DE69625191T2

DE69625191T2 - Azelluläre pertussis impfstoffe und verfahren zur herstellung

Info

Publication number: DE69625191T2
Application number: DE69625191T
Authority: DE
Inventors: Luis Barreto; Leslie Boux; E. Fahim; Andrew Herbert; E. Jackson; H. Klein; U. Tan; John Thipphawong; R. Vose
Original assignee: Aventis Pasteur Ltd
Current assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Priority date: 1995-05-04
Filing date: 1996-05-02
Publication date: 2003-07-10
Anticipated expiration: 2016-05-03
Also published as: EP0826001A1; FR16C0015I2; DE69625191D1; EP0824358B1; DK0824358T3; PT826001E; NL300804I2; PT824358E; WO1996034883A1; FR16C0015I1; EP1405643A1; LU93036I2; US20010009666A1; ES2180758T3; AU5494196A; CA2220048A1; AU710538B2; EP0826001B1; EP0824358A1; CA2220063A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft nichtzelluläre Pertussis-Impfstoffe, deren Bestandteil und deren Herstellung.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Der Keuchhusten oder die Pertussis stellt eine ernsthafte, höchst ansteckende Infektion der oberen Atemwege dar, die durch Bordetella pertussis verursacht wird. Bei der Weltgesundheitsorganisation wird geschätzt, dass es 60 Millionen Fälle von Keuchhusten pro Jahr und 0,5 bis 1 Million damit in Zusammenhang stehende Todesfälle gibt. (Lit. 1. In dieser Beschreibung wird auf verschiedene Literaturstellen in Klammern Bezug genommen, um den Stand der Technik, auf den sich die Erfindung bezieht, in umfassenderer Weise zu beschreiben. Am Ende der Beschreibung findet sich die vollständige bibliografische Information für jedes Literaturzitat.) In den nicht geimpften Bevölkerungskreisen wurde eine Höhe der Rate des Auftretens von Keuchhusten an Kindern im Alter von weniger als 5 Jahren von bis zu 80% beobachtet (Lit. 2). Obschon im allgemeinen der Keuchhusten als Kinderkrankheit betrachtet wird, gibt es auch bei Heranwachsenden und Erwachsenen zunehmende Anzeichen für klinische und asymptomatische Erkrankungen (Lit. 3, 4 und 5).
Die Einführung von Impfstoffen mit ganzen Zellen in den Jahren ab 1940, die sich aus chemisch und durch Hitze inaktivierten Organismen von B. pertussis zusammensetzten, war für einen drastischen Rückgang des Auftretens von Keuchhusten, der durch B. pertussis verursacht wird, verantwortlich. Die Effizienzraten für die Impfstoffe mit ganzen Zellen wurden auf bis zu 95% geschätzt, je nach der Definition der Krankheitsfälle (Lit. 6). Während die Infektion mit B. pertussis eine lebenslange Immunität verleiht, gibt es wachsende Anzeichen dafür, dass der Schutz nach der Immunisierung mit den Impfstoffen mit ganzen Zellen nachlässt (Lit. 3). In verschiedenen Berichten wird ein Zusammenhang zwischen der Keuchhustenimpfung mit ganzen Zellen, dem Auftreten von Reaktionen und schwerwiegenden Nebenwirkungen berichtet, was zu einem Rückgang der Impfbereitschaft und in der Folge zu erneuten Epidemien führte (Lit. 7). Erst vor kurzem wurden Impfstoffe mit definierten Komponenten gegen Keuchhusten entwickelt.

Antigene für definierte Impfstoffe gegen Keuchhusten

Es wurden verschiedene nichtzelluläre Impfstoffe gegen Keuchhusten entwickelt, welche Antigene von Bordetella pertussis, Pertussis-Toxin (PT), filamentöses Hämagglutinin (FHA), das Protein mit 69 kDa aus der äußeren Membran (Pertaktin) und Fimbrien-Agglutinogene mit einschließen (siehe unten stehende Tabelle 1. Die Tabellen erscheinen am Ende der Beschreibung.)

Pertussis-Toxin

Das Pertussis-Toxin stellt ein Exotoxin dar, das ein Mitglied der A/B-Familie der bakteriellen Toxine mit ADP-Ribosyltransferaseaktivität ist (Lit. 8). Der A-Anteil dieser Toxine zeigt die ADP-Ribosyltransferaseaktivität, und der B-Anteil vermittelt die Bindung des Toxins an die Rezeptoren der Wirtszellen und die Translokation von A an dessen Wirkungsort. Das PT erleichtert auch das Anhaften von B. pertussis an die Epithelzellen mit Flimmerhärchen (Lit. 9) und spielt ebenso bei der Invasion von Makrophagen durch B. pertussis eine Rolle (Lit. 10).
Sämtliche nichtzellulären Impfstoffe gegen Keuchhusten schließen bisher das PT mit ein, das als ein bedeutender Virulenzfaktor und schützendes Antigen vorgeschlagen wurde (Lit. 11, 12). Die natürliche Infektion mit B. pertussis erzeugt sowohl humorale als auch über Zellen vermittelte Antworten gegenüber dem PT (Lit. 13 bis 17). Kinder weisen anti-PT-Antikörper auf, die aus der Plazenta stammen (Lit. 16, 18), wobei humanes Kolostrum mit einem Gehalt an anti-PT-Antikörpern beim passiven Schutz von Mäusen gegen eine Infektion über Aerosole wirksam war (Lit. 19). Es wurde aufgezeigt, dass eine durch Zellen vermittelte Immunantwort (CMI) gegenüber Untereinheiten von PT nach der Immunisierung mit einem nichtzellulären Impfstoff eintritt (Lit. 20), wobei eine CMI-Antwort auf das PT nach der Impfung mit ganzen Zellen herbeigeführt wird (Lit. 13). Das chemisch inaktivierte PT in den Impfstoffen mit ganzen Zellen oder Komponenten schützt sowohl bei Tiermodellen als auch bei Menschen (Lit. 21). Ferner schützen monoklonale Antikörper, die für die Untereinheit 51 spezifisch sind, gegen eine Infektion mit B. pertussis (Lit. 22 und 23).
Die hauptsächlichen pathophysiologischen Effekte von PT gehen auf seine ADP- Ribosyltransferaseaktivität zurück. Das PT katalysiert den Transfer der ADP-Ribose aus NAD zu dem Bindungsprotein des Gi-Guanin-Nukleotids, so dass das Regulationssystem der zellulären Adenylatcyclase gestört wird (Lit. 24). Das PT verhindert auch das Einwandern von Makrophagen und Lymphozyten an die Zentren der Entzündung und verursacht Störungen bei der Phagozytose, die durch neutrophile Zellen vermittelt wird, sowie der Abtötung von Bakterien (Lit. 25). Eine Anzahl von Testverfahren in vitro und in vivo wurden dazu verwendet, die enzymatische Aktivität von S1 und/oder PT zu bestimmen, einschließlich der ADP-Ribosylierung des Transducins von Rindern (Lit. 26), des Assays mit dem Ovar des Chinesischen Hamsters (CHO) auf Basis von Zellzusammenballungen (Lit. 27), der Sensibilisierung mittels Histamin (Lit. 28), der Leukozytose und der NAD-Glykohydrolase. Bei der Exposition an PT entwickeln die CHO-Zellen eine typische Morphologie der Zellzusammenballung (Cluster). Dieses Phänomen ist abhängig von der Bindung des PT und der nachfolgenden Translokation und ADP-Ribosyltransferaseaktivität von S1, so dass der Assay mit den CHO-Zellen auf Basis von Zellzusammenballungen weit verbreitet ist und dazu verwendet wird, die Unversehrtheit und Toxizität der PT-Holotoxine auszutesten.

Filamentöses Hämagglutinin

Das filamentöse Hämagglutinin stellt ein großes (220 kDa) nichttoxisches Polypeptid dar, das die Anheftung von B. pertussis an die Flimmerhärchenzellen der oberen Atemwege während der bakteriellen Besiedelung vermittelt (Lit. 9, 29). Die natürliche Infektion induziert anti-FHA-Antikörper und die über Zellen vermittelte Immunität (Lit. 13, 15, 17, 30 und 31). Die anti-FHA-Antikörper finden sich im Humankolostrum und sie werden auch über die Plazenta übertragen (Lit. 17, 18 und 19). Die Impfung mit ganzzelligen oder nichtzellulären Keuchhusten-Impfstoffen führt zur Bildung von anti-FHA-Antikörpern, wobei nichtzelluläre Impfstoffe mit einem Gehalt an FHA auch eine CMI-Antwort auf FHA induzieren (Lit. 20, 32). Das FHA stellt ein schützendes Antigen in einem Atemwegsprovokationsmodell bei der Maus nach der aktiven oder passiven Immunisierung dar (Lit. 33, 34). Das FHA alleine schützt die Maus jedoch nicht bei dem Assay auf Basis des intrazerebralen Provokationspotenzials (Lit. 28).

Protein mit 69 kDa aus der äußeren Membran (Pertaktin)

Das Protein mit 69 kDa stellt ein Protein aus der äußeren Membran dar, das ursprünglich aus B. bronchiseptica identifiziert wurde (Lit. 35). Es wurde aufgezeigt, dass es ein schützendes Protein gegen B, bronchiseptica darstellt, wobei es im Anschluss daran sowohl in B. pertussis als auch in B. parapertussis identifiziert wurde. Das Protein mit 69 kDa bindet direkt an eukaryotische Zellen (Lit. 36), wobei die natürliche Infektion mit B. pertussis eine humorale anti-P.69-Antwort induziert (Lit. 14) und P.69 auch eine über Zellen vermittelte Immunantwort herbeiführt (Lit. 17, 37, 38). Die Impfung mit ganzzelligen oder nichtzellulären Impfstoffen führt zur Bildung von anti-P.69-Antikörpern (Lit. 32, 39), wobei nichtzelluläre Impfstoffe eine P.69-CMI induzieren (Lit. 39). Das Pertaktin schützt Mäuse gegen die Provokation durch Aerosole mit B. pertussis (Lit. 40), wobei es in Kombination mit dem FHA einen Schutz gegen B. pertussis auf Basis des intrazerebralen Provokationstest bildet (Lit. 41). Ebenso bildet der passive Transfer von polyklonalen oder monoklonalen anti- P.69-Antikörpern bei den Mäusen einen Schutz gegen die Provokation durch Aerosole (Lit. 42).

Agglutinogene

Die Serotypen von B. pertussis werden anhand von deren agglutinierenden Fimbrien definiert. Die WH() gibt die Empfehlung, dass die Impfstoffe mit ganzen Zellen die Agglutinogene (Aggs) vom Typ 1, 2 und 3 einschließen; da sie nicht über Kreuz schützen (Lit. 43). Das Agg 1 ist nicht aus Fimbrien und wird an allen Stämmen von 81 pertussis gefunden, wogegen die Aggs vom Serotyp 2 und 3 aus Fimbrien stammen. Die natürliche Infektion oder Immunisierung ganzzelligen oder nichtzellulären Impfstoffen induziert anti-Agg-Antikörper (Lit. 15, 32). Eine spezifische, durch Zellen vermittelte Immunantwort lässt sich bei Mäusen nach einer Infektion mit einem Aerosol mit Agg 2 und Agg 3 hervorrufen (Lit. 17). Agg 2 und Agg 3 bewirken bei Mäusen einen Schutz gegen eine Provokation der Atemwege, wobei menschliches Kolostrum mit einem Gehalt an anti-Agglutinogenen ebenfalls einen Schutz bei diesem Assay bewirken wird (Lit. 19, 44, 45).

Nichtzelluläre Impfstoffe

Der erste nichtzelluläre Impfstoff, der entwickelt wurde, war der Zweikomponenten- Impfstoff aus PT plus FHA (JNIH 6) von Sato et al. (Lit. 46). Dieser Impfstoff wurde durch die kombinierte Reinigung von PT- und FHA-Antigenen aus dem Überstand der Kultur des Stammes Tomaha von B. pertussis hergestellt, wonach sich das Toxoidieren mit Formalin anschloss. Nichtzelluläre Impfstoffe von verschiedenen Herstellern und jeweils unterschiedlicher Zusammensetzung wurden erfolgreich dazu verwendet, japanische Kinder gegen Keuchhusten zu immunisieren, was seit 1981 in einem drastischen Rückgang des Auftretens der Erkrankung resultierte (Lit. 47). Der Impfstoff JNIH 6 und ein Einkomponenten-Impfstoff auf Basis des PT-Toxoids (JNIH 7) wurden in einem umfangreichen klinischen Versuch 1986 in Schweden ausgetestet. Die anfänglichen Ergebnisse gaben einen Hinweis auf eine geringere Wirksamkeit als sie von einem Impfstoff mit ganzen Zellen berichtet wurde; allerdings haben daran angeschlossene Studien aufgezeigt, dass er gegenüber einem milderen Krankheitsverlauf, wie er anhand von serologischen Verfahren diagnostiziert wurde, wirksamer war (Lit. 48, 49, 50, 51). Es bestanden jedoch Hinweise darauf, dass bei diesen Impfstoffen eine Umkehr zur Toxizität des durch Formalin inaktivierten PT stattfand. Es wurde auch festgestellt, dass diese Impfstoffe eher einen Schutz gegen die Erkrankung als gegen eine Infektion bewirken.
Zum gegenwärtigen Zeitpunkt werden eine Anzahl von neuen nichtzellulären Keuchhusten-Impfstoffen untersucht, die Kombinationen von PT, FHA, P.69 und/oder Agglutinogenen einschließen; und diese sind in der Tabelle 1 aufgelistet. Es wurden unterschiedliche Techniken einer chemischen Entgiftung für das PT benutzt, darin eingeschlossen die Inaktivierung mit Formalin (Lit. 46), Glutaraldehyd (Lit. 52), Wasserstoffperoxid (Lit. 53) sowie Tetranitromethan (Lit. 54).
Somit dürften aktuelle, im Handel erhältliche nichtzelluläre Keuchhusten-Impfstoffe keine geeigneten Formulierungen geeigneter Antigene in passenden immunogenen Formen zur Erzielung des gewünschten Niveaus an Wirksamkeit in Bevölkerungskreisen, die gegenüber Keuchhusten anfällig sind, enthalten.
Die WO-A-95/29934 beschreibt einen bestimmten Vorgang zum Abtrennen von Schutzkomponenten von Bordetella pertussis und dann das Zusammenbauen eines Impfstoffes aus einer gereinigten Pertussis-Komponente, welcher eine Kombination aus FHA, PRN, Pertussis Fimbrien (FIM, d. h. Agglutinogenen) und PT umfasst. In diesem Dokument werden keine Daten für den Menschen angegeben. Dieses Dokument kann nur als Stand der Technik unter Artikel 54(3) EPÜ berücksichtigt werden.
Die EP-A-0 761 230 kann in ähnlicher Weise nur als Stand der Technik unter Artikel 54(3) EPÜ berücksichtigt werden. Sowohl EP-A 0 761 230 als auch WO-A-91/15505 beschreiben die Herstellung von adenylatcyclasefreiem Pertaktin und dessen Verwendung in Impfstoffen aus Bordetella pertussis-Komponenten mit anderen Bordetella pertussis-Antigenen. Es werden keine Wirksamkeitsdaten beschrieben.
Es wäre wünschenswert, wirksame nichtzelluläre Keuchhusten-Impfstoffe, die ausgewählte relative Mengen an ausgewählten Antigenen enthalten, sowie Verfahren zu deren Herstellung zu schaffen.
Die Erfindung stellt die Verwendung von einer gereinigten Form von Pertussis- Toxoid, filamentösem Hämagglutinin, Pertaktin und Fimbrien-Agglutinogenen von B. pertussis bei der Herstellung von einem Kombinationsimpfstoffpräparat gegen eine durch B. pertussis verursachte Erkrankung zur Verabreichung an eine Humanpopulation, die ein Risiko für eine durch B. pertussis verursachte Erkrankung aufweist, um Schutz gegen eine durch B. pertussis verursachte Erkrankung zu verleihen, bereit, worin jede Humaneinzeldosis des Impfstoffpräparats Tetanus-Toxoid, Diphtherie- Toxoid und die folgenden Keuchhustenantigene enthält, nämlich 5 bis 30 ug Stickstoff von dem Pertussis-Toxoid, 5 bis 30 ug Stickstoff von dem filamentösen Hämagglutinin, 3 bis 15 ug Stickstoff von. Pertaktin und 1 bis 10 ug Stickstoff von den Fimbrien-Agglutinogenen und worin das Impfstoffpräparat den Schutz gegen eine durch 8. pertussis verursachte Erkrankung wenigstens 70% der Mitglieder der Risikopopulation verleiht, was durch einen klinischen Wirksamkeitsversuch bestimmt werden kann, wobei die Fimbrien-Agglutinogene die Fimbrien-Agglutinogene 2 und 3 umfassen.
Die obige Impfstoffpräparation kann wenigstens ein weiteres nicht-Bordetella- Immunogen umfassen. Ein solches weiteres nicht-Bordetella-Immunogen kann ein Kapselpolysaccharid von Haemophilus, ein äußeres Membranprotein von Haemophilus, Hepatitis B-Oberflächenantigen, Polio, Mumps, Masern und/oder Röteln sein.
Die obigen Impfstoffpräparationen können weiterhin ein Hilfsmittel umfassen, und ein solches Hilfsmittel kann Aluminiumphosphat, Aluminiumhydroxid, Quil A, QS21, Calciumphosphat, Calciumhydroxid, Zinkhydroxid, ein Glykolipidanaloges, ein Octodecylester einer Aminosäure oder ein Lipoprotein sein.
Die Impfstoffpräparation kann Pertussis-Toxoid, filamentöses Hämagglutinin, das 69 kDa-Protein und filamentöse Agglutinogene von Bordetella bei einem Gewichtsverhältnis von ca. 10 : 5 : 5 : 3 umfassen, wie es durch ca. 10 ug Pertussis-Toxoid, ca. 5 ug filamentöses Hämagglutinin, ca. 5 ug des 69 kDa-Proteins und ca. 3 ug Fimbrien- Agglutinogene in einer Einzelhumandosis bereitgestellt wird.
Die Impfstoffpräparation kann alternativ Pertussis-Toxoid, filamentöses Hämagglutinin, 69 kDa-Protein und Fimbrien-Agglutinogene in einem Gewichtsverhältnis von ca. 20 : 20 : 5 : 3 umfassen, wie es durch ca. 20 ug Pertussis-Toxoid, ca. 20 ug filamentöses Hämagglutinin, ca. 5 ug des 69 kDa-Proteins und ca. 3 ug Fimbrien-Agglutinogene in einer Einzelhumandosis bereitgestellt wird.
Die Impfstoffpräparation gemäß einer anderen Alternative umfasst Pertussis-Toxoid, filamentöses Hämagglutinin, 69 kDa-Protein und Fimbrien-Agglutinogene in einem Gewichtsverhältnis von ca. 20 : 10 : 10 : 6, wie es durch ca. 20 ug Pertussis-Toxoid, ca. 10 ug filamentöses Hämagglutinin, ca. 10 ug 69 kDa-Protein und ca. 6 ug Fimbrien-Agglutinogene in einer Einzelhumandosis bereitgestellt wird.
In einer bestimmten Ausführungsform der Erfindung enthält die Impfstoffpräparation entweder:
(a) 10 ug Stickstoff von Pertussis-Toxoid, 5 ug Stickstoff von filamentösem Hämagglutinin, 5 ug Stickstoff von Agglutinogenen und 3 ug Stickstoff von Pertaktin in einer Einzelhumandosis; oder
(b) 20 ug Stickstoff von Pertussis-Toxoid, 20 ug Stickstoff von filamentösem Hämagglutinin, 5 ug Stickstoff von Agglutinogenen und 3 ug Stickstoff von Pertaktin in einer Einzelhumandosis.
Das Ausmaß des Schutzes für die einem Risiko unterliegende menschliche Population, das durch die Impfstoffpräparation geliefert wird, kann wenigstens ca. 80%, vorzugsweise ca. 85% betragen, für einen Fall mit spastischem Husten für eine Dauer von wenigstens 21 Tagen und einer durch Kultivierung bestätigten bakteriellen Infektion. Das Ausmaß des Schutzes für die einem Risiko unterliegende menschliche Population kann wenigstens ca. 70% betragen, für einen Fall von schwachem Keuchhusten mit einem Husten von wenigstens einem Tag Dauer.
Die Agglutinogen-Komponente der Impfstoffpräparation umfasst vorzugsweise Fimbrien-Agglutinogen 2 (Agg 2) und Fimbrien-Agglutinogen 3 (Agg 3), welche im Wesentlichen frei von Agglutinogen 1 sind. Das Gewichtsverhältnis von Agg 2 zu Agg 3 kann von ca. 1,5 : 1 von ca. 2 : 1 betragen.
Die Impfstoffpräparation kann eine DTP-Impfstoffpräparation sein, welche ca. 15 Lfs Diphtherie-Toxoid und ca. Lfs Tetanus-Toxoid enthält.
Zusätzlich kann die Impfstoffpräparation ebenfalls ein Hilfsmittel, insbesondere Alaun, enthalten.
Bei der Herstellung einer Einzelhumandosis der Impfstoffpräparation können von ca. 30 ug Stickstoff von Pertaktin und ca. 1 bis ca. 10 ug Stickstoff der Fimbrien- Agglutinogene eingesetzt werden. Insbesondere wurden die Impfstoffpräparationen, wie sie hierin diskutiert werden, durch das National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) der Regierung der Vereinigten Staaten für die Auswertung in einem klinischen Doppelblindversuch in Bezug auf die Wirksamkeit beim Menschen ausgewählt, so dass auf diese Weise eine hinreichende Grundlage für die besonders geschulte Fachwelt erarbeitet wurde, dahingehend, dass die Zusammensetzungen in einem gewissen Ausmaß zur Verhütung der angegebenen Erkrankung (Keuchhusten) wirksam sind. Der Gegenstand des Klinikversuchs (welcher ein Impfstoff wie hierin beschrieben war) hat die Prüfung der Vorhersehbarkeit der Nutzanwendung in vernünftiger Weise bestanden.
Die Erfindung wird nachstehend in den Beispielen veranschaulicht. Jedoch wird die vorliegende Erfindung nun zuerst, nur beispielhaft, durch Bezug auf die begleitende Zeichnung beschrieben, in welcher:
Die Fig. 1 ein schematisches Fließschema einer Vorgehensweise zur Isolierung einer Agglutinogenpräparation aus einem Bordetella-Stamm ist.
Was Fig. 1 betrifft, so wird ein Fließschema eines Verfahrens zur Herstellung einer Agglutinogenpräparation aus einem Bordetella-Stamm dargestellt. Wie aus der Fig. 1 ersichtlich ist, wird eine Zellpaste aus B. pertussis mit einem Gehalt an Agglutinogenen, wie z. B. eine Zellpaste aus B. pertussis mit beispielsweise einem Harnstoff enthaltenden Puffer, wie z. B. 10 mM Kaliumphosphat, 150 mM NaCl und 4 M Harnstoff extrahiert, um die Agglutinogene aus der Zellpaste zur Gewinnung eines ersten Überstandes (sp1) mit einem Gehalt an Agglutinogenen und einem ersten Rückstandsniederschlag (ppt1) in selektiver Weise zu extrahieren. Der erste Überstand (sp1) wird von dem ersten Rückstandsniederschlag (ppt1) z. B. durch Zentrifugieren abgetrennt. Der Rückstandsniederschlag (ppt1) wird verworfen. Der geklärte Überstand (sp1) kann im Anschluß daran konzentriert und gegenüber beispielsweise 10 mM Kaliumphosphat/150 mM NaCl/0,1% Triton X-100 unter Einsatz von zum Beispiel einem NMWL-Membranfilter von 100 bis 300 kDa der Diafiltration unterworfen werden.
Der erste Überstand wird sodann bei einer solchen Temperatur und für eine solche Zeitdauer inkubiert, dass ein geklärter Überstand (sp2) mit einem Gehalt an Agglutinogenen und ein zweiter zu verwerfender Niederschlag (ppt2) mit einem Gehalt an Verunreinigungen, die von Agglutinogenen verschieden sind, gewonnen werden. Die geeigneten Temperaturen schließen etwa 50ºC bis zu etwa 100ºC ein, einschließlich etwa 75ºC bis zu etwa 85ºC, wobei passende Inkubationszeiten etwa 1 bis zu etwa 60 Minuten einschließen. Der geklärte Überstand wird anschließend beispielsweise durch den Zusatz von Polyethylenglycol mit einem Molekulargewicht von ca. 8000 (PEG 8000) auf eine endgültige Konzentration von etwa 4,5 ± 0,2% konzentriert und sachte mindestens ca. 30 Minuten lang zur Gewinnung eines dritten Niederschlags (ppt3) gerührt, welcher durch Zentrifugieren gewonnen werden kann. Der verbleibende Überstand (sp3) wird verworfen.
Dieser dritte Niederschlag (ppt3) wird z. B. mit einem Puffer, enthaltend 10 mM Kaliumphosphat/150 mM NaCl, zur Gewinnung der rohen Fimbrien-Agglutinogen enthaltenden Lösung extrahiert. Es kann 1 M Kaliumphosphat zu der rohen Fimbrien- Lösung hinzugefügt werden, um sie im Hinblick auf das Kaliumphosphat auf ca. 100 mM einzustellen. Alternativ lässt sich der geklärte Überstand der mit Wärme behandelten Fimbrien-Agglutinogene auch ohne Ausfällung mittels der Gelfiltrationschromatographie reinigen, und zwar unter Einsatz eines Gels wie z. B. Sepharose CL6B. Die Fimbrien-Agglutinogene in der rohen Lösung werden im Anschluss daran durch Säulenchromatographie gereinigt, beispielsweise anhand der Passage durch eine PEI- Silica-Säule zur Gewinnung des Präparats mit dem Fimbrien-Agglutinogen im Durchlauf.
Dieses Fimbrien-Agglutinogen, enthaltend den Durchlauf, lässt sich weiter konzentrieren und der Diafiltration gegenüber beispielsweise einem Puffer mit einem Gehalt an 10 mM Kaliumphosphat/150 mM NaCl unter Einsatz einer NMWL-Membran mit 100 bis 300 kDa unterwerfen. Die Agglutinogenpräparation lässt sich durch die Filtration durch einen Membranfilter mit ≤0,22 um zur Gewinnung des endgültigen Fimbrien-Agglutinogenpräparats mit einem Gehalt an den Fimbrien-Agglutinogenen 2 und 3 sterilisieren.
Eine Agglutinogenpräparation aus einem Bordetella-Stamm kann Fimbrien-Agglutinogen 2 (Agg 2) und Fimbrien-Agglutinogen 3 (Agg 3) umfassen, welche im Wesentlichen frei von Agglutinogen 1 sind. Das Gewichtsverhältnis von Agg 2 zu Agg 3 kann von ca. 1,5 : 1 bis ca. 2 : 1 betragen. Derartige Fimbrien-Agglutinogenpräparationen können durch das Verfahren erzeugt werden, wie es hierin bereitgestellt wird und oben im Detail beschrieben wurde.
Die Impfstoffpräparation enthält Pertussis-Toxin oder ein Toxoid von diesem, einschließlich genetisch detoxifizierter Analoga von PT, wie hierin beispielsweise in Lit. 68 beschrieben wird.
Die Impfstoffpräparation kann weiterhin nicht-Bordetella-Immunogene einschließen, einschließlich des Kapselpolysaccharids von Haemophilus, des äußeren Membranproteins von Haemophilus, des Hepatitis B-Oberflächenantigens, Polio, Mumps, Masern und Röteln.
Jedes der Bordetella-Antigene wird individuell an ein Hilfsmittel (wie z. B. Alaun) absorbiert, um eine praktische und zügige Gewinnung der Impfstoffpräparationen, die ausgewählte relative Mengen an Antigenen enthalten, bereitzustellen, um einen Schutz in einem Ausmaß von wenigstens ca. 70% der Mitglieder einer Risikopopulation, vorzugsweise wenigstens ca. 80% einer solchen Population zu verleihen.
In besonderen Ausführungsformen weisen die Impfstoffpräparationen die folgenden Charakteristika auf (ug Proteine gemäß vorliegender Verwendung stützen sich auf die Ergebnisse aus Tests nach Kjeldahl, die an gereinigten Konzentraten vorgenommen wurden, und sind in Form von ug Proteinstickstoff ausgedrückt), und alle können mittels intramuskulärer Injektion verabreicht werden:

(a) CP10/5/5/3DT

Eine Formulierung des Komponentenimpfstoffes gegen Pertussis, der mit Diphtherie- und Tetanus-Toxoiden kombiniert ist, wurde mit CP10/5/5/3DT bezeichnet. Jede Humandosis an CP10/5/5/3DT mit 0,5 ml wurde so formuliert, dass sie ungefähr folgende Bestandteile enthielt:
10 ug Pertussis-Toxoid (PT)
5 ug filamentöses Hämagglutinin (FHA)
5 ug Fimbrien-Agglutinogene 2 und 3 (FIMB)
3 ug Protein aus der äußeren Membran mit 69 kDa
15 Lf Diphtherie-Toxoid
5 Lf Tetanus-Toxoid
1,5 mg Aluminiumphosphat
0,6% 2-Phenoxyethanol als Konservierungsmittel

(b) CP20/20/5/3DT

Eine weitere Formulierung des Komponentenimpfstoffes gegen Pertussis, der mit Diphtherie- und Tetanus-Toxoiden kombiniert ist, wurde mit CP20/20/5/3DT bezeichnet. Jede Humandosis an CP20/20/5/3DT mit 0,5 ml wurde so formuliert, dass sie ungefähr folgende Bestandteile enthielt:
20 ug Pertussis-Toxoid (PT)
20 ug filamentöses Hämagglutinin (FHA)
5 ug Fimbrien-Agglutinogene 2 und 3 (FIMB)
3 ug Protein aus der äußeren Membran mit 69 kDa
15 Lf Diphtherie-Toxoid
5 Lf Tetanus-Toxoid
1,5 mg Aluminiumphosphat
0,6% 2-Phenoxyethanol als Konservierungsmittel

(c) CP10/5/5DT

Eine Formulierung des Komponentenimpfstoffes gegen Pertussis, der mit Diphtherie- und Tetanus-Toxoiden kombiniert ist, wurde mit CP10/5/5DT bezeichnet. Jede Humandosis an CP10/5/5DT mit 0,5 ml wurde so formuliert, dass sie ungefähr folgende Bestandteile enthielt:
10 ug Pertussis-Toxoid (PT)
5 ug filamentöses Hämagglutinin (FHA)
5 ug Fimbrien-Agglutinogene 2 und 3 (FIMB)
15 Lf Diphtherie-Toxoid
5 Lf Tetanus-Toxoid
1,5 mg Aluminiumphosphat
0,6% 2-Phenoxyethanol als Konservierungsmittel

(d) CP10/10/10/6DT

Eine weitere Formulierung des Komponentenimpfstoffes gegen Pertussis, kombiniert mit Diphtherie- und Tetanus-Toxoiden, wurde mit CP10/10/10/6DT bezeichnet. Jede Humandosis an CP10/10/10/6DT mit 0,5 ml wurde so formuliert, dass sie ungefähr folgende Bestandteile enthielt:
20 ug Pertussis-Toxoid (PT)
10 ug filamentöses Hämagglutinin (FHA)
10 ug Fimbrien-Agglutinogene 2 und 3 (FIMB)
6 ug Protein aus der äußeren Membran mit 69 kDa (69 kDa)
15 Lf Diphtherie-Toxoid
5 Lf Tetanus-Toxoid
1,5 mg Aluminiumphosphat
0,6% 2-Phenoxyethanol als Konservierungsmittel
Die übrigen Immunogene aus Bordetella, das Pertussis-Toxin (einschließlich genetisch entgifteter Analoga davon gemäß der Beschreibung in beispielsweise Klein et al., US-Patent Nr. 5 085 862, das an den Patentinhaber übertragen wurde), das FHA und das Protein mit 69 kDa lassen sich mittels einer Vielfalt an Verfahren, wie sie z. B. unten stehend beschrieben sind, herstellen:

Reinigung von PT

Das PT lässt sich aus dem Überstand der Kultur aus einem Stamm von B. pertussis unter Einsatz herkömmlicher Verfahren isolieren. So z. B. lässt sich das Verfahren nach Sekura et al. (Lit. 55) einsetzen. Das PT wird zunächst durch Absorption des Überstands aus der Kultur an eine Säule isoliert, die die Gelmatrix mit einem Farbstoff-Liganden, Affi-Gel-Blue (Bio-Rad Labaratories, Richmond, CA) enthält. Das PT wird aus dieser Säule durch eine hochkonzentrierte Salzlösung eluiert, wie zum Beispiel 0,75 M Magnesiumchlorid, und nach Entfernen des Salzes einer Passage durch eine Säule mit der Affinitätsmatrix Fetuin-Sepharose unterzogen, wobei die Matrix aus Fetuin (fötales Globulin von Mammalia) zusammengesetzt ist, das mit der durch Cyanogenbromid aktivierten Sepharose verknüpft ist. Das PT wird aus der Fetuin-Säule unter Verwendung von 4 M Magnesiumsalz eluiert.
Alternativ lässt sich das Verfahren nach Irons et al. (Lit. 56) einsetzen. Der Überstand aus der Kultur wird auf einer Säule mit Sepharose 4B, die mit CNBr aktiviert wurde und an welche Haptoglobin zuerst kovalent gebunden ist, absorbiert. Das PT bindet an das Absorbens bei einem pH-Wert von 6,5, wobei es aus der Säule unter Einsatz von 0,1 M Tris/0,5 M NaCl-Puffer bei einer schrittweisen Abänderung bis auf den pH-Wert 10 eluiert wird.
Alternativ kann das Verfahren eingesetzt werden, das in dem US-Patent Nr. 4 705 686 beschrieben ist, welches für Scott et al. am 10. November 1987 erteilt wurde. Bei diesem Verfahren lässt man die Überstände aus der Kultur oder die Zellextrakte von 81 pertussis über eine Säule eines Ionenaustauscherharzes mit einer hinreichenden Kapazität zur Adsorption des Endotoxins laufen, wobei jedoch ein Durchlauf der Bordetella-Antigene oder eine anderweitige Abtrennung von dem Endotoxin ermöglicht wird.
Alternativ kann das PT unter Einsatz der Chromatographie mit Perlit gemäß der Beschreibung in dem EP-Patent Nr. 336 736 gereinigt werden, welches auf den Patentinhaber übertragen wurde.

Entgiftung von PT

Das PT wird zur Entfernung unerwünschter Wirkungen, die Nebenwirkungen des fertigen Impfstoffes hervorrufen könnten, entgiftet. Jedes beliebige der Vielzahl herkömmlicher chemischer Entgiftungsverfahren lässt sich anwenden, wie z. B. die Behandlung mit Formaldehyd, Wasserstoffperoxid, Tetranitromethan oder Glutaraldehyd.
Beispielsweise lässt sich das PT mit Glutaraldehyd unter Einsatz einer Modifikation der Vorgehensweise, wie sie bei Munoz et al. (Lit. 57) beschrieben ist, entgiften. Bei diesem Entgiftungsverfahren wird das gereinigte PT in einer Lösung mit einem Gehalt an 0,01 M Phosphat-gepufferter Salzlösung inkubiert. Die Lösung wird mit Glutaraldehyd auf 0,05% hergestellt, die Mischung bei Raumtemperatur 2 Stunden lang inkubiert und im Anschluss daran mit L-Lysin auf 0,02 M gebracht. Das Gemisch wird ferner 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert und sodann 2 Tage lang gegen 0,01 M PBS dialysiert. Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung lässt sich das Entgiftungsverfahren nachdem EP-Patent Nr. 336 736 anwenden. Kurz gesagt lässt sich das PT mit Glutaraldehyd wie folgt entgiften:
Das gereinigte PT in 75 mM Kaliumphosphat mit einem Gehalt an 0,22 M Natriumchlorid und einem pH-Wert von 8,0 wird mit einem gleichen Volumen an Glyzerin auf Proteinkonzentrationen von annähernd 50 bis zu 400 ug / ml verdünnt. Die Lösung wird auf 37ºC erwärmt und durch den Zusatz von Glutaraldehyd bis auf eine endgültige Konzentration von 0,5% (Gew./Vol.) entgiftet. Die Mischung wird bei 37ºC 4 Stunden lang gehalten und anschließend Asparaginsäure (1,5 M) bis auf eine endgültige Konzertration von 0,25 M hinzugegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 1 Stunde lang inkubiert und im Anschluss daran mit 10 Volumina 10 mM Kaliumphosphat, Enthaltend 0,15 M Natriumchlorid und 5% Glyzerin bei einem pH- Wert von 8,0 der Diafiltration unterworfen, um den Glyceringehalt zu verringern und das Glutaraldehyd zu entfernen. Das PT-Toxoid wird durch ein Membran von 0,2 um hindurch steril filtriert.
Im Falle des Einsatzes von rekombinanten Techniken zur Herstellung eines Mutantenmoleküls von PT mit einer geringen oder ohne Toxizität zur Verwendung als das toxoidierte Molekül besteht keine Notwendigkeit für eine chemische Entgiftung.

Reinigung von FHA

Das FHA lässt sich aus dem Überstand der Kultur im Wesentlichen in der Weise reinigen, wie sie von Cowell et al. (Lit. 58) beschrieben wurde. Wachstumspromoter, wie z. B. methylierte β-Cyclodextrine können zur Erhöhung der Ausbeute an FHA im jeweiligen Überstand der Kultur eingesetzt werden. Der Überstand der Kultur wird über eine Säule mit Hydroxylapatit gegeben. Das FHA wird an der Säule adsorbiert, das PT dagegen nicht. Die Säule wird dann intensiv mit Triton X-100 zum Entfernen des Endotoxins gewaschen. Im Anschluss daran wird das FHA unter Verwendung von 0,5 M NaCl in 0,1 M Natriumphosphat eluiert und bei Bedarf einer Passage durch eine Säule mit Fetuin-Sepharose zur Entfernung von verbliebenem PT unterzogen. Eine zusätzliche Reinigung kann die Passage durch eine Säule mit Sepharose CL-6B mit einschließen.
Alternativ lässt sich das FHA unter Verwendung von gegen das Antigen gerichteten monoklonalen Antikörpern reinigen, wobei die Antikörper auf einer mit CNBr aktivierten Affinitätssäule fixiert werden (Lit. 59).
Alternativ lässt sich das FHA unter Einsatz der Chromatographie mit Perlit reinigen, wie in der oben erwähnten EP 336 736 beschrieben ist.

Reinigung des Proteins aus der äußeren Membran mit 69 kDa (Pertaktin)

Das 69 kDa-Protein aus der äußeren Membran (69K oder Pertaktin) lässt sich aus den bakteriellen Zellen durch eine erste Inaktivierung der Zellen mittels eines bakteriostatischen Mittels wie z. B. durch Thimerosal gemäß der Beschreibung in der veröffentlichten EP 484 621 gewinnen. Die inaktivierten Zellen werden in einem wässrigen Medium suspendiert, wie z. B. PBS (pH-Wert 7 bis 8) und einer wiederholten Extraktion bei erhöhter Temperatur (45 bis 60ºC) unterzogen, wonach auf Raumtemperatur oder 4ºC abgekühlt wird. Die Extraktionen setzen das 69K-Protein aus den Zellen frei. Das Material mit einem Gehalt an dem 69K-Protein wird durch eine Fällung gewonnen und einer Passage über eine mit Affi-Gel-Blue befüllte Säule unterzogen. Das 69K-Protein wird bei einer hohen Salzkonzentration wie zum Beispiel 0,5 M Magnesiumchlorid eluiert. Nach der Dialyse wird es einer Passage durch einen die Chromatographie fokussierenden Träger unterworfen.
In alternativer Weise kann das Protein mit 69 kDa aus dem Überstand der Kultur aus einer B. pertussis-Kultur gemäß der Beschreibung in der veröffentlichten PCT- Anmeldung WO 91/15505, die auf den Namen ihres Rechtsnachfolgers lautet, gereinigt werden.
Weitere geeignete Reinigungsverfahren für das 69 kDa-Protein aus der äußeren Membran aus B. pertussis sind in dem US-Patent Nr. 5 276 142, das für Gotto et al. am 4. Januar 1984 erteilt wurde, und in dem US-Patent Nr. 5 101 014 beschrieben, das für Burns am 31. März 1992 erteilt wurde.
Es wurde eine Anzahl von klinischen Versuchen an Patienten gemäß vorliegender Beschreibung durchgeführt, um die Sicherheit, das Fehlen von Reaktionen und die Nützlichkeit der Komponentenimpfstoff zum Schutz gegen Keuchhusten abzusichern. Insbesondere wurden Immunantworten auf die einzelnen in den Impfstoffen enthaltenen Antigene erzielt (wie z. B. in der unten stehenden Tabelle 3 aufgezeigt ist). Ein besonderer nichtzellulärer Impfstoff gegen Keuchhusten in Form von CP10/5/5/3DT wurde in einer ausgedehnten placebokontrollierten, doppelt randomisierten klinischen multizentrischen Studie bei einer Risikobevölkerungsgruppe zur Abschätzung der Wirksamkeit des Impfstoffes gegen einen typischen Keuchhusten analysiert.
Die Definition der Fälle von typischen Keuchhustenerkrankungen war wie folgt:
21 Tage oder länger spastischer Husten sowie entweder
durch Kultivierung bestätigter B. pertussis,
oder
serologische Anzeichen einer Bordetella-spezifischen Infektion, welche durch einen Anstieg auf 100% von IgG- oder IgA-Antikörpern in einem ELISA gegen FHA oder PT in gepaarten Seren angezeigt wird;
oder
falls serologische Werte fehlen, das in die Studie einbezogene Kind befindet sich bisher in Kontakt mit einem durch Kultivierung bestätigten Fall von B. pertussis im Haushalt mit einem Einsetzen des Hustens innerhalb von 28 Tagen vor oder nach dem Beginn des Hustens bei diesem Kind aus der Studie.
Die Ergebnisse dieser Studie zeigten auf, dass CP10/5/5/3DT bei der Verhütung von Keuchhusten zu etwa 85% wirksam ist gemäß der Definition der Fälle von typischen Keuchhustenerkrankungen gemäß der oben stehenden Beschreibung. In der gleichen Studie war ein nichtzellulärer Zweikomponentenimpfstoff gegen Keuchhusten mit einem Gehalt an lediglich PT und FHA nur zu etwa 58% wirksam, wobei der Impfstoff mit ganzen Zellen gegen Keuchhusten nur zu etwa 48% wirksam war (siehe die unten stehende Tabelle 4). Darüber hinaus verhinderte der Impfstoff CP10/5/5/3DT einen mild verlaufenden Keuchhusten, wie er in Form eines Hustens von mindestens 1 Tag Dauer definiert wird, mit einer Wirksamkeit von etwa 77%. Insbesondere war das erzielte Profil der Immunantwort im Wesentlichen das gleiche wie jenes, das man im Anschluss an die Immunisierung mit den Impfstoffen mit ganzen Zellen gegen Keuchhusten erhält, von welchen berichtet wurde, dass diese in hohem Maße gegen Keuchhusten wirksam sind.

Impfstoffherstellung und Verwendung

Somit lassen sich immunogene Zusammensetzungen mit einer Eignung zur Verwendung als Impfstoffe aus den Immunogenen von Bordetella gemäß der vorliegenden Offenbarung herstellen. Der Impfstoff ruft eine Immunantwort bei einem Patienten hervor, der Antikörper produziert, die opsonisierend oder bakterizid sein können. Im Falle einer Exposition des geimpften Patienten an B. pertussis binden derartige Antikörper an die Bakterien und inaktivieren sie. Ferner können opsonisierende oder bakterizide Antikörper auch einen Schutz durch alternative Mechanismen bieten.
Immunogene Zusammensetzungen einschließlich der Impfstoffe lassen sich als Injektionspräparate, flüssige Lösungen oder Emulsionen herstellen. Die Immunogene aus Bordetella lassen sich mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern vermischen, welche mit den Immunogenen verträglich sind. Derartige Träger schließen Wasser, Salzlösung, Dextrose, Glyzerin, Ethanol und deren Kombinationen ein. Die immunogenen Zusammensetzungen und Impfstoffe können ferner Hilfsmittel, wie z. B. Benetzungsmittel oder Emulgatoren, den pH-Wert puffernde Mittel oder Adjuvanzien zur Erhöhung ihrer Wirksamkeit enthalten. Die immunogenen Zusammensetzungen und Impfstoffe lassen sich parenteral applizieren und zwar durch subkutane oder intramuskuläre Injektion. Die immunogenen Präparate und Impfstoffe werden in einer Art und Weise verabreicht, dass sie im Hinblick auf die Formulierung der Dosis verträglich ist, und zwar in einer Menge, dass die therapeutische Wirkung in Bezug auf die Immunogenität und den Schutz eintritt. Die zu applizierende Menge ist von dem zu behandelnden Patienten abhängig, und zwar unter Berücksichtigung der Leistungsfähigkeit des Immunsystems der Einzelperson im Hinblick auf die Produktion von Antikörpern und, im Bedarfsfall, die Produktion der über Zellen vermittelten Immunantwort. Exakte Mengen des aktiven Bestandteils, der appliziert werden soll, sind von der Einschätzung des praktizierenden Arztes abhängig. Die passenden Dosierungsbereiche lassen sich jedoch durch die Fachleute leicht bestimmen; jene können in der Größenordnung von Mikrogramm im Hinblick auf die Immunogene liegen. Geeignete Dosierungsschemata für die einleitende Verabreichung und die Dosen für den Booster-Effekt sind gleichfalls variabel, können aber eine einleitende Verabreichung mit nachfolgenden Applikationen einschließen. Die Dosierung kann auch vom Verabreichungsweg abhängig sein und dürfte entsprechend der Größe des Wirts variieren.
Die Konzentration der Immunogene in einer immunogenen Zusammensetzung gemäß der Erfindung beträgt im allgemeinen etwa 1 bis etwa 95%. Ein Impfstoff mit einem Gehalt an antigenem Material aus lediglich einem Pathogen stellt einen monovalenten Impfstoff dar. Impfstoffe mit einem Gehalt an antigenem Material aus mehreren Pathogenen stellen kombinierte Impfstoffe dar; sie sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Derartige Kombinationsimpfstoffe enthalten beispielsweise Material aus mehreren Pathogenen oder aus verschiedenen Stämmen in Bezug auf das gleiche Pathogen, oder aus Kombinationen verschiedener Pathogene.
Die Immunogenizität lässt sich in signifikanter Weise dann verbessern, wenn die Antigene zusammen mit Adjuvanzien appliziert werden, für gewöhnlich im Einsatz als 0,005 bis 0,5%ige Lösung in einer mit Phosphat gepufferten Salzlösung. Adjuvanzien verbessern die Immunogenizität eines Antigens, stellen aber nicht notwendigerweise selbst Immunogene dar. Die Adjuvanzien können die Funktion aufweisen, ein Antigen lokal in Nähe der Stelle der Applikation zu halten, um einen Depoteffekt zu entwickeln, der eine allmähliche und verzögerte Freisetzung des Antigens an die Zellen des Immunsystems erleichtert. Die Adjuvanzien können auch Zellen des Immunsystems zu einem Antigendepot locken und derartige Zellen zur Provokation von Immunantworten stimulieren.
Die immunstimulierenden Mittel oder Adjuvanzien werden schon seit vielen Jahren zur Verbesserung der Immunantworten des Wirtes auf beispielsweise Impfstoffe eingesetzt. Intrinsische Adjuvanzien, wie z. B. Lipopolysaccharide sind normalerweise die Komponenten der abgetöteten oder abgeschwächten Bakterien, die als Impfstoffe eingesetzt werden. Die exogenen (extrinsischen) Adjuvanzien stellen Immunmodulatoren dar, die typischerweise nicht in kovalenter Weise mit Antigenen verknüpft und so formuliert sind, dass die Immunantworten des Wirtes verbessert werden. Somit wurden Adjuvanzien identifiziert, welche die Immunantwort auf Antigene erhöhen, die parenteral befördert werden. Einige dieser Adjuvanzien sind jedoch toxisch; sie können unerwünschte Nebenwirkungen hervorrufen, so dass sie sich für die Verwendung beim Menschen und vielen Tieren nicht eignen. In der Tat werden allein Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat (kollektiv für gewöhnlich als Alaun bezeichnet) routinemäßig als Adjuvanzien in Impfstoffen für Mensch und Tier verwendet. Die Effizienz von Alaun bei der Steigerung der Antikörperantworten auf Diphtherie- und Tetanus-Toxoide ist wohl etabliert, wobei erst vor kurzem ein HBsAg- Imfpstoff mit Alaun als Adjuvans versehen wurde. Während die Nützlichkeit von Alaun für einige Anwendungen wohl etabliert ist, bestehen dafür Einschränkungen. Beispielsweise ist Alaun bei der Grippeimpfung unwirksam, wobei es in widersprüchlicher Weise eine über Zellen vermittelte Immunantwort hervorruft. Die durch Antigene mit Alaun als Adjuvans hervorgerufenen Antikörper sind in der Hauptsache vom Isotyp IgG1 bei der Maus, was für den Schutz durch einige Impfmittel nicht optimal sein dürfte.
Eine große Spannweite exogener Adjuvanzien kann starke Immunantworten gegenüber Antigenen bewirken. Diese schließen Saponine ein, die mit Antigenen aus Membranproteinen komplexiert sind (immunstimulierende Komplexe), Pluronic- Polymere mit Mineralöl, abgetötete Mykobakterien in Mineralöl, Freund'sches komplettes Adjuvans, Produkte aus Bakterien wie z. B. Muramyldipeptid (MDP) sowie Lipopolysaccharid (LPS) wie auch das Lipid A und Liposomen.
Zur effizienten Provokation von humoralen Immunantworten (HIR) und einer über Zellen vermittelten Immunität (CMI) werden Immunogene häufig in Adjuvanzien emulgiert. Zahlreiche Adjuvanzien sind toxisch und erzeugen Granulome sowie akute und chronische Entzündungen (Freund'sches komplettes Adjuvans, FCA), Zytolyse (Saponine und Pluronic-Polymere) und Pyrogenizität, Arthritis und vordere Uveitis (LPS und MDP). Obschon das FCA ein ausgezeichnetes Adjuvans darstellt und weit verbreitet in der Forschung benutzt wird, ist es wegen seiner Toxizität nicht für die Anwendung in Impfstoffen für Mensch und Tier zugelassen.
Wünschenswerte Charakteristika idealer Adjuvanzien schließen die folgenden Merkmale ein:
(1) Fehlen von Toxizität;
(2) Fähigkeit zur Stimulierung einer lang anhaltenden Immunantwort;
(3) Einfachheit der Herstellung und Stabilität bei langen Aufbewahrungszeiten;
(4) Fähigkeit zur Provokation von sowohl CMI als auch HIR auf Antigene, die auf verschiedenen Wegen appliziert wurden;
(5) Synergie mit weiteren Adjuvanzien;
(6) Befähigung zur selektiven Wechselwirkung mit Populationen von Antigenpräsentierenden Zellen (APC);
(7) Fähigkeit zur spezifischen Provokation von geeigneten Immunantworten, die für TH1- oder TH2-Zellen spezifisch sind; sowie
(8) Fähigkeiten zur selektiven Steigerung der geeigneten Isotypentiter von Antikörpern -(beispielsweise IgA) gegenüber Antigenen.
In dem US-Patent Nr. 4 855 283, das für Lockhoff et al. am 8. August 1989 erteilt wurde, wird gelehrt, dass Glykolipidanaloga einschließlich der N-Glykosylamide, N- Glykosylharnstoffe und N-Glykosylcarbamate als Immunmodulatoren oder Adjuvanzien fungieren können, wobei jede dieser Verbindungen am Zuckerrest durch eine Aminosäure substituiert ist. So wird von Lockhoff et al. (US-Patent Nr. 4 855 283 und Lit. 60) berichtet, dass die N-Glykolipidanaloga, welche strukturelle Ähnlichkeiten mit den natürlicherweise vorkommenden Glykolipiden, wie z. B. Glykosphingolipiden und Glykoglycerolipiden aufweisen, dazu befähigt sind, sowohl bei dem Impfstoff gegen den Herpes simplex-Virus als auch bei dem Impfstoff gegen den Pseudorabies-Virus starke Immunantworten zu provozieren. Einige Glykollipide wurden aus langkettigen Alkylaminen und Fettsäuren synthetisiert, die direkt mit den Zuckern über ein anomeres Kohlenstoffatom verknüpft sind, um so die Funktionen von natürlicherweise vorkommenden Lipidresten nachzuahmen.
Das US-Patent Nr. 4 258029, das für Moloney erteilt und auf den Rechtsnachfolger übertragen wurde, vermittelt die Lehre, dass Octadecyltyrosinhydrochlorid (OTH) dann als Adjuvans fungiert, wenn es mit Tetanus-Toxoid und einem Impfstoff gegen den Poliomyelitisvirus vom Typ I, II und III, der mit Formalin inaktiviert wurde, komplexiert wird. Ebenso berichteten Nixon-George et al. (Lit. 61); dass Octadecylester aus aromatischen Aminosäuren, die mit einem rekombinanten Oberflächenantigen von Hepatitis B komplexiert wurden, die Immunantworten des Wirtes gegenüber dem Hepatitis B-Virus verstärken würden.

Beispiele

Durch die oben stehende Offenbarung wird die vorliegende Erfindung generell beschrieben. Ein vollständigeres Verständnis lässt sich durch die Bezugnahme auf die folgenden speziellen Beispiele vermitteln. Diese Beispiele werden lediglich zu Zwecken der Veranschaulichung beschrieben und sollen nicht dazu dienen, den Umfang der Erfindung zu beschränken. Änderungen in der Form und Ersatz durch Äquivalente sind umfasst, wenn die Umstände diese anregen oder nahe legen können. Obwohl hierin spezifische Begriffe eingesetzt wurden, sind diese Begriffe nur in einem beschreibenden Sinn und nicht zu Zwecken der Beschränkung gedacht.
Die Verfahren der Proteinbiochemie, Fermentierung und Immunologie, die benutzt, aber nicht ausdrücklich in der vorliegenden Offenbarung beschrieben sind, sind in der wissenschaftlichen Literatur ausführlich erläutert; sie gehören zu den Fähigkeiten der Fachleute.

Beispiel 1:

Durch dieses Beispiel wird das Wachstum von Bordetella pertussis beschrieben.

Original-Impfkeime:

Die Kulturen der Original-Impfkeime aus einem Stamm von Bordetella pertussis wurden als Chargen gefriergetrockneter Impfkeime bei 2ºC bis 8ºC gehalten.

Impfkeime für den Ansatz:

Die gefriergetrocknete Kultur wurde in Hornibrook-Medium wiederhergestellt und dazu benutzt, Platten auf Basis von Bordet-Gengou-Agar (BGA) zu beimpfen. Das Medium nach Hornibrook weist die folgende Zusammensetzung auf:
Bestandteil auf 1 Liter
Caseinhydrolysat (mit Holzkohle behandelt) 10,0 g
Nikotinsäure 0,001 g
Calciumchlorid 0,002 g
Natriumchlorid 5,0 g
Magnesiumchlorid·Hexahydrat 0,025 g
Kaliumchlorid 0,200 g
dibasisches Kaliumphosphat 0,250 g
Stärke 1,0 g
destilliertes Wasser auf 1,0 Liter
Der pH-Wert wird mit 1%iger Natriumcarbonatlösung auf 6,9 ± 0,1 eingestellt. Das Medium wird in Röhrchen dispensiert und mittels Dampf im Autoklaven 20 Minuten lang sterilisiert, wobei das Autoklavieren bei 121ºC bis 124ºC 20 Minuten lang erfolgt. Die Impfkeime wurden 2 Mal subkultiviert, zuerst auf BGA-Platten und im Anschluss daran auf Komponenten-Pertussis-Agar (CPA). Der Komponenten- Pertussis-Agar (CPA) ist wie folgt zusammengesetzt:
NaCl 2,5 g/L
KH&sub2;PO&sub4; 0,5 g/L
KCl 0,2 g/L
MgCl&sub2;·(H&sub2;O)&sub6; 0,1 g/L
Tris-Base 1,5 g/L
Caseinaminosäuren 10,0 g/L
NaH-Glutamat 10,0 g/L
konz. HCl bis pH-Wert 7,2
Agar 15,0 g/L
Wachstumsfaktoren (CPGF) 10,0 ml/L
Die Komponenten-Pertussis-Wachstumsfaktoren (CPGF) - 100X sind wie folgt zusammengesetzt:
L-Cystein·HCl 4,0 g/L
Niacin 0,4 g/L
Ascorbinsäure 40,0 g/L
reduz. Glutathion 15,0 g/L
Fe&sub2;SO&sub4;·(H&sub2;O) 1,0 g/L
Dimethyl-β-cyclodextrin 100 g/L
CaCl&sub2;·(H&sub2;O)&sub2; 2,0 g/L
Die fertige Kultur wurde in einem Suspensionspuffer für Pertussis-Impfkeime (CPSB) suspendiert, in Aliquots von 2 bis 4 ml dispensiert und tiefgefroren bei -60ºC bis - 85ºC aufbewahrt. Der Suspensionspuffer für Pertussis-Impfkeime (CPSB) ist wie folgt zusammengesetzt:
Caseinaminosäuren 10,0 g/L
Tris-Base 1,5 g/L
wasserfreies Glyzerin 100 ml/L
konz. HCl bis pH 7,2
Diese Glyzerinsuspensionen bildeten das Ausgangsmaterial für die Herstellung der Ansatzimpfkeime.

Kultivierungsprozess:

Die Vermehrung der Ansatzimpfkeime wurde in Roux-Flaschen mit Komponenten- Pertussis-Agar 4 bis 7 Tage lang bei 34ºC bis 38ºC durchgeführt. Im Anschluss an diese Kultivierung wurden die Zellen von dem Agar mit der Komponenten-Pertussis- Nährlösung (CPB) abgewaschen. Die Proben wurden anhand der Gramfärbung im Hinblick auf die Reinheit und Trübung der Kultur beobachtet.
Die Zellen wurden in konische Kolben von 4 Liter Fassungsvermögen, welche CPB enthielten, überführt und bei 34ºC bis 38ºC für 20 bis 26 Stunden unter Schütteln inkubiert. Sodann wurden die Proben anhand der Gramfärbung im Hinblick auf die Reinheit der Kultur überprüft. Der Kolbeninhalt wurde vereinigt und die Suspension zur Impfung von 2 Fermentern mit einem Gehalt an CPB eingesetzt (10 Liter an Volumen, beginnend bei OD&sub6;&sub0;&sub0; 0,1-0,4). Die Impfkeime wurden bis zu einem Endwert von OD&sub6;&sub0;&sub0; 5,0 bis 10,0 wachsen gelassen. Die Proben wurden anhand der Gramfärbung im Hinblick auf die Reinheit der Kultur mittels antigenspezifischer ELISA-Tests sowie auf Sterilität überprüft.

Beispiel 2:

Durch dieses Beispiel wird die Reinigung von Antigenen aus der Zellkultur von Bordetella pertussis beschrieben.

Herstellung der Nährlösung und Zellkonzentrate:

Die Bakteriensuspension wurde in 2 Fermentern vom Produktionsmaßstab bei 34ºC bis 37ºC 35 bis 50 Stunden lang dem Wachstum überlassen. Den Fermentern wurden zum Überprüfen der Sterilität des Mediums Proben entnommen. Die Suspension wurde zum Abtrennen der Zellen aus der Nährlösung in eine kontinuierliche Scheibenstapelzentrifuge (12.000 · g) eingespeist. Die Zellen wurden bis zur erwarteten Extraktion der Fimbrienkomponente gesammelt. Die geklärte Flüssigkeit wurden der Passage durch einen Membranfilter von ≤0,22 um unterworfen. Die filtrierte Flüssigkeit wurde durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Membran mit einer nominalen Molekulargewichtsgrenze von 10 bis 30 kDa (NMWL) konzentriert. Das Konzentrat wurde bis zur erwarteten Abtrennung und Reinigung von Pertussis- Toxin (PT), filamentösem Hämagglutinin (FHA) und 69 kDa-Komponenten (Pertaktin) aufbewahrt.

Abtrennung der Komponenten der Nährlösung:

Die Komponenten der Nährlösung (69 kDa, PT und FHA) wurden abgetrennt und mittels der Perlit-Chromatographie und selektiver Elutionsschritte gereinigt, wie im Wesentlichen in dem EP-Patent Nr. 336 736 und in der von der Patentinhaberin veröffentlichten PCT-Anmeldung Nr. WO 91/15505, die oben beschrieben wurden, beschrieben wird. Die speziell durchgeführten Reinigungsprozesse werden nachstehend beschrieben:

Pertussis-Toxin (PT):

Die Perlit-Säule wurde mit 50 mM Tris, 50 mM Tris/0,5% Triton X-100 und 50 mM Tris-Puffer gewaschen. Die PT-Fraktion wurde aus der Perlit-Säule mit 50 mM Tris/ 0,12 M NaCl-Puffer eluiert.
Eine Hydroxylapatitsäure wurde mit der PT-Fraktion aus der Perlit-Chromatographie beladen und im Anschluss daran mit 30 mM Kaliumphosphatpuffer gewaschen. Das PT wurde mit 75 mM Kaliumphosphat/225 mM NaCl-Puffer eluiert. Die Säule wurde sodann mit 200 mM Kaliumphosphat/0,6 M NaCl zur Gewinnung der FHA-Fraktion gewaschen, welche verworfen wurde. Zu dem gereinigten PT wurde Glyzerin bis auf 50% hinzugefügt; dann wurde das Gemisch bei 2ºC bis 8ºC bis zur Entgiftung innerhalb einer Woche gelagert.

Filamentöses Hämagglutinin (FHA):

Die FHA-Fraktion wurde aus der Perlit-Säule mit 50 mM Tris/0,6 M NaCl eluiert. Das filamentöse Hämagglutinin wurde mittels Chromatographie über Hydroxylapatit gereinigt. Die Hydroxylapatitsäule wurde mit der FHA-Fraktion aus der Perlit-Säule beladen und anschließend mit 30 mM Kaliumphosphat mit einem Gehalt an 0,5% Triton X-100 gewaschen, wonach anschließend das Waschen mit 30 mM Kaliumphosphatpuffer erfolgte. Die PT-Fraktion wurde mit 85 mM Kaliumphosphatpuffer eluiert und verworfen. Die FHA-Fraktion wurde sodann mit 200 mM Kaliumphosphat/ 0,6 M NaCl eluiert und bei 2ºC bis 8ºC bis zur Entgiftung innerhalb einer Woche gelagert.

69 kDa (Pertaktin):

Das Konzentrat der Nährlösung wurde mit Wasser für Injektionszwecke (WFI) zum Erzielen einer Leitfähigkeit von 3 bis 4 mS/cm verdünnt und damit eine Perlitsäule bei einer Beladung von 0,5 bis 3,5 mg Protein pro ml Perlit beladen. Der Durchlauf (Fraktion der 69 kDa-Komponente) wurde mittels Ultrafiltration unter Einsatz einer NMWL-Membran von 10 bis 30 kDa konzentriert. Zu dem Konzentrat des Durchlaufs wurden 35% ± 3% (Gew./Vol.) Ammoniumsulfat hinzugegeben und das so erhaltene Gemisch entweder bei 2ºC bis 8ºC 4 ± 2 Tage aufbewahrt oder unmittelbar darauf zentrifugiert (7.000 · g). Der überschüssige Überstand wurde dekantiert und der Niederschlag durch Zentrifugieren (7.000 · g) gewonnen. Das Pellet aus dem [Protein mit] 69 kDa wurde entweder tiefgefroren bei -20ºC bis -30ºC aufbewahrt oder in Tris- oder Phosphatpuffer gelöst und unmittelbar danach verwendet.
Das Protein mit 69 kDa aus der äußeren Membran, das mittels der Ausfällung des Perlit-Durchlaufkonzentrats mit 35% (Gew./Vol.) Ammoniumsulfat gewonnen wurde, wurde zur Reinigung verwendet. Zu der 69 kDa-Fraktion wurde Ammoniumsulfat (100 ± 5 g pro Liter) hinzugefügt, wonach die Mischung mindestens 2 Stunden lang bei 2ºc bis 8ºC gerührt wurde. Das Gemisch wurde zur Gewinnung des Überstands zentrifugiert (7.000 · g). Zu dem Überstand wurde Ammoniumsulfat (100 bis 150 g pro Liter) hinzugefügt, wonach die Mischung mindestens 2 Stunden lang bei 2ºC bis 8ºC gerührt wurde. Das Gemisch wurde zur Gewinnung des Pellets zentrifugiert (7.000 · g), das in 10 mM Tris, HCl bei einem pH-Wert von 8 gelöst wurde. Die Ionenstärke der Lösung wurde auf den äquivalenten Gehalt von 10 mM Tris, HCl (pH 8), das 15 mM Ammoniumsulfat enthielt, eingestellt.
Das Protein mit 69 kDa wurde auf eine Hydroxylapatitsäule gegeben, die tandemartig mit einer Q-Sepharose-Säule verbunden war. Das Protein mit 69 kDa wurde in dem Durchlauf gesammelt und aus den Säulen mit 10 mM Tris, HCl (pH 8), enthaltend 15 mM Ammoniumsulfat, ausgespült und mit dem Protein mit 69 kDa im Durchlauf zusammengebracht. Die vereinigten Proteine mit 69 kDa wurden mit 6 bis 10 Volumina von 10 mM Kaliumphosphat (pH 8) mit einem Gehalt an 0,15 M NaCl auf einer NMWL-Membran von 100 bis 300 kDa der Diafiltration unterworfen. Das Ultrafiltrat wurde aufgefangen und das Protein mit 69 kDa in dem Ultrafiltrat konzentriert.
Das Lösungsmittel des Proteins mit 69 kDa wurde gegen 10 mM Tris, HCl (pH 8) ausgetauscht, und dieses wurde an Q-Sepharose adsorbiert, die mit 10 mM Tris, HCl (pH 8)/5 mM Ammoniumsulfat gewaschen wurde. Das Protein mit 69 kDa wurde mit 50 mM Kaliumsulfat (pH 8) eluiert. Das Protein mit 69 kDa wurde mit 6 bis 10 Volumina an 10 mM Kaliumphosphat (pH 8) mit einem Gehalt an 0,15 M NaCl auf einer NMWL-Membran von 10 bis 30 kDa der Diafiltration unterworfen. Anschließend wurde das Protein mit 69 kDa durch ein Filter von ≤0,22 um steril filtriert. Diese sterile Charge wurde bei 2ºC bis 8ºC aufbewahrt und die Adsorption innerhalb von 3 Monaten durchgeführt.

Fimbrien-Agglutinogene:

Die Agglutinogene wurden aus der Zellpaste im Anschluss an die Abtrennung aus der Nährlösung gereinigt. Die Zellpaste wurde zu einer Zellfraktion mit 0,05 Volumen in einem Puffer mit einem Gehalt an 10 mM Kaliumphosphat, 150 mM NaCl und 4 M Harnstoff verdünnt und 30 Minuten lang vermischt. Das Zell-Lysat wurde durch Zentrifugieren (12.000 · g) geklärt; sodann konzentriert und gegen 10 mM Kaliumphosphat/150 mM NaCl/0,1% Triton X-100 unter Verwendung eines NMWL- Membranfilters von 100 bis 300 kDa der Diafiltration unterworfen.
Anschließend wurde das Konzentrat bei 80ºC 30 Minuten lang wärmebehandelt und sodann noch einmal durch Zentrifugieren (9.000 · g) geklärt. Es wurde PEG 8000 zu dem geklärten Überstand bis zu einer endgültigen Konzentration von 4,5% ± 0,2 0/0 hinzugegeben und sachte mindestens 30 Minuten lang gerührt. Der so erhaltene Niederschlag wurde durch Zentrifugieren (17.000 · g) gesammelt und das Pellet mit einem Puffer aus 10 mM Kaliumphosphat/150 mM NaCl zur Bereitstellung einer rohen Fimbrien-Agglutinogen-Lösung extrahiert. Die Fimbrien-Agglutinogene wurden durch eine Passage durch PEI-Silica gereinigt. Die rohe Lösung wurde im Hinblick auf das Kaliumphosphat unter Verwendung von Puffer mit 1 M Kaliumphosphat auf 100 mM eingestellt und der Passage durch die Säule mit PEI-Silica unterzogen.
Der Durchlauf aus den Säulen wurde konzentriert und gegen einen Puffer mit 10 mM Kaliumphosphat/150 mM NaCl unter Verwendung eines NMWL-Membranfilters von 100 bis 300 kDa der Diafiltration unterworfen. Diese sterile Charge wurde bei 2ºC bis 8ºC aufbewahrt und die Adsorption innerhalb von 3 Monaten durchgeführt. Das Fimbrien-Agglutinogen-Präparat enthielt Fimbrien-Agg 2 und Fimbrien-Agg 3 in einem Gewichtsverhältnis von etwa 1,5 zu etwa 2 : 1, wobei festzustellen war, dass es im Wesentlichen frei von Agg 1 war.

Beispiel 3:

In diesem Beispiel wird das Toxoidieren der gereinigten Antigene von Bordetella pertussis, PT und FHA beschrieben.
Das gemäß der Beschreibung in Beispiel 2 in reiner Form gewonnene PT wurde durch das Einstellen der Glutaraldehydkonzentration in der PT-Lösung auf 0,5% ± 0,1% und 4-stündiges Inkubieren bei 37ºC ± 3ºC toxoidiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von L-Aspartat bis auf 0,21 ± 0,02 M gestoppt. Das Gemisch wurde im Anschluss daran 1 ± 0,1 Stunden lang beim Raumtemperatur und anschließend 1 bis 7 Tage bei 2ºC bis 8ºC gehalten.
Die so erhaltene Mischung wurde gegen einen Puffer mit 10 mM Kaliumphosphat/ 0,15 mM NaCl/5% Glyzerin unter Verwendung eines NMWL-Membranfilters von 30 kDa der Diafiltration unterworfen und anschließend mittels einer Passage durch einen Membranfilter von ≤0,22 um sterilisiert. Diese sterile Charge wurde bei 2ºC bis 8ºC aufbewahrt und die Adsorption innerhalb von 3 Monaten durchgeführt.
Die gemäß der Beschreibung in Beispiel 2 in reiner Form gewonnene FHA-Fraktion wurde durch das Einstellen der L-Lysin- und Formaldehydkonzentration auf 47 ± 5 mM bzw. 0,24 ± 0,05% und 6-wöchiges Inkubieren bei 35ºC bis 38ºC toxoidiert. Die Mischung wurde dann gegen 10 mM Kaliumphosphat -0,5 mM NaCl unter Verwendung einer NMWL-Membranfiltus von 30 kDa der Diafiltration unterworfen und anschließend mittels einer Passage durch einen Membranfilter sterilisiert. Diese sterile Charge wurde bei 2ºC bis 8ºC aufbewahrt und die Adsorption innerhalb von 3 Monaten durchgeführt.

Beispiel 4:

In diesem Beispiel ist die Adsorption der gereinigten Antigene von Bordetella pertussis beschrieben.
Zur individuellen Adsorption von PT, FHA, Agg und dem [Protein mit] 69 kDa auf Aluminiumphosphat (Alaun) wurde eine Vorratslösung von Aluminiumphosphat mit einer Konzentration von 18,75 ± 1 mg/ml hergestellt. Es wurde ein geeignetes Gefäß vorbereitet und die einzelnen Antigene in aseptischer Weise in das Gefäß gebracht. Das 2-Phenoxyethanol wurde aseptisch in einer solchen Menge hinzugegeben, dass eine endgültige Konzentration von 0,6% ± 0,1% (Vol./Vol.) erzielt wurde; danach wurde bis zur Homogenität gerührt. Das passende Volumen an Aluminiumphosphat wurde aseptisch in das Gefäß zugegeben. Ebenso wurde ein passendes Volumen an sterilem destilliertem Wasser hinzugefügt, um die endgültige Konzentration auf 3 mg Aluminiumphosphat/ml zu bringen. Die Behälter wurden hermetisch verschlossen und gekennzeichnet, wonach bei Raumtemperatur 4 Tage lang gerührt wurde. Das Gefäß wurde sodann bis zur erwarteten endgültigen Formulierung aufbewahrt.

Beispiel 5:

In diesem Beispiel ist die Formulierung eines Komponentenimpfstoffes gegen Keuchhusten beschrieben, der mit Diphtherie- und Tetanus-Toxoiden kombiniert ist.
Die gemäß der Beschreibung in den vorstehenden Beispielen gewonnenen Antigene aus B, pertussis wurden zur Schaffung verschiedener Komponenten-Pertussi-(CP)- Impfstoffe mit Diphtherie- und Tetanus-Toxoiden formuliert.
Die Pertussiskomponenten wurden aus Bordetella pertussis produziert, wobei die Kultivierung in Submerskultur gemäß der detaillierten Beschreibung in den oben stehenden Beispielen 1 bis 4 erfolgte. Nach dem Abschluss des Wachstums wurden die Kulturnährlösung und die Bakterienzellen voneinander durch Zentrifugieren getrennt. Jedes Antigen wurde jeweils für sich gereinigt. Das Pertussis-Toxin (PT) und das filamentöse Hämagglutinin (FHA) wurde aus der Nährlösung durch aufeinander folgende Chromatographie über Perlit und Hydroxylapatit gereinigt. Das PT wurde mit Glutaraldehyd entgiftet, wobei jegliches verbleibende PT (annähernd 1 %), das in der FHA-Fraktion vorhanden war, mit Formaldehyd entgiftet wurde. Die Fimbrien-Agglutinogene (2 + 3) (AGG) wurden aus den Bakterienzellen gewonnen. Die Zellen wurden mit Harnstoff aufgeschlossen und wärmebehandelt, wonach die Fimbrien-Agglutinogene durch Ausfällen mit Polyethylenglykol und Chromatographieren über Polyethylenimin-Silica gereinigt wurden. Die Komponente des Proteins mit 69 kDa (Pertaktin) wurde aus dem Durchlauf, erhalten aus dem Schritt der Perlitchromatographie (Beispiel 2), mittels Ausfällen mit Ammoniumsulfat isoliert und durch aufeinander folgendes Chromatographieren über Hydroxylapatit und Q-Sepharose gereinigt. Sämtliche Komponenten wurden durch Filtration durch einen Membranfilter mit 0,22 um sterilisiert.
Das Diphtherie-Toxoid wurde aus Corynebacterium diphtheriae gewonnen, dessen Wachstum in einer Submerskultur mittels Standardverfahren erfolgte. Die Gewinnung des Diphtherie-Toxoids gestaltete sich in 5 Schritten, nämlich Aufrechterhaltung der Ansatzimpfkeime, Kultivierung von Corynebacterium diphtheriae, Abernten von Diphtherie-Toxin, Entgiftung des Diphtherie-Toxins und Konzentrierung des Diphtherie-Toxoids.

Herstellung des Diphtherie-Toxoids

(I) Impfkeime für den Ansatz

Der Stamm von Corynbacterium diphtheriae wurde als gefriergetrocknete Impfkeimcharge bereit gehalten. Die rekonstituierten Impfkeime wurden auf einer geneigten Löffler-Kulturvorrichtung 18 bis 24 Stunden bei 35ºC ± 2ºC dem Wachstum überlassen und anschließend in Kolben mit einem Diphtherie-Medium überführt. Im Anschluss daran wurde die Kultur auf Reinheit und Gehalt an Lf getestet. Die noch verbliebenen Impfkeime wurden zur Inokulation eines Fermenters verwendet.

(II) Wachstum von Corynebacterium diphtheriae

Die Kultur wurde bei 35ºC ± 2ºC inkubiert und in dem Fermenter gerührt. Zu der Kultur wurden vorherbestimmte Mengen an Lösungen von Eisen-II-sulfat, Calciumchlorid und Phosphat hinzugefügt. Die tatsächlichen Mengen jeder einzelnen Lösung (Phosphat, Eisen-II-sulfat, Calciumchlorid) wurden experimentell für jede Charge des Mediums bestimmt. Die Anteile wurden so gewählt, dass sie den höchsten Gehalt an Lf ergaben. Am Ende des Wachstumszyklus (30 bis 50 Stunden) wurden den Kulturen Proben zwecks Reinheit und Gehalt an Lf entnommen.
Der pH-Wert wurde mit Natriumbicarbonat eingestellt, wobei die Kultur mit 0,4 Toluol 1 Stunde lang unter Aufrechterhalten einer Temperatur von 35ºC ± 2ºC inaktiviert wurde. Im Anschluss daran wurde ein Sterilitätstest zur Bestätigung der Abwesenheit lebender Zellen von C. diphtheriae durchgeführt.

(III) Ernten des Diphtherie-Toxins

Die mit Toluol behandelten Kulturen aus einem oder mehreren Fermentern wurden in einem großen Tank miteinander vereinigt. Es wurden annähernd 0,12% Natriumbicarbonat, 0,25% Holzkohle und 23% Ammoniumsulfat hinzugegeben und der pH- Wert getestet.
Das Gemisch wurde etwa 30 Minuten lang gerührt. Dann wurde Diatomeenerde hinzugefügt und die Mischung in einen Tiefenfilter gepumpt. Das Filtrat wurde so fange in Umlauf gehalten, bis es klar war, anschließend gesammelt und Proben zum Testen des Gehalts an Lf entnommen. Zu dem Filtrat wurde zusätzlich noch Ammoniumsulfat hinzugefügt, um eine Konzentration von 40% zu erreichen. Es wurde auch noch Diatomeenerde hinzugegeben. Dieses Gemisch wurde 3 bis 4 Tagelang bei 2ºC bis 8ºC gehalten, um so dem Niederschlag Gelegenheit zu geben, sich abzusetzen. Das ausgefällte Toxin wurde gesammelt und in 0,9%iger Salzlösung gelöst. Die Diatomeenerde wurde durch Filtrieren entfernt und das Toxin zur Entfernung des Ammoniumsulfats gegen 0,9%ige Salzlösung dialysiert. Das dialysierte Toxin wurde vereinigt und Proben zum Testen des Gehalts an Lf und der Reinheit entnommen.

(IV) Entgiftung des Diphtherie-Toxins

Die Entgiftung findet unmittelbar im Anschluss an die Dialyse statt. Das Toxin wird zur Entgiftung in der Weise verdünnt, dass die endgültige Lösung folgende Bestandteile enthielt:
a) Diphtherie-Toxin mit 1000 ± 10% Lf/ml
b) 0,5% Natriumbicarbonat
c) 0,5% Formalin
d) 0,9% (Gew./Vol.) L-Lysin·Monohydrochlorid.
Die Lösung wurde mit Salzlösung auf das (gewünschte) Volumen gebracht und der pH-Wert auf 7,6 ± 0,1 eingestellt.
Das Toxoid wurde durch Filtereinlagen aus Zellulose und Diatomeenerde und/oder einen Membranvorfilter sowie einen Membranfilter mit 0,2 um in ein Sammelgefäß hinein filtriert und 5 bis 7 Wochen lang bei 34ºC inkubiert. Zur Überprüfung der Toxizität wurde eine Probe gezogen.

(V) Konzentrierung des gereinigten Toxoids

Die Toxoide wurden miteinander vereinigt und anschließend durch Ultrafiltration konzentriert, wonach sie in einem passenden Behälter gesammelt wurden. Es wurden Proben zum Testen des Gehalts an Lf und der Reinheit entnommen. Das Konservierungsmittel (2-Phenoxyethanol) wurde zum Erzielen einer endgültigen Konzentration von 0,375% hinzugegeben und der pH-Wert auf 6,6 bis 7,6 eingestellt.
Das Toxoid wurde mittels Filtrieren durch einen Vorfilter und einen Membranfilter von 0,2 um (oder einer gleichwertigen Filtervorrichtung) hindurch sterilisiert und aufgesammelt. Das sterile Toxoid wurde anschließend anhand von Proben auf eine Irreversibilität des Gehalts an Toxoid Lf, Konservierungsmittel, Reinheit (Stickstoffgehalt), Sterilität und Toxizität hin überprüft. Das sterile, konzentrierte Toxoid wurde bis zur fertigen Formulierung bei 2ºC bis 8ºC gelagert.

Herstellung des Tetanus-Toxoids

Das Tetanus-Toxoid (T) wurde aus Clostridium tetani, das durch eine Submerskultur vermehrt wurde, gewonnen.
Die Gewinnung des Tetanus-Toxoids gestaltet sich in 5 Schritten, nämlich Bereithalten der Ansatzimpfkeime, Kultivierung von Clostridium tetani, Ernten von Tetanus- Toxin, Entgiftung des Tetanus-Toxins und Reinigung des Tetanus-Toxoids.

(I) Impfkeime für den Ansatz

Der Stamm von Clostridium tetani, der zur Gewinnung des Tetanus-Toxins zur Umwandlung in das Tetanus-Toxoid verwendet wurde, wurde in gefriergetrockneter Form als eine Charge von Impfkeimen bereit gehalten. Die Impfkeime wurden in ein Medium aus Thioglykolat inokuliert, wobei sie annähernd 24 Stunden lang bei 35ºC ± 2ºC dem Wachstum überlassen wurden. Zum Testen der Reinheit der Kultur wurde eine Probe genommen.

(II) Wachstum von Clostridium tetani

Das Tetanusmedium würde in einen Fermenter hinein dispensiert, wärmebehandelt und anschließend abgekühlt. Im Anschluss daran wurde der Fermenter beimpft, wobei die Kultur 4 bis 9 Tage lang bei 34ºC ± 2ºC dem Wachstum überlassen wurde. Zum Testen der Reinheit der Kultur und des Gehalts an Lf wurde eine Probe genommen.

(III) Ernten von Tetanus-Toxin

Das Toxin wurde durch Filtration durch Einlagen aus Zellulose und Diatomeenerde abgetrennt und das geklärte Toxin dann unter Einsatz von Membranfiltern filtersterilisiert. Es wurden zum Testen der Sterilität und des Gehalts an Lf Proben genommen. Das Toxin wurde durch Ultrafiltration unter Einsatz einer Porengröße von 30.000 Dalton konzentriert.

(IV) Entgiften des Tetanus-Toxins

Vor der Entgiftung wurden zum Testen des Gehalts an Lf Proben des Toxins genommen. Das konzentrierte Toxin (475 bis 525 Lf/ml) wurde durch den Zusatz von 0,5 %igem (Gew./Vol.) Natriumbicarbonat, 0,3%igem (Vol./Vol.) Formalin und 0,9 %igem (Gew./Vol.) L-Lysin. Monohydrochlorid entgiftet, wonach mit Salzlösung auf das (gewünschte) Volumen ergänzt wurde. Der pH-Wert wurde auf 7,5 ± 0,1 eingestellt, und die Mischung bei 37ºC 20 bis 30 Tage lang inkubiert. Zur Überprüfung der Sterilität und Toxizität wurden Proben gezogen.

(V) Reinigung des Toxoids

Das konzentrierte Toxoid wurde durch Vorfilter hindurch, wonach Membranfilter von 0,2 um folgten, sterilisiert. Zur Überprüfung der Sterilität und des Gehalts an Lf wurden Proben gezogen.
Die optimale Konzentration an Ammoniumsulfat stützte sich auf die Fraktionierungs- "S"-kurve, die anhand der Toxoidproben ermittelt wurde. Die erste Konzentration wurde zu dem Toxoid (in einer Verdünnung von 1.900-2.100 Lf/ml) hinzugefügt. Das Gemisch wurde wenigstens 1 Stunde lang bei 20ºC bis 25ºC gehalten und der Überstand gesammelt, wobei der Niederschlag, der die Fraktion mit hohem Molekulargewicht enthielt, verworfen wurde.
Eine zweite Konzentration von Ammoniumsulfat wurde zu dem Überstand für die zweite Fraktionierung hinzugefügt, um die Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen. Das Gemisch wurde mindestens 2 Stunden lang bei 20ºC bis 25ºC gehalten und konnte anschließend für maximal 3 Tage bei 2ºC bis 80ºC gehalten werden. Der Niederschlag, der das gereinigte Toxoid darstellt, wurde durch Zentrifugieren und Filtrieren gewonnen.
Das Ammoniumsulfat wurde unter Verwendung von Amicon-Ultrafiltrationsmembranen (oder gleichwertigen Membranen) mit PBS solange durch Diafiltration aus dem gereinigten Toxoid entfernt, bis in der Toxoidlösung kein Ammoniumsulfat mehr nachgewiesen werden konnte. Der pH-Wert wurde auf 6,6 bis 7,6 eingestellt, wobei das 2-Phenoxyethanol zur Erzielung einer Endkonzentration von 0,375% hinzugefügt wurde. Das Toxoid wurde durch Membranfiltration sterilisiert, wonach zum Testen (Irreversibilität des Toxoids, Gehalt an Lf, pH-Wert, Gehalt an Konservierungsmittel, Reinheit, Sterilität und Toxizität) Proben gezogen wurden.
Eine Formulierung eines Komponentenimpfstoffes gegen Keuchhusten, der mit Diphtherie- und Tetanustoxoiden kombiniert war, würde mit CP10/5/5/3DT bezeichnet.
Jede Humandosis von 0,5 ml CP10/5/5/3DT wurde mit einem jeweiligen Gehalt wie folgt formuliert:
10 ug Pertussis-Toxoid (PT)
5 ug filamentöses Hämagglutinin (FHA)
5 ug Fimbrien-Agglutinogene 2 und 3 (FIMB)
3 ug Protein aus der äußeren Membran mit 69 kDa
15 Lf Diphtherie-Toxoid
5 Lf Tetanus-Toxoid
1,5 mg Aluminiumphosphat
0,5% 2-Phenoxyethanol als Konservierungsmittel
Eine weitere Formulierung eines Komponentenimpfstoffes gegen Keuchhusten, der mit Diphtherie- und Tetanustoxoiden kombiniert war, wurde mit CP10/5/5DT bezeichnet. Jede Humandosis von 0,5 ml CP10/5/5DT wurde mit einem jeweiligen Gehalt wie folgt formuliert:
10 ug Pertussis-Toxoid (PT)
5 ug filamentöses Hämagglutinin (FHA)
5 ug Fimbrien-Agglutinogene 2 und 3 (FIMB)
15 Lf Diphtherie-Toxoid
5 Lf Tetanus-Toxoid
1,5 mg Aluminiumphosphat
0,6% 2-Phenoxyethanol als Konservierungsmittel
Eine weitere Formulierung eines Komponentenimpfstoffes gegen Keuchhusten, der mit Diphtherie- und Tetanustoxoiden kombiniert war, wurde mit CP20/20/5/3DT bezeichnet. Jede Humandosis von 0,5 ml CP20/20/5/3DT wurde mit einem jeweiligen Gehalt wie folgt formuliert:
20 ug Pertussis-Toxoid (PT)
20 ug filamentöses Hämagglutinin (FHA)
5 ug Fimbrien-Agglutinogene 2 und 3 (FIMB)
3 ug Protein aus der äußeren Membran mit 69 kDa
15 Lf Diphtherie-Toxoid
5 Lf Tetanus-Toxoid
1,5 mg Aluminiumphosphat
0,15% 2-Phenoxyethanol als Konservierungsmittel
Eine weitere Formulierung eines Komponentenimpfstoffes gegen Keuchhusten, der mit Diphtherie- und Tetanustoxoiden kombiniert war, wurde mit CP20/10/10/6DT bezeichnet. Jede Humandosis von 0,5 ml CP20/10/10/6DT wurde mit einem jeweiligen Gehalt wie folgt formuliert:
20 ug Pertussis-Toxoid (PT)
10 ug filamentöses Hämagglutinin (FHA)
10 ug Fimbrien-Agglutinogene 2 und 3 (FIMB)
6 ug Protein aus der äußeren Membran mit 69 kDa
15 Lf Diphtherie-Toxoid
5 Lf Tetanus-Toxoid
1,15 mg Aluminiumphosphat
0,6% 2-Phenoxyethanol als Konservierungsmittel

Beispiel 6:

In diesem Beispiel wird die klinische Bewertung der nichtzellulären Komponentenimpfstoffe gegen Keuchhusten beschrieben, wie sie in Einklang mit der Erfindung produziert werden.

(a) Studien bei Erwachsenen

Die Studien bei Erwachsenen und Kindern im Alter von 16 bis 20 Monaten zeigten, dass die Mehrfachkomponentenimpfstoffe mit einem Gehalt an Fimbrien-Agglutinogenen sowohl sicher und als auch immunogen sind (Tabelle 2).
Eine klinische Studie in der Phase I wurde bei Kindern im Alter von 17 und 18 Monaten in Calgary, Alberta mit dem 5-Komponentenimpfstoff (CP10/5/3DT) gegen Keuchhusten durchgeführt und über die negative Reaktion berichtet. 33 Kinder erhielten den Impfstoff, wobei zusätzlich noch 35 den gleichen Impfstoff, jedoch ohne die Proteinkomponente mit 69 kDa erhielten.
Die lokalen Reaktionen waren selten. Systemische, negative Reaktionen, die in erster Linie aus Irritationen bestanden, waren bei annähernd der Hälfte der Studienteilnehmer zu verzeichnen, unabhängig davon, welcher Impfstoff appliziert war. Anhand eines enzymatischen Immunoassays wurde ein jeweils signifikanter Anstieg der Antikörper im Hinblick auf anti-PT-, anti-FHA-, anti-Fimbrien-Agglutinogen- sowie anti-69 kDa-IgG-Antikörper und anti-PT-Antikörper beim CHO-Zellneutralisationstest gemessen. Keine Unterschiede bei der Antikörperantwort wurden bei den Kindern festgestellt, welche den 4-Komponentenimpfstoff (CP10/5/5DT) oder 5-Komponentenimpfstoff (CP10/5/5/3DT) erhalten hatten, jedoch mit Ausnahme bezüglich des anti-69 kDa-Antikörpers. Die Kinder, welche den 5-Komponentenimpfstoff mit einem Gehalt an dem Protein mit 69 kDa erhalten hatten, zeigten nach der Immunisierung einen signifikant höheren Titer des anti-69 kDa-Antikörpers.
Eine Dosis-Antwort-Studie mit dem 4-Komponentenimpfstoff wurde in Winnipeg, Manitoba, Kanada durchgeführt. Dabei wurden folgende zwei Formulierungen an Komponentenimpfstoffen verwendet: CP10/5/5/3DT und CP20/10/10/6DT. Ein DPT-Impfstoff mit ganzen Zellen wurde als Kontrolle noch mit eingeschlossen.
Diese Studie war eine Doppelblindstudie bei 91 Kindern im Alter von 17 bis 18 Monaten zum Zeitpunkt der Pertussis-Dosis für den Booster-Effekt. Sowohl CP10/5/5/3DT als auch CP20/10/10/6DT wurden bei diesen Kindern gut toleriert. Bei der Anzahl von Kindern, die irgendwelche lokalen oder systemischen Reaktionen nach der Applikation eines dieser Komponenten-Impfstoffe hatten, wurden keine Unterschiede demonstriert. Im Gegensatz dazu wiesen signifikant mehr Kinder, welchen den Impfstoff mit ganzen Zellen erhalten hatten, lokale und systemische Reaktionen auf als solche, welche den Komponentenimpfstoff CP20/10/10/6DT erhalten hatten.

Studien bei Kindern:

Phase II:

Es wurde eine Studie in Calgary, Alberta und Britisch Kolumbien, Kanada unter Einsatz des Impfstoffes CP10/5/5/3DT durchgeführt. 432 Kinder erhielten in dieser Studie den Komponentenimpfstoff gegen Keuchhusten oder den Kontroll-Impfstoff DPT mit ganzen Zellen im Alter von 2, 4 und 6 Monaten. Der Impfstoff CP10/5/5/3DT wurde von diesen Kindern gut toleriert. Die lokalen Reaktionen waren nach jeder Dosis mit dem Komponentenimpfstoff im Vergleich zum Impfstoff mit ganzen Zellen weniger häufig.
Nach der Impfung mit dem Komponentenimpfstoff gegen Keuchhusten wurde eine signifikante Antikörperantwort auf alle Antigene demonstriert. Die Empfänger des Impfstoffs mit ganzen Zellen zeigten eine heftige Antikörperantwort auf die Fimbrien- Agglutinogene D und T. Nach 7 Monaten wiesen 82% bis 89% der Empfänger des Komponentenimpfstoffs und 92% der Empfänger des Impfstoffs mit ganzen Zellen eine 4-fache Steigerung oder sogar einen noch größeren Anstieg des Antikörpertiters gegenüber Fimbrien-Agglutinogenen auf. Im Gegensatz dazu betrug die Antikörperantwort gegenüber FHA 75% bis 78% im Hinblick auf die Empfänger der Komponentenimpfstoffe im Vergleich zu 31% bei dem Impfstoff mit ganzen Zellen. Es war ein 4-faches Ansteigen des anti-69 kDa-Antikörpers bei 90 bis 93% der Empfänger der Komponentenimpfstoffe und 75% der Empfänger des Impfstoffs mit ganzen Zellen zu beobachten. Ein 4-facher Anstieg des Antikörpers gegen PT mittels eines Enzymimmunoassays war bei 40% bis 49% im Hinblick auf die Komponentenimpfstoffe und 32% der Impfstoffe mit ganzen Zellen zu verzeichnen; es stellte sich ein 4-faches Ansteigen der PT-Antikörper durch die CHO-Neutralisation bei 55% bis 69 der Komponentenimpfstoffe und 6% der Impfstoffe mit ganzen Zellen heraus (Tabelle 2).

Phase IIB:

Die Impfstoffe CP20/20/5/3DT und CP10/10/5/3DT wurden in einer randomisierten Blindstudie an 100 Kindern im Alter von 2, 4 und 6 Monaten gegen eine D&sub1;&sub5;PT-Kontrolle mit einem niedrigeren Diphtheriegehalt von 15 Lf, verglichen mit einer Formulierung mit 25 Lf, bewertet. Es wurden keine Unterschiede bei den negativen Reaktionsraten zwischen den beiden Komponenten-Formulierungen festgestellt; beide riefen in signifikanter Weise weniger Reaktionen hervor als die Kontrolle mit ganzen Zellen. Bei den Empfängern des Impfstoffs CP20/20/5/3DT mit einem erhöhten Gehalt an Antigenen wurden anhand eines Enzymimmunoassays und der CHO-Neutralisation höhere Antikörpertiter gegenüber PT und FHA erzielt. Nach 7 Monaten betrug der geometrische anti-FNA-Titer 95,0 bei den. Empfängern von CP20/20/5/3DT, 45,2 bei den Empfängern von CP10/5/5/3DT und lediglich 8, 9 bei den Empfängern von D&sub1;&sub5;PT. Die anti-PT-Tifer betrugen 133,3, 58,4 und 10,4 auf Basis des Immunoassays bzw. 82,4, 32,7 und 4,0 auf Basis der CHO-Neutralisation (Tabelle 2).
Diese Studie zeigte auf, dass der Komponentenimpfstoff gegen Keuchhusten in Kombination mit adsorbierten Diphtherie- und Tetanus-Toxoiden mit einem erhöhten Gehalt an Antigenen, bei Kindern sicher und immunogen war; ferner, dass der höhere Gehalt an Antigenen die Immunantwort gegenüber den zubereiteten Antigenen (PT und FHA) ohne das Ansteigen der Reaktionsbereitschaft steigerte.

NIAID, Phase II, US - Vergleichsversuch:

In den Vereinigten Staaten wurde eine Studie in der Phase II unter der Schirmherrschaft des National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) im Vorgriff zu einem Versuch zur Wirksamkeit von nichtzellulären Impfstoffen gegen Keuchhusten in großem Maßstab durchgeführt. Es wurde ein Einkomponentenimpfstoff gegen Keuchhusten gemäß der Erfindung in Kombination mit adsorbierten Diphtherie- und Tetanus-Toxoiden (CP10/5/5/3DT) in jenen Versuch zusammen mit 12 anderen nicht- zellulären Impfstoffen und 2 Impfstoffen mit ganzen Zellen einbezogen. Es wurde über Ergebnisse der Sicherheit bei 137 Kindern berichtet, die im Alter von 2, 4 und 6 Monaten mit dem Komponentenimpfstoff CP10/5/5/3DT immunisiert worden waren.
Wie schon aus früheren Studien ersichtlich ist, wurde festgestellt, dass der Komponentenimpfstoff sicher ist, eine niedrige Reaktionsbereitschaft aufweist und von den Impflingen gut vertragen wird.
Nach 7 Monaten waren sämtliche Titer des anti-PT-Antikörpers, anti-FHA-Antikörpers, anti-69 kDa-Antikörpers und der anti-Fimbrien-Agglutinogen-Antikörper im Vergleich zu den Titern, die sich nach Applikation der Impfstoffe mit ganzen Zellen ergaben, höher oder gleichwertig (Lit. 71 und Tabelle 2). Es wurde eine Doppelblindstudie durchgeführt, wonach die Kinder randomisiert so eingeteilt wurden, dass sie entweder die Formulierung des Impfstoffes CP20/20/5/3DT oder CP10/5/5/3DT erhielten. Insgesamt 2.050 Kinder waren in den Vereinigten Staaten und Kanada eingetragen; mit 1.961 Kindern wurde die Studie abgeschlossen. Beide Formulierungen des Impfstoffes waren sicher, wiesen eine geringe Reaktionsbereitschaft auf und waren bei diesen Kindern immunogen. An einer Untergruppe von 292 Kindern wurde die Immunogenizität bestimmt. Gegenüber sämtlichen in dem Impfstoff enthaltene Antigenen wurde ein Anstieg der Antikörper durch beide Impfstoff-Formulierungen hervorgerufen. Es provozierte die Formulierung CP20/20/5/3DT höhere Antikörpertiter gegenüber FHA, aber nicht PT. Die Formulierung CP10/5/5/3DT rief höhere Titer gegenüber Fimbrien sowie höhere Agglutinogentiter hervor.
Des weiteren wurde in Frankreich eine Studie zur Sicherheit und Immunogenizität durchgeführt. Der Aufbau der Studie war mit jenem der obenstehend beschriebenen nordamerikanischen Studie vergleichbar, jedoch mit der Ausnahme, dass die Impfstoffe im Alter von 2, 3 und 4 Monaten verabreicht wurden. Die lokalen und systemischen Reaktionen waren im allgemeinen geringfügig. Der Impfstoff war von den französischen Teilnehmern der Studie insgesamt gut unter Anwendung dieser Applikationsweise akzeptiert worden.

Versuch zur placebokontrollierten Wirksamkeit von 2 nichtzellulären Impfstoffen gegen Keuchhusten und eines Impfstoffes mit ganzen Zellen bei 10.000 Kindern

Im Gefolge der Ergebnisse aus der Phase II des NIAID-Vergleichsversuches in den Vereinigten Staaten wurden ein nichtzellulärer 2-Komponenten- und ein 5-Komponentenimpfstoff für einen multizentrischen kontrollierten, doppelt randomisierten und placebokontrollierten Versuch zur Wirksamkeit ausgewählt. Der klinische Versuch wurde in Schweden durchgeführt, wo ein starkes Auftreten von Keuchhusten zu verzeichnen ist. Der 2-Komponentenimpfstoff enthielt ein Glyceraldehyd- und Formalininaktiviertes PT (25 ug), mit Formalin behandeltes FHA (25 ug) und Diphtherie- Toxoid (17 Lf) sowie Tetanus-Toxoid (10 Lf). Der 5-Komponenten-Keuchhustenimpfstoff lag in Form von CP10/5/5/3DT vor. Für den Versuch wurden 10.000 Kinder, die annähernd die Hälfte der Kinder dieser Altersgruppe in Schweden repräsentieren, an 14 geographisch definierten Untersuchungsarten unter Anwendung des Geburtsregisters rekrutiert.
Die im Januar und Februar 1992 geborenen Kinder wurden in einem dreigliedrigen Versuch randomisiert. Nach der elterlichen Zustimmung erhielten zwei Drittel der Kinder eines der zwei nichtzellulären Diphtherie-Tetanus-Pertussis-Präparate im Alter von 2, 4 und 6 Monaten. Die Kontrollgruppe erhielt lediglich DT. Im Mai 1992 wurde ein in den Vereinigten Staaten zugelassener, im Handel erhältlicher DTP-Impfstoff mit ganzen Zellen eingeführt, wobei die zwischen März und Dezember 1992 geborenen Kinder in einem viergliedrigen Versuch randomisiert wurden. Nach der elterlichen Zustimmung erhielten drei Viertel der Kinder eines von drei DPT-Präparaten im Alter von 2, 4 und 6 Monaten. Die Kontrollgruppe erhielt lediglich DT.
Jeder Impfstoff wurde an etwa 2.500 Kinder verabreicht. Die Impfstoffe wurden in drei Dosen verabreicht. Die erste Dosis wurde im Alter von 2 Monaten und nicht später als im Alter von 3 Monaten appliziert. Die darauf folgenden Dosen wurden im Abstand von 8 Wochen gegeben. Die Impfstoffe wurden durch intramuskuläre Injektion appliziert.
Die Kinder samt den dazugehören Haushalten wurden 30 Monate lang beobachtet. Im Falle des Verdachts von Keuchhusten wurden klinische Daten erfasst und danach getrachtet, die Laborüberprüfung anhand von nasal aspirierten Sekreten, um eine Bakterienkultur anzulegen und mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eine Diagnose zu stellen, vorzunehmen. Für die serologische Diagnose wurden Blutproben akut Erkrankter und Genesender gesammelt.
In der Zeit vor dieser Studie war das Ausmaß des Schutzes, das durch die Komponentenimpfstoffe gegen Keuchhusten gemäß der vorliegenden Erfindung den Bevölkerungskreisen mit einem Risiko (insbesondere Neugeborenen) beigesteuert wurde, nicht bekannt. Insbesondere war der Beitrag verschiedener Bordetella-Komponenten zur Wirksamkeit der Impfstoffe und deren Vorhandensein in Pertussisimpfstoffen in ausgewählten relativen Mengen nicht bekannt.
Das Hauptziel des Versuchs war die Abschätzung der Fähigkeit der nichtzellulären Impfstoffe gegen Keuchhusten und des Impfstoffes mit ganzen Zellen, einen Schutz gegen einen typischen Keuchhusten im Vergleich zu einem Placebo zu bewirken.
In zweiter Linie bestand ein Endziel darin, die Wirksamkeit des Impfstoffes gegen eine bestätigte Pertussis-Infektion unterschiedlichen Schweregrads zu erforschen.
Die Wirksamkeit des Impfstoffs wird als die prozentuale Verminderung der Ansteckungswarscheinlichkeit für Keuchhusten unter den Impfstoffempfängern im Verhältnis zu nicht geimpften Kindern definiert.
Das relative Keuchhustenrisiko in zwei Impfgruppen wird als das Verhältnis der Erkrankungswahrscheinlichkeit in den zwei Gruppen ausgedrückt.
Die Ansteckungswahrscheinlichkeit für Keuchhusten, auch Erkrankungsrate genannt, lässt sich auf verschiedene Art und Weise abschätzen. Bei der Berechnung des Probenumfangs wird die Ansteckungswahrscheinlichkeit für Keuchhusten in einer vorgegebenen Studiengruppe anhand des Quotienten zwischen der Anzahl der Kinder mit Keuchhusten und den Kindern berechnet, welche nach Beendigung der Studie in dem Kollektiv der Gruppe verblieben waren.
Die Wirksamkeit des Komponentenimpfstoffes CP10/5/5/3DT bei dieser Studie zur Verhütung von typischem Keuchhusten ist in der Tabelle 4 aufgezeigt; sie betrug etwa 85%. In dem gleichen Versuch war ein nichtzellulärer 2-Komponentenimpfstoff gegen Keuchhusten mit einem Gehalt an lediglich PT und FHA etwa zu 58% wirksam, und der Impfstoff mit ganzen Zellen war etwa zu 48% wirksam. Das Impfstoffpräparat CP10/5/5/3DT war bei der Verhütung eines milden Keuchhustens bei einer geschätzten Wirksamkeit von etwa 77% ebenfalls effizient.
Die Impfstoffpräparate, die gemäß der Erfindung hergestellt wurden, sind sicher, rufen keine Reaktionen hervor, sind immunogen und bieten Menschen einen Schutz. Tabelle 1 Nichtzelluläre Pertussis-Impfstoffe
a mit Wasserstoffperoxid inaktiviert
b Massachusetts Public Health Laboratories
c TNM, mit Tetranitromethan inaktiviert
d GI, mit Glutaraldehyd inaktiviert
e FI, mit Formalin inaktiviert
f Centre for Applied Microbiology and Research Tabelle 2 Antworten der IgG-Antikörper auf Keuchhusten-Antigen und Diphtherie- und Tetanus-Toxoide bei Erwachsenen und jungen Kindern nach der Immunisierung mit Placebo oder nichtzellulären Pertussis-(AP), Diphtherie-Tetanus-Pertussis-(DPT) oder nichtzellulären Mehrfachkomponenten DTP-(ADTP)-Toxoiden.
Die Werte sind in Form des geometrischen Durchschnitts mit den Vertrauensgrenzen zu 95% ausgedrückt. Im Hinblick auf das Pertussis-Toxoid, das filamentöse Hämagglutinin, die Agglutinogene, das Pertaktin und die Diphtherie- und Tetanus-Toxoide sind die Antikörper-Titer in Form der ELISA-Einheiten pro nL ausgedrückt. In Bezug auf den CHO-Zell-Neutralisierungsassay geben die Werte die reziproken Daten der höchsten Verdünnung, die 80%ige Neutralisierung zeigt, an. Tabelle 3 Serologische Ergebnisse von nichtzellulären Pertussis-Impfstoffen bei Kindern (im Alter von 2, 4 und 6 Monaten)
CLI: Connaught Laboratories Incorporated, Swiftwater, Pennsylvania
CLL: Connaught Laboratories Limited, Willowdale, Ontario
Mass.: Massachusetts Public Laborstories
Lederle: Lederle Laborstories TABELLE 4 - Wirksamkeit der nichtzellulären Impfstoffe gegen Keuchhusten
A: Falldefinition: 21 Tage spastischer Husten und positive Kultur
B: Falldefinition: mindestens 1 Tag leichter Keuchhusten
Anmerkung 1: Vertrauensgrenzen
Anmerkung 2: Impfstoff gegen Keuchhusten mit ganzen Zellen

LITERATURSTELLEN

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4. Addiss, D. G., Davis, LP., Meade, BD., Burstyn, D. G. Meissner; M., Zastrow, J. A., Berg, J. L., Drinka, P., and Phillips, R. (1991). A pertussis outbreak in a Wisconsin nursing home. J. Infect Dis. 164: 704-710.
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Claims

1. Verwendung von einer gereinigten Form von Pertussis-Toxoid, filamentösem Hämagglutinin, Pertaktin und Fimbrien-Agglutinogenen von B. pertussis bei der Herstellung von einem Kombinationsimpfstoffpräparat gegen eine durch B. pertussis verursachte Erkrankung zur Verabreichung an eine Humanpopulation, die ein Risiko für eine durch B. pertussis verursachte Erkrankung aufweist, um Schutz gegen eine durch B. pertussis verursachte Erkrankung zu verleihen, worin jede Human-Einzeldosis des Impfstoffpräparats Tetanus-Toxoid, Diphtherie-Toxoid und die folgenden Pertussis-Antigene enthält, nämlich 5 bis 30 ug Stickstoff von dem Pertussis-Toxoid, 5 bis 30 ug Stickstoff von dem filamentösen Hämagglutinin, 3 bis 15 ug Stickstoff von Pertaktin und 1 bis 10 ug Stickstoff von den Fimbrien-Agglutinogenen und worin das Impfstoffpräparat den Schutz gegen eine durch B. pertussis verursachte Erkrankung wenigstens 70% der Mitglieder der Risikopopulation verleiht, was durch einen klinischen Wirksamkeitsversuch bestimmt werden kann, wobei die Fimbrien-Agglutinogene die Fimbrien-Agglutinogene 2 und 3 umfassen.

2. Verwendung gemäß Anspruch 1, worin das Impfstoffpräparat entweder

(a) 10 ug Stickstoff von Pertussis-Toxoid, 5 ug Stickstoff von filamentösem Hämagglutinin, 5 ug Stickstoff von Agglutinogenen und 3 ug Stickstoff von Pertaktin in einer Human-Einzeldosis; oder

(b) 20 ug Stickstoff von Pertussis-Toxoid, 20 ug Stickstoff von filamentösem Hämagglutinin, 5 ug Stickstoff von Agglutinogenen und 3 ug Stickstoff von Pertaktin in einer Human-Einzeldosis enthält.

3. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Ausmaß des Schutzes entweder:

(a) wenigstens 80% für einen Keuchhusten-Fall mit spastischem Husten für eine Dauer von wenigstens 21 Tagen und einer bestätigten bakteriellen Infektion; oder

(b) wenigstens 70% für einen schwachen Keuchhusten-Fall mit Husten für eine Dauer von wenigstens 1 Tag beträgt.

4. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Agglutinogene Fimbrien-Agglutinogen 2 (Agg 2) und Fimbrien-Agglutinogen 3 (Agg 3) im Wesentlichen frei von Agglutinogen 1 umfassen.

5. Verwendung gemäß Anspruch 4, worin das Gewichtsverhältnis von Agg 2 zu Agg 3 von 1,5 : 1 bis 2 : 1 beträgt.

6. Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Impfstoffpräparat das Tetanus-Toxoid und das Diphtherie-Toxoid in Mengen von 5 Lfs bzw. 15 Lfs enthält.

7. Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Impfstoffpräparat ein Adjuvans enthält.