DE69434079T2 - Plasmid zur Herstellung von CRM-Protein und Diphtherie-Toxin - Google Patents

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)

Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Herstellen von Diphtherie-Toxin oder CRM-Protein, das kreuzreaktiv mit Diphtherie-Toxin ist, ein Verfahren zum Exprimieren von Diphtherie-Toxin oder CRM-Protein, das kreuzreaktiv mit Diphtherie-Toxin in einem Wirt ist, und ein Mikroorganismus der Art Corynebacterium diphtheria Stamm C7, der mit einem solchen Plasmid transformiert ist.
  • Hintergrund
  • Das CRM197-Protein ist eine nicht toxische Form von Diphtherie-Toxin, doch ist es immunologisch nicht von Diphtherie-Toxin zu unterscheiden. CRM197 wird durch C. diphtheriae produziert, das durch die nicht toxigene Phage ß197tox-, erzeugt durch Nitrosoguanidin-Mutagenese der toxigenen Corynephage ß, infiziert ist (T. Uchida et al., 1971, Nature New Biology, 233:8–11). Das CRM197-Protein hat das gleiche Molekulargewicht wie das Diphtherie-Toxin, unterscheidet sich davon aber durch eine einzige Basenänderung (Guanin zu Adenin) im Strukturgen. Diese einzige Basenänderung erzeugt eine Aminosäure-Substitution (Glutaminsäure für Glycin) im ausgereiften Protein und beseitigt die toxischen Eigenschaften von Diphtherie-Toxin. Das CRM197-Protein ist ein sicherer und wirksamer T-Zellen-abhängiger Träger für Saccharide und wird derzeit im Haemophilus influenzae Typ b Oligosaccharid-CRM197-Konjugatvaccin (HibTiterTM; Lederle Praxis Biologicals, Rochester, N.Y.) benutzt.
  • Die Produktion signifikanter Mengen des CRM197-Proteins zum Einsatz in Vaccinen wurde aufgrund eines geringen Protein-Überflusses gehindert. Es wurden Techniken entwickelt, um die Produktion von CRM-Proteinen unter Einsatz von Doppel-Lysogenen (R. Rappuoli, 1983, Applied Eny. Microbio. 46:560–564; US-PS 4,925,972 von R. Rappuoli und R. Rappuoli, 1983, J. Bacteriol. 153:1202-1210) der nicht toxigenen Corynephage ß197 zu erhöhen. Rappuoli berichtet Ausbeuten an CRM197 von Doppel-Lysogenen, die bis zum Dreifachen höher sind als von den Einzel-Lysogenen. Die Produktions-Niveaus von CRM197 durch Einzel-Lysogene sind angemessen, jedoch wirtschaftlich unbefriedigend für die Produktion von Vaccinen, die CRM197-Protein benutzen.
  • Die Einführung von Mehrfach-Lysogenen der Corynephage ß in Corynebacterium diphtheriae ist ein arbeitsreiches Screen-Verfahren zum Identifizieren von Stämmen, die das CRM197-Protein, Diphtherie-Toxin oder andere CRM-Proteine, die kreuzreaktiv mit Diphtherie-Toxin sind, stärker produzieren können. Außerdem ist dieses Verfahren in seiner Fähigkeit zum Manipulieren der Protein-Expression unter Benutzung; standardgemäßer rekombinanter Techniken beschränkt. Es wäre daher nützlich, ein Verfahren zu entwickeln, das signifikante Menge von Diphtherie-Toxin und CRM-Proteinen durch Erhöhen der Genkopienzahl ohne den Einsatz von Corynephage ß oder durch Erhöhen der Produktions-Mengen dieser Proteine aus Stämmen erzeugen kann, die für Corynephage ß lysogen sind.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren und Plasmid-System zum Manipulieren und Einführen des Gens, das für CRM197, Diphtherie-Toxin und andere aus dem Diphtherietoxin-Gen abgeleitete CRM-Proteine codiert ebenso wie Mikroorganismen, die durch diese Mittel transformiert sind. Ein besonders bevorzugtes DNA-Plasmid, das als pPX 3511 bezeichnet wird, das das Gen für CRM197 aus der nicht toxigenen ß-Phage und das Plasmid pNG2-22 kombiniert, wird beschrieben. Das neue Plasmid-System ist in der Lage, Stämme von Corynebacterium diphtheriae in Stämme zu transformieren, die zum Exprimieren hoher Niveaus des CRM197-Proteins ohne die Benutzung von Mehrfach-Lysogene in der Lage sind. Die Erfindung liefert ein elegantes Mittel zur Erhöhung der Protein-Expression von CRM197, Diphtherie-Toxin und anderen vom Diphtherietoxin-Gen abgleiteten CRM-Proteinen. Die Gen-Expression kann auch durch Erhöhen der Promotor-Stärke oder durch Entfernen des Promotors aus der Eisen-Regulation manipuliert werden. In bevorzugten Ausführungsformen kann das Plasmid-System zum Exprimieren anderer Proteine, wie genetische Fusionen mit CRM197, Diphtherie-Toxin oder anderen vom Diphtherietoxin-Gen abgeleiteten CRM-Proteinen benutzt werden. Die Regulations- und Behandlungs-Sequenz von CRM197, Diphtherie-Toxin und anderen vom Diphtherie-Gen abgeleiteten CRM-Proteinen kann zum Exprimieren von Fremdproteinen in Corynebacterium spp. benutzt werden.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnung
  • 1 ist ein rekombinantes DNA-Plasmid, das als pPX 3511 bezeichnet wird, das das Gen für CRM197, eine multiple Klonierungsstelle, die abgeleitet ist vom E. coli-Klonierungsvektor pUC 18, der den Chloramphenicol-Resistenz(CmR)-Marker enthält und einen Replikationsursprung enthält, der vom Plasmid pNG2-22 (T.M. Serwold-Davis et al., FEM Microbiol. Lett. 66:119–124) abgeleitet ist.
  • 2 ist ein 12% SDS-PAGE-Gel, das die Produktion von CRM197 (61,8 Kilodalton) aus verschiedenen Stämmen von C. diphtheriae C7 zeigt. Spur A: Standards hohen Molekulargewichtes (BRL, 200-14,3 Kilodalton); Spur B: Einzel-Lysogen-C7(ß197)tox-; Spur C: Doppel-Lysogen-C7(ß197)tox-; Spur D: nicht lysogenes C7(-)tox- mit pPX 3511, gezüchtet ohne Chloramphenicol (Cm2) (2μg/ml); Spur E: nicht lysogenes C7(-)tox- it pPX 3511, gezüchtet mit Chloramphenicol (2μg/ml); Spur F: Einzel-Lysogen-C7(ß197)tox- mit pPX 3511, gezüchtet ohne Chloramphenicol (2μg/ml); Spur G: Einzel-Lysogen-C7(ß197)tox-, gezüchtet mit Chloramphenicol (2μg/ml).
  • 3 zeigt die Stabilität von Plasmid pPX 3511 in C. diphtheriae-C7(ß197)tox- unter Benutzung der Chloramphenicol-Resistenz als einem Indikator der Plasmid-Retention ohne antibiotische Selektion.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren und Plasmid-System zum Erzeugen von Diphtherie-Toxin, CRM197 und anderer von Diphtherietoxin-Gen abgeleiteter CRM-Proteine in Mengen, die zum Einsatz in Vaccinen oder für andere Verwendung genügen, die angemessene ver arbeitbare Mengen dieser Proteine erfordern. Das Plasmid-System liefert ein wirksames Mittel zum Einführen und Vergrößern der Kopienzahl des Diphtherietoxin-Gens oder CRM-Gens in Corynebacterium spp. Das Plasmid hat sein eigenes unabhängiges Episom mit seinen eigenen Replikations-Funktionen, was es dem Plasmid ermöglicht, Extrakopien von Diphtherietoxin- oder CRM-Gen in Wirtsstämme einzuführen, die zu einer solchen Integration nicht in der Lage sind, oder die vorher nicht durch die Phage ß197tox- infiziert sind. So sind, z.B., die Mengen an CRM197-Protein, die durch Corynebacterium spp. erzeugt werden, das das Plasmid dieser Erfindung beherbergt, vergleichbar, wenn nicht besser, als Ausbeuten an CRM197-Protein, das durch Mehrfach-Lysogene von C. diphtheriae exprimiert werden, die mit der Corynephage ß197tox- infiziert wurden.
  • Die Plasmide dieser Erfindung mit hohem Produktionsniveau umfassen ein für Diphtherie-Toxin oder CRM-Protein kodierendes Gen, das seine Promotor- und Regulations-Signalsequenz einschließt, einen Corynebacterium-Replikationsursprung derart, dass das resultierende Plasmid in Corynebacterium spp. eingeführt werden kann und einen selektierbaren Marker, der wahlweise mit einer multiplen Klonierungsstelle verknüpft ist. Dieses Plasmid wird zum Transformieren von Mikroorganismen der Art Corynebacterium und besonders von Corynebacterium diphtheriae unter Bedingungen benutzt, die zum Erleichtern der Expression des Diphtherietoxin- oder CRM-Gens genügen. Geeignete Wachstums-Bedingungen sind in Abhängigkeit vom Wirtsorganismus für den Fachmann leicht zugänglich. So ist es, z.B., für die optimale CRM197-, Diphtherie-Toxin- oder andere CRM-Protein-Produktion aus Corynebacterium spp. erforderlich, den Mikroorganismus in einem Medium mit wenig Eisen oder einem enteisenten Medium zu halten.
  • Das Plasmid enthält ein Gen, das für das Diphtherie-Toxin oder CRM-Protein codiert, das vom Diphtherietoxin-Gen abgeleitet ist. Beispiele von CRM-Proteinen, d.h., kreuzreagierende Materialien, die immunologisch kreuzreaktiv mit dem Diphtherie-Toxin sind, die in den Plasmid-Konstrukten dieser Erfindung eingesetzt werden können, schließen CRM197, CRM45, CRM30, CRM228 und CRM176 ein, sind jedoch darauf nicht beschränkt. Das für das CRM197-Protein codierende Gen ist von Diphtherie-Toxin (DT) abgeleitet, dessen Sequenz von Greenfield et al. (L. Greenfield et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:6853-6857) berichtet wurde. Der Unterschied zwischen dem DT-Gen und dem CRM197-Gen ist eine einzige Basen-Änderung im Strukturgen. Die Nucleotid-Sequenzen für einige der CRM-Gene wurden von T. Uchida et al. (J. Biol. Chem., 248:3838-3844, 1975) berichtet. Das gesamte CRM-Gen, einschließlich seiner Regulations-Signalsequenz, kann durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) produziert werden. Zum Erzeugen des CRM197-Gens oder anderer CRM-Gene können andere Amplifikations-Techniken oder synthetische Techniken benutzt werden.
  • Die Regulations-Signalsequenz auf dem für Diphtherie-Toxin und CRM-Protein codierenden Gen gestattet das Absondern des Proteins in das Medium. Das abgesonderte Protein kann somit aus dem Medium gewonnen und unter Benutzung bekannter Techniken, wie Salz-Ausfällung und Säulenchromatographie, gereinigt werden.
  • Die Mehrfach-Klonierungsstelle ist vorzugsweise von pUC 18 abgeleitet, doch können Mehrfach-Klonierungsstellen, die von anderen Quellen abgeleitet sind, benutzt werden, z.B. pBluescript oder eine andere synthetische Mehrfach-Klonierungsstelle. Alternativ kann die mehrfache Klonierungsstelle vollständig beseitigt werden, ohne die Betriebsfähigkeit des Plasmids zu beeinträchtigen. In einem anderen Falle wird ein selektierbarer Marker in das Plasmid eingebracht. Es kann irgendein antibiotischer Resistenz-Marker als der auswählbare Marker benutzt werden, wie Ampicillin, Erythromycin, Chloramphenicol, Kanamycin, doch ist er darauf nicht beschränkt. Zuerst wird die Emfindlichkeit des Corynebacter auf das Antibiotikum der Wahl getestet. Chloramphenicol ist bevorzugt, wenn die exprimierten Proteine für menschliche Verwendung beabsichtigt sind, da Chloramphenicol für einen solchen Zweck von der Food and Drug Administration genehmigt ist. Andere Verfahren der Plasmid-Selektion, wie Schwermetall-Resistenz oder Ernährungs-Anforderungen, können als Alternativen für antibiotische Resistenz-Marker benutzt werden.
  • Replikationsursprünge, die bei der Konstruktion von Hochproduktions-Plasmiden dieser Erfindung brauchbar sind, sind solche, die von Corynebacterium spp. abgeleitet sind. Der Replikationsursprung, der für pPX 3511 ausgewählt ist, ist vom Corynebacterium diphtheriae abgeleitet. Siehe Beispiel-Abschnitt. Andere Corynebacter-Replikationsursprünge können benutzt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Expression von CRM197 mit hohem Niveau unter Einsatz eines neuen rekombinanten DNA-Plasmids, als pPX 3511 bezeichnet, erzielt, das zum Transformieren von Stämmen von C. diphtheriae C7 zu Stämmen in der Lage ist, die hohe Niveaus von CRM197-Protein produzieren. pPX 3511, gezeigt in 1, enthält das von Diphtherie-Toxin abgeleitete CRM197-Gen (L. Greenfield et al.,1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6853-6857). Der übrige Abschnitt des Plasmids ist vom Eltern-Plasmid pNG2-22 abgeleitet, in das das CRM197-Gen eingeführt ist.
  • Plasmid pPX 3511 wird produziert, indem man zuerst das CRM197-Gen von C. diphtheriae durch eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert. Das CRM197-Gen wird dann in ein C. diphtheriae-Plasmid geklont, das einen selektierbaren Marker enthält, wie pNG2 (J. Schiller et al., 1980, Antimicrobial Agents ans Chemotherapy 18:814-821) und pNG2-22 (T.M. Serwold-Davis et al., 1990, FEM Microbiol. Lett., 66:119-124). Diese beiden Plasmide haben einen weiten Wirtsbereich und sie sind zur Replikation in geringer Kopienzahl (5-10 Kopien/Zelle) in allen bisher getesteten Coryneformen in der Lage.
  • Das Eltern-Plasmid pNG2 ist ein natürlich vorkommendes C. diphtheriae-Plasmid, das ursprünglich aus gegen Erythromycin resistenten klinischen Stämmen isoliert wurde. Der Replikationsursprung für pNG2 ist auf einem 2,6 kb EcoRI-CIaI-Fragment vorhanden. Dieser Replikationsursprung wurde zum Erzeugen eines Chloramphenicol-Resistenzvektors benutzt, der als pNG2-22 (Serwold-Davis et al., a.a.O.) und pCM 2,6 bezeichnet wird (Schmit, 1991, Infect. Immun. 59:1899-1904).
  • Der Stamm C. diphtheriae C7 wird dann mit dem resultierenden pPX 3511-Plasmid durch Elektroporation transformiert, was es ermöglicht, dass das Bacterium CRM197 ohne die Anwesenheit des Phagen ß197tox- produziert. Andere Transformations-Techniken können benutzt werden, wie bekannte physiklische und chemische Mittel (Serwold-Davis et al., a.a.O.). Diese Technik der Elektrotransformation mit pPX 3511 wird auch unter Benutzung von C. diphtheriae C7(ß197)tox--Einzel-Lysogen zur Erhöhung des Produktions-Niveaus von CRM197-Protein ausgeführt. Die Niveaus des durch die Transformanden exprimierten CRM197-Proteins sind mit Expressions-Niveaus des Einzel-Lysogen-C. diphtheriae C7(ß197)tox-ATCC Nr. 5328 und dem Doppel-Lysogen C. diphtheriae C7(ß197)tox-M1, ATCC Nr. 39255 verglichen, das das pPX 3511-Plasmid nicht beherbergt. Es wird beobachtet, dass, wenn Plasmid pPX 3511 in einen C. diphtheriae C7-Stam eingeschleust wird, die Transformanden zur Expression von CRM197 in Niveaus in der Lage sind, die äquivalent sind C. diphtheriae-Doppel-Lysogen-Stämmen.
  • In anderen Ausführungsformen der Erfindung wird der neue Plasmid-Vektor zur Erzeugung einer Reihe von Plasmid-Vektoren mit verschiedenen Fähigkeiten modifiziert. So kann, z.B., die Stellen-dirigierte Mutagenese zum Reparieren der einzigen Basenänderung in CRM197 benutzt werden, sodass das neue Plasmid Diphtherie-Toxin exprimieren würde. Andere Änderungen können an der geklonten CRM197-Gensequenz vorgenommen werden, um andere bekannte CRM-Proteine von Diphtherie-Toxin, wie CRM45, CRM30, CRM228 und CRM176, zu exprimieren (T. Uchida et al., 1973, J. Biol. Chem., 248:3838-3844).
  • Unter Benutzung rekombinanter DNA-Techniken können an den Regulations- oder Behandlungs-Sequenzen des Diphtherie-Toxins von CRM197 vorgenommen werden oder es können ähnlich geklonte Diphtherie-Toxin- oder CRM-Gene benutzt werden, um die Produktion dieser Proteine weiter zu erhöhen. So kann, z.B., die tox-Promotorregion modifiziert werden, um den Promotor von der Eisen-Regulierung zu befreien.
  • In einer anderen Ausführungsform kann das Plasmidvektor-System unter Einführung von Restriktionsenzym-Klonierungsstellen in das Aminoende des CRM197-Gens oder ähnlich geklonten Diphtherie-Toxin- oder CRM-Gens modifiziert werden. Das Klonen der DNA-Sequenzen von anderen Proteinen in die Klonierungsstellen würde es dann gestatten, dass der Plasmid-Vektor andere rekombinante Proteine oder Antigene als Fusionen mit Aminoende mit dem CRM197-Protein oder ähnlich geklontem Diphtherie-Protein oder CRM-Protein koexprimiert und all dies unter Direktion des tox-Promotors und der Signal-Sequenz. Zusätzlich oder alternativ können Klonierungsstellen in den Carboxy-Endabschnitt von CRM197, Diphtherie-Toxin oder ähnlich geklontem CRM eingeführt werden, um andere Proteine als Fusionen mit Carboxyende zu exprimieren. Aufgrund der Anwesenheit der regulierenden CRM197-Signalsequenz würde das resultierende Fusionsprotein in das Kulturmedium abgegeben werden. Alternativ braucht nur die regulierende Signalsequenz von CRM197 als ein Mittel zum Exprimieren anderer ins Kulturmedium ausgeschiedener Formen von Proteinen benutzt zu werden.
  • Geeignete Proteine und Antigene, die bei der Produktion des Plasmids nach der Erfindung brauchbar sind, schließen teilchenförmige Antigene, wie solche von Bakterien, Viren, Parasiten oder Pilzen, und Mikrokomponenten von Zellen und lösliche Antigene, wie Proteine, Peptide, Hormone und Glycoproteine, ein. Antigene von speziellem Interesse sind virale, Pilz-, Parasiten- oder bakterielle Antigene, Allergene oder zur Autoimmunität in Beziehung stehende Antigene oder mit Tumoren in Verbindung stehende Antigene. Die Antigene können aus natürlichen Quellen erhalten werden oder sie können durch rekombinante DNA-Technologie oder andere künstliche Mittel produziert werden.
  • Zu den interessierenden bakteriellen Antigenen gehören solche, die mit menschlichen bakteriellen Pathogenen assoziiert sind, einschließlich, z.B., typisierbare und nicht typisierbare Haemophilus influenzae, Escherichia coli, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Branhamella catarrhalis, Vibrio cholerae, Neisseriagonorrhoeae, Bordetella pertussis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae und Clostridium tetani. Einige spezifische bakterielle Antigene schließen bakterielle Oberflächen- und äußere Membran-Proteine (z.B. von Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Neisseriagonorrhoeae oder Branhamella catarrhalis) und bakterielle Oberflächen-Proteine (z.B. das M-Protein von Streptococcus pyogenes oder das 37 Kilodalton-Oberflächen-Protein von Streptococcus pneumoniae) ein.
  • Virale Antigene von pathogenen Viren schließen menschliches Immundef-izienz-Virus (Typen I und II), menschliches T-Zellen-Leukämievirus (Typen I, II und III), RS-Virus, Hepatitis A-, Hepatitis B-, Hepatitis C-, nicht-A- und nicht-B-Hepatitisvirus, Herpes simplex-Virus (Typen I und II), Cytomegalovirus, Influenza-Virus, Parainfluenza-Virus, Poliovirus, Rotavirus, Coronavirus, Rubella-Virus, Masern-Virus, Varicella, Epstein Barr-Virus, Adenovirus, Papilloma-Virus und Gelbfieber-Virus ein, doch sind sie darauf nicht beschränkt.
  • Mehrere spezifische virale Antigene dieser pathogenen Viren schließen das F-Protein (speziell Antigene, die das F-Peptid 283-315 enthalten, das in W089/02935 mit dem Titel "Respiratory Syncytial Virus (RS-Virus): Vaccines and Diagnostic Assays" von P. Paradiso et al. beschrieben ist), und die N- und G-Proteine des RS-Virus (RSV), VP4- (früher als VP3 bekannt), VP6- und VP7-Polypeptide von Rotavirus, Hüllen-Glycoproteine des menschlichen Immundefizienz-Virus und die Oberflächen- und Voroberflächen-Antigene von Hepatitis und Herpes-Glycoproteine B und D ein.
  • Pilz-Antigene können solche sein, die von Pilzen abgeleitet sind, einschließlich Candida spp. (speziell albicans), Cryptococcus spp. (speziell neoformans), Blastomyces spp. (z.B, dermatitidis), Histoplasma spp. (speziell capsudatum), Coccidroides spp. (speziell immitis), Paracoccidroides spp. (speziell brasiliensis) und Aspergillus spp., doch sind sie darauf nicht beschränkt. Beispiele von Parasiten-Antigenen schließen Plasmodium spp., Eimeria spp., Schistosoma spp., Trypanosoma spp., Babesia spp., Leishmania spp., Cryptosporidia spp., Toxoplasma spp. und Pneumocystis spp. ein, doch sind sie darauf nicht beschränkt.
  • Die Erfindung wird weiter durch die folgenden nicht einschränkenden Beispiele veranschaulicht:
  • Beispiel 1: Konstrukte
  • Bakterienstämme
  • E. coli DH5α (BRL, Gaithersburg, MD) wird für alle Klonierungs-Prozeduren benutzt. Stämme von nicht toxigenem, nicht lysogenem C. diphtheriae-C7(-)tox-, nicht toxigenem Einzel-Lysogen-C. diphtheriae-C7(ß197)tox- ATCC Nr. 5328 werden sowohl als Plasmid-Wirte als auch als Kontrollen bei CRM197-Protein-Expressions-Untersuchungen benutzt. Das nicht toxigene Doppel-Lysogen C. diphtheriae-C7(ß197)tox- ATCC Nr. 39255 wird als eine Kontrolle in CRM197-Protein-Expressions-Experimenten benutzt.
  • Medien und Bedingungen für die Züchtung
  • E. coli DH5α wird routinemäßig auf superoptimalem Brühe(SOB)-Agarmedium und in SOB-Flüssigkeit bei 37°C gezüchtet (J. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). C. diphtheriae-C7 Stämme werden routinemäßig auf SOC-Agar (J. Sambrook et al., a.a.O.) und -Flüssigkeit gezüchtet. Osmotisches ET-Agarmedium (G.R. Best und M.L. Britz, 1986, Appl. Microbiol. Biotech., 23:288-293) wird beim Plattieren elektroporierter Zellen benutzt. Enteisentes CY-Medium (R. Rappuoli et al., 1983, J. Bacteriol., 153:1202) wird für Experimente bei der Expression von CRM197 benutzt. Chloramphenicol wird in einer Menge von 34 μg/ml für E. coli DH5α und von 2 μg/ml für C. diphtheriae C7-Stämme hinzugegeben, die Plasmid pPX 3511 enthalten.
  • Klonen des CRM197-Gens
  • Das CRM197-Gen wird durch PCR(Polymerase-Kettenreaktion)-Amplifikation der Gensequenz von C. diphtheriae C7(ß197)tox--Einzellysogen-DNA unter Einsatz von Oligonucleotid-Primern auf der Grundlage der publizierten Sequenz von Diphtherie-Toxin (L. Greenfield et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6853-6857) geklont. Die Primer sind derart gebildet, dass ein Primer eine SaII/HincII-Restriktionsstelle zu Beginn des funktionalen Gens und der andere eine XbaI-Stelle nach dem Gen-Stopcodon des strukturellen Gens erzeugen würde. Diese und ähnliche Primer werden zum Amplifizieren und Klonen des CRM197-Gens, des Diphtherietoxin-Gens oder irgendeines CRM-Gens ähnlich dem Diphtherietoxin-Gen benutzt, das durch die Corynephage ß codiert wird.
  • Die CRM197-PCR-Produkte werden mit HincII und XbaI verdaut und in von SmaI/Xbal verdautem pNG2-22, einem Chloramphenicol-Resistenzvektor mit breitem Wirtsbereich mit der Fähigkeit, sowohl in Escherichia coli als auch Corynebacterium spp. zu replizieren, ligiert. Die Ligation wird benutzt, um E. coli DH5α zu transformieren und rekombinante Kolonien werden durch Restriktionsanalyse auf die Anwesenheit des CRM197-Gens gescreent. Ein Isolat, pPX 3511, wird unter Benutzung überlappender Primer sequenziert, um irgendwelche Änderungen am CRM197-Gen zu überprüfen. Die Oligonucleotid-Primer, die in PCR und dem Sequenzieren eingesetzt werden, werden auf einer DNA-Synthetisier-Vorrichtung 380B von Applied Biosystems synthetisiert. PCR wird mit einem thermischen DNA-Zyklisierer Cetus von Perkin-Elmer ausgeführt. Das Sequenzieren erfolgt unter Benutzung einer Sequenzier-Vorrichtung 373A von Applied Biosystems. Das resultierende Plasmid (pPX 3511) wird durch Elektroporation in den nicht toxigenen, nicht lysogenen Stamm C. diphtheriae C7(-)tox- und den nicht toxigenen Stamm C. diphtheriae C7(ß197)tox-, ATCC Nr. 5328, transferiert.
  • Elektroporation von C. dightheriae C7
  • C. diphtheriae C7 wird mit Plasmid pPX 3511-DNA durch Elektroporation unter Benutzung eines Protokolls transformiert, das für die Transformation von Corynebacterium gluta micum und Brevibacterium lactofermentum entwickelt wurde (J.A. Hayes und M.L. Britz,1989, FEMS Microbiol. Lett., 61:329-334), mit der Ausnahme, dass das mit 0,2% Tween-80 ergänzte SOC-Medium benutzt wurde. BTX-Transfektor 100 mit Power Plus und Optimizor Graphic Pulse Analyzer und Küvetten mit 1 mm Spalt wurden für die Elektroporation benutzt. Die Anwesenheit des Plasmids pPX 3511 in den transformierten C. diphtheriae C7-Stämmen wird durch Plasmid-Gewinnungs- und Restriktions-Analyse geprüft.
  • Beispiel 2: Expression
  • Quantitative CRM197-Expressions-Untersuchungen
  • Der Vergleich der CRM197-Produktion wurde durch Züchten von Stämmen von C. diphtheriae C7 unter ähnlichen Bedingungen und Vergleichen der Menge von CRM197 im Überstehenden der Kultur vorgenommen. Bei einem quantitativen Vergleich der Stämme wurden 4 ml Übernacht-Kulturen zu einem OD600=0,1 in enteisentem CY-Medium (30 ml Endvolumen in 250 ml Erlenmeyerkolben) verdünnt und unter Schütteln für 20 Stunden bei 37°C gezüchtet. pPX 3511 enthaltende Stämme wurden sowohl mit als auch ohne antibiotische Selektion (2 μg/ml Choramphenicol) gezüchtet. Nach der Inkubation wurden die Kulturen dann zentrifugiert, um die Zellen zu entfernen, und 20 μl des Überstehenden der Kulturen wurden auf ein 12% SDS-PAGE-Gel gegeben. Das Gel wurde mit Coomassie gefärbt und ein quantitativer Vergleich wurde unter Benutzung eines Durchlässigkeits/Reflexions-Abtast-Dichtemessgerät von Bio-Rad Modell 1650 mit einer Analyse-Packung GS 370 von Hoefer Scientific ausgeführt. Ein Vergleich der antigenen Eigenschaften des rekombinanten CRM197-Proteins und des lysogenen ß197tox--CRM197-Proteins wurde durch Immunoblotten des Gels und unter Einsatz von monoklonalen Antikörpern auf CRM197 vorgenommen. Durch pPX 3511 erzeugtes CRM197 ist antigenmäßig identisch dem durch lysogene Stämme erzeugten CRM197.
  • Stabilitäts-Experimente an Plasmid pPX 3511
  • Die Stabilität von Plasmid pPX 3511 wurde unter Beibehaltung der Chloramphenicol-Resistenz, als einem Indikator der Plasmid-Beibehaltung, ohne antibiotische Selektion untersucht. Kulturen von C. diphtheriae C7(ß197)tox--pPX 3511 wurden in SOC-Brühe, die mit 0,1% Tween-80 ergänzt war, um das Zellklumpen zu verhindern, für 18 Stunden (14 – 17 Generationen) bei 37°C gezüchtet. Die Kulturen wurden dann zum Zählen der Kolonien auf SOC-Agar plattiert und auf 1/10 für die nächste Generation verdünnt. Die SOC-Agarplatten wurden wiederholt aus SOC-Agar mit 2 μg/ml Chloramphenicol plattiert und der Prozentsatz der Kolonien, der Chloramphenicol-Resistenz beibehielt, errechnet. Dieses Verfahren wurde bis zu 60 Generationen wiederholt.
  • Beispiel 3: Biologische Resultate
  • Der quantitative Vergleich der CRM197-Produktion durch die verschiedenen C. diphtheriae C7-Stämme durch Dichtemessung der mit Coomassie gefärbten Gele (2) zeigt, dass die Stämme mit pPX 3511 etwa zweimal soviel CRM197 erzeugen wie das Einzellysogen und ebensoviel wie das Doppellysogen (Tabelle 1). Die Stabilität von Plasmid pPX 3511 über 60 Generationen ist in 3 gezeigt.
  • TABELLE 1
  • Produktion von CRM197 durch C. diphtheriae C7-Stämme, ausgedrückt durch das Mehrfache der des Einzellysogens (ß197)tox-
    Mehrfaches des Einzellysogens (ß197)tox-
    Doppellysogen (ß197)tox- 2,2
    pPX 3511(-)tox-, kein Cm2 2,8
    pPX 3511(-)tox-,Cm2 1,9
    pPX 3511 (ß197)tox-, kein Cm2 2,0
    pPX 3511 (ß197)tox-,Cm2 2,4
  • Biologische Hinterlegung
  • Plasmid pPX 3511 wurde unter den Bedingungen des Budapester Vertrages bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 am 12. Februar 1993 hinterlegt und erhielt die ATCC-Eingangsnummer 75415. Alle Beschränkungen über die Erhältlichkeit des hinterlegten Materials durch die Öffentlichkeit werden nach Erteilung eines Patentes auf diese Anmeldung unwiderruflich zurückgezogen. Die Hinterlegung erfolgt in einer öffentlichen Hinterlegungsstelle für eine Dauer von mindestens 30 Jahren vom Zeitpunkt der Hinterlegung oder für die Lebensdauer des Patentes oder für die Dauer von 5 Jahren nach dem letzten Antrag auf Lieferung einer Probe des biologischen Materials für den längeren Zeitraum statt. Die Hinterlegung wird ersetzt, falls sie nicht lebensfähig oder nicht replizierbar sein sollte.
  • Der Fachmann kennt viel Äquivalente der hier spezifisch beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung oder ist in der Lage solche zu finden, ohne mehr als Routine-Experimente auszuführen. Solche Äquivalente sollen vom Umfang der folgenden Ansprüche mit umfasst werden.

Claims (8)

  1. Verfahren zum Erzeugen von Diphtherie-Toxin oder CRM-Protein, das kreuzreaktiv mit Diphtherie-Toxin ist, wobei das Verfahren umfasst: Transformieren eines Mikroorganismus der Art Corynebacterium diphtheria Stamm C7 mit einem Plasmid, das a) ein für Diphtherie-Toxin oder CRM-Protein codierendes Gen, b) einen Corynebacterium-Replikationsursprung und c) einen selektierbaren Marker enthält, und Exprimieren des Toxins oder Proteins unter für die Expression des Gens durch den Mikroorganismus genügenden Bedingungen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Verfahren der Transformation durch Elektroporation ausgeführt wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, worin das CRM-Gen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus CRM197, CRM45, CRM30, CRM228 und CRM176.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Replikationsursprung vom Corynebacterium-Plasmid pNG2 stammt.
  5. Plasmid zum Exprimieren von Diphtherie-Toxin oder CRM-Protein, das mit Diphtherie-Toxin in einem Wirt kreuzreaktiv ist, umfassend: a) ein für Diphtherie-Toxin oder CRM-Protein codierendes Gen, b) einen Corynebacterium-Replikationsursprung und c) einen selektierbaren Marker, der gegebenenfalls an eine Mehrfach-Klonierungsstelle gebunden ist.
  6. Plasmid nach Anspruch 5, worin das für das Protein codierende Gen betriebsmäßig an eine Nucleotid-Sequenz gebunden ist, die für ein oder mehrere Proteine, Peptide oder Epitope davon codiert.
  7. Plasmid pPX 3511, ATTC-Eingangsnummer 75415.
  8. Mikroorganismus der Art Corynebacterium diphtheria Stamm C7, der mit dem Plasmid von Anspruch 5 transformiert ist.
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Families Citing this family (118)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2218166C (en) * 1995-04-14 2012-08-14 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of inducing immune tolerance using immunotoxins
US7517527B2 (en) 1995-10-30 2009-04-14 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Immunotoxin with in vivo T cell suppressant activity and methods of use
US7696338B2 (en) 1995-10-30 2010-04-13 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Immunotoxin fusion proteins and means for expression thereof
US7288254B2 (en) 1995-10-30 2007-10-30 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, Nih Use of immunotoxins to induce immune tolerance to pancreatic islet transplantation
US7125553B1 (en) 1996-04-15 2006-10-24 The United States of America as represented by the Department of Health and Human Services c/o Centers for Disease Control and Prevention Methods of inducing immune tolerance using immunotoxins
EP0968282A2 (de) * 1997-03-05 2000-01-05 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Vektore und verfahren zur expression mutierter proteinen
CA2284079C (en) 1997-03-05 2009-05-12 David M. Neville Immunotoxins and methods of inducing immune tolerance
US6676943B1 (en) 1997-04-24 2004-01-13 Regents Of The University Of Minnesota Human complement C3-degrading protein from Streptococcus pneumoniae
CN1086945C (zh) * 1997-06-03 2002-07-03 胡章英 白喉口服液
GB9923060D0 (en) * 1999-09-29 1999-12-01 Chiron Spa Vaccine
MX339524B (es) 2001-10-11 2016-05-30 Wyeth Corp Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica.
GB0211118D0 (en) * 2002-05-15 2002-06-26 Polonelli Luciano Vaccines
US20040096461A1 (en) * 2002-07-30 2004-05-20 Baxter Healthcare Corporation Chimeric multivalent polysaccharide conjugate vaccines
US7785608B2 (en) * 2002-08-30 2010-08-31 Wyeth Holdings Corporation Immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease
US7301554B2 (en) * 2002-09-20 2007-11-27 Ricoh Company, Ltd. Light scanning device, scanning line adjusting method, scanning line adjusting control method, image forming apparatus, and image forming method
HUE026000T2 (en) 2003-12-17 2016-04-28 Wyeth Llc Immunogenic peptide-bearing conjugates and methods for their preparation
PL2336147T3 (pl) 2003-12-17 2015-01-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Immunogenne koniugaty A beta z nośnikiem peptydowym i sposoby ich otrzymywania
GB0505996D0 (en) 2005-03-23 2005-04-27 Glaxosmithkline Biolog Sa Fermentation process
US7709001B2 (en) 2005-04-08 2010-05-04 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
KR20150061019A (ko) 2005-04-08 2015-06-03 와이어쓰 엘엘씨 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
TW200806315A (en) * 2006-04-26 2008-02-01 Wyeth Corp Novel formulations which stabilize and inhibit precipitation of immunogenic compositions
US8808707B1 (en) 2006-05-08 2014-08-19 Wyeth Llc Pneumococcal dosing regimen
US9107880B2 (en) 2006-05-31 2015-08-18 Silvio Buzzi Pharmaceutical use of protein molecules immunologically correlated to diptheria toxin
AR064642A1 (es) 2006-12-22 2009-04-15 Wyeth Corp Polinucleotido vector que lo comprende celula recombinante que comprende el vector polipeptido , anticuerpo , composicion que comprende el polinucleotido , vector , celula recombinante polipeptido o anticuerpo , uso de la composicion y metodo para preparar la composicion misma y preparar una composi
CN101265288B (zh) * 2007-03-13 2012-03-21 齐鲁制药有限公司 Crm197突变体的纯化方法
KR101450958B1 (ko) 2009-04-30 2014-10-15 콜레이 파마시티컬 그룹, 인코포레이티드 폐렴구균 백신 및 그의 용도
BRPI1015567A2 (pt) 2009-06-22 2021-08-31 Wyeth Llc Composições imunogênicas de antígenos de staphylococcus aureus
SG10201406432RA (en) 2009-06-22 2014-11-27 Wyeth Llc Compositions and methods for preparing staphylococcus aureus serotype 5 and 8 capsular polysaccharide conjugate immunogenic compositions
IT1398927B1 (it) 2009-06-25 2013-03-28 Consorzio Interuniversitario Per Lo Sviluppo Dei Sistemi A Grande Interfase Csgi Espressione batterica di un gene artificiale per la produzione di crm197 e derivati.
AU2010201410B2 (en) * 2010-03-30 2015-04-30 Pelican Technology Holdings, Inc. High level expression of recombinant CRM197
KR20130072201A (ko) 2010-03-30 2013-07-01 피페넥스 인크. 재조합 독소 단백질의 고수준 발현
HUE048398T2 (hu) 2010-06-04 2020-07-28 Wyeth Llc Vakcinakészítmények
EP2942061A3 (de) 2010-06-07 2016-01-13 Pfizer Vaccines LLC Ige-ch3-peptidimpfstoff
HUE052850T2 (hu) 2010-08-23 2021-05-28 Wyeth Llc Neisseria meningitidis RLP2086 antigéneket tartalmazó stabil készítmények
NZ607224A (en) 2010-09-10 2014-11-28 Wyeth Llc Non-lipidated variants of neisseria meningitidis orf2086 antigens
EP2716661B1 (de) 2011-06-01 2018-03-07 Xiamen University Fusionsprotein mit dem nichttoxischen diphtherietoxin-mutanten crm197 oder einem fragment davon
SA115360586B1 (ar) 2012-03-09 2017-04-12 فايزر انك تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها
KR101763625B1 (ko) 2012-03-09 2017-08-01 화이자 인코포레이티드 수막염균 조성물 및 이의 사용 방법
US9169304B2 (en) 2012-05-01 2015-10-27 Pfenex Inc. Process for purifying recombinant Plasmodium falciparum circumsporozoite protein
KR102057217B1 (ko) 2012-06-20 2020-01-22 에스케이바이오사이언스 주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
CA2879272A1 (en) 2012-07-16 2014-01-23 Robert G.K. DONALD Saccharides and uses thereof
CN102766647A (zh) * 2012-07-25 2012-11-07 天津康希诺生物技术有限公司 在白喉杆菌中稳定复制的表达载体及含该载体的白喉杆菌
MY167579A (en) 2012-08-16 2018-09-20 Pfizer Glycoconjugation processes and compositions
JP6266000B2 (ja) 2012-10-03 2018-01-24 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 免疫原性組成物
KR20140075201A (ko) 2012-12-11 2014-06-19 에스케이케미칼주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
KR20140075196A (ko) 2012-12-11 2014-06-19 에스케이케미칼주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
CA2943263C (en) 2012-12-20 2018-12-04 Pfizer Inc. Glycoconjugation process
WO2014107652A2 (en) 2013-01-04 2014-07-10 Obi Pharma Vaccines with higher carbohydrate antigen density and novel saponin adjuvant
ES2685894T3 (es) 2013-03-08 2018-10-15 Pfizer Inc. Polipéptidos de fusión inmunogénicos
US9707153B2 (en) 2013-04-24 2017-07-18 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
CN104140972B (zh) * 2013-05-07 2018-01-23 上海惠盾生物技术有限公司 白喉毒素突变体crm197的制备方法
US9908805B2 (en) 2013-08-26 2018-03-06 Corning Incorporated Method for localized annealing of chemically strengthened glass
RU2662968C2 (ru) 2013-09-08 2018-07-31 Пфайзер Инк. Иммуногенная композиция против neisseria meningitidis (варианты)
US11708411B2 (en) 2013-12-20 2023-07-25 Wake Forest University Health Sciences Methods and compositions for increasing protective antibody levels induced by pneumococcal polysaccharide vaccines
US11160855B2 (en) 2014-01-21 2021-11-02 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
EP3096785B1 (de) 2014-01-21 2020-09-09 Pfizer Inc Immunogene zusammensetzungen mit konjugierten kapselsaccharid-antigenen und verwendungen davon
EP4286000A3 (de) 2014-01-21 2024-02-14 Pfizer Inc. Kapsulare polysaccharide aus streptococcus pneumoniae und konjugate davon
KR102049826B1 (ko) 2014-01-21 2019-12-03 화이자 인코포레이티드 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 피막 폴리사카라이드 및 그의 접합체
CN106661587B (zh) 2014-01-31 2020-01-24 法纳生物解决办法有限责任公司 Crm197和相关蛋白的表达和纯化
EP3443983B1 (de) 2014-02-14 2022-07-20 Pfizer Inc. Immunogene glykoproteinkonjugate
US9815886B2 (en) 2014-10-28 2017-11-14 Adma Biologics, Inc. Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency
MX2017006506A (es) 2014-11-20 2018-03-12 Biological E Ltd Polinucleotido optimizado en el codon para la expresion de alto nivel de crm197.
HRP20230416T1 (hr) 2015-01-15 2023-07-07 Pfizer Inc. Imunogeni pripravci, namijenjeni upotrebi u cjepivima protiv pneumokoka
EP3270959A1 (de) 2015-02-19 2018-01-24 Pfizer Inc Neisseria meningitidis-zusammensetzungen und verfahren dafür
PE20180172A1 (es) 2015-05-04 2018-01-22 Pfizer Conjugados proteina-polisacarido de estreptococo grupo b, metodos para producir conjugados, composiciones inmunogenas que comprenden conjugados y sus usos
HUE053272T2 (hu) 2015-06-23 2021-06-28 Biological E Ltd Multivalens konjugált pneumococcus vakcina
CN108367063A (zh) 2015-07-21 2018-08-03 辉瑞公司 包含缀合的荚膜糖抗原的免疫原性组合物及其试剂盒和用途
JP6884145B2 (ja) 2015-11-20 2021-06-09 ファイザー・インク 肺炎連鎖球菌ワクチンにおいて用いるための免疫原性組成物
US11965009B2 (en) 2016-03-10 2024-04-23 The Johns Hopkins University Methods of producing aggregate-free monomeric diphtheria toxin fusion proteins and therapeutic uses
US11203626B2 (en) 2016-03-10 2021-12-21 The Johns Hopkins University Methods of producing aggregate-free monomeric diphtheria toxin fusion proteins and therapeutic uses
BR112018068055A2 (pt) 2016-03-10 2019-01-08 Univ Johns Hopkins métodos para produção de proteínas de fusão de toxina da difteria monoméricas livre de agregados e usos terapêuticas
WO2017220753A1 (en) 2016-06-22 2017-12-28 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
EP3269385A1 (de) 2016-07-12 2018-01-17 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Pneumokokken-polysaccharid-proteinkonjugatzusammensetzung
EP3493840B1 (de) 2016-08-05 2022-08-24 Sanofi Pasteur Inc. Polyvalente pneumokokken-polysaccharid-proteinkonjugatzusammensetzung
BR112019001971A2 (pt) 2016-08-05 2019-05-07 Sanofi Pasteur, Inc. composição conjugada de polissacarídeo-proteína pneumocócica multivalente
EP3518965A1 (de) 2016-09-30 2019-08-07 Biological E Limited Mehrwertige pneumokokken-impfstoffzusammensetzungen mit polysaccharidproteinkonjugaten
US10751402B2 (en) 2016-11-09 2020-08-25 Pfizer Inc. Immunogenic compositions and uses thereof
US11951165B2 (en) 2016-12-30 2024-04-09 Vaxcyte, Inc. Conjugated vaccine carrier proteins
MX2019008564A (es) 2017-01-20 2019-09-19 Pfizer Composiciones inmunogenicas para su uso en vacunas neumococicas.
SG11201906519RA (en) 2017-01-31 2019-08-27 Pfizer Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
CN110225757A (zh) 2017-01-31 2019-09-10 默沙东公司 由肺炎链球菌血清型19f生产荚膜多糖蛋白缀合物的方法
KR101908590B1 (ko) 2017-02-01 2018-10-16 (주)포바이오코리아 Crm197의 용해성 단백질 발현 및 정제 방법
WO2018144799A1 (en) 2017-02-03 2018-08-09 SCHADECK, Eva, Barbara Haemophilus influenzae saccharide-carrier conjugate compositions and uses thereof
US10259865B2 (en) 2017-03-15 2019-04-16 Adma Biologics, Inc. Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection
BR112019022093A2 (pt) * 2017-04-22 2020-05-05 Biological E Ltd método aprimorado para a produção em alto nível de crm
EP3678654A4 (de) 2017-09-07 2021-04-21 Merck Sharp & Dohme Corp. Pneumokokken-polysaccharide und deren verwendung in immunogenen polysaccharid-trägerproteinkonjugaten
CN111683678B (zh) 2017-12-06 2024-01-26 默沙东有限责任公司 包含肺炎链球菌多糖蛋白缀合物的组合物及其使用方法
KR102475419B1 (ko) * 2018-07-16 2022-12-07 주식회사 유바이오로직스 Crm197을 고농도로 발현하는 코리네박테리움 균주
US11260119B2 (en) 2018-08-24 2022-03-01 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
CN109100517A (zh) * 2018-10-08 2018-12-28 武汉生命科技股份有限公司 一种用于检测白喉抗体的抗原蛋白、试剂盒及制备方法
WO2020121159A1 (en) 2018-12-12 2020-06-18 Pfizer Inc. Immunogenic multiple hetero-antigen polysaccharide-protein conjugates and uses thereof
TWI788610B (zh) 2018-12-19 2023-01-01 美商默沙東有限責任公司 包含肺炎鏈球菌多醣-蛋白質結合物之組合物及其使用方法
JP7239509B6 (ja) 2019-02-22 2023-03-28 ファイザー・インク 細菌多糖類を精製するための方法
EP3952906A1 (de) 2019-04-10 2022-02-16 Pfizer Inc. Immunogene zusammensetzungen mit konjugierten kapselförmigen saccharidantigenen, kits damit und verwendungen davon
AU2020323498A1 (en) 2019-07-31 2022-03-03 Sk Bioscience Co., Ltd. Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate compositions and methods of using the same
EP4051696A1 (de) 2019-11-01 2022-09-07 Pfizer Inc. Escherichia-zusammensetzungen und verfahren dafür
JP2021132644A (ja) 2020-02-21 2021-09-13 ファイザー・インク 糖の精製
JP2023514697A (ja) 2020-02-23 2023-04-07 ファイザー・インク 大腸菌組成物およびその方法
EP3900739A1 (de) 2020-04-21 2021-10-27 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Synthetische streptococcus-pneumoniae-saccharid-konjugate zum konservierten membranprotein
EP3919076A1 (de) 2020-06-02 2021-12-08 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Synthetische oligosaccharidimpfstoffe gegen streptococcus pneumoniae mit mikropartikel-adjuvans-formulierungen
US20230321212A1 (en) 2020-08-26 2023-10-12 Pfizer Inc. Group b streptococcus polysaccharide-protein conjugates, methods for producing conjugates, immunogenic compositions comprising conjugates, and uses thereof
MX2023003169A (es) 2020-09-17 2023-03-27 Janssen Pharmaceuticals Inc Composiciones de vacunas multivalentes y usos de las mismas.
EP4232593A1 (de) 2020-10-22 2023-08-30 Pfizer Inc. Verfahren zur reinigung von bakteriellen polysacchariden
KR20230096033A (ko) 2020-10-27 2023-06-29 화이자 인코포레이티드 에스케리키아 콜라이 조성물 및 그의 방법
US20240000912A1 (en) 2020-11-04 2024-01-04 Pfizer Inc. Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines
US20230405137A1 (en) 2020-11-10 2023-12-21 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
US20220202923A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Pfizer Inc. E. coli fimh mutants and uses thereof
KR20220102871A (ko) 2021-01-14 2022-07-21 (주)셀트리온 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물
TW202245835A (zh) 2021-02-04 2022-12-01 美商默沙東有限責任公司 用於肺炎球菌結合物疫苗之奈米乳化液佐劑組合物
WO2022234416A1 (en) 2021-05-03 2022-11-10 Pfizer Inc. Vaccination against pneumoccocal and covid-19 infections
JP2024517780A (ja) 2021-05-03 2024-04-23 ファイザー・インク 細菌およびベータコロナウイルス感染症に対するワクチン接種
TW202304503A (zh) 2021-05-28 2023-02-01 美商輝瑞大藥廠 包含結合之莢膜醣抗原的免疫原組合物及其用途
CA3221075A1 (en) 2021-05-28 2022-12-01 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2023135515A1 (en) 2022-01-13 2023-07-20 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2023161817A1 (en) 2022-02-25 2023-08-31 Pfizer Inc. Methods for incorporating azido groups in bacterial capsular polysaccharides
WO2023218322A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Pfizer Inc. Process for producing of vaccine formulations with preservatives
WO2024084397A1 (en) 2022-10-19 2024-04-25 Pfizer Inc. Vaccination against pneumoccocal and covid-19 infections
WO2024089001A1 (en) 2022-10-24 2024-05-02 Idorsia Pharmaceuticals Ltd Vaccine against klebsiella pneumoniae

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH660375A5 (it) * 1983-02-08 1987-04-15 Sclavo Spa Procedimento per la produzione di proteine correlate alla tossina difterica.
FR2549855B1 (fr) * 1983-07-29 1987-03-27 Grp Genie Genetique Sequence nucleotidique codant pour le peptide signal de la toxine diphterique, vecteur contenant cette sequence nucleotidique, leur application a la transformation de micro-organismes et compositions peptidiques obtenues

Also Published As

Publication number Publication date
ATE280235T1 (de) 2004-11-15
JPH06292593A (ja) 1994-10-21
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FI941050A (fi) 1994-09-06
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DK0616034T3 (da) 2005-02-21
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CA2116914A1 (en) 1994-09-06
EP0616034A2 (de) 1994-09-21
SK24094A3 (en) 1995-03-08
ES2231770T3 (es) 2005-05-16
US5614382A (en) 1997-03-25
KR940021731A (ko) 1994-10-19
NO940774D0 (no) 1994-03-04
FI112090B (fi) 2003-10-31
IL108822A0 (en) 1994-06-24
CZ39394A3 (en) 1995-02-15
AU686126B2 (en) 1998-02-05
NO940774L (no) 1994-09-06
NZ260027A (en) 1996-03-26
KR100316004B1 (ko) 2002-02-19
FI941050A0 (fi) 1994-03-04

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