DE69622555T2

DE69622555T2 - Azelluläre pertussis-impfstoffe und verfahren zu deren herstellung

Info

Publication number: DE69622555T2
Application number: DE69622555T
Authority: DE
Inventors: Luis Barreto; E. Fahim; Andrew Herbert; E. Jackson; H. Klein; U. Tan; John Thipphawong; R. Vose
Original assignee: Aventis Pasteur Ltd
Current assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Priority date: 1995-05-04
Filing date: 1996-05-02
Publication date: 2003-03-27
Anticipated expiration: 2016-05-03
Also published as: EP0826001A1; FR16C0015I2; DE69625191D1; EP0824358B1; DK0824358T3; PT826001E; NL300804I2; PT824358E; WO1996034883A1; FR16C0015I1; EP1405643A1; LU93036I2; US20010009666A1; DE69625191T2; ES2180758T3; AU5494196A; CA2220048A1; AU710538B2; EP0826001B1; EP0824358A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft nichtzelluläre Pertussis-Impfstoffe, deren Bestandteile und deren Herstellung.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Der Keuchhusten oder die Pertussis stellt eine ernsthafte, höchst ansteckende Infektion der oberen Atemwege dar, die durch Bordetella pertussis verursacht wird. Bei der Weltgesundheitsorganisation (WHO) wird geschätzt, dass es 60 Millionen Fälle von Keuchhusten pro Jahr und 0,5 bis 1 Million damit in Zusammenhang stehender Todesfälle (Lit. 1) gibt. In dieser Beschreibung wird auf verschiedene Literaturstellen/Referenzen in Klammern Bezug genommen, um den Stand der Technik, auf den sich die Erfindung bezieht, in umfassenderer Weise zu beschreiben. Am Ende der Patentschrift findet sich die vollständige bibliografische Information für jedes Literaturzitat, wobei sich unmittelbar danach die Ansprüche anschließen. Die jeweiligen Offenbarungen dieser Literaturstellen werden auf diese Weise durch die Bezugnahme darauf in die vorliegende Offenbarung eingeschlossen. In den nicht durchgeimpften Bevölkerungskreisen beträgt die Höhe der Rate des Auftretens von Keuchhusten 80%, wie an Kindern im Alter von weniger als 5 Jahren beobachtet wurde (Lit. 2). Obschon im allgemeinen der Keuchhusten als Kinderkrankheit betrachtet wird, gibt es auch bei Heranwachsenden und Erwachsenen zunehmende Anzeichen für klinische und asymptomatische Erkrankungen (Lit. 3, 4 und 5).
Die Einführung von Impfstoffen aus ganzen Zellen in den Jahren ab 1940, die sich aus chemisch und durch Hitze inaktivierten Organismen von B. pertussis zusammensetzten, war für einen drastischen Rückgang des Auftretens von Keuchhusten verantwortlich, der durch Bordetella pertussis verursacht wird. Die Effizienzraten für die Impfstoffe aus ganzen Zellen wurden auf bis zu 95% geschätzt, je nach der Definition der Krankheitsfälle (Lit. 6). Während die Infektion mit B. pertussis eine lebenslange Immunität verleiht, gibt es wachsende Anzeichen dafür, dass der Schutz nach der Keuchhustenimpfung mit den Impfstoffen aus ganzen Zellen nachlässt (Lit. 3). In verschiedenen Berichten wird ein Zusammenhang zwischen der Impfung mit ganzen Zellen, des Auftretens von Reaktionen und schwer wiegenden Nebenwirkungen berichtet, was zu einem Rückgang der Impfbereitschaft und in der Folge zu erneuten Epidemien führte (Lit. 7). Erst vor kurzem wurden Impfstoffe mit definierten Komponenten gegen Keuchhusten entwickelt.

Antigene für definierte Impfstoffe gegen Keuchhusten:

Es wurden verschiedene nichtzelluläre Impfstoffe gegen Keuchhusten entwickelt, welche Antigene gegen Bordetella pertussis, Pertussis-Toxin (PT), filamentöses Hämagglutinin (FHA), das Protein mit 69 kDa aus der äußeren Membran (Pertaktin) und Fimbrien-Agglutinogene mit einschließen (siehe unten stehende Tabelle 1. Die Tabellen erscheinen am Ende der Beschreibung).

Pertussis-Toxin

Das Pertussis-Toxin stellt ein Exotoxin dar, das ein Mitglied der A/B-Familie der bakteriellen Toxine mit einer Aktivität der ADP-Ribosyltransferase (Lit. 8) ist. Der A-Anteil oder die Untereinheit S1 dieser Toxine zeigt eine Aktivität der ADP-Ribosyltransferase, wogegen der B-Anteil (Untereinheiten S2 bis S5) die Bindung des Toxins an die Rezeptoren der Wirtszellen und die Translokation von A an dessen Aktivitätszentrum vermittelt. Das PT erleichtert auch das Anhaften von B. pertussis an die Epithelzellen mit Flimmerhärchen (Lit. 9) und spielt bei der Invasion von Makrophagen durch B. pertussis eine Rolle (Lit. 10).
Sämtliche nichtzelluläre Impfstoffe gegen Pertussis schließen bisher das PT mit ein, das bisher als ein bedeutender Virulenzfaktor und schützendes Antigen (Lit. 11 und 12) vorgeschlagen wird. Die natürliche Infektion mit B. pertussis erzeugt sowohl humorale als auch über Zellen vermittelte Antworten gegenüber dem PT (Lit. 13 bis 17). Kinder weisen anti-PT Antikörper auf, die aus der Plazenta stammen (Lit. 16, 18), wobei humanes Kolostrum mit einem Gehalt an anti-PT Antikörpern beim passiven Schutz von Mäusen gegen eine Infektion über Aerosole wirksam war (Lit. 19). Es wurde aufgezeigt, dass eine durch Zellen vermittelte Immunantwort (CMI) gegenüber Untereinheiten von PT nach der Impfung mit einem nichtzellulären Impfstoff (Lit. 20) eintritt, wobei eine CMI-Antwort auf das PT nach der Impfung mit ganzen Zellen herbeigeführt wird (Lit. 13). Das chemisch inaktivierte PT in den Impfstoffen mit ganzen Zellen oder Komponenten-Impfstoffen schützt sowohl bei Tiermodellen als auch bei Menschen (Lit. 21). Ferner schützen monoklonale Antikörper, die für die Untereinheit S1 spezifisch sind, gegen eine Infektion mit B. pertussis (Lit. 22 und 23).
Die hauptsächlichen pathophysiologischen Effekte vom PT gehen auf seine Aktivität im Hinblick auf die ADP-Transferase zurück. Das PT katalysiert den Transfer der ADP-Ribose aus dem NAD in Richtung Bindungsprotein des Gi-Guanin-Nukleotids, so dass das Regulationssystem der zellulären Adenylat-Cyclase aufgetrennt wird (Lit. 24). Das PT verhindert auch das Einwandern von Makrophagen und Lymphozyten an die Zentren der Entzündung und verursacht Störungen bei der Phagozytose, die durch neutrophile Zellen vermittelt wird sowie die Abtötung von Bakterien (Lit. 25). Eine Anzahl von analytischen Testverfahren in vitro und in vivo wurden dazu verwendet, die enzymatische Aktivität von S1 und/oder PT zu bestimmen, und zwar einschließlich der ADP-Ribosylierung des Transducins von Rindern (Lit. 26), des analytischen Testverfahrens mit dem Ovar des Chinesischen Hamsters (CHO) auf Basis von Zellzusammenballungen (Lit. 27), der Sensibilisierung mittels Histamin (Lit. 28), der Leukozytose und der Aktivität der NAD-Glykohydrolase. Bei der Exposition gegenüber dem PT entwickeln die CHO-Zellen eine typische Ausformung der Zellzusammenballung (Cluster). Dieses Phänomen ist abhängig von der Bindung des PT und der nachfolgenden Translokation und Aktivität der ADP-Ribosyltransferase von S1, so dass das analytische Testverfahren mit den CHO-Zellen auf Basis von Zellzusammenballungen weit verbreitet ist und dazu verwendet wird, die Unversehrtheit und Toxizität der PT-Holotoxine auszutesten.

Filamentöses Hämagglutinin

Das filamentöse Hämagglutinin stellt ein großes nichttoxisches Polypeptid mit 220 kDa dar, das die Anheftung von B. pertussis an die Flimmerhärchenzellen der oberen Atemwege während der bakteriellen Besiedelung vermittelt (Lit. 9 und 29). Die natürliche Infektion induziert anti-FHA Antikörper und die über Zellen vermittelte Immunität (Lit. 13, 15, 17, 30 und 31). Die anti-FHA Antikörper finden sich im Humankolostrum und werden auch über die Plazenta übertragen (Lit. 17, 18 und 19). Die Impfung mit Pertussisvakzinen aus ganzen Zellen oder nichtzellulären Keuchhusten-Impfstoffen führt zur Bildung von anti-FHA Antikörpern, wobei nichtzelluläre Keuchhusten-Impfstoffe mit einem Gehalt an FHA auch eine CMI-Antwort auf FHA (Lit. 20 und 32) induzieren. Das FHA stellt ein schützendes Antigen in einem Atemwegsprovokationsmodell bei der Maus nach der aktiven oder passiven Immunisierung dar (Lit. 33 und 34). Das FHA alleine schützt die Maus jedoch nicht bei dem analytischen Testverfahren auf Basis des intrazerebralen Provokationspotenzials (Lit. 28).

Protein mit 69 kDa aus der äußeren Membran (Pertaktin)

Das Protein mit 69 kDa stellt ein Protein aus der äußeren Membran dar, das ursprünglich aus B. bronchiseptica identifiziert wurde (Lit. 35). Es wurde aufgezeigt, dass es ein schützendes Protein gegen B. bronchiseptica darstellt, wobei es im Anschluss daran sowohl in B. pertussis als auch in B. parapertussis identifiziert wurde. Das Protein mit 69 kDa bindet direkt an eukaryotische Zellen (Lit. 36), wobei die natürliche Infektion mit B. pertussis eine humorale anti-P.69 Antwort (Lit. 14) induziert wird und dieses P.69 auch eine über Zellen vermittelte Immunantwort herbeiführt (Lit. 17, 37 und 38). Die Impfung mit Pertussisvakzinen aus ganzen Zellen oder nichtzellulären Keuchhusten- Impfstoffen führt zur Bildung von anti-P.69 Antikörpern Lit. 32 und 39), wobei nichtzelluläre Keuchhusten-Impfstoffe eine CMI-Antwort auf P.69 (Lit. 20 39) induzieren. Das Pertaktin schützt Mäuse gegen die Provokation durch Aerosole mit B. pertussis (Lit. 40), wobei es in Kombination mit dem FHA einen Schutz gegen B. pertussis auf Basis des intrazerebralen Provokationstestverfahrens bildet (Lit. 41). Ebenso bildet der passive Transfer von polyklonalen und monoklonalen anti-P.69 Antikörpern bei den Mäusen einen Schutz gegen die Provokation durch Aerosole (Lit. 42).

Agglutinogene

Die Serotypen von B. pertussis werden anhand von deren agglutinierenden Flimmerhärchen definiert. Die WHO gibt die Empfehlung, dass die Impfstoffe aus ganzen Zellen die Agglutinogene (Agge) vom Typ 1, 2 und 3 einschließen, da sie nicht über Kreuz schützen (Lit. 43). Das Agg 1 ist nicht aus Flimmerhärchen und wird an allen Stämmen von B. pertussis gefunden, wogegen Agg 2 und 3 von Flimmerhärchen stammen. Die natürliche Infektion oder Immunisierung mit Pertussisvakzinen aus ganzen Zellen oder nichtzellulären Keuchhusten-Impfstoffen induziert anti-Agg Antikörper (Lit. 15 und 32). Eine spezifische, durch Zellen vermittelte Immunantwort lässt sich bei Mäusen nach einer Infektion mit einem Aerosol mit Agg 2 und Agg 3 hervorrufen (Lit. 17). Agg 2 und Agg 3 bewirken bei Mäusen einen Schutz gegen eine Provokation der Atemwege, wobei menschliches Kolostrum mit einem Gehalt an gegen Agglutinogene gerichteten Antikörpern ebenfalls einen Schutz bei dieser Analysenanordnung bewirken (Lit. 19, 44 und 45).

Nichtzelluläre Impfstoffe

Der erste nichtzelluläre Impfstoff, der entwickelt wurde, war die Zweikomponentenvakzine aus PT plus FHA (JNIH 6) von Sato et al. (Lit. 46). Dieser Impfstoff wurde durch die kombinierte Reinigung von PT- und FHA-Antigenen aus dem Überstand der Kultur des Stammes Tomaha von B. pertussis hergestellt, wonach sich das Toxoidieren mit Formalin anschloss. Nichtzelluläre Impfstoffe von verschiedenen Herstellern und jeweils unterschiedlicher Zusammensetzung wurden erfolgreich dazu verwendet, japanische Kinder gegen Keuchhusten zu immunisieren, was seit 1981 in einem drastischen Rückgang des Auftretens der Erkrankung resultierte (Lit. 47). Der Impfstoff JNIH 6 und ein 1- Komponenten-Impfstoff auf Basis des PT-Toxoids (JNIH 7) wurden in einem umfangreichen klinischen Versuch 1986 in Schweden ausgetestet. Die anfänglichen Ergebnisse gaben einen Hinweis auf eine geringere Wirksamkeit als sie von einem Impfstoff aus ganzen Zellen berichtet wurde; allerdings haben daran angeschlossene Studien aufgezeigt, dass er gegenüber einem milderen Krankheitsverlauf, wie er anhand von serologischen Verfahren diagnostiziert wurde, wirksamer war (Lit. 48, 49, 50 und 51). Es bestanden jedoch Hinweise darauf, dass bei diesen Impfstoffen eine Umkehr zur Toxizität des durch Formalin inaktivierten PT stattfand. Es wurde auch festgestellt, dass diese Impfstoffe eher einen Schutz gegen die Erkrankung als gegen eine Infektion bewirken.
Zum gegenwärtigen Zeitpunkt werden eine Anzahl von nichtzellulären Impfstoffen untersucht, die Kombinationen von PT, FHA, P.69 und/oder Agglutinogene einschließen; diese Bestandteile sind in der Tabelle 1 aufgelistet. Es wurden unterschiedliche Techniken einer chemischen Entgiftung für das PT benutzt, darin eingeschlossen die Inaktivierung mit Formalin (Lit. 46), Glutaraldehyd (Lit. 52), Wasserstoffperoxid (Lit. 53) sowie Tetranitromethan (Lit. 54).
Somit dürften aktuelle, im Handel erhältliche nichtzelluläre Impfstoffe keine geeigneten Formulierungen geeigneter Antigene in passenden immunogenen Formen zur Erzielung des gewünschten Niveaus an Wirksamkeit in Bevölkerungskreisen, die gegenüber Keuchhusten anfällig sind, enthalten.
Es wäre wünschenswert, wirksame nichtzelluläre Impfstoffe, die ausgewählte relative Mengen an ausgewählten Antigenen enthalten, sowie Verfahren zu deren Herstellung zu schaffen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung ist auf Präparate auf Basis von nichtzellulären Impfstoffen gegen Keuchhusten, deren Komponenten, Verfahren zur Herstellung derartiger Impfstoffe und ihrer Komponenten, und Verfahren zu deren Verwendung gerichtet.
In Einklang mit einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Agglutinogenpräparats aus einem Bordetella-Stamm unter Einbeziehung der folgenden Schritte geschaffen:
(a) Bereitstellen einer Zellpaste des Bordetella-Stamms;
(b) Extrahieren von Fimbrien (Flimmerhärchen)-Agglutinogenen aus der Zellpaste in selektiver Weise zum Erzeugen eines ersten Überstandes, der die Agglutinogene enthält, sowie eines ersten Niederschlags (Präzipitat/Niederschlag) als Rückstand;
(c) Abtrennen des ersten Überstandes vom ersten Rückstandsniederschlag(präzipitat);
(d) Inkubation des ersten Überstandes bei einer solchen Temperatur und Zeitdauer, dass ein Fimbrien-Agglutinogene enthaltender geklärter Überstand sowie ein zweiter Niederschlag mit einem Gehalt an Verunreinigungen aus Nicht-Agglutinogenen erzeugt werden;
(e) Einengen des geklärten Überstandes zum Erzeugen einer rohen Lösung mit einem Gehalt an Fimbrien(Flimmerhärchen)-Agglutinogen; sowie
(f) Reinigen der Agglutinogene aus der rohen Lösung aus Fimbrien-Agglutinogen zum Erzeugen des Agglutinogenpräparats.
Der Bordetella-Stamm ist B. pertussis. Der erste Überstand mag bei einer Temperatur von etwa 50ºC bis etwa 100ºC, einschließlich einer Temperatur von etwa 75ºC bis etwa 85ºC, vorzugsweise bei etwa 80ºC inkubiert werden. Die Zeitdauer der Inkubation mag etwa 10 Minuten bis etwa 60 Minuten, vorzugsweise etwa 30 Minuten betragen. Die Fimbrien-Agglutinogene mögen aus der Zellpaste in selektiver Weise mittels einer Dispergierung der Zellpaste in einem Puffer mit einem Gehalt von etwa 1 M bis etwa 6 M Harnstoff extrahiert werden. Gemäß einer besonderen Ausgestaltung wird der erste Überstand vor der Inkubation bei der Temperatur und Zeitdauer eingeengt, womit die Gewinnung des geklärten Überstandes erzielt wird.
Der geklärte Überstand lässt sich vermittels beliebiger zweckmäßiger Maßnahmen unter Einschluss der Fällung von Fimbrien-Agglutinogenen aus dem geklärten Überstand, Abtrennung der ausgefällten Fimbrien-Agglutinogene aus dem so resultierenden Überstand und Solubilisierung der abgetrennten Fimbrien-Agglutinogene einengen. Die Fällung (Präzipitierung) lässt sich durch den Zusatz eines Polyethylenglykols, wie zum Beispiel mittels Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von etwa 8000 zu dem geklärten Überstand durchführen. Die Konzentration an dem Polyethylenglykol, das bei einer derartigen Ausfällung eingesetzt wird, kann etwa 3 Gewichtsprozent bis etwa 5 Gewichtsprozent, in bevorzugter Weise zwischen etwa 4,3 und etwa 4,7 Gewichtsprozent betragen, um die Ausfällung der genannten Fimbrien-Agglutinogene aus dem geklärten Überstand zu bewirken.
Die Fimbrien-Agglutinogene lassen sich aus der rohen Lösung aus den Fimbrien (Flimmerhärchen) durch die Säulenchromatographie reinigen, wobei die Säulenchromatographie die Gelfiltration, wie zum Beispiel die Verwendung von Sephadex 6B und/oder die PEI-Kieselgelsäulenchromatographie, mit einschließt. Gemäß einem besonderen Aspekt der Erfindung werden die Agglutinogene in Form eines sterilen Agglutinogenpräparats zur Verfügung gestellt, wobei die Sterilisation zum Beispiel durch die Sterilfiltration des Durchlaufs aus der Reinigung mittels der Säulenchromatographie erfolgt. Gemäß einer besonderen Ausgestaltung wird das sterile Fimbrien-Agglutinogenpräparat auf einem Adjuvans auf Mineralsalzbasis adsorbiert, das in Form von Alaun vorliegen mag.
Gemäß einem besonderen Aspekt der Erfindung wird ein Fimbrien-Agglutinogen-Präparat aus einem Bordetella pertussis Stamm geschaffen, das Fimbrien-Agglutinogen 2 (Agg 2) und Fimbrien- Agglutinogen 3 (Agg 3) enthält und im Wesentlichen frei ist vom Agglutinogen 1. Auf Grund der Berichte, wonach das Agglutinogen 1 das Lipo-Oligosaccharid (LOS) von B. pertussis darstellt und eine Reaktion hervorruft, wird auf dieser Basis durch die Schaffung eines Fimbrien-Agglutinogens, das im Wesentlichen frei ist vom LOS, aus diesem Grund das Hervorrufen von Reaktionen vermindert. Das Gewichtsverhältnis von Agg 2 zu Agg 3 kann in derartigen Fimbrien-Agglutinogen-Präparaten im Bereich von etwa 1,5 : 1 bis zu etwa 2 : 1 liegen. Gemäß einer besonderen Ausgestaltung der Erfindung wird ein Fimbrien-Agglutinogen-Präparat geschaffen, das mittels des vorliegend zur Verfügung gestellten Verfahrens hergestellt wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine immunogene Zusammensetzung geschaffen, die das Fimbrien-Agglutinogen-Präparat enthält, welches vorliegend zur Verfügung gestellt wird. Die immunogene Zusammensetzung lässt sich in Form eines Impfstoffes für den in vivo Gebrauch formulieren, um einen Schutz für einen Wirt zu bewirken, der damit gegen die Erkrankung immunisiert worden ist, die durch Bordetella hervorgerufen wurde, wobei der Impfstoff noch ein anderes Antigen von Bordetella enthalten kann. Das mindestens noch 1 zusätzlich enthaltene Bordetella-Antigen mag als filamentöses Hämagglutinin, als Protein aus der äußeren Membran mit 69 kDa, als Adenylatcyclase oder in Form von Bordetella - Lipo-Oligosacchariden, Proteinen aus der äußeren Membran und als Pertussistoxin oder Toxoid einschließlich genetisch entgifteter Analoga davon vorliegen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung kann die immunogene Zusammensetzung, wie sie vorliegend geschaffen wird, mindestens ein Immunogen mit umfassen, das von Bordetella verschieden ist. Ein derartiges von Bordetella verschiedenes Immunogen kann in Form eines Diphtherie- Toxoids, Tetanus-Toxoids, Kapselpolysaccharids von Hämophilus, dem Protein aus der äußeren Membran von Hämophilus, dem Hepatitis B-Oberflächenantigen, und jeweils von Polio, Mumps, Masern und/oder Röteln vorliegen.
Die immunogenen Zusammensetzungen, wie sie vorliegend geschaffen werden, können ferner noch ein Adjuvans umfassen, wobei ein derartiges Adjuvans in Form von Aluminiumphosphat, Aluminiumhydroxid, Quil A, QS 21, Calciumphosphat, Calciumhydroxid, Zinkhydroxid, eines Analogon auf Glykolipidbasis, einem Octodecylester einer Aminosäure oder einem Lipoprotein vorliegen kann.
In Einklang mit einem speziellen Aspekt der Erfindung wird eine Impfstoffzusammensetzung zum Schutz von Bevölkerungskreisen mit einem Risiko für den Fall einer Erkrankung geschaffen, die durch eine Infektion durch B. pertussis hervorgerufen wird, wobei die Zusammensetzung ein Pertussis-Toxoid, filamentöses Hämagglutinin, Pertaktin und Agglutinogene in gereinigter Form in ausgewählten relativen Mengen enthält, um einen Schutz bis zu einem Ausmaß von wenigstens 70% der Mitglieder der Bevölkerungskreise mit einem Risiko zu verleihen.
Eine derartige Impfstoffzusammensetzung mag etwa 5 bis zu etwa 30 ug Stickstoff eines Pertussis-Toxoids, etwa 5 bis zu etwa 30 ug Stickstoff von filamentösem Hämagglutinin, etwa 3 bis zu etwa 15 ug Stickstoff von Pertaktin und etwa 1 bis zu etwa 10 ug Stickstoff von Agglutinogenen enthalten.
Gemäß einer speziellen Ausgestaltung kann der Impfstoff ein Pertussis-Toxoid, filamentöses Hämagglutinin, Fimbrien-Agglutinogene und das Protein mit 69 kDa aus Bordetella in einem Gewichtsverhältnis von etwa 10 : 5 : 5 : 3 umfassen, wie es durch etwa 10 ug Pertussis-Toxoid, etwa 5 ug filamentöses Hämagglutinin, etwa 5 ug Fimbrien-Agglutinogene und etwa 3 ug Protein mit 69 kDa in einer einfachen Dosis für den Menschen zur Verfügung gestellt wird. Gemäß einer weiteren besonderen Ausgestaltung der Erfindung kann der Impfstoff Pertussis-Toxoid, filamentöses Hämagglutinin, Fimbrien-Agglutinogene und das Protein mit 69 kDa in einem Gewichtsverhältnis von etwa 20 : 20 : 5 : 3 umfassen, wie es durch etwa 20 ug Pertussis-Toxoid, etwa 20 ug filamentöses Hämagglutinin, etwa 5 ug Fimbrien-Agglutinogene und etwa 3 ug Protein mit 69 kDa in einer einfachen Dosis für den menschlichen Patienten zur Verfügung gestellt wird. Gemäß einer zusätzlichen weiteren besonderen Aspekt der Erfindung kann der Impfstoff Pertussis-Toxoid, filamentöses Hämagglutinin, Fimbrien- Agglutinogene und das Protein mit 69 kDa in einem Gewichtsverhältnis von 20 : 10 : 10 : 6 umfassen, wie es durch etwa 20 ug Pertussis-Toxoid, etwa 10 ug filamentöses Hämagglutinin, etwa 10 ug Fimbrien-Agglutinogene und etwa 6 ug Protein mit 69 kDa in einer einfachen Dosis für Patienten zur Verfügung gestellt wird.
Das Ausmaß des Schutzes, der durch die Impfstoffzusammensetzung gemäß der Erfindung bei den Bevölkerungskreisen mit einem Risiko erzielt wird, liegt bei mindestens etwa 80%, vorzugsweise bei etwa 85%, und zwar im Falle eines spastischen Hustens mit einer Dauer von wenigstens 21 Tagen und einer Infektion durch Bakterien, die durch eine Kultur bestätigt wird. Das Ausmaß des Schutzes bei den Bevölkerungskreisen mit einem Risiko kann mindestens 70% für einen Fall eines milde verlaufenden Keuchhustens betragen, wobei der Husten mindestens einen Tag dauert.
Die Agglutinogenkomponente des Impfstoffes umfasst in bevorzugter Weise das Fimbrien- Agglutinogen 2 (Agg 2) und das Fimbrien-Agglutinogen 3 (Agg 3), wobei diese im Wesentlichen frei sind vom Agglutinogen 1. Das Gewichtsverhältnis von Agg 2 zu Agg 3 mag im Bereich von etwa 1,5 : 1 bis etwa 2 : 1 liegen.
Der vorliegend geschaffene Impfstoff lässt sich mit einem Tetanus-Toxoid und Diphtherie- Toxoid kombinieren, um eine DTP-Vakzine zu schaffen. Gemäß einer Ausgestaltung enthält der Impfstoff etwa 15 Lfs (limit flocculation units) an Tetanus-Toxoid.
Darüber hinaus kann der Impfstoff auch ein Adjuvans, insbesondere Alaun, enthalten.
In derartigen besonderen Ausgestaltungen sorgen die immunogenen Zusammensetzungen für ein Profil der Immunantwort auf jedes einzelne der Antigene, die darin enthalten sind, wobei das Profil der Immunantwort im Wesentlichen zu jenem äquivalent ist, das durch einen Pertussis-Impfstoff aus ganzen Zellen produziert wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Immunisierung eines Wirts gegen eine Erkrankung geschaffen, die von Bordetella hervorgerufen wurde, wobei das Verfahren die Verabreichung einer immuneffizienten Menge an der in vorliegender Weise produzierten immunogenen Zusammensetzung oder Impfstoff an den Wirt, der ein menschlicher Patient sein kann, mit umfasst.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Immunisierung von Bevölkerungskreisen mit einem Risiko gegen eine Erkrankung geschaffen, die von B. pertussis hervorgerufen wird, wobei das Verfahren die Verabreichung einer immuneffizienten Menge an der vorliegend geschaffenen Impfstoffzusammensetzung an die Mitglieder von Bevölkerungskreisen mit einem Risiko mit umfasst, um den Mitgliedern von Bevölkerungskreisen mit einem Risiko in einem Ausmaß von mindestens 70% einen Schutz zu verleihen.
Die Vorteile der vorliegenden Erfindung schließen ein einfaches Verfahren zur Herstellung von immunogenen Agglutinogenpräparaten mit ein, die sich für den Einschluss in nichtzelluläre Keuchhustenimpfstoffe zur Effizienzsteigerung derartiger Vakzine eignen.
Die mittels der vorliegenden Erfindung geschaffenen Agglutinogenpräparate finden bei der Formulierung von nichtzellulären Multikomponentenimpfstoffen ihre Nutzanwendung, um einen damit immunisierten Wirt vor einer Erkrankung zu schützen, welche durch Bordetella einschließlich B. pertussis hervorgerufen wird. Insbesondere wurden die immunogenen Zusammensetzungen mit einem Gehalt an den Agglutinogenpräparationen, wie sie vorliegend zur Verfügung gestellt werden, durch das National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) der Regierung der Vereinigten Staaten für die wissenschaftliche Auswertung (Evaluierung) in einem klinischen Doppelblindversuch in Bezug auf die Wirksamkeit beim Menschen ausgewählt, so dass auf diese Weise eine hinreichende Grundlage für die besonders geschulte Fachwelt erarbeitet wurde, und zwar dahin gehend, dass die Zusammensetzungen in einem gewissen Ausmaß zur Verhütung der angegebenen Erkrankung (Keuchhusten) wirksam sind. Der Versuch läuft seit dem Anmeldetag der US-Patentanmeldung. Der Gegenstand des Klinikversuchs (auf Basis des vorliegend geschaffenen Impfstoffes) hat die Prüfung der Vorhersehbarkeit der Nutzanwendung in wohl durchdachter Weise bestanden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die vorliegende Erfindung lässt sich ferner aus der folgenden detaillierten Beschreibung und den Beispielen unter Bezugnahme auf die beigefügte Zeichnung verstehen, worin:
die Fig. 1 ein schematisches Fließschema der Vorgehensweise zur Isolierung einer Agglutinogenpräparation aus einem Bordetella-Stamm in Einklang mit einem Aspekt der vorliegenden Erfindung darstellt.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden neue Techniken geschaffen, die sich zur Herstellung von Agglutinogenpräparaten aus einem Stamm von Bordetella pertussis einsetzen lassen. Wie aus der Fig. 1 ersichtlich ist, wird eine Zellpaste aus Bordetella mit einem Gehalt an Agglutinogenen, wie zum Beispiel eine Zellpaste aus Bordetella pertussis mit beispielsweise einem Harnstoff enthaltenden Puffer, wie zum Beispiel 10 mM Kaliumphosphat, 150 mM NaCl und 4M Harnstoff extrahiert, um die Agglutinogene aus der Zellpaste zur Gewinnung eines ersten Überstandes (sp 1) mit einem Gehalt an Agglutinogenen und einem ersten Rückstandsniederschlag(präzipitat) (ppt 1) in selektiver Weise zu extrahieren. Der erste Überstand (sp 1) wird von dem ersten Rückstandsniederschlag (ppt 1) wie zum Beispiel durch Zentrifugieren abgetrennt. Der Rückstandsniederschlag (ppt 1) wird verworfen. Der geklärte Überstand (sp 1) kann im Anschluss daran eingeengt und gegenüber beispielsweise 10 mM Kaliumphosphat/150 mM NaCl/0,1% Triton X100 unter Einsatz wie zum Beispiel einem NMWL-Membranfilter von 100 bis 300 kDa der Diafiltration unterworfen werden.
Der erste Überstand wird sodann bei einer solchen Temperatur und für eine solche Zeitdauer inkubiert, dass ein geklärter Überstand (sp 1) mit einem Gehalt an Agglutinogenen und ein zu verwerfender Niederschlag (ppt 2) mit einem Gehalt an Verunreinigungen, die von Agglutinogenen verschieden sind, gewonnen werden. Die geeigneten Temperaturen schließen etwa 50ºC bis zu etwa 100ºC ein, einschließlich etwa 75º bis zu etwa 85ºC, wobei passende Inkubationszeiten etwa 1 bis zu etwa 60 Minuten mit inbegriffen sind. Der geklärte Überstand wird anschließend beispielsweise durch den Zusatz von Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von circa 8000 (PEG 8000) auf eine endgültige Konzentration von etwa 4,5 ± 0,2% eingeengt und sachte mindestens 30 Minuten lang zur Gewinnung eines dritten Niederschlags (ppt 3) gerührt, welcher durch Zentrifugieren gewonnen werden kann. Der verbleibende Überstand (sp 3) wird sodann verworfen.
Dieser dritte Niederschlag (ppt 3) wird zum Beispiel mit einem Puffer, enthaltend 10 mM Kaliumphosphat und 150 mM NaCl, zur Gewinnung der rohen Lösung aus Fimbrien-Agglutinogen extrahiert. Es kann 1 M Kaliumphosphat zu der rohen Lösung aus Fimbrien-Agglutinogen hinzugefügt werden, um sie im Hinblick auf das Kaliumphosphat auf circa 100 mM einzustellen. Alternativ lässt sich der geklärte Überstand der mit Wärme behandelten Fimbrien-Agglutinogene auch ohne Ausfällung mittels der Gelfiltrationschromatographie reinigen, und zwar unter Einsatz eines Gels wie zum Beispiel Sepharose CL 6B. Die Fimbrien-Agglutinogene in der Rohlösung werden im Anschluss daran durch Säulenchromatographie gereinigt, beispielsweise anhand der Passage durch eine PEI-Silika - (Siliziumdioxid) - Säule zur Gewinnung des Präparats mit dem Fimbrien-Agglutinogen im Durchlauf.
Dieses Fimbrien-Agglutinogen, enthaltend den Durchlauf, lässt sich weiter einengen und der Diafiltration gegenüber beispielsweise einer Pufferlösung mit einem Gehalt an 10 mM Kaliumphosphat und 150 mM NaCl unter Einsatz eines NMWL-Membranfilters von 100 bis 300 kDa unterwerfen. Die Agglutinogenpräparation lässt sich durch die Filtration durch ein Filter mit einer Membran (der Porenweite) von ≤ 0,22 um zur Gewinnung des endgültigen Fimbrien-Agglutinogenpräparats mit einem Gehalt an den Fimbrien-Agglutinogenen 2 und 3 sterilisieren.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auf ein Agglutinogenpräparat aus einem Bordetella pertussis Stamm unter Einschluss der Fimbrien-Agglutinogene 2 (Agg 2) und 3 (Agg 3), die im Wesentlichen vom Agglutinogen 1 frei sind. Das Gewichtsverhältnis von Agg 2 zu Agg 3 mag zwischen etwa 1,5 : 1 bis zu etwa 2 : 1 betragen. Derartige Fimbrien-Agglutinogenpräparate lassen sich anhand des vorliegend zur Verfügung gestellten und oben stehend in detaillierter Form beschriebenen Verfahrens gewinnen. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auch auf immunogene Zusammensetzungen (einschließlich der Impfstoffe), welche die Fimbrien-Agglutinogenspräparate, wie sie vorliegend geschaffen wurden, enthalten. Derartige Impfstoffe können auch noch andere Immunogene aus Bordetella enthalten, einschließlich des filamentösen Hämagglutinins, des Proteins aus der äußeren Membran mit 69 kDa und des Pertussis-Toxins oder eines Toxoids davon einschließlich genetisch entgifteter Analoga von PT, beispielsweise gemäß der Beschreibung in der Lit. 68 sowie Immunogenen, die von Bordetella verschieden sind, einschließlich des Diphtherie-Toxoids, Tetanus-Toxoids, der Kapselpolysaccharide von Hämophilus, der Proteine aus der äußeren Membran von Hämophilus, des Hepatitis B-Oberflächenantigens, und jeweils der von Polio, Mumps, Masern und/oder Röteln. Jedes der Antigene aus Bordetella wird individuell an ein Adjuvans absorbiert (wie zum Beispiel Alaun), um eine praktische und zügige Gewinnung der Impfstoffe mit ausgewählten relativen Mengen an Antigenen in den Vakzinen zu erzielen, wie sie vorliegend zur Verfügung gestellt wurden.
Gemäß ausgewählter Ausgestaltungen werden durch die Erfindung Impfstoffe mit den folgenden Kennzeichen (ug Proteine gemäß vorliegender Verwendung stützen sich auf die Ergebnisse aus Versuchen nach Kjeldahl, wie sie an gereinigten Konzentraten vorgenommen wurden und in Form von ug Proteinstickstoff ausgedrückt sind), wobei sämtliche Impfstoffe mittels intramuskulärer Injektion appliziert werden können:

(a) CP10/5/5/3DT

Eine Formulierung des Komponentenimpfstoffes gegen Pertussis, der mit Diphtherie- und Tetanus-Toxoiden kombiniert ist, wurde mit CP10/5/5/3DT bezeichnet. Jede Dosis an CP10/5/5/3DT mit 0,5 ml für Patienten wurde so formuliert, dass sie ungefähr folgende Bestandteile enthielt:
10 ug Pertussis-Toxoid (PT)
5 ug filamentöses Hämagglutinin (FHA)
5 ug Fimbrien-Agglutinogene 2 und 3 (FIMB)
3 ug Protein aus der äußeren Membran mit 69 kDA
15 Lf Diphtherie-Toxoid
5 Lf Tetanus-Toxoid
1,5 mg Aluminiumphosphat
0,6% 2-Phenoxyethanol als Konservierungsmittel

(b) CP20/20/5/3DT

Eine weitere Formulierung des Komponentenimpfstoffes gegen Pertussis, der mit Diphtherie- und Tetanus-Toxoiden kombiniert ist, wurde mit CP20/20/5/3DT bezeichnet. Jede einzelne Dosis an CP20/20/5/3DT mit 0,5 ml für Patienten wurde so formuliert, dass sie ungefähr folgende Bestandteile enthielt:
20 ug Pertussis-Toxoid (PT)
20 ug filamentöses Hämagglutinin (FHA)
5 ug Fimbrien-Agglutinogene 2 und 3 (FIMB)
3 ug Protein aus der äußeren Membran mit 69 kDA
15 Lf Diphtherie-Toxoid
5 Lf Tetanus-Toxoid
1,5 mg Aluminiumphosphat
0,6% (c) 2-Phenoxyethanol als Konservierungsmittel

(c) CP10/5/5DT

Eine Formulierung des Komponentenimpfstoffes gegen Pertussis, der mit Diphtherie- und Tetanus-Toxoiden kombiniert ist, wurde mit CP10/5/5DT bezeichnet. Jede Dosis an CP10/5/5DT mit 0,5 ml für Patienten wurde so formuliert, dass sie ungefähr folgende Bestandteile enthielt:
10 ug Pertussis-Toxoid (PT)
5 ug filamentöses Hämagglutinin (FHA)
5 ug Fimbrien-Agglutinogene 2 und 3 (FIMB)
15 Lf Diphtherie-Toxoid
5 Lf Tetanus-Toxoid
1,5 mg Aluminiumphosphat
0,6% 2-Phenoxyethanol als Konservierungsmittel

(d) CP20/10/10/6DT

Eine weitere Formulierung des Komponentenimpfstoffes gegen Pertussis, kombiniert mit Diphtherie- und Tetanus-Toxoiden, wurde mit CP20/10/10/6DT bezeichnet. Jede Dosis an CP20/10/10/6DT mit 0,5 ml für Patienten wurde so formuliert, dass sie ungefähr folgende Bestandteile enthielt:
20 ug Pertussis-Toxoid (PT)
10 ug filamentöses Hämagglutinin (FHA)
10 ug Fimbrien-Agglutinogene 2 und 3 (FIMB)
6 ug Protein aus der äußeren Membran mit 69 kDA
15 Lf Diphtherie-Toxoid
5 Lf Tetanus-Toxoid
1,5 mg Aluminiumphosphat
0,6% 2-Phenoxyethanol als Konservierungsmittel
Die übrigen Immunogene aus Bordetella, das Pertussis-Toxin (einschließlich genetisch entgifteter Analoga davon gemäß der Beschreibung in beispielsweise Klein et al., US-Patent Nr. 5 085 862, das an den Patentinhaber übertragen wurde, das FHA und das Protein mit 69 kDa lassen sich mittels einer Vielfalt an Verfahren, wie sie unten stehend beschrieben sind, herstellen:

Reinigung von PT

Das PT lässt sich aus dem Überstand der Kultur aus einem Stamm von B. pertussis unter Einsatz herkömmlicher Verfahren isolieren. So zum Beispiel lässt sich das Verfahren nach Sekura et al. (Lit. 55) einsetzen. Das PT wird zunächst durch Absorption des Überstands aus der Kultur an eine Säule isoliert, die die Gelmatrix mit einem Farbstoff-Liganden enthält, Afft-Gel-Blue (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). Das Pt wird aus der Säule durch eine hochgestellte Salzlösung eluiert, wie zum Beispiel 0,75 M Magnesiumchlorid und nach Entfernen des Salzes einer Passage durch eine Säule mit der Affinitätsmatrix Fetuin-Sepharose unterzogen, wobei die Matrix aus Fetuin (fötales Glo-bulin von Mammalia) zusammengesetzt ist, das mit der durch Cyanogenbromid (CNBr) aktivierten Sepharose verknüpft ist. Das PT wird aus der Fetuin-Säule unter Verwendung von 4M Magnesiumsalz eluiert.
Alternativ lässt sich auch das Verfahren nach Irons et al. (Lit. 56) einsetzen. Der Überstand aus der Kultur wird auf einer Säule mit Sepharose 4B, die mit CNBr aktiviert wurde und an welche Haptoglobin zuerst kovalent gebunden ist, absorbiert. Das PT bindet an das Absorbens bei einem pH-Wert von 6,5, wobei es aus der Säule unter Einsatz von 0,1 M Tris/0,5 M NaCl-Puffer bei einer schrittweisen Abänderung bis auf den pH-Wert 10 eluiert wird.
Alternativ kann das Verfahren eingesetzt werden, das in dem US-Patent Nr. 4 705 686 beschrieben ist, welches für Scott et al. am 10. Nov. 1987 erteilt wurde.
Bei diesem Verfahren lässt man die Überstände aus der Kultur oder die Zellextrakte von B. pertussis über eine Säule eines Ionenaustauscherharzes mit einer hinreichenden Kapazität zur Adsorption des Endotoxins laufen, wobei jedoch ein Durchlauf der Bordetella-Antigene oder eine anderweitige Abtrennung des Endotoxins ermöglicht wird.
Alternativ kann das PT unter Einsatz der Chromatographie mit Perlit gemäß der Beschreibung in dem EP-Patent Nr. 336 736 gereinigt werden, welches auf den Patentinhaber übertragen wurde; dies ist unter Bezugnahme darauf in die vorliegende Beschreibung mit einbezogen.

Entgiftung von PT

Das PT wird zur Entfernung unerwünschter Wirkungen, die Nebenwirkungen des fertigen Impfstoffes hervorrufen könnten, entgiftet. Jedes beliebige der herkömmlichen chemischen Entgiftungsverfahren lässt sich anwenden, wie zum Beispiel die Behandlung mit Formaldehyd, Wasserstoffperoxid, Tetranitromethan oder Glutaraldehyd.
Beispielsweise lässt sich das PT mit Glutaraldehyd unter Einsatz einer Modifikation der Vorgehensweise, wie sie bei Munoz et al. (Lit. 57) beschrieben ist, entgiften. Bei diesem Entgiftungsverfahren wird das gereinigte PT in einer Lösung mit einem Gehalt an 0,01 M Phosphat in Bezug auf eine gepufferte Salzlösung inkubiert. Die Lösung wird mit Glutaraldehyd zu 0,5% hergestellt, die Mischung bei Raumtemperatur 2 Stunden lang inkubiert und im Anschluss daran mit L-Lysin zu 0,02 M zubereitet. Das Gemisch wird ferner 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert und sodann 2 Tage lang gegen 0,01 M PBS dialysiert. Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung lässt sich das Entgiftungsverfahren nach dem EP-Patent Nr. 336 736 anwenden. Kurz gesagt lässt sich das PT mit Glutaraldehyd wie folgt entgiften:
Das gereinigte PT in 75 mM Kaliumphosphat mit einem Gehalt an 0,22 M Natriumchlorid und einem pH-Wert von 8,0 wird mit den gleichen Volumenteilen an Glyzerin und Protein in der jeweiligen Konzentration von annähernd 50 bis zu 400 ug pro ml verdünnt. Die Lösung wird auf 37ºC erwärmt und durch den Zusatz von Glutaraldehyd bis auf eine endgültige Konzentration von 0,5% Gew./Vol. entgiftet. Die Mischung wird bei 37ºC 4 Stunden lang gehalten und anschließend Asparaginsäure zu 1,5 M bis auf eine endgültige Konzentration von 0,25 M hinzugegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 1 Stunde lang inkubiert und im Anschluss daran mit 10 Volumina (einer Lösung von) 10 mM Kaliumphosphat, enthaltend 0,15 M Natriumchlorid und 5% Glyzerin bei einem pH-Wert von 8,0 der Diafiltration unterworfen, um den Glyzeringehalt zu verringern und das Glutaraldehyd zu entfernen. Das PT-Toxoid wird durch eine Membran von 0,2 um hindurch steril filtriert.
Im Falle des Einsatzes von rekombinanten Techniken zur Herstellung eines Mutantenmoleküls auf Basis von PT mit einer geringen oder ohne Toxizität zur Verwendung als das toxoidierte Molekül besteht keine Notwendigkeit für eine chemische Entgiftung.

Reinigung von FHA

Das FHA lässt sich aus dem Überstand der Kultur im Wesentlichen in der Weise reinigen, wie sie von Cowell et al. (Lit. 58) beschrieben wurde. Wachstumspromotoren, wie zum Beispiel methylierte β-Cyclodextrine können zur Erhöhung der Ausbeute an FHA im jeweiligen Überstand der Kultur eingesetzt werden. Der Überstand der Kultur wird über eine Säule mit Hydroxylapatit gegeben. Das FHA wird an der Säule adsorbiert, das PT dagegen nicht. Die Säule wird dann intensiv mit Triton X100 zum Entfernen des Endotoxins gewaschen. Im Anschluss daran wird das FHA unter Verwendung von 0,5 M NaCl in 0,1 M Natriumphosphat eluiert und bei Bedarf einer Passage durch eine Säule mit Fetuin-Sepharose zur Entfernung von verbliebenem PT unterzogen. Eine zusätzliche Reinigung kann die Passage durch eine Säule mit Sepharose CL-6B mit einschließen.
Alternativ lässt sich das FHA unter Verwendung von gegen die Antikörper gerichteten monoklonalen Antikörpern reinigen, wobei die Antikörper auf einer mit CNBr aktivierten Affinitätssäule fixiert werden (Lit. 59).
Weiter lässt sich das FHA in alternativer Weise unter Einsatz der Chromatographie mit Perlit reinigen, wie in der oben stehend erwähnten EP 336 736 beschrieben ist.

Reinigung des Proteins aus der äußeren Membran mit 69 kDa (Pertaktin)

Das 69 kDa-Protein aus der äußeren Membran (69K oder Pertaktin) lässt sich aus den bakteriellen Zellen durch eine erste Inaktivierung der Zellen mittels eines bakteriostatischen Mittels wie zum Beispiel durch Thimerosal gemäß der Beschreibung in der veröffentlichten EP 484 621 gewinnen, wobei letztere Publikation durch die Bezugnahme darauf vorliegend miteinbezogen wird. Die inaktivierten Zellen werden in einem wässrigen Medium suspendiert, wie zum Beispiel PBS (pH- Wert 7 bis 8) und einer wiederholten Extraktion bei erhöhten Temperaturen von 45 bis 60ºC unterzogen, wonach bei Raumtemperatur oder bei 4ºC die Kühlung erfolgt. Die Extraktionen setzen das 69K-Protein frei. Das Material mit einem Gehalt an dem 69K-Protein wird durch eine Fällung gewonnen und einer Passage über eine mit Afft-Gel-Blue befüllte Säule unterzogen. Das 69K-Protein wird bei einer hohen Salzkonzentration wie zum Beispiel 0,5 M Magnesiumchlorid eluiert. Nach der Dialyse wird es einer Passage durch einen die Chromatographie fokussierenden Träger unterworfen.
In alternativer Weise kann das Protein mit 69 kDa aus dem Überstand der Kultur aus einer B. pertussis - Kultur gemäß der Beschreibung in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 91/15 505, die auf den Namen ihres Rechtsnachfolgers lautet, gereinigt werden.
Weitere geeignete Reinigungsverfahren für das 69 kDa-Protein aus der äußeren Membran aus B. pertussis sind in dem US-Patent Nr. 5 276 142, das für Gotto et al. am 4. Jan. 1984 erteilt wurde, und in dem US-Patent Nr. 5 101 014 beschrieben, das für Burns am 31. März 1992 erteilt wurde.
Es wurde eine Anzahl von klinischen Versuchen an Patienten gemäß vorliegender Beschreibung durchgeführt, um die Sicherheit, das Fehlen von Reaktionsbereitschaft und der Nützlichkeit der Komponentenwirkstoffe mit einem Gehalt an Fimbrien-Agglutinogen, die gemäß der vorliegenden Beschreibung hergestellt werden, zum Schutz gegen Keuchhusten abzusichern. Insbesondere wurden Immunantworten auf die einzelnen in den Impfstoffen enthaltenen Antigene erzielt (wie zum Beispiel in der unten stehenden Tabelle 3 aufgezeigt ist). Ein besonderer nichtzellulärer Impfstoff gegen Keuchhusten in Form von CP10/5/5/3DT wurde in einer ausgedehnten placebokontrollierten, doppelt randomisierten klinischen multizentrischen Studie bei einem Patientenkollektiv zur Abschätzung der Wirksamkeit des Impfstoffs gegen einen typischen Keuchhusten analysiert.
Die Definition der Fälle von typischen Keuchhustenerkrankungen war wie folgt:
21 Tage oder länger spastischer Husten sowie entweder eine abgesicherte Kultur von B. pertussis,
oder
serologische Anzeichen einer bordetellaspezifischen Infektion, welche durch 100% IgG oder einen Anstieg des IgA-Antikörpertiters auf Basis von ELISA gegen FHA oder PT in gepaarten Seren angezeigt wird,
oder
falls serologische Werte fehlen, das in die Studie einbezogene Kind befindet sich bisher in Kontakt mit einem im Haushalt durch eine Kultur abgesicherten Fall von B. pertussis mit einem Ausbruch der Hustenanfälle innerhalb von 28 Tagen vor oder nach dem Beginn des Hustens bei diesem Kind aus der Studie.
Die Ergebnisse dieser Studie zeigten auf, dass CP10/5/5/3DT bei der Verhütung von Keuchhusten zu etwa 85% wirksam ist gemäß der Definition der Fälle von typischen Keuchhustenerkrankungen gemäß der oben stehenden Beschreibung. Gemäß der gleichen Studie war ein nichtzellulärer 2- Komponentenimpfstoff gegen Keuchhusten mit einem Gehalt an lediglich PT und FHA nur zu etwa 58% wirksam, wobei die Vakzine aus ganzen Zellen gegen Pertussis nur zu 48% wirksam war (siehe die unten stehende Tabelle 4). Darüber hinaus verhinderte der Impfstoff CP10/5/5/3DT einen mild verlaufenden Keuchhusten, wie er in Form eines Husten von mindestens 1 Tag Dauer definiert wird, mit einer Wirksamkeit von etwa 77%. Insbesondere war das erzielte Profil der Immunantwort im Wesentlichen das gleiche wie jenes, das man im Anschluss an die Immunisierung mit den Impfstoffen aus ganzen Zellen gegen Pertussis erhält, für welche es Berichte über eine hohe Wirksamkeit dieser Vakzine gibt.

Impfstoffpräparate und Verwendung

Somit lassen sich immunogene Zusammensetzungen mit einer Eignung zur Verwendung als Impfstoffe aus den Immunogenen von Bordetella pertussis gemäß der vorliegenden Offenbarung herstellen. Der Impfstoff ruft eine Immunantwort bei einem Patienten hervor, der Antikörper produziert, die möglicherweise Opsonine erzeugen oder bakterizid sind. Im Falle einer Exposition des geimpften Patienten gegenüber B. pertussis binden derartige Antikörper an die Bakterien und inaktivieren sie.
Ferner können die Antikörper im Zusammenhang mit den Opsoninen oder der bakteriziden Aktivität auch einen Schutz durch alternative Mechanismen bieten.
Immunogene Zusammensetzungen einschließlich der Impfstoffe lassen sich als Injektionspräparate, flüssige Lösungen oder Emulsionen herstellen. Die Immunogene aus Bordetella lassen sich mit pharmazeutisch annehmbaren Exzipienzien vermischen, welche mit den Immunogenen verträglich sind. Derartige Exzipienzien schließen Wasser, Salzlösung, Dextrose, Glyzerin, Ethanol und deren Kombinationen ein. Die immunogenen Zusammensetzungen und Impfstoffe können ferner Hilfsstoffe zur Erhöhung ihrer Wirksamkeit enthalten, wie zum Beispiel Benetzungsmittel oder Emulgatoren, den pH-Wert puffernde Mittel oder Adjuvanzien. Die immunogenen Zusammensetzungen und Impfstoffe lassen sich parenteral applizieren und zwar durch eine Injektion auf subkutanem oder intramuskulärem Wege. Die immunogenen Präparate und Impfstoffe werden in einer Art und Weise verabreicht, dass sie im Hinblick auf die Formulierung der Dosis verträglich ist, und zwar in einer Menge, dass die therapeutische Wirkung in Bezug auf die Immunogenität und den Schutz eintritt. Die zu applizierende Menge ist von dem zu behandelnden Patienten abhängig, und zwar unter Berücksichtigung der Leistungsfähigkeit des Immunsystems der Einzelperson im Hinblick auf die Produktion von Antikörpern und, im Bedarfsfall, die Produktion der über Zellen vermittelte Immunantwort. Exakte Mengen des Wirkstoffs, der appliziert werden soll, sind von der Einschätzung des Praktikers abhängig. Die passenden Dosierungsbereiche lassen sich durch die Fachleute leicht bestimmen; jene können in der Größenordnung von Mikrogramm im Hinblick auf die Immunogene liegen. Geeignete Dosierungsschemata für die einleitende Verabreichung und die Dosen für den Booster-Effekt sind gleichfalls variabel, können aber eine einleitende Verabreichung mit nachfolgenden Applikationen einschließen. Die Dosierung kann auch vom Verabreichungsweg abhängig sein und dürfte entsprechend der Größe des Wirts variieren.
Die Konzentration der Immunogene in einer immunogenen Zusammensetzung gemäß der Erfindung beträgt im allgemeinen etwa 1 bis etwa 95%. Ein Impfstoff mit einem Gehalt an antigenem Material aus lediglich 1 Pathogen stellt einen monovalenten Impfstoff dar. Impfstoffe mit einem Gehalt an antigenem Material aus mehreren Pathogenen stellen kombinierte Impfstoffe dar; sie sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Derartige Kombinationsimpfstoffe enthalten beispielsweise Material aus mehreren Pathogenen oder aus verschiedenen Stämmen in Bezug auf das gleiche Pathogen, oder aus Kombinationen verschiedener Pathogene.
Die Immunogenizität lässt sich in signifikanter Weise dann verbessern, wenn die Antigene zusammen mit den Adjuvanzien appliziert werden, für gewöhnlich im Einsatz als 0,005 bis 0,5%ige Lösung in einer mit Phosphat gepufferten Salzlösung. Adjuvanzien verbessern die Immunogenizität eines Antigens, stellen aber nicht notwendigerweise selbst Immunogene dar. Die Adjuvanzien können die Funktion aufweisen, ein Antigen lokal in Nähe der Stelle der Applikation zu halten, um einen Depoteffekt zu entwickeln, der eine allmähliche und verzögerte Freisetzung der Antigene gegenüber den Zellen des Immunsystems erleichtert. Die Adjuvanzien können auch Zellen des Immunsystems zu einem Antigendepot locken und derartige Zellen zur Provokation der Immunantworten stimulieren.
Die immunstimulierenden Mittel oder Adjuvanzien werden schon seit vielen Jahren zur Verbesserung der Immunantworten des Wirtes auf die Impfstoffe eingesetzt. Intrinsische Adjuvanzien, wie zum Beispiel Lipopolysaccharide stellen normalerweise die Komponenten der abgetöteten oder abgeschwächten Bakterien dar, die als Impfstoffe eingesetzt werden. Die exogenen (extrinsischen) Adjuvanzien stellen Immunmodulatoren dar, die typischerweise nicht in kovalenter Weise mit Antigenen verknüpft und so formuliert sind, dass die Immunantwort des Wirts verbessert wird. Somit wurden die Adjuvanzien dahingehend identifiziert, dass sie die Immunantwort auf Antigene erhöhen, die parenteral freigegeben werden. Einige dieser Adjuvanzien sind jedoch toxisch; sie können unerwünschte Nebenwirkungen hervorrufen, so dass sie sich für die Verwendung beim Menschen und vielen Tieren nicht eignen. In der Tat werden allein Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat (kollektiv für gewöhnlich als Alaun bezeichnet) routinemäßig als Adjuvanzien in Impfstoffen für Tier und Mensch verwendet. Die Effizienz von Alaun bei der Steigerung der Antikörperantworten auf Diphtherie- und Tetanus-Toxoide ist wohl etabliert, wobei erst vor kurzem ein HBsAg-Impfstoff mit Alaun als Adjuvans versehen wurde. Während die Nützlichkeit von Alaun für einige Anwendungen wohl etabliert ist, bestehen dafür Einschränkungen. Beispielsweise ist Alaun bei der Grippeimpfung unwirksam, wobei es in widersprüchlicher Weise eine über Zellen vermittelte Immunantwort provoziert. Die durch Alaun als Adjuvans provozierten Antigene sind in der Hauptsache vom Isotyp IgG1 bei der Maus, was für den Schutz durch einige Impfmittel nicht optimal sein dürfte.
Eine große Spannweite exogener Adjuvanzien kann starke Immunantworten gegenüber Antigenen bewirken. Diese schließen Saponine ein, die mit Antigenen aus Membranproteinen komplex verbunden sind (immunstimulierende Komplexe), Pluronic-Polymere mit Mineralöl, abgetötete Mykobakterien in Mineralöl, Freund'sches komplettes Adjuvans, Produkte aus Bakterien wie zum Beispiel Muramyldipeptid (MDP) sowie Lipopolysaccharid (LPS) wie auch das Lipid A und Liposomen.
Zur effizienten Provokation von humoralen Immunantworten (HIR) und einer über Zellen vermittelten Immunität (CMI) werden Immunogene häufig in Adjuvanzien emulgiert. Zahlreiche Adjuvanzien sind toxisch und erzeugen Granulome sowie akute und chronische Entzündungen (Freund' sches komplettes Adjuvans, FCA), Zytolyse (Saponine und Pluronic-Polymere) und Pyrogenizität, Arthritis und vordere Uveitis (LPS und MDP). Obschon das FCA ein ausgezeichnetes Adjuvans darstellt und weit verbreitet in der Forschung benutzt wird, ist es wegen seiner Toxizität nicht für die Anwendung in Impfstoffen für Mensch und Tier zugelassen.
Wünschenswerte Charakteristika idealer Adjuvanzien schließen die folgenden Merkmale ein:
(1) Fehlen von Toxizität;
(2) Fähigkeit zur Stimulierung einer lang anhaltenden Immunantwort;
(3) Einfachheit der Herstellung und Stabilität für lange Aufbewahrungszeiten;
(4) Fähigkeit zur Provokation von sowohl über Zellen vermittelte (CMI) als auch humorale Antworten (HIR) auf Antigene, die auf verschiedenen Wegen appliziert wurden;
(5) Synergie mit weiteren Adjuvanzien;
(6) Befähigung zur selektiven Wechselwirkung mit Populationen von Antigene präsentierenden Zellen (APC);
(7) Fähigkeit zur spezifischen Provokation von Immunantworten, die für TH1- oder TH2-Zellen spezifisch sind; sowie
(8) Fähigkeit zur selektiven Steigerung der geeigneten Isotypentiter von Antikörpern (beispielsweise IgA) gegenüber Antigenen.
In dem US-Patent Nr. 4 855 283, das für Lockhoff et al. am 8. Aug. 1989 erteilt wurde, wird gelehrt, dass Glykolipidanaloga einschließlich der N-Glykosylamide, N-Glykosylharnstoffe und N-Glykosylcarbamate als Immunmodulatoren oder Adjuvanzien fungieren können, wobei jede dieser Verbindungen am Zuckerrest durch eine Aminosäure substituiert ist. So wird von Lockhoff et al. (US-Patent Nr. 4 855 283 und Lit. 60) berichtet, dass die Glykolipidanaloga, welche strukturelle Ähnlichkeiten mit den natürlicherweise vorkommenden Glykolipiden aufweisen, wie zum Beispiel Glykosphingolipide und Glykoglycerolipide, dazu befähigt sind, starke Immunantworten im Zusammenhang mit Impfstoffen sowohl gegen den Viren Herpes simplex und als auch gegen Pseudorabies zu provozieren. Einige Glykolipide wurden aus langkettigen Alkylaminen und Fettsäuren synthetisiert, die direkt mit den Zuckern über ein anomeres Kohlenstoffatom verknüpft sind, um so die Funktionen von natürlicherweise vorkommenden Lipiden nachzuahmen.
Das US-Patent Nr. 4 258 029, das für Moloney erteilt und auf den Rechtsnachfolger übertragen wurde, vermittelt die Lehre, dass Octadecyltyrosin·Hydrochlorid (OTH) dann als Adjuvans fungiert, wenn es mit Tetanus-Toxoid und einem Impfstoff gegen den Polyomyelitisvirus vom Typ I, II und III, der mit Formalin inaktiviert wurde, komplexiert wird. Ebenso berichteten Nixon-George et al. (Lit. 61), dass Octadecylester aus aromatischen Aminosäuren, die mit einem rekombinanten Oberflächenantigen von Hepatitis B komplexiert wurden, die Immunantworten des Wirtes gegenüber dem Virus der Hepatitis B verstärken würden.

BEISPIELE

Durch die oben stehende Offenbarung wird die vorliegende Erfindung generell beschrieben. Ein vollständigeres Verständnis lässt sich durch die Bezugnahme auf die folgenden speziellen Beispiele vermitteln.
Die Verfahren der Biochemie der Proteine, Fermentierung und Immunologie, die benutzt, aber nicht ausdrücklich in der vorliegenden Offenbarung beschrieben sind, sind in der wissenschaftlichen Literatur ausführlich erläutert; sie gehören zu den Fähigkeiten der Fachleute.

Beispiel 1:

Durch das Beispiel wird das Wachstum von Bordetella pertussis beschrieben.

Original-Impfkeime:

Die Kulturen der Original-Impfkeime aus einem Stamm von Bordetella pertussis wurden als Chargen gefriergetrockneter Original-Impfkeime bei 2ºC bis zu 8ºC gehalten.

Impfkeime für den Ansatz:

Die gefriergetrocknete Kultur wurde aus dem Hornibrook-Medium gewonnen und dazu benutzt, Platten auf Basis von Bordet-Gengou-Agar (BGA) zu beimpfen. Das Medium nach Hornibrook weist die folgende Zusammensetzung auf:
Bestandteil auf einen Liter
Caseinhydrolysat 10,0 g
Nikotinsäure 0,001 g
Calciumchlorid 0,002 g
Natriumchlorid 5,0 g
Magnesiumchlorid·Hexahydrat 0,025 g
Kaliumchlorid 0,200 g
dibasisches Kaliumphosphat 0,250 g
Stärke 1,0 g
destilliertes Wasser auf 1 Liter
Der pH-Wert wird mit 1%iger Natriumcarbonatlösung auf 6,9 ± 0,1 eingestellt. Das Medium wird in Röhrchen dispensiert und mittels Dampf im Autoklaven 20 Minuten lang sterilisiert, wobei das Autoklavieren bei 121ºC bis 124ºC 20 Minuten lang erfolgt. Die Impfkeime wurden 2 Mal subkultiviert zuerst auf BGA-Platten und im Anschluss daran auf Komponenten-Pertussis-Agar (CPA). Der Komponenten-Pertussis-Agar (CPA) ist wie folgt zusammengesetzt:
NaCl 2,5 g pro L
KH&sub2;PO&sub4; 0,5 g pro L
KCl 0,2 g pro L
0,1 g pro L
MgCl&sub2;·(H&sub2;O)&sub6;
Tris-Base 1,5 g pro L
Kaseinaminosäuren 10,0 g pro L
NaH-Glutamat 10,0 g pro L
konz. HCl bis pH-Wert 7,2
Agar 15,0 g pro L
Wachstumsfaktoren (CPGF) 10,0 ml pro L
Die Wachstumsfaktoren (CPGF) - 100X sind im Hinblick auf die Keuchhusten-Komponenten wie folgt zusammengesetzt:
L-Cystein·HCl 4,0 g pro L
Niacin 0,4 g pro L
Ascorbinsäure 40,0 g pro L
reduz. Glutathion 15 g pro L
Fe&sub2;SO&sub4;·(H&sub2;O)&sub7; 1,0 g pro L
Dimethyl - β - Cyclodextrin 100 g pro L
CaCl&sub2;·(H&sub2;O)&sub2; 2,0 g pro L
Die fertige Kultur wurde in einem Suspensionspuffer für Pertussis-Impfkeime (CPSB), der jeweils in aliquoten Anteilen von 2 bis 4 ml dispensiert und tiefgefroren bei -60ºC bis -85ºC aufbewahrt wurde, suspendiert. Der Suspensionspuffer für Pertussis-Impfkeime (CPSB) ist wie folgt zusammengesetzt:
Caseinaminosäuren 10,0 g pro L
Tris - Base 1,5 g pro L
wasserfreies Glyzerin 100 ml pro L
konz. HCl bis ph 7,2
Diese Glyzerinsuspensionen bildeten das Ausgangsmaterial für die Herstellung der Ansatzimpfkeime.

Kultivierungsprozess:

Die Vermehrung der Ansatzimpfkeime wurde in Flaschen mit Komponenten-Pertussis-Agar Roux 4 bis 7 Tage lang bei 34ºC bis zu 38ºC durchgeführt. Im Anschluss an diese Kultivierung wurden die Zellen aus dem Agar mit der Komponenten-Pertussis-Nährbouillon herausgewaschen. Die Proben wurden an Hand der Gramfärbung im Hinblick auf die Reinheit und Opakizität (Trübung) der Kultur beobachtet.
Die Zellen wurden in konische Flaschen von 4 Liter Fassungsvermögen mit einem Gehalt an CPB überführt und bei 34ºC bis 38ºC 20 bis 26 Stunden lang unter Schütteln inkubiert. Sodann wurden die Proben an Hand der Gramfärbung im Hinblick auf die Reinheit der Kultur überprüft. Der Flascheninhalt wurde vereinigt und die Suspension zur Impfung von 2 Bioreaktoren (Fermentern) mit einem Gehalt an CPB eingesetzt (10 Liter an Volumen, beginnend bei OD&sub6;&sub0;&sub0; 0,1 bis 0,4). Die Impfkeime wurden bis zu einem Endwert von OD&sub6;&sub0;&sub0; 5,0 bis 10,0 wachsen gelassen. Die Proben wurden an Hand der Gramfärbung im Hinblick auf die Reinheit der Kultur mittels antigenspezifischer ELISA- Tests sowie auf Sterilität überprüft.

Beispiel 2:

Durch dieses Beispiel wird die Reinigung der Antigene aus der Zellkultur von Bordetella pertussis beschrieben.

Herstellung der Nährbouillon und Zellkonzentrate:

Die Bakteriensuspension wurde dem Wachstum in 2 Bioreaktoren vom Produktionsmaßstab bei 34ºC 35 bis 50 Stunden lang dem Wachstum überlassen. Den Bioreaktoren wurden zum Überprüfen der Sterilität Proben entnommen. Die Suspension wurde zum Abtrennen der Zellen aus der Nährbrühe in eine kontinuierliche Scheibenstapelzentrifuge (12 000 · g) eingespeist. Die Zellen wurden bis zur erwarteten Extraktion der Fimbrienkomponente gesammelt. Die geklärte Flüssigkeit wurden der Passage durch ein Membranfilter von ≤ 0,22 um (Porenweite) hindurch unterworfen. Die abfiltrierte Flüssigkeit wurde durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Membran vom nominalen Molekulargewicht 10 bis 30 kDa (NMWL) eingeengt. Das Konzentrat wurde bis zur erwarteten Abtrennung und Reinigung von Komponenten des Pertussis-Toxins (PT), filamentösen Hämagglutinins (FHA) und Pertaktins mit 69 kDa aufbewahrt.

Abtrennung der Komponenten von der Nährbouillon:

Die Komponenten der Nährbouillon (69 kDa-Protein, PT und FHA) wurden abgetrennt und mittels der Perlit-Chromatographie und selektiver Eluierschritte gereinigt, wobei diese Stufen im Wesentlichen in dem EP-Patent Nr. 336 736 beschrieben sind, ebenso in der von der Patentinhaberin veröffentlichten PCT-Anmeldung Nr. WO 91/15 505 gemäß oben stehender Beschreibung. Die speziell durchgeführten Reinigungsprozesse sind wie unten stehend beschrieben:

Pertussis-Toxin (PT):

Die Perlit-Säule wurde mit 50 mM Tris, 50 mM Tris/0,5% Triton X-100 und 50 mM Tris-Puffer gewaschen. Die PT-Fraktion wurde aus der Perlit-Säule mit 50 mM Tris/0,12 M NaCl-Puffer eluiert.
Eine Hydroxylapatitsäule wurde mit der PT-Fraktion aus der Perlit-Chromatographie beladen und im Anschluss daran mit 30 mM Kaliumphosphatpuffer gewaschen. Das PT wurde mit 75 mM Kaliumphosphat/225 mM NaCl-Puffer eluiert. Die Säule wurde sodann mit 200 mM Kaliumphosphat/0,6 M NaCl zur Gewinnung der FHA-Fraktion gewaschen, welche beiseite gestellt wurde. Zu dem gereinigten PT wurde Glyzerin zu 50% hinzugefügt; dann wurde das Gemisch bei 2ºC bis zu 8ºC bis zur Entgiftung innerhalb einer Woche gelagert.

Filamentöses Hämagglutinin (FHA):

Die FHA-Fraktion wurde aus der Perlit-Säule mit 50 mM Tris/0,6 M NaCl eluiert. Das filamentöse Hämagglutinin wurde mittels Chromatographie über Hydroxylapatit gereinigt. Die Hydroxylapatitsäule wurde mit der FHA-Fraktion aus der Perlit-Säule beladen und anschließend mit 30 mM Kaliumphosphat mit einem Gehalt an 0,5% Triton X-100 gewaschen, wonach anschließend das Waschen mit 30 mM Kaliumphosphatpuffer erfolgte. Die PT-Fraktion wurde mit 85 mM Kaliumphosphatpuffer eluiert und verworfen. Die FHA-Fraktion wurde sodann mit 200 mM Kaliumphosphat/0,6 M NaCl eluiert und bei 2ºC bis zu 8ºC bis zur Entgiftung innerhalb einer Woche gelagert.

Protein mit 69 kDa (Pertaktin):

Das Konzentrat der Nährbouillon wurde mit Wasser für Injektionszwecke (WFI) zum Erzielen einer Leitfähigkeit von 3 bis 4 mS pro cm verdünnt und damit eine Perlitsäule in einer Ladekonzentration von 0,5 bis 3,5 mg pro mg Perlit beladen. Der Durchlauf (69 kDa - Komponente) wurde mittels Ultrafiltration unter Einsatz einer NMWL-Membran von 10 bis 30 kDa eingeengt. Zu dem Konzentrat des Durchlaufs wurden 35% ± 3% (Gew./Vol) Ammoniumsulfat hinzugegeben und das so erhaltene Gemisch entweder bei 2ºC bis zu 8ºC 2 ± 4 Tage aufbewahrt oder unmittelbar darauf bei 7000 · g abzentrifugiert. Der überschüssige Überstand wurde dekantiert und der Niederschlag (das Präzipitat) durch Abzentrifugieren bei 7000 · g gewonnen. Das Pellet aus dem Protein mit 69 kDa wurde entweder tiefgefroren bei -20ºC bis -30ºC aufbewahrt oder in Tris- oder Phosphatpuffer aufgelöst und unmittelbar danach verwendet.
Das Protein mit 69 kDa aus der äußeren Membran, das mittels der Ausfällung des Perlit-Durchlaufkonzentrats mit 35% (Gew./Vol) Ammoniumsulfat gewonnen wurde, diente Reinigungszwecken. Zu der 69 kDa-Fraktion wurde Ammoniumsulfat zu 100 ± 5 g pro Liter hinzugefügt, wonach die Mischung mindestens 2 Stunden lang bei 2ºC bis zu 8ºC gerührt wurde. Das Gemisch wurde bei 7000 · g zur Gewinnung des Überstands abzentrifugiert. Zu dem Überstand wurde das Ammoniumsulfat in einer Menge von 100 bis 150 g pro Liter hinzugefügt, wonach die Mischung mindestens 2 Stunden lang bei 2ºC bis zu 8ºC gerührt wurde. Das Gemisch wurde bei 7000 · g zur Gewinnung des Pellets abzentrifugiert, das in 10 mM Tris und HCl bei einem pH-Wert von 8 aufgelöst wurde. Die Ionenstärke der Lösung wurde auf den äquivalenten Gehalt von 10 mM Tris/HCl, entsprechend pH 8, sowie 15 mM Ammoniumsulfat, eingestellt.
Das Protein mit 69 kDa wurde auf eine Hydroxylapatitsäule verbracht, die tandemartig mit der Q-Sepharose-Säule verbunden war. Das Protein mit 69 kDa aus dem Durchlauf wurde gesammelt und aus den Säulen mit 10 mM Tris/HCl (bei pH 8), enthaltend 15 mM Ammoniumsulfat, ausgespült und mit dem Protein mit 69 kDa im Durchlauf zusammengebracht. Die vereinigten Proteine mit 69 kDa wurden mit 6 bis 10 Volumina von 10 mM Kaliumphosphat (pH 8) mit einem Gehalt an 0,15 M NaCl auf einer NMWL-Membran von 100 bis 300 kDa der Diafiltration unterworfen. Das Ultrafiltrat wurde aufgefangen und das Protein mit 69 kDa in dem Ultrafiltrat angereichert.
Das Protein mit 69 kDa wurde gegen Lösungsmittel in 10 mM Tris/HCl (pH 8) ausgetauscht und an Q-Sepharose adsorbiert sowie mit 10 mM Tris/HCl (pH 8)/5 mM Ammoniumsulfat gewaschen. Das Protein mit 69 kDa wurde mit 50 mM Ammoniumsulfat (pH 8) eluiert und sodann mit 6 bis 10 Volumina an 10 mM Kaliumphosphat (pH 8) mit einem Gehalt an 0,15 M NaCl auf einer NMWL- Membran von 10 bis 30 kDa der Diafiltration unterworfen. Anschließend wurde das Protein mit 69 kDa durch ein Filter von ≤0,22 um (Porenweite) steril filtriert. Diese sterile Charge wurde bei 2ºC bis zu 8ºC aufbewahrt und die Adsorption innerhalb von 3 Monaten durchgeführt.

Fimbrien-Agglutinogen:

Die Agglutinogene wurden aus der Zellpaste im Anschluss an die Abtrennung aus der Nährbrühe gereinigt. Die Zellpaste wurde zu einer Zellfraktion mit 0,05 Volumen in einem Puffer mit einem Gehalt an 10 mM Kaliumphosphat, 150 mM NaCl und 4 M Harnstoff verdünnt und 30 Minuten lang vermischt. Das Zell-Lysat wurde durch Zentrifugieren bei 12 000 · g geklärt, sodann eingeengt und gegen 10 mM Kaliumphosphat/150 mM NaCl/0,1% Triton X-100 unter Verwendung einer NMWL- Filtermembran von 100 bis 300 kDa der Diafiltration unterworfen.
Anschließend wurde das Konzentrat bei 80ºC 30 Minuten lang wärmebehandelt und sodann noch einmal durch Zentrifugieren bei 9000 · g geklärt. Es wurde PEG 8000 zu dem geklärten Überstand bis zu einer endgültigen Konzentration von 4,5% ≤0,2% hinzugegeben und sachte mindestens 30 Minuten lang gerührt. Der so erhaltene Niederschlag wurde durch Zentrifugieren bei 17 000 · g aufgesammelt und das Pellet mit einer Pufferlösung aus 10 mM Kaliumphosphat/150 mM NaCl zur Bereitstellung einer rohen Fimbrien-Agglutinogen-Lösung extrahiert. Die Fimbrien-Agglutinogene wurden durch eine Passage durch PEI-Silika (Siliziumdioxid) gereinigt. Die rohe Lösung wurde im Hinblick auf das Kaliumphosphat unter Verwendung von Puffer aus 1 M Kaliumphosphat auf 100 mM eingestellt und der Passage durch eine Säule mit PEI - Silika unterzogen.
Der Durchlauf aus den Säulen wurde eingeengt und gegen einen Puffer aus 10 mM Kaliumphosphat und 150 mM NaCl unter Verwendung einer NMWL-Filtermembran von 100 bis 300 kDa der Diafiltration unterworfen. Diese sterile Charge wurde bei 2ºC bis zu 8ºC aufbewahrt und die Adsorption innerhalb von 3 Monaten durchgeführt. Das Fimbrien-Agglutinogen-Präparat enthielt Fimbrien- Agg 2 und Fimbrien-Agg 3 in einem Gewichtsverhältnis von etwa 1,5 zu etwa 2 : 1, wobei festzustellen war, dass es im Wesentlichen frei von Agg 1 war.

Beispiel 3:

In diesem Beispiel wird das Toxoidieren der gereinigten Antigene von Bordetella pertussis, sowie von PT und FHA beschrieben.
Das gemäß der Beschreibung in Beispiel 2 in reiner Form gewonnene PT wurde durch das Einstellen der Glutaraldehydkonzentration in der PT enthaltenden Lösung auf 0,5% ± 0,1% und 4- stündiges Inkubieren bei 37ºC toxoidiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von L-Aspartat bis zu 0,21 ± 0,02 M gestoppt. Das Gemisch wurde im Anschluss daran 1 ± 0,1 Stunden lang bei Raumtemperatur gehalten und anschließend 1 bis 7 Tage bei 2ºC bis 8ºC aufbewahrt.
Die so erhaltene Mischung wurde gegen einen Puffer aus 10 mM Kaliumphosphat und 0,15 mM NaCl und 5% Glyzerin unter Verwendung einer NMWL-Filtermembran von 30 kDa der Diafiltration unterworfen und anschließend mittels einer Passage durch ein Filter von ≤0,22 um (Porenweite) sterilisiert. Diese sterile Charge wurde bei 2ºC bis zu 8ºC aufbewahrt und die Adsorption innerhalb von 3 Monaten durchgeführt.
Die gemäß der Beschreibung in Beispiel 2 in reiner Form gewonnene FHA-Fraktion wurde durch das Einstellen der Lysin- und Formaldehydkonzentration auf 47% ± 5 mM bzw. 0,24% ± 0,05% und 6-wöchiges Inkubieren bei 37ºC bis 38ºC toxoidiert. Die so erhaltene Mischung wurde gegen einen Puffer aus 10 mM Kaliumphosphat und 0,5 mM NaCl unter Verwendung einer NMWL-Filtermembran von 30 kDa der Diafiltration unterworfen und anschließend mittels einer Passage durch ein Membranfilter sterilisiert. Diese sterile Charge wurde bei 2ºC bis zu 8ºC aufbewahrt und die Adsorption innerhalb von 3 Monaten durchgeführt.

Beispiel 4:

In diesem Beispiel ist die Adsorption der gereinigten Antigene von Bordetella pertussis beschrieben.
Zur individuellen Adsorption von PT, FHA, Agg und dem Protein mit 69 kDa auf Aluminiumphosphat (Alaun) wurde eine Vorratslösung aus Alumiumphosphat bis auf eine Konzentration von 18,75 ± 1 mg pro ml hergestellt. Es wurde ein geeignetes Gefäß vorbereitet und die einzelnen Antigene in aseptischer Weise in das Gefäß verbracht. Das 2-Phenoxyethanol wurde aseptisch in einer solchen Menge hinzugegeben, dass eine endgültige Konzentration von 0,6% ± 0,1% (Vol./Vol.) erzielt wurde; danach wurde bis zur Homogenität gerührt. Das passende Volumen an Alumiumphosphat wurde aseptisch in das Gefäß eingefüllt. Ebenso wurde ein passendes Volumen an sterilem destillierten Wasser hinzugefügt, um die endgültige Konzentration von 3 mg Aluminiumphosphat pro ml zu erzielen. Die Behälter wurden hermetisch verschlossen und gekennzeichnet, wonach bei Raumtemperatur 4 Tage lang gerührt wurde. Das Gefäß wurde sodann bis zur erwarteten endgültigen Formulierung aufbewahrt.

Beispiel 5:

In diesem Beispiel ist die Formulierung einer Komponentenvakzine gegen Keuchhusten beschrieben, der mit Diphtherie-und Tetanus-Toxoiden kombiniert ist.
Die gemäß der Beschreibung in den vorstehenden Beispielen gewonnenen Antigene aus B. pertussis wurden zur Schaffung verschiedener Komponenten-Pertussis-(CP)-Vakzine mit Diphtherie-und Tetanus-Toxoiden formuliert.
Die Pertussiskomponenten wurden aus Bordetella pertussis produziert, wobei die Kultivierung in Submerskultur gemäß der detaillierten Beschreibung in den oben stehenden Beispielen 1 bis 4 erfolgte. Nach dem Abschluss des Wachstums wurden die Nährbouillon und die Bakterienzellen voneinander durch Abzentrifugieren getrennt. Jedes Antigen wurde jeweils für sich gereinigt. Das Pertussis-Toxin (PT) und das filamentöse Hämagglutinin (FHA) wurden aus der Nährbrühe durch aufeinander folgende Chromatographie über Perlit und Hydroxylapatit gereinigt. Das PT wurde mit Glutaraldehyd entgiftet, wobei jegliches verbleibende PT (annähernd 1%), das in der FHA-Fraktion vorhanden war, mit Formaldehyd entgiftet wurde. Die Fimbrien-Agglutinogene (Agg 2 + 3) wurden aus den Bakterienzellen gewonnen. Die Zellen wurden mit Harnstoff aufgeschlossen und wärmebehandelt, wonach die Fimbrien-Agglutinogene durch Ausfällen mit Polyethylenglykol und Chromatographieren über Polyethylenimin-Silika gereinigt wurden. Die Komponente des Proteins mit 69 kDa (Pertaktin) wurde aus dem Durchlauf, erhalten aus dem Schritt der Perlitchromatographie (Beispiel 2), mittels Ausfällen mit Ammoniumsulfat isoliert und durch aufeinander folgendes Chromatographieren über Hydroxylapatit und Q-Sepharose gereinigt. Sämtliche Komponenten wurden durch Filtration durch ein Membranfilter mit einer Porenweite von 0,22 um sterilisiert.
Das Diphtherie-Toxoid wurde aus Corynebacterium diphtheriae gewonnen, dessen Wachstum in einer Submerskultur mittels standardisierter Verfahren erfolgte. Die Gewinnung des Diphtherie- Toxoids gestaltet sich in 5 Schritten, das heißt Beibehaltung der Ansatzimpfkeime, Kultivierung von Corynebacterium diphtheriae, Abernten von Diphtherie-Toxin, Entgiftung des Diphtherie-Toxins und Anreicherung des Diphtherie-Toxoids.

Herstellung des Diphtherie-Toxoids

(I) Impfkeime für den Ansatz

Der Stamm von Corynebacterium diphtheriae wurde als gefriergetrocknete Impfkeimcharge bereit gehalten. Die rekonstituierten Impfkeime wurden auf der abgeböschten Löffler - Kulturvorrichtung 18 bis 24 Stunden bei 35ºC ± 2ºC dem Wachstum überlassen und anschließend in Flaschen mit einem Diphtherie-Medium überführt. Im Anschluss daran wurde die Kultur auf Reinheit und Gehalt an Lf ausgetestet. Die noch verbliebenen Impfkeime wurden zur Inokulation des Bioreaktors verwendet.

(II) Wachstum von Corynebacterium diphtheriae

Die Kultur wurde bei 35ºC ± 2ºC inkubiert und in dem Bioreaktor gerührt. Zu der Kultur wurden vorherbestimmte Mengen an Lösungen aus Eisen-II-sulfat, Calciumchlorid und Phosphat hinzugefügt. Die tatsächlichen Mengen jeder einzelnen Lösung (Eisen-II-sulfat, Calciumchlorid und Phosphat) wurden experimentell für jede Charge des Mediums bestimmt. Die Anteile wurden so gewählt, dass sie den höchsten Gehalt an Lf ergaben. Am Ende des Wachstumszyklus (30 bis 50 Stunden) wurden den Kulturen Proben zwecks Reinheit und Gehalt an Lf entnommen.
Der pH-Wert wurde mit Natriumhydrogencarbonat eingestellt, wobei die Kultur mit 0,4% Toluol 1 Stunde lang unter Aufrechterhalten einer Temperatur von 35ºC ± 2ºC inaktiviert wurde. Im Anschluss daran wurde ein Sterilitätstest zur Bestätigung der Abwesenheit lebender Zellen von Corynebacterium diphtheriae durchgeführt.

(III) Abernten des Diphtherie-Toxins

Die mit Toluol behandelten Kulturen aus 1 oder mehreren Bioreaktoren wurden in einem großen Tank miteinander vereinigt. Es wurden annähernd 0,12% Natriumcarbonat, 0,25% Aktivkohle und 23% Ammoniumsulfat hinzugegeben und der pH-Wert ausgetestet.
Das Gemisch wurde etwa 30 Minuten lang gerührt. Dann wurde Diatomeenerde hinzugefügt und die Mischung in einen Tiefenfilter gepumpt. Das Filtrat wurde so lange in Umlauf gehalten, bis es klar war, anschließend aufgesammelt und Proben zum Austesten des Gehalts an Lf entnommen. Zu dem Filtrat wurde zusätzlich noch Ammoniumsulfat hinzugefügt, um eine Konzentration von 40% zu erreichen. Es wurde auch noch Diatomeenerde hinzugegeben. Dieses Gemisch wurde 3 bis 4 Tage lang bei 2ºC bis zu 8ºC gehalten, um so dem Niederschlag Gelegenheit zu geben, sich abzusetzen. Das ausgefällte Toxin wurde aufgesammelt und in 0,9%iger Salzlösung aufgelöst. Die Diatomeenerde wurde durch Abfiltrieren entfernt und das Toxin zur Entfernung des Ammoniumsulfats gegen 0,9%ige Salzlösung dialysiert. Die dialysierten Toxine wurden vereinigt und Proben zur Austestung der Reinheit und des Gehalts an Lf entnommen.

(IV) Entgiftung des Diphtherie-Toxins

(Die Entgiftung findet unmittelbar im Anschluss an die Dialyse statt. Das Toxin wird zur Entgiftung in der Weise verdünnt, dass die endgültige Lösung folgende Bestandteile enthält:
Diphtherie-Toxin zu 1000 ± 10% Lf pro ml
0,5% Natriumhydrogencarbonat
0,5% Formalin
0,9% (Gew./Vol.) L-Lysin·Monohydrochlorid.
Die Lösung wurde mit Salzlösung auf das (gewünschte) Volumen gebracht und der pH-Wert auf 7,6 ± 0,1 eingestellt.
Das Toxoid wurde durch Filtereinlagen aus Zellulose und Diatomeenerde und/oder ein Membranvorfilter sowie ein Membranfilter mit (der Porenweite von) 0,2 um in ein Sammelgefäß hinein filtriert und 5 bis 7 Wochen lang bei 34ºC inkubiert. Zur Überprüfung der Toxizität wurde eine Probe gezogen.

(V) Anreicherung des gereinigten Toxoids

Die Toxoide wurden miteinander vereinigt und anschließend durch Ultrafiltration angereichert, wonach sie in einem passenden Behälter aufgesammelt wurden. Es wurden Proben zur Austestung der Reinheit und des Gehalts an Lf entnommen. Das Konservierungsmittel in Form des 2-Phenoxyethanols wurde zum Erzielen einer endgültigen Konzentration von 0,375% hinzugegeben und der pH- Wert auf 6,6 bis 7,6 eingestellt.
Das Toxoid wurde mittels Filtrieren durch ein Vorfilter und ein Membranfilter (der Porenweite) von 0,2 um (oder einer gleichwertigen Filtervorrichtung) hindurch sterilisiert und sodann aufgesammelt. Das sterile Toxoid wurde anschließend anhand von Proben auf eine Irreversibilität des Gehalts an Toxoid-Lf, Konservierungsmittel, Reinheit (Stickstoffgehalt), Sterilität und Toxizität hin überprüft. Das sterile, angereicherte Toxoid wurde bis zur fertigen Formulierung bei 2ºC bis zu 8ºC gelagert.

Herstellung des Tetanus-Toxoids

Das Tetanus-Toxoid (T) wurde aus Clostridium tetani, das durch eine Submerskultur vermehrt wurde, gewonnen.
Die Gewinnung des Tetanus-Toxoids gestaltet sich in 5 Schritten, das heißt Bereithalten der Ansatzimpfkeime, Kultivierung von Clostridium tetani, Abernten von Tetanus-Toxin, Entgiftung des Tetanus-Toxins und Reinigung des Tetanus-Toxoids.

(I) Impfkeime für den Ansatz

Der Stamm von Clostridium tetani, der zur Gewinnung des Tetanus-Toxins zur Umwandlung in das Tetanus-Toxoid verwendet wurde, wurde in gefriergetrockneter Form als eine Charge von Impfkeimen bereit gehalten. Die Impfkeime wurden in ein Medium aus Thioglykolat inokuliert, wobei sie annähernd 24 Stunden lang bei 35ºC ± 2ºC dem Wachstum überlassen wurden. Zum Austesten der Reinheit der Kultur wurde eine Probe genommen.

(II) Wachstum von Clostridium tetani

Das Tetanusmedium wurde in einen Bioreaktor hinein dispensiert, wärmebehandelt und anschließend abgekühlt. Im Anschluss daran wurde der Bioreaktor beimpft, wobei die Kultur 4 bis 9 Tage lang bei 34ºC ± 2ºC dem Wachstum überlassen wurde. Zum Austesten der Reinheit der Kultur und des Gehalts an Lf wurde eine Probe genommen.

(III) Abernten von Tetanus-Toxin

Das Toxin wurde durch Filtereinlagen aus Zellulose und Diatomeenerde abgetrennt und das geklärte Toxin unter Einsatz von Membranfiltern filtersterilisiert. Es wurden zum Austesten der Sterilität und des Gehalts an Lf Proben genommen. Das Toxin wurde durch Ultrafiltration unter Einsatz einer Porengröße von 30 000 Dalton angereichert.

(IV) Entgiften des Tetanus-Toxins

Vor der Entgiftung wurden zum Austesten des Gehalts an Lf Proben genommen. Das angereicherte Toxin (475 bis 525 Lf pro ml) wurde durch den Zusatz einer 0,5%igen (Gew./Vol.) Natriumhydrogencarbonat-, 0,3%igen (Vol./Vol.) Formalin- und einer 0,9%igen (Gew./Vol.) L-Lysin·Monohydrochloridlösung entgiftet, wonach mit Salzlösung auf das (gewünschte) Volumen ergänzt wurde.
Der pH-Wert wurde auf 7,5 ± 0,1 eingestellt und die Mischung bei 37ºC 20 bis 30 Tage lang inkubiert. Zur Überprüfung der Sterilität und Toxizität wurden Proben gezogen.

(V) Reinigung des Toxoids

Das angereicherte Toxoid wurde (mittels Filtrieren) durch Vorfilter hindurch sterilisiert, wonach sich die Sterilisierung mittels Membranfilter von 0,2 um anschloss. Zur Überprüfung der Sterilität und des Gehalts an Lf wurden Proben gezogen.
Die optimale Konzentration an Ammoniumsulfat stützte sich auf die Fraktionierungskurve "S", die an Hand der Toxoidproben ermittelt wurde. Die erste Konzentration wurde zu dem Toxoid in einer Verdünnung von 1900 bis 2100 Lf pro ml hinzugefügt. Das Gemisch wurde wenigstens 1 Stunde lang bei 20ºC bis 25ºC gehalten und der Überstand gewonnen, wobei der Niederschlag mit einem Gehalt an der Fraktion mit hohem Molekulargewicht beiseite gestellt wurde.
Eine zweite Konzentration von Ammoniumsulfat wurde zu dem Überstand für die zweite Fraktionierung hinzugefügt, um die Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen. Das Gemisch wurde mindestens 2 Stunden lang bei 20ºC bis 25ºC gehalten und konnte anschließend für maximal 3 Tage bei 2ºC bis 8ºC gehalten werden. Der Niederschlag, der das gereinigte Toxoid darstellte, wurde durch Abzentrifugieren und Filtrieren gewonnen.
Das Ammoniumsulfat wurde unter Verwendung von Ultrafiltrationsmembranen Amicon (oder gleichwertiger Membranen) mit PBS so lange durch Diafiltration aus dem gereinigten Toxoid entfernt, bis in der Toxoidlösung kein Ammoniumsulfat mehr gefunden werden konnte. Der pH-Wert wurde auf 6,6 bis 7,6 eingestellt, wobei das 2-Phenoxyethanol zur Erzielung einer Endkonzentration von 0,375 % hinzugefügt wurde. Das Toxoid wurde durch Membranfiltration sterilisiert, wonach anhand von Proben die Irreversibilität des Gehalts an Toxoid, an Lf, der pH-Wert, Gehalt an Konservierungsmittel, die Reinheit, Sterilität und Toxizität überprüft wurden.
Eine Formulierung eines Komponentenimpfstoffes gegen Keuchhusten, der mit Diphtherie- und Tetanustoxoiden kombiniert war, wurde mit CP10/5/5/3DT bezeichnet. Jede Einzeldosis von 0,5 ml CP10/5/5/3DT für Patienten wurde mit einem jeweiligen Gehalt formuliert wie folgt:
10 ug Pertussis-Toxoid (PT)
5 ug filamentöses Hämagglutinin (FHA)
5 ug Fimbrien-Agglutinogene 2 und 3 (FIMB)
3 ug Protein aus der äußeren Membran mit 69 kDa
15 Lf Diphtherie-Toxoid
5 Lf Tetanus-Toxoid
1,5 mg Aluminiumphosphat
0,6% 2-Phenoxyethanol als Konservierungsmittel
Eine weitere Formulierung eines Komponentenimpfstoffes gegen Keuchhusten, der mit Diphtherie- und Tetanustoxoiden kombiniert war, wurde mit CP10/5/5DT bezeichnet. Jede Einzeldosis von 0,5 ml CP10/5/5DT für Patienten wurde mit einem jeweiligen Gehalt formuliert wie folgt:
10 ug Pertussis-Toxoid (PT)
5 ug filamentöses Hämagglutinin (FHA)
5 ug Fimbrien-Agglutinogene 2 und 3 (FIMB)
15 Lf Diphtherie-Toxoid
5 Lf Tetanus-Toxoid
1,5 mg Aluminiumphosphat
0,6% 2-Phenoxyethanol als Konservierungsmittel
Eine weitere Formulierung eines Komponentenimpfstoffes gegen Keuchhusten, der mit Diphtherie- und Tetanustoxoiden kombiniert war, wurde mit CP20/20/5/3DT bezeichnet. Jede Einzeldosis von 0,5 ml CP20/20/5/3DT für Patienten wurde mit einem jeweiligen Gehalt formuliert wie folgt:
20 ug Pertussis-Toxoid (PT)
20 ug filamentöses Hämagglutinin (FHA)
5 ug Fimbrien-Agglutinogene 2 und 3 (FIMB)
3 ug Protein aus der äußeren Membran mit 69 kDa
15 Lf Diphtherie-Toxoid
5 Lf Tetanus-Toxoid
1,5 mg Aluminiumphosphat
0,6% 2-Phenoxyethanol als Konservierungsmittel
Eine weitere Formulierung eines Komponentenimpfstoffes gegen Keuchhusten, der mit Diphtherie- und Tetanustoxoiden kombiniert war, wurde mit CP20/10/10/6DT bezeichnet. Jede Einzeldosis von 0,5 ml CP20/10/10/6DT für Patienten wurde mit einem jeweiligen Gehalt formuliert wie folgt:
20 ug Pertussis-Toxoid (PT)
10 ug filamentöses Hämagglutinin (FHA)
10 ug Fimbrien-Agglutinogene 2 und 3 (FIMB)
6 ug Protein aus der äußeren Membran mit 69 kDa
15 Lf Diphtherie-Toxoid
5 Lf Tetanus-Toxoid
1,5 mg Aluminiumphosphat
0,6% 2-Phenoxyethanol als Konservierungsmittel

Beispiel 6:

In diesem Beispiel wird die klinische Bewertung der nichtzellulären Komponentenimpfstoffe gegen Keuchhusten beschrieben, wie er in Einklang mit der Erfindung produziert wird.

(a) Studien bei Erwachsenen:

Die Studien bei Erwachsenen und Kindern im Alter von 16 bis 20 Monaten in Calgary und Alberta zeigten, dass die Mehrfachkomponentenimpfstoffe mit einem Gehalt an Fimbrien-Agglutinogenen sowohl sicher und als auch immunogen sind (Tabelle 2).
Eine klinische Studie in der Phase I wurde bei Kindern im Alter von 17 und 18 Monaten in Calgary und Alberta mit dem 5-Komponentenimpfstoff (CP10/5/5/3DT) durchgeführt und über die negative Reaktion berichtet. 33 Kinder erhielten den Impfstoff, wobei zusätzlich noch 35 den gleichen Impfstoff, jedoch ohne die Proteinkomponente mit 69 kDa erhielten.
Die lokalen Reaktionen waren selten. Systemische, negative Reaktionen, die in erster Linie aus Irritationen bestanden, waren bei annähernd der Hälfte der Studienteilnehmer zu verzeichnen, unabhängig davon, welcher Impfstoff appliziert war. Anhand eines enzymatischen immunologischen Testverfahrens wurde ein jeweils signifikanter Anstieg der Antikörper(titer) im Hinblick auf anti-PT-, anti- FHA-, anti-Fimbrien-Agglutinogen- sowie anti-69 kDa IgG-Antikörper und anti-PT-Antikörper beim CHO-Zellneutralisationstest gemessen. Keine Unterschiede bei der Antikörperantwort wurden bei den Kindern festgestellt, welche den 4-Komponentenimpfstoff (CP10/5/5DT) oder 5-Komponentenimpfstoff (CP10/5/5/3DT) erhalten hatten, jedoch mit Ausnahme bezüglich des anti-69kDa-Antikörpers. Die Kinder, welche den 5-Komponentenimpfstoff mit einem Gehalt an dem Protein mit 69 kDa erhalten hatten, zeigten nach der Immunisierung einen signifikant höheren Titer des anti-69 kDa- Antikörpers.
Eine Dosis-Antwort-Studie mit dem 4-Komponenten-Impfstoff wurde in Winnipeg, Manitoba und Kanada durchgeführt. Dabei wurden folgende 2 Formulierungen an Komponentenimpfstoffen verwendet: CP10/5/5/3DT und CP20/10/10/6DT. Ein DPT-Impfstoff aus ganzen Zellen wurde zum Vergleich noch mit eingeschlossen.
Diese Studie war eine Doppelblindstudie bei 91 Kindern im Alter von 17 bis 18 Monaten zum Zeitpunkt der Dosis für den Booster-Effekt (Auffrischung). Sowohl CP10/5/5/3DT als auch CP 20/10/10/6DT wurden bei diesen Kindern gut toleriert. Bei der Anzahl von Kindern, die irgendwelche lokale oder systemische Reaktionen nach der Applikation eines dieser Impfstoffe hatten, wurden keine Unterschiede demonstriert. Im Gegensatz dazu wiesen signifikant mehr Kinder, welche den Impfstoff aus ganzen Zellen erhalten hatten, lokale und systemische Reaktionen auf als solche, welche den Komponentenimpfstoff CP20/10/10/6DT erhalten hatten.

(b) Studien bei Kindern:

Phase II:

Es wurde eine Studie in Calgary, Alberta und Britisch Kolumbien unter Einsatz des Impfstoffes CP10/5/5/3DT durchgeführt. 432 Kinder erhielten den Komponentenimpfstoff gegen Keuchhusten oder den Impfstoff DPT aus ganzen Zellen im Alter von 2, 4 und 6 Monaten. Der Impfstoff CP10/5/5/3 DT wurde von diesen Kindern gut toleriert. Die lokalen Reaktionen waren nach jeder Dosis im Hinblick auf den Komponentenimpfstoff im Vergleich zum Impfstoff DPT aus ganzen Zellen weniger häufig.
Nach der Impfung mit dem Komponentenimpfstoff gegen Keuchhusten wurde eine signifikante Antikörperantwort demonstriert. Die Empfänger des Impfstoffs aus ganzen Zellen zeigten eine heftige Antikörperantwort auf die Fimbrien-Agglutinogene im Hinblick auf D und T. Bei 7 Monaten wiesen 82% bis 89% der Empfänger des Komponentenimpfstoffs und 92% der Empfänger des Impfstoffs aus ganzen Zellen eine 4-fache Steigerung oder sogar einen noch größeren Anstieg des Antikörpertiters gegenüber Fimbrien-Agglutinogenen auf. Im Gegensatz dazu betrug die Antikörperantwort gegenüber FHA 75% bis 78% im Hinblick auf die Empfänger der Komponentenimpfstoffe im Vergleich zu 31% Empfänger des Impfstoffs aus ganzen Zellen. Es war ein 4-faches Ansteigen des anti-69 kDa-Protein-Antikörpers bei 90 bis 93% der Empfänger der Komponentenimpfstoffe und 75% der Empfänger des Impfstoffs aus ganzen Zellen zu beobachten. Ein 4-facher Anstieg des Antikörpertiters gegenüber PT mittels eines enzymatischen immunologischen Testverfahrens war bei 40% bis 49% im Hinblick auf die Komponentenimpfstoffe und 32% der Impfstoffe aus ganzen Zellen zu verzeichnen; es stellte sich ein 4-faches Ansteigen der PT-Antikörper durch die Neutralisation in Bezug auf CHO bei 55% bis 69% der Komponentenimpfstoffe und 6% der Impfstoffe aus ganzen Zellen heraus (Tabelle 2).

Phase IIB:

Die Impfstoffe CP20/20/5/3DT und CP10/10/5/3DT wurden in einer randomisierten Blindstudie an 100 Kindern im Alter von 2, 4 und 6 Monaten gegen einen Vergleich mit D&sub1;&sub5;PT mit einem niedrigeren Diphtheriegehalt von 15 Lf, verglichen mit einer Formulierung mit 25 Lf, bewertet. Es wurden keine Unterschiede bei den negativen Reaktionen zwischen den beiden Formulierungen festgestellt; beide riefen in signifikanter Weise weniger Reaktionen hervor als beim Vergleich mit dem beide riefen in signifikanter Weise weniger Reaktionen hervor als beim Vergleich mit dem Impfstoff aus ganzen Zellen. Bei den Empfängern des Impfstoffes CP20/20/5/3DT mit einem erhöhten Gehalt an Antigenen wurden an Hand des enzymatischen immunologischen Testverfahrens und der Neutralisation in Bezug auf CHO und FHA höhere Antikörpertiter gegenüber PT erzielt. Bei 7 Monaten betrug der geometrische anti-FHA-Titer 95,0 bei den Empfängern von CP20/20/5/3DT, 45,2 bei den Empfängern von CP10/5/5/3DT und lediglich 8, 9 bei den Empfängern von D&sub1;&sub5;PT. Die anti-PT-Titer betrugen 133,3, 58,4 und 10,4 auf Basis des immunologischen Testverfahrens bzw. 82,4, 32,7 und 4,0 auf Basis der CHO-Neutralisation (Tabelle 2).
Diese Studie zeigte auf, dass der Komponentenimpfstoff gegen Keuchhusten in Kombination mit adsorbierten Diphtherie- und Tetanus-Toxoiden mit einem erhöhten Gehalt an Antigenen, bei Kindern sicher und immunogen war; ferner, dass der höhere Gehalt an Antigenen die Immunantwort gegenüber den zubereiteten Antigenen (PT und FHA) ohne das Ansteigen der Reaktionsbereitschaft steigerte.

NIAID, Phase II, US - Vergleichsversuch:

In den Vereinigten Staaten wurde eine Studie in der Phase II unter der Schirmherrschaft des National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) im Vorgriff zu einem Versuch zur Wirksamkeit von nichtzellulären Impfstoffen in großem Maßstab durchgeführt. Es wurde ein Komponentenimpfstoff gegen Keuchhusten gemäß der Erfindung in Kombination mit adsorbierten Diphtherie- und Tetanus-Toxoiden (CP10/5/5/3DT) in jenen Versuch zusammen mit 12 anderen nichtzellulären Impfstoffen und 2 Impfstoffen aus ganzen Zellen einbezogen. Es wurde über Ergebnisse der Sicherheit bei 137 Kinder berichtet, die im Alter von 2, 4 und 6 Monaten mit dem Komponentenimpfstoff CP 10/5/5/3DT immunisiert worden waren.
Wie schon aus früheren Studien ersichtlich ist, wurde festgestellt, dass der Komponentenimpfstoff sicher ist, eine niedrige Reaktionsbereitschaft aufweist und von den Impflingen gut vertragen wird.
Im Hinblick auf 7 Monate waren sämtliche Titer der anti-PT-, anti-FHA-, anti-69kDa- und anti- Fimbrien-Agglutinogen-Antikörper im Vergleich zu den Titern, die sich nach Applikation der Impfstoffe aus ganzen Zellen erzielen ließen, höher oder gleichwertig (Lit. 71 und Tabelle 2). Es wurde eine Doppelblindstudie durchgeführt, wonach die Kinder randomisiert so eingeteilt wurden, dass sie entweder die Formulierung des Impfstoffes CP20/20/5/3DT oder CP10/5/5/3DT erhielten. Insgesamt 2050 Kinder waren in den Vereinigten Staaten und Kanada eingetragen; mit 1961 Kindern wurde die Studie abgeschlossen. Beide Formulierungen des Impfstoffes waren sicher, wiesen eine geringe Reaktiogenizität auf und waren bei diesen Kindern immunogen. An einer Untergruppe von 292 Kindern wurde die Immunogenizität bestimmt. Gegenüber sämtlichen in dem Impfstoff enthaltenen Antigenen wurde eine Antikörperantwort durch beide Impfstoff-Formulierungen provoziert. Es provozierte die Formulierung CP20/20/5/3DT höhere Antikörpertiter gegenüber FHA aber nicht PT. Die Formulierung CP10/5/5/3DT provozierte höhere Titer gegenüber Fimbrien sowie höhere Agglutinogentiter.
Des Weiteren wurde in Frankreich eine Studie zur Sicherheit und Immunogenizität durchgeführt. Der Aufbau der Studie war mit jenem der oben stehend beschriebenen nordamerikanischen Studie vergleichbar, jedoch mit der Ausnahme, dass die Impfstoffe im Alter von 2, 3 und 4 Monaten verabreicht wurden. Die lokalen und systemischen Reaktionen waren im allgemeinen geringfügig. Der Impfstoff war von den französischen Teilnehmern der Studie überall gut unter Anwendung der Applikationsweise akzeptiert worden.

Versuch zur placebokontrollierten Wirksamkeit von 2 nichtzellulären Impfstoffen gegen Keuchhusten und eines Impfstoffes aus ganzen Zellen bei 10 000 Kindern

Im Gefolge der Ergebnisse aus der Phase II des NIAID-Vergleichsversuches in den Vereinigten Staaten wurden ein nichtzellulärer 2-Komponenten- und ein 5-Komponenten-Impfstoff für einen multizentrischen kontrollierten, doppelt randomisierten und placebokontrollierten Versuch zur Wirksamkeit ausgewählt. Der klinische Versuch wurde in Schweden durchgeführt, wo ein starkes Auftreten von Keuchhusten zu verzeichnen ist. Der 2-Komponenten-Impfstoff enthielt mit Glyzerinaldehyd und Formalin inaktiviertes PT (25 ug), mit Formalin behandeltes FHA (25 ug) und Diphtherie-Toxoid (17 Lf) sowie Tetanus-Toxoid (10 Lf). Der 5-Komponenten-Keuchhusten-Impfstoff lag in Form von CP10/5/5/3DT vor. Für den Versuch wurden 10 000 Kinder, die annähernd die Hälfte der Kinder dieser Altersgruppe in Schweden repräsentieren, an 14 geographisch definierten Gegenden bzw. Orten unter Anwendung des Geburtsregisters rekrutiert.
Die im Januar und Februar 1992 geborenen Kinder wurden in einem dreigliedrigen Versuch randomisiert. Nach der elterlichen Zustimmung erhielten zwei Drittel der Kinder eines der 2 nichtzellulären Diphtherie-Tetanus-Pertussis-Präparate im Alter von 2, 4 und 6 Monaten. Die Vergleichsgruppe erhielt lediglich DT. Im Mai 1992 wurde ein in den Vereinigten Staaten zugelassener, im Handel erhältlicher DTP-Impfstoff aus ganzen Zellen eingeführt, wobei die zwischen März und Dezember 1992 geborenen Kinder in einem viergliedrigen Versuch randomisiert wurden. Nach der elterlichen Zustimmung erhielten drei Viertel der Kinder eines von 3 Diphtherie-Tetanus- Pertussis-(DPT)-Präparaten im Alter von 2, 4 und 6 Monaten. Die Vergleichsgruppe erhielt lediglich DT. Jeder Impfstoff wurde an etwa 2500 Kinder verabreicht. Die Impfstoffe wurden in 3 Dosen verabreicht. Die erste Dosis wurde im Alter von 2 Monaten und nicht später als im Alter von 3 Monaten appliziert. Die darauf folgenden Dosen wurden im Abstand von 8 Wochen gegeben. Die Impfstoffe wurden durch intramuskuläre Injektion appliziert.
Die Kinder samt den dazu gehörigen Haushalten wurden 30 Monate lang beobachtet. Im Falle des Verdachts von Pertussis wurden klinische Daten erfasst und danach getrachtet, die Laborüberprüfung an Hand von nasal aspirierten Sekreten vorzunehmen, um eine Bakterienkultur anzulegen und mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eine Diagnose zu stellen. Für die serologische Diagnose wurden Blutproben akut Erkrankter und Genesender gesammelt.
In der Zeit vor dieser Studie war das Ausmaß von Pertaktin, das durch die Komponentenimpfstoffe gegen Keuchhusten gemäß der vorliegenden Erfindung den Bevölkerungskreisen mit einem Risiko (insbesondere Neugeborenen) beigesteuert wurde, nicht bekannt. Insbesondere war der Beitrag verschiedener Bordetella-Komponenten zur Wirksamkeit der Impfstoffe und (in diesem Zusammenhang auch) deren Vorhandensein in Pertussisvakzinen in ausgewählten relativen Mengen nicht bekannt.
Das Hauptziel des Versuches war die Abschätzung der Fähigkeit der nichtzellulären Impfstoffe gegen Keuchhusten und des Impfstoffes aus ganzen Zellen, einen Schutz gegen einen typischen Keuchhusten im Vergleich zu Placebo zu bewirken.
In zweiter Linie bestand ein Endziel darin, die Wirksamkeit des Impfstoffes gegen eine bestätigte Infektion unterschiedlichen Schweregrads zu erforschen.
Die Wirksamkeit des Impfstoffes wird als die Verminderung der Ansteckungswahrscheinlichkeit für Keuchhusten unter den Impflingen in Prozent im Verhältnis zu nicht geimpften Kindern definiert. Das relative Keuchhustenrisiko in beiden Impfgruppen wird als das Verhältnis der Erkrankungswahrscheinlichkeit in den beiden Gruppen ausgedrückt.
Die Ansteckungswahrscheinlichkeit für Keuchhusten, auch Erkrankungsrate genannt, lässt sich auf verschiedene Art und Weise abschätzen. Bei der Berechnung des Probenumfangs wird die Ansteckungswahrscheinlichkeit für Keuchhusten in einer vorgegebenen Studiengruppe anhand des Quotienten zwischen der Anzahl der Kinder mit Keuchhusten und den Kindern berechnet, welche nach Beendigung der Studie in dem Kollektiv der Gruppe verblieben waren.
Die Wirksamkeit des Komponentenimpfstoffes CP10/5/5/3DT bei dieser Studie zur Verhütung von typischem Keuchhusten ist in der Tabelle 4 aufgezeigt; sie betrug etwa 85%. In dem gleichen Versuch war der nichtzelluläre 2-Komponentenimpfstoff mit einem Gehalt an lediglich PT und FHA etwa zu 58% wirksam, und der Impfstoff aus ganzen Zellen war etwa zu 48% wirksam. Das Impfstoffpräparat CP10/5/5/3DT war bei der Verhütung eines milden Keuchhustens bei einer geschätzten Wirkung von etwa 77% ebenfalls effizient.

ZUSAMMENFASSUNG DER OFFENBARUNG

Zusammengefasst lässt sich anhand der Offenbarung sagen, dass durch die vorliegende Erfindung neue Präparate von Fimbrien-Agglutinogenen aus Bordetella pertussis und Verfahren zu deren Herstellung geschaffen werden. Die Fimbrien-Agglutinogene lassen sich mit anderen Bordetella-Antigenen und solchen, die von Bordetella verschieden sind, zur Herstellung einer Anzahl von Mehrfachkomponentenimpfstoffen gegen Keuchhusten formulieren. Derartige Impfstoffe sind bei Menschen sicher, ohne Reaktiogenizität, wie auch immunogen und protektiv. Tabelle 1 Nichtzelluläre Pertussis-(Keuchhusten)Impfstoffe
aInaktiviertes Wasserstoffperoxid
bMassachusetts Public Health Laboratories
cTNM, inaktiviertes Tetranitromethan
dGI, inaktiviertes Glutaraldehyd
eFI, inaktiviertes Formalin
fCentre for Applied Microbiology and Research Tabelle 2 Antworten der IgG-Antikörper auf Keuchhusten-Antigen und Diphtherie- und Tetanus- Toxoide bei Erwachsenen und kleinen Kindern nach der Impfung mit Placebo oder nichtzellulären Pertussis-(AP), Diphtherie-Tetanus-Pertussis- (DPT) oder nichtzellulären Mehrfachkomponenten DTP-(ADTP)-Toxoiden:
Die Werte sind in Form des geometrischen Durchschnitts mit den Vertrauensgrenzen zu 95% ausgedrückt. Im Hinblick auf das Pertussis-Toxoid, das filamentöse Hämagglutinin, die Agglutinogene, das Pertaktin und die Diphtherie- und Tetanus-Toxoide sind die Antikörper-Titer in Form der ELISA-Einheiten pro nL ausgedrückt. In Bezug auf das CHO-Zell-Neutralisierungsverfahren geben die Werte die reziproken Daten der höchsten Verdünnung unter Demonstration der 80%igen Neutralisierung an. Tabelle 3 Serologische Ergebnisse von nichtzellulären Pertussis-Impfstoffen bei Kindern im Alter von 2, 4 und 6 Monaten
CLI: Connaught Laboratories Incorporated, Swiftwater, Pennsylvania
CLL: Connaught Laboratories Limited, Willowdale, Ontario
Mass.: Massachusetts Public Laboratories
Lederle: Lederle Laboratories Tabelle 4 Wirksamkeit der nichtzellulären Impfstoffe gegen Keuchhusten (Pertussis)
A: Falldefinition: 21 Tage spastischer Husten und positive Kultur
B: Falldefinition: mindestens 1 Tag leichter Keuchhusten
Anmerkung 1: Vertrauensgrenzen
Anmerkung 2: Impfstoff gegen Keuchhusten aus ganzen Zellen

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Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Agglutinogenpräparats mit einem Gehalt an Fimbrien- Agglutinogen 2 (Agg 2) und Fimbrien-Agglutinogen 3 (Agg 3), das im Wesentlichen frei ist von Agglutinogen 1, aus einem Bordetella pertussis-Stamm unter Einbeziehung der folgenden Schritte:

(a) Bereitstellen einer Zellpaste aus dem Bordetella pertussis-Stamm;

(b) Extrahieren von Fimbrien-Agglutinogenen 2 und 3 aus der Zellpaste in selektiver Weise mittels Dispergieren der Zellpaste in einem Puffer mit einem Gehalt an 1 Mol bis 6 Mol Harnstoff zum Erzeugen eines ersten Überstandes, der die Agglutinogene 2 und 3 enthält, sowie eines ersten Niederschlags (Präzipitat/Ausfällung) als Rückstand;

(c) Abtrennen des ersten Überstandes vom ersten Rückstandsniederschlag;

(d) Inkubation des ersten Überstandes bei einer Temperatur von 75ºC bis 85ºC, zum Beispiel bei 80ºC für eine Zeitdauer von 10 Minuten bis zu 60 Minuten, beispielsweise 30 Minuten zum Erzeugen eines geklärten Überstandes mit einem Gehalt an den Fimbrien-Agglutinogenen 2 und 3 sowie eines zweiten Niederschlags mit einem Gehalt an Verunreinigungen aus Agglutinogen, das nicht aus Fimbrien (Flimmerhärchen) stammt.

(e) Einengen des geklärten Überstandes zum Erzeugen einer rohen Lösung aus Fimbrien- Agglutinogen mittels Ausfällung der Fimbrien-Agglutinogene 2 und 3 aus dem geklärten Überstand durch den Zusatz eines Polyethylenglykols zu dem geklärten Überstand, Abtrennen der ausgefällten Fimbrien-Agglutinogene 2 und 3 aus dem so gewonnenen Überstand und Solubilisierung der abgetrennten Fimbrien-Agglutinogene 2 und 3 sowie

(f) Reinigen der Fimbrien-Agglutinogene 2 und 3 aus der rohen Lösung aus Fimbrien- Agglutinogen zum Erzeugen des Präparats auf Basis von Fimbrien-Agglutinogen, enthaltend die Fimbrien-Agglutinogene 2 und 3.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der erste Überstand vor dem Inkubationsschritt (d) eingeengt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Fällung (Präzipitierung) durch den Zusatz von Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von 8000 zu dem geklärten Überstand in einer Konzentration von 3 Gewichtsprozent bis 5 Gewichtsprozent zum Erzielen der Präzipitierung (Fällung/Niederschlag) der Agglutinogene aus dem geklärten Überstand bewirkt wird, wobei optional die Konzentration des Polyethylenglykols 4,3 bis 4,7 Gewichtsprozent beträgt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Agglutinogene aus der rohen Lösung aus Fimbrien-Agglutinogen mittels Säulenchromatographie gereinigt werden.

5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die Säulenchromatographie Sephadex 6B und/oder die Säulenchromatographie mit PEI/Siliziumdioxid mit einschließt.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, bei dem der Reinigungsschritt die Sterilisation eines Durchlaufs aus der Säulenchromatographie-Reinigung mit einschließt, um ein steriles Präparat aus Fimbrien-Agglutinogen bereitzustellen, wobei vorzugsweise das sterile Präparat aus Fimbrien- Agglutinogen auf einem Adjuvans aus Mineralsalz, zum Beispiel Alaun, absorbiert wird.

7. Präparat aus Fimbrien-Agglutinogen, das aus einem Bordetella pertussis -Stamm stammt, wobei das Präparat Fimbrien-Agglutinogen 2 (Agg 2) und Fimbrien-Agglutinogen 3 (Agg 3) aufweist und im Wesentlichen frei von Agglutinogen 1 ist.

8. Präparat nach Anspruch 7, bei dem das Gewichtsverhältnis von Agg 2 zu Agg 3 von 1,5 : 1 bis 2 : 1 beträgt.

9. Immunogene Zusammensetzung mit einem Gehalt an einem Agglutinogenpräparat nach Anspruch 6 oder 7.

10. Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 9, die als Impfstoff für die in vivo- Applikation zum Schutze eines Empfängers zur Immunisierung mit diesem Impfstoff gegen eine Erkrankung formuliert ist, die von Bordetella hervorgerufen wird, wobei je nach Wunsch noch mindestens ein anderes Bordetella-Antigen darin enthalten sein kann.

11. Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 10, worin mindestens noch ein anderes Bordetella-Antigen enthalten ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus filamentösem Hämagglutinin, dem Protein aus der äußeren Membran mit 69 kDa, Adenylatcyclase, Bordetella-Lipo- Oligosaccharid, Proteinen aus der äußeren Membran und Pertussis-Toxin oder Toxoiden daraus besteht.

12. Immunogene Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 11 mit einem Gehalt an Pertussis-Toxoid, filamentösem Hämagglutinin und Fimbrien-Agglutinogenen von B. pertussis in einem Gewichtsverhältnis von 2 : 1 : 1.

13. Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 12, worin das genannte Gewichtsverhältnis durch 10 ug Pertussis-Toxoid, 5 ug filamentöses Hämagglutinin und 5 ug Fimbrien-Agglutinogene in einer einfachen Dosis für den Humanpatienten erzielt ist.

14. Immunogene Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 11 mit einem Gehalt an Pertussis-Toxoid, filamentösem Hämagglutinin, Fimbrien-Agglutinogenen, und dem Protein aus der äußeren Membran mit 69 kDa von B. pertussis in einem Gewichtsverhältnis von 10 : 5 : 5 : 3.

15. Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 14, worin das genannte Gewichtsverhältnis durch 10 ug Pertussis-Toxoid, 5 ug filamentöses Hämagglutinin, 5 ug Fimbrien-Agglutinogene und 3 ug des 69 kDa-Proteins in einer einfachen Dosis für Humanpatienten erzielt ist.

16. Immunogene Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 11 mit einem Gehalt an Pertussis-Toxoid, filamentösem Hämagglutinin, Fimbrien-Agglutinogenen und dem Protein mit 69 kDa von B. pertussis in einem Gewichtsverhältnis von 20 : 20 : 5 : 3.

17. Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 16, worin das genannte Gewichtsverhältnis durch 20 ug Pertussis-Toxoid, 20 ug filamentöses Hämagglutinin, 5 ug Fimbrien-Agglutinogen und 3 ug Protein mit 69 kDa in einer einfachen Dosis für Humanpatienten erzielt ist.

18. Immunogene Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 16, die ferner noch mindestens ein Nicht-Bordetella-Immunogen mit umfasst, wobei vorzugsweise das Nicht-Bordetella- Immunogen darin aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem Diphtherie-Toxoid, dem Tetanus- Toxoid, dem Kapselpolysaccharid von Hämophilus, dem Protein aus der äußeren Membran von Hämophilus, dem Oberflächenantigen (der Erreger) von Hepatitis B, Polio, Mumps, Masern und Rubella besteht.

19. Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 14 oder 16, die ferner noch ein Diphtherie-Toxoid in einer Menge von 15 Lfs (limit flocculation units) und ein Tetanus-Toxoid in einer Menge von 5 Lfs in einer Dosis für Humanpatienten enthält.

20. Immunogene Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 19, die ferner noch ein Adjuvans mit umfasst.

21. Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 20, worin das Adjuvans aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Aluminiumphosphat, Aluminiumhydroxid, Quil A, QS 21, Calciumphosphat, Calciumhydroxid, Zinkhydroxid, einem Analogon von Glykolipiden, einem Octodecylester aus einer Aminosäure und einem Lipoprotein besteht.

22. Verwendung eines Agglutinogen-Präparats nach Anspruch 7 oder 8 bei der Herstellung einer Impfstoff(Vakzine)zusammensetzung.