CN105106947A - 过氧化氢脱毒的无细胞百日咳疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种无细胞百日咳疫苗，其包含百日咳鲍特氏杆菌(Bordetella？pertussis)液体培养物上清部分的PT抗原和FHA抗原以及百日咳鲍特氏杆菌液体培养物菌体部分的PRN抗原。其中所述PT抗原和FHA抗原采用过氧化氢作为脱毒剂，甘油作为抗聚集剂，尿素作为保护剂进行脱毒。脱毒后的百日咳原液具有良好的免疫原性，且无对人体有害物质残留，具有良好的免疫原性和更广谱的抗原性。本发明还涉及上述无细胞百日咳疫苗的制备方法，以及包含上述无细胞百日咳疫苗的联合疫苗的制备方法。

Description

过氧化氢脱毒的无细胞百日咳疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种百日咳疫苗的脱毒方法，具体涉及一种采用过氧化氢脱毒无细胞百日咳疫苗抗原的方法，本发明还涉及采用过氧化氢脱毒的无细胞百日咳疫苗及其制备方法。

背景技术

百日咳(pertussis)是由百日咳鲍特氏杆菌(Bordetellapertussis)引起的一种具有高度传染性的严重急性呼吸道传染病，传染性较强，人群普遍易感，其中尤以婴幼儿多见，是严重威胁人类健康的主要传染病之一。

百日咳的病原菌是鲍特菌属(Bordetella)中的百日咳鲍特菌(B.pertussis)，常称百日咳杆菌。百日咳杆菌能产生许多毒性因子，可以因环境条件改变而发生表型变化，毒力因子的表达水平也不同，这些因子包括百日咳外毒素(PT)；丝状血凝素(filamentoushemagglutinin，FHA)；百日咳杆菌粘着素(pertactinPRN)；耐热的内毒素(endotoxin，ET)；不耐热毒素(HLT)；气管细胞毒素(TCT)；腺苷环化酶毒素(ACT)等多种生物活性物质。当细菌随空气飞沫浸入易感者的呼吸道后，细菌的丝状血凝素黏附于咽喉至细支气管黏膜的纤毛上皮细胞表面；继之，细菌在局部繁殖并产生多种毒素如百日咳外毒素、腺苷环化酶等引起上皮细胞纤毛麻痹和细胞变性，使其蛋白合成降低，上皮细胞坏死脱落，以及全身反应。近来研究还表明百日咳发生机制与百日咳杆菌毒素类物质损害宿主细胞免疫功能有关。但目前对于百日咳的发病机理的认识还不完全清楚。

接种百日咳疫苗是目前预防百日咳最有效、最经济的手段。已用于预防接种的百日咳菌苗有全细胞菌苗和无细胞菌苗，全细胞百日咳疫苗是将百日咳全菌体用适当灭活剂灭活后，与佐剂配合，直接用做免疫用疫苗。其简单生产过程为：将细菌大量培养增殖后，沉降菌体，用适量浓度的甲醛溶液，在一定温度下，使其灭活成无传染性、但具有免疫原性的菌体液，将不同血清型的菌体原液按一定比例配合后，即成为百日咳原液。

百日咳全菌体疫苗在20世纪30年代首次临床证实具有免疫保护作用，并用于免疫以来，迄今已使用了近70年，其在控制和降低儿童百日咳发病方面发挥了巨大作用，但由于副反应太高，以至于在日本、英国均有抵制疫苗接种情况的出现。由于接种率下降，导致百日咳流行出现反弹，鉴于此种情况，日本于80年代率先研制并使用了以PT和FHA为主要有效成分的无细胞百日咳疫苗[张庶民，徐颖华，等.中国药事2005，19(11)：685-686]。

我国企业采用的无细胞百日咳疫苗工艺主要是沿用日本的无细胞百日咳生产工艺进行生产。工艺基本上包括大发酵罐培养细菌、硫酸铵沉淀、高盐浓度抽取、透析和蔗糖梯度超离心等步骤，在生产过程中去除了百日咳菌体中的有害成分，提取纯化出有效抗原PT和FHA部分(可能含有少量PRN和Agg)，使无细胞百白破疫苗在保持免疫原性的基础上大大减少了副反应的发生。这种纯化方式简便快捷，但不能对无细胞百日咳疫苗的各组分抗原精确定量，得到有效组分PT、FHA的含量不确定，且其纯度很难达到90％以上。

欧美国家主要采用柱层析法分别纯化每个组分，按照一定比例配制成疫苗，成分明确，纯度高。这种采用分别纯化的组分aPV，纯度达到90％以上，成分明确，副作用小。临床观察显示，APV和DTaP在免疫效果上与百日咳全菌体疫苗相当，且副反应明显降低[田秀梅，朱凤才，张艺飓，等.吸附无细胞百白破联合疫苗安全性观察[J].中国初级卫生保健，2007，21(11)：52-54]。

百日咳疫苗的生产过程中，传统的脱毒方法是采用甲醛或戊二醛和赖氨酸脱毒法。用甲醛解毒的无细胞百日咳菌苗,经37℃处理后,大部分出现明显毒性逆转。戊二醛是具有间臂作用的交联剂，可以自由的与毒素的两个结合位点或两个毒素分子结合，从而形成稳定的结合物。赖氨酸可能有两方面的作用，其一是防止毒素分子间过度交联形成凝块；其二是封闭残余活性醛基以终止脱毒作用，防止毒性逆转或脱毒过度而影响免疫原性[刘德铮，肖詹蓉，李万臣，王兴宇，赵宝明，等.应用戊二醛对百日咳抗原进行解毒的研究[J].生物制品学杂志，1990，3(4)：181-184]。戊二醛具有良好的脱毒效果，但是由于戊二醛本身的交联作用，脱毒过程中的百日咳原液容易出现抗原凝集沉淀，使脱毒后的百日咳原液不能除菌过滤，这在百日咳疫苗的生产工艺中是一个潜在风险。

CN87104279采用过氧化氢脱毒、EDTA、金属盐、硫酸铵共同脱毒，脱毒反应速率取决于过氧化氢、EDTA和金属盐。该方法脱毒过程中EDTA还会与金属盐螯合，反应复杂不易控制；同时由于缺乏抗聚集剂，在脱毒过程中蛋白质由于疏水作用聚集沉淀而不易除菌过滤，产量低，不适合大规模工业化生产。

发明内容

针对现有技术中的上述问题，本发明的目的是提供一种采用过氧化氢脱毒的无细胞百日咳疫苗，以及包含该无细胞百日咳疫苗的联合疫苗，脱毒后的疫苗特异性毒性较低，免疫原性较高。

本发明的另一目的是提供采用过氧化氢脱毒无细胞百日咳疫苗抗原的方法，采用过氧化氢作为脱毒剂，甘油作为抗聚集剂，尿素作为稳定剂，脱毒过程中不产生抗原凝集沉淀，脱毒后可以除菌过滤，抗原回收率高。

本发明的又一目的是提供制备上述无细胞百日咳疫苗的方法。

为达上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种无细胞百日咳疫苗，包含百日咳鲍特氏杆菌(Bordetellapertussis)液体培养物上清部分的PT抗原和FHA抗原以及百日咳鲍特氏杆菌液体培养物菌体部分的PRN抗原，其中所述PT抗原和FHA抗原采用过氧化氢作为脱毒剂进行脱毒。

本发明还可采用以下技术方案进一步实现：

所述的无细胞百日咳疫苗，其中，所述PT抗原和FHA抗原采用甘油作为抗聚集剂，采用尿素作为稳定剂。

所述的无细胞百日咳疫苗，其中，所述疫苗按照每剂含PT抗原10-40μg、FHA抗原5-40μg、PRN抗原1-15μg的抗原含量配制。

本发明还提供了一种百日咳-白喉-破伤风联合疫苗，其中，所述联合疫苗的抗原包括如权利要求1所述的无细胞百日咳疫苗的抗原以及白喉类毒素和破伤风类毒素。

所述的联合疫苗，其中，所述联合疫苗抗原的含量为每剂含PT抗原10-40μg；FHA抗原5-40μg；PRN抗原1-15μg；白喉类毒素10-30Lf；破伤风类毒素1-10Lf。

本发明提供的采用过氧化氢脱毒无细胞百日咳疫苗抗原的方法，采用过氧化氢分别脱毒百日咳鲍特氏杆菌液体培养物上清部分的PT抗原和FHA抗原，其具体包括如下步骤：

a)置换纯化后的PT抗原和FHA抗原缓冲体系，采用摩尔浓度为20-200mmol/L的磷酸盐、碳酸盐或醋酸盐作为缓冲盐水，将pH值调节到7.0-9.0；

b)将步骤a中置换缓冲体系后的抗原稀释至100-500μg/ml；

c)在步骤b稀释后的抗原中加入抗聚集剂甘油和稳定剂尿素，使甘油终体积浓度达到10％(V/V)-60％(V/V)，尿素终摩尔浓度达到1-2mol/L；

d)在步骤c后加入终浓度为0.5％(W/V)-1.5％(W/V)的过氧化氢，将缓冲体系pH值调至7.0-9.0；

e)在20-40℃条件下，脱毒2-5小时；

f)通过透析或超滤方式去除过氧化氢，完成脱毒，除菌过滤。

进一步的，所述的采用过氧化氢脱毒无细胞百日咳疫苗抗原的方法，其中，所述步骤a中采用超滤方式置换缓冲体系，采用浓度为100mmol/L的磷酸盐缓冲盐水，将体系pH值调节为8.0。

所述的采用过氧化氢脱毒无细胞百日咳疫苗抗原的方法，其中，所述步骤b中的抗原稀释至250μg/ml。

所述的采用过氧化氢脱毒无细胞百日咳疫苗抗原的方法，其中，所述步骤c中甘油终体积浓度为30％(V/V)，尿素终摩尔浓度为2mol/L。

所述的采用过氧化氢脱毒无细胞百日咳疫苗抗原的方法，其中，所述步骤d中PT抗原脱毒加入过氧化氢终浓度为1.0％(W/V)，FHA抗原脱毒加入过氧化氢终浓度为0.5％(W/V)，pH均调至8.0。

所述的采用过氧化氢脱毒无细胞百日咳疫苗抗原的方法，其中，所述步骤e中脱毒温度为37℃，PT抗原脱毒时间为4小时，FHA抗原脱毒时间为2小时。

所述的采用过氧化氢脱毒无细胞百日咳疫苗抗原的方法，其中，所述步骤f中采用超滤的方式去除过氧化氢。

本发明还提供了一种制备无细胞百日咳疫苗的方法，采用柱层析法制备抗原，包括如下步骤：

1)将百日咳博德特氏菌经离心分离为上清部分和菌体部分；

2)将步骤1中的上清部分经层析纯化分离得到PT抗原和FHA抗原；

3)将步骤1中的菌体部分经热释放后经过层析纯化得到PRN抗原；

4)将步骤2中的PT抗原和FHA抗原采用过氧化氢作为脱毒剂进行脱毒；

5)将步骤3中的PRN抗原和步骤4中脱毒后的PT抗原和FHA抗原经0.22μm的滤膜微孔过滤后，用铝佐剂分别吸附PT、FHA、PRN抗原；

6)将步骤5中吸附后的PT、FHA、PRN抗原混合配制成为百日咳疫苗。

所述的制备无细胞百日咳疫苗的方法，其中，所述步骤4中采用过氧化氢脱毒包括如下步骤：

a)置换纯化后的PT抗原和FHA抗原缓冲体系，采用摩尔浓度为20-200mmol/L的磷酸盐、碳酸盐或醋酸盐作为缓冲盐水，将pH值调节到7.0-9.0；

b)将步骤a中置换缓冲体系后的抗原稀释至100-500μg/ml；

c)在步骤b稀释后的抗原中加入抗聚集剂甘油和稳定剂尿素，使甘油终体积浓度达到10％(V/V)-60％(V/V)，尿素终摩尔浓度达到1-2mol/L；

d)在步骤c后加入终浓度为0.5％(W/V)-1.5％(W/V)的过氧化氢，将缓冲体系pH值调至7.0-9.0；

e)在20-40℃条件下，脱毒2-5小时；

f)通过透析或超滤方式去除过氧化氢，完成脱毒，除菌过滤。

所述的制备无细胞百日咳疫苗的方法，其中，所述步骤5中的铝佐剂为氢氧化铝、磷酸铝或硫酸铝，优选氢氧化铝。

本发明的优点是：

1)本发明的无细胞百日咳疫苗，采用过氧化氢、甘油和尿素对百日咳疫苗抗原进行脱毒，过氧化氢是除水外的另一种氢的氧化物。粘性比水稍微高，化学性质不稳定，一般以30％或60％的水溶液形式存放。过氧化氢有很强的氧化性，且具弱酸性。当过氧化氢在碱性条件下能自发分解生成水和氧。这种尚未结合成氧分子的氧原子，具有很强的氧化能力，与抗原蛋白接触时，能氧化抗原上的特定位点。过氧化氢无对人体有害物质残留，且可以通过透析或超滤等方式完全去除。分解后剩余的物质是无任何毒害、无任何刺激作用的水，不会形成污染。甘油和尿素本身作为人体内脂肪和蛋白质的代谢产物，在经透析或超滤等方式的去除后，低浓度的残留不会对人体产生毒副作用。

2)脱毒过程中不产生抗原凝集沉淀，脱毒后可以除菌过滤，抗原回收率高。

3)与现有疫苗相比，本发明抗原制备方法、抗原脱毒方法以及疫苗配比方式均不同。本发明采用柱层析法制备抗原，与传统盐析法相比，纯度更高，能达到90％以上；过氧化氢脱毒法与传统的戊二醛脱毒法相比，脱毒后的百日咳原液无对人体有害的物质残留，且有良好的免疫原性和更广谱的抗原性；将分别纯化后的抗原按比例配比，其疫苗成分明确，能保证疫苗质量的可控性和稳定性。

4)本发明的无细胞百日咳疫苗，与白喉类毒素、破伤风类毒素组成的联合疫苗，百日咳抗原的保护效力不被白喉类毒素和破伤风类毒素减弱，白喉类毒素和破伤风类毒素的保护效力也不会被百日咳抗原减弱，因此能够制备联合疫苗。

本发明的重点发现在于采用过氧化氢、甘油和尿素混合作用于无细胞百日咳疫苗的抗原进行脱毒。该法不仅适用于PT抗原、FHA抗原和PRN抗原这一种3组分疫苗，也适用于白喉、破伤风等其他类毒素疫苗。

本疫苗可供3个月～6周岁儿童使用，自3月龄开始至12月龄，每针间隔4～6周，每次注射0.5ml。加强免疫通常在基础免疫后18～24月龄内进行，注射剂量为0.5ml。

本发明通过如下实施例，进一步阐述本发明的核心内容，所述实施例用于阐述本发明的概念和几个优选方案，并非限制本发明。本发明的其他实施例在不背离本发明核心的前提下为本领域技术人员所预见。

附图说明

图1：纯化后的PT、FHA抗原及Prn抗原电泳图(图中，左侧图片从左至右依次为PT抗原、FHA抗原、蛋白质MAKER；右侧图片从左至右分别为蛋白质MAKER、Prn抗原。对纯化后的溶液进行分析时，SDS-PAGE电泳上样量为15μl/孔，蛋白质含量为3/孔。)

图2：质反应平行线法计算PT、FHA和Prn配比的效价的软件截图(表五第1组)。

图3：质反应平行线法计算PT、FHA和Prn配比的效价的软件截图(表五第2组)。

图4：质反应平行线法计算PT、FHA和Prn配比的效价的软件截图(表五第3组)

图5：质反应平行线法计算PT、FHA和Prn配比的效价的软件截图(表五第4组)。

图2-5为AtatisticalAnalysis软件计算效价截图，图中a线为参考菌苗的剂量反应曲线，b线为供试品的剂量反应曲线。该软件由中国食品药品检定研究院提供，根据质反应平行线法(中华人民共和国药典2010版三部)设计，专用于计算疫苗效价。

具体实施方式

本发明中部分技术术语缩写和中文全称如下：

百日咳毒素：PT

丝状血凝素：FHA

百日咳黏着素(69KD外膜蛋白)：Prn

主要物料和设备

百日咳菌种：本发明中所用百日咳菌种购自于中国药品生物制品检定院中国医学细菌保藏管理中心。此菌株经中国医学菌种保藏中心收藏，菌株编号为58003，为百日咳I相CS菌株。

本发明包括但不限于以下实施例。

实施例1：百日咳抗原的获得

将购自于中国药品生物制品检定院的百日咳I相菌种(编号为58003)启开后，接种于改良包-姜培养基上，于35～37℃培养70小时～72小时，第2代和第3代接种于活性碳半综合固体培养基，于35～37℃培养23小时～24小时，然后接种于FMCL(Frohlichmodifiedcyclodextrinliquid)培养基或S-S(Stainer-Scholte)培养基上，于35～37℃培养24小时～48小时用于生产。

可采用静置培养法或发酵罐培养法，温度35.5～36.0℃，培养过程应取样做纯菌检查。

培养物于对数生长期后或静止期前收获。

采用连续流离心，分离培养上清部分和菌体部分。离心后上清液进行PT、FHA组份的纯化；离心收集的菌体沉淀进行Prn组份的纯化。

1.PT、FHA抗原纯化

将培养上清部分用30kDa截留分子量膜包超滤浓缩10～30倍,用10-100mM的PB缓冲液将电导洗至1-10ms/cm。

可采用阳离子交换层析介质，如CMSepharoseFF或合适介质，进行PT、FHA组份的分离。超滤浓缩液上样，进行电导线性洗脱，收集PT、FHA抗原。

2.Prn抗原

按照每克菌体加5-50ml含0.1-0.5mol/LNacl的Tris-Hcl缓冲液，使用匀化仪进行匀化，直至均匀、无明显颗粒，再将菌体的混悬液置60℃水浴箱中进行热释放30-60min，释放后按照10000g、30min、4℃参数离心，收集上清液。

采用阴离子交换层析介质，如DEAESepharoseFF或合适介质，进行电导线性洗脱，收集Prn目标峰。

3.纯化后抗原检测：

3.1纯度

采用SDS-PAGE电泳，PT、FHA的电泳结果见图1左侧图片(从左到右分别为PT抗原、FHA抗原、MAKER)，Prn的电泳结果见图1右侧图片(从左到右分别为MAKER、Prn抗原)。通过软件ImageQuantTL(IQ)计算，PT、FHA、Prn的纯度均为100％，说明柱层析法制备的抗原纯度高，已达到检验生化物质最高纯度的电泳纯。

3.2CHO细胞毒性

待检样品预稀释：将本实施例纯化后的PT抗原稀释到1ng/ml，纯化后的FHA和PRN抗原稀释到100μg/ml。

细胞板稀释：取96孔细胞培养板，每行第一孔加入200μl预稀释完成后的待检样品，每个样品间隔一行，该行剩余孔各加入100μl细胞生长液，用微量移液器从第一列吸取100μl样品至第二列，缓慢吹打混匀，抽取100μl液体至第三列，缓慢吹打混匀，依次倍比稀释至第十二列，弃100μl样品。

细胞悬液制备：准备CHO细胞1瓶，于超净台内打开瓶盖，弃去全部细胞生长液，加入足量0.25％胰酶润湿整个瓶底，盖上瓶盖于倒置显微镜下观察，待5分钟内细胞形态变化后，于超净台内弃去全部胰酶，加入细胞生长液，吹打瓶底细胞，混匀后取细胞悬液计数，并使用细胞生长液将细胞悬液稀释至8×104个/ml备用。

种板：将制备好的细胞悬液加入已稀释好的样品孔中，100μl/孔。

设置细胞对照：每孔加入细胞悬液及细胞生长液各100μl，每次做2孔。

培养：将96孔细胞培养板加盖后放入37℃，5％二氧化碳孵箱中培养48小时

结果观察(染色)：培养48小时后，从孵箱取出96孔细胞培养板，直接在显微镜下观察，或进行染色，染色可按以下步骤进行：

固定：弃去孔中液体，使用微量移液器在每孔中加入150μl无水乙醇，室温放置5分钟固定，弃去固定液，每孔加入150μlPBS，放置1分钟，弃去PBS。

染色：每孔加入100μl结晶紫染液染色5分钟后，用自来水轻轻冲洗掉染液，将细胞板倒置于吸水纸上，吸干水分。

结果判定：

将96孔板置于倒置显微镜下观察细胞簇集情况。

判定：细胞均不簇集，判为不簇集“-”、50％以下细胞簇集，判为簇集可疑“±”、50％细胞簇集，判为簇集成串“+”、100％细胞簇集，判为明显簇集成串“++”。

以簇集成串“+”为特异性簇集阳性判断标准。

检测结果：

表1、纯化后抗原CHO细胞毒性

由上表细胞毒性测试可看出，对于PT、FHA抗原必须进行脱毒处理，对于Prn抗原，则可不进行脱毒处理。

实施例2：PT抗原的脱毒

a)将实施例1中纯化后的PT抗原通过透析或超滤等方式置换为磷酸盐缓冲液，浓度为100mmol/L，pH为8.0。

b)将步骤a中置换缓冲体系后的抗原稀释至250μg/ml。

c)在步骤b稀释后的抗原中加入甘油和尿素，使甘油终浓度达到30％(V/V)，尿素终浓度达到2mol/L。

d)在步骤c后加入终浓度为1％(W/V)的过氧化氢，将pH调至8.0。

e)脱毒温度为37℃，脱毒时间为4小时。

f)通过超滤的方式去除过氧化氢，终止脱毒。

g)在步骤f终止脱毒后，用0.22μm的滤膜微孔过滤，获得脱毒后PT原液。

脱毒后PT原液检测结果参见表2所示，细菌内毒素为4.7EU/mgPr.，CHO细胞毒性为12.5μgPT不引起CHO细胞簇集，脱毒效果良好。

表2、脱毒后PT原液检测结果

实施例3：FHA抗原的脱毒

a)将纯化后的FHA抗原通过透析或超滤等方式置换为磷酸盐缓冲液，浓度为100mmol/L，pH为8.0。

b)将步骤a中置换缓冲体系后的抗原稀释至250μg/ml。

c)在步骤b稀释后的抗原中加入甘油和尿素，使甘油终浓度达到30％(V/V)，尿素终浓度达到2mol/L。

d)在步骤c后加入终浓度为0.5％(W/V)的过氧化氢，将pH调至8.0。

e)脱毒温度为37℃，脱毒时间为2小时。

f)通过超滤的方式去除过氧化氢，终止脱毒。

g)在步骤f终止脱毒后，用0.22μm的滤膜微孔过滤，获得脱毒后FHA原液。

脱毒后FHA原液检测结果参见表3所示，脱毒效果良好。

表3、脱毒后FHA原液检测结果

实施例4：百日咳抗原的吸附

将实施例2和3中脱毒后PT、FHA抗原以及未脱毒的Prn抗原分别用氢氧化铝稀释液吸附。具体方法为：

a)将脱毒后的PT抗原在搅拌下转移到氢氧化铝稀释液中，将pH调至5.8-7.2之间。

b)将脱毒后的FHA抗原在搅拌下转移到氢氧化铝稀释液中，将pH调至5.8-7.2之间。

c)将未脱毒的Prn抗原在搅拌下转移到氢氧化铝稀释液中，将pH调至5.8-7.2之间。

吸附率检测：

将吸附后抗原6500g离心5分钟，取上清。

将吸附后抗原和解离液(二乙醇胺、TritonX-100、PBS)1:1混合，37℃解离90min。

Lowry法分别测定上清液及解离后样品中抗原含量。

吸附率＝(1-Ag上清/Ag解离后样品)×100％

检测结果如表4所示，各抗原的吸附率均在98％以上，吸附效果好。

表4、各抗原吸附率结果

实施例5：PT、FHA和Prn配比免疫评价：

将实施例4中吸附后的抗原按照表5分别配制成4组疫苗，测定效价。

百日咳参考苗稀释：

参考疫苗来源于中国食品药品检定研究院，批号为20060301，作为标准品参与结果计算，用0.85％的生理氯化钠溶液将百日咳参考菌依次稀释成每1ml含1IU、0.2IU、0.04IU的三个浓度梯度。

待检品稀释：将待检品(对应表5编号1-4的4组疫苗)稀释到表5所示要求浓度(见表5)

攻击菌液的制备：

取批号2005－1的35～37℃培养20～24小时的CMCC5803018323株百日咳菌种，菌苔经肉眼检查为纯菌后，刮至适量的生理氯化钠或PH7.2～7.4的PBS溶液中，用灭菌脱脂棉过滤，测定浓度，然后用PH7.0～7.2的1％蛋白胨水稀释成每0.03ml含菌8.0×104个，作为实验组的攻击菌。然后再连续稀释，使每0.03ml含菌8000、800、80及8个菌，以上5个稀释度作为对照组的攻击菌液，用于测定攻击菌液的LD50。

免疫：

用不同稀释度的参考苗和待检样品分别免疫10～12g小鼠(同性或雌雄各半)，每个稀释度免疫20只，每只腹腔注射0.5ml，同时饲养55只备作对照用。

攻击：

小鼠免疫14～16天后，此期间内参考菌苗和供试品的每个稀释度免疫的小鼠的健存率应至少为94％，每只小鼠用0.25ml注射器脑内攻击0.03ml菌液(含菌8.0×104)，在试验组攻击后再进行对照组攻击菌的LD50测定，每组设定5个稀释度，对照组每稀释度攻击10只小鼠。

结果观察：

小鼠攻击后观察14天。攻击后第三天，试验组动物每组至少16只，以后每日观察动物并记录死亡数，最初3天死亡的动物不作统计，至第14天有麻痹，头部肿胀，弓背及明显耸毛的动物按死亡计。

结果计算和判定：

按质反应平行线法计算供试品效价。

供试品按成品疫苗浓度稀释后，每1次人用剂量的免疫效价应不低于4.0IU，且95％可信限的低限应不低于2.0IU。如达不到上述要求时可进行复试，但所有有效试验的结果必须以几何平均值(如用概率分析法时，应用加权几何平均)来计算。达到上述要求判为合格。

表5、按质反应平行线法计算各组的效价

由上表5可看出，三组分疫苗的免疫效力明显高于单组份疫苗。

实施例6：组分百日咳疫苗的制备

1.配方

每剂量(0.5ml)中含实施例4中吸附后的PT抗原、FHA抗原和PRN抗原分别如下所示：

表6、组分百日咳疫苗配方

2.合并及稀释

室温，搅拌下，将PT、FHA、Prn吸附后原液加入稀释液中，调节pH值至5.8～7.2，继续搅拌不低于1小时。

3.效价与特异性毒性的检测：

3.1效价

按《中华人民共和国药典》三部(2010年版)中“吸附百白破联合疫苗”附录2进行。以适宜的稀释倍数稀释至第一个免疫剂量，再按5倍系列稀释。免疫时间为21天。每一次人用剂量的免疫效价应不低于4.0IU，且95％可信限的低限应不低于2.0IU。如达不到上述要求时可进行复试，但所有有效试验的结果必须以几何平均值(如用概率分析法时，应用加权几何平均)来计算。达到上述要求即判为合格。

3.2特异性毒性

毒性参考品购自中国食品药品检定研究院(批号为第一批)按照每批标示进行稀释，将本实施例配制的疫苗稀释至与成品相同浓度。用体重14～16gNIH小鼠(雌性或雌雄各半)，毒性参考品的每一稀释度和供试品各用一组，每组至少10只，每只小鼠腹腔注射0.5ml，分别进行3.2.1～3.2.3项试验，应符合规定。

3.2.1小鼠体重减轻试验

于注射前和注射后16～18小时分别称取小鼠体重，试验结果经统计学方法处理后，注射供试品的小鼠体重减轻毒性的活性应不高于10BWDU/ml。

3.2.2小鼠白细胞增多试验

于注射后3日分别取小鼠末稍血进行白细胞计数。试验结果经统计学方法处理后，注射供试品的小鼠白细胞增多毒性的活性应不高于0.5LPU/ml。

3.2.3小鼠组胺致敏试验

于注射后4日，每只小鼠腹腔注射0.5ml含二盐酸组织胺4mg或二磷酸组织胺2mg的溶液，30分钟后分别测小鼠肛温。试验结果经统计学方法处理后，供试品的小鼠组胺致敏毒性的活性应不高于0.8HSU/ml，且无动物死亡。

3.3毒逆(组胺法)

每批供试品置37℃4周，按3.2.3项进行试验，应符合规定。

4.检测结果如表6所示，完全符合《中华人民共和国药典》三部(2010年版)的规定，具体数值详见下表7：

表7、百日咳疫苗效价与特异性毒性检测结果

实施例7：组分百白破疫苗的制备

1.配方

每剂量(0.5ml)中含实施例4中吸附后的PT抗原、FHA抗原、PRN抗原和吸附后的白喉类毒素、破伤风类毒素分别如下所示：

表8、组分百白破疫苗配方

2.合并及稀释

室温，搅拌下，将吸附后的PT、FHA、Prn、白喉类毒素、破伤风类毒素原液加入稀释液中，调节pH值至5.8～7.2，继续搅拌不低于1小时。

3.效价和毒性检测

3.1效价测定

3.1.1无细胞百日咳疫苗

按《中华人民共和国药典》(2010年版三部)中“吸附百白破联合疫苗”附录2进行。以适宜的稀释倍数稀释至第一个免疫剂量，再按5倍系列稀释。免疫时间为21天。每一次人用剂量的免疫效价应不低于4.0IU；且95％可信限的低限应不低于2.0IU。如达不到上述要求时可进行复试，但所有有效试验的结果必须以几何平均值(如用概率分析法时，应用加权几何平均)来计算。达到上述要求即判为合格。

3.1.2白喉疫苗

按《中华人民共和国药典》(2010年版三部)附录XIC进行，每一次人用剂量中白喉类毒素的免疫效价应不低于30IU。

3.1.3破伤风疫苗

按《中华人民共和国药典》(2010年版三部)附录XIB进行。每一次人用剂量中破伤风类毒素的免疫效价应不低于40IU。

3.2特异性毒性试验

3.2.1无细胞百日咳疫苗

毒性参考品购自中国食品药品检定研究院(批号为第一批)，按照每批标示进行稀释，将本实施例制备的百白破疫苗稀释至与成品相同浓度。用体重14～16gNIH小鼠(雌性或雌雄各半)，毒性参考品的每一稀释度和供试品各用一组，每组至少10只，每只小鼠腹腔注射0.5ml，分别进行3.2.1.1-3.2.1.3项试验，应符合规定。

3.2.1.1小鼠体重减轻试验

于注射前和注射后16～18小时分别称取小鼠体重，试验结果经统计学方法处理后，注射供试品的小鼠体重减轻毒性的活性应不高于10BWDU/ml。

3.2.1.2小鼠白细胞增多试验

于注射后3日分别取小鼠末稍血进行白细胞计数。试验结果经统计学方法处理后，注射供试品的小鼠白细胞增多毒性的活性应不高于0.5LPU/ml。

3.2.1.3小鼠组胺致敏试验

于注射后4日，每只小鼠腹腔注射0.5ml含二盐酸组织胺4mg或二磷酸组织胺2mg的溶液，30分钟后分别测小鼠肛温。试验结果经统计学方法处理后，供试品的小鼠组胺致敏毒性的活性应不高于0.8HSU/ml，且无动物死亡。

3.2.2白喉、破伤风疫苗

用体重250～350g豚鼠,每批制品不少于4只,每只腹部皮下注射2.5ml,分两侧注射,每侧1.25ml，观察30天。注射部位可有浸润，经5～7天变成硬结，可能30天不完全吸收。在第10天、第20天、第30天称体重，到期体重比注射前增加，局部无化脓、无坏死、无破伤风症状及无晚期麻痹症者为合格。

3.3毒性逆转试验

每批供试品置37℃4周，按3.2.1.3项进行，应符合规定。

检测结果参加表9所示，完全符合《中华人民共和国药典》三部(2010年版)的规定：

表9、组分百白破疫苗效价与特异性毒性检测结果

上述实施例的疫苗抗原配比为优选比例，其每剂各组分抗原含量可在以下区间选择：

PT抗原10-40μg；FHA抗原5-40μg；PRN抗原1-15μg；白喉类毒素10-30Lf；破伤风类毒素1-10Lf。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限定。凡本领域的技术人员利用本发明的技术方案对上述实施例做出的任何等同的变动、修饰或演变等，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (14)

1.一种无细胞百日咳疫苗，其特征在于：

包含百日咳鲍特氏杆菌(Bordetellapertussis)液体培养物上清部分的PT抗原和FHA抗原以及百日咳鲍特氏杆菌液体培养物菌体部分的PRN抗原。

2.根据权利要求1所述的无细胞百日咳疫苗，其特征在于：

采用过氧化氢、甘油、尿素混合作用于PT抗原和FHA抗原进行脱毒，其中过氧化氢作为脱毒剂，甘油作为抗聚集剂，尿素作为保护剂。

3.根据权利要求1所述的无细胞百日咳疫苗，其特征在于：

所述疫苗按照每剂含PT抗原10-40μg、FHA抗原5-40μg、PRN抗原1-15μg的抗原含量配制。

4.一种百日咳-白喉-破伤风联合疫苗，其特征在于：

所述联合疫苗的抗原包括如权利要求1所述的无细胞百日咳疫苗的抗原以及白喉类毒素和破伤风类毒素。

5.根据权利要求4所述的联合疫苗，其特征在于：

所述联合疫苗抗原的含量为每剂含PT抗原10-40μg；FHA抗原5-40μg；PRN抗原1-15μg；白喉类毒素10-30Lf；破伤风类毒素1-10Lf。

6.一种采用过氧化氢脱毒无细胞百日咳疫苗抗原的方法，其特征在于：

采用过氧化氢分别脱毒百日咳鲍特氏杆菌Bordetellapertussis液体培养物上清部分的PT抗原和FHA抗原，其包括如下步骤：

a)置换纯化后的PT抗原和FHA抗原缓冲体系，采用摩尔浓度为20-200mmol/L的磷酸盐、碳酸盐或醋酸盐作为缓冲盐水，将pH值调节到7.0-9.0；

b)将步骤a中置换缓冲体系后的抗原稀释至100-500μg/ml；

c)在步骤b稀释后的抗原中加入抗聚集剂甘油和稳定剂尿素，使甘油终体积浓度达到10％(V/V)-60％(V/V)，尿素终摩尔浓度达到1-2mol/L；

d)在步骤c后加入终浓度为0.5％(W/V)-1.5％(W/V)的过氧化氢，将缓冲体系pH值调至7.0-9.0；

e)在20-40℃条件下，脱毒2-5小时；

f)通过透析或超滤方式去除过氧化氢，完成脱毒，除菌过滤。

7.根据权利要求6所述的采用过氧化氢脱毒无细胞百日咳疫苗抗原的方法，其特征在于：

所述步骤a中采用超滤方式置换缓冲体系，采用浓度为100mmol/L的磷酸盐缓冲盐水，将体系pH值调节为8.0。

8.根据权利要求6所述的采用过氧化氢脱毒无细胞百日咳疫苗抗原的方法，其特征在于：

所述步骤b中的抗原稀释至250μg/ml。

9.根据权利要求6所述的采用过氧化氢脱毒无细胞百日咳疫苗抗原的方法，其特征在于：

所述步骤c中甘油终体积浓度为30％(V/V)，尿素终摩尔浓度为2mol/L。

10.根据权利要求6所述的采用过氧化氢脱毒无细胞百日咳疫苗抗原的方法，其特征在于：

所述步骤d中PT抗原脱毒加入过氧化氢终浓度为1.0％(W/V)，FHA抗原脱毒加入过氧化氢终浓度为0.5％(W/V)，pH均调至8.0。

11.根据权利要求6所述的采用过氧化氢脱毒无细胞百日咳疫苗抗原的方法，其特征在于：

所述步骤e中脱毒温度为37℃，PT抗原脱毒时间为4小时，FHA抗原脱毒时间为2小时。

12.根据权利要求6所述的采用过氧化氢脱毒无细胞百日咳疫苗抗原的方法，其特征在于：

所述步骤f中采用超滤的方式去除过氧化氢。

13.一种制备无细胞百日咳疫苗的方法，其特征在于：采用柱层析法制备抗原，所述方法包括如下步骤：

1)将百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)培养物经离心分离为上清部分和菌体部分；

2)将步骤1中的上清部分经层析纯化分离得到PT抗原和FHA抗原；

3)将步骤1中的菌体部分经热释放后经过层析纯化得到PRN抗原；

4)将步骤2中的PT抗原和FHA抗原采用过氧化氢作为脱毒剂进行脱毒；

5)将步骤3中的PRN抗原和步骤4中脱毒后的PT抗原和FHA抗原经0.22μm的滤膜微孔过滤后，用铝佐剂分别吸附PT、FHA、PRN抗原；

6)将步骤5中吸附后的PT、FHA、PRN抗原混合配制成为百日咳疫苗。

14.根据权利要求13所述的制备无细胞百日咳疫苗的方法，其特征在于：

所述步骤5中的铝佐剂为氢氧化铝、磷酸铝或硫酸铝，优选氢氧化铝。