CN104140972B

CN104140972B - 白喉毒素突变体crm197的制备方法

Info

Publication number: CN104140972B
Application number: CN201310163343.5A
Authority: CN
Inventors: 陈国友
Original assignee: SHANGHAI HUIDUN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Shanghai Huidun Yintai Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2013-05-07
Filing date: 2013-05-07
Publication date: 2018-01-23
Anticipated expiration: 2033-05-07
Also published as: CN104140972A

Abstract

本发明涉及白喉毒素突变体CRM197的制备方法。具体地，公开了一种用于编码白喉毒素突变体CRM197的核苷酸序列，其编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；而且所述核苷酸序列与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列有≥95%相同性。还公开了高效表达白喉毒素突变体CRM197的表达载体、工程菌及制备方法等。本发明构建的重组白喉毒素突变体CRM197表达工程菌具有表达量高，表达稳定等优点，所采取的纯化工艺稳定可靠，得率高，利于大规模生产。

Description

白喉毒素突变体CRM197的制备方法

技术领域

本发明涉及一种免疫蛋白载体的制备，具体涉及一种白喉毒素突变体CRM197的制备方法，属于生物医药领域。

背景技术

白喉毒素(diphtheria toxin,DT)是白喉杆菌β噬菌体溶源化后，由β噬菌体tox基因编码合成的外毒素。DT分子全长533aa，分子量为58330D，Cys186与Cys201形成二硫键，其间的柄状环TL1(187-200aa)富含Arg，易被胰蛋白酶切开，使DT成为由二硫键连接的A片段(1-193aa)与B片段(194-533aa)。白喉毒素通过诱导把细胞凋亡而杀灭细胞，其步骤如下：(1)DT的细胞膜受体结合区(receptor binding domain,R区)与细胞膜受体结合后，引导细胞内吞，DT及受体包裹入内吞泡中，进而形成溶酶体小泡。(2)在酸性环境的溶酶体小泡中，T区变构，TH8(326-347aa)与TH9(358-376aa)形成发夹结构***溶酶体小泡的膜中，进而形成通道，协助N端的酶活性区(catalytic domain,1-193aa)穿过膜，进入胞浆。(3)在进入还原性环境的胞浆时，随着二硫键的打开，TL1环缺口的存在使DT分离成A、B两片段。(4)胞浆中的底物NAD+进入DT活性位点缝隙(34-52aa),随后游离的酶活性A片段与核糖体结合，将ADP-核糖基转移到真核细胞蛋白合成延伸因子FF2的Diphthamide-His699上，使之失活。(5)靶向蛋白合成受阻，细胞凋亡。

CRM197(cross-reacting materials197)是20世纪70年代早期从白喉杆菌毒性基因突变株的菌株中获得的，是白喉毒素突变体中的一种。由于错义突变，白喉毒素抗原结合片段中52位点上的甘氨酸变成谷氨酸，致使白喉毒素酶活性位点发生改变，CRM197的A片段不能与EF2结合，从而不能对细胞起到毒性作用，但免疫原性与白喉毒素几乎没有差别。它们均可以与细胞膜上特定的白喉毒素受体(diphtheria toxin receptor，DTR)即肝素结合表皮生长因子的膜结合前体(pro heparin-binding epidermal growth factor，pro HB-EGF)结合，因此，CRM197常作为一种免疫蛋白载体，在国内外得到广泛关注。早在20世纪80年代中期，CRMl97就作为载体蛋白应用于疫苗的接种，在对人体的治疗中有很长的安全历史(Anderson P,Pichichero ME,et al.Immunogens consisting of oligosaccharidesfrom the capsule of Haemophilus influenzae type b coupled to diphtheriatoxoid or the toxin protein CRM197.J Clin Invest.1985;76(1):52-9.)。美国科学家针对小儿在2岁前对于肺炎球菌疫苗不能产生免疫记忆，因此，将球菌表面七价多糖交联于多种蛋白载体以便小儿在2岁前能对肺炎球菌产生抗体，经过多种蛋白载体交联后的动物及临床效果比较，发现PnPs-CRM197能产生较好的免疫效果，且安全无毒副作用(Black S,Shinefield H,et al.Efficacy,safety and immunogenicity of heptavalentpneumococcal conjugate vaccine in children.Northern California KaiserPermanente Vaccine Study Center Group.Pediatr Infect Dis J.2000;19(3):187-95.)。目前该产品也通过美国FDA批准上市，商品名为Prevnar。我国科学家李模孝等针对消化道肿瘤细胞能合成和分泌胃泌素，并表达相应的受体的特性，将胃泌素G17分子与CRM197交联而得G17CRM197，其动物免疫实验表明，G17CRM197能够刺激机体产生高滴度抗胃泌素抗体(参见专利CN101050236A)。

基于CRM197的作用，关于CRM197的制备也是药物研究的热点。迄今为止工业制备CRM197所用宿主主要是白喉杆菌(如专利号US4925792、专利号EP0616034)，但是白喉杆菌发酵条件苛刻，并且培养基成分复杂、价格昂贵，不利于大规模工业生产。

因此，需要开发一种廉价、高效的CRM197表达体系。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效表达人白喉毒素突变体CRM197白喉毒素突变体CRM197的方法、表达载体和宿主细胞。

在本发明第一方面中，提供了一种用于编码白喉毒素突变体CRM197的核苷酸序列，所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；而且所述核苷酸序列与SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列有≥95%相同性。

在另一优选例中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在另一优选例中，所述核苷酸为DNA。

在本发明第二方面中，提供了一种表达载体，它含有本发明第一方面所述的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述表达载体用于重组表达白喉毒素突变体CRM197。

在另一优选例中，所述表达载体为原核表达载体。

在另一优选例中，所述表达载体为pET41a。

在本发明第三方面中，提供了一种宿主细胞，它含有本发明第二方面所述的表达载体。

在另一优选例中，所述宿主细胞为大肠杆菌。

在另一优选例中，所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。

在本发明第四方面中，提供了一种重组白喉毒素突变体CRM197的制备方法，包括步骤：

(a)培养如本发明第三方面所述的宿主细胞，至OD₆₀₀值为25-45(优选35-45)；

(b)诱导培养步骤(a)的宿主细胞，从而表达重组白喉毒素突变体CRM197；

(c)分离出表达的重组白喉毒素突变体CRM197。

在另一优选例中，所述的诱导为经IPTG诱导。

在另一优选例中，所述宿主细胞为大肠杆菌；优选为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。

在另一优选例中，白喉毒素突变体CRM197在宿主细胞中的表达量占总蛋白的30%以上。

在另一优选例中，在步骤(a)中，使用初始培养基培养所述宿主细胞；

所述初始培养基含有：0.0014-0.5g/L微量元素、1-5g/L酵母浸出粉、10-25g/L葡萄糖；并且

在培养过程中补充如下养料：10-50wt%甘油，5-10wt%酵母浸出物和10-16wt%蛋白胨。

在另一优选例中，在步骤(b)中，所述白喉毒素突变体CRM197以包涵体形式表达；且在步骤(c)中，还包括如下步骤：包涵体的提取、洗涤、溶解、变性和复性、以及纯化。

在另一优选例中，所述的纯化包括：阴离子交换柱纯化、分子筛柱纯化、或其组合。

在另一优选例中，进行阴离子交换柱层析时，洗脱液pH为7.0-10.0；较佳地，洗脱液pH为8.0。

在另一优选例中，进行阴离子交换柱层析时，洗脱剂包含Tris-HCl和NaCl。

在另一优选例中，进行阴离子交换柱层析时，洗脱剂包含20mM Tris-HCl和1MNaCl。

在另一优选例中，进行阴离子交换柱层析时，所用的阴离子交换介质为Source30Q(GE Healthcare)。

在另一优选例中，进行分子筛柱层析时，填料为Superdex200(GE Healthcare)；和/或洗脱剂为pH7.0，10mM PBS缓冲液。

在另一优选例中，所述复性条件包括：

(1)复性时间为12-60小时；和/或

(2)复性时蛋白浓度为100-500ug/ml。

在另一优选例中，所述复性液包含：Tris-HCl,NaCl,GSH,GSSG。

在另一优选例中，所述复性液包含：20mM Tris-HCl,0.1M NaCl,1mM GSH,0.5mMGSSG。

在另一优选例中，复性时间为24-48小时。

在另一优选例中，复性时蛋白浓度为100－200ug/ml。

在本发明第五方面中，提供了一种重组白喉毒素突变体CRM197包涵体的制备方法，包括步骤：

(i)培养如本发明第三方面所述的宿主细胞，至OD₆₀₀值为25-45(优选35-45)；

(ii)诱导培养步骤(i)的宿主细胞，从而得到重组白喉毒素突变体CRM197的包涵体。

在另一优选例中，所述的诱导为经IPTG诱导。

在另一优选例中，在步骤(i)中，使用初始培养基培养所述宿主细胞；所述初始培养基含有：0.0014-0.5g/L微量元素、1-5g/L酵母浸出粉、10-25g/L葡萄糖。

在另一优选例中，在培养过程中补充如下养料：10-50wt%甘油，5-10wt%酵母浸出物和10-16wt%蛋白胨。

在另一优选例中，在步骤(ii)中，还包括如下步骤：包涵体的提取和/或洗涤。

在本发明第六方面中，提供了一种白喉毒素突变体CRM197的包涵体，所述的包涵体是本发明第五方面所述的制备方法获得。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了pET41a-CRM197质粒结构图。

图2显示了优化后的克隆的CRM197的DNA片段电泳分析图；

泳道M：标准分子量；

泳道1：含未优化DNA序列BL21(DE3)中CRM197的表达量；

泳道2：含有优化DNA序列的BL21(DE3)中CRM197的表达量。

图3显示了优化前后白喉毒素突变体CRM197诱导表达全菌蛋白图，其中，

泳道M：标准分子量；

泳道1：优化前白喉毒素突变体CRM197IPTG诱导前表达全菌蛋白图；

泳道2：优化前白喉毒素突变体CRM197IPTG诱导后表达全菌蛋白图；

泳道3：优化后白喉毒素突变体CRM197IPTG诱导前表达全菌蛋白图；

泳道4：优化后白喉毒素突变体CRM197IPTG诱导后表达全菌蛋白图；

可见，优化前目的蛋白基本无表达，优化后并经IPTG诱导后目的蛋白在全菌蛋白中含量约为30%。

图4显示了原核表达工程菌BL21(DE3)/pET41a-CRM197发酵生长曲线。

图5显示了纯化后电泳分析纯化结果，目的蛋白纯度约为95%，分子量为道尔顿。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，发现白喉毒素突变体CRM197用常规技术无法成功表达，其主要原因之一是天然基因序列未经合理的优化。发明人对现有的CRM197基因序列进行了针对性优化设计，构建了CRM197的重组表达载体，将优化后的CRM197编码序列(如SEQ ID NO:2)转入合适的宿主细胞(如大肠杆菌)以包涵体形式表达，目的蛋白CRM197表达量高(在全菌蛋白中占30%以上)，且易于纯化，回收率高，适合于大规模工业化生产。在此基础上，发明人完成了本发明。

序列优化

在本发明中，提供了优化的、特别适合在大肠杆菌中表达的CRM197的编码序列。

如本文所用，所述“优化编码序列”、“优化编码基因”均指一种用于编码白喉毒素突变体CRM197的核苷酸序列，所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；且所述核苷酸序列与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列有≥95%相同性。

优选地，本发明还提供了一种用于编码白喉毒素突变体CRM197的核苷酸序列，所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；且所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在另一优选例中，所述核苷酸为DNA。

CRM197优化编码序列的设计合成可依据OptimumGene^TM算法，优化了影响基因表达的序列片段，这些序列片段包括但不限于，密码子使用偏好性，GC含量，CpG二核苷酸含量，mRNA的二级结构，隐蔽剪接位点，早期多聚腺苷化位点，内部核糖体进入位点和结合位点，负CpG岛，RNA不稳定区，重复序列(直接重复、反向重复等)和可能影响克隆的限制性位点。

表达载体和宿主细胞

本发明还提供了一种用于重组表达白喉毒素突变体CRM197的表达载体，它含有本发明的优化编码序列。

优选地，所述表达载体为原核表达载体。白喉毒素突变体CRM197的长度符合原核表达的适用长度范围，并且没有跨膜区，适宜于原核表达。

许多表达载体可应用CRM197的原核表达，包括pET系列载体。优选pET41a作为表达载体。更优选pET41a(+)作为表达载体。所述pET41a(+)质粒可包含质粒复制起始子ori，卡那霉素抗性基因Kan，lacI序列，组氨酸标签序列，多克隆酶切位点MCS，S标签序列和GST标签等序列。

本发明还提供了一种宿主细胞，它含有用于重组表达白喉毒素突变体CRM197的表达载体。

优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌，以提高CRM197的表达量。许多大肠杆菌表达菌株可应用CRM197的原核表达，如BL21(DE3)、BE21Rosetta(DE3)、BL21(DE3)pLysS等。本发明优选BL21(DE3)作为表达菌株。BL21(DE3)可高效表达含有噬菌体T7启动子的非毒性蛋白，T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体的DE3区，该区整合于BL21的染色体上。

制备方法

本发明提供了一种优选的白喉毒素突变体CRM197的制备方法，具体包括步骤：

(1)扩增白喉毒素突变体CRM197的优化编码基因：

通过化学合成方法，根据本发明的优化编码基因，设计合成引物，并在上游引物和下游引物分别引入酶切位点(如NdeI和XhoI)，经PCR扩增，得到优化后的CRM197的编码序列(即优化编码序列)。

(2)构建白喉毒素突变体CRM197的重组表达质粒：

将CRM197的优化编码序列与表达载体序列进行酶切、纯化、连接、转化；筛选及鉴定含目的基因的阳性重组质粒。

白喉毒素突变体CRM197的长度符合原核表达的适用长度范围，并且没有跨膜区，适宜于原核表达。许多表达载体可应用CRM197的原核表达，包括pET系列载体。本发明优选用pET41a(+)作为表达载体。pET41a(+)质粒包含质粒复制起始子ori，卡那霉素抗性基因Kan，lacI序列，组氨酸标签序列，多克隆酶切位点MCS，S标签序列和GST标签等序列。

(3)构建白喉毒素突变体CRM197的高表达工程菌：

将步骤(2)中鉴定正确的阳性重组质粒转化至宿主细胞(如大肠杆菌)中表达，进行筛选、鉴定及表达，具体包括目的蛋白的诱导表达、目的蛋白聚丙烯酰胺SDS-PAGE电泳分析；将表达目的蛋白的菌株进行测序鉴定重组质粒的正确性。

许多大肠杆菌表达菌株可用CRM197的原核表达，如BL21(DE3)、BE21Rosetta(DE3)、BL21(DE3)pLysS等。本发明优选用BL21(DE3)作为表达菌株，BL21(DE3)可高效表达含有噬菌体T7启动子的非毒性蛋白，T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体的DE3区，该区整合于BL21的染色体上。

(4)白喉毒素突变体CRM197的发酵：

针对步骤(3)已筛选出的原核高表达工程菌，通过对培养基的优化、发酵参数的优化、补料方案的选择，建立一套完整合适的高密度发酵工艺，使最终发酵的工程菌中CRM197表达量可占总蛋白的30%以上，发酵终产物中目的蛋白CRM197以包涵体的形式存在。

发酵工艺研究的目的是建立一套完整合适的发酵工艺，基本思想是在终产物产率、操作的简便性和投入的经济性之间寻求最合适方案，其中终产物的产率是考虑的首要因素。本发明研究了分批补料发酵技术生产治疗性蛋白结合疫苗组分白喉毒素突变体CRM197发酵基本培养基和过程中培养基补充等问题。

基本培养基优选大肠杆菌培养基，其包括四类营养成分：氮源物质(主要是氨基酸和蛋白质类)；碳水化合物(主要是糖类和甘油等)；无机盐类(包括各种所需盐类和微量元素)；维生素类。

工程菌优选在M9CA培养基中生长迅速，表达量高，且考虑到M9CA具有缓冲能力，有利于细菌发酵时pH值的稳定控制，故本实验选择M9CA作为培养基，其包括葡萄糖、酵母浸出粉、多种盐类及不同的微量元素配方。

优选的培养基配方如下：

(5)白喉毒素突变体CRM197的纯化：

优选包括包涵体的提取、洗涤、变复性、阴离子交换柱以及分子筛柱纯化，经聚丙烯酰胺SDS-PAGE电泳分析显示目的蛋白的纯度可以达到95%以上。

步骤(5)中所述的阴离子交换柱为Source30Q阴离子交换层析柱，分子筛为Superdex200凝胶层析柱。

与现有技术相比，本发明主要具有如下优点：

1.提供了一种新型的经优化的白喉毒素突变体CRM197基因，该基因非常适合大肠杆菌表达，具有高表达、高分泌、高稳定的优点。

2.含有优化的白喉毒素突变体CRM197基因的大肠杆菌中，CMR197表达量高，在全菌蛋白中占30%以上，且易于纯化，纯度达到90%以上，目的蛋白回收率高，非常适合大规模发酵生产。

3.还提供了一种制备白喉毒素突变体CRM197的方法，该方法工艺简单，操作性强，制备成本低，适宜于工业化制备。

下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1原核高表达工程菌BL21(DE3)/pET41a-CRM197的构建与筛选

发明人对天然的人白喉毒素突变体CRM197的DNA编码序列(如SEQ ID NO.:3所示)进行改进，得到如SEQ ID NO.:2所示的优化DNA编码序列。

具体地，该人白喉毒素突变体CRM197的优化DNA编码序列可通过如下实施例得。

1.1优化DNA序列的扩增

根据SEQ ID NO.:2所示的人白喉毒素突变体CRM197的优化DNA编码序列(作为目的优化序列)，通过常规的化学合成方法合成该优化序列，在上游引物和下游引物分别引入NdeI酶切位点(CATATG)和XhoI酶切位点(CTCGAG)，经PCR扩增，得到优化后编码CRM197的DNA序列。

上游引物：

5'-CTTTAAGAAGGAGATATACATATGGGCGCAGACGATGTTGTTGACTCTTCTAAATCCTT-3'(SEQID NO.:4)

下游引物：

5'-TCAATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTATTAGGATTTGATTTCGA-3'(SEQID NO.:5)

扩增条件如下：

循环数：22个循环

实验结果：

人白喉毒素突变体CRM197序列包含535个氨基酸，包含终止码的核苷酸序列全长为1611bp。PCR扩增的人CRM197基因片段克隆入pUC57载体后测序鉴定。测序的结果显示得到的DNA序列和目的优化序列完全一致，氨基酸序列与GeneBank收录的序列完全一致(GenBank ID: AAA32182.1)。

1.2质粒的构建和筛选

将步骤(1.1)扩增的CRM197的DNA编码序列以NdeI和XhoI双酶切，并***用NdeI和XhoI酶切的pET41a(+)载体，构建成pET41a(+)-CRM197质粒。

建立如下双酶切体系：

Nde I 1μL

Xho I 1μL

10x酶切缓冲液 5μL

DNA(扩增产物或pET41a(+)载体) 1μg

dd H2O 补足至50μL

此体系于37°C水浴中反应2小时。反应产物分别由AxyPrep PCR清洁试剂盒和AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行纯化回收。

建立如下连接反应体系：

T4DNA连接酶 1μL

10x DNA连接酶缓冲液 1μL

CRM197优化序列酶切产物 0.3pmol

pET41a(+)载体酶切产物 0.03pmol

dd H2O 补足至20μL

此体系于16°C水浴中反应过夜，反应产物用于后续转化反应。

实验结果：经测序证实连接反应的产物序列是正确的。pET41a(+)-CRM197质粒的结构图谱如图1所示。

1.3原核高表达工程菌的构建与筛选

在步骤(1.2)中得到序列正确表达的质粒，将该质粒转化到BL21(DE3)中。

建立如下转化体系：

5μL连接反应产物

100μL BL21(DE3)表达工程菌

于冰上孵育1小时，于45°C热激42秒，于冰上孵育5分钟后加入900μL无抗生素的LB培养基，于37°C摇床培养45分钟后离心，弃850μL上清，将细胞悬浮后，铺于预热至室温的含卡那霉素的LB固体培养基上，37°C培养过夜。

实验结果：含pET41a(+)-CRM197的BL21(DE3)单菌落大量长于含卡那霉素的LB固体培养基上。与未优化DNA序列(即如SEQ ID NO.:3所示的天然序列)相比，含有优化DNA序列(如SEQ ID NO.:2所示)的BL21(DE3)中，CRM197的表达量显著提高，见图2。

实施例2高表达原核工程菌BL21(DE3)/pET41a-CRM197的大规模培养

经研究表明，工程菌在M9CA培养基中生长迅速，表达量高，且考虑到M9CA具有缓冲能力，有利于细菌发酵时pH值的稳定控制，故本实验选择M9CA作为培养基，其包括葡萄糖、酵母浸出粉、多种盐类及不同的微量元素配方。

优选的培养基配方如下：

以此培养基作为扩增培养基，在37℃进行培养。

待发酵8小时，以50%体积甘油和2*YT作为补料液开始补料，补料速度维持在1ml/min，当发酵至13小时，通常OD₆₀₀在25-45之间，开始加入IPTG至终浓度1mM诱导表达，细菌发酵生长曲线见图4。

按生长菌种必须经过扩增，由于种子液的扩增无需工程菌表达白喉毒素突变体CRM197，因此我们要尽可能地增加细菌的扩增量。将种子液以10%比例接种入M9CA培养基中，在摇床中发酵5hr后，使其OD₆₀₀达到1.5-2.5后，接入至发酵罐中。

讨论：

2.1pH值的波动对白喉毒素突变体CRM197的表达产生明显的影响，当pH值在6.5-7.4之间时白喉毒素突变体CRM197表达基本不受影响。本实施例选用pH为7.0。

2.2溶氧是一个对细菌生长影响极大的参数。在发酵罐培养中溶氧主要受到三个因素的控制，即转速、通气量和罐压，加大任何一项都可使溶氧值增加。一般大肠杆菌的培养，溶氧值通常设定在30-80%之间。本实施例选用溶氧值大于30%。溶氧值小于30%时，细菌生长周期将延长。故将转速、通气量与溶氧控制级联(最高转速不得大于800rpm)，而通气量最少定为2L/min，罐压定为6PSI，以保证溶氧控制在30%以上。

2.3在发酵过程中，工程菌BL21(DE3)/pET41a-CRM197细菌在37℃培养后，加入IPTG进行诱导。在诱导的开始阶段，表达产物随着诱导的时间延长而不断增加，但随着诱导时间的延长，其表达量不再增加，有时反而因为外源性重组蛋白在细菌内的酶解作用而下降。因此在工艺研究过程中，观察热诱导后2h，3h，4h，白喉毒素突变体CRM197表达量的变化。结果表明，细菌在诱导2h后CRM197即有明显的表达，4h达最高峰，因此，本实施例选用4h作为发酵诱导表达时间。

结果如图3所示，序列优化前，不管是否经IPTG诱导,目的蛋白均基本无表达；序列优化后并经IPTG诱导后，目的蛋白在全菌蛋白中含量约为30%。

实施例3重组白喉毒素突变体CRM197的包涵体的溶解与复性

实验方法：

将发酵离心后收获的包涵体先用1%的Triton X-100洗涤1hr后，离心收获包涵体，按照1:19的比例溶解包涵体于6M Gua-HCl(盐酸胍)20mM TrisHCl,1mM EDTA,10mM DTT中，接着按1:4用8M尿素，20mM TrisHCl，0.1M NaCl，1mM EDTA,10mM DTT稀释，最后按1:9缓慢加入复性液20mM TrisHCl,0.1M NaCl,1mMGSH,0.5mM GSSG,pH8.0。在低温下放置12-60小时使其复性。

实验结果：获得自然状态下复性良好的重组CRM197。

讨论：

包涵体的分离与溶解是原核重组表达蛋白制备中的一个重要步骤。原核表达***因为缺乏蛋白质折叠所需的环境，表达产物结构与天然蛋白明显不同，许多蛋白质常以不溶性包涵体形式存在，并绝大多数无生物学活性。包涵体作为原核表达产物的一种主要存在形式，为目的蛋白的富集及后续的分离纯化提供了十分便利的条件。

本发明中，高表达的CRM197是以不溶性的包涵体形式存在，经高压破菌(1000psi)后，经离心，收集沉淀，即为包涵体。

用含低浓度去垢剂如尿素，盐酸胍或表面活性剂的缓冲液洗涤，洗涤目的是在保证靶蛋白基本不损失的情况下，去除部分菌体蛋白和杂质，简化后面的纯化步骤，本实施例比较了2M的尿素和Triton X-100的洗涤效果，Triton-X100洗涤效果更好，因此，选择Triton-X100洗涤包涵体。

由于包涵体是变性的CRM197的聚合体，因此必须采用变性剂如高浓度的尿素或盐酸胍溶解，本实施例采用6M盐酸胍的Tris缓冲液(pH=8.0)溶解包涵体，用8M尿素的Tris缓冲液(pH=8.0)稀释溶解液使蛋白浓度降到合理的范围有利于复性。

使变性的包涵体复性为有功能活性的靶蛋白，必须降低或去除高浓度尿素，目前较常用的去除方法有稀释和透析两种，后者因不易控制内毒素等的污染，且在大规模制备中不易操作，而前者相对简单，因此本实验用稀释法降低尿素浓度，选用pH=8.020mMTris缓冲液(含0.1M NaCl、1mmGSH/0.5mMGSSG)作为复性液。

将CRM197复性浓度控制在100-500ug/ml范围比较合适，尤以100ug/ml左右最佳。

复性的时间对正确复性也有明显的影响，太短时间复性不完全，复性后的蛋白不稳定，最后选择复性时间控制在12-60小时合适，以24-48小时左右为最佳。

实施例4采用阴离子交换层析Source30Q从复性液中初步分离CRM197

实验方法：

将实施例3中复性好的CRM197用10kD的超滤膜超滤换液10倍体积的10mM TrisHClpH8.0,直至蛋白溶液电导小于2us/cm，将超滤换液后的CRM197蛋白溶液上样至已经用20mMTrisHCl pH8.0平衡的Source30Q阴离子交换柱上，线性增加20mM TrisHCl1M NaCl pH8.0的浓度直至100%，收集最大的洗脱组分即为CRM197。

实验结果：

通过Source30Q进行了CRM197的初步捕获和洗脱，纯化可以达到75%-85%左右。

讨论：

生物分子根据它们自身的特殊性质不同，可以通过色谱的方法纯化，离子交换(IEX)就是根据生物分子表面净电荷的不同而将其分离。由于CRM197的等电点为5.85，因此在pH8.0的Tris/HCl缓冲液中带负电荷而被阴离子交换介质所吸附，通过比较选择Source15Q，Source30Q，DEAE，QHP等不同阴离子介质，发现Source30Q的选择性和吸附性最佳，因此选择其为初步纯化用填料。

经过观察，发现选用不同pH值缓冲液进行阴离子交换时，会对CRM197的最终得率产生较大的影响。pH值过低，可能导致蛋白质在填料上吸附过弱，pH值过高，可能会使目的蛋白离子交换填料上吸附力变强。

通过比较，本实验选用pH8.020mM Tris/HCl1M的NaCl梯度混合20mM Tris/HCl线性洗脱可将CRM197洗下。

实施例5采用凝胶过滤层析Superdex200精细纯化CRM197

实验方法：将Source30Q纯化捕获的CRM197蛋白继续上柱已经用10mM PBS,10mMMgCl2平衡过的Superdex200柱，2ml/min进行柱洗脱，CRM197蛋白约在250ml-300ml洗脱体积处出峰。

实验结果：获得纯度>90%的CRM197蛋白。

讨论：

凝胶过滤层析主要是根据生物分子大小进行纯化分离，不像离子交换或者亲和层析，分子不与层析介质结合，其原理为生物大分子不进入介质孔径内，而小分子进入因此其停留时间更长。通过该方法可以将Source30Q纯化后的收集物按照分子大小的不同进行精细纯化，去除与CRM197分子量相差较大的不同分子，以达到更高的纯度。

通过对不同的凝胶过滤层析介质Sephacryl和Superdex的筛选发现，Superdex200具有更高的分辨率，且其分离获得的蛋白纯度更佳，因此选择其为CRM197精细纯化的介质。

结果表明：经过以上各步分离后的CRM197样品，经用银染电泳鉴定示其纯度在90％以上，如图5所示。目的蛋白CRM197表达量高(在全菌蛋白中占30%以上)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种用于编码白喉毒素突变体CRM197的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；而且所述核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.如权利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列为DNA序列。

3.一种表达载体，其特征在于，它含有如权利要求1或2所述的核苷酸序列。

4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为原核表达载体。

5.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pET41a。

6.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求3所述的表达载体。

7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。

8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。

9.一种重组白喉毒素突变体CRM197的制备方法，其特征在于，包括步骤：

(a)培养如权利要求6所述的宿主细胞，至OD₆₀₀值为25-45；

(c)分离出表达的重组白喉毒素突变体CRM197。

10.如权利要求9所述的制备方法，所述的白喉毒素突变体CRM197在宿主细胞中的表达量占总蛋白的30％以上。

11.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，在步骤(a)中，使用初始培养基培养所述宿主细胞；所述初始培养基含有：0.0014-0.5g/L微量元素、1-5g/L酵母浸出粉、10-25g/L葡萄糖；并且

在培养过程中补充如下养料：10-50wt％甘油，5-10wt％酵母浸出物和10-16wt％蛋白胨。

12.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，

在步骤(b)中，所述白喉毒素突变体CRM197以包涵体形式表达；且

在步骤(c)中，还包括如下步骤：包涵体的提取、洗涤、溶解、变性和复性、以及纯化。

13.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述的纯化包括：阴离子交换柱纯化、分子筛柱纯化、或其组合。

14.如权利要求13所述的制备方法，其特征在于，进行分子筛柱层析时，填料为Superdex 200；和/或洗脱剂为pH 7.0，10mM PBS缓冲液。

15.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述复性的条件包括：

(1)复性时间为12-60小时；和/或

(2)复性时蛋白浓度为100-500μg/ml。

16.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述复性的复性液包含：Tris-HCl,NaCl,GSH,GSSG。

17.一种重组白喉毒素突变体CRM197包涵体的制备方法，其特征在于，包括步骤：

(i)培养如权利要求6所述的宿主细胞，至OD₆₀₀值为25-45；

18.如权利要求17所述的制备方法,其特征在于，在步骤(i)中，使用初始培养基培养所述宿主细胞；所述初始培养基含有：0.0014-0.5g/L微量元素、1-5g/L酵母浸出粉、和10-25g/L葡萄糖。

19.一种白喉毒素突变体CRM197的包涵体，其特征在于，所述的包涵体是由权利要求17所述的制备方法制备获得的。