches", die die Klassifikation von HRGP als Mitglied einer Cystatin-Superfamilie zusammen mit α2HS-Glykoprotein und Kininogen ermöglichen. Es gibt sechs vermeintliche Stellen für N-verknüpfte Glykosylierung im Aminoterminalen Teil von HRGP. Eine zentrale Domäne enthält Tandemwiederholungen des Pentapeptids [H/P]-[H/P]PHG. Beide, die zentrale Domäne und die C-terminale Domäne mit 105 Aminosäuren, sind über Disulfid an die Cystatin-artigen "Stretches" in der Amino-terminalen Domäne gebunden (Borza et al., 1996). HRGP bindet Heparin/Heparansulfate (Lijnen et al. (1983) J. Biol. Chem. 258:3803-3808) in einer pH-abhängigen Wechselwirkung (Peterson et al. (1987) J. Biol. Chem. 262: 7567-7574). Die isolierte Histidin-Prolin-reiche Mitteldomäne vermittelt eine Heparinbindung (Borza et al., 1996), allerdings ist die Amino-terminale Domäne bei der Heparinbindung ebenfalls impliziert. Siehe Koide et al. (1986) FEBS Lett. 194:242-244. Eine kongenitale Defiziens an HRGP wurde für eine Einzel-Nucleotid-Mutation kartiert, welche im Ersatz von Gly85 durch Glu in HRGP resultiert. Diese Mutation führt zu einer ineffizienten Prozessierung des Proteins, von dem der Hauptteil intrazellulär zurückgehalten wird. Als Folge sind die Serumlevel von HRGP auf 25-30% der normalen Level reduziert. Siehe Shigekiyo et al. (1993) Thromb. Haemost. 70:263-265, und Shigekiyo et al. (1998) Blood 91:128-133. HRGP inhibiert die anti-angiogenetische Wirkung von Thrombospordin-1 in in vivo-Cornea-Angiogenese-Assays (Simantor et al. (2001), J. Clin. Invest. 45-52).
Angiogenese, der Prozess der Bildung neuer Blutgefäße, der zur Neovaskularisation führt, ist während der Embryoentwicklung, der Ovulation, der cyclikalen Entwicklung der Endometriumdrüse, der Wundheilung, des Gewebe- und Organwachstums, der Entzündungs- und Wundheilung essentiell. Es wird angenommen, dass eine unausgewogene Neovaskularisation zur Pathogenese bestimmter Krankheitszustände, z.B. Arthritis, Psoriasis, Hämangiomen, dia betischer Retinopathie und retrolentaler Fibroplasie, beiträgt und das Auftreten von Tumorwachstum und Metastasenbildung zulässt. Siehe z.B. US 5 854 205 . Tumorzellen müssen neue Gefäße anziehen, um lokal zu expandieren und Metastasen zu produzieren.
ZUSAMMENFASSUNG
Die Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass die Verabreichung von HRGP an einen Säuger zur Inhibierung von Angiogenese führt.
Nach einem Aspekt ist die Erfindung durch eine Zusammensetzung gekennzeichnet, die ein HRGP-Polypeptid und ein anti-angiogenetisches Mittel und/oder ein anti-neoplastisches Mittel umfasst. Die Zusammensetzung kann einen pharmazeutischen Carrier umfassen, der zur Verabreichung an einen Säuger annehmbar ist. Das HRGP-Polypeptid kann z.B. intaktes HRGP, ein modifiziertes HRGP-Polypeptid oder ein Fragment von intaktem HRGP umfassen. Dieses Fragment von intaktem HRGP kann die Amino-terminale Domäne, die zentrale Domäne oder die C-terminale Domäne von intaktem HRGP umfassen, ist aber nicht darauf beschränkt, oder kann ein Fragment umfassen, das wenigstens eine Tandemwiederholung des Pentapeptids [H/P]-[H/P]PHG umfasst. Das anti-angiogenetische Mittel kann z.B. Angiostatin, Thrombostatin, Endostatin, Interferon-α, Interferon-induzierbarer Faktor 10, Thrombozytenfaktor 4 oder ein COX-2-Inhibitor sein.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Zusammensetzung, die ein HRGP-Polypeptid in Kombination mit einem anti-angiogenetischen Mittel und/oder einem antineoplastischen Mittel umfasst, zur Verwendung als Medikament. Darüber hinaus bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung der genannten Kombination zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung der Angiogenese.
In der Erfindung werden auch Herstellungsgegenstände gekennzeichnet, umfassend Verpackungsmaterialien und ein HRGP-Polypeptid mit einem anti-angiogenetischen und/oder anti-neoplastischen Mittel innerhalb des Verpackungsmaterials, wobei das Verpackungsmaterial eine Kennzeichnung oder Verpackungsbeilage umfasst, die anzeigt, dass das HRGP-Polypeptid einem Säuger zur Inhibition von Angiogenese zu verabreichen ist.
Nach einem anderen Aspekt kennzeichnet die Erfindung die Verwendung eines HRGP-Polypeptids für die Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung von Angiogenese in einem Säuger. Der Säuger kann einen Angiogenese-abhängigen Krebs haben oder kann an einem mit Angiogenese in Verbindung stehenden Krankheitsbild leiden. Ein solches mit Angiogenese in Verbindung stehendes Krankheitsbild kann myokardiale Angiogenese, diabetische Retinopathie, diabetische Neovaskularisation, ungeeignete Wundheilung oder eine Entzündungskrankheit umfassen, ist aber nicht auf diese beschränkt.
Nach einem anderen Aspekt kennzeichnet die Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren eines anti-angiogenetischen Polypeptids. Das Verfahren kann Messen des Effekts eines HRGP-Polypeptids auf FGF-2-induzierte Migration von primären Rinder-Nebennierencortex-Kapillarendothelzellen und Identifizieren des HRGP-Polypeptids als ein anti-angiogenetisches Polypeptid, wenn die FGF-2-induzierte Migration in Gegenwart des HRGP-Polypeptids signifikant verringert ist, umfassen. Alternativ kann das Verfahren Messen des Effektes eines HRGP-Polypeptids auf Hühner-Chorioallantoismembran-Angiogenese und Identifizieren des HRGP-Polypeptids als anti-angiogenetisches Polypeptid, wenn die Hühner-Chorioallantoismembran-Angiogenese in Gegenwart des HRGP-Polypeptids signifikant verringert ist, umfassen. Bei einer anderen Alternative kann das Verfahren Messen des Effektes eines HRGP-Polypeptids auf das Wachstum eines Angiogenese-abhängigen Tumors in einem Säuger und Identifizieren des HRGP-Polypeptids als anti-angiogenetisches Polypeptid, wenn das Tumorwachstum in Gegenwart des HRGP-Polypeptids signifikant verringert ist, umfassen. Das HRGP-Polypeptid kann ein HRGP-Fragment sein. Der Angiogenese-abhängige Tumor kann z.B. ein Fibrosarkom, ein Neuroblatsom oder ein Teratom sein. Der Tumor kann z.B. in einer Maus oder einer Ratte entstanden sein.
Wenn nichts anderes definiert ist, haben alle technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke, die hierin verwendet werden, dieselbe Bedeutung, wie sie von einem Fachmann auf dem Fachgebiet, zu dem die Erfindung gehört, allgemein verstanden wird. Obgleich Verfahren und Materialien, die ähnlich oder äquivalent den hierin Beschriebenen sind, bei der Durchführung und den Tests der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, werden geeignete Verfahren und Materialien beschrieben. Im Streitfall wird die vorliegende Beschreibung, einschließlich der Definitionen, entscheiden. Die Materialien, Verfahren und Beispiele sind außerdem nur erläuternd und nicht dazu bestimmt, beschränkend zu sein.
Die Details einer oder mehrerer Ausführungsformen der Erfindung sind in den beigefügten Zeichnungen und in der folgenden Beschreibung ausgeführt. Andere Merkmale, Aufgaben und Vorzüge der Erfindung werden aus der Beschreibung und den Zeichnungen und aus den Ansprüchen klar.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Effekte von HRGP auf FGF-2-induzierte Endothelzell-Migration. Primäre Rinder-Kapillarendothelzellen (BCE) wurden bezüglich ihrer Fähigkeit, in einer Mini-Boyden-Kammer in Gegenwart oder in Abwesenheit von HRGP zu FGF-2 zu wandern, untersucht. Es sind die Mittelwerte ± SEM von drei unterschiedlichen Experimenten gezeigt.
2 ist ein Diagramm, das die Inhibition von Tumorwachstum mit der Verabreichung von HRGP zeigt. In 2A wurden weibliche C57BL6/J-Mäuse subkutan mit 0,5 × 10⁶ T241-Zellen in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) geimpft. Wenn Tumoren tastbar waren (Behandlungstag 0), wurden Tiere statistisch eingeteilt, um eine 11-tägige Behandlung mit 4 mg/kg/Tag mit HRGP (n=8) oder PBS (n=10) durch s.c.-Injektion zu erhalten. In 2B wurde eine Parallelgruppe von Mäusen, die tastbare T241-Tumore trugen, PBS (N=6) oder Thermolysin-gespaltenes Antithrombin (N=6) injiziert. AT=Thermolysin-gespaltenes Antithrombin.
3 zeigt Hauptdomänen von HRGP, umfassend: einen N-terminalen Cystatinartigen Teil, eine Histidin/Prolin-reiche Mitteldomäne und eine C-terminale Region. Gezeigt ist auch ein Volllängen-HRGP mit einem His-Tag (His 1) und zwei C-terminal verkürzte Polypeptide (His 3-4). 6 × His = His-Tag, EK = Enterokinase-Spaltungsstelle. Die Zahlen 390 und 320 zeigen den C-terminalen Rest der verkürzten Polypeptide an. Die mit 0115, 0116 und 0119 markierten Balken geben die Positionen der Peptide an, gegen die Kaninchen-Antikörper entwickelt wurden.
4 zeigt den Effekt von rHRGP auf FGF-2- und Serum-induzierte Migration. A. FGF-induzierte Migration von BCE-Zellen wurde durch 100 ng/ml rHRGP inhibiert. Serum (FCS)-induzierte Migration wurde durch HRGP nicht inhibiert. B. Dosis-Antwort-Kurve von rHRGP gegen FGF-induzierte Migration von BCE-Zellen. FGF-2 wurde mit 5 ng/ml verwendet.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Es wurde entdeckt, dass gereinigtes humanes Plasma-HRGP eine Chorioallantoismembran (CAM)-Angiogenese, eine Endothelzell-Migration und Tumorwachstum inhibiert. Eine Behandlung der CAM mit Wachstumsfaktoren, z.B. Fibroblastenwachstumsfaktor 2 (FGF-2) oder vaskulärem Endothelzellwachstumsfaktor A (VEGF-A) stimuliert eine Angiogenese in der CAM. Überraschenderweise resultiert die Anwendung eines zehnfachen molaren Überschusses von HRGP zusammen mit FGF-2 oder VEGF-A in einer Suppression der Angiogenese. Primäre Rinder-Kapillarendothel (BCE)-Zellen wandern zu FGF-2 in einer Mini-Boyden-Kammer, und zwar mit einer 150%igen Zunahme gegenüber der Grundmigration. Diese erhöhte Migration wurde durch Co-Inkubation mit HRGP vollständig unterdrückt. Schließlich wurde beobachtet, dass Injektionen von gereinigtem HRGP zu einer drastischen Reduzierung des Fibrosarkom-Tumorwachstums in Mäusen führte, wobei Tumore um 75% in der Größe reduziert wurden. Siehe Beispiel 9 und 2. Auf der Basis dieser unerwarteten Feststellungen sind HRGP-Polypeptide ein neues und neuartiges therapeutisches Mittel für die Behandlung von Krankheiten oder Prozesse, die durch Angiogenese vermittelt sind oder diese involvieren. HRGP-Polypeptide werden zur Behandlung oder Unterdrückung des Wachstums von Angiogenese-abhängigem Krebs besonders nützlich sein.
Die HRGP-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können aus frisch gesammeltem humanen Serum gereinigt werden oder durch gut bekannte rekombinante Methodologien produziert werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die HRGP-Polypeptide umfassen, können Subjekten verabreicht werden, bei denen es wünschenswert ist, eine Angiogenese zu inhibieren. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden HRGP-Polypeptide in Kombination mit anderen anti-angiogenetischen Verbindungen und/oder anti-neoplastischen Verbindungen für die Behandlung von Krankheiten verwendet.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Kits, umfassend Verpackungsmaterialien und ein isoliertes HRGP-Polypeptid in Kombination mit einem anti-angiogenetischen Mittel und/oder anti-neoplastischen Mittel, wobei das Verpackungsmaterial eine Kennzeichnung oder Packungsbeilage umfasst, die anzeigt, dass das Polypeptid einem Säuger zur Inhibition von Angiogenese zu verabreichen ist.
PRODUKTION VON HRGP-POLYPEPTIDEN
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung von im Wesentlichen reinen HRGP-Polypeptiden zur Verfügung. Der Ausdruck "im Wesentlichen rein", wie er hierin bezüglich eines Polypeptids verwendet wird, meint, dass das Polypeptid im Wesentlichen frei von anderen Polypeptiden, Lipiden, Kohlenhydraten und Nucleinsäure, mit denen es natürlicherweise assoziiert ist, ist. Demnach ist ein im Wesentlichen reines Polypeptid ein beliebiges Polypeptid, das aus seiner natürlichen Umgebung entfernt wurde. Wie hierin verwendet, kann ein im Wesentlichen reines HRGP-Polypeptid wenigstens 60% rein sein und kann wenigstens etwa 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 oder 99% rein sein. Typischerweise wird ein im Wesentlichen reines Polypeptid auf einem nicht-reduzierenden Polyacrylamidgel eine einzelne Hauptbande ergeben.
Die cDNA- und Aminosäuresequenzen von HRGP aus mehreren verschiedenen Spezies sind bekannt. Die vollständigen cDNA- und Aminosäuresequenzen sind für humanes (Koide et al. (1986) FEBS Lett. 194:242-244), Ratten- und Maus-HRGP (Hulett und Parish (2000) Immunology and Cell Biology 78:280-287) bekannt. Eine partielle cDNA-Sequenz, der die codierende Region für die Leadersequenz fehlt, und die abgeleitete Volllängen-Aminosäuresequenz sind für Kaninchen-HRGP bekannt. Siehe Borza et al. (1996) Biochemistry 35:1925-1934. Eine partielle Aminosäuresequenz für Rinder-HRGP, abgeleitet durch direkte Proteinsequenzierung, ist ebenfalls verfügbar. Siehe Sorenson et al. (1993) FEBS Lett. 328:285. Fünf-Aminosäuren-Polymorphismen in humanem HRGP wurden von Hennis et al. identifiziert: Ile162, Pro186, His322, Arg430 und Asn475. Siehe Hennis et al. (1995) Thromb. Haemost. 74:1491 und Hennis et al. (1995) Thromb. Haemost. 74:1497. Shigekiyo et al. identifizierten einen weiteren Glu85-Polymorphismus. Siehe Shigekiyo et al. (1998) Blood 91:128.
Es wird einzusehen sein, dass der Ausdruck "HRGP-Polypeptid" nicht nur intaktes HRGP umfasst. Der Ausdruck "HRGP-Polypeptid" beinhaltet auch verlängerte Proteine oder Peptide, in denen eine oder mehrere Aminosäuren an einem oder an beiden Enden von HRGP angefügt sind oder an eine innere Region von HRGP angefügt sind. Der Ausdruck "HRGP-Polypeptid" umfasst auch HRGP-Polypeptide, die mit detektierbaren Gruppierungen oder Toxinen, z.B. Ricin, markiert sind.
Der Ausdruck HRGP-Polypeptid umfasst Polypeptide, die eine der drei Hauptdomänen des HRGP-Moleküls und funktionelle Fragmente davon umfassen. Die Amino-terminale Domäne, die etwa 250 Aminosäurereste umfasst, enthält zwei Cysteinprotease-Inhibitor (Cystatin)-artige "Stretches". Es gibt sechs vermeintliche Stellen für N-verknüpfte Glykosylierung in der Amino-terminalen Domäne von HRGP. Die zentrale Domäne enthält Tandemwiederholungen des Pentapeptids [H/P]-[H/P]PHG, und die C-terminale Domäne enthält 105 Aminosäuren. Sowohl die zentrale Domäne als auch die C-terminale Domäne sind durch Disulfid an die Cystatin-artigen "Stretches" in der Amino-terminalen Domäne gebunden (siehe Borza et al., 1996). Die isolierte Histidin-Prolin-reiche Mitteldomäne vermittelt eine pH-abhängige Heparinbindung (Borza et al., 1996). Die Amino-terminale Domäne ist auch bei der Heparinbindung impliziert.
Der Ausdruck HRGP-Polypeptide umfasst z.B. verkürzte Polypeptide, die eine Länge von 75 oder mehr Aminosäureresten (z.B. 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 320, 325, 350, 390 oder mehr Aminosäurereste) hat und zu einem Teil einer HRGP-Aminosäuresequenz identisch ist.
In einigen Ausführungsformen behalten HRGP-Polypeptide die anti-angiogenetische Aktivität des intakten HRGP-Polypeptids bei. Solche HRGP-Polypeptide behalten wenigstens 5% (z.B. 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% oder noch mehr) der anti-angiogenetischen Aktivität des intakten Volllängen-HRGP bei. Die antiangiogenetische Aktivität wird in den CAM oder Endothelzellen-Migrations-Assays, die unten beschrieben werden, analysiert.
In der Definition für "HRGP-Polypeptid" enthalten sind auch "modifizierte HRGP-Polypeptide". Solche modifizierten HRGP-Polypeptide behalten anti-angiogenetische Aktivität bei. Modifizierte HRGP-Polypeptide umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, HRGP-Polypeptide mit Substitutionen natürlich vorkommender Aminosäuren an spezifischen Stellen mit anderen Molekülen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, natürlich auftretende und nicht natürlich auftretende Aminosäuren. Mit umfasst werden auch HRGP-Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz enthalten, die eine einzelne Insertion, eine einzelne Deletion, eine einzelne Substitution, mehrere Insertionen, mehrere Deletionen, mehrere Substitutionen oder eine beliebige Kombination davon (eine einzelne Deletion zusammen mit mehreren Insertionen) enthält. Diese verschiedenen Modifikationen können unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, produziert werden; diese umfassen Techniken auf der Basis der Polymerasekettenreaktion (PCR) und ortsspezifische in vitro-Mutagenese, um eine oder mehrere Aminosäureänderungen einzuführen oder um die Protein-codierende Sequenz an vorher festgelegten Aminosäureresten zu kürzen. Siehe z.B. Kunkel et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488-492.
In der Definition für modifizierte HRGP-Polypeptide sind auch HRGP-Polypeptide eingeschlossen, die mit anderen Verbindungen, z.B. Polyethylenglykol (PEG)-Polymeren, verknüpft sind. Die Derivatisierung von Aminosäuren an der Oberfläche von Polypeptiden, z.B. HRGP-Polypeptiden, mit PEG-enthaltenden Verbindungen kann die Zirkulations-Lebenszeit solcher Polypeptide verlängern und ihre potentiellen antigenen Eigenschaften reduzieren. Siehe Beauchamp et al. (1983) Anal. Biochem. 131(1):25-33. Das Molekulargewicht von verwendetem PEG ist nicht besonders beschränkt, ist üblicherweise 300 bis 30.000, vorzugsweise 1.000 bis 15.000. Das Verfahren der PEG-Modifikation kann ein beliebiges aus dem Stand der Technik sein. Siehe z.B. Beauchamp et al. (1983) Anal. Biochem. 131(1):25-33.
Außerdem kann ein modifiziertes HRGP-Polypeptid im Rahmen der Erfindung so "manipuliert" werden, dass es eine Aminosäuresequenz enthält, die ermöglicht, dass das Polypeptid an einer Affinitätsmatrix eingefangen wird. Beispielsweise kann ein Tag, z.B. c-myc-, Hämagglutinin-, Polyhistidin- oder F1ag^TM-Tag (Kodak) eingesetzt werden, um eine Polypeptidreinigung zu unterstützen. Solche Tags können irgendwo innerhalb des Polypeptids, einschließlich entweder am Carboxyl- oder Amino-Terminus, insertiert werden. HRGP-Polypeptide können auch als Fusionen mit Enzymen, die eine Detektion des Polypeptids unterstützen, z.B. alkalische Phosphatase, produziert werden.
Es kann ein beliebiges Verfahren verwendet werden, um ein im Wesentlichen reines HRGP-Polypeptid zu erhalten. Beispielsweise kann intaktes HRGP aus frisch gesammeltem humanen Plasma durch Chromatographie an Phosphocellulose in Gegenwart von Proteinase-Inhibitoren im Anschluss an die Verfahren gereinigt werden. Siehe Rylatt et al. (1981) Eur. J. Biochem. 119:641-646, oder Kluszynski et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:13541-13547. Das resultierende Protein ist zu 95% rein, wie es durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) bestimmt wird. HRGP-Domänen, einschließlich der N-terminalen Domäne, der C-terminalen Domäne und der zentralen Domäne, können aus HRGP isoliert werden, das einer beschränkten Plasminproteolyse nach dem Verfahren, das bei Borza et al. (1996) Biochemistry 35:1925-1934, ausgeführt ist, unterzogen wird. Als Quelle kann ein beliebiges Material verwendet werden, um ein im Wesentlichen reines Polypeptid zu erhalten. Beispielsweise können Gewebekulturzellen, die ein bestimmtes Polypeptid von Interesse exprimieren, eingesetzt werden, um im Wesentlichen reines Polypeptid zu erhalten. Zusätzlich zu Polypeptid-Reinigungstechniken, z.B. Affinitätschromatographie und HPLC, können Polypeptid-Synthesetechniken eingesetzt werden, um ein HRGP-Polypeptid zu produzieren.
HRGP-Polypeptide können auch durch rekombinante Verfahren produziert werden. Die cDNA-Sequenzen von Kaninchen- (Borza et al. (1996) Biochemistry 35:1925-1934), Ratten-, Maus- (Hulett und Parish (2000) Immunology and Cell Biology 78: 280-287) und humanem (Koide et al. (1986) FEBS Lett. 194:242-244) HRGP sind fachbekannt. Verfahren für die Expression eines Proteinproduktes durch einen cDNA-Klon sind gut bekannt. Siehe z.B. Maniatis et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., Seiten 16.1-17.44. Das produzierte HRGP-Polypeptid kann entweder ein intaktes HRGP-Polypeptid oder ein Fragment von HRGP sein. Geeignete Expressionssysteme umfassen, ohne Beschränkung, Mikroorganismen, z.B. Bakterien (z.B. E. coli und B. subtilis), die mit rekombinanter Bakteriophagen-DNA-, Plasmid-DNA- oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren transformiert wurden; Hefe (z.B. Saccharomyces und Pichia), die mit rekombinanten Hefe-Expressionsvektoren transformiert wurden; Insektenzellsysteme, die mit rekombinanten Virus-Expressionsvektoren infiziert wurden (z.B. mit Baculovirus); Pflanzenzellsysteme, die mit rekombinanten Virus-Expressionsvektoren (z.B. Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) und Tabakmosaikvirus (TMV)) infiziert wurden oder mit rekombinanten Plasmid-Expressionsvektoren (z.B. Ti-Plasmid), die Fusionsprotein-Nucleotidsequenzen enthalten, transformiert wurden; oder Säugerzellsysteme (z.B. HEK, COS-, CHO-, BHK-, 293-, VERO-, HeLa-, MDCK-, WI38- und NIH 3T3-Zellen), die mit Expressionskonstrukten transformiert wurden, welche Promotoren enthalten, die aus einem Genom von Säugerzellen (z.B. der Metallothionein-Promotor) oder aus Säugerviren (z.B. der Adenovirus-später-Promotor und der Vacciniavirus-7.5K-Promotor) stammen. Auch verwendbar als Wirtszellen sind primäre oder sekundäre Zellen, die direkt aus einem Säuger, transfiziert mit einem Plasmidvektor oder infiziert mit einem viralen Vektor, z.B. Herpesviren, Retroviren, Vacciniaviren, abgeschwächte Vacciniaviren, Kanarienpockenviren, Adenoviren, Adeno-assoziierten Viren, Lentiviren und Herpesviren, unter anderen, erhalten werden.
ASSAYS AUF ANTI-ANGIOGENESE-AKTIVITÄT
Anti-angiogenetische Aktivität kann im CAM-Assay analysiert werden, und zwar im Wesentlichen wie es in Friedlander et al. und Dixelius et al. beschrieben ist. Siehe Friedlander et al. (1995) Science 5241:1500, und Dixelius et al. (2000) Blood 95:3403. Kurz ausgedrückt, es wird ein 1 × 1 cm-Fenster in der Schale angelegt, das eine avaskuläre Zone der CAM eines befruchteten Hühnerembryos freilegt. Die zu untersuchende Probe wird auf diese avaskuläre Zone aufgebracht, das Fenster wird mit Klebeband verschlossen, und der Hühnerembryo wird für drei weitere Tage inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wird die CAM unter einem Lichtmikroskop untersucht, um zu sehen, ob durch die Probe Endothelzellwachstum inhibiert worden war, wodurch angezeigt wird, dass die getestete Probe anti-angiogenetisch ist. Eine statistisch signifikante Abnahme beim CAM-Score von 1,0 oder mehr im Vergleich zu dem Score des Stimulators allein zeigt an, dass ein HRGP-Polypeptid anti-angiogenetische Aktivität hat.
Alternativ kann die anti-angiogenetische Aktivität eines HRGP-Polypeptids bestimmt werden, indem der Effekt des HRGP-Polypeptids auf die Unterdrückung einer FGF-2-induzierten Migration von Rinder-Kapillarendothelzellen in einer modifizierten Boyden-Kammer analysiert wird. Siehe Auerbach et al. (1991) Pharmacol. Ther. 51:1-11. Eine statistisch signifikante Abnahme von wenigstens 50% bei der FGF-2-induzierten Migration im Vergleich zu einer Migration in Gegenwart von FGF-2 allein zeigt, dass ein HRGP-Polypeptid antiangiogenetische Aktivität hat.
Anti-angiogenetische Aktivität eines HRGP-Polypeptids kann auch bestimmt werden, indem der Effekt des Polypeptids auf das Wachstum eines Angiogenese-abhängigen Tumors in einem Säuger, z.B. Fibrosarkomwachstum in Tieren, gemessen wird. Ein HRGP-Polypeptid, das nach Verabreichung an Tumor-tragende Mäuse eine statistisch signifikante Inhibition des Tumorvolumens erreicht, wird als eins mit anti-angiogenetischer Aktivität angesehen. In einigen Ausführungsformen kann ein anti-angiogenetisches HRGP-Polypeptid in einer 10%igen Reduktion des Tumorvolumens im Vergleich zu einem Kontroll-Peptid, von dem bekannt ist, dass es keinen Effekt auf Tumorwachstum hat, resultieren. In anderen Ausführungsformen kann ein anti-angiogenetisches HRGP-Polypeptid das Tumorvolumen um 15% oder mehr, 20% oder mehr, 30% oder mehr, 50% oder mehr, 75% oder mehr oder 90% oder mehr, verglichen mit einem Kontroll-Polypeptid, das keinen Effekt auf Tumorwachstum hat, reduzieren.
Es ist einzusehen, dass zur Beurteilung des Effektes eines HRGP-Polypeptids eine Differenz als statistisch signifikant bei einem p-Wert von ≤ 0,05 bei einer geeigneten Parameter- oder Nicht-Parameter-Statistik, z.B. Chi-Square-Test, Student-t-Test, Mann-Whitney-Test oder F-Test, angesehen wird.
ZUSAMMENSETZUNGEN, DIE HRGP UMFASSEN
Eine Zusammensetzung der Erfindung umfasst ein HRGP-Polypeptid in Kombination mit einem anti-angiogenetischen Mittel und/oder einem anti-neoplastischen Mittel. In einigen Ausführungsformen umfasst eine Zusammensetzung auch einen pharmazeutisch annehmbaren Carrier.
Anti-angiogenetische Mittel umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Interferoninduzierbares Protein 10 und Fragmente und Analoga von Interferon-induzierbarem Protein 10, TGF-beta, Thrombospondin, Interleukin-1 (IL-1), gamma- und alpha-Interferon (IFN), Gewebe-Inhibitor von Metalloproteinase-1 (TIMP-1), Thrombozytenfaktor 4 bzw. Plättchenfaktor 4 (PF4), Protamin, Fumagillin, Angiostatin und dergleichen.
Anti-neoplastische Mittel, die zur Verwendung in dieser Erfindung in Betracht gezogen werden, sind solche Mittel, die als chemotherapeutische Mittel für Tumorzellen toxisch sind. Chemotherapeutische Mittel umfassen Alkylierungsmittel, Antimetaboliten, natürliche Produkte, Hormone und Antagonisten, Modifizierungsmittel für eine biologische Antwort (z.B. Interferon und hämatopoetische Wachstumsfaktoren), Differenzierungsmittel, z.B. Butyrat-Derivate, Antikörper gegen Tumorantigene und andere gemischte Mittel. Spezifische Beispiele umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Taxol, Cyclophosphamid, Carboplatinum, Cisplatinum, Cisplatin, Gancyclovir, Camptothecin, Paclitaxel, Hydroxyharnstoff, 5-Azacytidin, 5-Aza-2'-desoxycytidin, Suramin, Retinoide und dergleichen. Eine Verwendung von chemotherapeutischen Mitteln ist besonders in Situationen nützlich, in denen der zu behandelnden Säuger eine große, vorher existierende Tumormasse hat, die gut vaskularisiert ist. Das chemotherapeutische Mittel dient zur Verringerung der Tumormasse, und das HRGP-Polypeptid verhindert oder inhibiert eine Neovaskularisierung innerhalb der Tumormasse oder um die Tumormasse herum.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die HRGP umfassen, können durch intravenöse Infusion verabreicht werden oder können subkutan, intramuskulär, interperitoneal, intrarektal, intravaginal, intranasal, intragastrisch, intratracheal, intrapulmonal, intratumoral oder intraläsional injiziert werden. Die erforderliche Dosierung hängt vom Verabreichungsweg, der Natur der Formulierung, der Natur der Krankheit des Patienten, der Größe, dem Gewicht des Subjekts, dem Oberflächenbereich, dem Alter und dem Geschlecht, anderen verabreichten Arzneimitteln und der Beurteilung des behandelnden Arztes ab. Im Hinblick auf die Vielzahl der Verabreichungswege sind weite Schwankungen bei der benötigten Dosierung zu erwarten. Schwankungen bei diesen Dosierungsleveln können eingestellt werden, indem empirische Standard-Routineuntersuchungen zur Optimierung, wie sie auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, verwendet werden. Verabreichungen können einfach oder mehrfach erfolgen (z.B. 2- oder 3-, 4-, 6-, 8-, 10-, 20-, 50-, 100-, 150-mal oder öfter).
Pharmazeutisch annehmbare Carrier sind biologisch kompatible Vehikel, die zur Verabreichung an einen Säuger, wie z.B. einen menschlichen Patienten, geeignet sind, z.B. physiologische Salzlösung. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten typischerweise etwa 0,1 bis 90 Gew.-% (z.B. 1-20% oder 1 bis 10%) eines erfindungsgemäßen therapeutischen Mittels in einem pharmazeutisch annehmbaren Carrier. Injizierbare Formulierungen der Zusammensetzungen können verschiedene Carrier, z.B. Pflanzenöle, Dimethylacetamid, Dimethylformamid, Ethyllactat, Ethylcarbonat, Isopropylmyristat, Ethanol, Polyole (Glycerin, Propylenglykol, flüssiges Polyethylenglykol und dergleichen) enthalten. Für intravenöse Injektionen können wasserlösliche Versionen der Verbindungen durch das Tropfverfahren verabreicht werden, wobei eine pharmazeutische Formulierung, die HRGP und ein physiologisches Exzipiens enthält, durch Infusion verabreicht wird. Physiologisch annehmbare Carrier können z.B. 5% Dextrose, 0,9% Salzlösung, Ringers-Lösung oder andere geeignete Carrier umfassen. Intramuskuläre Präparate, z.B. eine sterile Formulierung einer geeigneten löslichen Salzform der Verbindungen, kann in einem pharmazeutischen Exzipiens, z.B. 0,9%ige Salz- oder 5%ige Glucoselösung, aufgelöst und verabreicht werden. Eine geeignete unlösliche Form der Verbindung kann als eine Suspension in einer wässrigen Grundlage oder einer pharmazeutisch annehmbaren Öl-Grundlage, z.B. einem Ester einer langkettigen Fettsäure (z.B. Ethyloleat), hergestellt und verabreicht werden. Eine topische, halbfeste Salbenformulierung enthält typischerweise eine Konzentration des aktiven Ingrediens von etwa 1 bis 20%, z.B. 5 bis 10%, in einem Carrier, z.B. einer pharmazeutischen Creme-Grundlage. Verschiedene Formulierungen zur topischen Verwendung umfassen Tropfen, Tinkturen, Lotionen, Cremes, Lösungen und Salben, die das aktive Ingrediens und verschiedene Träger und Vehikel enthalten. Der optimale prozentuale Anteil des therapeutischen Mittels in jeder pharmazeutischen Formulierung variiert entsprechend der Formulierung selbst und der therapeutischen Wirkung, die bei den spezifischen Pathologien und den damit in Beziehung stehenden therapeutischen Behandlungsplänen gewünscht ist. Verfahren zur Herstellung solcher Formulierungen sind gut bekannt und können z.B. in "Remington's Pharmaceutical Sciences" gefunden werden.
Eine therapeutisch wirksame Menge ist eine Menge, die fähig ist, bei einem behandelten Säuger, z.B. einem menschlichen Patienten, ein medizinisch wünschenswertes Resultat zu erzeugen. Wie es auf medizinischem Gebiet gut bekannt ist, hängt die Dosierung für einen Patienten von vielen Faktoren ab; diese umfassen die Größe des Patienten, den Körperoberflächenbereich, das Alter, die besondere zu verabreichende Verbindung, Geschlecht, Zeit und Verabreichungsweg, allgemeinen Gesundheitszustand und andere Arzneimittel, die gleichzeitig verabreicht werden. Die Dosierungen werden variieren, allerdings ist eine bevorzugte Dosierung zur Verabreichung etwa 0,01 bis 1.000 mg/kg Körpergewicht. Beispielsweise kann eine bevorzugte Dosierung 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 5,0, 10, 25, 50, 100, 500, 750 oder 1.000 mg/kg Körpergewicht umfassen, ist aber nicht darauf beschränkt. Es wird erwartet, dass die bevorzugte Verabreichung intravenös sein wird.
Ein anti-angiogenetisches HRGP-Polypeptid kann einem Subjekt verabreicht werden, in dem eine Inhibierung der Angiogenese gewünscht wird. Geeignete Subjekte bzw. Personen umfassen, ohne Beschränkung, solche mit einem einer Vielzahl angiogenetisch abhängiger Krebsarten, z.B. Rhabdomyosarcom, Glioblastom multiforme, Leiomyosarcom, Prostatakarzinom, Mammakarzinom, Lungenkarzinom, Melanom, Blasenkarzinom, Pankreaskarzinom und Nierenkarzinom. Angiogenetische Krankheiten, die für eine Behandlung unter Verwendung von HRGP-Polypeptid zugänglich sind, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, diabetische Retinopathie, diabetische Neovaskularisation, retrolentale Fibroplasie, Trachom, neovaskuläres Glaukom, Psoriasis, Angiofibrom, immune und nicht-immune Entzündung, Kapillarbildung in arteriosklerotischen Plaque, myokardiale Angiogenese, Hämangiom, übermäßige Wundreparatur, verschiedene Entzündungskrankheiten und jede andere Krankheit, die durch übermäßige und/oder deregulierte Angiogenese gekennzeichnet ist.
HERSTELLUNGSGEGENSTÄNDE
HRGP-Polypeptide in Kombination mit einem anti-angiogenetischen Mittel und/oder einem anti-neoplastischen Mittel können als Herstellungsgegenstand verpackt sein, der eine oder mehrere Einzeldosisformen enthält. Der Herstellungsgegenstand umfasst typischerweise wenigstens einen Behälter mit einem Etikett. Dieser Behälter kann z.B. Glas- oder Kunststoffflaschen oder Phiolen, Metall- oder Kunststofffolie umfassen und kann auch eine Einzeldosis-Blisterverpackung umfassen. Der Behälter enthält eine Zusammensetzung, die ein HRGP-Polypeptid umfasst. Der Verpackung kann eine Kennzeichnung oder eine Packungsbeilage beigefügt sein, die anzeigt, dass das Polypeptid zur Inhibierung von Angiogenese zu verabreichen ist; sie kann auch Anweisungen für eine in vivo- oder ex vivo-Verwendung angeben. Der Herstellungsgegenstand kann auch einen zweiten Behälter umfassen, der ein geeignetes Verdünnungsmittel oder einen geeigneten Puffer umfasst. Er kann außerdem andere Materialien umfassen, die unter kommerziellen Gesichtspunkten und vom Standpunkt des Verbrauchers aus wünschenswert sind, einschließlich Puffer, Filter, Nadeln, Spritzen, Verpackungsbeilagen mit Instruktionen zur Verwendung.
THERAPEUTISCHE VERFAHREN ZUR INHIBIERUNG VON ANGIOGENESE
Ein anti-angiogenetisches HRGP-Polypeptid kann einer Person verabreicht werden, bei der gewünscht wird, eine Angiogenese zu inhibieren. Geeignete Personen umfassen, ohne Beschränkung, solche mit einer Vielzahl von angiogenetisch abhängigen Krebsarten, z.B. Rhabdomyosarcom, Glioblastom multiforme, Leiomyosarcom, Prostatakarzinom, Mammakarzinom, Lungenkarzinom, Melanom, Blasenkarzinom, Pankreaskarzinom und Nierenkarzinom. Angiogenetische Erkrankungen, die einer Behandlung unter Verwendung von HRGP-Polypeptid zu gänglich sind, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, diabetische Retinopathie, diabetische Neovaskularisation, retrolentale Fibroplasie, Trachom, neovaskuläres Glaukom, Psoriasis, Angiofibrom, immune und nicht-immune Entzündung, Kapillarbildung in arteriosklerotischen Plaque, myokardiale Angiogenese, Hämangiom, übermäßige Wundreparatur, verschiedene Entzündungskrankheiten und jede andere Krankheit, die durch übermäßige und/oder deregulierte Angiogenese gekennzeichnet ist.
Typischerweise wird ein anti-angiogenetisches HRGP-Polypeptid in einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht. Für therapeutische Anwendungen wird HRGP-Polypeptid einem Säuger, z.B. einem Menschen, in einer pharmazeutisch annehmbaren Dosierungsform verabreicht. HRGP-Polypeptid kann intravenös als Bolus oder durch kontinuierliche Infusion über einen Zeitraum, auf intramuskulärem, subkutanem, intraartikulärem, intrasynovialem, intrathekalem, oralem, topischem Weg oder auf Inhalationswegen verabreicht werden. Eine kontinuierliche lokale Langzeitabgabe eines HRGP-Polypeptids kann durch die Implantation von mirkoverkapselten HRGP-Polypeptid-sezernierenden Zellen erreicht werden. Siehe z.B. Read et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19(1):29-34, und Joki et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19(1):35-39.
Zur Prävention oder Behandlung einer Krankheit wird die geeignete Dosierung von HRGP-Polypeptid vom zu behandelnden Krankheitstyp, der Schwere und dem Verlauf der Krankheit, dem Verlauf einer früheren Therapie, der medizinischen Geschichte des Patienten und dem Ansprechen auf das HRGP-Polypeptid sowie vom Urteil des behandelnden Arztes abhängen. Das HRGP-Polypeptid wird dem Patienten bei einer einmaligen Behandlung oder während einer Behandlungsreihe verabreicht. In Abhängigkeit vom Typ und der Schwere der Krankheit ist etwa 0,01 bis etwa 1000 mg HRGP-Polypeptid/kg Körpergewicht des Patienten eine Anfangs-Kandidaten-Dosierung zur Verabreichung an den Patienten, ob z.B. durch eine oder mehrere getrennte Verabreichungen oder durch kontinuierliche Infusion. Für wiederholte Verabreichungen über mehrere Tage oder länger wird die Behandlung, abhängig vom Zustand, wiederholt, bis eine gewünschte Suppression der Krankheitssymptome auftritt. Es können allerdings andere Dosierungspläne nützlich sein und sind nicht ausgeschlossen.
Die Behandlungswirksamkeit kann durch verschiedene Parameter beurteilt werden; diese umfassen Tumorgrößenverringerung, wie sie durch Messung von Hautmassen bestimmt wird, wie sie durch Röntgenstrahlen, Scans und andere Mittel der Tumorgrößenbeurteilung bestimmt wird; Fehlen von Tumorprogression, wie sie durch die oben aufgelisteten Verfahren beurteilt wird, reduzierte Keloidbildung, was durch Messung und Beurteilung oberflächlicher Läsionen bestimmt wird; Verbesserung von retinalen Läsionen, die mit diabetischer Retinopathie verbunden sind, was durch vergleichende Analyse von Photographien des Retinafundus und andere geeignete Burteilungsmethoden bestimmt wird; fehlendes Fortschreiten von diabetischer Retinopathie, wie es durch die oben aufgelisteten Methoden bestimmt wird. Pharmakolo gische Blutspiegel an HRGP-Polypeptid können durch ELISA, Einfang-Assays, Radioimmuno-Assays, Rezeptorbindungs-Assays und dergleichen bestimmt werden.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen näher beschrieben; diese sollen den Rahmen der Erfindung, der in den Ansprüchen beschrieben wird, nicht beschränken.
Beispiel 1 - Gewebekultur
Eine Schweineaortaendothel (PAE)-Zelllinie, die FGF-Rezeptor-1 (FGFR-1) überexprimiert, wurde in Ham's F12-Medium, supplementiert mit 10% fötalem Rinderserum (FCS), kultiviert. Siehe Wennström et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:13749. Primäre Rinder-Nebennierencortex-Kapillarendothel (BCE)-Zellen wurden auf Gelatine-beschichteten Gewebekulturschalen in Dulbecco's modifiziertem Medium, das mit 10% FCS und 1 ng/ml FGF-2 (Boehringer Mannheim) ergänzt war, kultiviert. U-343 MG-humane Gliomazellen wurden in Dulbecco's modfiziertem Medium, ergänzt mit 10% FCS, kultiviert. Swiss 3T3-Fibroblasten wurden in DMEM, das in 10% FCS supplementiert war, kultiviert. Humane Embryonieren (HEK) 293-EBNA-Zellen wurden in DMEM/10% FCS kultiviert.
Beispiel 2 - Chorioallantoismembran (CAM)-Assay
Die Bedingungen für den CAM-Assay, die befolgt wurden, waren im Wesentlichen, wie sie bei Friedlander et al. und Dixelius et al. beschrieben wurden. Siehe Friedlander et al. (1995) Science 5241:1500, und Dixelius et al. (2000) Blood 95:3403. Befruchtete Hühnerembryos wurden lokal gekauft und für 10 Tage bei 38°C mit 70% Feuchtigkeit vorinkubiert. Direkt über dem Luftsack am Ende des Eis wurde ein kleines Loch gebohrt. An der CAM wurde eine avaskuläre Zone identifiziert, und über diesem Bereich wurde ein zweites Loch in die Eischale gemacht. Die CAM wurde durch Anlegen von Vakuum an das erste Loch von der Schale abgetrennt. Filterscheiben (Whatman Inc.) wurden mit 3 mg/ml Cortisonacetat (Sigma) gesättigt und in Puffer (30 μl für jeden Filter) mit oder ohne FGF-2 (Boehringer Mannheim; 0,2 μg für jeden Filter), VEGF-A (Peprotech; 0,2 μl für jeden Filter) und gereinigtes HRGP (3 μg für jeden Filter) eingeweicht. Die CAM wurde nach Anlegen eines 1 × 1 cm-Fensters in der Schale freigelegt, und die Probe wurde an einen avaskulären Teil der Membran addiert. Die Fenster wurden mit Klebeband verschlossen, und die Hühnerembryos wurden für drei weitere Tage inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Membran um den Filter ausgeschnitten, der nach unten gedreht wurde, und es wurde im Lichtmikroskop (Nikon Eclipse TE 300, Vergrößerung 2,5 oder 4) untersucht.
Beispiel 3 - Assay auf Endothelzell-Migration
Der Migrations-Assay wurde in einer modifizierten Boyden-Kammer (siehe Auerbach et al. (1991) Pharmacol. Ther. 51:1-11) unter Verwendung von Mikroporen-Nitrocellulosefiltern (8 μm dick, 8 μm Poren), die mit einer Typ I-Collagen-Lösung mit 100 μg/ml (Vitrogen 100, Collagen Corp.) beschichtet waren, durchgeführt. Primäre BCE-Zellen oder humane Gliomzellen (U-343 MG) wurden für 30 min mit HRGP (100 ng/ml) vorinkubiert, trypsiniert und mit einer Konzentration von 4,0 × 10⁵ Zellen/ml in Ham's F 12-Medium, das 0,1 % fötales Kälberse rum (FCS) enthielt, resuspendiert. Die Zellsuspension wurde in die obere Kammer gegeben, und Medium, das 0,1% FCS in Kombination mit 5 ng/ml FGF-2 oder 5 ng/ml von Thrombozyten stammenden Wachstumsfaktor-BB (PDGF-BB; Peprotech Inc.) und 100 ng/ml HRGP, einzeln oder in Kombination, enthielt, wurde unter den Filter in die untere Kammer gegeben. Als positive Kontrolle wurde FCS mit 10% verwendet. Nach 4 h bei 37°C wurde das Medium entfernt, und Zellen, die am Filter klebten, wurden in reinem Methanol fixiert und mit Giemsa-Färbung gefärbt. Zellen an der Unterseite des Filters wurden in drei getrennten mikroskopischen Feldern gezählt, wobei Bildanalyse-Software (Easy Image Analysis) von Bergström Instruments, Schweden, verwendet wurde. Alle Proben wurden in wenigstens sechs Vertiefungen für jede Behandlung analysiert.
Beispiel 4 - Tierstudien
Tierstudien wurden in der Tierabteilung des Biomedical Center, Uppsala University, durchgeführt, waren durch die lokale Behörde für Tierexperimente genehmigt und wurden entsprechend den UKCCCR-Richtlinien für das Wohl von Tieren in experimenteller Neoplasie durchgeführt. Siehe Workman et al. (1988) Lab. Anim. 22:195-201. 6 Wochen alte, weibliche C57BL6/J-Mäuse (Mollegard/Bomhultgard, Dänemark) wurden akklimatisiert und in Gruppen von fünf in Käfigen gehalten und wurden mit einer Nahrung aus Tierfutter und Trinkwasser ad lib. gefüttert. Die Mäuse wurden mit Isofluran (Forene; Abbott, Schweden) während aller Behandlungen anästhesiert. T241-Fibrosarkomzellen, 0,5 × 10⁶ in 50 μl DMEM, wurden subkutan in die linke Flanke der Maus injiziert.
Tiere, die tastbare Tumoren trugen, wurden randomisiert und erhielten eine Behandlung mit 4 mg/kg/Tag HRGP oder Vehikel (PBS) oder als Kontrolle, Thermolysin-gespaltenes Antithrombin, gegeben als tägliche subkutane Injektionen in die rechte Seite bzw. Flanke für elf Tage. Die Tumoren wurden mit einem Greifzirkel einmal am Tag in einem Doppelt-Blindverfahren gemessen, und die Volumina wurden durch die Formel π/6 × Breite² × Länge errechnet. Die statistische Analyse wurde unter Verwendung von ANOVA durchgeführt. Nach etwa 11 Tagen Behandlung wurden die Mäuse mit einer letalen Dosis an Pentobarbiton getötet und mit 4% Paraformaldehyd in Millonig-Phosphatpuffer, pH 7,4, perfundiert. Die Tumoren wurden dann nach histologischen Standardverfahren in Paraffin eingebettet und in Schnitte mit 4 μm Dicke geschnitten.
Beispiel 5 - Immunpräzipitation und Blotting (ist nicht Teil der Erfindung)
PAE/FGFR-1-Zellen, die in Beispiel 1 beschrieben wurden, wurden über Nacht an Serum hungern gelassen und mit FGF-2 (100 ng/ml) oder HRGP (1 μg/ml) stimuliert oder nicht, und zwar einzeln oder in Kombination, für 10 Minuten bei 37°C. Die Zellen wurden in Nonidet P40-haltigem Puffer lysiert, Proben wurden durch SDS-PAGE getrennt und auf Hybond-C extra (Amersham Pharmacia Biotech) transferiert. Die Membranen wurden mit Anti-PhosphoErk1/2-Antikörpern (New England Biolabs Inc.) oder Anti-Phosphop38-Antikörpern (New England Biolabs Inc.) immungeblottet. Immunreaktive Proteine wurden durch ein Chemi- Lumineszenz-Detektionssystem sichtbar gemacht. Siehe Matthews et al. (1985) Anal. Biochem. 151:205-209.
Beispiel 6 - HRGP inhibiert CAM-Angiogenese
Die CAM von 10 Tage alten Hühnerembryos wurde freigelegt, indem ein Fenster in die Schale gemacht wurde. Eine Behandlung der CAM mit Wachstumsfaktoren, z.B. FGF-2, stimulierte eine Angiogenese in der CAM (Tabelle 1). Die Applikation von FGF-2 oder VEGF-A zusammen mit einem zehnfachen molaren Überschuss an HRGP auf die CAM resultierte in der Suppression der Angiogenese.
Tabelle 1 Inhibitorischer Effekt von HRGP auf Hühner-Chorioallantoismembran-Angiogenese, induziert durch FGF-2 oder VEGF-A (0,2 μg/Filter)
Der Score von 0 (niedrig) bis 3 (hoch) basierte auf der Anzahl von Gefäßverzweigungspunkten nach dem Verfahren von Friedlander et al., 1995, und Dixelius et al. (2000). Es wurden Mittelwerte für 5-6 Embryos aufgezeichnet. Die Variabilität war weniger als 15%. Diese Resultate zeigen, dass HRGP anti-angiogenetische Aktivität hat, wie sie durch einen Chorioallantoismembran-Assay gemessen wird.
Beispiel 7 - HRGP inhibiert Endothelzell-Migration
Angiogenese ist ein kollektiver Begriff für eine Anzahl von Veränderungen, die vaskuläre Endothelzellen zur Bildung eines neuen Gefäßes durchmachen, z.B. Proliferation, Migration und Differenzierung. Siehe Gerwins et al. (2000) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 34:185-194. Unter Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Assays wurde der Effekt von HRGP auf Endothelzell-Migration analysiert. Primäre Rinder-Kapillarendothel (BCE)-Zellen wanderten gegen FGF-2 mit einer 150%igen Erhöhung gegenüber der Basal-Migration in einer Mini-Boyden-Kammer. Diese verstärkte Migration wurde durch Co-Inkubation von FGF-2 mit HRGP mit 100 ng/ml vollständig unterdrückt (1). Dagegen wurde eine Migration von U-343 MG-Humangliomzellen gegen PDGF-BB durch HRGP nicht inhibiert. Die Resultate zeigen, dass HRGP anti-angiogenetische Aktivität hat, wie sie durch einen Endothelzell-Migrations-Assay gemessen wird.
Beispiel 8 - Signaltransduktion
Die Effekte von HRGP auf eine FGF-2-induzierte Signaltransduktion in Endothelzellen wurden in dem in Beispiel 5 beschriebenen Assay getestet. PAE/FGFR-1-Zellen wurden mit 100 ng/ml FGF-2 oder 50 ng/ml VEGF-A für 7 min in Gegenwart oder in Abwesenheit von 1 μg/ml HRGP behandelt. Es wurden Gesamtzelllysate hergestellt und durch SDS-PAGE und Immunblotting analysiert. HRGP hatte keinen Einfluss auf die VEGF-A- oder FGF-2-induzierte Aktivierung von MAP-Kinasen, z.B. Erk1/2, oder die FGF-2-induzierte Aktivierung von p38, was anzeigt, dass eine FGF-2-vermittelte FGFR-1-Aktivierung und eine Signaltransduktion durch HRGP nicht beeinträchtigt wurden. Es gab einen leichten Anstieg beim Basallevel von Erk1/2- und p38-Aktivitäten in den HRGP-behandelten Zellen.
Beispiel 9 - Inhibierung von Fibrosarkom-Tumorwachstum in Mäusen
HRGP inhibierte das Wachstum von Fibrosarkom in Mäusen in dem in Beispiel 4 beschriebenen Assay. HRGP, das aus humanem Plasma gereinigt worden war, wurde verwendet, um C57/schwarze Mäuse zu behandeln, die an ihrer linken Seite tastbare, subkutane T241-Fibrosarkomas trugen. Als Kontrolle wurden C27/schwarze Mäuse mit PBS behandelt. Behandlungen wurden täglich als subkutane Injektionen mit einer Dosis von 4 mg/kg in die rechte Flanke gegeben, bis die Größe des Kontrolltumors den oberen Level von 2,5 cm² erreichte (etwa 11 Tage). Injektionen mit HRGP führten zu einer drastischen Verringerung im Tumorwachstum (2). Zum Zeitpunkt des Tötens war die Größe der Tumoren um etwa 75% reduziert. Parallel dazu wurden Tumor-tragende Tiere mit Thermolysin-gespaltenem Antithrombin behandelt (2B). Es gab keinen statistisch signifikanten Unterschied in der Tumorgröße zwischen PBS-behandelten Tieren und Tieren, die mit Thermolysin-gespaltenem Antithrombin behandelt worden waren. Diese Resultate zeigen, dass der Effekt von pHRGP nicht allgemein auf Manipulationen oder Proteininjektion zurückzuführen war und dass HRGP antiangiogenetische Aktivität hat, wie sie durch einen Fibrosarkom-Tumorwachstums-Assay gemessen wurde.
Beispiel 10 - Konstruktion von HRGP-Expressionsvektoren (ist nicht Teil der Erfindung)
Volllängen-cDNA, die für humanes Histidin-reiches Glykoprotein (HRGP) codiert, wurde in die EcoR1/Xho1-Stellen im pCEP-Pu2-Expressionsvektor kloniert (Hallgren et al., 2000). cDNA für die Aminosäuren 1-18 in HRGP codiert für ein Signalpeptid, das eine extrazelluläre Sekretion des Proteins ermöglicht. Dazu wurde die BM40-Signalsequenz vor der Klonierungskassette in pCEP-Pu2 durch Restriktionsspaltung mit HindIII/Nhe1 entfernt. Der neue Vektor wurde pCEP-78544 genannt und codiert für HRGP ohne ein His-Tag (rHRGP).
Expressionsvektoren für His-Tag-enthaltendes Volllängen-HRGP und C-terminal verkürzte Varianten wurden auch unter Verwendung des pCEP-Pu2-Expressionssystems konstruiert. Diese Vektoren wurden durch PCR-Amplifikation entweder von Volllängen- oder weniger als Volllängen-Teilen von HRGP hergestellt. Ein His-Tag (sechs Histidine) wurde an den N-Terminus der HRGP-codierenden Region angefügt, um eine Reinigung zu erleichtern. Zwischen dem His-Tag und dem HRGP-codierenden Region wurde eine Enterokinase-Spaltungsstelle eingeführt, um eine Entfernung des His-Tags zu ermöglichen. In diesen Vektoren wurde die HRGP-Signalsequenz ausgeschlossen. Statt dessen wurde das PCR-Produkt im Raster mit der BM40-Signalsequenz in pCEP-Pu2 verbunden. Es wurden drei derartige Vektoren konstruiert, und pCEP-Pu2/His 1, 3 und 4 genannt. Die drei Vektoren codieren für His-Tagenthaltendes Volllängen-HRGP (His 1) und zwei verkürzte HRGP-Polypeptide (His 3-4). Siehe 3.
Beispiel 11 - Transfektion von EBNA-293-Zellen und Sammlung von konditioniertem Medium (ist nicht Teil der Erfindung)
Humane Embryonieren (HEK) 293-EBNA-Zellen wurden verwendet, um rekombinante HRGP-Polypeptide zu produzieren. Diese Zellen sind stabil mit dem EBNA-1-Gen transfiziert, welches auch durch den pCEP-Pu2-Vektor exprimiert wird, um eine chromosomale Integration von transfizierter Plasmid-DNA zu verhindern. Diese Manipulation sorgt für eine hohe Plasmid-Kopienzahl im Cytoplasma der Zelle und erhöht die Ausbeute an rekombinantem Protein. Die HRGP-Expressionsvektoren, die in Beispiel 10 beschrieben sind, wurden in die 293-EBNA-Zelllinie unter Verwendung von Lipofectamin (Invitrogen) nach dem Protokoll des Herstellers transfiziert. Etwa 48-72 Stunden nach Transfektion wurden die Zellen unter selektivem Druck mit 2,5 μl/ml Puromycin (Sigma), um bezüglich Aufnahme des pCEP-Pu2-Vektors zu selektieren, und 0,25 mg/ml G418 (Calbiochem), um auf EBNA-1-exprimierende Zellen zu selektieren, gegeben. Wachsende Zellen wurden sich entwickeln gelassen, und konditioniertes Medium wurde jeden fünften Tag gesammelt. Um eine Kontamination durch Rinder-HRGP zu vermeiden, wurde FCS in ein definiertes Serum-Ersatzmedium, TCM (ICN Biomedicals), während der Sammlung von konditioniertem Medium geändert. Zellen und Debris wurden durch Zentrifugation für 10 min bei 1200 g entfernt.
Beispiel 12 - Reinigung von HRGP aus Plasma (pHRGP) und rekombinantem HRGP (rHRGP) (ist nicht Teil der Erfindung)
pHRGP wurde aus frisch gesammeltem Humanplasma durch Chromatographie an Phospocellulose in Gegenwart von Proteinase-Inhibitoren gereinigt (Rylatt et al., 1981; Kluszynski et al., 1997). Dasselbe Verfahren wurde verwendet, um kein Tag-enthaltendes HRGP (rHRGP) aus konditioniertem Medium zu reinigen.
Beispiel 13 - Reinigung von His-Tag-enthaltendem HRGP (ist nicht Teil der Erfindung)
His-Tag-enthaltende HRGP-Polypeptide wurden aus den mit His 1, 3 und 4 transfizierten Zelllinien, die in Beispiel 11 beschrieben sind, unter Verwendung von Ni-NTA-Agarose gereinigt. Etwa 50 ml HRGP-konditioniertes Medium wurden mit 200 μl 50% Ni-NTA-Agaroseaufschlämmung "end-over-end" bei 4°C über Nacht inkubiert. Die Agarose wurde zentrifugiert und 3-4 Mal mit PBS pH 7,0/1 M NaCl/0,2% Tween-20 gewaschen. Die Agarose wurde in eine Säule gepackt und erneut wie oben gewaschen. Gebundenes Material wurde unter Verwendung von 100 mM Imidazol/20 mM Tris, pH 8,0/0,1 M NaCl in Fraktionen eluiert. Protein-enthaltende Fraktionen wurden gesammelt und gegen PBS, pH 7,0, dialysiert. Die Endproteinkonzentration wurde durch Vergleich mit einem BSA-Standard an SDS-PAGE und durch den BCA-Protein-Assay-Kit (Pierce) bestimmt.
Beispiel 14 - TUNEL-Assay
Durch terminale Desoxynucleotidyltransferase vermittelte dUTP-"nick-end"-Markierung (TUNEL)-Assays wurden wie folgt durchgeführt. BCE-Zellen wurden auf Gelatine-beschichteten Glasobjektträgern in DMEM/10% NCS mit 2 ng/ml FGF-2 beimpft. Nach 48 Stunden wurde das Medium in Hungermedium (DMEM/0,5% NCS), das entweder 10 ng/ml FGF-2, 1 μg/ml rHRGP oder die Kombination der zwei enthielt, geändert. Vierundvierzig Stunden später wurden die Zellen in 4% Paraformaldehyd fixiert und apoptotische Zellen unter Verwendung des in situ Cell Detection Kit, mit Fluorescein (Roche Diagnostics) gefärbt. Kurz ausgedrückt, das Prinzip des Verfahrens besteht darin, freie 3'-OH-Enden, die während des apoptotischen Prozesses erzeugt werden, mit fluoreszentem dUTP in einer enzymatischen Reaktion zu markieren. Um fähig zu sein, alle Zellen zu detektieren, wurde eine doppelte Färbung mit Hoechst 33342 durchgeführt. Der Prozentwert TUNEL-positiver Zellen wurde bestimmt, indem etwa 1500 Zellen aus jeder Behandlung analysiert wurden.
Beispiel 15 - Analyse der FGFR-Aktivierung (ist nicht Teil der Erfindung)
Eine Analyse der FGF-Rezeptor (FGFR)-Aktivierung wurde unter Verwendung von PAE/FGFR-1-Zellen, die über Nacht in F12/0,1% BSA serumgehungert worden waren und mit FGF-2 (50 ng/ml) oder rHRGP (1 μg/ml) oder der Kombination stimuliert worden waren, für 8 min bei 37°C durchgeführt. Die Zellen wurden in Triton X-100-enthaltendem Puffer lysiert, und Tyrosin-phosphorylierte Proteine wurden unter Verwendung des 4G10-Antikörpers (Upstate Biotechnology) immunpräzipitiert. Die Proben wurden durch SDS-PAGE getrennt und auf Hybond-C extra (Amersham Pharmacia Biotech) transferiert. Mit einem Anti-FGFR-1-Antikörper, bereitgestellt von Dr. P. Maher, Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA, wurde ein Immunblotting durchgeführt. Eine Analyse von p38-Phosphorylierung wurde in PAE/FGFR-1-Zellen, die für 10 oder 30 Minuten bei 37°C mit 50 ng/ml FGF-2 behandelt worden waren, mit oder vor Inkubation mit 1 μg/ml rHRGP für 30 min vor Zusatz von FGF-2 durchgeführt. Die Zellen wurden in Triton X-100-enthaltendem Puffer lysiert, und Gesamtlysate wurden durch SDS-PAGE getrennt und mit Anti-Phospho-p38- und Anti-p38-Antikörpern (New England Biolabs Inc.) immungeblottet. Eine Analyse der ERK1/2-Phosphorylierung wurde in BCE-Zellen, die für 10 oder 90 min bei 37°C mit 50 ng/ml FGF-2 behandelt worden waren, mit oder ohne Vorinkubation mit 1 μg/ml rHRGP für 30 min vor Zusatz von FGF-2 durchgeführt. Die Zellen wurden in Triton X-100-enthaltendem Puffer lysiert, und Gesamtlysate wurden durch SDS-PAGE getrennt und mit Anti-Phospho-ERK-Antikörper (New England Biolabs Inc.) immungeblottet.
Immunreaktive Proteine wurden durch ein Chemilumineszenz-Detektionssystem (Matthews et al., 1985) sichtbar gemacht.
Beispiel 16 - Produktion und Charakterisierung von rekombinantem HRGP (ist nicht Teil der Erfindung)
Um die anti-angiogenetische Wirkung von HRGP weiter zu untersuchen und eine minimale aktive Region des Proteins zu bestimmen, wurde rekombinantes HRGP produziert (rHRGP). Volllängen-HRGP wurde mit und ohne ein His-Tag konstruiert und isoliert, wie es in den Beispielen 10-13 beschrieben ist. Zwei C-terminal verkürzte HRGP-Polypeptide mit His-Tag wurden produziert und isoliert, wie es in den Beispielen 10-11 und 13 beschrieben ist.
Eine Coomassie-Färbung von isoliertem pHRGP-Polypeptid und isoliertem rHRGP-Polypeptid zeigte, dass das rekombinante Protein ein etwas kleineres scheinbares Molekulargewicht zeigte, möglicherweise infolge unterschiedlicher Glykosylierungsgrade. Ein Western-Blotting mit einem HRGP-spezifischen Antikörper zeigte außer dem Volllängenprotein eine Reihe kleinerer Fragmente sowohl in der pHRGP- als auch der rHRGP-Fraktion. Isolierte His 1-, 3- und 4-HRGP-Polypeptide wurden auch durch Coomassie-Färbung und Anti-HRGP-Western-Blot analysiert. Die vorausgesagten Molekülmassen waren wie erwartet, und alle drei rekombinanten Proteine wurden durch einen HRGP-spezifischen Antikörper erkannt. Das kürzeste verkürzte HRGP-Polypeptid, His 3, schien gegenüber einer proteolytischen Spaltung empfindlicher zu sein als die His 1- und 4-HRGP-Polypeptide.
Domänen-spezifische Antikörper gegen HRGP wurden durch Immunisierung von Kaninchen mit drei verschiedenen Peptiden, die 0115, 0116 und 0119 genannt wurden, entwickelt. Die Positionen dieser Peptide im HRGP-Protein sind in 3 gezeigt. Western-Blot für Volllängen-HRGP wurde unter Verwendung der drei Anti-Peptid-Antikörper durchgeführt. Die Resultate zeigten, dass das Volllängen-HRGP-Polypeptid durch alle drei Antikörper detektiert wurde. Allerdings wurde ein spezifisches Reaktivitätsmuster für jeden der drei Antikörper gegen kleinere von HRGP abgeleitete Fragmente beobachtet.
Beispie 17 - rHRGP inhibiert Endothelzell-Migration
Der Effekt von rHRGP auf Endothelzell-Migration wurde unter Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Assays gemessen. Es wurde derselbe inhibitorische Effekt auf eine FGF-induzierte Migration, der mit pHRGP beobachtet wurde, auch beobachtet, wenn rHRGP verwendet wurde (4A). Der inhibitorische Effekt von rHRGP war statistisch signifikant. Eine Migration, die durch fötales Kälberserum induziert wurde, wurde allerdings durch rHRGP nicht inhibiert. Siehe 4A.
Der Assay wurde auch unter Verwendung variierender Mengen an rHRGP durchgeführt. Wie in 4B gezeigt ist, wurden 100 ng/ml rHRGP benötigt, um die Migration zum Basislevel zu inhibieren. Das Vorliegen eines His-Tag beeinträchtigte die Fähigkeit von His 1-HRGP nicht, eine FGF-induzierte Migration zu inhibieren.
Der Effekt von rHRGP gegen die Wachstumsfaktoren VEGF-A und von Thrombozyten stammendem Wachstumsfaktor BB (PDGF-BB) wurde ebenfalls analysiert. VEGF-A und PDGF-BB induzieren auch eine Migration von BCE-Zellen in Kultur. rHRGP verhinderte eine Wachstumsfaktor-induzierte Migration, entweder durch VEGF-A oder PDGF-BB, vollständig. Um die Möglichkeit auszuschließen, dass ein Heparin-bindendes Plasmaprotein mit etwa derselben Größe wie HRGP eine FGF-induzierte Migration beeinträchtigen könnte, haben wir den Effekt von Protein C-Inhibitor (PCI)-Polypeptid im Migrations-Assay gemessen. Das Vorliegen von PCI in Abwesenheit von HRGP hatte keinen Effekt auf eine FGF-induzierte Migration. Der Effekt auf FGF-induzierte Endothelzell-Migration von rHRGP allein wurde mit dem von Endostatin (ES) allein verglichen. ES ist ein bekanntes anti-angiogenetisches Mittel. Sowohl rHRGP als auch ES wurden mit 100 ng/ml verwendet, was einem Molverhältnis von 1:3 zwischen HRGP und ES entspricht. Beide, rHRGP und ES, inhibierten eine FGF-induzierte Migration auf wenigstens Basallevel, wobei ES etwas wirksamer ist. Um die Zellspezifität der Effekte von rHRGP zu untersuchen, testeten wird seine Fähigkeit, eine FGF-induzierte Migration von Swiss 3T3-Maus-Fibroblasten zu inhibieren. Wenn 3T3-Zellen BCE-Zellen im Assay ersetzen, hatte rHRGP keine Wirkung auf die Zellmigration, was anzeigt, dass die biologische Aktivität von rHRGP für Endothelzellen spezifisch ist.
Beispiel 18 - HRGP inhibiert FGF-induziertes Überleben von Endothelzellen
Es wurde ein TUNEL-Assay durchgeführt, wie es in Beispiel 14 beschrieben ist. BCE-Zellen, die auf mit Gelatine überzogenen Objektträgern ausgesät worden waren, wurden in en Medium gegeben, das wenig Serum enthielt (DMEM/0,5% NCS), und es wurden Zusätze aus FGF-2 und rHRGP gemacht, entweder einzeln oder in Kombination, und zwar mit 10 ng/ml FGF-2 und 1 μg/ml rHRGP. Der prozentuale Anteil TUNEL-positiver Zellen wurde in jeder Behandlung bestimmt.
FGF-2 induzierte eine dreifache Reduktion beim Prozentwert an apoptotischen (TUNEL-positiven) Zellen im Hungermedium. Das FGF-induzierte Überleben von Endothelzellen wurde aufgehoben, wenn rHRGP zusammen mit FGF-2 zugesetzt wurde. rHRGP allein hatte keinen Effekt.
Beispiel 19 - Signaltransduktion
Wir testeten den Effekt von HRGP auf FGF-2-induzierte Signaltransduktion in Endothelzellen. Der Effekt auf FGF-Rezeptor-1 (FGFR-1)-Aktivierung wurde untersucht, indem PAE/FGFR-1-Zellen mit 50 ng/ml FGF-2 für 8 min behandelt wurden, vorinkubiert mit 1 μg/ml rHRGP für 30 min oder nicht. Die Gesamtzelllysate wurden hergestellt, und Tyrosin-phosphorylierte Proteine wurden immunpräzipitiert. Die Proben wurden durch SDS-PAGE getrennt und mit Anti-FGRF-1-Antikörper einem Immunblotting unterzogen. Die Resultate zeigten, dass rHRGP eine FGF-2-induzierte Aktivierung von FGFR-1 nicht beeinträchtigt.
Der Effekt von rHRGP auf p38-MAPK-Aktivierung wurde in PAE/FGFR-1-Zellen analysiert. p38-MAPK wurde mit Apoptose in Endothelzellen in Verbindung gebracht. Die Zellen wurden für 10 oder 30 Minuten mit 50 ng/ml FGF-2, mit oder ohne Vorinkubation in 1 μg/ml rHRGP für 30 min vor Zugabe von FGF-2, behandelt. Gesamtlysate wurden durch SDS-Page abgetrennt und einem Immunblotting mit einem Anti-Phospho-p38-Antikörper unterzogen. FGF-2 induzierte eine erhöhte Phosphorylierung von p38, sowohl bei 10 als auch bei 30 min Stimulation, aber es gab keinen Effekt von HRGP. Ein Immunblotting mit einem Anti-p38-Antikörper zeigte in jeder Bahn eine gleiche Menge an Protein.
Beispiel 20 - Tumorwachstum in Mäusen
Tumor-tragende Mäuse werden in gleicher Weise, wie in Beispiel 4 beschrieben, hergestellt, wobei Neuroblastomzellen anstelle von T241-Fibrosarkomzellen und eine geeignete Stelle zur Einführung in die Tiere verwendet werden. Mäuse, die detektierbare Tumore tragen, werden randomisiert und erhalten Behandlungen mit HRGP, Vehikel (PBS) allein oder ein Polypeptid, das keine Wirkung auf Tumorwachstum hat, als negative Kontrolle, z.B. Thermolysingespaltenes AT oder Immunglobulin G. HRGP, Vehikel und Kontrollpeptid werden täglich verabreicht. Tumore werden einmal am Tag oder zur Verabreichungszeit gemessen, wobei ein Doppel-Blindverfahren angewendet wird. Tumorvolumina werden durch die Formel π/6 × Breite² × Länge errechnet. Die statistische Analyse wurde unter Verwendung von ANOVA oder einem anderen geeigneten statistischen Verfahren durchgeführt. Am Ende des Experiments werden die Mäuse unter Verwendung einer letalen Dosis an Pentobarbiton oder durch ein anderes zugelassenes Tötungsverfahren getötet und werden mit 4% Paraformaldehyd in Millonig-Phosphatpuffer, pH 7,4, perfundiert oder mit einem Puffer perfundiert, der ein markiertes Lectin enthält, welches spezifisch an Endothelzellen bindet. Die Tumoren werden dann nach histologischen Standardverfahren in Paraffin eingebettet oder tiefgefroren und in Schnitte mit einer Dicke von 4 μm seziert.
Das Experiment wird unter Verwendung eines Verabreichungsplans mit jedem zweiten Tag oder eines Verabreichungsplans für 5 Tage pro Woche wiederholt. Das Experiment wird unter Verwendung von Lewis-Lungenzellen, Teratomzellen, oder anderen Tumorzell-Modellen anstelle von Neuroblastomzellen, wiederholt.
Beispiel 21 - Effekt von verkürzten Formen von HRGP
Die rekombinanten HRGP-Polypeptide His 3 und 4 werden isoliert, wie es in Beispiel 13 beschrieben ist. Die entsprechenden Polypeptide ohne His-Tags werden ebenfalls isoliert.
Jedes der vier Polypeptide wird im CAM-Assay, der in Beispiel 2 beschrieben ist, dem Endothelzell-Migrations-Assay, der in Beispiel 3 beschrieben ist, dem Fibrosarkomtumor-Assay, der in Beispiel 4 beschrieben ist, dem Signaltransduktions-Assay, der in Beispiel 8 beschrieben ist, und dem TUNEL-Apoptose-Assay, der in Beispiel 14 beschrieben ist, getestet.
Beispiel 22 - Embryoidkörper-Angiogenese
Maus-Embryo-Stammzellen werden durch Entnahme von LIF induziert, zu differenzieren. Zellen werden in hängenden Tropfkulturen aggregiert und nach 4 Tagen in nicht-adhärente Petrischalen gespült. Die Aggregate (Embryoidkörper, EB) werden in den Petrischalen mit ei nem der Folgenden behandelt: pHRGP, rHRGP, His 1, His 3 oder His 4. Als Kontrolle werden EB mit ES als positive Kontrolle und PCI als negative Kontrolle behandelt. Die Bildung von Gefäßplexus wird quantitativ durch Immunhistochemie unter Verwendung von Anti-CD31-Antikörpern an EB-Proben nach 6, 8, 12 und 16 Tagen in Kultur analysiert. Für ein immunhistochemisches Färben werden EB auf Objektträgern in 4% Paraformaldehyd fixiert und in Methanol permeabilisiert. Endogene Peroxidase-Aktivität wird in 3% H₂O₂ in Methanol blockiert. Unspezifische Bindungsstellen werden unter Verwendung des TNB-Blockierungspuffer-Kits (NEL 700; NEN Life Science Products) blockiert, worauf eine Inkubation über Nacht mit einem primären Ratten-anti-Maus-CD31-Antikörper (Pharmingen), verdünnt 1:8000 in TNB, folgt. Nach dem Waschen werden die Proben mit einem sekundären biotinylierten Ziege-anti-Ratten-IgG (Vektor) und anschließend mit Streptavidin-konjugierter Meerrettichperoxidase und Biotinyltyramid (aus dem NEL-Kit) inkubiert, um das Signal zu verstärken. Für die Enzymreaktion wird der ABC-Reagens-Kit von Vektor verwendet. EB in 3-D-Collagen-Gelen werden unter Verwendung eines ähnlichen Protokolls gefärbt, mit der Ausnahme, dass Inkubations- und Waschzeiträume ausgedehnt werden und dass ein Waschen mit PBS, das Triton-X 100 enthält, erfolgt.
Die Embyoidkörper werden auch quantitativ analysiert, um die Größe des Endothelzellen-Pools zu bestimmen. Dies erfolgt durch Collagenasebehandlung, gefolgt von Fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) oder Isolierung von Endothelzellen durch Fangen an Anti-CD31-beschichteten magnetischen Perlen.
Das Experiment wird wiederholt, indem einzelne EB auf Glasobjektträger herausgenommen werden, worauf eine Behandlung mit einem HRGP-Polypeptid folgt, wie es oben beschrieben wurde. Das Experiment wird wiederholt, indem EB in dreidimensionale Collagen-Gele gesät werden, worauf eine Behandlung mit einem HRGP-Polypeptid folgt, wie es oben beschrieben wurde.
ANDERE AUSÜHRUNGSFORMEN
Es ist einzusehen, dass, obgleich die Erfindung in Verbindung mit der detaillierten Beschreibung derselben beschrieben wurde, die vorangehende Beschreibung dazu bestimmt ist, die Erfindung zu erläutern und nicht den Rahmen der Erfindung zu beschränken, der durch den Rahmen der beigefügten Ansprüche definiert wird. Weitere Aspekte, Vorzüge und Modifikationen liegen innerhalb des Rahmens der folgenden Ansprüche.

Claims

Verfahren zum Identifizieren eines anti-angiogenetischen Polypeptids, umfassend: Messen des Effekts eines HRGP-Polypeptids auf FGF-2-induzierte Migration von primären Rindernebennierencortex-Kapillarendothelzellen; und Identifizieren des HRGP-Polypeptids als ein anti-angiogenetisches Polypeptid, wenn die FGF-2-induzierte Migration in Gegenwart des HRGP-Polypeptids signifikant verringert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das HRGP-Polypeptid ein HRGP-Fragment ist.
Verfahren zum Identifizieren eines anti-angiogenetischen Polypeptids, umfassend: Messen des Effekts eines HRGP-Polypeptids auf Hühner-Chorioallantoismembran-Angiogenese; und Identifizieren des HRGP-Polypeptids als anti-angiogenetisches Polypeptid, wenn die Hühner-Chorioallantoismembran-Angiogenese in Gegenwart des HRGP-Polypeptids signifikant verringert ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das HRGP-Polypeptid ein HRGP-Fragment ist.
Verfahren zum Identifizieren eines anti-angiogenetischen Polypeptids, umfassend: Messen des Effekts eines HRGP-Polypeptids auf das Wachstum eines Angiogenese-abhängigen Tumors; und Identifizieren des HRGP-Polypeptids als anti-angiogenetisches Polypeptid, wenn das Tumorwachstum in Gegenwart des HRGP-Polypeptids signifikant verringert ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das HRGP-Polypeptid ein HRGP-Fragment ist.
Zusammensetzung, umfassend ein im Wesentlichen reines HRGP-Polypeptid in Kombination mit einem anti-angiogenetischen Mittel und/oder einem anti-neoplastischen Mittel.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei das antiangiogenetische Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Angiostatin, Thrombostatin, Endostatin, Interferon-α, Interferon-induzierbarer Faktor10, Plättchenfaktor 4 und einen COX-2-Inhibitor.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei das antineoplastische Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Taxol, Cyclophosphamid, Carboplatinum, Cisplatinum, Cisplatin, Gancyclovir, Camptothecin, Paclitaxel, Hydroxyharnstoff, 5-Azacytidin, 5-Aza-2'-desoxycytidin, Suramin und Retinoide.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7-9, wobei die Zusammensetzung ein Fragment des HRGP-Polypeptids umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei das Fragment die aminoterminale Domäne von intaktem HRGP umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei das Fragment die zentrale Domäne von intaktem HRGP umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei das Fragment die C-terminale Domäne von intaktem HRGP umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10-13, wobei das Fragment wenigstens eine Tandemwiederholung des Pentapeptids [H/P]-[H/P]PHG umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7-14, wobei die Zusammensetzung ferner einen pharmazeutischen Carrier, annehmbar zur Verabreichung an einen Säuger, umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7-15 zur Verwendung als Medikament.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 7-16 zur Herstellung eines Medikaments zum Inhibieren von Angiogenese.
Herstellungsgegenstand, umfassend Verpackungsmaterial und eine Zusammensetzung, hergestellt gemäß einem der Ansprüche 7-17, innerhalb des Verpackungsmaterials, wobei das Verpackungsmaterial eine Kennzeichnung oder Packungsbeilage umfasst, die anzeigt, dass das Polypeptid einem Säuger zur Inhibition von Angiogenese zu verabreichen ist.
Verwendung eines im Wesentlichen reinen HRGP-Polypeptids zur Herstellung eines Medikaments zum Inhibieren von Angiogenese.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei das HRGP-Polypeptid ein Fragment des HRGP-Polypeptids umfasst.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Polypeptid die aminoterminale Domäne von intaktem HRGP umfasst.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Polypeptid die zentrale Domäne von intaktem HRGP umfasst.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Polypeptid die C-terminale Domäne von intaktem HRGP umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 20-23, wobei das Polypeptid wenigstens eine Tandemwiederholung des Pentapeptids [H/P]-[H/P]PHG umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 19-24, wobei das Medikament ferner einen pharmazeutischen Carrier, annehmbar zur Verabreichung an einen Säuger, umfasst.