ES2685894T3 - Polipéptidos de fusión inmunogénicos - Google Patents

Polipéptidos de fusión inmunogénicos Download PDF

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ES2685894T3 ES14714380.4T ES14714380T ES2685894T3 ES 2685894 T3 ES2685894 T3 ES 2685894T3 ES 14714380 T ES14714380 T ES 14714380T ES 2685894 T3 ES2685894 T3 ES 2685894T3
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Deborah Ann Dilts
Kathrin Ute Jansen
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Mark Edward Ruppen
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Abstract

Un polipéptido aislado que comprende la secuencia de un polipéptido transportador, en el que el polipéptido transportador es un citolisoide, ligado operativamente a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido ORF2086 no lipidado y en el que el polipéptido ORF2086 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.

Description

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DESCRIPCION
Polipéptidos de fusión inmunogénicos Referencia a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica prioridad sobre la solicitud de patente provisional de Estados Unidos n.° de serie 61/775.478, presentada el viernes, 8 de marzo de 2013.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a composiciones de Neisseria meningitidis y a procedimientos de las mismas. Antecedentes de la invención
Neisseria meningitidis es una bacteria gramnegativa encapsulada que puede causar sepsis, meningitis y muerte. N. meningitidis se puede clasificar en aproximadamente 13 serogrupos según las cápsulas de polisacáridos distintivas química y antigénicamente. Cinco de los serogrupos (A, B, C, T y W135) son responsable de la mayoría de las enfermedades. La meningitis meningocócica es una enfermedad devastadora que puede matar a niños y adultos jóvenes en horas a pesar de la disponibilidad de antibióticos. Existe la necesidad de composiciones inmunogénicas mejoradas contra la meningitis meningocócica.
Sumario de la invención
Para cumplir con estas y otras necesidades, la presente invención se refiere a moléculas y composiciones como se describe en las presentes reivindicaciones. En un aspecto, la divulgación se refiere a un polipéptido aislado que incluye la secuencia de aminoácidos de un polipéptido transportador y la secuencia de aminoácidos de un polipéptido ORF2086. En una realización, el polipéptido aislado es un polipéptido de fusión. En una realización, el polipéptido ORF2086 es un polipéptido e la subfamilia A. En una realización, el polipéptido ORF2086 es un polipéptido e la subfamilia B. En una realización, El polipéptido ORF2086 está lipidado. En una realización, el polipéptido ORF2086 no está lipidado. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A05. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A12. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A22. En una realización, el polipéptido ORF2086 es B01. En una realización, el polipéptido ORF2086 es B09. En una realización, el polipéptido oRf2086 es B15. En una realización, el polipéptido ORF2086 es B16. En una realización, el polipéptido ORF2086 es B22. En una realización, el polipéptido ORF2086 es B24. En una realización, el polipéptido ORF2086 es B44. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A62. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A04. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A01. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A06. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A07. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A15. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A19. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A20. En una realización, el polipéptido oRf2086 es A29. En una realización, el polipéptido ORF2086 es B02. En una realización, el polipéptido ORF2086 incluye la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5, 19 y 22-65.
En una realización, el polipéptido transportador es un citolisoide. En una realización, El citolisoide deriva de un polipéptido neumolisina de Streptococcus pneumoniae, un polipéptido perfringolisina O de Clostridium perfringens, un polipéptido intermedilisina de Streptococcus intermedius, un polipéptido alveolisina de Bacillus alvei, un polipéptido antrolisina de Bacillus anthracis, un supuesto polipéptido cereolisina de Bacillus cereus, un polipéptido ivanolisina O de Listeria ivanovii, un polipéptido piolisina de Arcanobacterium pyogenes, un polipéptido seeligeriolisina O de Listeria seeligeri, un polipéptido estreptolisina O de S. pyogenes, un polipéptido suilisina de Streptococcus suis, un polipéptido tetanolisina de Clostridium tetani, un polipéptido listeriolisina O de Listeria monocytogenes, un polipéptido estreptolisina O de Streptococcus equisimilis, un polipéptido estreptolisina O de S. canis, un polipéptido turingiolisina O de Bacillus thuringiensis, un polipéptido latersporolisina O de B. laterosporus, un polipéptido botulinolisina de Clostridium botulinum, un polipéptido chauveolisina de C. chauvoei, un polipéptido bifermentolisina de C. bifermentans, un polipéptido sordelilisina de C. sordellii, un polipéptido histoliticolisina de Clostridium histiolyticum, un polipéptido novilisina de Clostridium novyi, o un polipéptido septicolisina O de Clostridium septicum. En una realización, el citolisoide deriva de un polipéptido neumolisina de Streptococcus pneumoniae. En una realización, el citolisoide incluye una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1.
En una realización, el polipéptido transportador se detoxifica en comparación con el polipéptido transportador de tipo salvaje correspondiente y se selecciona entre el grupo que consiste en la toxina del tétanos (TT), la proteína circumsporozoíto de Plasmodium falciparum, el antígeno de superficie de la hepatitis B, el polipéptido del núcleo nuclear de la hepatitis B, el polipéptido de la matriz de H. influenzae, la hemaglutinina de H. influenzae, toxoide diftérico, el mutante del toxoide diftérico CRM197, el complejo polipeptídico de la membrana externa de N. meningitidis del grupo B (OMPC), un citolisoide, la toxina neumolisina neumocócica, el polipéptido del shock térmico de Mycobacterium bovis, el polipéptido del shock térmico de M. leprae, el toxoide del cólera, LT de E. coli, ST de E. coli, la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, el polipéptido A de la superficie neumocócica, el polipéptido adhesina neumocócica (PsaA), la peptidasa C5a de estreptococos del grupo A o el grupo B, el polipéptido D de Haemophilus influenzae, ovoalbúmina, hemocianina de lapa californiana (KLH), seroalbúmina bovina (BSA),
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derivado polipeptídico purificado de la tuberculina (PPD), PorB (de N. meningitidis) y derivados, variantes o fragmentos de los mismos. En una realización, el polipéptido transportador no es CRM197.
En una realización, el polipéptido incluye además una secuencia polipeptídica derivada de bacterias neumocócicas. En una realización, el polipéptido aislado no incluye una secuencia polipeptídica derivada de bacterias neumocócicas.
En una realización, el polipéptido aislado provoca un anticuerpo bactericida contra una variante del serogrupo B de N. meningitidis que es homóloga del polipéptido ORF2086. En una realización, el polipéptido aislado provoca un anticuerpo bactericida contra una variante del serogrupo B de N. meningitidis que es heteróloga del polipéptido ORF2086.
En una realización, el polipéptido de fusión incluye el siguiente orden: el polipéptido transportador unido operablemente al polipéptido ORF2086. En una realización, el polipéptido de fusión incluye el siguiente orden: un polipéptido ORF2086 unido operablemente a un polipéptido transportador. En una realización, el polipéptido transportador incluye la SEQ ID NO: 1 y el polipéptido ORF2086 incluye la SEQ ID NO: 5. En una realización, el polipéptido aislado incluye la SEQ ID NO: 2.
En un segundo aspecto, la divulgación se refiere a un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de acuerdo con uno cualquiera de los polipéptidos de la invención descritos en el presente documento.
En un tercer aspecto, la divulgación se refiere a una composición inmunogénica que incluye un polipéptido de acuerdo con uno cualquiera de los polipéptidos de la invención descritos en el presente documento y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En una realización, la composición inmunogénica incluye además al menos un conjugado seleccionado entre: a) un conjugado de un polisacárido capsular de Neisseria meningitidis del serogrupo A; b) un conjugado de un polisacárido capsular de Neisseria meningitidis del serogrupo C; c) un conjugado de un polisacárido capsular de Neisseria meningitidis del serogrupo W135; y d) un conjugado de un polisacárido capsular de Neisseria meningitidis del serogrupo Y.
En un cuarto aspecto, la divulgación se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria contra Neisseria meningitidis en un mamífero. El procedimiento incluye administrar al mamífero una cantidad eficaz del polipéptido aislado de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento. En una realización, la respuesta inmunitaria incluye un anticuerpo bactericida. En una realización, la respuesta inmunitaria es igual a una respuesta inmunitaria de un mamífero al que se ha administrado un polipéptido ORF2086 no lipidado correspondiente en ausencia de un polipéptido transportador, cuando se evalúa en condiciones idénticas. En una realización, la respuesta inmunitaria es mayor que una respuesta inmunitaria de un mamífero al que se ha administrado un polipéptido ORF2086 no lipidado correspondiente en ausencia de un polipéptido transportador, cuando se evalúa en condiciones idénticas. En una realización, la respuesta inmunitaria es, como máximo, un 10 % menor que una respuesta inmunitaria de un mamífero al que se ha administrado un polipéptido ORF2086 lipidado correspondiente en ausencia de un polipéptido transportador, cuando se evalúa en condiciones idénticas. En una realización, la respuesta inmunitaria es, como máximo, un 20 % menor que una respuesta inmunitaria de un mamífero al que se ha administrado un polipéptido ORF2086 lipidado correspondiente en ausencia de un polipéptido transportador, cuando se evalúa en condiciones idénticas.
En un quinto aspecto, la divulgación se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria contra Neisseria meningitidis en un mamífero. El procedimiento incluye administrar al mamífero una cantidad eficaz de la composición inmunogénica descrita en el presente documento. En una realización, la respuesta inmunitaria incluye un anticuerpo bactericida. En una realización, la respuesta inmunitaria es igual a una respuesta inmunitaria de un mamífero al que se ha administrado un polipéptido ORF2086 lipidado correspondiente en ausencia de un polipéptido transportador, cuando se evalúa en condiciones idénticas. En una realización, la respuesta inmunitaria es mayor que una respuesta inmunitaria de un mamífero al que se ha administrado un polipéptido ORF2086 no lipidado correspondiente en ausencia de un polipéptido transportador, cuando se evalúa en condiciones idénticas. En una realización, la respuesta inmunitaria es, como máximo, un 10 % menor que una respuesta inmunitaria de un mamífero al que se ha administrado un polipéptido ORF2086 lipidado correspondiente en ausencia de un polipéptido transportador, cuando se evalúa en condiciones idénticas. En una realización, la respuesta inmunitaria es, como máximo, un 20 % menor que una respuesta inmunitaria de un mamífero al que se ha administrado un polipéptido ORF2086 lipidado correspondiente en ausencia de un polipéptido transportador, cuando se evalúa en condiciones idénticas.
En un sexto aspecto, la divulgación se refiere a una composición inmunogénica que incluye un polipéptido ORF2086 y un polipéptido transportador. En una realización, la composición es un conjugado. En una realización, el polipéptido ORF2086 es un polipéptido e la subfamilia A. En una realización, el polipéptido ORF2086 es un polipéptido e la subfamilia B. En una realización, El polipéptido ORF2086 está lipidado. En una realización, el polipéptido ORF2086 no está lipidado. En una realización, el polipéptido ORF2086 es no lipidado y no piruvilado. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A05. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A12. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A22. En una realización, el polipéptido ORF2086 es B01. En una realización, el polipéptido ORF2086 es B09. En una realización, el polipéptido ORF2086 es B15. En una realización, el
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polipéptido ORF2086 es B16. En una realización, el polipéptido ORF2086 es B22. En una realización, el polipéptido ORF2086 es B24. En una realización, el polipéptido ORF2086 es B44. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A62. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A04. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A01. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A06. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A07. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A15. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A19. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A20. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A29. En una realización, el polipéptido ORF2086 es B02. En una realización, el polipéptido ORF2086 incluye la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5, 19 y 22-65.
En una realización, el polipéptido transportador es un citolisoide. En una realización, El citolisoide deriva de un polipéptido neumolisina de Streptococcus pneumoniae, un polipéptido perfringolisina O de Clostridium perfringens, un polipéptido intermedilisina de Streptococcus intermedius, un polipéptido alveolisina de Bacillus alvei, un polipéptido antrolisina de Bacillus anthracis, un supuesto polipéptido cereolisina de Bacillus cereus, un polipéptido ivanolisina O de Listeria ivanovii, un polipéptido piolisina de Arcanobacterium pyogenes, un polipéptido seeligeriolisina O de Listeria seeligeri, un polipéptido estreptolisina O de S. pyogenes, un polipéptido suilisina de Streptococcus suis, un polipéptido tetanolisina de Clostridium tetani, un polipéptido listeriolisina O de Listeria monocytogenes, un polipéptido estreptolisina O de Streptococcus equisimilis, un polipéptido estreptolisina O de S. canis, un polipéptido turingiolisina O de Bacillus thuringiensis, un polipéptido latersporolisina O de B. laterosporus, un polipéptido botulinolisina de Clostridium botulinum, un polipéptido chauveolisina de C. chauvoei, un polipéptido bifermentolisina de C. bifermentans, un polipéptido sordelilisina de C. sordellii, un polipéptido histoliticolisina de Clostridium histiolyticum, un polipéptido novilisina de Clostridium novyi, o un polipéptido septicolisina O de Clostridium septicum. En una realización, el citolisoide deriva de un polipéptido neumolisina de Streptococcus pneumoniae. En una realización, el citolisoide incluye una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1.
En una realización, el polipéptido transportador se detoxifica en comparación con el polipéptido transportador de tipo salvaje correspondiente y se selecciona entre el grupo que consiste en la toxina del tétanos (TT), la proteína circumsporozoíto de Plasmodium falciparum, el antígeno de superficie de la hepatitis B, el polipéptido del núcleo nuclear de la hepatitis B, el polipéptido de la matriz de H. influenzae, la hemaglutinina de H. influenzae, toxoide diftérico, el mutante del toxoide diftérico CRM197, el complejo polipeptídico de la membrana externa de N. meningitidis del grupo B (OMPC), un citolisoide, la toxina neumolisina neumocócica, el polipéptido del shock térmico de Mycobacterium bovis, el polipéptido del shock térmico de M. leprae, el toxoide del cólera, LT de E. coli, ST de E. coli, la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, el polipéptido A de la superficie neumocócica, el polipéptido adhesina neumocócica (PsaA), la peptidasa C5a de estreptococos del grupo A o el grupo B, el polipéptido D de Haemophilus influenzae, ovoalbúmina, hemocianina de lapa californiana (KLH), seroalbúmina bovina (BSA), derivado polipeptídico purificado de la tuberculina (PPD), PorB (de N. meningitidis) y derivados, variantes o fragmentos de los mismos. En una realización, un polipéptido transportador es CRM197. En una realización, el polipéptido transportador es heterólogo del polipéptido ORF2086.
En una realización, la composición incluye además una secuencia polipeptídica derivada de bacterias neumocócicas. En una realización, la composición no incluye una secuencia polipeptídica derivada de bacterias neumocócicas.
En una realización, la composición provoca una respuesta de anticuerpo bactericida contra una cepa del serogrupo B de N. meningitidis que expresa una variante de ORF2086 que es homóloga al polipéptido ORF2086. En una realización, la composición provoca una respuesta de anticuerpo bactericida contra una cepa del serogrupo B de N. meningitidis que expresa una variante de ORF2086 que es heteróloga al polipéptido ORF2086.
En una realización, la composición incluye además al menos un conjugado seleccionado entre: a) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis del serogrupo A; b) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis del serogrupo C; c) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis del serogrupo W135; y d) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis del serogrupo Y. En una realización, la composición incluye además un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En un séptimo aspecto, la divulgación se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria contra Neisseria meningitidis en un mamífero. El procedimiento incluye administrar al mamífero una cantidad eficaz de la composición descrita en el presente documento. En una realización, la respuesta inmunitaria incluye un anticuerpo bactericida. En una realización, la respuesta inmunitaria es igual a una respuesta inmunitaria de un mamífero al que se ha administrado un polipéptido ORF2086 lipidado correspondiente en ausencia de un polipéptido transportador, cuando se evalúa en condiciones idénticas. En una realización, la respuesta inmunitaria es mayor que una respuesta inmunitaria de un mamífero al que se ha administrado un polipéptido ORF2086 no lipidado correspondiente en ausencia de un polipéptido transportador, cuando se evalúa en condiciones idénticas. En una realización, la respuesta inmunitaria es, como máximo, un 10 % menor que una respuesta inmunitaria de un mamífero al que se ha administrado un polipéptido ORF2086 lipidado correspondiente en ausencia de un polipéptido transportador, cuando se evalúa en condiciones idénticas. En una realización, la respuesta inmunitaria es, como máximo, un 20 % menor que una respuesta inmunitaria de un mamífero al que se ha administrado un polipéptido ORF2086 lipidado correspondiente en ausencia de un polipéptido transportador, cuando se evalúa en condiciones idénticas.
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Breve descripción de los dibujos
Figuras 1A-E: Descripción esquemática de polipéptidos de fusión. A. Fusión Ply-A05; B. Fusión A05-Ply; C. Fusión CRM197-A05; D. Fusión A05-CRM197; E. Fusión DTA-A05.
Figura 2: Expresión de las proteínas de fusión Ply-A05 a 30 °C en cultivos en matraces a pequeña escala. T0, muestra de preinducción; T3 3 horas después de la inducción; T21, 21 horas después de la inducción; S, fracción soluble; I, fracción insoluble; (-), antes de la inducción; (+), postinducción.
Figura 3: Expresión de proteínas de fusión Ply-A05 a 20 °C en cultivos en matraces a pequeña escala. Panel A: células cosechadas antes de la inducción (0) y a las 17 y 41 horas de la inducción. Panel B: Evaluación de la solubilidad de pDD20 a las 17 h después de la inducción. Calles: 1. T0 lisado de células enteras (WCL); 2. T17 WCL; 3. sobrenadante T17 BUGBUSTER™; 4. sedimento T17 BUGBUSTER™; 5. sobrenadante de ultrasonidos T17; 6. sedimento de ultrasonidos T17.
Figura 4: Seis Inducción en matraz de 1 litro de pDD20/BD686. Calles: 0, preinducción; 18, horas después de la inducción; S, fracción soluble; I fracción insoluble.
IDENTIFICADORES DE SECUENCIA
La SEQ ID NO: 1 expone la secuencia de aminoácidos para un neumolisoide.
La SEQ ID NO: 2 expone la secuencia de aminoácidos para un polipéptido neumolisoide y A05 no lipidado (PLY- A05).
La SEQ ID NO: 3 expone una secuencia de DNA que codifica el neumolisoide de SEQ ID NO: 1.
La SEQ ID NO: 4 expone una secuencia de ADN que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 2.
La SEQ ID NO: 5 expone la secuencia de aminoácidos para un polipéptido A05.
La SEQ ID NO: 6 expone una secuencia de ADN que codifica un polipéptido A05.
La SEQ ID NO: 7 expone una secuencia de ADN que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 8.
La SEQ ID NO: 8 expone la secuencia de aminoácidos para un polipéptido A05 no lipidado y neumolisoide (A05- PLY).
La SEQ ID NO: 9 expone una secuencia de ADN que codifica CRM197.
La SEQ ID NO: 10 expone la secuencia de aminoácidos para CRM197.
La SEQ ID NO: 11 expone una secuencia de ADN que codifica los restos de aminoácidos 1-193 de CRM197 (DT-A).
La SEQ ID NO: 12 expone la secuencia de aminoácidos para los 1-193 de CRM197 (DT-A).
La SEQ ID NO: 13 expone una secuencia de ADN que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 14.
La SEQ ID NO: 14 expone la secuencia de aminoácidos para CRM197 y un polipéptido A05 no lipidado (CRM)197- A05).
La SEQ ID NO: 15 expone una secuencia de ADN que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 16.
La SEQ ID NO: 16 expone la secuencia de aminoácidos para un polipéptido A05 no lipidado y CRM197 (A05- CRM197).
La SEQ ID NO: 17 expone una secuencia de ADN que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 18.
La SEQ ID NO: 18 expone la secuencia de aminoácidos para un fragmento de CRM197 y un polipéptido A05 no lipidado (DT-A-A05).
La SEQ ID NO: 19: expone la secuencia de aminoácidos para una 2086 variante A05 de N. meningitidis del
serogrupo B. En comparación con A05 de tipo silvestre, La SEQ ID NO: 19 incluye una glicina después de una
cisteína inicial y una deleción de cuatro aminoácidos en el extremo N-terminal.
La SEQ ID NO: 20 expone la secuencia de aminoácidos para una 2086 variante B01 de N. meningitidis del
serogrupo B, que incluye una Cys en el extremo N-terminal en la posición de aminoácido 1.
La SEQ ID NO: 21 expone la secuencia de aminoácidos para una neumolisina de tipo silvestre de Streptococcus pneumoniae.
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45
La SEQ ID NO: 24 expone la secuencia de serogrupo B, que incluye una Cys en el extremo
La SEQ ID NO: 25 expone la secuencia de serogrupo B, que incluye una Cys en el extremo
La SEQ ID NO: 26 expone la secuencia de serogrupo B, que incluye una Cys en el extremo
La SEQ ID NO: 27 expone la secuencia de serogrupo B, que incluye una Cys en el extremo
La SEQ ID NO: 28 expone la secuencia de serogrupo B, que incluye una Cys en el extremo
La SEQ ID NO: 29 expone la secuencia de serogrupo B, que incluye una Cys en el extremo
La SEQ ID NO: 30 expone la secuencia de serogrupo B, que incluye una Cys en el extremo
La SEQ ID NO: 31 expone la secuencia de serogrupo B, que incluye una Cys en el extremo
La SEQ ID NO: 32 expone la secuencia de serogrupo B, que incluye una Cys en el extremo
La SEQ ID NO: 33 expone la secuencia de serogrupo B, que incluye una Cys en el extremo
La SEQ ID NO: 34 expone la secuencia de serogrupo B, que incluye una Cys en el extremo
La SEQ ID NO: 35 expone la secuencia de serogrupo B, que incluye una Cys en el extremo
La SEQ ID NO: 36 expone la secuencia de serogrupo B, que incluye una Cys en el extremo
La SEQ ID NO: 37 expone la secuencia de serogrupo B, que incluye una Cys en el extremo
La SEQ ID NO: 38 expone la secuencia de serogrupo B, que incluye una Cys en el extremo
La SEQ ID NO: 39 expone la secuencia de serogrupo B, que incluye una Cys en el extremo
La SEQ ID NO: 40 expone la secuencia de serogrupo B, que incluye una Cys en el extremo
La SEQ ID NO: 41 expone la secuencia de serogrupo B, que incluye una Cys en el extremo
Cys N-terminal no está presente
La SEQ ID NO: 42 expone la secuencia de serogrupo B, que no incluye una Cys en el extrei
aminoácidos para una 2086 variante A05 de N. N-terminal en la posición de aminoácido 1.
aminoácidos para una 2086 variante A04 de N. N-terminal en la posición de aminoácido 1.
aminoácidos para una 2086 variante A01 de N. N-terminal en la posición de aminoácido 1.
aminoácidos para una 2086 variante A06 de N. N-terminal en la posición de aminoácido 1.
aminoácidos para una 2086 variante A07 de N. N-terminal en la posición de aminoácido 1.
aminoácidos para una 2086 variante A12 de N. N-terminal en la posición de aminoácido 1.
aminoácidos para una 2086 variante A15 de N. N-terminal en la posición de aminoácido 1.
aminoácidos para una 2086 variante A19 de N. N-terminal en la posición de aminoácido 1.
aminoácidos para una 2086 variante A20 de N. N-terminal en la posición de aminoácido 1.
aminoácidos para una 2086 variante A29 de N. N-terminal en la posición de aminoácido 1.
aminoácidos para una 2086 variante B03 de N. N-terminal en la posición de aminoácido 1.
aminoácidos para una 2086 variante B02 de N. N-terminal en la posición de aminoácido 1.
aminoácidos para una 2086 variante B09 de N. N-terminal en la posición de aminoácido 1.
aminoácidos para una 2086 variante B15 de N. N-terminal en la posición de aminoácido 1.
aminoácidos para una 2086 variante B16 de N. N-terminal en la posición de aminoácido 1.
aminoácidos para una 2086 variante B22 de N. N-terminal en la posición de aminoácido 1.
aminoácidos para una 2086 variante B24 de N. N-terminal en la posición de aminoácido 1.
aminoácidos para una 2086 variante B44 de N. N-terminal en la posición de aminoácido 1.
aminoácidos para una 2086 variante A62 de N. N-terminal en la posición de aminoácido 1.
aminoácidos para una 2086 variante A01 de N. o N-terminal en la posición de aminoácido 1.
meningitidis del meningitidis del meningitidis del meningitidis del meningitidis del meningitidis del meningitidis del meningitidis del meningitidis del meningitidis del meningitidis del meningitidis del meningitidis del meningitidis del meningitidis del meningitidis del meningitidis del meningitidis del meningitidis del
meningitidis del
La SEQ ID NO: 43 expone la secuencia de aminoácidos para una 2086 variante A04 de N. meningitidis del serogrupo B, que no incluye una Cys en el extremo N-terminal en la posición de aminoácido 1.
La SEQ ID NO: 44 expone la secuencia de aminoácidos para una 2086 variante A05 de N. meningitidis del serogrupo B, que no incluye una Cys en el extremo N-terminal en la posición de aminoácido 1.
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La SEQ ID NO: 47 expone la secuencia de aminoácidos para una 2086 variante A12 de N. meningitidis del serogrupo B, que no incluye una Cys en el extremo N-terminal en la posición de aminoácido 1.
La SEQ ID NO: 48 expone la secuencia de aminoácidos para una 2086 variante A15 de N. meningitidis del serogrupo B, que no incluye una Cys en el extremo N-terminal en la posición de aminoácido 1.
La SEQ ID NO: 49 expone la secuencia de aminoácidos para una 2086 variante A19 de N. meningitidis del serogrupo B, que no incluye una Cys en el extremo N-terminal en la posición de aminoácido 1.
La SEQ ID NO: 50 expone la secuencia de aminoácidos para una 2086 variante A20 de N. meningitidis del serogrupo B, que no incluye una Cys en el extremo N-terminal en la posición de aminoácido 1.
La SEQ ID NO: 51 expone la secuencia de aminoácidos para una 2086 variante A22 de N. meningitidis del serogrupo B, que no incluye una Cys en el extremo N-terminal en la posición de aminoácido 1.
La SEQ ID NO: 52 expone la secuencia de aminoácidos para una 2086 variante A29 de N. meningitidis del serogrupo B, que no incluye una Cys en el extremo N-terminal en la posición de aminoácido 1.
La SEQ ID NO: 53 expone la secuencia de aminoácidos para una 2086 variante B01 de N. meningitidis del serogrupo B, que no incluye una Cys en el extremo N-terminal en la posición de aminoácido 1.
La SEQ ID NO: 54 expone la secuencia de aminoácidos para una 2086 variante B02 de N. meningitidis del serogrupo B, que no incluye una Cys en el extremo N-terminal en la posición de aminoácido 1. La SEQ ID NO: 55 expone la secuencia de aminoácidos para una 2086 variante B09 de N. meningitidis del serogrupo B, que no incluye una Cys en el extremo N-terminal en la posición de aminoácido 1.
La SEQ ID NO: 56 expone la secuencia de aminoácidos para una 2086 variante B15 de N. meningitidis del serogrupo B, que no incluye una Cys en el extremo N-terminal en la posición de aminoácido 1.
La SEQ ID NO: 57 expone la secuencia de aminoácidos para una 2086 variante B16 de N. meningitidis del serogrupo B, que no incluye una Cys en el extremo N-terminal en la posición de aminoácido 1.
La SEQ ID NO: 58 expone la secuencia de aminoácidos para una 2086 variante B22 de N. meningitidis del serogrupo B, que no incluye una Cys en el extremo N-terminal en la posición de aminoácido 1.
La SEQ ID NO: 59 expone la secuencia de aminoácidos para una 2086 variante B24 de N. meningitidis del serogrupo B, que no incluye una Cys en el extremo N-terminal en la posición de aminoácido 1.
La SEQ ID NO: 60 expone la secuencia de aminoácidos para una 2086 variante B44 de N. meningitidis del serogrupo B, que no incluye una Cys en el extremo N-terminal en la posición de aminoácido 1.
La SEQ ID NO: 61 expone la secuencia de aminoácidos para una 2086 variante A62 de N. meningitidis del serogrupo B, que no incluye una Cys en el extremo N-terminal en la posición de aminoácido 1.
Modificaciones:
La SEQ ID NO: 62 expone la secuencia de aminoácidos para una 2086 variante B09 de N. meningitidis del serogrupo B, en la que no está presente una cisteína en el extremo N-terminal y la secuencia incluye una región Gly/Ser adicional, en comparación con la SEQ ID NO: 35.
La SEQ ID NO: 63 expone la secuencia de aminoácidos para una 2086 variante B22 de N. meningitidis del serogrupo B, en la que la cisteína en el extremo N-terminal en la posición de aminoácido 1 de la SEQ ID NO: 38 se reemplaza por una glicina.
La SEQ ID NO: 64 expone la secuencia de aminoácidos para una 2086 variante A22 de N. meningitidis del serogrupo B, en la que la cisteína en el extremo N-terminal en la posición de aminoácido 1 de la SEQ ID NO: 22 se reemplaza por una glicina.
La SEQ ID NO: 65 expone una secuencia de ADN que codifica un gen B22, en el que el codón para la Cys en el extremo N-terminal en la posición de aminoácido 1 de la SEQ ID NO: 38 se reemplaza por un codón para una glicina.
Ejemplos de secuencias de ADN que codifican polipéptidos ORF2086
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La SEQ ID NO: 68 expone una secuencia de ADN para el gen de 2086 de la variante A04 de N. meningitidis del serogrupo B, que incluye un codón que codifica una Cys en el extremo N-terminal.
La SEQ ID NO: 69 expone una secuencia de ADN para el gen de 2086 de la variante A05 de N. meningitidis del serogrupo B, que incluye un codón que codifica una Cys en el extremo N-terminal.
La SEQ ID NO: 70 expone una secuencia de ADN para el gen de 2086 de la variante A06 de N. meningitidis del serogrupo B, que incluye un codón que codifica una Cys en el extremo N-terminal.
La SEQ ID NO: 71 expone una secuencia de ADN para el gen de 2086 de la variante A07 de N. meningitidis del serogrupo B, que incluye un codón que codifica una Cys en el extremo N-terminal.
La SEQ ID NO: 72 expone una secuencia de ADN para el gen de 2086 de la variante A12 de N. meningitidis del serogrupo B, que incluye un codón que codifica una Cys en el extremo N-terminal.
La SEQ ID NO: 73 expone una secuencia de ADN para el gen de 2086 de la variante A15 de N. meningitidis del serogrupo B, que incluye un codón que codifica una Cys en el extremo N-terminal.
La SEQ ID NO: 74 expone una secuencia de ADN para el gen de 2086 de la variante A19 de N. meningitidis del serogrupo B, que incluye un codón que codifica una Cys en el extremo N-terminal.
La SEQ ID NO: 75 expone una secuencia de ADN para el gen de 2086 de la variante A20 de N. meningitidis del serogrupo B, que incluye un codón que codifica una Cys en el extremo N-terminal.
La SEQ ID NO: 76 expone una secuencia de ADN para el gen de 2086 de la variante A22 de N. meningitidis del serogrupo B, que incluye un codón que codifica una Cys en el extremo N-terminal.
La SEQ ID NO: 77 expone una secuencia de ADN para el gen de 2086 de la variante B01 de N. meningitidis del serogrupo B, que incluye un codón que codifica una Cys en el extremo N-terminal.
La SEQ ID NO: 78 expone una secuencia de ADN para el gen de 2086 de la variante B02 de N. meningitidis del serogrupo B, que incluye un codón que codifica una Cys en el extremo N-terminal.
La SEQ ID NO: 79 expone una secuencia de ADN para el gen de 2086 de la variante B44 de N. meningitidis del serogrupo B, que incluye un codón que codifica una Cys en el extremo N-terminal.
La SEQ ID NO: 80 expone una secuencia de ADN para el gen de 2086 de la variante B03 de N. meningitidis del serogrupo B, que incluye un codón que codifica una Cys en el extremo N-terminal.
La SEQ ID NO: 81 expone una secuencia de ADN para el gen de 2086 de la variante B09 de N. meningitidis del serogrupo B, que incluye un codón que codifica una Cys en el extremo N-terminal.
La SEQ ID NO: 82 expone una secuencia de ADN para el gen de 2086 de la variante B15 de N. meningitidis del serogrupo B, que incluye un codón que codifica una Cys en el extremo N-terminal.
La SEQ ID NO: 83 expone una secuencia de ADN para el gen de 2086 de la variante B16 de N. meningitidis del serogrupo B, que incluye un codón que codifica una Cys en el extremo N-terminal.
La SEQ ID NO: 84 expone una secuencia de ADN para el gen de 2086 de la variante B22 de N. meningitidis del serogrupo B, que incluye un codón que codifica una Cys en el extremo N-terminal.
La SEQ ID NO: 85 expone una secuencia de ADN para el gen de 2086 de la variante B24 de N. meningitidis del serogrupo B, que incluye un codón que codifica una Cys en el extremo N-terminal.
La SEQ ID NO: 86 expone una secuencia de ADN para el gen de 2086 de la variante A05 de N. meningitidis del serogrupo B, en la que el codón que codifica una cisteína en el extremo N-terminal se ha delecionado, en comparación con la SEQ ID NO: 69.
La SEQ ID NO: 87 expone una secuencia de ADN para el gen de 2086 de la variante A12-2 de N. meningitidis del serogrupo B, que incluye un codón que codifica una Cys en el extremo N-terminal.
Polipéptidos portadores
La SEQ ID NO: 88 expone la secuencia de aminoácidos para una neumolisina de tipo silvestre de Streptococcus pneumoniae.
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perfringens.
La SEQ ID NO: 90 expone la secuencia de aminoácidos para una intermedilisina de tipo silvestre de Streptococcus intermedius.
La SEQ ID NO: 91 expone la secuencia de aminoácidos para una alveolisina de tipo silvestre de Bacillus alvei.
La SEQ ID NO: 92 expone la secuencia de aminoácidos para una antrolisina de tipo silvestre de Bacillus Anthracis.
La SEQ ID NO: 93 expone la secuencia de aminoácidos para una cereolisina putativa de tipo silvestre de Bacillus cereus.
La SEQ ID NO: 94 expone la secuencia de aminoácidos para una ivanolisina O de tipo silvestre de Listeria ivanovii.
La SEQ ID NO: 95 expone la secuencia de aminoácidos para una piolisina de tipo silvestre de Arcanobacterium pyogenes.
La SEQ ID NO: 96 expone la secuencia de aminoácidos para una seeligeriolisina O de tipo silvestre de Listeria seeligeri.
La SEQ ID NO: 97 expone la secuencia de aminoácidos para una estreptolisina O de tipo silvestre de Streptococcus pyogenes.
La SEQ ID NO: 98 expone la secuencia de aminoácidos para una suilisina de tipo silvestre de Streptococcus suis.
La SEQ ID NO: 99 expone la secuencia de aminoácidos para una tetanolisina de tipo silvestre de Clostridium tetani.
La SEQ ID NO: 100 expone la secuencia de aminoácidos para una listeriolisina O de tipo silvestre de Listeria monocytogenes.
La SEQ ID NO: 101 expone la secuencia de aminoácidos para una turingiolisina de tipo silvestre de Bacillus thuringiensis (previamente anotado como perfringolisina).
La SEQ ID NO: 102 expone la secuencia de aminoácidos para una región de la neumolisina de tipo silvestre de Streptococcus pneumoniae que incluye una secuencia consenso correspondiente a los restos 144 a 161 de la neumolisina de tipo silvestre.
La SEQ ID NO: 103 expone la secuencia de aminoácidos para una región de perfringolisina O de tipo silvestre de Clostridium perfringens que incluye una secuencia consenso correspondiente a los restos 144 a 161 de la neumolisina de tipo silvestre.
La SEQ ID NO: 104 expone la secuencia de aminoácidos para una región de intermedilisina de tipo silvestre de Streptococcus intermedius que incluye una secuencia consenso correspondiente a los restos 144 a 161 de la neumolisina de tipo silvestre.
La SEQ ID NO: 105 expone la secuencia de aminoácidos para una región de la alveolisina de tipo silvestre de Bacillus alvei que incluye una secuencia consenso correspondiente a los restos 144 a 161 de la neumolisina de tipo silvestre.
La SEQ ID NO: 106 expone la secuencia de aminoácidos para una región de la antrolisina de tipo silvestre de Bacillus anthracis que incluye una secuencia consenso correspondiente a los restos 144 a 161 de la neumolisina de tipo silvestre.
La SEQ ID NO: 107 expone la secuencia de aminoácidos para una región de la cereolisina putativa de tipo silvestre de Bacillus cereus que incluye una secuencia consenso correspondiente a los restos 144 a 161 de la neumolisina de tipo silvestre.
La SEQ ID NO: 108 expone la secuencia de aminoácidos para una región de la ivanolisina O de tipo silvestre de Listeria ivanovii que incluye una secuencia consenso correspondiente a los restos 144 a 161 de la neumolisina de tipo silvestre.
La SEQ ID NO: 109 expone la secuencia de aminoácidos para una región de perfringolisina O de tipo silvestre de Clostridium perfringens que incluye una secuencia consenso correspondiente a los restos 144 a 161 de la neumolisina de tipo silvestre.
La SEQ ID NO: 110 expone la secuencia de aminoácidos para una región de seeligeriolisina O de tipo silvestre de Listeria seeligeri que incluye una secuencia consenso correspondiente a los restos 144 a 161 de la neumolisina de tipo silvestre.
La SEQ ID NO: 111 expone la secuencia de aminoácidos para una región de estreptolisina O de tipo silvestre de
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Streptococcus pyogenes que incluye una secuencia consenso correspondiente a los restos 144 a 161 de la neumolisina de tipo silvestre.
La SEQ ID NO: 112 expone la secuencia de aminoácidos para una región de la suilisina de tipo silvestre de Streptococcus suis que incluye una secuencia consenso correspondiente a los restos 144 a 161 de la neumolisina de tipo silvestre.
La SEQ ID NO: 113 expone la secuencia de aminoácidos para una región de tetanolisina de tipo silvestre de Clostridium tetani que incluye una secuencia consenso correspondiente a los restos 144 a 161 de la neumolisina de tipo silvestre.
La SEQ ID NO: 114 expone la secuencia de aminoácidos para una región de listeriolisina O de tipo silvestre de Listeria monocytogenes que incluye una secuencia consenso correspondiente a los restos 144 a 161 de la neumolisina de tipo silvestre.
La SEQ ID NO: 115 expone la secuencia de aminoácidos para una región de la turingiolisina de tipo silvestre de Bacillus thuringiensis (previamente anotado como perfringolisina) que incluye una secuencia consenso correspondiente a los restos 144 a 161 de la neumolisina de tipo silvestre.
La SEQ ID NO: 116 expone la secuencia de aminoácidos para una perfringolisina O de tipo silvestre de Clostridium perfringens.
La SEQ ID NO: 117 expone la secuencia de aminoácidos para una variante del neumolisoide que incluye una mutación de la lisina en la posición de aminoácido 460 a un resto de ácido aspártico.
La SEQ ID NO: 118 expone la secuencia de aminoácidos para una variante de un neumolisoide. Cuando se compara con la SEQ ID NO: 117, La SEQ ID NO: 118 tiene un cambio de aminoácido de lisina en la posición 208 a arginina.
La SEQ ID NO: 119 expone la secuencia de aminoácidos para un neumolisoide de ejemplo que incluye una sustitución de asparagina en lugar de ácido aspártico en la posición de aminoácido 385 y deleción de alanina 146 y arginina 147 de la secuencia de neumolisina de tipo silvestre.
La SEQ ID NO: 120 expone la secuencia de aminoácidos para un neumolisoide de ejemplo que incluye una sustitución de fenilalanina en lugar de triptófano en la posición de aminoácido 433 de la secuencia de neumolisina de tipo silvestre.
Secuencias optimizadas para los codones
La SEQ ID NO: 121 expone una secuencia de ADN optimizada para codones para un gen B44.
La SEQ ID NO: 122 expone una secuencia de ADN optimizada para codones para un gen B09, en la que no está codificada una cisteína en el extremo N-terminal y en la que la secuencia incluye codones que codifican una región Gly/Ser adicional, en comparación con la SEQ ID NO: 81.
La SEQ ID NO: 123 expone una secuencia de ADN optimizada para codones para un gen B09, en la que no está codificada una cisteína en el extremo N-terminal.
La SEQ ID NO: 124 expone una secuencia de ADN optimizada para codones para un gen B09, en la que no está codificada una cisteína en el extremo N-terminal.
La SEQ ID NO: 125 expone una secuencia de ADN optimizada para codones que codifica un polipéptido A05.
La SEQ ID NO: 126 expone una secuencia de ADN optimizada para codones que codifica un polipéptido A05.
La SEQ ID NO: 127 expone una secuencia de ADN optimizada para codones que codifica un polipéptido A22.
La SEQ ID NO: 128 expone una secuencia de ADN optimizada para codones que codifica un polipéptido A62.
La SEQ ID NO: 129 expone una secuencia de ADN optimizada para codones que codifica un polipéptido A12.
Secuencias adicionales
La SEQ ID NO: 130 expone la secuencia de aminoácidos para un polipéptido B24. La SEQ ID NO: 130 es idéntica a la SEQ ID NO: 39 en la que los restos en las posiciones 1-3 de la SEQ ID NO: 39 se han delecionado.
La SEQ ID NO: 131 expone una secuencia de ADN que codifica un polipéptido A22, en el que el codón para la Cys en el extremo N-terminal en la posición de aminoácido 1 de la SEQ ID NO: 22 se reemplaza por un codón para una glicina.
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La SEQ ID NO: 132 expone la secuencia de aminoácidos para una A22, en la que la cisteína en el extremo N- terminal en la posición de aminoácido 1 de la SEQ ID NO: 22 se reemplaza por una glicina.
La SEQ ID NO: 133 expone una secuencia de ADN que codifica un gen B09, en la que el codón que codifica una cisteína en el extremo N-terminal no está presente.
La SEQ ID NO: 134 expone una secuencia de ADN que codifica un gen B44, en la que el codón que codifica una cisteína en el extremo N-terminal no está presente.
La SEQ ID NO: 135 expone la secuencia de aminoácidos para una 2086 variante A05 de N. meningitidis del serogrupo B, en la que no está presente una cisteína en el extremo N-terminal.
La SEQ ID NO: 136 expone la secuencia de aminoácidos para un polipéptido neumolisoide y A12 no lipidado (PLY- A12).
La SEQ ID NO: 137 expone la secuencia de aminoácidos para un neumolisoide y un polipéptido A12 no lipidado (PLY-A12), en la metionina N-terminal en la posición 1 de la SEQ ID NO: 136 se ha eliminado.
La SEQ ID NO: 138 expone la secuencia de aminoácidos para un polipéptido neumolisoide y B01 no lipidado (PLY- B01).
La SEQ ID NO: 139 expone la secuencia de aminoácidos para un neumolisoide y un polipéptido B01 no lipidado (PLY-B01), en la metionina N-terminal en la posición 1 de la SEQ ID NO: 138 se ha eliminado.
La SEQ ID NO: 140 expone la secuencia de aminoácidos para un polipéptido neumolisoide y B09 no lipidado (PLY- B09).
La SEQ ID NO: 141 expone la secuencia de aminoácidos para un neumolisoide y un polipéptido B09 no lipidado (PLY-B09), en la metionina N-terminal en la posición 1 de la SEQ ID NO: 140 se ha eliminado.
La SEQ ID NO: 142 expone la secuencia de aminoácidos para un polipéptido neumolisoide y B24 no lipidado (PLY- B24).
La SEQ ID NO: 143 expone la secuencia de aminoácidos para un neumolisoide y un polipéptido B24 no lipidado (PLY-B24), en la metionina N-terminal en la posición 1 de la SEQ ID NO: 142 se ha eliminado.
La SEQ ID NO: 144 expone la secuencia de aminoácidos para un polipéptido neumolisoide y B44 no lipidado (PLY- B44).
La SEQ ID NO: 145 expone la secuencia de aminoácidos para un neumolisoide y un polipéptido B44 no lipidado (PLY-B44), en la metionina N-terminal en la posición 1 de la SEQ ID NO: 144 se ha eliminado.
La SEQ ID NO: 146 expone la secuencia de aminoácidos para un polipéptido GNA2091.
La SEQ ID NO: 147 expone la secuencia de aminoácidos para un polipéptido GNA2091, en la que la metionina N- terminal en la posición 1 de la SEQ ID NO: 146 se ha eliminado.
La SEQ ID NO: 148 expone la secuencia de aminoácidos para un polipéptido GNA2091 y A05 no lipidado (GNA2091-A05).
La SEQ ID NO: 149 expone la secuencia de aminoácidos para un polipéptido A05 GNA2091 y no lipidado (GNA2091-A05), en el que se elimina la metionina N-terminal en la posición 1 de La SEQ ID nO: 148 se ha eliminado.
La SEQ ID NO: 150 expone la secuencia de aminoácidos para una peptidasa C5a estreptocócica (SCP) de Streptococcus pyogenes.
La SEQ ID NO: 151 expone la secuencia de aminoácidos para un SCP, en la que la metionina N-terminal en la posición 1 de la SEQ ID NO: 150 se ha eliminado.
La SEQ ID NO: 152 expone la secuencia de aminoácidos para un SCP y un polipéptido A05 no lipidado (SCP-A05).
La SEQ ID NO: 153 expone la secuencia de aminoácidos para un SCP y un polipéptido A05 no lipidado (SCP-A05), en la que la metionina N-terminal en la posición 1 de La SEQ ID NO: 152 se ha eliminado.
La SEQ ID NO: 154 expone la secuencia de aminoácidos para un CRM197.
La SEQ ID NO: 155 expone la secuencia de aminoácidos para un CRM197, en la que la metionina N-terminal en la posición 1 de la SEQ ID NO: 154 se ha eliminado.
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La SEQ ID NO: 156 expone la secuencia de aminoácidos para un polipéptido A05 como en la SEQ ID NO: 5, en la que una cisteína está presente en la posición 1.
La SEQ ID NO: 157 expone la secuencia de aminoácidos para un polipéptido A05 como en la SEQ ID NO: 5, en la que una cisteína está presente en la posición 2.
La SEQ ID NO: 158 expone la secuencia de aminoácidos para un polipéptido A05 como en la SEQ ID NO: 5, en la que una cisteína está presente en la posición 6.
Descripción detallada de la invención
Los inventores descubrieron, entre otras cosas, moléculas y/o composiciones que incluyen un polipéptido ORF2086 y un polipéptido transportador. Las moléculas y/o composiciones pueden prepararse por fusión genética o por conjugación o pueden prepararse sintéticamente.
Los polipéptidos y conjugados de la invención de la invención, como se describe en las reivindicaciones, permiten, sorprendentemente, la inducción efectiva de una amplia respuesta inmunitaria contra N. meningitidis. En algunos aspectos, los polipéptidos de fusión y conjugados de la invención exhiben una eficacia mejorada en la inducción de una respuesta inmunitaria contra N. meningitidis, en comparación con las composiciones que incluyen polipéptidos ORF2086 en ausencia de un polipéptido transportador. Por ejemplo, los inventores descubrieron que los polipéptidos de fusión pueden proporcionar una amplia cobertura, por ejemplo, provocando anticuerpos bactericidas contra múltiples cepas variantes de LP2086 incluso cuando el polipéptido de fusión incluye un polipéptido ORF2086 de una cepa de N. meningitidis. La eficacia mejorada de las composiciones de la invención puede permitir que se administren dosis o concentraciones reducidas de polipéptidos ORF2086 a un sujeto, en comparación con las composiciones que incluyen polipéptidos ORF2086 en ausencia de un polipéptido transportador. La eficacia mejorada de las composiciones de la invención también ayuda a minimizar el coste de la producción de vacunas y permite diseños que proporcionan eficacia a una amplia gama de serotipos.
A) Polipéptidos aislados y polipéptidos de fusión
En un aspecto, la divulgación se refiere a un polipéptido aislado que incluye la secuencia de aminoácidos de un polipéptido transportador y la secuencia de aminoácidos de un polipéptido ORF2086. En una realización, el polipéptido aislado es un polipéptido formado sintéticamente. En una realización preferente, el polipéptido aislado es un polipéptido de fusión que incluye polipéptidos unidos de forma operativa. Al menos un componente polipeptídico de un polipéptido de fusión y/o aislado incluye un polipéptido transportador o una variante activa o fragmento del mismo, que está unido operativamente a un polipéptido ORF2086 o a una variante activa o fragmento del mismo.
Como se usa en el presente documento, un "polipéptido de fusión" o "proteína de fusión" se refiere a un polipéptido que tiene un enlace genético en el marco de al menos dos polipéptidos. Tras la transcripción/traducción, se produce un polipéptido individual. Por consiguiente, múltiples polipéptidos, o fragmentos de los mismos, se pueden incorporar en un único polipéptido. Múltiples formas de polipéptidos de fusión se desvelan en el presente documento y se analizan con detalle a continuación.
"Unido operativamente" se refiere a un enlace funcional entre dos o más elementos. Por ejemplo, un enlace operable entre dos polipéptidos puede fusionar ambos polipéptidos juntos en marco para producir un único polipéptido de fusión. En una realización, el polipéptido ORF2086 y el polipéptido transportador se fusionan entre sí dentro del marco.
1) Polipéptido ORF2086. El polipéptido aislado puede incluir cualquier polipéptido ORF2086. En una realización,
el polipéptido ORF2086 es un polipéptido e la subfamilia A. En una realización, el polipéptido ORF2086 es un polipéptido e la subfamilia B. En una realización, El polipéptido ORF2086 está lipidado. En una realización, el polipéptido ORF2086 no está lipidado. En una realización, el polipéptido ORF2086 es no lipidado y no piruvilado. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A04. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A05. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A06. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A07. En una
realización, el polipéptido ORF2086 es A12. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A15. En una
realización, el polipéptido ORF2086 es A19. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A20. En una
realización, el polipéptido ORF2086 es A01. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A22. En una
realización, el polipéptido ORF2086 es A29. En una realización, el polipéptido ORF2086 es B01. En una
realización, el polipéptido ORF2086 es B02. En una realización, el polipéptido ORF2086 es B09. En una
realización, el polipéptido ORF2086 es B15. En una realización, el polipéptido ORF2086 es B16. En una
realización, el polipéptido ORF2086 es B22. En una realización, el polipéptido ORF2086 es B24. En una
realización, el polipéptido ORF2086 es B44. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A62. Preferentemente, el polipéptido ORF2086 es A05. Los polipéptidos ORF2086 se describen con más detalle a continuación. Los polipéptidos ORF2086 se describen en el documento WO2012032489 y la patente de Estados Unidos con número de publicación US20120093852. Los polipéptidos ORF2086 también se describen en el documento WO2013132452 y en la patente de Estados Unidos con número de publicación US20130243807.
2) Polipéptido portador. El polipéptido aislado puede incluir cualquier polipéptido portador. Preferentemente, el polipéptido transportador se detoxifica o exhibe toxicidad disminuida en comparación con el polipéptido
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transportador de tipo silvestre correspondiente. En una realización, el polipéptido transportador es un citolisoide. En una realización preferente, El citolisoide deriva de un polipéptido neumolisina de Streptococcus pneumoniae, un polipéptido perfringolisina O de Clostridium perfringens, un polipéptido intermedilisina de Streptococcus intermedius, un polipéptido alveolisina de Bacillus alvei, un polipéptido antrolisina de Bacillus anthracis, un supuesto polipéptido cereolisina de Bacillus cereus, un polipéptido ivanolisina O de Listeria ivanovii, un polipéptido piolisina de Arcanobacterium pyogenes, un polipéptido seeligeriolisina O de Listeria seeligeri, un polipéptido estreptolisina O de Streptococcus pyogenes, un polipéptido suilisina de Streptococcus suis, un polipéptido tetanolisina de Clostridium tetani, un polipéptido listeriolisina O de Listeria monocytogenes, un polipéptido estreptolisina O de Streptococcus equisimilis, un polipéptido estreptolisina O de S. canis, un polipéptido turingiolisina O de Bacillus thuringiensis, un polipéptido latersporolisina O de B. laterosporus, un polipéptido botulinolisina de Clostridium botulinum, un polipéptido chauveolisina de Clostridium chauvoei, un polipéptido bifermentolisina de C. bifermentans, un polipéptido sordelilisina de Clostridium sordellii, un polipéptido histoliticolisina de Clostridium histiolyticum, un polipéptido novilisina de Clostridium novyi, o un polipéptido septicolisina O de Clostridium septicum.
Ejemplos adicionales de una proteína transportadora incluyen la peptidasa C5a peptidasa de estreptococos (SCP) de Streptococcus pyogenes, GNA2091 (también conocido como proteína accesoria 936) de Neisseria y CRM197. Más ejemplos y descripciones de proteínas portadoras se proporcionan a continuación en la sección C.
En una realización preferente, el citolisoide deriva de un polipéptido neumolisina de Streptococcus pneumoniae. En una realización más preferida, el citolisoide incluye una secuencia que tiene al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1. En una realización más preferida, el citolisoide incluye la SEQ ID NO: 1.
En otra realización, el polipéptido transportador se detoxifica o exhibe una toxicidad disminuida en comparación con el polipéptido transportador de tipo salvaje correspondiente y se selecciona entre el grupo que consiste en la toxina del tétanos (TT), la proteína circumsporozoíto de Plasmodium falciparum, el antígeno de superficie de la hepatitis B, el polipéptido del núcleo nuclear de la hepatitis B, el polipéptido de la matriz de H. influenzae, la hemaglutinina de H. influenzae, toxoide diftérico, el mutante del toxoide diftérico CRM197, el complejo polipeptídico de la membrana externa de N. meningitidis del grupo B (OMPC), un citolisoide, la toxina neumolisina neumocócica, el polipéptido del shock térmico de Mycobacterium bovis, el polipéptido del shock térmico de M. leprae, el toxoide del cólera, LT de E. coli, ST de E. coli, la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, el polipéptido A de la superficie neumocócica, el polipéptido adhesina neumocócica (PsaA), la peptidasa C5a de estreptococos del grupo A o el grupo B, el polipéptido D de Haemophilus influenzae, ovoalbúmina, hemocianina de lapa californiana (KLH), seroalbúmina bovina (BSA), derivado polipeptídico purificado de la tuberculina (PPD), PorB (de N. meningitidis) y derivados, variantes o fragmentos de los mismos.
En una realización, el polipéptido de fusión no incluye CRM197. Los polipéptidos transportadores se describen con más detalle a continuación.
3) Ensamblaje: El polipéptido de fusión puede ser directo, es decir, en ausencia de una molécula enlazadora empírica, o la fusión puede ser a través de una molécula enlazadora. Por ejemplo, el polipéptido de fusión puede incluir componentes polipeptídicos, tales como un péptido enlazador, entre los polipéptidos del polipéptido de fusión, o un marcador peptídico para la purificación por afinidad (por ejemplo en el extremo N o C). Los péptidos enlazadores de ejemplo incluyen un enlazador Gly-Ser-Gly (GSG). Una molécula enlazadora puede incluir uno o más restos de aminoácidos, normalmente de aproximadamente 2 a aproximadamente 30 restos de aminoácidos, preferentemente de 3 a 25 restos. En una realización preferente, el polipéptido de fusión no incluye un péptido enlazador. Un polipéptido de fusión de ejemplo que no incluye un enlazador es un polipéptido de fusión que incluye, en el siguiente orden, un polipéptido transportador y un polipéptido ORF2086, tales como, por ejemplo, en la SEQ ID NO: 2. Ejemplos adicionales incluyen PLY-A12 (SEQ ID NO: 127), PLY-B01 (SEQ ID NO: 139), PLY-B09 (SEQ ID NO: 141), PLY-B24 (SEQ ID NO: 143), PLY-B44 (SEQ ID NO: 145), GNA2091-A05 (SEQ ID NO: 149) y SCP-A05 (SEQ ID NO: 153).
El polipéptido de fusión se puede ensamblar en diversas combinaciones. El polipéptido transportador puede estar en el extremo N-terminal o C-terminal del polipéptido de fusión o puede estar flanqueado por polipéptidos bacterianos inmunogénicos, por ejemplo, flanqueados por polipéptidos ORF2086. El polipéptido ORF2086 puede fusionarse al extremo N terminal o al extremo C terminal del polipéptido portador. Por ejemplo, en una realización, el polipéptido de fusión incluye el siguiente orden: el polipéptido transportador unido operablemente al polipéptido ORF2086. En una realización preferente, el polipéptido de fusión no incluye un enlazador cuando el polipéptido transportador está operativamente unido al polipéptido ORF2086 en dicho orden. En dichas realizaciones preferidas, la región del tallo nativa del polipéptido ORF2086 puede servir como enlazador entre los polipéptidos. Las regiones del tallo de un polipéptido ORF2086 se describen en el documento WO2012032489 y la patente de los Estados Unidos con n-° de publicación US20120093852. En otra realización, el polipéptido de fusión incluye el siguiente orden: un polipéptido ORF2086 unido operablemente a un polipéptido transportador. En una realización preferente, el polipéptido de fusión incluye un enlazador cuando el polipéptido transportador está operativamente unido al polipéptido ORF2086 en dicho orden.
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En una realización, el polipéptido de fusión incluye un polipéptido ORF2086 unido a un polipéptido transportador, pero otras conformaciones están dentro del alcance de la divulgación. Por ejemplo, en otra realización, el polipéptido de fusión incluye, como máximo, 1, 2, 3, 4 o 5 polipéptidos bacterianos inmunogénicos. En otra realización, el polipéptido de fusión incluye, como máximo, 1, 2, 3, 4 o 5 polipéptidos transportadores.
En algunas realizaciones, el polipéptido de fusión comprende adicionalmente un tercer polipéptidos o adicionales. La fuente del tercer polipéptido o polipéptidos adicionales puede incluir, aunque no de forma limitante, N. meningitidis. En una realización, un tercer polipéptido se fusiona en el marco con el polipéptido ORF2086 o con el polipéptido transportador. En otra realización, cuando múltiples polipéptidos transportadores o variantes o fragmentos de los mismos están incluidos en el polipéptido de fusión, el tercer polipéptido puede estar localizado en el extremo N- terminal o C-terminal del polipéptido de fusión, o puede estar localizado internamente en el polipéptido de fusión de modo que esté flanqueado por polipéptidos de proteína transportadora. En una realización, el polipéptido de fusión incluye una secuencia polipeptídica derivada de bacterias neumocócicas. En otra realización, el polipéptido de fusión no incluye una secuencia polipeptídica derivada de bacterias neumocócicas.
Preferentemente, el polipéptido de fusión incluye polipéptidos que se derivan de especies bacterianas que son diferentes de las especies bacterianas de las que deriva el polipéptido portador. Por consiguiente, en una realización, la proteína transportadora es heteróloga para el polipéptido ORF2086 y para cualquier polipéptido adicional incluido en el polipéptido de fusión. "Heterólogo", en referencia a un polipéptido, es un polipéptido que se origina a partir de una proteína diferente y/o de una especie bacteriana diferente.
4) Polipéptidos de fusión y/o aislados de ejemplo
En un aspecto, la divulgación se refiere a un polipéptido aislado que incluye la secuencia de aminoácidos para un neumolisoide (tal como, por ejemplo, La SEQ ID NO: 1) y un polipéptido ORF2086 no lipidado (tal como, por ejemplo, un polipéptido cualquiera que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionado entre la SEQ ID NO: 4261, y cualquier polipéptido descrito en la sección D "Polipéptidos ORF" a continuación). Por ejemplo, en una realización, el polipéptido aislado incluye un neumolisoide (sEq ID NO: 1) y un A12 no lipidado (SEQ ID NO: 47) para producir PLY-A12 (SEQ ID NO: 136). En otra realización, el polipéptido aislado incluye un neumolisoide (SEQ ID NO: 1) y un B01 no lipidado (SEQ ID NO: 53) para producir PLY-B01 (SEQ ID NO: 138). En otra realización, el polipéptido aislado incluye un neumolisoide (SEQ ID NO: 1) y un B09 no lipidado (SEQ ID NO: 55) para producir PLY-B09 (SEQ ID NO: 140). En otra realización, el polipéptido aislado incluye un neumolisoide (SEQ ID NO: 1) y un B24 no lipidado (SEQ ID NO: 59) para producir PLY-B24 (SEQ ID NO: 142). En otra realización, el polipéptido aislado incluye un neumolisoide (SEQ ID NO: 1) y un B44 no lipidado (SEQ ID NO: 60) para producir PLY-B44 SEQ ID NO: 144).
a) PLY y A05:
En un aspecto, la divulgación se refiere a un polipéptido aislado que incluye la secuencia de aminoácidos para un neumolisoide y un polipéptido A05 no lipidado. En una realización, el neumolisoide incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1. Preferentemente, el neumolisoide está codificado por una secuencia de ADN expuesta en la SEQ ID NO: 3. En una realización, el polipéptido A05 incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5. En una realización, el polipéptido aislado es un polipéptido de fusión.
En una realización, el polipéptido de fusión incluye el siguiente orden: el polipéptido transportador unido operablemente al polipéptido ORF2086. Por ejemplo, en una realización, el polipéptido de fusión incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2 (PLY-A05). En una realización, el polipéptido de fusión está codificado por una secuencia de ADN expuesta en la SEQ ID NO: 4.
En otra realización, el polipéptido de fusión incluye el siguiente orden: el polipéptido ORF2086 unido operablemente a un polipéptido transportador. Por ejemplo, en una realización, el polipéptido de fusión incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 8 (A05-PLY). En una realización, el polipéptido de fusión está codificado por una secuencia de ADN expuesta en la SEQ ID NO: 7.
En otra realización, el polipéptido de fusión incluye además un péptido enlazador. En una realización, el enlazador incluye un péptido Gly-Ser-Gly (GSG). El polipéptido de fusión que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 8 incluye un enlazador GSG.
b) CRM197 y A05:
En un aspecto, la divulgación se refiere a un polipéptido aislado que incluye la secuencia de aminoácidos para u CRM 197 ( (tal como, por ejemplo, La SEQ ID NO: 155) y un polipéptido ORF2086 no lipidado (tal como, por ejemplo, un polipéptido cualquiera que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionado entre la SEQ ID NO: 42-61, y cualquier polipéptido descrito en la sección D "Polipéptidos ORF" a continuación).
En un aspecto, la divulgación se refiere a un polipéptido aislado que incluye la secuencia de aminoácidos para CRM197 y un polipéptido A05 no lipidado. En una realización, CRM197 incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 10. En otra realización, CRM197 incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 155. Preferentemente, PCRM197 está codificada por una secuencia de ADN expuesta en la SEQ ID NO: 9. En una
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realización, el polipéptido A05 incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5. En una realización, el polipéptido aislado es un polipéptido de fusión.
En una realización, el polipéptido de fusión incluye el siguiente orden: el polipéptido transportador unido operablemente al polipéptido ORF2086. Por ejemplo, en una realización, el polipéptido de fusión incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID nO: 14 (CRM197-A05). En una realización, el polipéptido de fusión está codificado por una secuencia de ADN expuesta en la SEQ ID NO: 13.
En otra realización, el polipéptido de fusión incluye el siguiente orden: el polipéptido ORF2086 unido operablemente a un polipéptido transportador. Por ejemplo, en una realización, el polipéptido de fusión incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 16 (A05-CRM197). En una realización, el polipéptido de fusión está codificado por una secuencia de ADN expuesta en la SEQ ID NO: 15.
En una realización adicional, el polipéptido de fusión incluye además un péptido enlazador. En una realización, el enlazador incluye un péptido Gly-Ser-Gly (GSG). El polipéptido de fusión que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 16 incluye un enlazador GSG.
En un aspecto, la divulgación se refiere a un polipéptido aislado que incluye la secuencia de aminoácidos para un fragmento de CRM197 y un polipéptido A05 no lipidado. En una realización, el fragmento de CRM197 (por ejemplo, los restos de aminoácidos 1-193 de CRM197 mostrados en la SEQ ID NO: 10; región DT-A) incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 12. Preferentemente, el fragmento de CRM197 está codificado por una secuencia de ADN expuesta en la SEQ ID NO: 11. En una realización, el polipéptido A05 incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5. En una realización, el polipéptido aislado es un polipéptido de fusión.
En una realización, el polipéptido de fusión incluye el siguiente orden: el fragmento de CRM197 unido operablemente al polipéptido ORF2086. Por ejemplo, en una realización, el polipéptido de fusión incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 18 (DT-A-A05). En una realización, el polipéptido de fusión está codificado por una secuencia de ADN expuesta en la SEQ ID NO: 17.
c) GNA2091 y A05:
En un aspecto, la divulgación se refiere a un polipéptido aislado que incluye la secuencia de aminoácidos para GNA2091 (tal como, por ejemplo, La SEQ ID NO: 147) y un polipéptido ORF2086 no lipidado (tal como, por ejemplo, un polipéptido cualquiera que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionado entre la SEQ ID NO: 42-61, y cualquier polipéptido descrito en la sección D "Polipéptidos ORF" a continuación).
En un aspecto, la divulgación se refiere a un polipéptido aislado que incluye la secuencia de aminoácidos para GNA2091 y un polipéptido A05 no lipidado. En una realización, GNA2091 incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 147. En una realización, el polipéptido A05 incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5. En una realización, el polipéptido aislado es un polipéptido de fusión.
En una realización, el polipéptido de fusión incluye el siguiente orden: el GNA2091 unido operablemente al polipéptido ORF2086. Por ejemplo, en una realización, el polipéptido de fusión incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 149 (GNA2091-A05).
d) SCP y A05:
En un aspecto, la divulgación se refiere a un polipéptido aislado que incluye la secuencia de aminoácidos para SCP (tal como, por ejemplo, La SEQ ID NO: 151) y un polipéptido ORF2086 no lipidado (tal como, por ejemplo, un polipéptido cualquiera que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionado entre la SEQ ID NO: 42-61, y cualquier polipéptido descrito en la sección D "Polipéptidos ORF" a continuación).
En un aspecto, la divulgación se refiere a un polipéptido aislado que incluye la secuencia de aminoácidos para SCP y un polipéptido A05 no lipidado. En una realización, SCP incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 151. En una realización, el polipéptido A05 incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5. En una realización, el polipéptido aislado es un polipéptido de fusión.
En una realización, el polipéptido de fusión incluye el siguiente orden: el SCP unido operablemente al polipéptido ORF2086. Por ejemplo, en una realización, el polipéptido de fusión incluye la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 153 (SCP-A05).
5) Composiciones inmunogénicas que incluyen un polipéptido de fusión:
En un aspecto, la divulgación se refiere a una composición inmunogénica que incluye un polipéptido aislado y/o de fusión como se ha descrito anteriormente. La composición inmunogénica incluye además un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En una realización, la composición inmunogénica incluye además al menos un conjugado seleccionado entre: a) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis del serogrupo A; b) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis del serogrupo C; c) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria
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meningitidis del serogrupo W135; y d) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis del serogrupo Y. Dichos conjugados de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis se conocen en la técnica. A continuación se describen descripciones de conjugados de sacárido capsular y conjugados de polisacáridos de N. meningitidis.
6) Respuestas inmunitarias: En un aspecto, el polipéptido de fusión induce una respuesta inmunitaria contra N. meningitidis en un mamífero. En una realización, el polipéptido de fusión induce un anticuerpo bactericida contra una cepa del serogrupo B de N. meningitidis que expresa una variante de ORF2086 que es homóloga del polipéptido ORF2086. Por ejemplo, un polipéptido de fusión que incluye una proteína transportadora y un polipéptido A05 puede inducir un anticuerpo bactericida contra una cepa que expresa A05 de N. meningitidis del serogrupo B. En otra realización, el polipéptido de fusión induce una respuesta de anticuerpo bactericida contra una cepa del serogrupo B de N. meningitidis que expresa una variante de ORF2086 que es heteróloga del polipéptido ORF2086. Por ejemplo, un polipéptido de fusión que incluye una proteína transportadora y un polipéptido A05 puede inducir una respuesta de anticuerpos bactericida contra una cepa del serogrupo B que expresa A22 de N. meningitidis.
Sorprendentemente, los inventores descubrieron que un polipéptido de fusión que incluye un polipéptido ORF2086 no lipidado y un polipéptido transportador puede inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero que es mejor que la respuesta inmunitaria inducida por una composición que incluye una forma no lipidada del mismo polipéptido ORF2086 en ausencia del polipéptido portador, cuando se evalúa en condiciones idénticas.
En una realización, la respuesta inmunitaria inducida por el polipéptido de fusión es igual a una respuesta inmunitaria en un mamífero al que se ha administrado un polipéptido ORF2086 no lipidado correspondiente en ausencia de un polipéptido transportador, cuando se evalúa en condiciones idénticas.
En otra realización, la respuesta inmunitaria inducida por el polipéptido de fusión es igual a una respuesta inmunitaria en un mamífero al que se ha administrado un polipéptido ORF2086 lipidado correspondiente en ausencia de un polipéptido transportador, cuando se evalúa en condiciones idénticas.
En una realización, la respuesta inmunitaria inducida por el polipéptido de fusión es mayor que la respuesta inmunitaria en un mamífero al que se ha administrado un polipéptido ORF2086 no lipidado correspondiente en ausencia de un polipéptido transportador, cuando se evalúa en condiciones idénticas. Por ejemplo, la respuesta inmunitaria inducida por el polipéptido de la invención puede ser mayor que al menos un 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % o más.
En otra realización, la respuesta inmunitaria inducida por el polipéptido de fusión es mayor que la respuesta inmunitaria en un mamífero al que se ha administrado un polipéptido ORF2086 lipidado correspondiente en ausencia de un polipéptido transportador, cuando se evalúa en condiciones idénticas. Por ejemplo, la respuesta inmunitaria inducida por el polipéptido de la invención puede ser mayor que al menos un 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % o más.
En otra realización, la respuesta inmunitaria el polipéptido de fusión es, como máximo, un 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 % o 5 % menor que la respuesta inmunitaria en un mamífero al que se ha administrado un polipéptido ORF2086 lipidado correspondiente en ausencia de un polipéptido transportador, cuando se evalúa en condiciones idénticas.
En un aspecto adicional, la divulgación se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria contra Neisseria meningitidis en un mamífero. La respuesta inmunitaria puede ser contra uno cualquiera de un serogrupo de N. meningitidis o una combinación de serogrupos de N. meningitidis (por ejemplo, A, B, C, W135, X y/o Y). El procedimiento incluye administrar al mamífero una cantidad eficaz del polipéptido aislado como se describe. En una realización, el polipéptido aislado incluye un polipéptido de fusión como se ha descrito anteriormente. En otra realización, el procedimiento incluye administrar al mamífero una cantidad eficaz de una composición inmunogénica que incluye un polipéptido aislado y/o de fusión como se describe. La respuesta inmunitaria inducida por el procedimiento puede incluir un anticuerpo bactericida. Las respuestas de anticuerpos bactericidas se describen a continuación.
B) Conjugados
En un aspecto, la divulgación se refiere a una composición inmunogénica que incluye un polipéptido ORF2086 y un polipéptido transportador. En una realización, la composición inmunogénica incluye un conjugado de un polipéptido ORF2086 unido a un polipéptido transportador. Los polipéptidos pueden estar unidos a través de cualquier enlace de manera que los polipéptidos sean estables en condiciones fisiológicas. En una realización, los polipéptidos están unidos por enlaces covalentes. En otra realización, los polipéptidos están unidos por enlaces no covalentes. Los conjugados se pueden preparar usando procedimientos conocidos en la técnica.
1) Polipéptido ORF2086. El conjugado puede incluir cualquier polipéptido ORF2086. En una realización, el polipéptido ORF2086 es un polipéptido e la subfamilia A. En una realización, el polipéptido ORF2086 es un polipéptido e la subfamilia B. En una realización, El polipéptido ORF2086 está lipidado. En una realización, el polipéptido ORF2086 no está lipidado. En una realización, el polipéptido ORF2086 es no lipidado y no piruvilado. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A04. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A05. En una
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realización,
el polipéptido ORF2086 es A06. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A07. En una
realización,
el polipéptido ORF2086 es A12. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A15. En una
realización,
el polipéptido ORF2086 es A19. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A20. En una
realización,
el polipéptido ORF2086 es A01. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A22. En una
realización,
el polipéptido ORF2086 es A29. En una realización, el polipéptido ORF2086 es B01. En una
realización,
el polipéptido ORF2086 es B02. En una realización, el polipéptido ORF2086 es B09. En una
realización,
el polipéptido ORF2086 es B15. En una realización, el polipéptido ORF2086 es B16. En una
realización,
el polipéptido ORF2086 es B22. En una realización, el polipéptido ORF2086 es B24. En una
realización,
el polipéptido ORF2086 es B44. En una realización, el polipéptido ORF2086 es A62.
Preferentemente, el polipéptido ORF2086 es A05.
Los polipéptidos ORF2086 se describen con más detalle a
continuación.
En una realización preferente, el polipéptido ORF2086 es un polipéptido ORF2086 no piruvilado no lipidado, como se describe en el documento WO2013132452 y la publicación de patente de Estados Unidos n.° US20130243807. El término "no piruvilado" se refiere a un polipéptido que no tiene contenido de piruvato. Los polipéptidos ORF2086 no lipidados que tienen un contenido de piruvato exhibían típicamente un desplazamiento de masa de +70 o +71, en comparación con el polipéptido de tipo silvestre correspondiente. En una realización, el polipéptido de la invención no exhibe un desplazamiento de masa de +70 o +71 en comparación con el correspondiente polipéptido no lipidado de tipo silvestre cuando se mide mediante espectrometría de masas. En otra realización, el polipéptido de la invención no exhibe un desplazamiento de masa de +70 o +71 en comparación con el correspondiente polipéptido no lipidado que tiene una cisteína inicial en la posición 1 del extremo N cuando se mide por espectrometría de masas.
2) Polipéptido portador. El conjugado puede incluir cualquier polipéptido portador. Preferentemente, el polipéptido transportador se detoxifica o exhibe toxicidad disminuida en comparación con el polipéptido transportador de tipo silvestre correspondiente. En una realización, el polipéptido transportador es un citolisoide. En una realización preferente, El citolisoide deriva de un polipéptido neumolisina de Streptococcus pneumoniae, un polipéptido perfringolisina O de Clostridium perfringens, un polipéptido intermedilisina de Streptococcus intermedius, un polipéptido alveolisina de Bacillus alvei, un polipéptido antrolisina de Bacillus anthracis, un supuesto polipéptido cereolisina de Bacillus cereus, un polipéptido ivanolisina O de Listeria ivanovii, un polipéptido piolisina de Arcanobacterium pyogenes, un polipéptido seeligeriolisina O de Listeria seeligeri, un polipéptido estreptolisina O de Streptococcus pyogenes, un polipéptido suilisina de Streptococcus suis, un polipéptido tetanolisina de Clostridium tetani, un polipéptido listeriolisina O de Listeria monocytogenes, un polipéptido estreptolisina O de Streptococcus equisimilis, un polipéptido estreptolisina O de Streptococcus canis, un polipéptido turingiolisina O de Bacillus thuringiensis, un polipéptido latersporolisina O de Brevibacillus. laterosporus, un polipéptido botulinolisina de Clostridium botulinum, un polipéptido chauveolisina de C Clostridium chauvoei, un polipéptido bifermentolisina de Clostridium bifermentans, un polipéptido sordelilisina de Clostridium sordellii, un polipéptido histoliticolisina de Clostridium histiolyticum, un polipéptido novilisina de Clostridium novyi, o un polipéptido septicolisina O de Clostridium septicum.
En una realización preferente, el citolisoide deriva de un polipéptido neumolisina de Streptococcus pneumoniae. En una realización más preferida, el citolisoide incluye una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1.
En otra realización, el polipéptido transportador se detoxifica o exhibe una toxicidad disminuida en comparación con el polipéptido transportador de tipo salvaje correspondiente y se selecciona entre el grupo que consiste en la toxina del tétanos (TT), la proteína circumsporozoíto de Plasmodium falciparum, el antígeno de superficie de la hepatitis B, el polipéptido del núcleo nuclear de la hepatitis B, el polipéptido de la matriz de H. influenzae, la hemaglutinina de H. influenzae, toxoide diftérico, el mutante del toxoide diftérico CRM197, el complejo polipeptídico de la membrana externa de N. meningitidis del grupo B (OMPC), un citolisoide, la toxina neumolisina neumocócica, el polipéptido del shock térmico de Mycobacterium bovis, el polipéptido del shock térmico de M. leprae, el toxoide del cólera, LT de E. coli, ST de E. coli, la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, el polipéptido A de la superficie neumocócica, el polipéptido adhesina neumocócica (PsaA), la peptidasa C5a de especies estreptococos del grupo A o el grupo B, el polipéptido D de Haemophilus influenzae, ovoalbúmina, hemocianina de lapa californiana (KLH), seroalbúmina bovina (BSA), derivado polipeptídico purificado de la tuberculina (PPD), PorB de N. meningitidis, y derivados, variantes o fragmentos de los mismos. En una realización preferente, el conjugado incluye CRM197. Los polipéptidos transportadores se describen con más detalle a continuación.
Ejemplos adicionales de una proteína transportadora incluyen la peptidasa C5a peptidasa de estreptococos (SCP) de Streptococcus pyogenes, GNA2091 (también conocido como proteína accesoria 936) de Neisseria y CRM197. Más ejemplos y descripciones de proteínas portadoras se proporcionan a continuación en la sección C.
3) Ensamblaje: En una realización, el conjugado incluye un polipéptido ORF2086 directamente unido al polipéptido transportador. Por ejemplo, los polipéptidos del conjugado se acoplan en ausencia de una molécula enlazadora. En otra realización, el conjugado incluye un polipéptido ORF2086 indirectamente unido al polipéptido transportador. Por ejemplo, el polipéptido transportador puede estar unido a un intermediario y ese intermediario está unido al polipéptido ORF2086.
En una realización, el conjugado incluye un polipéptido ORF2086 unido a un polipéptido transportador, pero otras
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conformaciones están dentro del ámbito de la divulgación. Por ejemplo, en otra realización, el conjugado incluye, como máximo, 1, 2, 3, 4 o 5, 6, 7, 8, 9 o 10 polipéptidos bacterianos inmunogénicos. En una realización, el conjugado incluye, como máximo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 polipéptidos ORF2086. En otra realización, el conjugado incluye, como máximo, 1, 2, 3, 4 o 5 polipéptidos transportadores.
En algunas realizaciones, el conjugado comprende adicionalmente un tercer polipéptido o polipéptidos adicionales posteriores. La fuente del tercer polipéptido o polipéptidos adicionales puede incluir, aunque no de forma limitante, N. meningitidis. En una realización, un tercer polipéptido se fusiona en el marco con el polipéptido ORF2086 o con el polipéptido transportador. En una realización, el conjugado incluye una secuencia polipeptídica derivada de bacterias neumocócicas. En otra realización, el conjugado no incluye una secuencia polipeptídica derivada de bacterias neumocócicas.
Las proteínas ORF2086 no lipidadas no piruviladas se describen en el documento WO2013132452 y la patente de Estados Unidos con número de publicación US201 30243807. Los procedimientos para eliminar o reducir la probabilidad de modificación de piruvilación después de la expresión de proteínas ORF2086 no lipidadas también se describen en dicho documento.
Un procedimiento adicional para eliminar la piruvilación incluye el tratamiento de la proteína con sulfato de cinc.
Otro procedimiento más incluye modificaciones genéticas e la proteína ORF2086 no lipidada para delecionar la cisteína inicial en la posición 1 del extremo N terminal y reemplazar cualquier resto de aminoácido en el extremo N terminal con un resto de cisteína. Por ejemplo, en una realización, la proteína ORF2086 no lipidada incluye una secuencia de aminoácidos en la que un resto de cisteína no está en la posición 1 del extremo N de la proteína ORF2086 y en la que un resto de serina se reemplaza por un resto de cisteína, en comparación con la proteína ORF2086 no lipidada de tipo silvestre correspondiente.
Preferentemente, el resto de aminoácido que debe reemplazarse por un resto de cisteína está, como máximo, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 o 5 aminoácidos. desde el resto inicial del extremo N-terminal.
Por ejemplo, en una realización, la proteína ORF2086 no lipidada incluye una secuencia de aminoácidos en la que un resto de cisteína no está en la posición 1 del extremo N de la proteína ORF2086 y en la que un resto en la posición 2 se reemplaza por un resto de cisteína, en comparación con la proteína ORF2086 no lipidada de tipo silvestre correspondiente.
Preferentemente, el resto de aminoácido a reemplazar por un resto de cisteína es un resto de serina ubicado, como máximo, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 o 5 aminoácidos del resto inicial del extremo N-terminal. Por ejemplo, la proteína ORF2086 no lipidada incluye una secuencia de aminoácidos en la que un resto de cisteína no está en la posición 1 del extremo N de la proteína ORF2086 y en la que un resto de serina en la posición 2 se reemplaza por un resto de cisteína, en comparación con la proteína ORF2086 no lipidada de tipo silvestre correspondiente. Compárese, por ejemplo, La sEq ID NO: 5, La SEQ ID NO: 156 y SEQ ID NO: 157.
En otra realización, la proteína ORF2086 no lipidada incluye una secuencia de aminoácidos en la que un resto de cisteína no está en la posición 1 del extremo N de la proteína ORF2086 y en la que un resto de serina en la posición 6 se reemplaza por un resto de cisteína, en comparación con la proteína ORF2086 no lipidada de tipo silvestre correspondiente. Compárese, por ejemplo, La SEQ ID NO: 5, La SeQ ID NO: 156 y SEQ ID No: 158.
Preferentemente, El conjugado incluye polipéptidos que derivan de especies bacterianas que son diferentes de las especies bacterianas de las que deriva el polipéptido portador. Por consiguiente, en una realización, la proteína transportadora es heteróloga para el polipéptido ORF2086 y para cualquier polipéptido adicional incluido en el conjugado. "Heterólogo" en referencia a un polipéptido es un polipéptido que se origina a partir de una proteína diferente y/o de una especie de bacteria diferente.
La conjugación entre el polipéptido transportador y el polipéptido ORF2086, opcionalmente a través de un reticulante, puede realizarse de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica. Preferentemente, un enlace entre un polipéptido transportador y el polipéptido ORF2086 se logra usando un polipéptido transportador activado que tiene al menos un extremo activado adecuado para la reacción con un centro nucleofílico (por ejemplo, un resto de lisina o cisteína de una proteína).
En una realización, la proteína transportadora se activa con maleimida a través de una reacción no específica de NHS-éster a restos de lisina. La única cisteína en N-terminal del polipéptido ORF2086 se conjuga a continuación con una maleimida de la proteína transportadora.
Como se sabe en la materia, las maleimidas reaccionan con grupos sulfhidrilo para formar enlaces tioéter estables. N-etil maleimida (NEM) es un ejemplo de un reactivo que reacciona con tiol. Por ejemplo, una proteína neumolisina puede prepararse para la conjugación por derivatización de la proteína con NEM, seguido de activación con SM (PEG)4.
En otra realización, el polipéptido transportador se activa con sulfosuccinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-
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carboxilato (Sulfo-SMCC). Sulfo-SMCC es un reticulante de amina a sulfhidrilo soluble en agua. Contiene una N- hidroxisuccinimida (éster NHS) que reacciona con amina y un grupo maleimida que reacciona con sulfhidrilo. En un ejemplo, una proteína SCP puede activarse con Sulfo-SMCC.
4) Composiciones inmunogénicas que incluyen un conjugado: En un aspecto, la divulgación se refiere a una composición inmunogénica que incluye un conjugado como se ha descrito anteriormente. La composición inmunogénica incluye además un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En una realización, la composición inmunogénica incluye al menos un conjugado seleccionado entre: a) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis del serogrupo A; b) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis del serogrupo C; c) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis del serogrupo W135; y d) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis del serogrupo Y. Dichos conjugados de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis se conocen en la técnica. A continuación se describen descripciones de conjugados de sacárido capsular y conjugados de polisacáridos de N. meningitidis.
5) Respuestas inmunitarias: En un aspecto, el conjugado induce una respuesta inmunitaria contra N. meningitidis en un mamífero. En una realización, un conjugado induce un anticuerpo bactericida contra una variante del serogrupo B de N. meningitidis que es homóloga del polipéptido ORF2086. Por ejemplo, un conjugado que incluye una proteína transportadora y un polipéptido A05 puede inducir un anticuerpo bactericida contra una cepa que expresa A05 del serogrupo B de N. meningitidis. En otra realización, el conjugado induce un anticuerpo bactericida contra una variante del serogrupo B de N. meningitidis que es heteróloga del polipéptido ORF2086. Por ejemplo, un conjugado que incluye una proteína transportadora y un polipéptido A05 puede inducir un anticuerpo bactericida contra una cepa que expresa A22 del serogrupo B de N. meningitidis.
En una realización, un conjugado que incluye un polipéptido ORF2086 no lipidado y un polipéptido transportador puede inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero que es comparable a la respuesta inmunitaria inducida por una composición que incluye una forma lipidada del mismo polipéptido ORF2086 en ausencia del polipéptido transportador, cuando se evalúa en condiciones idénticas.
En una realización, la respuesta inmunitaria inducida por el conjugado es igual a la respuesta inmunitaria de un mamífero al que se ha administrado una composición que incluye un polipéptido ORF2086 no lipidado correspondiente en ausencia de un polipéptido transportador, cuando se evalúa en condiciones idénticas.
En otra realización, la respuesta inmunitaria inducida por el conjugado es igual a la respuesta inmunitaria de un mamífero al que se ha administrado una composición que incluye un polipéptido ORF2086 lipidado correspondiente en ausencia de un polipéptido transportador, cuando se evalúa en condiciones idénticas.
En otra realización, la respuesta inmunitaria inducida por el conjugado es mayor que la respuesta inmunitaria de un mamífero al que se ha administrado una composición que incluye un polipéptido ORF2086 lipidado correspondiente en ausencia de un polipéptido transportador, cuando se evalúa en condiciones idénticas. Por ejemplo, la respuesta inmunitaria inducida por el conjugado puede ser mayor en al menos un 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % o más.
En otra realización, la respuesta inmunitaria inducida por el conjugado es mayor que la respuesta inmunitaria de un mamífero al que se ha administrado una composición que incluye un polipéptido ORF2086 no lipidado correspondiente en ausencia de un polipéptido transportador, cuando se evalúa en condiciones idénticas. Por ejemplo, la respuesta inmunitaria inducida por el conjugado puede ser mayor en al menos un 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % o más.
En una realización adicional, la respuesta inmunitaria del conjugado es, como máximo, un 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 % o 5 % menor que la respuesta inmunitaria de un mamífero al que se ha administrado una composición que incluye el polipéptido ORF2086 lipidado correspondiente en ausencia de un polipéptido transportador, cuando se evalúa en condiciones idénticas.
En otro aspecto, la divulgación se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria contra Neisseria meningitidis en un mamífero. La respuesta inmunitaria puede ser contra uno cualquiera de un serogrupo de N. meningitidis o una combinación de serogrupos de N. meningitidis (por ejemplo, A, B, C, W135, X y/o Y). El procedimiento incluye administrar al mamífero una cantidad eficaz del polipéptido aislado como se describe. En una realización, el polipéptido aislado incluye un conjugado como se ha descrito anteriormente. En otra realización, el procedimiento incluye administrar al mamífero una cantidad eficaz de una composición inmunogénica que incluye un polipéptido y/o conjugado aislado como se describe. La respuesta inmunitaria inducida por el procedimiento puede incluir un anticuerpo bactericida. Las respuestas de anticuerpos bactericidas se describen a continuación.
C) Polipéptido portador
Una proteína o polipéptido transportador es una entidad polipeptídica que induce una respuesta inmunitaria dirigida contra una molécula unida al polipéptido portador. Uniendo un polipéptido transportador a una molécula (por ejemplo, a un polipéptido ORF2086), es posible aumentar la inmunogenicidad del polipéptido antigénico.
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Los polipéptidos transportadores de ejemplo incluyen formas detoxificadas de los siguientes: toxina del tétanos (TT), la proteína circumsporozoíto de Plasmodium falciparum, el antígeno de superficie de la hepatitis B, la proteína del núcleo nuclear de la hepatitis B, la proteína de la matriz de H. influenzae, la hemaglutinina de H. influenzae, toxoide diftérico, el mutante del toxoide diftérico CRM197, el complejo de la proteína de la membrana externa de N. meningitidis del grupo B (OMPC), un citolisoide, la toxina neumolisina neumocócica, la proteína del shock térmico de Mycobacterium bovis, la proteína del shock térmico de M. leprae, el toxoide del cólera, LT de E. coli, ST de E. coli, la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, la proteína A de la superficie neumocócica, la proteína adhesina neumocócica (PsaA), la peptidasa C5a de estreptococos del grupo A o el grupo B, la proteína D de Haemophilus influenzae, ovoalbúmina, hemocianina de lapa californiana (KLH), seroalbúmina bovina (BSA), el derivado proteico purificado de la tuberculina (PPD), PorB (de N. meningitidis) y derivados, variantes o fragmentos de los mismos. El polipéptido transportador exhibe, preferentemente, menos toxicidad que la correspondiente forma de tipo silvestre del polipéptido portador.
Toxoides de la difteria: En una realización preferente, el polipéptido transportador es un toxoide diftérico o una variante o fragmento del mismo, más preferentemente, CRM197. CRM197 es una variante no tóxica (es decir, toxoide) de la toxina diftérica. En una realización, CRM197 se aísla de cultivos de la cepa C7 (p197) de Corynebacterium diphtheriae cultivada en medio con extracto de levadura y casaminoácidos. En otra realización, CRM197 se prepara de forma recombinante de acuerdo con los procedimientos descritos en la patente de Estados Unidos n.° 5.614.382. En algunas realizaciones, CRM197 se prepara en Pseudomonas fluorescens. Se pueden usar otros toxoides diftéricos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, CRM176, CRM228, CRM45, CRM9, CRM102, CRM103 y CRM107.
El toxoide diftérico puede incluir un polipéptido del toxoide diftérico de longitud completa, variantes activas o fragmentos del mismo, o cualquier fragmento inmunogénico del toxoide diftérico. Los toxoides diftéricos de ejemplo incluyen toxoides que tienen una deleción o mutación de Glu 148 a Asp, Gln o Ser y/o Ala 158 a Gly y otras mutaciones, en comparación con la toxina diftérica de tipo silvestre correspondiente, como se divulga en la patente de Estados Unidos n.° 4.709.017 o la patente de Estados Unidos n.° 4.950.740; la mutación de al menos uno o más restos de Lys 516, Lys 526, Phe 530 y/o Lys 534 y otras mutaciones desveladas en la patente de Estados Unidos n.° 5.917.017 o la patente de Estados Unidos n.° 6.455.673; o fragmentos divulgados en la patente de Estados Unidos n.° 5.843.711.
Un toxoide diftérico de ejemplo adicional incluye un fragmento de CRM que incluye los aminoácidos 1-193 de CRM197, como se muestra en la SEQ ID NO: 12), conocida como región "DT-A".
En una realización, una proteína CRM197 incluye una secuencia que tiene al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 10. En una realización más preferida, la proteína transportadora incluye la SEQ ID NO: 10.
En otra realización preferente, la proteína CRM197 incluye una secuencia que tiene al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 155. En una realización más preferida, la proteína CRM197 incluye la SEQ ID NO: 155.
Citolisoides: En otra realización preferente, el polipéptido transportador es un citolisoide o una variante o fragmento del mismo. En una realización más preferida, el polipéptido transportador es una toxina neumolisina con toxina neumocócica que se detoxifica o exhibe menos toxicidad que la forma de tipo silvestre correspondiente de la neumolisina toxina neumocócica.
Como se usa en el presente documento, "citolisoide" se refiere a una citolisina modificada, en el que la modificación de la proteína inactiva, detoxifica o reduce la toxicidad, la oligomerización y/o las propiedades hemolíticas de la proteína citolisoide al tiempo que retiene la actividad imunogénica.
Las citolisinas están asociadas a una familia de toxinas formadoras de poros producidas por varias especies de al menos los géneros Clostridium, Streptococcus, Listeria, Bacillus y Arcanobacterium. Las citolisinas pueden conocerse como proteínas hemolíticas. Las secuencias de aminoácidos de las citolisinas de tipo silvestre de ejemplo se muestran en las SEQ ID NO: 88-101. Tales citolisinas son citolisinas que se unen al colesterol.
Una reducción de la toxicidad de la proteína citolisina (es decir, una reducción de la toxicidad, oligomerización y/o hemólisis) incluye al menos un 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o mayor disminución estadísticamente significativa respecto a un control adecuado, tal como en comparación con la proteína citolisina de tipo silvestre correspondiente. Los procedimientos para ensayar la actividad de citolisina son conocidos en la técnica.
Las modificaciones que pueden inactivar o reducir la actividad tóxica (es decir, oligomerización y/o hemólisis) de citolisinas son conocidas en la técnica. Estas modificaciones pueden ser sustituciones, deleciones y/o adiciones de aminoácidos. Tales modificaciones son conocidas en la técnica. Algunos ejemplos incluyen, aunque no de forma limitante, los descritos en los documentos WO2005/108419 y WO2005/108580 que desvelan citolisoides que tienen una mutación (por ejemplo, una sustitución o deleción) dentro de la región correspondiente a los restos de aminoácidos de 144 a 161 de la proteína neumolisina de tipo silvestre. Esta región de neumolisina tiene una secuencia de consenso que se comparte entre las citolisinas. Las citolisinas mutantes tienen una actividad de
oligomerización y/o hemolítica reducida en comparación con la citolisina de tipo silvestre y, por lo tanto, son menos tóxicas. La mutante puede tener una sustitución o deleción de uno o más restos de aminoácidos dentro de las regiones correspondientes a los aminoácidos 144 a 161 de la secuencia de neumolisina de tipo silvestre. Por lo tanto, el citolisoide puede tener una mutación en uno o más de los restos de aminoácidos 144, 145, 146, 147, 148, 5 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160 o 161 de la neumolisina de tipo silvestre.
Las regiones de las citolisinas descritas por las SEQ ID NO: 88-101 correspondientes a los restos 144 a 161 de la neumolisina de tipo silvestre se enumeran a continuación.
Citolisina
Secuencia consenso con los aa de neumolisina 144-161 Posición de aminoácidos
Neumolisina de Streptococcus pneumoniae (SEQ ID NO: 88)
VPARMQYEKITAHSMEQL (SEQ ID NO: 102) V144-L161
Perfringolisina O de Clostridium perfringens (SEQ ID NO: 89)
LPARTQYSESMVYSKSQI (SEQ ID NO: 103) L175-I192
Intermedilisina de Streptococcus pneumoniae (SEQ ID NO: 90)
VPARMQYESISAQSMSQL (SEQ ID NO: 104) V202-L219
Alveolisina de Bacillus alvei (SEQ ID NO: 91)
LPARLQYAESMVYSQNQI (SEQ ID NO: 105) L177-I194
Antrolisina de Bacillus anthracis (SEQ ID NO: 92)
LPARTQYSESMVYSKSQL (SEQ ID NO: 106) L188-L205
Supuesta cereolisina de Bacillus cereus (SEQ ID NO: 93)
LPARTQYSESMVYSKSQI (SEQ ID NO: 107) L175-I192
Ivanolisina O de Listeria ivanovii (SEQ ID NO: 94)
ISAKIDYDQEMAYSESQL (SEQ ID NO: 108) I199-L216
Perfringolisina O de Clostridium perfringens (SEQ ID NO: 116)
LPARTQYSESMVYSKSQI (SEQ ID NO: 109) L174-I191
Seeligeriolisina O de Listeria seeligeri (SEQ ID NO: 96)
INAKIDYSDEMAYSESQL (SEQ ID NO: 110) I201-L218
Estreptolisina O de S. pyogenes (SEQ ID NO: 97)
LPARTQYTESMVYSKSQI (SEQ ID NO: 111) L249-I266
SuilIsina de Streptococcus suis (SEQ ID NO: 98)
TQAELQYDETMAYSMSQL (SEQ ID NO: 112) T172-L189
Tetanolisina de Clostridium tetani (SEQ ID NO: 99)
IPTRMSYSDTMVYSQSQL (SEQ ID NO: 113) I201-L218
Listeriolisina O d Listeria monocytogenes (SEQ ID NO: 100)
VSAKIDYDDEMAYSESQL (SEQ ID NO: 114) V200-L217
Turingiolisina de Bacillus thuringiensis (SEQ ID NO: 101)
LPARMQYTESMVYSKSQI (SEQ ID NO: 115) L188-I205
Ciertas proteínas de citolisina mutantes preferidas difieren de la proteína de tipo silvestre por la sustitución o deleción de dos aminoácidos adyacentes dentro de la región correspondiente a los restos de aminoácidos 144 a 151 10 de la secuencia de neumolisina de tipo silvestre. Ejemplos de tales dobles mutantes son aquellos que contienen sustituciones o deleciones de aminoácidos correspondientes a valina 144 y prolina 145, alanina 146 y arginina 147, metionina 148 y glutamina 149, o tirosina 150 y ácido glutámico 151, es decir, los aminoácidos correspondientes que se muestran en la tabla anterior. En una realización preferente, el citolisoide incluye una deleción de alanina 146 y arginina 147 en comparación con la citolisina de tipo silvestre correspondiente.
15 El mutante puede tener una sustitución en un resto correspondiente a Y181 de perfringolisina. Este resto corresponde a Y150 de neumolisina. Tales mutantes pueden derivarse de perfringolisina o de otras proteínas citolisinas.
Se describen mutantes adicionales de citolisinas que tienen actividad hemolítica reducida en el documento WO 90/06951 y contienen al menos una sustitución o deleción de aminoácidos en al menos una de las regiones 20 correspondientes a los aminoácidos 257-297, 367-397 o 424-437 de la secuencia de neumolisina de tipo silvestre, y, en particular, en las posiciones correspondientes a los aminoácidos 367, 384, 385, 428, 433 y 435 de la secuencia de neumolisina. Por tanto, la proteína citolisina utilizada en los procedimientos y composiciones descritos en el presente documento puede incluir una o más de tales mutaciones además de, o en lugar de, la mutación en la región
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correspondiente a los aminoácidos 144-161 de la secuencia de neumolisina.
Las proteínas citolisina pueden incluir otras mutaciones en relación con las secuencias de tipo silvestre. Estas mutaciones pueden reducir una o más actividades biológicas de la proteína citolisina, tal como la actividad hemolítica, la actividad de oligomerización o la capacidad para activar el complemento, o pueden ser fenotípicamente silenciosas.
Las deleciones y sustituciones son ejemplos de mutaciones que pueden usarse para proporcionar las proteínas mutantes de la descripción con toxicidad reducida. Las sustituciones no conservadoras pueden ser particularmente adecuadas para reducir la toxicidad del mutante, ya que es menos probable que un mutante que tenga una mutación no conservadora retenga niveles de función de tipo salvaje en relación con uno que tenga una sustitución conservadora. Ejemplos adicionales no limitantes de citolisoides en la técnica de desvelan en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2009/0285846A1 (WO2012/134975) y la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2010/0166795 (WO2007/144647).
Las variantes activas o fragmentos de los diversos citolisoides pueden incluir al menos un 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con un polipéptido citolisoide proporcionado en el presente documento en cuanto a que mantienen la actividad del polipéptido transportador. Las variantes activas de los citolisoides son conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Las SEQ ID NO: 117-120 y SEQ ID NO: 1. Véase también, por ejemplo, la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2009/0285846A1 y la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2010/0166795.
También se pueden usar fragmentos de proteínas de citolisina mutantes o de tipo silvestre que retienen la actividad del polipéptido portador. Dichos fragmentos pueden tener, por ejemplo, al menos 50 aminoácidos de longitud, al menos 100 aminoácidos de longitud, al menos 200 aminoácidos de longitud, al menos 300 aminoácidos de longitud o al menos 400 aminoácidos de longitud, siempre que retengan la actividad del polipéptido transportador.
Neumolisoides: En una realización preferente, el polipéptido transportador incluye un polipéptido neumolisoide o una variante o fragmento del mismo. La neumolisina es una toxina que forma poros y es la principal citolisina producida por Streptococcus pneumoniae. La secuencia de aminoácidos de neumolisina de tipo silvestre o nativa se expone en la SEQ ID NO: 21.
Como se usa en el presente documento, "neumolisoide" se refiere a una neumolisina modificada (un toxoide de neumolisina), en la que la modificación de la proteína inactiva o reduce la toxicidad, la oligomerización, las propiedades hemolíticas y/o de activación del complemento de la proteína neumolisoide al tiempo que retiene la actividad del polipéptido transportador, en comparación con la correspondiente neumolisina de tipo silvestre.
Neumolisoides de ejemplo que se pueden usar en las diversas composiciones proporcionadas en el presente documento se describen en, por ejemplo, los documentos WO2005/108419, WO2005/108580, WO 90/06951, la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2009/0285846A1 y la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2010/0166795. Los documentos WO2005/108419 y WO2005/108580 desvelan neumolisoides que tienen una mutación (por ejemplo, una sustitución o deleción) dentro de la región de los aminoácidos 144 a 161 de la proteína neumolisina de tipo silvestre. Estos mutantes tienen una toxicidad, oligomerización y/o actividad hemolítica reducidas en comparación con la neumolisina de tipo silvestre y, por lo tanto, son menos tóxicos.
El mutante puede tener una sustitución o deleción de uno o más aminoácidos 144 a 161 de la secuencia de neumolisina de tipo silvestre. Por lo tanto, el neumolisoide puede tener una mutación en uno o más de los restos de aminoácidos 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160 o 161 de la neumolisina de tipo silvestre. Además, en el documento WO 90/06951 se describen neumolisoides que tienen actividad hemolítica reducida y que tienen al menos una sustitución o deleción de aminoácidos en al menos una de las regiones correspondientes a los aminoácidos 257-297, 367-397 o 424-437 de la neumolisina de tipo silvestre.
Otros ejemplos de un neumolisoide incluyen la SEQ ID NO: 1, o una variante activa o fragmento del mismo. Otro ejemplo incluye un neumolisoide que tiene una mutación de la lisina en la posición de aminoácido 460 a un resto de ácido aspártico (SEQ ID NO: 117) en comparación con la correspondiente neumolisina de tipo silvestre (SEQ ID NO: 21). Tal variante de neumolisoide se desvela en la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2009/0285846A1. Una variante de la SEQ ID NO: 117 se proporciona en el presente documento y se expone en la SEQ ID NO: 118. La variante activa incluye un cambio de aminoácido de lisina en la posición 208 a arginina cuando se compara con la SEQ ID NO: 117.
El neumolisoide expuesto en la SEQ ID NO: 119, o una variante activa o fragmento del mismo, incluye una sustitución de asparagina en lugar de ácido aspártico en la posición de aminoácido 385 y la deleción de alanina 146 y arginina 147 de la secuencia de neumolisina de tipo silvestre. Este neumolisoide expuesto en la SEQ ID NO: 119 puede ser deficiente en hemólisis y en la activación del complemento y se desvela en la solicitud de patente de Estados Unidos número 2010/0166795.
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En una realización más preferida, el polipéptido de fusión incluye un neumolisoide que tiene la SEQ ID NO: 1 o variantes activas o fragmentos de los mismos. El polipéptido de SEQ ID NO: 1 incluye una deleción A146R147, en comparación con el neumolisoide de tipo silvestre.
Por consiguiente, las variantes activas o fragmentos de neumolisoides se proporcionan en el presente documento. Dichas variantes activas pueden comprender al menos un 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 88-120 o SEQ ID NO: 21. Las variantes activas de neumolisina también se describen, por ejemplo, en los documentos US 2010/0166795 y US 2008/0285846A1. La técnica proporciona una guía con respecto a la preparación de dichas variantes, tal como se describe en otra parte del presente documento. Por lo tanto, en una realización, el polipéptido de fusión incluye el neumolisoide expuesto en una cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 88-101, La SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 1, o una variante activa de la misma que tienen al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21.
En una realización, la proteína transportadora deriva de la peptidasa C5a estreptocócica (SCP) de Streptococcus pyogenes. En una realización preferente, la proteína transportadora incluye una secuencia que tiene al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 151. En una realización más preferida, la proteína transportadora incluye la SEQ ID NO: 151.
En una realización, la proteína transportadora deriva de GNA2091. En una realización preferente, la proteína transportadora incluye una secuencia que tiene al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 147. En una realización más preferida, la proteína transportadora incluye la SEQ ID NO: 147.
D) Polipéptidos ORF2086
El término "ORF2086", como se usa en el presente documento, se refiere al marco de lectura abierto 2086 de una bacteria de la especie Neisseria. ORF2086 de Neisseria, las proteínas codificadas en el mismo, fragmentos de dichas proteínas y composiciones inmunogénicas que comprenden dichas proteínas se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en el documento WO2003/063766 y en las solicitudes de patente de Estados Unidos n.° 20060257413, US 20090202593, WO2012032489 y US 20120093852. Los polipéptidos ORF2086 también se describen en el documento WO2013132452 y en la patente de Estados Unidos con número de publicación US20130243807. Los ejemplos de un polipéptido ORF2086 incluyen un polipéptido que tiene una cualquiera de las secuencias expuestas en las SEQ ID NO: 22-87, tal como una cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 5, 19, 22-65.
El término “P2086” se refiere, en general, a la proteína codificada por ORF2086. La "P" antes de "2086" es una abreviatura de "proteína". Las proteínas P2086 de la divulgación pueden estar lipidadas o no lipidadas. “LP2086” y “P2086” se refieren, normalmente, a formas lipidadas y no lipidadas de una proteína 2086, respectivamente. La proteína P2086 de la divulgación puede ser recombinante. “rLP2086” y “rP2086” se refieren, normalmente, a formas lipidadas y no lipidadas de una proteína 2086 recombinante, respectivamente. "2086" también se conoce como proteína de unión al factor H (fHBp).
La expresión "polipéptido ORF2086 no lipidado de tipo silvestre" o "polipéptido 2086 no lipidado de tipo silvestre" o "polipéptido no lipidado de tipo silvestre" como se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido ORF2086 que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos del correspondiente polipéptido ORF2086 lipidado maduro encontrado en la naturaleza. La única diferencia entre las moléculas no lipidadas y lipidadas es que el polipéptido ORF2086 no lipidado de tipo silvestre no está lipidado con una cola del lípido tripalmitoílo en la cisteína en N-terminal.
La expresión "cisteína N-terminal" se refiere a un resto de cisteína (Cys) en la cola N-terminal o N-terminal de un polipéptido. Más específicamente, la "cisteína en el extremo N-terminal" como se usa en el presente documento se refiere a la cisteína en el extremo N-terminal a la que las lipoproteínas LP2086 están lipidadas con una cola de lípido de tripalmitoílo, como se sabe en la técnica.
En una realización, los polipéptidos y composiciones de la invención incluyen un polipéptido ORF2086, en el que el polipéptido ORF2086 no incluye un resto de cisteína en el extremo N del polipéptido ORF2086. Los ejemplos de un polipéptido ORF2086 en el que no está presente una cisteína N-terminal incluyen los polipéptidos descritos en las SEQ ID NO: 42-65 y las SEQ ID NO: 131-134.
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En aún otra realización, el polipéptido ORF2086 en un conjugado de polipéptido transportador-polipéptido ORF2086 no incluye una cisteína en el extremo N-terminal del polipéptido ORF2086.
El término "tallo de Gly/Ser" como se usa en el presente documento se refiere a restos de Gly y Ser consecutivos en el extremo N-terminal de un polipéptido ORF2086. Puede haber al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 restos de Gly y Ser, preferentemente entre 5 y 12 restos de Gly y Ser, en el tallo de Gly/Ser. En una realización, el polipéptido ORF2086 incluye al menos 2 y, como máximo, 15 restos de Gly y/o Ser consecutivos. Los tallos de Gly/Ser nativos de las variantes del polipéptido ORF2086 están representados por las secuencias subrayadas en la FlG. 2A-2C del documento WO2012032489 y la publicación de patente de Estados Unidos N.° US20120093852. En una realización, el tallo de Gly/Ser del polipéptido ORF2086 incluye una modificación en comparación con el polipéptido ORF2086 de tipo silvestre o nativo. Los ejemplos de una modificación del tallo de Gly/Ser nativo de un polipéptido ORF2086 incluyen una deleción de un resto de Gly y/o Ser, una sustitución de un resto de Gly por un resto de Ser o una sustitución de un resto de Ser por un resto de Gly, una adición de un resto de Gly y/o Ser, y cualquier combinación de los mismos. Los ejemplos de un polipéptido ORF2086 que incluye una modificación de la región del tallo de Gly/Ser nativo incluyen, por ejemplo, los polipéptidos descritos por las SEQ ID NO: 62-65 y las SEQ ID NO: 131-134.
Como se sabe en la materia, la forma no lipidada de un polipéptido ORF2086 puede carecer de la secuencia líder original o puede incluir una secuencia líder que se reemplaza con una porción de una secuencia que no especifica un sitio para la acilación de ácidos grasos en una célula huésped. Véase, por ejemplo, los documentos WO2003/063766, La patente de Estados Unidos n.° 8101194, el documento WO2012032489 y la publicación de patente de Estados Unidos n.° US20120093852. Los ejemplos de un polipéptido ORF2086 no lipidado incluyen un polipéptido que tiene cualquiera de las secuencias expuestas en las SEQ ID NO: 22-65. En una realización preferente, los ejemplos de un polipéptido ORF2086 no lipidado incluyen un polipéptido que tiene una cualquiera de las secuencias expuestas en las SEQ ID NO: 42-65.
En una realización, el polipéptido ORF2086 está codificado por una cualquiera de las secuencias de polinucleótidos expuestas en las SEQ ID NO: 66-87. En una realización preferente, el polipéptido ORF2086 está codificado por una secuencia que no codifica una cisteína en el extremo N o en la posición 1 del resto de aminoácido del polipéptido ORF2086. Las secuencias de polinucleótidos de ejemplo incluyen las SEQ ID NO: 131-134.
En otra realización preferente, el polipéptido ORF2086 está codificado por una secuencia optimizada de codones de una cualquiera de las secuencias de polinucleótidos expuestas en las SEQ ID NO: 66-87. Las secuencias optimizadas para los codones que codifican un polipéptido ORF2086 se describen en el documento WO2012032489, la publicación de patente de Estados Unidos n.° US20120093852, la PCT/IB2013/051791 y la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 13/787594. Ejemplos de secuencias optimizadas para codones incluyen las secuencias de polinucleótidos expuestas en la SEQ ID NO: 121-129.
El polipéptido ORF2086 puede derivar de una especie de Neisseria, incluyendo las cepas de Neisseria meningitidis (serogrupos A, B, C, D, W-135, X, Y, Z y 29E), Neisseria gonorrhoeae, y Neisseria lactamica, así como porciones inmunogénicas y/o equivalentes biológicos de dichas proteínas.
Los polipéptidos ORF2086 incluyen las proteínas de la subfamilia A y las proteínas de la subfamilia B, porciones inmunogénicas de las mismas y/ equivalentes biológicos de las mismas. Los polipéptidos ORF2086 o equivalentes de los mismos, etc. pueden estar lipidados o no lipidados. Preferentemente, el polipéptido ORF2086 no está lipidado. Como alternativa, las composiciones inmunogénicas pueden incluir combinaciones de polipéptidos ORF2086 lipidados y no lipidados.
Las proteínas de la subfamilia A de ORF2086 y los polipéptidos de la subfamilia B son conocidos en la técnica. Véanse el documento WO2003/063766 y la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 8101194, que desvelan las SEQ ID NO: 260 a 278 en la misma que representan secuencias de aminoácidos asociadas con proteínas de la Subfamilia A de 2086. Además, Las SEQ ID NO: 279 a 299 desveladas en el documento WO2003/063766 y la patente de Estados Unidos n.° 8101194 representan las secuencias de aminoácidos asociadas con proteínas de 2086 subfamilia B. Los polipéptidos de ORF2086 de la subfamilia A y la subfamilia B también se describen en el documento WO2012032489, la publicación de patente de Estados Unidos n.° US20120093852, El documento PCT/IB2013/051791, ahora WO2013132452, y la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 13/787594, ahora número de publicación US20130243807. En una realización, el polipéptido no lipidado incluye la secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % de identidad con una secuencia que codifica el polipéptido lipidado correspondiente.
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En una realización de ejemplo, el polipéptido ORF2086 incluye su región de tallo Gly/Ser nativa respectiva. Por ejemplo, el polipéptido B44 incluye una región de tallo como se muestra en el subrayado en la FIG. 2C del documento WO2012032489 y la publicación de Patente de Estados Unidos N.° US20l20093852. Véase, por ejemplo, los restos 2-12 de la SEQ ID NO: 40 y los restos 1-11 de la SEQ ID NO: 60. Como otro ejemplo, el polipéptido A12 incluye una región de tallo como se muestra en el subrayado en la FIG. 2A del documento WO2012032489 y la publicación de Patente de Estados Unidos N.° US201 20093852. Véase, por ejemplo, los restos 2-7 de la SEQ ID NO: 28 y los restos 1-6 de la SEQ ID NO: 47.
En una realización, el polipéptido ORF2086 incluye al menos aproximadamente 200, 210, 220, 230, 240, 250, 255 o 260 aminoácidos consecutivos, y como máximo aproximadamente 270, 269, 268, 267, 266, 265, 264, 263., 260, 259, 258, 257, 256 o 255 aminoácidos consecutivos. Cualquier valor mínimo se puede combinar con un valor máximo para definir un intervalo. Más preferentemente, el polipéptido tiene al menos 254 o 262 aminoácidos consecutivos. En algunas realizaciones, el polipéptido tiene, como máximo, 254 aminoácidos consecutivos. En otras realizaciones, el polipéptido tiene, como máximo, 262 aminoácidos consecutivos. En una realización, el polipéptido ORF2086 incluye la secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con una secuencia que codifica el polipéptido ORF2086 correspondiente. Por ejemplo, en una realización de ejemplo, el polipéptido A62 incluye la secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticas a la SEQ ID NO: 41.
Como se usa en el presente documento, el término "no piruvilado" se refiere a un polipéptido que no tiene contenido de piruvato. Los polipéptidos ORF2086 no lipidados que tienen un contenido de piruvato exhibían típicamente un desplazamiento de masa de +70, en comparación con el polipéptido de tipo silvestre correspondiente. En una realización, el polipéptido de la invención no exhibe un desplazamiento de la masa de +70 en comparación con el correspondiente polipéptido de tipo silvestre no lipidado cuando se mide mediante espectrometría de masas. Los polipéptidos ORF2086 n piruvilados también se describen en el documento WO2012032489, la publicación de patente de Estados Unidos n.° US20120093852, la PCT/IB2013/051791 y la solicitud de patente de Estados Unidos n.° 13/787594.
E) Polinucleótidos
En un aspecto, la divulgación se refiere a un polinucleótido aislado que codifica uno cualquiera de los polipéptidos aislados descritos en el presente documento. En un aspecto, la divulgación se refiere a un polinucleótido aislado que codifica uno cualquiera de los polipéptidos de fusión descritos en el presente documento. En una realización, la secuencia de polinucleótidos aislados es una secuencia optimizada de codones.
En una realización, el polipéptido ORF2086 está codificado por una secuencia de polinucleótidos optimizada por codones. Los ejemplos de una secuencia optimizada de codones que codifica un polipéptido ORF2086 incluyen las secuencias expuestas en las SEQ ID NO: 121-129. En una realización preferente, el polipéptido aislado está codificado por una secuencia de polinucleótidos que incluye una secuencia de polinucleótidos optimizada por codones que codifica un polipéptido ORF2086. En una realización más preferida, el polipéptido de fusión está codificado por una secuencia de polinucleótidos que incluye una secuencia de polinucleótidos optimizada por codones que codifica un polipéptido ORF2086. En otra realización preferente, el polipéptido ORF2086 en un conjugado de polipéptido transportador-ORF2086 está codificado por una secuencia de polinucleótido optimizada por codones.
F) Fragmentos de los Polinucleótidos y Polipéptidos
Las variantes activas y los fragmentos de los polinucleótidos y polipéptidos divulgados también se describen en el presente documento. "Variantes" se refiere a secuencias sustancialmente similares. Como se usa en el presente documento, un "polipéptido variante" se refiere a un polipéptido derivado de la proteína nativa mediante una modificación de uno o más restos de aminoácidos en cualquier posición de la proteína nativa. La modificación puede incluir una deleción (denominada truncamiento) de uno o más restos de aminoácidos en el extremo N-terminal y/o C- terminal de la proteína nativa, deleción y/o adición de uno o más restos de aminoácidos en uno o más sitios internos en la proteína nativa, o una sustitución de uno o más restos de aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa. Los polipéptidos variantes continúan teniendo la actividad biológica deseada del polipéptido nativo, es decir, son inmunogénicos. Una variante de una secuencia polipeptídica o polinucleotídica desvelada en el presente documento típicamente tendrá al menos aproximadamente un 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia con la secuencia de referencia.
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longitud completa y, por lo tanto, ser inmunogénico. Los fragmentos de un polinucleótido pueden codificar fragmentos de proteína que retienen la actividad biológica de la proteína y, por lo tanto, son inmunogénicos. Como alternativa, los fragmentos de un polinucleótido que son útiles como cebadores de PCR generalmente no codifican fragmentos de proteína que retengan actividad biológica. Por lo tanto, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos desvelada en el presente documento pueden variar de al menos aproximadamente 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400 o 1500 nucleótidos contiguos o hasta el polinucleótido de longitud completa. Los fragmentos de una secuencia polipeptídica desvelados en el presente documento pueden comprender al menos 10, 15, 20, 25, 30, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190., 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 o 500 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en el polipéptido de longitud completa.
G) Conjugados meningocócicos
En una realización, la composición inmunogénica incluye además al menos un conjugado seleccionado entre el grupo que consiste en: un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis del serogrupo A; un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis del serogrupo C; un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis del serogrupo W135; y un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis del serogrupo Y.
En una realización preferente, la composición inmunogénica incluye un conjugado de un polisacárido capsular de Neisseria meningitidis y una proteína transportadora. Preferentemente, la proteína transportadora en el conjugado de sacárido es una toxina bacteriana, tal como una toxina diftérica o del tétanos, o toxoides o mutantes de la misma. De la forma más preferente, la proteína transportadora es CRM197. Por ejemplo, en una realización, la composición incluye al menos un conjugado seleccionado entre (a) un conjugado del polisacárido capsular del serogrupo A de N. meningitidis y CRM197; (b) un conjugado del polisacárido capsular del serogrupo C de N. meningitidis y CRM197; (c) un conjugado del polisacárido capsular del serogrupo W135 de N. meningitidis y CRM197; y (d) un conjugado del polisacárido capsular del serogrupo Y de N. meningitidis y CRM197.
Los sacáridos capsulares de los serogrupos A, C, W135 e Y se caracterizan y conocen en la técnica, y se describen en el documento WO2012032489 y la publicación de patente de Estados Unidos N.°. US20120093852, cada uno de los cuales se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad.
H) Respuestas inmunitarias bactericidas
En otro aspecto, los polipéptidos aislados y composiciones descritos en el presente documento provocan una respuesta inmunitaria bactericida en un mamífero frente a un polipéptido ORF2086 del serogrupo B de N. meningitidis. Las composiciones tienen la capacidad de inducir anticuerpos antimeningocócicos bactericidas después de la administración a un mamífero y en realizaciones preferidas pueden inducir anticuerpos que son bactericidas contra cepas de N. meningitidis que expresan variantes de LP2086 de las respectivas subfamilias. A continuación se proporciona información adicional sobre respuestas bactericidas.
En una realización, el polipéptido aislado y/o la composición descritos en el presente documento provocan una respuesta inmunitaria bactericida contra una cepa de N. meningitidis del serogrupo B que expresa una variante de ORF2086 que es homóloga al polipéptido ORF2086. En una realización preferente, una composición que incluye un polipéptido de la subfamilia A desencadena una respuesta inmunitaria bactericida contra una cepa de N. meningitidis del serogrupo B que expresa una variante LP2086 de la subfamilia A homóloga. En otra realización preferente, una composición que incluye un polipéptido de la subfamilia A desencadena una respuesta inmunitaria bactericida contra una cepa de N. meningitidis del serogrupo B que expresa una variante LP2086 de la subfamilia A heteróloga.
En otra realización preferente, el polipéptido aislado y/o la composición descritos en el presente documento provocan una respuesta inmunitaria bactericida contra una cepa del serogrupo B de N. meningitidis que expresa una variante de ORF2086 que es heteróloga al polipéptido ORF2086.
En una realización, las composiciones provocan una respuesta inmunitaria bactericida contra una cepa de N. meningitidis del serogrupo B que expresa una variante LP2086 de la subfamilia heteróloga. Por ejemplo, una composición que incluye un polipéptido de la subfamilia A puede provocar una respuesta inmunitaria bactericida contra cepas de N. meningitidis del serogrupo B que expresa una variante LP2086 de la subfamilia A o la subfamilia B.
En un aspecto adicional, los polipéptidos aislados y composiciones descritos en el presente documento provocan una respuesta inmunitaria bactericida contra al menos una cepa de N. meningitidis del serogrupo A, el serogrupo B, el serogrupo C, el serogrupo W135, el serogrupo X, y/o el serogrupo Y de N. meningitidis. En una realización preferente, las composiciones provocan una respuesta inmunitaria bactericida al menos contra el serogrupo B, el serogrupo C y el serogrupo Y de N. meningitidis.
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provoca estos anticuerpos funcionales.
En una realización, la respuesta inmunitaria y/o la inducción de anticuerpos bactericidas se mide mediante un ensayo bactericida en suero (SBA). Un SBA de ejemplo se describe a continuación.
En una realización preferente, el polipéptido y/o composición de la invención inducen una respuesta inmunitaria en un mamífero, en la que la respuesta es de al menos 1 vez, 2 veces, al menos 3 veces o, preferentemente, al menos 4 veces o más mayor que la respuesta inmunitaria en el mamífero en ausencia del polipéptido y/o composición de la invención. Por ejemplo, en una realización, el polipéptido y/o composición de la invención inducen una respuesta inmunitaria en un mamífero, en la que la respuesta es de al menos 1 vez, 2 veces, 3 veces o, preferentemente, al menos 4 veces o más mayor que la respuesta inmunitaria en el mamífero antes de la administración del polipéptido y/o composición de la invención. En una realización de ejemplo, un polipéptido aislado que incluye la SEQ ID NO: 2 induce una respuesta inmunitaria en un mamífero, En el que la respuesta es de al menos 1 vez, 2 veces, 3 veces o, preferentemente, al menos 4 veces mayor que la respuesta inmunitaria en el mamífero en ausencia del polipéptido.
Descripciones generales
El término "mamíferos" tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier mamífero, tales como, por ejemplo, seres humanos, ratones, conejos o primates no humanos. En una realización preferente, el mamífero es un ser humano.
Ejemplo 1: Clonación y expresión de polipéptidos de fusión, incluido A05
El gen fHBP A05 utilizado se muestra en la SEQ ID NO: 6 (construcción de expresión pEB042).
Diseño de fusiones PLY
La versión de neumolisina (PLY) utilizada en estos estudios se denominó delta 6 (A6PLY). Contiene una deleción de restos de aminoácidos A146Rl47. El gen resultante es 1410 pb (SEQ ID NO: 3) y 470 aminoácidos (SEQ ID NO: 1). Se diseñaron dos fusiones de A6PLY a A05. Uno tenía A6PLY en el extremo N terminal del polipéptido de fusión (SEQ ID NO: 4 ADN y la SEQ ID NO: 2, proteína; Figura 1A). La región del tallo de A05 sirvió como un enlazador flexible entre las proteínas. En la segunda fusión, se colocó A05 en el extremo N-terminal seguido del enlazador Gly- Ser-Gly (GSG), seguido del gen PLY (SEQ ID NO: 7, ADN; La SEQ ID NO: 8, proteína, Figura 1B).
Se han fabricado y verificado varias construcciones de proteína de fusión de neumolisina adicionales para su expresión. Estas construcciones adicionales usan la región del tallo de las respectivas variantes de fHBP como un enlazador flexible. Estos incluyen PLY-A12 (SEQ ID NO: 136), PLY-B01 (SEQ ID NO: 138), PLY-B09 (SEQ ID NO: 140), PLY-B24 (SEQ ID NO: 142), PLY-B44 SEQ ID NO: 144),
Diseño de las fusiones CRMw-A05
CRM197 se usó tanto como la proteína de longitud completa (536 aminoácidos, SEQ ID NO: 9, ADN; La SEQ ID NO: 10, proteína) o la región DT-A (aminoácidos 1-193 de CRM197; La SEQ ID NO: 11, ADN; La SEQ ID NO: 12, proteína). Se realizaron dos fusiones de A05 utilizando el CRM197 de longitud completa, (i) CRM197 en el extremo N- terminal fusionado a A05 (SEQ ID NO: 13, ADN; La SEQ ID NO: 14, proteína Figura 1C), y (ii) A05 en el extremo N- terminal, seguido del enlazador GSG y, después, CRM197 (SEQ ID nO: 15, ADN; La SEQ ID NO: 16; proteína, Figura 1D). Se realizó una versión de la fusión DT-A-A05: DT-A en el extremo N-terminal fusionado con A05 en el extremo C (SEQ ID NO: 17, ADN; La SEQ ID NO: 18, proteína, Figura 1E).
Diseño de construcciones de la proteína de fusión A05 que usan transportadores proteicos alternativos
Se diseñaron construcciones adicionales para evaluar transportadores proteicos alternativos fusionados con la variante A05 fHBP. Estos transportadores proteicos incluyen, (i) GNA2091 de N. meningitidis, y (ii) C5a peptidasa de estreptococos (SCP) de Streptococcus pyogenes. La proteína de fusión en el primer caso está compuesta por 180 aminoácidos de GNA2091 (SEQ ID NO: 146) en el extremo N-terminal fusionada a A05 en el extremo C-terminal, usando la región del tallo de A05 como el enlazador flexible entre las proteínas (GNA2091-A05 SEQ ID NO: 148), El segundo ejemplo está compuesto por 950 aminoácidos de SCP (SEQ ID NO: 150) en el extremo N-terminal fusionada a A05 en el extremo C-terminal, usando la región del tallo de A05 como el enlazador flexible entre las proteínas (SCP-A05 SEQ ID NO: 152),
Vectores de expresión utilizados en estos estudios
Las proteínas de fusión iniciales se clonaron en pET30a en los sitios Ndel-BamHI mediante la reacción InFusion® (Clontech). Las fusiones se clonaron posteriormente en un panel de 6 vectores seleccionados para evaluar diferentes promotores con el fin de optimizar la expresión de proteínas (rhaT, lac, y el promotor de arabinosa). Los vectores también variaron en la intensidad de las secuencias de Shine Delgarno que promueven la iniciación de la traducción. Los vectores se basan en la cadena principal de pET30a, sustituyendo el promotor T7 y los genes reguladores por estos elementos específicos.
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Líneas celulares y expresión
Todos los plásmidos de expresión se transformaron en E. coli. Las cepas de expresión se cultivaron durante la noche en HySoy más 0,5 % de glucosa y 50 pg/ml de kanamicina a 30 °C. Los cultivos nocturnos se sembraron en medio HySoy recién preparado más 50 pg/ml de kanamicina en una dilución 1:50. Las células se cultivaron a 30 °C o a 20 °C. A una DO600 ~1,0, los cultivos se indujeron con el inductor apropiado y se incubaron a las mismas temperaturas durante la noche. Se recogieron las células y se evaluó la solubilidad de las muestras añadiendo reactivo BUGBUSTER™ (EMD) o mediante ultrasonidos, seguido de centrifugación. Los lisados celulares completos y las fracciones solubles/insolubles se pasaron por geles Tris-Bis al 4-12 % y se tiñeron con tinción de Coomassie.
Resultados
La tabla 1 muestra los resultados de la clonación de la fusión CRM197-A05 (SEQ ID NO: 14). En general, los clones de CRM 197-A05 dieron productos con mutaciones múltiples en el marco de lectura abierto. Todos los clones de fusión produjeron proteína recombinante que era 100 % insoluble. La construcción de fusión DT-A-A05 (SEQ ID NO: 18) también produjo proteína insoluble.
La Tabla 2 muestra los resultados de las proteínas de fusión Ply-A05. Mientras que la expresión de Ply-A05 o A05- Ply en pET30a a 30 °C produjo proteína de fusión insoluble, los vectores alternativos produjeron proteína parcialmente soluble. En particular, las proteínas de fusión Ply-A05 expresadas en pRHAM (pDD18), pRAME (pDD21) y pDK347 (pDD20) a 30 °C fueron considerablemente solubles (Figura 2). Se eligió pDD18 para la fermentación, no obstante, las condiciones usadas (medio Apollon, crecimiento a 30 °C, inducción con 0,2 % de ramnosa) produjeron proteína insoluble. Se realizaron cultivos en matraces de agitación a pequeña escala de pDD18, pDD20 y pDD21 a 20 °C para determinar si una temperatura más baja podría potenciar la solubilidad de la proteína de fusión. A diferencia de pDD20, los cultivos de pDD18 y pDD21 no expresaron cantidades detectables de proteína Ply-A05 a 20 °C (Figura 3). Por lo tanto, se produjeron seis cultivos en matraz de 1 litro de pDD20 para la purificación de proteínas (Figura 4). La proteína de fusión expresada a partir de pDD20 tiene un único cambio de aminoácido (L32f) en la porción de neumolisina de la proteína de fusión.
Tabla 1. Proteínas de fusión CRM197-A05 producidas.
Construcci ón
Inserto Plásmido Cepa Nivel de expresión Solubilidad Secuencia
pDD23
CRM-A05 pRHAM (ramnosa) BD686 {+} No analizado V543G
pDD24
CRM-A05 pRAME (rhaT con potenciador) BD686 {++} insoluble L164F, S446N, V482I, V651I
pDD25
CRM-A05 pDK329 (ara) BD686 {+} No analizado correcto
pDD26
CRM-A05 pDK338 (lac) BD686 {-} No analizado N373H
pDD27
CRM-A05 pDK347 (lac con potenciador) BD686 {+} insoluble correcto
pDD28
CRM-A05 pDK363 (ara con potenciador) BD686 {+++} insoluble correcto
pDD14
DTA-A05 pET30a BD686 {+++++} insoluble R259K, T394S
pDD31
DTA-A05 pRAME (rhaT con potenciador) BD686 {-} No analizado R259K, T394S
pDD34
DTA-A05 pDK347 (lac con potenciador) BD686 {-} No analizado R259K, T394S
pDD35
DTA-A05 pDK363 (ara con potenciador) BD686 {++++} insoluble R259K, T394S
pLN15
A05-CRM pET30a BD686 {++++++} insoluble correcto
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Tabla 2. Proteínas de fusión Ply-A05 producidas.
Construcci ón
inserto plásmido cepa nivel de expresión solubilidad secuencia
pDD15
Ply-A05 pET30a BD686 {+++++} insoluble correcto
pDD18
Ply-A05 pRHAM (ramnosa) BD686 {+++} soluble correcto
pDD19
Ply-A05 pDK329 (ara) BD686 {+} No analizado correcto
pDD20
Ply-A05 pDK347 (lac con potenciador) BD686 {++++} soluble L32F
pDD21
Ply-A05 pRAME (rhaT con potenciador) BD686 {++++} en su mayoría soluble correcto
pDD22
Ply-A05 pDK338 (lac) BD686 {+} No analizado correcto
pDD29
Ply-A05 pDK363 (ara con potenciador) BD686 {+++++} en su mayoría insoluble correcto
pLN116
A05-Ply pET30a BD686 {+++++} insoluble correcto
Ejemplo 2: Ensayo bactericida en suero
Los títulos de anticuerpos funcionales se determinaron mediante ensayo bactericida en suero (SBA) contra cepas de Neisseria meningitidis que expresan una variante LP2086 con secuencia homóloga o heteróloga a las contenidas en la vacuna.
Los anticuerpos bactericidas en suero de macacos o conejos inmunizados con la vacuna de ORF2086 se detectaron usando SBA con complemento humano. Los sueros inmunes de conejos o los sueros inmunes de macacos se inactivaron por calor para eliminar la actividad intrínseca del complemento y posteriormente se diluyeron en serie a 1:2 en PBS de Dulbecco con Ca2 + y Mg2 + (D-PBS) en una placa de microtitulación de 96 pocillos para evaluar la actividad bactericida sérica contra cepas de N. meningitidis. Las bacterias utilizadas en el ensayo se cultivaron en medio GC suplementado con suplemento de Kellogg (GCK) y 4,2 % de NaHCO3 y se controlaron mediante densidad óptica a 650 nm. Las bacterias se cosecharon para usar en el ensayo A una DO650 final de 0,50-0,60, diluido en D- PBS y se añadieron 1000-3000 UFC a la mezcla de ensayo con 20 % de complemento humano.
Como fuente de complemento exógena se usó suero humano sin actividad bactericida detectable. Las fuentes del complemento se probaron para determinar su idoneidad para cada cepa de ensayo de N. meningitidis individual. Se usó una fuente de complemento solo si el número de bacterias que sobrevivieron en las reacciones de control sin suero inmune añadido era > 50 % de las iniciales.
Después de una incubación de 30 minutos con agitación a 700 rpm en un agitador a 37 °C con 5 % de CO2, se añadió D-PBS a la mezcla de reacción y se transfirieron alícuotas a placas de microfiltro llenas con medio de GCK al 50 %. Las placas de microfiltro se filtraron, se incubaron durante la noche a 37 °C con 5 % de CO2 y las microcolonias se tiñeron y cuantificaron. Los títulos bactericidas en suero se definieron como la dilución de suero recíproca interpolada que produjo una reducción del 50 % de las unidades formadoras de colonias (UFC) en comparación con las UFC en pocillos de control sin sueros inmunes usando estas condiciones de ensayo. Se observó una mayor susceptibilidad a la destrucción con suero inmune ORF2086 en relación con los sueros preinmunes si había un aumento de 4 veces o más en el título de SBA. A los sueros que eran negativos contra la cepa de ensayo a la dilución de partida se asignó un título de la mitad del límite de detección para el ensayo (es decir, 4).
Ejemplo 3: Inmunogenicidad del polipéptido de fusión (SEQ ID NO: 2)
La actividad bactericida de las muestras de suero de ratones inmunizados con versiones no lipidadas de alelos de la proteína fHBP es generalmente menor que las muestras de suero de ratones inmunizados con los homólogos de fHBP lipidados. De forma similar, la respuesta de la SBA contra cepas de N. meningitidis que expresan dos variantes distintas de fHBP de la subfamilia A (A05 y A22) es mayor después de la inmunización de primates no humanos (NHP) con A05 lipidada (SEQ ID NO: 19) que con A05 no lipidado (SEQ ID NO: 44) (Tabla 3).
Tabla 3. El título bactericida contra cepas de N. meningitidis que expresan las variantes de fHBP A05 y A22 es mayor en suero de NHP vacunados con A05 lipidado (SEQ ID NO: 19) en comparación con A05 no
lipidado (SEQ ID NO: 5).
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% Respondedores elevación > 4X Títulos PD3 SBA
vacuna de A05
Dosis (mcg) A05 A22
Lipidado
30 100 60
10 70 80
No lipidado
120 30 0
60 50 20
30 50 0
10 40 10
Se han evaluado composiciones adicionales para proporcionar cobertura usando combinaciones de proteínas no lipidadas. En esta investigación, los inventores demostraron que la inmunogenicidad puede mejorarse con proteínas recombinantes compuestas por variantes no lipidadas de fHBP genéticamente fusionadas a una proteína transportadora. Los mismos hallazgos también podrían extenderse a las variantes de fHBP que están conjugadas con proteínas transportadoras.
En el ejemplo actual, se prueba una proteína de fusión recombinante (SEQ ID NO: 2) compuesta por neumolisina de Streptococcus pneumoniae atenuado (A6PLY) genéticamente fusionada a la variante A05 de fHBP de N. meningitidis (SEQ ID NO: 5).
El A6PLY atenuado (SEQ ID NO: 1) se produce mediante mutagénesis dirigida al sitio. Específicamente, la variante A6PLY inmunogénica (deleción del dipéptido A146R147) elimina tanto la actividad citolítica que forma poros como el fenotipo proinflamatorio que es característico de la PLY de tipo silvestre (SEQ ID NO: 21).
Para explorar si la A6PLY atenuada podría estabilizarse y, por lo tanto, mejorar la inmunogenicidad de A05 no lipidado, se construyó una proteína recombinante compuesta por A6PLY de Str. pneumoniae genéticamente fusionado a la variante de fHBP de N. meningitidis A05 (SEQ ID NO: 2) para la prueba. En el presente ejemplo, se inmunizaron primates no humanos (NHP) con la proteína de fusión A6PLY-A05 (SEQ ID NO: 2) del bivalente de A05 lipidado (SeQ ID NO: 19)/B01 (SeQ ID No: 20) y se reforzó las semanas 4 y 8. El suero de los animales tomado a las 10 semanas (después de la dosis 3, PD3) se evaluó para determinar la actividad bactericida contra una cepa de expresión A05 de N. meningitidis. Los títulos de SBA en muestras de PD3 de ambos grupos de tratamiento fueron elevados en comparación con los títulos de prevacunación (Tabla 4). La respuesta inmunitaria a A6PLY-A05 (SEQ ID NO: 2) fue tan fuerte como a la respuesta a la composición de A05 lipidada (SEQ ID NO: 19)/B01 (SEQ ID NO: 20).
TABLA 4. Actividad bactericida contra aislados clínicos de N. meningitidis del serogrupo B que expresan las variantes de la proteína fHBP A05 (SEQ ID NO: 23) o A22 (SEQ ID NO: 22) usando suero de NhP vacunados con la proteína de fusión A6PLY-A05 (SEQ ID NO: 2) o A05 bivalente lipidado (SEQ ID NO: 19)/B01 (SEQ ID
___________________________________________NO: 20).___________________________________________
% Respondedores al PD3 con elevación > 4X Títulos de SBA
Composición antigénica
Lipidado Dosis/0,5 ml A05 A22
A05 (SEQ ID NO: 19) y B01 (SEQ ID NO: 20)
Sí 10 mcg cada uno 80 60
A6PLY-A05 (SEQ ID NO: 2)
No 10 mcg 100 100
Las muestras de suero de PD3 de los NHP vacunados con A6PLY-A05 (SEQ ID NO: 2) también tenían una fuerte actividad bactericida contra una cepa de N. meningitidis que expresa la variante de fHBP A22 (SEQ ID NO: 22) (Tabla 4). El porcentaje de animales que responden con una elevación > 4 veces en el título de SBA utilizando la cepa objetivo A22 de N. meningitidis fue mayor en los NHP tratados con A6PLY-A05 que en el grupo de tratamiento con fHBP lipidado bivalente. En resumen, la actividad bactericida funcional contra cepas de N. meningitidis que expresan dos variantes de fHBP distintas de la subfamilia A que usan suero de NHP vacunados con la proteína de fusión A6PLY-A05 no lipidada es al menos tan fuerte como la actividad del grupo de tratamiento con rLP2086 bivalente lipidado.
Para explorar más a fondo el impacto de A6PLY de Str. pneumoniae relativo a otras proteínas transportadoras sobre la inmunogenicidad de A05 no lipidado, se preparó una proteína recombinante compuesta por GNA2091 de N. meningitidis fusionada con la variante de fHBP A05 para la prueba. Además, un conjugado químico de la peptidasa C5a estreptocócica expresada recombinante (SCP) de Streptococcus pyogenes (tratada con cinc, véase el Ejemplo 4) acoplado a la variante fHBP A05 (SEQ ID NO: 5) también se preparó para la evaluación de la inmunogenicidad. En el presente ejemplo, se inmunizaron primates no humanos (NHP) con las proteínas de fusión A05 respectivas, el conjugado químico SCP-A05, la composición de A05 bivalente lipidada (SeQ ID NO: 19)/B01 (SEQ ID NO: 20), o A05 no lipidado (SEQ ID NO: 5) y se reforzaron las semanas 4 y 8. La dosis de antígeno se ajustó de modo que se administró el equivalente de 10 mcg de A05 con cada vacunación. El suero de animales extraído a las 10 semanas (después de la dosis 3, PD3) se evaluó para determinar la actividad bactericida contra una cepa de expresión de
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A05 de N. meningitidis. Los títulos de SBA en las muestras de PD3 del grupo de tratamiento PLY-A05 (SEQ ID NO 2) fueron (i) elevados en comparación con los títulos de prevacunación, (ii) comparables a la respuesta a la composición A05/B01 lipidada bivalente y (iii) superior a la respuesta inmunitaria al A05 no lipidado y a los antígenos de la proteína de fusión GNA2091-A05 (SEQ iD NO: 149) (Tabla 5). Mientras que los animales vacunados con el conjugado químico SCP-A05 respondieron al antígeno, la magnitud de la respuesta inmunitaria no fue tan robusta como la detectada en el grupo de tratamiento con proteína de fusión PLY-A05.
Tabla 5
Composición antigénica
Lipidado Cantidad de fHBP en el antígeno (mcg/0,5 ml) Títulos de GMT SBA el PD3 (A05) % Respondedores elevación >4X Títulos de SBA (A05)
A05 (SEQ ID NO: 19) y B01 (SEQ ID NO: 20)
sí 10 de cada uno 64 100
A05 (SEQ ID NO: 5)
no 10 19 80
PLY-A05 (SEQ ID NO: 2)
no 10 104 100
GNA2091-A05 (SEQ ID NO: 149)
no 10 16 60
SCP-A05 (SEQ ID NO: 5) Conjugado
no 10 43 80
Ejemplo 4: Eliminación de la modificación postraduccional
Cuando la cisteína en rP2086-A05-cys está localizada en el extremo amino (SEQ ID NO: 156), una cantidad significativa de la proteína se piruvila durante la fermentación. Esta modificación de piruvilación se eliminó de las proteínas mediante tratamiento con sulfato de cinc. Los espectros de masas caracterizaron el rP2086-A05-cys piruvilado (SEQ ID NO: 156) como que exhibía un desplazamiento de masa de +71 Da, en comparación con la proteína rP2086-A05-cys tratada con sulfato de cinc, que no exhibió un desplazamiento de masa de +71 en comparación con rP2086-A05-cys piruvilada correspondiente.
Moviendo el resto de cisteína a otras posiciones en la proteína (por ejemplo, mover la cisteína a las posiciones 2 o 6, véase la SEQ ID NO: 157 y SEQ ID NO: 158, respectivamente) se eliminó el problema de la piruvilación. Una descripción de estas construcciones se proporciona en el Ejemplo 9.
Además de las técnicas de cromatografía estándar, para separar rP2086-A05-cys nativa de la proteína que contiene tioles bloqueados, se usó una resina reactiva con tiol (Thioproply Sepharose 6B). En esta técnica, la rP2086-A05-cys nativa se une a la columna y la rP2086-A05-cys bloqueada se eluye en el flujo. La rP2086-A05-cys nativa se eluye a continuación de la columna usando un agente reductor (preferentemente DTT).
Como se usa en los siguientes ejemplos, el término "rP2086-A05-cys" se refiere a una proteína rP2085 A05 no piruvilada no lipidada, independientemente de cómo la modificación de piruvilación no está presente, por ejemplo, naturalmente durante la fermentación, por tratamiento con sulfato de cinc, mediante modificaciones genéticas a la proteína para eliminar la cisteína inicial en la posición 1 del extremo N y reemplazando un resto de serina en las posiciones 2 o 6 con un resto de cisteína.
Ninguno de los procesos descritos a continuación han sido optimizados. Por consiguiente, se podrían hacer otras concentraciones de proteína, proporciones de proteína, tiempos de reacción y temperaturas distintas a las descritas para producir conjugados de rP2086-A05.
Ejemplo 5: Conjugación de neumolisina a rP2086-A05-cys usando un reticulante de amina a sulfhidrilo con brazo espaciador de polietilenglicol (PEG) soluble.
Preparación del intermedio neumolisina-NEM activado por SM (PEG)4
La proteína neumolisina a aproximadamente 10 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato se prepara para la conjugación por derivatización de la proteína con N-etil maleimida (NEM), seguido de activación con sM(PEG)4. Se incuba un NEM con un exceso molar de 10 veces con neumolisina a 20-25 °C y EDTA 1 mM durante un tiempo suficiente para bloquear los sulfhidrilos de neumolisina por completo. Típicamente, 20 minutos son suficientes para preparar el intermedio neumolisina-NEM. Enlazador SM(PEG)4, obtenido a partir de una solución que tiene una concentración de 100 mM y disuelto en disolvente dimetilsulfóxido, se incuba a un exceso molar de 10 veces sobre el intermedio neumolisina-NEM intermedio durante 30 minutos. La reacción de activación se termina por cromatografía de exclusión por tamaño usando una columna rellena con resina Sephadex G25. Las fracciones cromatográficas que contenían el intermedio SM (PEG)4-neumolisina activada-NEM pueden almacenarse a -80 °C o conjugarse inmediatamente con la proteína intermedia mutante del tallo de cisteína MnB 2086 A05 reducida.
La modificación de NEM se usa para bloquear el resto de cisteína en la neumolisina de modo que no reaccione con el enlazador SM (PEG).
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Ejemplo 6: Preparación de rP2086-A05-cys reducida:
rP2086-A05-cys a aproximadamente 1,3 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato se incuba con una cantidad de resina TCEP inmovilizada y EDTA 1 mM suficientes para reducir por completo los sulfhidrilos de la proteína MnB. Típicamente, Una incubación de 30 minutos de rP2086-A05-cys con un volumen igual de resina sedimentada y EDTA 1 mM es suficiente para reducir por completo los sulfhidrilos. El intermedio de proteína MnB reducida se recupera por filtración a través de una membrana de polietersulfona de 0,2 micrómetros y se usa inmediatamente para la conjugación.
Ejemplo 7: Conjugación de intermedio de SM (PEG)4-Neumolisina activada -NEM a rP2086-A05-cys:
El intermedio rP2086-A05-cys reducido se combina con el intermedio SM(PEG)4-neumolisina activada-NEM intermedio para lograr una relación molar de 4:1 a concentraciones de la proteína de aproximadamente 1,2 y 0,6 mg/ml respectivamente. La reacción continúa durante 2 horas a 20-25 °C y se termina mediante la adición de Cisteamina-HCI a pH 5,5, a la solución de reacción a una concentración final de 2 mM de cisteamina-HCl. El producto de la reacción de conjugación rP2086-A05-cys SM(PEG)4 El producto de reacción conjugado de neumolisina-NEM se purifica cromatográficamente a partir del intermedio SM(PEG)4-neumolisina activada-NEM sin conjugar mediante cromatografía de afinidad con metal inmovilizado (IMAC) utilizando resina de flujo rápido de níquel-sefarosa 6. El producto de reacción se une en un tampón compuesto por Tris 20 mM, NaCl 0,5 M a pH 7,7 y se eluye en Tris 20 mM, NaCl 0,5 M a pH 7,7 imidazol 40 mM. Se consigue una purificación adicional del conjugado mediante la eliminación del intermediario de la proteína mutante del tallo de cisteína MnB 2086 A05 reducida por cromatografía de intercambio iónico usando resina Q Sepharose HP. El producto de reacción se une en Tris 20 mM, a pH 7,7 y se recupera en una elución de gradiente salino de Tris 20 mM, NaCl 0,5 M a pH 7,7. Las fracciones Q que contienen el conjugado se intercambian con tampón mediante Cromatografía de Exclusión por Tamaño usando una columna rellena con resina Sephadex G25 y se filtra en esterilidad.
Ejemplo 8: Conjugación de SCP a rP2086-A05-cys usando un reticulante de amina a sulfhidrilo con un brazo espaciador de ciclohexano
Preparación del intermedio de SMCC-SCP activada:
La proteína SCP a aproximadamente 12,6 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato se incuba a 25 °C con un exceso molar de 20 veces del enlazador sulfosuccinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato, (Sulfo- SMCC; obtenido a partir de una reserva 20 mM preparada en fosfato de sodio 10 mM a pH 6,8) y EDTA 1 mM durante 1 hora. La reacción de activación se termina por cromatografía de exclusión por tamaño usando una columna rellena con resina Sephadex G25. Las fracciones cromatográficas que contienen el intermedio SCP activado-MCC pueden almacenarse a -80 °C o conjugarse inmediatamente con intermedio de rP2086-A05-cys reducido.
Preparación del intermedio de rP2086-A05-cys reducido:
Se incuba rP2086-A05-cys a aproximadamente 3,8 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato con TCEP 4 mM y EDTA 1 mM, suficiente para reducir por completo los sulfhidrilos de la proteína MnB. Típicamente, una incubación de 1 hora de la proteína MnB con TCEP y EDTA 1 mM es suficiente para reducir completamente los sulfhidrilos. La proteína MnB reducida se usa inmediatamente para la conjugación.
Conjugación del intermedio SMCC-SCP activado a rP2086-A05-cys:
La rP2086-A05-cys reducida se combina con el intermedio SMCC-SCP activado para lograr una relación en peso igual, (una relación molar de 4:1), a concentraciones proteicas de aproximadamente 2,6 mg/ml y 2,6 mg/ml respectivamente. La reacción continúa durante 2,5 horas a -25 °C y se termina mediante la adición de Cisteamina- HCI a pH 5,5, a la solución de reacción a una concentración final de 2 mM de cisteamina-HCl. El producto de la reacción de conjugación MnB 2086 A05 cisteína-producto de la reacción de conjugación de proteína mutante SMCC- SCP se purifica cromatográficamente a partir del intermedio SMCC-SCP no conjugado activado mediante cromatografía de afinidad de metal inmovilizada (IMAC) utilizando resina de flujo rápido de níquel-sefarosa 6. El producto de reacción se une en un tampón compuesto por Tris 20 mM, NaCl 0,5 M a pH 7,7 y se eluye en Tris 20 mM, NaCl 0,5 M a pH 7,7 imidazol 40 mM. Se consigue una purificación adicional del conjugado mediante la eliminación del intermedio de proteína mutante de cisteína MnB 2086 A05 reducida por cromatografía de intercambio iónico usando resina Q Sepharose HP. El producto de reacción se une en Tris 20 mM, a pH 7,7 y se recupera en una elución de gradiente salino de Tris 20 mM, NaCl 0,5 M a pH 7,7. Las fracciones Q que contienen el conjugado se intercambian con tampón mediante Cromatografía de Exclusión por Tamaño usando una columna rellena con resina Sephadex G25 y se filtra en esterilidad.
Ejemplo 9: Generación de mutantes del tallo rP2086-A05-cys
Se diseñó una construcción no lipidada de A05 para eliminar la señal de lipidación y producir una proteína recombinante con la cisteína en el extremo N-terminal. Las proteínas se expresaron fuertemente en E. coli. Las proteínas purificadas se analizaron usando cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC)
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interconectada con un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo cuádruple (QTOF-MS) para proporcionar un medio de monitorización de la formación de variantes relacionadas con el producto.
Para evaluar si mover la cisteína en la región del tallo de la glicina serina de A05 reduciría las modificaciones en la cisteína mientras se mantiene disponible para la conjugación, se construyeron dos variantes de A05, una con la cisteína N-terminal movida a la posición 2 de la proteína madura reemplazando el resto de serina en esta posición (véase la SEQ ID NO: 157) y uno con la cisteína movida a la posición 6 de la proteína madura reemplazando el resto de serina en esta posición (véase la SEQ ID NO: 158). Esto se logró incorporando los cambios del codón en el cebador 5' utilizado para la amplificación del gen. Tanto los cebadores 5' como 3' diseñados para amplificar A05 tenían 15 extensiones de bases con homología con el corte de pET30a con Ndel y BamHI. A05 y el vector se ligaron usando un kit Clontech InFusion®. Tras la transformación, se cribaron las colonias para detectar inserciones y se verificó que las que contenían inserciones contenían la sustitución de aminoácidos por secuenciación de ADN.
Las siguientes cláusulas describen realizaciones adicionales de la divulgación:
C1. Un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de un polipéptido transportador y la secuencia de aminoácidos de un polipéptido ORF2086.
C2. El polipéptido de acuerdo con la cláusula C1, en el que el polipéptido aislado es un polipéptido de fusión.
C3. El polipéptido de acuerdo con la cláusula C1, en el que el polipéptido ORF2086 es un polipéptido de la subfamilia A.
C4. El polipéptido de acuerdo con la cláusula C1, en el que el polipéptido ORF2086 es un polipéptido de la subfamilia B.
C5. El polipéptido de acuerdo con la cláusula C1, en el que el polipéptido ORF2086 está lipidado.
C6. El polipéptido de acuerdo con la cláusula C1, en el que el polipéptido ORF2086 no está lipidado.

C7. El polipéptido de acuerdo con la cláusula C1, en el que el polipéptido ORF2086 es A05.

C8. El polipéptido de acuerdo con la cláusula C1, en el que el polipéptido ORF2086 es A12.

C9. El polipéptido de acuerdo con la cláusula C1, en el que el polipéptido ORF2086 es A22.
C10.
El pol péptido de acuerdo con la cláusula C1, en el que el pol ipéptido ORF2086 es B01.
C11.
El poli péptido de acuerdo con la cláusula C1, en el que el pol ipéptido ORF2086 es B09.
C12.
El poli péptido de acuerdo con la cláusula C1, en el que el pol ipéptido ORF2086 es B15.
C13.
El poli péptido de acuerdo con la cláusula C1, en el que el pol ipéptido ORF2086 es B16.
C14.
El poli péptido de acuerdo con la cláusula C1, en el que el pol ipéptido ORF2086 es B22.
C15.
El poli péptido de acuerdo con la cláusula C1, en el que el pol ipéptido ORF2086 es B24.
C16.
El poli péptido de acuerdo con la cláusula C1, en el que el pol ipéptido ORF2086 es B44.
C17.
El poli péptido de acuerdo con la cláusula C1, en el que el pol ipéptido ORF2086 es A62.
C18.
El pol péptido de acuerdo con la cláusula C1, en el que el pol ipéptido ORF2086 es A04.
C19.
El poli péptido de acuerdo con la cláusula C1, en el que el pol ipéptido ORF2086 es A01.
C20.
El poli péptido de acuerdo con la cláusula C1, en el que el pol ipéptido ORF2086 es A06.
C21.
El pol péptido de acuerdo con la cláusula C1, en el que el pol ipéptido ORF2086 es A07.
C22.
El poli péptido de acuerdo con la cláusula C1, en el que el pol ipéptido ORF2086 es A15.
C23.
El poli péptido de acuerdo con la cláusula C1, en el que el pol ipéptido ORF2086 es A19.
C24.
El pol péptido de acuerdo con la cláusula C1, en el que el pol ipéptido ORF2086 es A20.
C25.
El poli péptido de acuerdo con la cláusula C1, en el que el pol ipéptido ORF2086 es A29.
C26.
El poli péptido de acuerdo con la cláusula C1, en el que el pol ipéptido ORF2086 es B02.
C27.
El polipéptido de acuerdo con la cláusula C1, donde el polipéptido ORF2086 compren
D NO: 5, 19, 22-65.
polipéptido transportador es un citolisoide.
aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ C28. El polipéptido de acuerdo con la cláusula C1, en el que el C29. El polipéptido de acuerdo con la cláusula C28, en el que el citolisoide deriva de un polipéptido neumolisina de Streptococcus pneumoniae, un polipéptido perfringolisina O de Clostridium perfringens, un polipéptido intermedilisina de Streptococcus intermedius, un polipéptido alveolisina de Bacillus alvei, un polipéptido antrolisina de Bacillus anthracis, un supuesto polipéptido cereolisina de Bacillus cereus, un polipéptido ivanolisina O de Listeria ivanovii, un polipéptido piolisina de Arcanobacterium pyogenes, un polipéptido seeligeriolisina O de Listeria seeligeri, un polipéptido estreptolisina O de S. pyogenes, un polipéptido suilisina de Streptococcus suis, un polipéptido tetanolisina de Clostridium tetani, un polipéptido listeriolisina O de Listeria monocytogenes, un polipéptido estreptolisina O de Streptococcus equisimilis, un polipéptido estreptolisina O de S. canis, un polipéptido turingiolisina O de Bacillus thuringiensis, un polipéptido latersporolisina O de B. laterosporus, un polipéptido botulinolisina de Clostridium botulinum, un polipéptido chauveolisina de C. chauvoei, un polipéptido bifermentolisina de C. bifermentans, un polipéptido sordelilisina de C. sordellii, un polipéptido histoliticolisina de Clostridium histiolyticum, un polipéptido novilisina de Clostridium novyi, o un polipéptido septicolisina O de Clostridium septicum. C30. El polipéptido de acuerdo con la cláusula C29, en el que el citolisoide deriva de un polipéptido neumolisina de Streptococcus pneumoniae.
C31. El polipéptido de acuerdo con la cláusula C30, en el que el citolisoide comprende una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1.
C32. El polipéptido de acuerdo con la cláusula C1, en el que el polipéptido transportador se detoxifica en comparación con el polipéptido transportador de tipo silvestre correspondiente y se selecciona entre el grupo que consiste en la toxina del tétanos (tT), la proteína circumsporozoíto de Plasmodium falciparum, el antígeno de
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superficie de la hepatitis B, el polipéptido del núcleo nuclear de la hepatitis B, el polipéptido de la matriz de H. influenzae, la hemaglutinina de H. influenzae, toxoide diftérico, el mutante del toxoide diftérico CRM197, el complejo polipeptídico de la membrana externa de N. meningitidis del grupo B (OMPC), un citolisoide, la toxina neumolisina neumocócica, el polipéptido del shock térmico de Mycobacterium bovis, el polipéptido del shock térmico de M. leprae, el toxoide del cólera, LT de E. coli, ST de E. coli, la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, el polipéptido A de la superficie neumocócica, el polipéptido adhesina neumocócica (PsaA), la peptidasa C5a de estreptococos del grupo A o el grupo B, el polipéptido D de Haemophilus influenzae, ovoalbúmina, hemocianina de lapa californiana (KLH), seroalbúmina bovina (BSA), derivado polipeptídico purificado de la tuberculina (PPD), PorB (de N. meningitidis) y derivados, variantes o fragmentos de los mismos. C33. El polipéptido de acuerdo con la cláusula C1, en el que el polipéptido transportador es CRM197.
C34. El polipéptido de acuerdo con la cláusula C32, en el que el polipéptido transportador no es CRM197.
C35. El polipéptido de acuerdo con la cláusula C1, en el que el polipéptido transportador es la peptidasa C5a estreptocócica (SCP) de Streptococcus pyogenes.
C36. El polipéptido de acuerdo con la cláusula C1, en el que el polipéptido transportador es GNA2091.
C37. El polipéptido de acuerdo con la cláusula C1, que comprende además una secuencia polipeptídica derivada de bacterias neumocócicas.
C38. El polipéptido de acuerdo con la cláusula C1, en el que el polipéptido aislado no comprende una secuencia polipeptídica derivada de bacterias neumocócicas.
C39. El polipéptido de acuerdo con la cláusula C1, en el que el polipéptido aislado provoca un anticuerpo bactericida contra una variante del serogrupo B de N. meningitidis que es homóloga del polipéptido ORF2086. C40. El polipéptido de acuerdo con la cláusula C1, en el que el polipéptido aislado provoca un anticuerpo bactericida contra una variante del serogrupo B de N. meningitidis que es heteróloga del polipéptido ORF2086. C41. El polipéptido de acuerdo con la cláusula C2, en el que el polipéptido de fusión comprende el siguiente orden: el polipéptido transportador unido operablemente al polipéptido ORF2086.
C42. El polipéptido de acuerdo con la cláusula C2, en el que el polipéptido de fusión comprende el siguiente orden: un polipéptido ORF2086 unido operablemente a un polipéptido transportador.
C43. El polipéptido de acuerdo con la cláusula C2, en el que el polipéptido transportador comprende la SEQ ID NO: 1 y el polipéptido ORF2086 comprende la SEQ ID NO: 5.
C44. El polipéptido de acuerdo con la cláusula C43, en el que el polipéptido aislado comprende la SEQ ID NO: 2. C45. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las cláusulas CC1- CC44.
C46. Una composición inmunogénica que comprende un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las cláusulas CC1-CC44 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
C47. La composición de acuerdo con la cláusula C46, que comprende además al menos un conjugado seleccionado entre: a) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis del serogrupo A; b) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis del serogrupo C; c) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis del serogrupo W135; y d) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis del serogrupo Y.
C48. Un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria contra Neisseria meningitidis en un mamífero que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz del polipéptido aislado de acuerdo con una cualquiera de las cláusulas CC1-CC44.
C49. El procedimiento de la cláusula C48, en el que la respuesta inmunitaria comprende un anticuerpo bactericida.
C50. El procedimiento de la cláusula C48, en el que la respuesta inmunitaria es igual a una respuesta inmunitaria de un mamífero al que se ha administrado un polipéptido ORF2086 lipidado correspondiente en ausencia de un polipéptido transportador, cuando se evalúa en condiciones idénticas.
C51. El procedimiento de la cláusula C48, en el que la respuesta inmunitaria es mayor que una respuesta inmunitaria de un mamífero al que se ha administrado un polipéptido ORF2086 no lipidado correspondiente en ausencia de un polipéptido transportador, cuando se evalúa en condiciones idénticas.
C52. El procedimiento de la cláusula C48, en el que la respuesta inmunitaria es, como máximo, un 10 % menor que una respuesta inmunitaria de un mamífero al que se ha administrado un polipéptido ORF2086 lipidado correspondiente en ausencia de un polipéptido transportador, cuando se evalúa en condiciones idénticas.
C53. El procedimiento de la cláusula C48, en el que la respuesta inmunitaria es, como máximo, un 20 % menor que una respuesta inmunitaria de un mamífero al que se ha administrado un polipéptido ORF2086 lipidado correspondiente en ausencia de un polipéptido transportador, cuando se evalúa en condiciones idénticas.
C54. Un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria contra Neisseria meningitidis en un mamífero que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de la composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las cláusulas CC46-CC47.
C55. El procedimiento de la cláusula C54, en el que la respuesta inmunitaria comprende un anticuerpo bactericida.
C56. El procedimiento de la cláusula C54, en el que la respuesta inmunitaria es igual a una respuesta inmunitaria de un mamífero al que se ha administrado un polipéptido ORF2086 lipidado correspondiente en ausencia de un polipéptido transportador, cuando se evalúa en condiciones idénticas.
C57. El procedimiento de la cláusula C54, en el que la respuesta inmunitaria es mayor que una respuesta inmunitaria de un mamífero al que se ha administrado un polipéptido ORF2086 no lipidado correspondiente en ausencia de un polipéptido transportador, cuando se evalúa en condiciones idénticas.
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C58. El procedimiento de la cláusula C54, en el que la respuesta inmunitaria es, como máximo, un 10 % menor que una respuesta inmunitaria de un mamífero al que se ha administrado un polipéptido ORF2086 lipidado correspondiente en ausencia de un polipéptido transportador, cuando se evalúa en condiciones idénticas.
C59. El procedimiento de la cláusula C54, en el que la respuesta inmunitaria es, como máximo, un 20 % menor que una respuesta inmunitaria de un mamífero al que se ha administrado un polipéptido ORF2086 lipidado correspondiente en ausencia de un polipéptido transportador, cuando se evalúa en condiciones idénticas.
C60. Una composición inmunogénica que comprende un polipéptido ORF2086 y un polipéptido transportador. C61. La composición de acuerdo con la cláusula C60, en la que la composición es un conjugado.
C62. La composición de acuerdo con la cláusula C60, en el que el polipéptido ORF2086 es un polipéptido de la subfamilia A.
C63. La composición de acuerdo con la cláusula C60, en el que el polipéptido ORF2086 es un polipéptido de la subfamilia B.
C64. La composición de acuerdo con la cláusula C60, en el que el polipéptido ORF2086 está lipidado.
C65. La composición de acuerdo con la cláusula C60, en el que el polipéptido ORF2086 no está lipidado.
C66. La composición de acuerdo con la cláusula C60, en la que el polipéptido ORF2086 es no lipidado y no piruvilado.
C67.
La composición de acuerdo con la cláusula C60, en el que el polipéptido ORF2086 es A05
C68.
La composición de acuerdo con la cláusula C60, en el que el polipéptido ORF2086 es A12
C69.
La composición de acuerdo con la cláusula C60, en el que el polipéptido ORF2086 es A22
C70.
La composición de acuerdo con la cláusula C60, en el que el polipéptido ORF2086 es B01
C71.
La composición de acuerdo con la cláusula C60, en el que el polipéptido ORF2086 es B09
C72.
La composición de acuerdo con la cláusula C60, en el que el polipéptido ORF2086 es B15.
C73.
La composición de acuerdo con la cláusula C60, en el que el polipéptido ORF2086 es B16
C74.
La composición de acuerdo con la cláusula C60, en el que el polipéptido ORF2086 es B22
C75.
La composición de acuerdo con la cláusula C60, en el que el polipéptido ORF2086 es B24
C76.
La composición de acuerdo con la cláusula C60, en el que el polipéptido ORF2086 es B44
C77.
La composición de acuerdo con la cláusula C60, en el que el polipéptido ORF2086 es A62

C78. El polipéptido de acuerdo con la cláusula C60, en e

C79. El polipéptido de acuerdo con la cláusula C60, en e

C80. El polipéptido de acuerdo con la cláusula C60, en e

C81. El polipéptido de acuerdo con la cláusula C60, en e

C82. El polipéptido de acuerdo con la cláusula C60, en e

C83. El polipéptido de acuerdo con la cláusula C60, en e

C84. El polipéptido de acuerdo con la cláusula C60, en e

C85. El polipéptido de acuerdo con la cláusula C60, en e

C86. El polipéptido de acuerdo con la cláusula C60, en e
que e que e que e que e que e que e que e que e que e
polipéptido ORF2086 es A04. polipéptido ORF2086 es A01. polipéptido ORF2086 es A06. polipéptido ORF2086 es A07. polipéptido ORF2086 es A15. polipéptido ORF2086 es A19. polipéptido ORF2086 es A20. polipéptido ORF2086 es A29. polipéptido ORF2086 es B02.
C87. La composición de acuerdo con la cláusula C60, donde el polipéptido ORF2086 comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5, 19, 22-65.
C88. La composición de acuerdo con la cláusula C60, en el que el polipéptido transportador es un citolisoide.
C89. La composición de acuerdo con la cláusula C88, en el que el citolisoide deriva de un polipéptido neumolisina de Streptococcus pneumoniae, un polipéptido perfringolisina O de Clostridium perfringens, un polipéptido intermedilisina de Streptococcus intermedius, un polipéptido alveolisina de Bacillus alvei, un polipéptido antrolisina de Bacillus anthracis, un supuesto polipéptido cereolisina de Bacillus cereus, un polipéptido ivanolisina O de Listeria ivanovii, un polipéptido piolisina de Arcanobacterium pyogenes, un polipéptido seeligeriolisina O de Listeria seeligeri, un polipéptido estreptolisina O de S. pyogenes, un polipéptido suilisina de Streptococcus suis, un polipéptido tetanolisina de Clostridium tetani, un polipéptido listeriolisina O de Listeria monocytogenes, un polipéptido estreptolisina O de Streptococcus equisimilis, un polipéptido estreptolisina O de S. canis, un polipéptido turingiolisina O de Bacillus thuringiensis, un polipéptido latersporolisina O de B. laterosporus, un polipéptido botulinolisina de Clostridium botulinum, un polipéptido chauveolisina de C. chauvoei, un polipéptido bifermentolisina de C. bifermentans, un polipéptido sordelilisina de C. sordellii, un polipéptido histoliticolisina de Clostridium histiolyticum, un polipéptido novilisina de Clostridium novyi, o un polipéptido septicolisina O de Clostridium septicum.
C90. La composición de acuerdo con la cláusula C89, en el que el citolisoide deriva de un polipéptido neumolisina de Streptococcus pneumoniae.
C91. La composición de acuerdo con la cláusula C90, en el que el citolisoide comprende una secuencia que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1.
C92. La composición de acuerdo con la cláusula C60, en el que el polipéptido transportador se detoxifica en comparación con el polipéptido transportador de tipo silvestre correspondiente y se selecciona entre el grupo que consiste en la toxina del tétanos (tT), la proteína circumsporozoíto de Plasmodium falciparum, el antígeno de superficie de la hepatitis B, el polipéptido del núcleo nuclear de la hepatitis B, el polipéptido de la matriz de H. influenzae, la hemaglutinina de H. influenzae, toxoide diftérico, el mutante del toxoide diftérico CRM197, el complejo polipeptídico de la membrana externa de N. meningitidis del grupo B (OMPC), un citolisoide, la toxina neumolisina neumocócica, el polipéptido del shock térmico de Mycobacterium bovis, el polipéptido del shock térmico de M. leprae, el toxoide del cólera, LT de E. coli, ST de E. coli, la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, el polipéptido A de la superficie neumocócica, el polipéptido adhesina neumocócica (PsaA), la peptidasa C5a de estreptococos del grupo A o el grupo B, el polipéptido D de Haemophilus influenzae,
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ovoalbúmina, hemocianina de lapa californiana (KLH), seroalbúmina bovina (BSA), derivado polipeptídico purificado de la tuberculina (PPD), PorB (de N. meningitidis) y derivados, variantes o fragmentos de los mismos. C93. La composición de acuerdo con la cláusula C60, en el que el polipéptido transportador es CRM197.
C94. La composición de acuerdo con la cláusula C92, en el que el polipéptido transportador es CRM197.
C95. La composición de acuerdo con la cláusula C60, en el que el polipéptido transportador es la peptidasa C5a estreptocócica (SCP) de Streptococcus pyogenes.
C96. La composición de acuerdo con la cláusula C60, en el que el polipéptido transportador es GNA2091.
C97. La composición de acuerdo con la cláusula C60, en la que el polipéptido transportador es heterólogo del polipéptido ORF2086.
C98. La composición de acuerdo con la cláusula C60, que comprende además una secuencia polipeptídica derivada de bacterias neumocócicas.
C99. La composición de acuerdo con la cláusula C60, en la que la composición no comprende una secuencia polipeptídica derivada de bacterias neumocócicas.
C100. La composición de acuerdo con la cláusula C60, en la que la composición provoca una respuesta de anticuerpo bactericida contra una cepa del serogrupo B de N. meningitidis que expresa una variante de ORF2086 que es homóloga del polipéptido ORF2086.
C101. La composición de acuerdo con la cláusula C60, en la que la composición provoca una respuesta de anticuerpo bactericida contra una cepa del serogrupo B de N. meningitidis que expresa una variante de ORF2086 que es heteróloga del polipéptido ORF2086.
C102. La composición de acuerdo con la cláusula C60, que comprende además al menos un conjugado seleccionado entre: a) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis del serogrupo A; b) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis del serogrupo C; c) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis del serogrupo W135; y d) un conjugado de un sacárido capsular de Neisseria meningitidis del serogrupo Y.
C103. La composición de acuerdo con una cualquiera de las cláusulas CC60-CC102, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
C104. Un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria contra Neisseria meningitidis en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de la composición de acuerdo con una cualquiera de las cláusulas CC60-CC103.
C105. El procedimiento de la cláusula C104, en el que la respuesta inmunitaria comprende un anticuerpo bactericida.
C106. El procedimiento de la cláusula C104, en el que la respuesta inmunitaria es igual a una respuesta inmunitaria de un mamífero al que se ha administrado un polipéptido ORF2086 lipidado correspondiente en ausencia de un polipéptido transportador, cuando se evalúa en condiciones idénticas.
C107. El procedimiento de la cláusula C104, en el que la respuesta inmunitaria es mayor que una respuesta inmunitaria de un mamífero al que se ha administrado un polipéptido ORF2086 no lipidado correspondiente en ausencia de un polipéptido transportador, cuando se evalúa en condiciones idénticas.
C108. El procedimiento de la cláusula C104, en el que la respuesta inmunitaria es, como máximo, un 10 %
menor que una respuesta inmunitaria de un mamífero al que se ha administrado un polipéptido ORF2086
lipidado correspondiente en ausencia de un polipéptido transportador, cuando se evalúa en condiciones idénticas.
C109. El procedimiento de la cláusula C104, en el que la respuesta inmunitaria es, como máximo, un 20 %
menor que una respuesta inmunitaria de un mamífero al que se ha administrado un polipéptido ORF2086
lipidado correspondiente en ausencia de un polipéptido transportador, cuando se evalúa en condiciones idénticas.

C110. Un polipéptido aislado que comprende la SEQ ID NO: 2.

C111. Un polipéptido aislado que comprende la SEQ ID NO: 8.

C112. Un polipéptido aislado que comprende la SEQ ID NO: 14.

C113. Un polipéptido aislado que comprende la SEQ ID NO: 16.

C114. Un polipéptido aislado que comprende la SEQ ID NO: 18.

C115. Un polipéptido aislado que comprende la SEQ ID NO: 137.

C116. Un polipéptido aislado que comprende la SEQ ID NO: 139.

C117. Un polipéptido aislado que comprende la SEQ ID NO: 141.

C118. Un polipéptido aislado que comprende la SEQ ID NO: 143.

C119. Un polipéptido aislado que comprende la SEQ ID NO: 145.

C120. Un polipéptido aislado que comprende la SEQ ID NO: 149.

C121. Un polipéptido aislado que comprende la SEQ ID NO: 153.
C122. Un polipéptido de fusión que comprende la SEQ ID NO: 1 operativamente unido a expuesta en la SEQ ID NO: 42 a SEQ ID NO: 61.
C123. Un polipéptido de fusión que comprende la SEQ ID NO: 147 operativamente unido a expuesta en la SEQ ID NO: 42 a SEQ ID NO: 61.
C124. Un polipéptido de fusión que comprende la SEQ ID NO: 151 operativamente unido a expuesta en la SEQ ID NO: 42 a SEQ ID NO: 61.
C125. Un polipéptido de fusión que comprende la SEQ ID NO: 10 operativamente unido a expuesta en la SEQ ID NO: 42 a SEQ ID NO: 61.
C126. Un polipéptido de fusión que comprende la SEQ ID NO: 155 operativamente unido a
cualquier secuencia cualquier secuencia cualquier secuencia cualquier secuencia cualquier secuencia
5
10
15
20
25
30
35
40
expuesta en la SEQ ID NO: 42 a SEQ ID NO: 61.
C127. Una composición que comprende una C5a peptidasa estreptocócica (SCP) de Streptococcus pyogenes conjugada a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 156.
C128. Una composición que comprende una C5a peptidasa estreptocócica (SCP) de Streptococcus pyogenes conjugada a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 157.
C129. Una composición que comprende una C5a peptidasa estreptocócica (SCP) de Streptococcus pyogenes conjugada a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 158.
C130. Una composición que comprende un neumolisoide conjugado a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 156.
C131. Una composición que comprende un neumolisoide conjugado a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 157.
C132. Una composición que comprende un neumolisoide conjugado a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 158.
C133. Una composición que comprende un primer polipéptido de fusión que comprende un neumolisoide operativamente unido a un ORF2086 A05 no lipidado y un segundo polipéptido de fusión que comprende un neumolisoide unido operativamente a un ORF2086 B01 no lipidado.
C134. Una composición que comprende un primer polipéptido de fusión que comprende la secuencia de
aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 y un segundo polipéptido de fusión que comprende la secuencia de
aminoácidos de la SEQ ID NO: 139.
C135. Una composición que comprende un primer polipéptido de fusión que comprende un neumolisoide
operativamente unido a un ORF2086 B01 no lipidado y un segundo polipéptido de fusión que comprende un
neumolisoide unido operativamente a un ORF2086 B24 no lipidado.
C136. Una composición que comprende un primer polipéptido de fusión que comprende un neumolisoide operativamente unido a un ORF2086 B09 no lipidado y un segundo polipéptido de fusión que comprende un neumolisoide unido operativamente a un ORF2086 B44 no lipidado.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Pfizer Inc.
<120> POLIPÉPTIDOS DE FUSIÓN INMUNOGÉNICOS
<130> PC72014
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<160> 158
<170> PatentIn versión 3.5
<210> 1 <211>468 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintética <400> 1

Claims (6)

1. Un polipéptido aislado que comprende la secuencia de un polipéptido transportador, en el que el polipéptido transportador es un citolisoide, ligado operativamente a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido ORF2086 no lipidado y en el que el polipéptido ORF2086 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.
5 2. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polipéptido transportador es:
- derivado de un polipéptido neumolisina de Streptococcus pneumoniae o;
- detoxificado en comparación con el polipéptido transportador de tipo silvestre correspondiente que es neumolisina de toxina neumocócica.
3. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polipéptido es un polipéptido de fusión.
10 4. Un polipéptido aislado que comprende la SEQ ID NO: 2 u 8.
5. Un polipéptido de fusión que comprende la SEQ ID NO: 1 operativamente ligada a la SEQ ID NO: 44.
6. Una composición inmunogénica que comprende un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
7. Una composición que comprende un primer polipéptido de fusión que comprende un neumolisoide operativamente 15 ligado a un ORF2086 A05 no lipidado y un segundo polipéptido de fusión que comprende un neumolisoide
operativamente ligado a un ORF2086 no lipidado.
8. Una composición que comprende un neumolisoide conjugado a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 156, 157 o 158.
263
A05
CRM197.
264
imagen1
imagen2
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Usados de células enteras
pDD18 0 17 41

pDD20 PDD21

0 17 41 0 17 41
. . . . -

■ •*'’'• "• ' <•
Fracciones de pDD a T17
1 2 3 4 5 6
imagen3
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