CN1147259A - 分离百日咳杆菌保护性组分的方法 - Google Patents
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Abstract
提供了有效分离百日咳杆菌保护性组分的方法，以对磷酸钙凝胶的吸附能力的差异为基础，从百日咳杆菌培养物中分离百日咳杆菌的保护性组分，所述磷酸钙凝胶是在存在过量磷酸离子的条件下，提供将钙离子加到百日咳杆菌培养物中而形成的。传统上，已经用用于不同组分的不同纯化方法，分离百日咳杆菌的保护性组分。根据本发明，使用同样的方法纯化所有的百日咳杆菌主要保护性组分。因此可以高效率和高回收率地纯化每个组分，对于工业生产是非常有利的一个方面。还可以有效地生产改进纯化的百日咳组分疫苗，该疫苗包括百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)，百日咳菌毛(FIM)和百日咳毒素(PT)的有效组分。
Description
本发明涉及分离百日咳杆菌保护性组分的方法。通过适当混合由本发明方法分离的保护性组分，可以制备百日咳组分疫苗。
疫苗被广泛地用于防止传染病。百日咳，一种因感染百日咳杆菌而引起的传染性呼吸疾病，由于窒息性(apneic)咳嗽同时偶尔伴有痉挛可能严重地影响患者，特别是婴儿。为了治疗这种疾病，实践中均是使用灭活后的百日咳杆菌全培养细胞(灭活的疫苗)。但是，已经报告了在接种位点的定位反应和副反应，如发烧，从而社会上急需解决此问题。为了解决该问题， 已经进行了许多使用从百日咳杆菌中分离的保护性组分作为疫苗的尝试。例如，通过从百日咳杆菌中提取保护性蛋白质，如百日咳毒素(PT)，百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)和百日咳菌毛(FIM)，除去内毒素(ET)而制备无细胞百日咳疫苗(ACP疫苗)，但由于下述缺陷而并不完全令人满意。
用相应的方法分离了百日咳毒素(PT)，百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)和百日咳菌毛(FIM)，(所有均是已经在实践应用中有效的百日咳杆菌保护性组分)。
用人结合珠蛋白作为配体的亲和层析可分离百日咳毒素(PT)[Biochimica et Biophysica Acta，Vol.580，p.175(1979)]。但是由于人结合珠蛋白是从人血中收集的，因此可能受到肝炎病毒的污染；使用动物血清时有相同的问题。另一种方法是使用变性的血浆铜蓝蛋白作为配体的亲和层析(日本未审查专利No.62135/1987)。尽管该方法没有病毒污染的问题，但产生了其他一些问题，包括血浆铜蓝蛋白和硫氰酸钠的高毒性和强身体滞留以及有蛋白质变性作用的其他洗脱剂的污染疫苗。
就百日咳丝状血细胞凝集素(PHA)来说，可利用的是使用羟基磷灰石的纯化方法[Infection and Immunity，Vol.41，p.313(1983)and EP-A-231083，EP-A-427462，EP-A462534；日本未审查专利Nos.234031/1987，169893/1992，368337/1993]。但是该方法要花长时间进行柱操作而且由于羟基磷灰石的高成本而不经济。
就pertactin(PRN，69K-OMP)来说，使用小鼠血清作为配体进行亲和层析[Infection and Immunity，Vol.56，p.3189(1988)]，但也有上述缺陷。
就百日咳菌丝(FIM)来说，通过用硫酸铵和氯化镁盐析来纯化百日咳杆菌细胞提取物[Infection and immunity，Vol.48，p442(1985)]，但由于产率低该方法在疫苗生成效率方面是很差的。
有一种通过用氢氧化铝凝胶吸附而制备革兰氏阴性菌疫苗的方法(WO93/10216)。该方法需要大量的氢氧化铝凝胶，来吸附在革兰氏阴性菌中产生的保护性组分和内毒素。用WO93/10216的方法得到的疫苗由于稀释的疫苗而将内毒素释放体内，因而有副作用，如发烧和内毒素-休克的危险。
就包括组分混合物而不必分离百日咳杆菌中的每个组分的百日咳疫苗生产而言，一种可以得到的方法是使用磷酸钙凝胶(EP-A-291968，日本未审查专利No.52726/1989)。但是在该方法中，存在1M氯化钠的时，形成的磷酸钙并不吸附保护性组分。
如上所述，总的来讲，必须使用不同的纯化方法分离百日咳杆菌中的相应的保护性组分。由于辛苦的操作和实践应用难，所以该方法不适用于疫苗的大规模生产。此外，在现有技术中公开的分离保护性组分的常规方法还存在材料或试剂有致病性或毒性的问题。
针对上述背景，本发明人研究了有效分离百日咳杆菌的保护性组分的方法，发现在存在过量磷酸离子的条件下，向百日咳杆菌培养物中加入钙离子，可以有效地从百日咳杆菌中分离百日咳杆菌的保护性组分。在这一发现的基础上，本发明人作了进一步的研究，将有效安全分离保护性组分的方法与磷酸钙凝胶处理和盐洗脱以及加热结合在一起，构成了本发明。因此，本发明涉及：
(1)通过将百日咳杆菌培养物与磷酸钙凝胶接触而分离百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)，百日咳菌毛(FIM)和百日咳毒素(PT)中的至少一种的方法，所述磷酸钙凝胶是通过在存在磷酸离子的条件下，将钙离子加到培养物中而形成的。
(2)通过将百日咳杆菌培养物分离到细胞和培养液中并完成(A)，(B)，(C)和(D)步骤中的至少一个步骤而分离百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)，百日咳菌毛(FIM)和百日咳毒素(PT)中的至少一个成员的方法：(A)在此步骤中，用盐溶液洗脱分离的细胞，使洗脱的溶液与上述(1)中的磷酸钙凝胶接触而分离百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)，(B)在此步骤中，在存在盐溶液的条件下，将从上述步骤(A)中洗脱处理的细胞残留物加热，然后与磷酸钙凝胶接触，通过将洗脱的溶液与上述(1)中的磷酸钙凝胶接触而分离pertactin(PRN，69K-OMP)，(C)在此步骤中，在存在盐溶液的条件下，将从上述步骤(A)中洗脱处理的细胞残留物加热，将上清液与磷酸钙凝胶接触并用盐溶液洗脱，通过将洗脱的溶液与上述(1)中的磷酸钙凝胶接触而分离百日咳菌毛(FIM)，(D)在此步骤中，将培养物或分离培养液与上述(1)中的磷酸钙凝胶接触，从所述上清液中分离百日咳毒素(PT)。
(3)上述(2)中的分离方法，其中将所述上清液与磷酸钙凝胶接触，然后用盐溶液洗脱以分离在步骤(A)中的百日咳丝状血细胞凝集素。
(4)上述(2)中的分离方法，其中将所述上清液与磷酸钙凝胶接触后，与离子交换凝胶接触，以分离步骤(B)中的pertactin(PRN，69K-OMP)。
(5)上述(2)中的分离方法，其中将所述上清液与磷酸钙凝胶接触，然后除去，将所得的残留物用盐溶液洗脱以分离步骤(C)中的百日咳菌毛(FIM)。
(6)上述(2)中的分离方法，其中将所述上清液与离子交换凝胶接触以分离步骤(D)中的百日咳毒素(PT)。
(7)上述(2)中的分离方法，其中在步骤(A)和(C)中所用的盐溶液是含碱金属盐的缓冲液。
(8)上述(7)中的分离方法，其中所述盐溶液是含0.01-1.0M氯化钠的缓冲液。
(9)上述(1)或(2)中的分离方法，其中，在存在磷酸离子的条件下，将钙离子加到pH7-9的培养物或上清液中而形成磷酸钙凝胶。
(10)上述(9)中的分离方法，其中磷酸离子和钙离子的当量比为每当量钙离子1.25-30当量的磷酸离子。
(11)上述(9)中的方法论方法，其中存在0.05-0.1M磷酸盐缓冲液时，加入0.1-2w/v％的醋酸钙作为钙离子源而形成磷酸钙凝胶。
(12)上述(1)或(2)中的分离方法，其中分离百日咳毒素(PT)，百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)和百日咳菌毛(FIM)中的至少一个成员，此后，在存在硫酸铵的条件下，吸附到氢氧化铝凝胶上而除去内毒素。
(13)上述(1)或(2)中的分离方法，其中分离百日咳毒素(PT)，百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)和百日咳菌毛(FIM)中的至少一个成员，此后通过区离心除去内毒素。
(14)百日咳疫苗，其中PT∶FHA∶FIM的混合比例为4-6∶8-10∶1。
(15)百日咳疫苗，其中PT∶FHA∶∶PRN∶FIM的混合比例为2-6∶4-10∶1-1∶1。
用于本发明的百日咳杆菌菌株不受限制，只要它能够产生百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)百日咳菌毛(FIM)和百日咳毒素(PT)，所有百日咳杆菌保护性组分中的一个或一个以上的成员就行。有用的菌株包括已知菌株如百日咳杆菌TohamaPhase I菌株[Infection and Immunity，Vol.6，p.89，(1972)](保存在thenational institute of Health，Ministry of SocialWelfare，Tokyo，Japan(NIHJ1052)，自1980年8月13日保藏在theInstitute for Fermentation Osaka，保藏号为IFO14073)，百日咳杆菌Yamaguchi Phase I菌株，百日咳杆菌I期菌株18-322和百日咳杆菌I期菌株165，从生产率的角度看，优选的是百日咳杆菌Tohama Phase I菌株(IFO14073)。用已知的方法可以培养百日咳杆菌。有用的培养基包括已知的基本培养基，如Cohen-Wheeler培养基，StaineF-Scholte培养基和其他液体培养基，优选的是Stainer-Scholte培养基。含保护性组分和内毒素的溶液可以是通过静止培养或罐培养而得到的培养物。在本发明中，培养物指因培养所述百日咳杆菌而产生的培养细胞或培养液。而且在本发明中。上清液指因在存在盐溶液的条件下加热细胞或用来自按下述吸附保护性组分的磷酸钙凝胶的盐溶液洗脱而产生的培养物液体或上清液。细胞包括培养物细胞和细胞残留物。在本发明中，用于将百日咳杆菌培养物分离成细胞和培养物上清液的方法可以是已知方法，如离心或过滤。
用于本发明的磷酸钙凝胶不是已经制备好的凝胶，但优选的是存在过量磷酸离子时，将钙离子加到被处理的培养物或上清液中而形成的磷酸钙凝胶(可以称为内部凝胶形成方法)。通过制备好的磷酸钙凝胶(如市售的羟基磷灰石凝胶)。与使用制备好的上述羟基磷灰石凝胶(可以称为外部凝胶形成方法)的前种方法相比，正如下文所述，使用磷酸钙凝胶的本发明方法在百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)和百日咳菌毛(FIM)的吸附效率和其回收效率方面均较高。此外，由于不存在凝胶预处理和再生步骤，本发明中所用的磷酸钙凝胶在操作效率方面也更好，而且成本上更有利。另外，通过适当选择磷酸离子与钙离子的比例，可以选择性地将百日咳杆菌中的每种组分吸附到磷酸钙凝胶上。如果用磷酸钙凝胶处理培养获取上清液，所含的磷酸离子量不够，可以加入适当浓度的磷酸盐缓冲液以便在加入钙离子前提供磷酸离子。如，通过加入1M的磷酸盐缓冲液，将磷酸离子的终浓度调整到0.02-0.2M，优选的是0.05-0.1M。
可溶性钙盐是加入的钙离子源的例子，如醋酸钙，氯化钙和硝酸钙，优选的是来自醋酸钙的钙离子。有关磷酸离子和钙离子的比例，优选的是与钙离子相比，磷酸离子过量。按下文所述，针对百日咳杆菌中的每种保护性组分，可以适当选择所述比例。
在上述步骤(A)中，按如下分离百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)：用已知方法，如离心或过滤从百日咳杆菌培养物中取出培养液，如培养上清液后，将1/10-1/20体积(相对于培养液的量)(相当于50-100×109个细胞/ml的终浓度)的盐溶液加到细胞中以洗脱血细胞凝集素。在这种情况下，所用的盐溶液优选的是用碱金属盐或碱土金属盐补充的缓冲液，具体地是用0.25-1.0M碱金属盐或碱土金属盐补充的0.04-0.08M磷酸盐缓冲液，特别优选的是用0.5-1.0M碱金属盐补充的0.05M的磷酸盐缓冲液。加到缓冲液中的碱金属盐或碱土金属盐的实例是氯化钠，氯化钾和氯化镁。例如，优选的是通过将1/10-1/20体积(相对于培养液的量)的0.04-0.08M用-.5-1.0M氯化钠补充的磷酸盐缓冲液(pH7-9)，更优选的是0.05M用1M氯化钠补充的磷酸盐缓冲液(pH8)加到收集的细胞中，在4℃-室温，优选的8-15℃缓慢搅拌1-60分钟，优选的是1-30分钟并静置1-2天来洗脱血细胞凝集素。然后将含洗脱的百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)的溶液经已知方法，如离心或过滤以回收上清液(用通过该处理而同时得到的细胞残留物分离pertactin(PRN，69K-OMP)和百日咳菌毛(FIM))。然后将由此得到的上清液与磷酸钙凝胶接触。
就磷酸离子和钙离子的比例而言，优选的是与钙离子相比，磷酸离子过量。例如，这些离子的当量比优选的是每当量钙离子的1.25-10当量，更优选的是1.5-7.5当量的磷酸离子。可以将所述定量比例表达为0.8-20M的磷酸离子与1M钙离子的摩尔比，优选的是1-5M磷酸离子与1M钙离子的摩尔比。例如，向含在上述浓度范围内浓度(0.02-0.2M，优选的是0.05-1.0M)的磷酸离子的溶液(pH7-9)中加入钙盐达到4-70mM，优选的是8-50mM(如加入醋酸钙达到0.1-0.8w/v％，优选的是0.2-0.6w/v％)的终浓度，然后在4℃-室温，优选8-15℃缓慢反应1-4小时，优选1或2小时以形成磷酸钙凝胶。
尽管百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)被吸附到所加入的醋酸钙凝胶上，条件是将磷酸钙凝胶的量加到超过0.8w/v％的终浓度，优选的是以落在上述浓度范围内的终浓度量加入醋酸钙凝胶以便只选择性地吸附百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)。在完成反应后，用已知方法，如离心或过滤除去所述上清液；收集所得的凝胶沉淀。为了沉淀，加入1/10-1/20体积(相当于培养液的量)的盐溶液以洗脱百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)。在这种情况下，所用的盐溶液可以与从上述细胞中洗脱百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)所用的相同的盐溶液。优选的是将1/10-1/20体积(相当于培养液的量)用1-2M氯化钠补充的0.05-0.1M磷酸盐缓冲液(pH7-9)，更优选的是用1-1.5M氯化钠补充的0.1M磷酸盐缓冲液(pH8)加入到上述凝胶沉淀中，然后在4℃-室温，缓慢搅拌1-2小时以洗脱所述血细胞凝集素。在完成搅拌后，用已知方法，如离心或过滤除去沉淀以回收上清液中的百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)。如果需要，可以通过盐析或用超滤膜浓缩所述上清液，并脱盐。使用上述处理达到的上清液经下述的氢氧化铝凝胶处理或区离心，基本上没有损失地分离选择性除去了内毒素的百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)。
在上述步骤(B)或(C)中，按如下分离pertactin(PRN，69K-OMP)和百日咳菌毛(FIM)：存在1/10-1/20体积(相当于培养液的量)(相当于500-100×109细胞/ml的终浓度)盐溶液的条件下，加热含百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)的从洗脱溶液而得到的细胞残留物以便提取pertactin(PRN，69K-OMP)。在这种情况下，所用的盐溶液与上述(A)中所用的相同。但是，优选的是使用1/10-1/20体积(相当于培养液的量)用0.01-0.25M氯化钠补充的0.01-0.05M磷酸盐缓冲液(pH7-9)，更优选的是用0.15-0.25 M氯化钠补充的0.1M磷酸盐缓冲液(pH7)。优选的是在40-80℃，优选的50-60℃的热水中加热60-120分钟，优选的80-90分钟。用已知方法，如离心或过滤回收上清液中的的热提取的pertactin(PRN，69K-OMP)和百日咳菌毛(FIM)。然后将由此得到的上清液与磷酸钙凝胶接触。在这种情况下，按上述步骤(A)可以完成磷酸钙凝胶；但是优选的是在下列浓度内完成。例如，向含磷酸离子的溶液(pH7-9)(通过加入1M磷酸盐缓冲液等，按需要调整到0.05-0.1M，优选的1M的终磷酸离子浓度)中加入钙盐达到40-180mM，优选的55-150mM(如加入的醋酸钙达到1-2w/v％，优选的1.3-1.7w/v％的终浓度)，然后在4℃-室温，优选的8-15℃缓慢反应1-4小时，优选的1-2小时以形成磷酸钙凝胶。完成该反应后，用已知的分离方法，如过滤或离心将所得的沉淀和上清液彼此分离以基本上没有损失地回收上清液中的pertactin(PRN，69K-OMP)和在凝胶残留物中的百日咳菌毛(FIM)。
用已知方法，优选的用离子交换凝胶处理可以进一步纯化用上述处理达到的粗纯化的pertactin(PRN，69K-OMP)，优选的是预先浓缩粗纯化的pertactin(PRN，69K-OMP)用硫酸铵盐析或用超滤膜脱盐。在本发明中，有用的离子交换凝胶包括阴离子交换凝胶和阳离子交换凝胶，优选的是阳离子交换凝胶。用柱层析方法或分批方法可以完成与离子交换凝胶的接触。通过该处理，吸附杂质，即在粗纯化的pertactin(PRN，69K-OMP)中除pertactin(PRN，69K-OMP)以外的物质；收集流出物以达到含pertactin(PRN，69K-OMP)的溶液中。用柱层析方法，用离子交换凝胶装柱，起始材料即粗纯化的pertactin(PRN，69K-OMP)以100-500ml/cm2/小时的流速通过该柱。用分批方法，将粗纯化的pertactin(PRN，69K-OMP)放在容器中，直接向其中加入离子交换凝胶，然后搅拌约30-3小时，优选的约1小时，以吸附杂质，即除pertactin(PRN，69K-OMP)的物质。用pH5.0-8.0和100-300umho(0.1-3.0mS)电导率的缓冲液，如0.01-0.02M磷酸盐缓冲液(pH5.5-6.0)吸附损失杂质。通过使上述处理得到的上清液经下述的氢氧化铝凝胶处理或区离心处理，基本上没有损失就可以分离已除去了内毒素的pertactin(PRN，69K-OMP)。
向用上述处理而得到的含粗百日咳菌毛(FIM)的凝胶残留物中加入1/10-1/20体积(相对于培养液的量)的盐溶液，以洗脱百日咳菌毛(FIM)。在这种情况下，盐溶液可以与上述步骤(A)中所用的相同。例如，优选的是加入1/10-1/20体积(相对于培养液的量)用1-2M氯化钠补充的0.05-1.0M磷酸盐缓冲液(pH7-9)，优选的用1-1.5M氯化钠补充的0.1M磷酸盐缓冲液(pH8)，然后在4℃-室温缓慢搅拌1-2小时以洗脱百日咳菌毛(FIM)。完成搅拌后，用已知方法，如离心或过滤取出沉淀，以回收上清液中的百日咳菌毛(FIM)。将上述处理后得到的上清液经氢氧化铝凝胶处理或区离心处理，可以基本上没有损失地得到选择性除去了内毒素的百日咳菌毛(FIM)。
在上述步骤(D)中，按下列步骤分离百日咳毒素(PT)：尽管在该步骤中，不必将百日咳杆菌培养物分成培养的细胞和培养物上清液，但就效率而论，优选的是用已知方法，如离心或过滤从百日咳杆菌中回收上清液，用超滤膜等将上清液浓缩约10-20倍，然后在该步骤前通过离心力或另一种方法收集上清液。然后将上清液与磷酸钙凝胶接触。在这种情况下，可以用与上述步骤(A)相同的方法完成磷酸钙凝胶处理，但优选的是在下列浓度范围内完成所述处理。例如，向含磷酸离子的溶液(pH7-9)(按需要通过加入1M磷酸盐缓冲液等而将磷酸离子终浓度调整到0.05-1.0M，优选的0.1M)中加入钙盐，达到40-180mM，优选的55-150mM的终浓度(如加入醋酸钙达到1-2w/v％，优选的1.3-1.7w/v％的终浓度)，然后在4℃-室温，优选8-15℃缓慢反应1-4小时，优选1-2小时以形成磷酸钙凝胶。完成所述反应后，用已知方法，如离心或过滤将所得的沉淀和上清液彼此分离以便基本上无损失地回收上清液中的百日咳毒素(PT)。通过离子交换凝胶处理，进一步纯化经上述处理得到的粗纯化的百日咳毒素(PT)；优选的是预先浓缩并用硫酸铵盐析或超滤膜浓缩粗纯化的百日咳毒素(PT)。在此所用的离子交换凝胶的实例电话阴离子交换凝胶和阳离子交换凝胶，优选阳离子交换凝胶。通过柱层析方法或分批法可以完成与离子交换凝胶的接触。通过所述处理，在粗纯化的百日咳毒素(PT)中的百日咳毒素(PT)被吸附到凝胶上，然后用适当的缓冲液洗涤以洗脱并除去杂质，此后，用适当pH和离子强度的缓冲液洗脱并分离百日咳毒素(PT)。在柱层析方法中，用离子交换凝胶装柱，起始材料，即粗纯化的百日咳毒素(PT)以100-500ml/cm2/小时的流速通过该柱以吸附毒素。在分批方法中，将粗纯化的百日咳毒素(PT)放在容器中，向其中直接加入离子交换凝胶，然后搅拌约30分钟-3小时，优选约1小时，以便吸附毒素。用PH为5.0-6.0和电导率为100-300umho(0.1-0.3mS)的缓冲液，如0.01-0.02M磷酸盐缓冲液(pH5.5-6.0)吸附粗纯化的百日咳毒素(PT)。用PH为7.0-7.5和电导率为1000-2000umho(1-2mS)的缓冲液，如0.1-0.2M磷酸盐缓冲液(pH7.0-7.5)从已经吸附了百日咳毒素(PT)的离子交换凝胶上洗脱百日咳毒素。使通过上述处理而得到的洗脱物将下述的氢氧化铝凝胶处理或区离心处理，可以基本上不损失地分离已选择性除去了内毒素的百日咳毒素(PT)。
在本发明中，完成用于除去内毒素的氢氧化铝凝胶处理以便通过将所述材料与存在硫酸铵时预先制备的氢氧化铝凝胶接触，从而只选择性地吸附内毒素。但是，氢氧化铝凝胶(其量低于WO93/10216中所用的1/10)几乎不吸附任何量的百日咳杆菌的的保护性组分。填充优选的是在用已知方法浓缩后，如硫酸铵盐析或处理膜方法后，完成所述处理。用于预先制备的氢氧化铝凝胶的铝离子包括可溶的铝化合物的那些，如硫酸铝，氯化铝，优选氯化铝的铝离子。优选通过将2M氢氧化钠溶液加到25-190mM铝盐溶液(如0.9-4.5％氯化铝溶液)中而制备pH为7.0-7.5的氢氧化铝，在4℃-室温缓慢反应1-3小时以形成所需的氢氧化铝凝胶。然后处理用上述处理得到的氢氧化铝凝胶以回收用已知方法，如过滤或离心得到的凝胶沉淀以便在所述反应后，除去游离的铝离子。通过离心回收用已知方法，如硫酸铵盐析浓缩的百日咳杆菌保护性组分；将所述沉淀溶解在用0.25M氯化钠补充的0.25M磷酸盐缓冲液(pH7.0-7.5)中。向该百日咳杆菌保护性组分中加入饱和的硫酸铵得到2.0-8.0v/v％的终浓度，然后加入预先制备的，回收的氢氧化铝凝胶得到0.1-1.0mg/ml，优选0.2-0.5mg/ml的终浓度，在4℃-室温缓慢反应30分钟-1小时。完成反应后，用已知方法，如过滤或离心除去氢氧化铝以便不损失地分离已除去了内毒素的百日咳杆菌保护性组分。
在本发明中，完成区离心以除去内毒素，而且优选在用已知方法，如硫酸铵盐析浓缩后完成。区离心方法包括蔗糖密度梯度离心，氯化铯密度梯度离心和酒石酸钾密度梯度离心，优选蔗糖密度梯度离心。例如，在0-30％w/v％的蔗糖密度梯度上以60000-122000G离心约10-24小时而完成蔗糖密度梯度离心后，可以分离已除去了内毒素的百日咳杆菌保护性组分。
通过使用British Journal of Experimental Pathslogy，Vol.44，p.177(1963)中描述的常规解毒技术，将PT解毒。用在日本未审查专利No52726/1989中描述的方法可以将FHA，PRN和FIM灭活。通过以任何所需的比例混合用本发明方法得到的百日咳杆菌保护性组分，可以生产优于已知的百日咳疫苗的改善的纯化的百日咳组分疫苗。即不可能改变在全细胞或共纯化的无细胞疫苗中稳定的各组分的比例，而不需得到分别纯化的组分，而用本发明方法可以选择在人中作为百日咳疫苗的抗原的比例，原因是在本发明中有效地纯化了各组分。需要纯化的百日咳组分疫苗以便以尽可能小的总蛋白质量混合保护性组分并得到更有效的免疫原性。本发明纯化的百日咳组分疫苗优选的包括所有三种组分，即，FHA，FIM和PT，而且还可包括其他不产生不需要副作用的药物学可接受的组分如PRN。
当将这些组分混合以生产本发明纯化的百日咳组分疫苗时，在下文实施例中举证了其比例。本发明组分疫苗PT∶FHA∶FIM的比例近似是4-6∶8-10∶1，优选，5-6∶8-10∶1，而且例如含有，20-30μg蛋白质/ml的PT，40-50μg蛋白质/ml的FHA和5-10μg蛋白质/ml的FIM，优选25-30μg蛋白质/ml的PT，40-50μg蛋白质/ml的FHA和5μg蛋白质/ml的FIM。上述组分疫苗还可包含5-10μg蛋白质/ml的PRN，而且PT∶FHA∶PRN∶FIM的比例为2-6∶4-10∶1-2∶1，优选5-6∶8-10∶2∶1。即，优选的它含有25-30μg蛋白质/ml的PT，40-50μg蛋白质/ml的FHA，10μg蛋白质/ml的PRN和5μg蛋白质/ml的FIM。
可以将本发明的上述效果总结如下：本发明方法的特征在于使用同样的方法纯化所有的百日咳杆菌主要保护性组分。这样不需要象现有技术那样，因不同的组分而需要不同的烦琐过程，因此，可以高效率和高回收率地纯化每个组分，对于工业生产是非常有利的一个方面。另外，内毒素含量(用Limulus试验确定的)对于本发明得到的所有百日咳杆菌的保护性组分来说，每100μg蛋白质不超过1ng，这样提供了很高的实用价值。还可以有效地生产改进纯化的百日咳组分疫苗，该疫苗包括百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)，百日咳菌毛(FIM)和百日咳毒素(PT)的有效组合。
实施例
下文通过下列实施例和参考例(但不限于这些例子)来更详细地描述本发明。在下面的描述中，百日咳毒素(PT)，百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)，百日咳菌毛(FIM)和内毒素也分别称之为PT，FHA，69K-OMP，FIM和ET。
实施例1
使用Stainer-Scholte培养基通过Roux瓶静止培养(450ml，35℃，5天)和罐搅拌培养(40l，35℃，2天)将百日咳杆菌Tohama I期菌株培养至最终浓度为2×109个细胞/ml，得到百日咳杆菌培养物。
使用超滤膜将细胞培养物浓缩至十分之一体积，在此之后离心分离上清液和细胞。向上清液中加入1M磷酸盐缓冲溶液(pH8.0)至最终浓度为0.1M，接着加入醋酸钙溶液至最终浓度为1.6w/v％并在室温搅拌1小时。过滤该磷酸钙凝胶溶液。浓缩所得的滤液并使用超滤膜脱盐至电导为200欧姆，通过一个磺丙基阳离子交换层析柱(Tosoh Corporation生产)，用0.01M磷酸盐缓冲溶液(pH6.0)洗涤，并用0.1M磷酸盐缓冲溶液洗脱，得到百日咳毒素(PT)。其次，将细胞分散在十分之一体积(相对于培养液的量)的补充有1M氯化钠的0.05M磷酸盐缓冲溶液(pH8.0)中，接着离心分离得到上清液和细胞。向该上清液加入醋酸钙溶液至最终浓度为0.5w/v％，接着在室温搅拌1小时。过滤该磷酸钙凝胶溶液；收集得到的凝胶层。用补充有0.15M氯化钠的0.01M磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)洗脱该凝胶层得到含有百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)的溶液。分别地，将细胞分散在十分之一体积(相对于培养液的量)的补充有1M氯化钠的0.05M磷酸盐缓冲溶液(pH8.0)中，在此之后在60℃的温水中加热90分钟，接着离心分离得到上清液。向上清液中加入1M磷酸盐缓冲溶液(pH8.0)至最终浓度为0.1M，之后加入醋酸钙溶液至最终浓度为1.6w/v％，接着在室温搅拌1小时。过滤该磷酸钙凝胶溶液，收集滤液和凝胶层。浓缩所得的滤液并使用超滤膜脱盐至电导为200欧姆和通过一个磺丙基阳离子交换层析柱(Tosoh Corporation生产)；收集洗脱液得到含有pertactin(PRN，69K-OMP)的溶液。分别地，用补充有1M氯化钠的0.05M磷酸盐缓冲溶液(pH8.0)洗脱凝胶层得到含有百日咳菌毛(FIM)的溶液。
对照例制备如下：每升培养液加入220g硫酸铵，接着充分搅拌。在4℃保持约14天后，离心分离该混合物；除去上清液，并收集沉淀物。向这样得到的沉淀物加入十分之一体积(相对于培养液)的补充有1M氯化钠的0.05M磷酸盐缓冲溶液(pH8.0)，接着充分搅拌。在4℃保持约4天后，再离心分离该混合物；收集上清液得到含有百日咳毒素(PT)，百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)或百日咳菌毛(FIM)的溶液。
通过ELISA，用纯化的百日咳内毒素(PT)，百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)，百日咳菌毛(FIM)的制品作为参考确定百日咳毒素(PT)，百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)或百日咳菌毛(FIM)在每个样品中的含量。结果以μg蛋白质/ml的单位表示。
蛋白质含量的确定：用加热的三氯醋酸沉淀的蛋白质通过Lowry法用牛血白蛋白(Fraction V，Wako Pure ChemicalIndustries生产)作为参考定量。结果以μg蛋白质/ml的单位表示。
Roux瓶培养液的结果和罐培养液的结果分别示于表1和表2。
表1
*每个数值表示相对于对照组的百分数。
| 样品 | 活性成分蛋白含量(μg蛋白质/ml) | 回收*(％) | 总蛋白质含量(μg蛋白质/ml) | 纯度(％)(活性成分蛋白质含量/总蛋白质含量) |
| PT | 2656.8 | 90.0 | 2662.1 | 99.8 |
| FHA | 9161.7 | 85.0 | 9339.1 | 98.1 |
| FIM | 474.7 | 244.6 | 495.5 | 95.8 |
| 69K-OMP | 3683.8 | 244.6 | 3607.2 | 102.1 |
表2
| 样品 | 活性成分蛋白质含量(μg蛋白质/ml) | 回收*(％) | 总蛋白质含量(μg蛋白质/ml) | 纯度(％)活性成分蛋白质含量/总蛋白质含量 |
| PT | 3242.2 | 78.9 | 3359.8 | 96.5 |
| FHA | 9527.0 | 98.0 | 9752.9 | 97.7 |
| FIM | 675.0 | 1184.0 | 714.7 | 95.0 |
| 69K-OMP | 4333.5 | 2364.0 | 4505.1 | 96.3 |
*每个数值表示相对于对照组的百分数。
从这些数值明显看出，每个保护性组分被有效地分离了，并且在罐培养液的情况下，pertactin(PRN，69K-OMP)和百日咳菌毛(FIM)(两者在Roux瓶培养液的情况下产率均低)的回收量很大。
参考例1
向用实施例1中所述方法制备的对照溶液中加入醋酸钙至最终浓度为0.5w/v％，接着在室温下搅拌1小时。将一半量的饱和硫酸铵溶液加入到通过过滤该钙溶液得到的滤液中；该混合物在4℃保持7天。离心分离硫酸铵盐析出的产物；收集所得的沉淀并将其再悬浮在补充有0.25M氯化钠的0.025M磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)中得到起始原料。将氢氧化铝凝胶(预先制备成最终浓度为0.4mg/ml)加入到这一起始原料中；将硫酸铵加入到通过离心分离回收的氢氧化铝中至最终浓度为0，2，4或8w/v％，接着在室温下缓慢搅拌30分钟。反应完成之后，通过离心分离除去氢氧化铝凝胶以便分离上清液。用下面所述的方法测定每个上清液的血细胞凝集活性和内毒素含量。结果示于表3。
血细胞凝集活性的测定：在样品被连续地用0.01M的磷酸盐缓冲的盐水稀释2倍之后，加入0.6v/v％chick固定的红血细胞引起血细胞凝集。每个样品显示出血细胞凝集的最大稀释率作为血细胞凝集素滴定度HA。内毒素(ET)含量的测定：使用大肠杆菌(Difico055-B5)作为参考菌株，通过Limulus试验(Wako Pure Chemical Kit)测定ET含量。结果以ng/ml的单位表示。从表3可以明显看出，通过在硫酸铵存在的条件下用预先制备的氢氧化铝凝胶处理样品，可以选择性地除去内毒素，而不损失活性组分。
表3
| 加入的硫酸铵量(w/v％) | 内毒素含量(ng/ml) | HA 值(HAU/ml) | HA回收率*(％) |
| 0 | 15.8 | 16000 | 50.0 |
| 2 | 11.1 | 32000 | 100.0 |
| 4 | ＜9.0 | 32000 | 100.0 |
| 8 | ＜9.0 | 24000 | 75.0 |
*每个内毒素除去率即HA回收率的数值是相对于预处理数值的百分数。
实施例2
将一半量的饱和的硫酸铵溶液加入到在实施例1中得到的百日咳毒素(PT)，百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)和百日咳菌毛(FIM)的每一个中，接着充分搅拌。在4℃保持一周之后，再离心分离该混合物；收集所得的沉淀。
把该沉淀溶解在补充有0.25M氯化钠的0.025M磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)中得到百日咳毒素(PT)，百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)，或百日咳菌毛(FIM)溶液。将饱和的硫酸铵溶液加入到每个溶液中至最终浓度为4.0v/v％。将预先制备的，回收的氢氧化铝凝胶加入到该混合物中至最终浓度为0.4mg/ml，接着在室温下缓慢搅拌30分钟。反应完成后，通过离心分离除去氢氧化铝凝胶得到百日咳毒素(PT)，百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)和百日咳菌毛(FIM)。
百日咳毒素(PT)含量，百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)含量，pertactin(PRN，69K-OMP)含量和百日咳菌毛(FIM)含量用与在实施例1中同样的方法测定；而内毒素的含量用与在参考例1中同样的方法测定。结果示于表4。
表4
| 样品 | 内毒素含量(ng/100μg蛋白质) | 活性成分蛋白质含量(μg蛋白质/ml) | 回收率＊(％) |
| PT | 0.01 | 2999.0 | 82.5 |
| FHA | 0.11 | 9060.2 | 95.1 |
| FIM | 0.54 | 478.6 | 70.9 |
| 69K-OMP | 0.08 | 3505.8 | 80.9 |
*回收率的数值表示相对于预处理数值的百分数。
从此表可以明显看出，内毒素被选择性地除去，同时基本上没有损失保护性组分，对于所有组分每100μg蛋白质/ml内毒素含量不大于1ng/ml。
实施例3
将一半量的饱和的硫酸铵溶液加入到在实施例1中得到的百日咳毒素(PT)，百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)，百日咳菌毛(FIM)的每一个中，接着充分搅拌。在4℃保持一周之后，再离心分离该混合物；收集所得的沉淀。把该沉淀溶解在补充有1M氯化钠的0.05M磷酸盐缓冲溶液(pH8.0)中，在此之后通过试管法使用补充有1M氯化钠的0.05M磷酸盐缓冲溶液(pH8.0)作为外部流体进行渗析，得到百日咳毒素(PT)，百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)或百日咳菌毛(FIM)溶液。浓缩的渗析液在蔗糖密度梯度为1-30w/w％进行蔗糖梯度密度离心分离并在Rmax为64900G条件下约18小时。完成离心分离之后，把34w/w％的蔗糖送入低转速的旋转器中收集馏份。
百日咳毒素(PT)含量，百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)含量，pertactin(PRN，69K-OMP)含量和百日咳菌毛(FIM)含量用与在实施例1中同样的方法测定；而内毒素的含量用与在参考例1中同样的方法测定。结果示于表5。
表5
| 样品 | 内毒素含量(ng/100μg蛋白质) | 活性成分蛋白质含量(μg蛋白质/ml) | 回收率：*(％) |
| PT | 0.04 | 231.2 | 82.5 |
| FHA | 0.01 | 849.4 | 79.3 |
| FIM | 0.20 | 49.1 | 80.3 |
| 69K-OMP | 0.03 | 319.8 | 92.0 |
*回收率的数值表示相对于预处理数值的百分数。
从此表可以明显看出，内毒素被选择性地除去，同时基本上没有损失保护性组分，对于所有组分每100μg蛋白质/ml内毒素含量不大于1ng/ml。
实施例4
向在实施例3中得到的PT中加入***外加氨基酸例如赖氨酸至最终浓度为0.4v/v％，通过混合之后，让其在39℃在恒温箱中保持21-35天。
向在实施例3中得到的FHA，69K-OMP和FIM的每一个中加入***至最终浓度为0.4v/v％，通过混合之后，让其在39℃在恒温箱中保持7天。
如上处理的每个这些组分用补充有0.15M氯化钠的1mM磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)进行渗析，得到解毒的PT，无活性的FHA，无活性的69K-OMP和无活性的FIM。
这些解毒的或无活性的组分以示于表6和表7中的几个比例混合，并且接着加入氯化铝至最终浓度为0.2mg/ml，分别得到疫苗。
老鼠与这些混合的疫苗的内脑效力试验结果示于表6和表7。试验按照日本生物制品的最低要求(日本生物制造商协会)的方法进行。
表6
| 相应保护性组分的蛋白质含量(μg蛋白质/ml) | 小鼠脑内效力 | ||||
| PT | FHA | FIM | 69K-OMP | IU/ml | 50％有效剂量(μg蛋白质) |
| 10 | 40 | 0 | 0 | 10.9 | 1.06 |
| 20 | 30 | 0 | 0 | 13.4 | 0.89 |
| 20 | 40 | 0 | 0 | 11.6 | 1.18 |
| 20 | 50 | 0 | 0 | 13.6 | 1.18 |
| 20 | 80 | 0 | 0 | 12.6 | 1.81 |
| 30 | 40 | 0 | 0 | 19.3 | 0.85 |
| 40 | 40 | 0 | 0 | 18.7 | 1.04 |
表7
| 相应保护性组分的蛋白质含量(μg蛋白质/ml) | 小鼠脑内效力 | ||||
| PT | FHA | FIM | 69K-OMP | IU/ml | 50％有效剂量(μg蛋白质) |
| 25 | 25 | 0 | 0 | 19.5 | 1.18 |
| 25 | 25 | 5 | 0 | 26.0 | 0.98 |
| 25 | 25 | 0 | 10 | 24.1 | 1.18 |
| 25 | 25 | 5 | 10 | 19.3 | 1.60 |
| 25 | 50 | 0 | 0 | 24.1 | 1.47 |
| 25 | 50 | 5 | 0 | 22.2 | 1.70 |
| 25 | 50 | 0 | 10 | 23.7 | 1.68 |
| 25 | 50 | 5 | 10 | 24.8 | 1.71 |
从这些数值可以明显看出，无活性的69K-OMP和无活性的FIM两者对老鼠的内脑效力有很小的作用，并且在含有大于25μg蛋白质/ml解毒PT的混合疫苗中没有观察到明显的不同。
实施例5
用在实施例4中得到的混合疫苗进行老鼠空气传染预防能力试验。每个稀释到三分之一的疫苗分别以0.2ml的稀释疫苗量皮下给药到4周大的老鼠上。在给药4周后，每个老鼠通过使用气溶室用百日咳杆菌的18-323I期菌株进行通气传染，在传染10天后，打开每个老鼠的腹部并且从感染的老鼠中取出气管和肺。
将每个匀浆的组织样品用于Bordet-Gengou琼脂。该琼脂在35℃培养5天并计数百日咳杆菌的菌落数。
根据无给药老鼠的菌落数计算保护剂量。
在气管的情况下，计算75％保护剂量，而在肺的情况下，计算50％保护剂量。结果以μg蛋白质表示。
以高给药剂量组计算生长抑制率。生长抑制率的公式如下：结果示于表8。
表8
| 相应保护性组分的蛋白质含量(μg蛋白质/ml) | 气管 | 肺 | |||||
| 75％保护剂量(μg蛋白质) | 生长抑制率(％) | 50％保护剂量(μg蛋白质) | 生长抑制率(％) | ||||
| PT | FHA | FIM | 69K-OMP | ||||
| 40 | 40 | 0 | 0 | 3.75 | 97.5 | 1.00 | 89.9 |
| 20 | 80 | 0 | 0 | 4.76 | 87.7 | 1.10 | 92.6 |
| 25 | 50 | 0 | 0 | 4.14 | 89.5 | 0.96 | 89.7 |
| 25 | 50 | 5 | 0 | 1.07 | 100 | 0.49 | 100 |
| 25 | 50 | 0 | 10 | 1.74 | 100 | 0.49 | 100 |
| 25 | 50 | 5 | 10 | 0.52 | 100 | 0.26 | 100 |
从此表可以明显看出，无活性的69K-OMP和无活性的FIM两者对老鼠的内脑效力有很小的作用，但它们均显示出对空气传染能力的预防作用。
试验实施例1
磷酸钙凝胶(内部凝胶)成形和羟基磷灰石凝胶(外部凝胶)之间对FHA和FIM吸收性能的差异。
用述于实施例1中的方法制备Roux瓶静止培养物。使用超滤膜将细胞培养物浓缩至十分之一体积，在此之后离心分离上清液(样品a)和细胞。将细胞分散在十分之一体积的补充有1M氯化钠的0.05M磷酸盐缓冲溶液(pH8.0)中并很好地搅拌。保持在4℃4天，接着离心分离得到洗脱的含有PT，FHA，69K-OMP和FIM的上清液(样品b)。
上述的培养物上清液(样品a)和洗脱的上清液(样品b)按照下面1)或2)处理。
1)磷酸钙凝胶(内部凝胶)成形处理
将1M磷酸盐缓冲溶液(pH8)加入到样品中，接着加入醋酸钙溶液至最终浓度为0.5w/v％，1.0w/v％或2.0w/v％并在室温缓慢地搅拌1小时，接着在1000rpm下离心分离10分钟成为上清液和凝胶残余物。通过用补充有1M氯化钠的0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH8.0)洗脱凝胶残余物得到洗脱溶液。
2)羟基磷灰石凝胶(外部凝胶)处理
用0.01M磷酸盐缓冲溶液(pH8.0)平衡羟基磷灰石凝胶(BDHChemical Ltd生产)。将该凝胶加入到20w/v％，10w/v％或50w/v％(对于样品体积)并在室温搅拌1小时，接着通过在1000rpm离心分离10分钟从凝胶残余物中分离上清液。通过用补充有1M氯化钠的0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH8.0)洗脱凝胶残余物得到洗脱溶液。
通过ELISA用FHA或FIM作为house参考确定每个样品中的FHA或FIM的含量。分析结果μg蛋白质/ml的单位表示。蛋白质含量：用加热的三氯醋酸沉淀的蛋白质通过Lowry法用牛血白蛋白(Fraction V，Wako Pure Chemical Industries生产)作为参考定量。结果以μg蛋白质/ml的单位表示。
分别用下面公式计算凝胶对FHA和FIM的吸收率和回收率。
结果示于表9和表10。
表9a)培养物上清液
| FHA | FIN | ||||
| 吸附率(％) | 回收率(％) | 吸附率(％) | 回收率(％) | ||
| 加入的醋酸钙浓度(w/v％) | 0.51.02.0 | 89.790.489.5 | 69.663.044.4 | 0.095.094.3 | 0.077.998.4 |
| 加入的羟基磷灰石的浓度(w/v％) | 2.010.050.0 | 25.449.590.8 | 27.526.448.9 | 0.07.922.1 | 0.04.15.3 |
表10
b)用补充有1M-NaCl的0.05M磷酸盐缓冲溶液(pH8.0)从细胞洗脱的溶液
| FHA | FIN | ||||
| 吸时率(％) | 回收率(％) | 吸附率(％) | 回收率(％) | ||
| 加入的醋酸钙浓度(w/v％) | 0.51.02.0 | 96.398.798.7 | 87.261.055.1 | 18.799.999.8 | 12.574.394.3 |
| 加入的羟基磷灰石浓度(w/v％) | 2.010.050.0 | 10.84.715.6 | 1.03.816.7 | 4.69.713.5 | 1.13.98.2 |
磷酸钙凝胶(内部凝胶)很强地吸附FHA和FIM，但羟基磷灰石凝胶对FIM有小的吸收作用。与磷酸钙凝胶相比，羟基磷灰石凝胶对FHA也有小的吸收作用并且取决于加入的体积。
本发明方法的特征在于使用同样的方法纯化所有的百日咳杆菌主要保护性组分。因此可以高效率和高回收率地纯化每个组分，对于工业生产是非常有利的一个方面。还可以有效地生产改进纯化的百日咳组分疫苗，该疫苗包括百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69K-OMP)，百日咳菌毛(FIM)和百日咳毒素(PT)的有效组合。
Claims (15)
1.通过将百日咳杆菌培养物与磷酸钙凝胶接触而分离百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69-OMP)，百日咳菌毛(FIM)和百日咳毒素(PT)中的至少一个成员的方法，所述磷酸钙凝胶是通过在存在磷酸离子的条件下，将钙离子加到培养物而形成的。
2.通过将百日咳杆菌培养物分成细胞和培养液，然后完成至少步骤(A)，(B)，(C)和(D)中的一个而分离百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69-OMP)，百日咳菌毛(FIM)和百日咳毒素(PT)中的至少一个成员的方法：(A)在此步骤中，用盐溶液洗脱分离的细胞，使洗脱的溶液与权利要求1中的磷酸钙凝胶接触而分离百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)，(B)在此步骤中，在存在盐溶液的条件下，将从上述步骤(A)中洗脱处理的细胞残留物加热，然后与磷酸钙凝胶接触，通过将洗脱的溶液与权利要求1中的磷酸钙凝胶接触而分离pertactin(PRN，69K-OMP)，(C)在此步骤中，在存在盐溶液的条件下，将从上述步骤(A)中洗脱处理的细胞残留物加热，将上清液与磷酸钙凝胶接触并用盐溶液洗脱，通过将洗脱的溶液与权利要求1中的磷酸钙凝胶接触而分离百日咳菌毛(FIM)，(D)在此步骤中，将培养物或分离培养液与权利要求1中的磷酸钙凝胶接触，从所述上清液中分离百日咳毒素(PT)。
3.权利要求2的分离方法，其中将所述上清液与磷酸钙凝胶接触，然后用盐溶液洗脱以分离步骤(A)中的百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)。
4.权利要求2的分离方法，其中将与磷酸钙凝胶接触过的所述上清液与离子交换凝胶接触以分离pertactin(PRN，69K-OMP)。
5.权利要求2的分离方法，其中将所述上清液与磷酸钙凝胶接触，然后除去，将所得的残留物用盐溶液洗脱以分离组织(C)中的百日咳菌毛(FIM)。
6.权利要求2的分离方法，其中将所述上清液与离子交换凝胶接触以分离步骤(D)中的百日咳毒素(PT)。
7.权利要求2的分离方法，其中在步骤(A)和(C)中所用的盐溶液是含碱金属盐的缓冲液。
8.权利要求7的分离方法，其中所述盐溶液是含0.01-1.0M氯化钠的缓冲液。
9.权利要求1或2的分离方法，其中通过在存在磷酸离子时，将钙离子加到pH7-9的培养物或上清液中而形成磷酸钙凝胶。
10.权利要求9的分离方法，其中磷酸离子和钙离子的当量比为每当量钙离子1.25-30当量磷酸离子。
11.权利要求9的分离方法，其中存在0.05-1.0M磷酸盐缓冲液时，以0.1-2w/v％加入醋酸钙作为钙离子源而形成磷酸钙凝胶。
12.利要求1或2的分离方法，其中分离了百日咳毒素(PT)，百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69-OMP)，和百日咳菌毛(FIM)中的至少一个成员，此后通过存在硫酸铵时，吸附到氢氧化铝凝胶上而除去内毒素。
13.权利要求1或2的分离方法，其中分离了百日咳毒素(PT)，百日咳丝状血细胞凝集素(FHA)，pertactin(PRN，69-OMP)，和百日咳菌毛(FIM)中的至少一个成员，此后用区离心除去内毒素。
14.百日咳疫苗，其中以4-6∶8-10∶1的比例混合组分PT∶FHA∶FIM。
15.百日咳疫苗，其中以2-6∶4-10∶1-2∶1的比例混合组分PT∶FHA∶PRN∶FIM。
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