DE69034075T2

DE69034075T2 - Rekombinantes poxvirus und streptokokken enthaltend ein m-protein

Info

Publication number: DE69034075T2
Application number: DE69034075T
Authority: DE
Inventors: A. Vincent FISCHETTI; E. Dennis HRUBY
Original assignee: Rockefeller University
Current assignee: Rockefeller University
Priority date: 1989-06-21
Filing date: 1990-06-21
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2010-06-22
Also published as: WO1990015872A1; ATE240396T1; EP0437604A1; JPH03504336A; CA2035039C; AU6307494A; AU5948490A; CA2035039A1; AU682344B2; ES2199932T3; DK0437604T3; AU2855397A; EP0437604A4; US5985654A; EP0437604B1; JP2577280B2; DE69034075D1

Description

Diese Erfindung betrifft Viren, so wie Vacciniaviren und Geflügelpockenviren, die so modifiziert sind, daß sie die DNA-Sequenz (das Gen) enthalten, welche in einem Säugetier, einschließlich Menschen, bewirkt, daß ein Protein exprimiert wird, welches der konservierten, exponierten Region des M6-Proteins entspricht. Sie betrifft ebenso die Verwendung solch modifizierter Produkte als Vaccine, um gegen Streptokokkeninfektion zu schützen. Weiterhin betrifft sie Plasmide oder andere Vektoren, die dieses Gen tragen.
Verwandte Anmeldungen
Diese Anmeldung ist eine Teilanmeldung der U.S.-Anmeldung, Seriennummer 07/369,118, eingereicht am 21. Juni 1989. Ebenfalls wird die gleichzeitig eingereichte Anmeldung von Fischetti erwähnt, Anmeldeseriennummer ............... eingereicht ............ 1990 (Anwalt Docket Nr. 18106B), welche eine Teilanmeldung der Anmeldung mit der Seriennummer 07/315,588, eingereicht am 27. Februar 1989, ist, welche wiederum eine Teilanmeldung der Anmeldung mit der Seriennummer 173,380, eingereicht am 25. März 1988, ist, wobei auf jede von denen hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird.
Hintergrund der Erfindung
Ungefähr 30 Millionen Fälle von Gruppe A-Streptokokkeninfektionen treten jedes Jahr in den Vereinigten Staaten auf, von denen die am häufigsten auftretende eine akute Streptokokkenpharyngitis ist, welche vorwiegend bei Kindern des Schulalters gefunden wird. Bis zu 5% der Pharyngitisfälle, welche unbehandelt geblieben sind, oder welche nicht effektiv behandelt wurden, können zu akutem rheumatischen Fieber führen, eine Krankheit, welche schließlich in Herzschäden resultieren kann. Während dies nicht ein Hauptproblem in den Vereinigten Staaten ist, sind diese Streptokokken-Folgeerkrankungen ein signifikantes Problem in den Entwicklungsnationen der Welt. Beispielsweise wurde geschätzt, daß annähernd 6 Millionen Kinder des Schulalters in Indien an rheumatischen Herzkrankheiten leiden.
Das M-Protein der Gruppe A-Streptokokken ist ein faserförmiges Dimer aus Helices, die in einem coiled coil angeordnet sind, welches sich bis zu etwa 50 nm von der Oberfläche dieser Organismen erstreckt. Es ist ein fibrilläres Molekül, von denen mehr als 80 serologische M-Typen existieren. Das Protein läßt den Streptokokkus resistent gegenüber nicht-immuno-Phagozytose sein. Es ist der Hauptvirulenzfaktor von streptokokkalen Bakterien.
Daher gibt es über 80 unterschiedliche Serotypen von Gruppe A-Streptokokken, so daß ein Vaccin, das auf den typspezifischen Epitopen basiert, nicht praktikabel sein könnte. Im allgemeinen wurde bis jetzt kein befriedigendes Vaccin entwickelt, das Schutz gegen streptokokkale Infektion verleiht, auch wenn signifikante und teure Aufwendungen in dieser Richtung unternommen worden sind.
Es gibt einen starken Antrieb, ein sicheres und effektives Vaccim gegenüber A-Streptokokken zu entwickeln.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wurde nun überraschenderweise herausgefunden, daß ein Polypeptid, das der konservierten exponierten Region des M-Proteins entspricht (hierin manchmal als "M6'-Protein" bezeichnet), eine schützende Immunantwort hervorrufen kann, wenn es einem Säugetier verabreicht wird. Das M6'-Polypeptid kann durch Modifizieren des Genoms eines Virus der Familie der Pockenviren hergestellt werden, so wie das Vaccinia-Orthopockenvirus oder das Geflügelpocken-Avipockenvirus, so daß sie ein genetisch hergestelltes Gen enthalten ("das M6'-Gen"), welches das M6'-Protein exprimiert. Das M6'-Protein kann einem Säugetier verabreicht werden durch Verabreichung eines modifizierten Vacciniavirus oder Geflügelpockenvirus, das das Gen enthält, das für das Protein codiert, an ein Säugetier.
Daher stellt die vorliegende Erfindung ein Protein zur Verfügung, das in der Lage ist, eine Immunschutzantwort gegen streptokokkale Infektion in einem Säugetier hervorzurufen, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz umfaßt, welche gleich oder im wesentlichen gleich der Aminosäurerestsequenz in der konservierten exponierten Region des M6-Proteins ist. Die vorliegende Erfindung stellt ebenso das M6'-Protein zur Verfügung.
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung ein Gen zur Verfügung, das für ein Protein codiert, das in der Lage ist, eine Immunschutzantwort gegenüber streptokokkaler Infektion in einem Säugetier hervorzurufen, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz umfaßt, welche gleich oder im wesentlichen gleich ist, wie die Aminosäurerestsequenz in der konservierten exponierten Region des M6-Proteis. Die vorliegende Erfindung stellt ebenso das M6'-Gen zur Verfügung.
Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung ein Plasmid zur Verfügung, welches ein Gen enthält, das für ein Protein codiert, das in der Lage ist, eine Immunschutzantwort auf streptokokkale Infektion in einem Säugetier hervorzurufen, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz umfaßt, welche gleich oder im wesentlichen gleich ist, wie eine Aminosäurerestsequenz in der konservierten exponierten Region des M6-Proteins. Das codierende Gen kann das M6'-Gen sein.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenso ein Virus zur Verfügung, vorzugsweise aus der Familie der Pockenviren, enthaltend ein Gen, das für ein Protein codiert, das in der Lage ist, eine Immunschutzantwort gegenüber streptokokkaler Infektion in einem Säugetier hervorzurufen, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz umfaßt, welche gleich oder im wesentlichen gleich ist, wie eine Aminosäurerestsequenz in der konservierten exponierten Region des M6-Proteins. Typische Pockenviren beinhalten Vaccinia- oder Geflügelpocken-Viren; das Geflügelpockenvirus ist ein bevorzugter Virus. Das Gen, das das Virus enthalten kann, ist das M6'-Gen.
Allgemeiner stellt die vorliegende Erfindung ein Virus zur Verfügung, das ein Gen enthält, das für ein Oberflächenantigen oder ein Teil davon eines Prokaryonts enthält, wobei das Oberflächenantigen oder der Teil davon verantwortlich für die Virulenz des Prokaryonten ist. Typische Viren beinhalten diejenigen der Familie der Pockenviren, insbesondere Vaccinia und Geflügelpocken; wobei Geflügelpocken ein bevorzugter Virus ist. Das Oberflächenantigen oder der Teil davon kann ein Protein sein, das in der Lage ist, eine Immunschutzantwort in einem Säugetier hervorzurufen, welches eine Aminosäuresequenz umfaßt, welche gleich oder im wesentlichen gleich ist, wie eine Aminosäurerestsequenz in der konservierten exponierten Region des M6-Proteins. Der Prokaryont kann ein Bakterium sein, insbesondere Streptokokken. Das Gen, das das Virus enthalten kann, ist das M6'-Gen.
Ebenso stellt die vorliegende Erfindung ein Vaccin zur Verfügung, welches einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und ein Virus umfaßt, das ein Gen enthält, das für ein Oberflächenantigen oder einen Teil davon eines Prokaryonts codiert, wobei das Oberflächenantigen oder der Teil davon verantwortlich für die Virulenz des Prokaryonts ist; und das Virus in einer ausreichenden Menge für ein ausreichendes Antigen oder einen Teil davon vorhanden ist, um eine schützende Antwort auf eine Infektion hervorzurufen, die durch den Prokaryont verursacht wird. Das Oberflächenantigen oder der Teil davon kann ein Protein sein, das in der Lage ist, eine Immunschutzantwort auf Streptokokkeninfektion in einem Säugetier hervorzurufen, welches eine Aminosäuresequenz umfaßt, welches die gleiche ist, oder im wesentlichen die gleiche ist, wie eine Aminosäurerestsequenz in der konservierten exponierten Region des M6-Proteins; und das Virus ist in einer ausreichenden Menge für ausreichendes Protein vorhanden, um eine Schutzantwort auf eine Streptokokkeninfektion hervorzurufen. Der Prokaryont kann ein Bakterium sein, insbesondere Streptokokken. Wiederum beinhalten typische Viren diejenigen der Familie der Pockenviren, insbesondere Vaccinia und Geflügelpocken; Geflügelpocken sind bevorzugt; und das Gen, das das Virus enthalten kann, ist das M6'-Gen.
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Kontrollieren von prokaryontischer Infektion in einem Säugetier mit Bedarf für solche Kontrolle zur Verfügung, welches die Verabreichung eines Virus, der ein Gen enthält, das für ein Oberflächenantigen oder einen Teil davon eines Prokaryonts codiert, an das Säugetier umfaßt, wobei das Oberflächenantigen oder der Teil davon für die Virulenz des Prokaryonts verantwortlich ist und das Virus in einer ausreichenden Menge für ausreichendes Antigen oder eines Teils davon verabreicht wird, um eine Antikörperantwort auf eine Infektion, die durch das Prokaryont verursacht wird, hervorzurufen. Das Oberflächenantigen oder der Teil davon kann ein Protein sein, das in der Lage ist, eine Immunschutzantwort auf Streptokokkeninfektion in einem Säugetier hervorzurufen, welches eine Aminosäuresequenz umfaßt, welche gleich oder im wesentlichen gleich der Aminosäuresequenz in der konservierten exponierten Region des M6-Proteins ist; das Virus wird in einer ausreichenden Menge verabreicht, damit das Protein eine Antikörperantwort hervorrufen kann, die ausreichend ist, um eine solche Kontrolle zu bewirken. Der Prokaryont kann ein Bakterium sein, insbesondere Streptokokken. Wiederum beinhalten typische Viren diejenigen der Familie der Pockenviren, insbesondere Vaccinia und Geflügelpocken; Geflügelpocken sind bevorzugt; und das Gen, das das Virus enthalten kann, ist das M6'-Gen.
Die vorliegende Erfindung stellt zusätzlich ein Gen zur Verfügung, das für ein Segment eines Oberflächenantigens oder eines Teils davon eines Prokaryonts codiert, wobei das Oberflächenantigen für die Virulenz des Prokaryonts verantwortlich ist; und das Segment des Oberflächenantigens oder des Teils davon in der Lage ist, eine Immunschutzantwort auf die Infektion, die durch den Prokaryont in einem Säugetier verursacht wird, hervorzurufen. Dies ist kein Naturprodukt, da das Codieren ein Segment eines Oberflächenantigens oder einen Teil davon und nicht das gesamte Antigen betrifft.
Ebenso stellt die vorliegende Erfindung einen Plasmid zur Verfügung, das ein Gen enthält, das für ein Segment eines Oberflächenantigens oder eines Teils davon eines Prokaryonts codiert, wobei das Oberflächenantigen für die Virulenz des Prokaryonts verantwortlich ist; und das Codieren des Gens nicht natürlicherweise in dem Plasmid vorhanden ist.
Der Ausdruck "das codierende Gen, das natürlicherweise nicht in dem Plasmid vorhanden ist" wird verwendet, so daß klar ist, daß ein Naturprodukt sich nicht innerhalb des Umfangs dieser Erfindung befindet. Beispielsweise wurde das neue M6'-Gen dieser Erfindung in dem neuen Plasmid pVV3:M6' bei der American Type Culture Collection hinterlegt. Die Hinterlegung bestand aus einer Probe des pVV3:M6'-Plasmids in E. coli unter der Zugangsnummer 68003. Das M6'-Gen ist natürlicherweise nicht in einem Plasmid von E. coli vorhanden; oder "das codierende Gen (das M6'-Gen) ist natürlicherweise nicht in dem Plasmid (von E. coli) vorhanden". Auf gleiche Weise wird der Begriff "Segment eines Oberflächenantigens oder eines Teils davon" verwendet, so daß die Gene und Plasmide innerhalb des Umfanges davon nicht Naturprodukte beinhalten, oder nicht das beinhalten, was bereits bekannt ist, z. B. das M6-Gen oder der Plasmid pVV3:M6.
Auf gleiche Weise stellt die vorliegende Erfindung ein Vaccin zur Verfügung, das einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und ein Virus umfaßt, vorzugsweise aus der Familie der Pockenviren, enthaltend ein Gen, das für ein Protein codiert, das in der Lage ist, eine Immunschutzantwort auf streptokokkale Infektion in einem Säugetier hervorzurufen, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz umfaßt, welche dieselbe oder im wesentlichen dieselbe ist, wie eine Aminosäurerestsequenz in der konservierten exponierten Region des M6-Proteins; und das Virus ist in einer ausreichenden Menge für ausreichendes Protein vorhanden, um eine Schutzantwort gegenüber Streptokokkeninfektion hervorzurufen. Wiederum beinhalten typische Pockenviren Vaccinia und Geflügelpocken; Geflügelpocken sind bevorzugt; und das Gen, das das Virus enthalten kann, ist das M6'-Gen.
Die vorliegende Erfindung stellt zusätzlich ein Verfahren zum Kontrollieren von streptokokkaler Infektion in einem Säugetier zur Verfügung, das einer solchen Kontrolle bedarf, welches die Verabreichung eines Virus aus der Familie der Pockenviren an das Säugetier umfaßt, welches ein Gen enthält, das für Protein codiert, das in der Lage ist, eine Immunoschutzantwort auf streptokokkaler Infektion in einem Säugetier hervorzurufen, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz umfaßt, welche gleich oder im wesentlichen gleich ist, wie die Aminosäuresequenz in der konservierten exponierten Region des M6-Proteins; das Virus wird in einer ausreichenden Menge verabreicht, damit das Protein eine Antikörperantwort hervorrufen kann, die Ausreicht, um eine solche Kontrolle zu bewirken. Wiederum beinhalten typische Pockenviren Vaccinia und Geflügelpocken; Geflügelpocken sind bevorzugt; und das Gen, das das Virus enthalten kann, ist das M6'-Gen.
Der Begriff "die gleiche oder im wesentlichen die gleiche" wird hierin verwendet, um die Sequenz von Aminosäuren in Proteinen in dieser Erfindung zu beschreiben, die die wünschenswerte Aktivität aufweisen, da solche Proteine entweder identisch mit der exponierten konservierten Region des M6-Proteins von Gruppe A-Streptokokken sind oder so ähnlich zu diesem Segment sind, daß sie die gleiche Aktivität haben. Keine nicht angemessene Experimentiertätigkeit ist erforderlich, um Proteine zu bestimmen, welche so ähnlich zu der konservierten exponierten Region des M6-Proteins sind, daß sie die gleiche Aktivität wie diejenigen haben, welche gleich sind, wie die Region. Der Fachmann kann vom Lesen dieser Beschreibung homologe Polypeptide herstellen, die dieselbe Aktivität und im wesentlichen die gleiche Sequenz haben, wie die exponierte konservierte Region des M6-Proteins. Beispielsweise können die Termini verlängert werden, z. B. um einen Anker zur Verfügung zu stellen, der das Protein an ein Bindemittel bindet. Ein Protein mit derselben Aktivität und einem hohen Grad an Homologie mit der konservierten exponierten Region kann einfacher synthetisiert werden oder weniger teuer herzustellen sein, und dieses Protein wird als innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung befindlich angesehen.
Um die Begriffe, die hierin verwendet werden, weiterhin zu verdeutlichen, sind die Proteine der vorliegenden Erfindung nicht das gesamte M-Protein, sondern haben eher die gleiche oder im wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz wie die konservierte, exponierte Region des M6-Proteins der Gruppe A-Streptokokken (oder eines Teils davon). Die Polypeptide dieser Erfindung werden nicht als natürlich auftretend angesehen. Um die Proteine dieser Erfindung zu erhalten, werden Viren genetisch modifiziert, um diese Proteine zu exprimieren. Jedoch, nachdem hierin die konservierte, exponierte Region des M6-Proteins der Gruppe A-Streptokokken und die Verwendbarkeit davon offenbart ist, kann die Synthese der Proteine durch selektive enzymatische oder chemische Spaltung des M-Proteins oder durch Festphasensynthese (siehe Anmeldung von Fischetti, erwähnt unter „Verwandte Anmeldungen") erreicht werden. Die hierin offenbarten Proteine sind keine Naturprodukte, ob sie aus der Genexpression eines modifizierten Virus oder aus anderer Synthese resultieren, da diese Proteine hierin nicht das gesamte M-Protein sind, sondern die gleichen oder im wesentlichen die gleichen sind, wie eine Aminosäuresequenz in nur einem Teil des M-Proteins; wobei der Teil die konservierte exponierte Region des M-Proteins (oder einen Teil davon) umfaßt.
Weiterhin haben die hierin offenbarten Proteine nicht dieselben Charakteristika und dieselbe Verwendbarkeit wie irgendein M-Protein oder ein anderes natürlich auftretendes Protein, da das M-Protein aufgrund der Variabilität der Spezies des M-Proteins aus unterschiedlichen Stämmen von Streptokokken nicht zum Schutz gegen streptokokkale Infektionen verwendet werden kann, während die Proteine hierin verwendet werden können, um Vaccine herzustellen, die Schutz ermöglichen, welcher nicht stammspezifisch ist. Daher sind die hierin offenbarten Proteine keine Naturprodukte, da sie nicht als distinkte Einheiten in der Natur existieren und niemals vorher produziert wurden und da kein Naturprodukt dieselben Eigenschaften hat, wie diese Proteine.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 zeigt die vollständige Aminosäuresequenz des M6-Proteins des Stammes D471 der Gruppe A-Streptokokkenkultur von der Rockefeller University-Sammlung.
2 illustriert ein Modell des vollständigen M6-Proteins vom Stamm D471, wie es auf der Zellwand existiert.
3 und 4 zeigen die Strategie, die verwendet wurde, um die Produkte dieser Erfindung herzustellen.
5 und 6 zeigen die Strukturen des M6'-Proteins und das M6'-Gen.
7 zeigt die Anordnung der bevorzugten Peptide der konservierten Region.
Detaillierte Beschreibung
Es wird aus 2 ersehen werden, daß ein Teil des M-Proteins, der Carboxyterminus, in das Peptidoglykan der Zellwand und in die cytoplasmatische Membran eingebettet ist. Ein Segment des M-Moleküls wird durch das Kohlenhydrat der Zellwand geschützt, welches aus einem Rhamnosegerüst (offener Kreis) und aus N-Acetylglykosaminzweigen (geschlossene Kreise) zusammengesetzt ist. Der distale Aminoterminus des M-Proteins ist nicht-helical. Das meiste des M-Moleküls zwischen dem Kohlenhydratschutz und der nicht-helicalen Region ist auf der Oberfläche des Streptokokkus exponiert.
1 ist die vollständige Aminosäuresequenz eines M-Proteins von einem spezifischen Stamm. M-Proteine von anderen Stämmen werden im allgemeinen dieselben strukturellen Eigenschaften und Konfirmationen haben, aber die Aminosäuresequenzen werden variieren. Die Hauptvariationen treten in Richtung des Aminoterminus auf. Die Moleküle werden mehr und mehr konserviert in Richtung des Carboxyendes. Daher steigt die Homologie innerhalb der M-Moleküle von unterschiedlichen Serotypen progressiv an Orten an, welche näher am Carboxyterminus und proximaler an der Zellwand sind. Die konservierte exponierte Region verläuft etwa von Position 170 bis zu Position 299 und wird im allgemeinen als die Region angesehen, die bei dem Ile bei Position 210 beginnt. Die konservierte exponierte Region befindet sich vorzugsweise zwischen etwa Position 210 und ungefähr Position 298. Als Balance des Moleküls wird die konservierte nichtexponierte Region angesehen. Diese Erfindung betrifft die konservierte exponierte Region des M-Proteinmoleküls.
Es ist die Variabilität am Aminoterminus, welche für die antigene Variation des M-Proteins verantwortlich ist. Typspezifische Antikörper, welche Schutz gegen einen Serotyp ermöglichen, sind nicht wirksam darin, einer Infektion durch andere Serotypen in einem Opsonophagozytose-Assay zu widerstehen. Daher ist es für ein Individuum theoretisch möglich, vielfach mit unterschiedlichen Streptokokkenstämmen infiziert zu werden, und jede Infektion wird fortfahren, bis das Immunsystem Antikörper gegen die typspezifische Nterminale Region des M-Moleküls generiert hat.
Es wird vermutet, daß die C-Repeat-Region des M-Proteins aus hochkonservierten C-Repeat-Blocks besteht, unterbrochen durch Spacer-Sequenzen, welche weniger gut unter den unterschiedlichen Serotypen konserviert sein können (siehe 7). Die hochkonservierten C1- und C2-Repeat-Blocks sind benachbart an der Zellwand angeordnet, d. h. in Typ 6-Streptokokken.
Insbesondere zeigt 7, daß das Aminoende des M-Proteins typspezifisch ist (antigenisch variabel). Sequenzen in Position 298–441 sind im allgemeinen zellverbunden. Innerhalb der konservierten Region tritt die C-Repeat-Region auf, die aus dem C1-Block, Spacer und dem C2-Block besteht. Die nichttypspezifischen Eptiope von M6, welche unter anderen M-Proteinserotypen bis zu variierenden Graden geteilt werden, sind hier angeordnet. Monoklonale und affinitätsaufgereinigte Antipeptidantikörper, welche zu der B-Repeat-Region und der Pepsin-Site des M6-Proteins mappen, werden unter nur 10% bis 17% der mehr als 50 unterschiedlichen Serotypen geteilt. Im Gegensatz dazu werden Antikörper, welche zu der anschließenden C-Repeat-Region mappen, unter etwa 60% bis 70% der Serotypen geteilt. Während Proteine dieser Erfindung sich von dem B5-Repeat-Block durch die C-Repeat-Region und sogar von dem B4-Repeat-Block zu dem Carboxyterminus für breitbasierenden Schutz erstrecken können, ist es bevorzugt, daß das Protein gleich oder im wesentlichen gleich der konservierten exponierten Region ist, welche von etwa Position 170 bis zu Position 299 verläuft, und es ist sogar besonders bevorzugt, daß die Proteine gleich oder im wesentlichen gleich der Region sind, die von etwa Position 235 bis zu Position 299 verläuft; d. h. vollständig innerhalb der hochkonservierten C-Repeat-Region enthalten sind. In der folgenden Diskussion beziehen sich Nummern in Klammern, die auf das Wort Peptid oder Protein oder Polypeptid folgen, so wie "Peptid (240–260)" auf ein Peptid oder Protein oder Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, welche dieselbe oder im wesentlichen dieselbe ist, wie die Sequenz in dem M6-Protein, die sich von der Position der ersten Nummer bis zur Position der zweiten Nummer erstreckt.
Absorptions-Assays mit Antipeptid-Fabs zeigen an, daß ein Klasse I-spezifischer mAb (10B6) zu Peptid (240–260) mappt, während andere Klasse I-spezifischen mAbs (10FS) zu beiden Peptiden (240–260) und Peptid (272–292) mappen. Zusätzlich haben Antipeptidantikörper, die gegen Peptid (240–260) und Peptid (272–292) gerichtet sind, substantielle Immunoreaktivität mit den extrahierten Formen von verschiedenen Klasse II M-Proteinen auf dem Western-Blot, auch wenn Antipeptidantikörper gegen Peptid (248–269) und Peptid (256–277) Klasse I-spezifisch sein können. Daher, innerhalb einer schmalen Region der C-Repeat-Region des M6-Proteins können sich sowohl Klasse I-spezifische als auch geteilte antigene Determinanten befinden. Daher wird ein Vaccin, das aus Antigenen besteht, die der C-Repeat-Region entsprechen, sowohl gegen Klasse I- als auch gegen Klasse II-Streptokokken schützen.
Daher, zusätzlich zu Proteinen, welche gleich oder im wesentlichen gleich sind, wie die Sequenz der konservierten exponierten Region des M6-Proteins, gibt es eine Präferenz für Proteine, welche gleich oder im wesentlichen ähnlich zu der Sequenz der C-Repeat-Region oder zu Teilen davon sind. Ähnlich bevorzugte Proteine beinhalten Polypeptid (216–235), Polypeptid (248–269), Polypeptid (275–284), Polypeptid (240–260), Polypeptid –(256–277) und Polypeptid (272–292) (siehe Anmeldung von Fischetti, erwähnt unter Verwandte Anmeldungen).
Vaccine für die Verwendung zum Schutz gegen streptokokkale Infektion wurden vorher vorgeschlagen. Diese Vaccine wurden hergestellt aus Polypeptiden aus dem hypervariablen Aminoende des Moleküls. Sie genossen einigen Erfolg beim Zurverfügungstellen von typspezifischer Immunität gegen homologe Serotypen. Deren Leistung wurde verbessert durch Inkorporieren von verschiedenen typspezifischen Determinanten in das gleiche multivalente Vaccin. Jedoch, gegeben das enorme Aufgebot an existierenden M-Serotypen, ist dieses kein attraktives Verfahren.
Gruppe A-Streptokokken sind weitverbreitete humane Pathogene, welche für nasopharyngeale Infektionen und Impetigo verantwortlich sind. Es gibt ungefähr 30 Millionen Fälle von Gruppe A-streptokokkalen Infektionen jedes Jahr allein in den Vereinigten Staaten. Trotz der Tatsache, daß streptokokkale Infektion erfolgreich mit Antibiotika behandelt werden kann, verursacht sie in der Zwischenzeit häufig erhebliches Unbehangen und einen Produktivitätsverlust. Ein kleiner Prozentsatz von infizierten Individuen, die mit streptokokkaler Infektion in Verbindung stehen, entwickeln ernsthaftere Krankheiten, so wie rheumatisches Fieber und Glomerulonephritis. In Entwicklungsländern ist rheumatisches Fieber die Hauptursache für Herzkrankheiten unter Kindern. Daher gibt es einen starken Antrieb, ein sicheres und effektives Vaccin gegen Gruppe A-Streptokokken zu entwickeln.
Die Erfahrung zeigt, daß streptokokkale Infektionen, insbesondere Pharangytis, im allgemeinen auf Kinder limitiert sind. Das Auftreten von Infektions-Peaks ist im Alter von 6–8. Erwachsene sind anscheinend resistenter gegen solche Infektionen, vermutlich, da sie eine Immunität aufgebaut haben, welche effektiv gegen die meisten Serotypen ist. Daher könnte eine immunologische Antwort gegen streptokokkale Infektionen vorhanden sein, welche Antikörper produziert, welche Epitope für die meisten, wenn nicht für alle streptokokkale Serotypen produziert. Es wurde herausgefunden, daß solche Epitope in der konservierten Region des M-Proteins vorhanden sind, welche nicht durch deren Nähe zur Zellwand geschützt sind, d. h. in der konservierten exponierten Region des M-Proteins.
Während die Identität der Aminosäuren in dieser Region etwas unter den Serotypen variiert, verläuft sie im allgemeinen von etwa Aminosäure 170 bis zur Position 299 auf dem M-Proteinmolekül, vorzugsweise von Position 210 bis zu 198 oder 299 und sogar mehr bevorzugt von etwa Position 235 bis zu etwa Position 299.
Polypeptide oder Proteine aus dieser Region sind in der Lage, eine schützende Immunantwort hervorzurufen und rufen sie hervor, wenn sie einem Säugetier verabreicht werden, das einen Bedarf für einen Schutz gegen streptokokkale Infektion hat.
Wie bekannt ist, hat der menschliche Körper verschiedene Verfahren, sich gegen Infektionen durch Mikroorganismen zu schützen. Eines ist das adaptive System, in welchem die Immunantwort auf einen eindringenden Organismus in der Produktion von IgG-Antikörpern resultiert, welche durch Ermöglichen der Opsonisierung und Phagocytose funktionieren, die durch Komplement vermittelt wird. Ein anderes ist die Produktion oder Aktivierung von IgA, welches das vorwiegende Immunogloglulin in seromucosen Sekretionen, so wie Speichel, Tracheobronchialsekretionen, Colostrum, Milch- und Genital-Harn-Sekretionen ist. IgG wird ebenso in diesen Sekretionen gefunden, jedoch in geringern Konzentrationen. Sekretions-IgA (sIgA) ist eine dimere Form des IgA, geschützt vor Proteolyse durch den Sekretionsbestandteil. Eine Funktion von IgA ist es, zu vermeiden, daß infektiöse Mikroorganismen sich am mukösen Gewebe anhaften, es kolonisieren und invasieren.
Ein gegenwärtig bevorzugtes Verfahren für die Praxis dieser Empfindung involviert im Prinzip die Stimulation des sekretorischen Immunsystems, insbesondere sIgA durch intranasale oder orale Verabreichung. Es kann eine concomitante Produktion von IgG vorliegen und beides kann zur Immunisierung beitragen. Die Erfindung wird im Prinzip beschrieben werden, wie auf dieses Verfahren angewandt. Die Polypeptide der Erfindung können ebenfalls verwendet werden, um IgA als die prinzipielle Antwort auf die parenterale Verabreichung durch die concomitante Produktion von Niedrigspiegel-IgA zu stimulieren.
Vacciniavirus und Geflügelpockenvirus sind Mitglieder der Familie der Pockenviren. Innerhalb der Familie der Pockenviren befinden der Genus Orthopockenvirus und der Genus Avipockenvirus, inter alia. Es gibt mehr als 20 Viren in der Familie der Pockenviren, einschließlich Viren, die für Blattern, Kuhpocken, Geflügelpocken und menschliche Krankheiten verantwortlich sind.
Geflügelpocken befinden sich im Genus Avipockenvirus, wobei Vaccinia und Blattern im Genus Orthopockenviren angeordnet sind. Der Genus Avipockenvirus beinhaltet ebenso Kanarienpocken, Juncopocken, Taubenpocken, Spatzenpocken, Starpocken und Truthahnpocken. Charakteristika von Pockenviren beinhalten, daß die Virons groß sind, klotzförmig (oder ovoid im Falle des Genus Parapockenvirus), ungefähr 300–450 mal 170–260 nm in der Größe, mit einer externen Hülle, einer Beschichtung von tubulären Strukturen und einer internen Struktur, die aus einem DNA-enthaltenem Kern und einem oder zwei lateralen Körpern besteht. Das Genom besteht aus einem einzigen Molekül dsDNA mit kovalent geschlossenen Enden ("hairpins") mit einer Größe von 130-280 kbp. Die Viren haben mehr als 100 Proteine und verschiedene Enzyme (einschließlich DNA-abhängiger RNA-Polymerase, Guanylmethyltransferase und Poly (A) Polymerase). Initiale Transkription tritt innerhalb des Viruskerns auf, was zu der Synthese von frühen Proteinen führt, von denen einige zur Unbeschichtung von viraler DNA führen, was weitere Transkription und DNA-Replikation erlaubt. Replikation und Aufbau tritt in dem Cytoplasma im Viroplasma auf ("virale Fabriken") und Virions werden freigesetzt durch Knospung (extrazelluläre eingehüllte Virions) oder durch Zellzerstörung (intrazelluläre eingehüllte Virions). Es gibt ein gewöhnliches Pockenvirusgruppenantigen (Nucleoproteinantigen) und Viren, die Mitglied des Genus Orthopockenviren sind, produzieren ein Nichtvirion-Hemagglutinin.
Diese Erfindung wird prinzipiell beschrieben werden, da sie sich auf Vaccinia und Geflügelpocken als Vektor für das Gen beziehen, das die konservierte, exponierte Region des M-Proteins exprimiert, aber andere Vektoren (Viren, insbesondere Mitglieder der Pockenviren) können ebenso verwendet werden. Auf ähnliche Art und Weise können andere Gene für Antigene von Prokaryonten verwendet werden, welche verantwortlich für die Virulenz der Prokaryonten sind. Geflügelpocken ist ein bevorzugter Vektor, da etwa 1 in 100.000 Personen, die Vaccinia ausgesetzt sind, eine nachteilige Reaktion zeigen (z. B. Encephalitis), während keine solche Reaktion bekannt ist, die von der Aussetzung gegenüber Geflügelpocken resultiert. Zusätzlich ist der natürliche Wirtsbereich des Geflügelpockenvirus auf Vogelarten limitiert (siehe Taylor et al, "Protective immunity against avian influenca induced by fowlpox virus recombinant", Vaccine, Band 6, Dezember 1988, Seite 504, worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird). Der Geflügelpockenstamm, der hierin FP-1 genannt wird, ist ein Duvette-Stamm, modifiziert, um als ein Vaccin in tagealten Hühnern verwendet zu werden; der Stamm ist ein kommerzieller Stamm, der als 0 DCEP 25/CE67/2309 Oktober 1980 bezeichnet wird, und ist erhältlich vom Institut Merieux, Inc.
Vaccinia und Geflügelpocken sind eukaryontische Viren, welche die meisten Phasen ihrer respektiven reproduktiven Zyklen innerhalb des Cytoplasmas der Wirtszelle vervollständigen. Sie sind nichttransformierende Viren, d. h. die virale DNA wird nicht in das Wirtsgenom integriert, noch verursachen irgendwelche viralen Genprodukte Transformation. Die Viren werden als nicht-onkogen angesehen. Vaccinia wird seit ungefähr 200 Jahren bei Vaccinen für die Inokulation gegen Blattern verwendet und der medizinische Berufsstand ist sehr gut mit den Eigenschaften des Virus vertraut, wenn er in einem Vaccin verwendet wird. Auch wenn die Inokulation mit Vaccinia nicht ohne Risiko ist, sind die Risiken insgesamt sehr gut bekannt, gut definiert und das Virus wird als relativ gutartig angesehen.
Paoletti et al in U.S.-Patent Nummer 4,603,112, 4,722,848 und 4,769,300 haben Verfahren für die Produktion von Vacciniastämmen beschrieben, in welchem das Vacciniagenom modifiziert wurde, beispielsweise durch die Einführung eines Gens, welches natürlicherweise nicht vorhanden ist. Die Verfahren dieser Patente sind im allgemeinen auf die Herstellung der Produkte dieser Erfindung anwendbar. Und auf jedes der U.S.-Patente Nr. 4,603,112, 4,722,848 und 4,769,330 wird hiermit vollinhaltlich Bezug genommen. In WO89/03429, publiziert am 20. April 1989 (PCT/US88/02816, Prioritätsanmeldungen U.S.-Anmeldungen 090,711, 110,335, 186,054 und 234,390, eingereicht am 27. August 1987, respektive 20. Oktober 1987, 25. April 1988 und 23. August 1989), auf die hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird, führt Paoletti Verfahren für die Produktion von Geflügelpockenstämmen aus, in welchen das Geflügelpockengenom modifiziert wurde, beispielsweise durch Einführung eines Gens, welches natürlicherweise nicht vorhanden ist. Jedoch, weder diese Publikation noch die vorher erwähnten Paoletti-Patente lehrt oder suggeriert das Einführen eines Gens für ein Oberflächenantigen (oder eines Teils davon) eines Prokaryonts, welches verantwortlich für die Virulenz des Prokaryonts ist, in ein Virus, insbesondere Vaccinia oder Geflügelpocken; und, insbesondere lehren die vorher erwähnten Paoletti-Publikationen und -Patente nicht, noch suggerieren sie das Einführen eines Gens für die konservierte exponierte Region des M-Proteins (oder eines Teils davon) in ein Virus, insbesondere ein Vacciniavirus oder ein Geflügelpockenvirus. Weiterhin stellen Paoletti in WO89/03429 keine praktische Verwendbarkeit für die Einführung von prokaryontischer DNA in einen Virus zur Verfügung: Paolettis einzige Verwendung von prokaryontischer DNA ist die von dem LacZ-Gen, welches beta-Galactosidase in ziemlich jedem System exprimiert und gewöhnlich lediglich als Farbmarker verwendet wird. Die Expression von beta-Galactosidase durch Einführung des LacZ-Gens in einen Virus ist nicht eine Lehre dafür oder ein Vorschlag dazu zu verursachen, daß ein Virus ein Antigen (oder ein Teil davon), welches für die Virulenz eines Prokaryonts verantwortlich ist durch die Insertion von prokaryontischer DNA für dieses Antigen (oder eines Teils davon) in den Virus exprimiert.
Es wurde daher nun entdeckt, daß ein modifizierter Virus, vorzugsweise ein Geflügelpockenvirus oder ein Vacciniavirus, enthaltend in deren Genom ein genetisch eingefügtes Gen, exprimierend ein Antigen, das für die Virulenz eines Prokaryonts verantwortlich ist, vorzugsweise das M6'-Gen oder ein Gen, das die konservierte, exponierte Region des M6-Proteins (M6'-Protein) enthält, erfolgreich verwendet werden kann, um eine Immunantwort in einem Säugetierwirt hervorzurufen, welche ausreichend ist, um einen Wirt gegen Infektionen zu schützen, die durch den Prokaryont, z. B. streptokokkale Infektionen, so wie streptokokkale Pharangytis, verursacht werden.
Die verwendete Strategie, einen angemessenen rekombinanten Virus anzusammeln und zu isolieren, der das M6'-Gen enthält und das M6'-Gen exprimiert, ist in 3 und 4 gezeigt. Die Produktion von neuem Virus verwendet den bekannten Plasmid pVV3:M6, hergestellt wie beschrieben durch Hruby et al in Proc. Natl. Acad. Sci. USA Band 85, Seiten 5714–5717, August 1988, Microbiology (auf das hierin voll inhaltlich Bezug genommen wird), um den neuen Plasmid pWVV3:M6' herzustellen, welcher verwendet wird, um das Chimäre M6'-Gen in das Vacciniaoder vorzugsweise das Geflügelpockenvirusgenom einzuführen, um den rekombinanten Virus VV:M6' oder FPV:M6' herzustellen.
Es wurde herausgefunden, daß die neuen Vaccinia oder Geflügelpockenviren, die das vollständige Genfragment der konservierten Region des M6-Proteins enthalten, d. h. enthaltend das M6'-Gen zum Exprimieren eines trunkierten M6-Proteins, hierin identifiziert als das M6'-Protein, signifikanten Schutz gegen bakterielle mucosale Kolonisierung verleihen wird, wenn es als prophylaktisches Vaccin verwendet wird. Aus Bequemlichkeitsgründen wird das neue Vacciniavirus hierin als das VV:M6'-Virus benannt werden; und das neue Geflügelpockenvirus wird hierin als FPV:M6'-Virus bezeichnet werden.
Die folgenden nicht-limitierenden Beispiele sind lediglich zum Zwecke der Illustration gegeben und sind nicht limitierend für diese Erfindung auszulegen, wobei viele offensichtliche Variationen möglich sind, ohne vom Geist oder Umfang der Erfindung abzuweichen.
BEISPIELE
Beispiel 1: Virusaufbau (VV:M6')
3 zeigt die Struktur des VV:M6'-rekombinanten Virus. Der obere Teil der Figur ist eine schematische Darstellung der strukturellen Haupteigenschaften des Proteins, für das der M6-Open-Reading-Frame codiert, mit konservierten und variablen Regionen unter den angezeigten unterschiedlichen M-Serotypen. Siehe Hollingshead et al, J. Biol. Chem. 261, 1677 (1986). Die A-, B-, C- und D-Aminosäuren-Repeat-Blocks sind angezeigt, ebenso wie die Prolin-Glycin-(Pro/Gly)-reiche Region und der Membrananker (Memb. Anker). Unter Verwendung der angezeigten FokI-Site wurde die konservierte 3'-Hälfte des M6-Gens in einem Plasmidvektor, wie hierunter beschrieben, subkloniert. Die genomische Struktur des rekombinanten VV:M6' ist am unteren Ende der Figur gezeigt. Das M6'-Insert grenzt an das konstitutive 7,6 kDa-virale Thymidinkinasegen (dicke Pfeile) an. Die ungefähren Anordnungen der frühen (Pe) und späten (Pγ) transkriptionalen Start-Sites sind angezeigt, ebenso wie die Zeit, die für die Terminierung des frühen Transkripts (T_τ) verwendet wird. Die Struktur des VV:M6'-Rekombinants, die Sequenz der Kreuzungsregionen und die Expression der chimären transkriptionalen Einheit wurde durch DNA-Sequenzierung, Northern-Blot-Hybridisierung und Nuclease Sl-Mappingverfahren verifiziert.
In dem ersten Schritt für die Konstruktion von VV:M6', wie gezeigt in 4, wurde der PVV:M6-Plasmid mit FokI (schneidet bei Position 751 der M6-Sequenz) und mit ClaI (schneidet am 3'-Ende des Inserts) geschnitten. Das Fragment, das der 3'-Hälfte des M6-Gens entspricht, wurde isoliert, die ausgesparten Enden wurden unter Verwendung von Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I eingefüllt und das blunt-endige Fragment wurde in die SmaI-Site von M13mp 19 RF DNA kloniert. Eine rekombinante Phage, die das Insert in der richtigen Orientierung enthielt, wurde durch Hybridisierung mit einer strangspezifischen Oligonukleotidesonde identifiziert. Einzel-strängige DNA wurde hergestellt und als Substrat für Oligonukleotid-gerichtete site-spezifische Mutagenese verwendet, entworfen, um ein G zwischen den Positionen 769 und 770 des Inserts einzuführen. Diese Veränderung, welche durch Sangers Dideoxynukleotid-Sequenzierungsverfahren verifiziert wurde, resultierten in dem Lys-209-Codon des M6-Open-Reading-Frames, das in ein Anin-frame-AGT-Codon umgewandelt wird. Das mutagenisierte Insert (M6') wurde aus der Phagen-DNA unter Verwendung von EcoRI und BamHI ausgeschnitten, welche an dem 5'-, beziehungsweise an dem 3'-Ende des M6'-Inserts schneidet. Die ausgesparten Enden wurden mit Klenow bluntiert und das Fragment wurde blunt-endig in die BamHI-Site des pVV3-Insertionsplasmids ligiert, welcher ebenso mit Klenow aufgefüllt wurde. Restriktionskarte und Nukleotidsequenzverfahren wurden verwendet, um einen rekombinanten Plasmid auszuwählen, der das M6'-Insert in der korrekten Orientierung hinsichtlich des w 7,5 kDa-Promoterelements enthielt. Dieser pVV3:M6-rekombinante Plasmid wurde verwendet, um das Chimäre Gen in das VV-Genom unter Verwendung von Standardmarkertransfertechnologie einzuführen. Dann wurde das rekombinante Virus (VV:M6') wachsen gelassen, auf gereinigt und dann vorsichtig analysiert, um zu verifizieren, daß das M6'-Insert vorhanden war, intakt war und aktiv in Virus-infizierten Zellen transkribiert wurde. Die Struktur des. M6'-Gens und des M6'-Proteins sind in 5 und 6 unter Verwendung von Standardsymbolen für die Bestandteile gezeigt.
Beispiel 2: Viruswirksamkeit (VV:M6')
Mäusegruppen (Schweizer CDl, Jackson Labs) wurden intranasal mit entweder dem VV:M6'-Virus oder dem Wildtyp-Stamm in einer Dosis von 10⁷ bis zu 10⁸ plaqueformenden Einheiten (PFU)/Maus immunisiert. Nach vier Wochen wurden die Mäuse sowohl intranasal als auch oral mit M6 Gruppe A-Streptokokken (Stamm 543/192 von der Rockefeller University Collection) herausgefordert, welche resistent gegenüber 200 μg/ml Streptomycin gemacht wurden. Alle Tiere waren zu 4-5/Käfig während des Experimentes eingesperrt. Die Präparation des Stammes für die Herausforderung war wie beschrieben von Bessen und Fischetti in Infect. Immun. 56,2666 (1988). Zwei separate Herausforderungen wurden ausgeführt unter Verwendung von unterschiedlichen Dosen von Streptokokken- (6 × 10⁶ oder 1 × 10⁷ -koloniebildenden Einheiten (CFU/Maus). In jedem Falle wurden 20 μl der streptokokkalen Suspension in jedes Nasenloch verabreicht und zusätzliche 10 μl wurden oral verabreicht. Beginnend 24 Stunden nach der Herausforderung und in 24 bis 72 Stundenintervallen für zehn Tage danach wurde ein Abstrich aus dem Rachen entnommen (Calgiswab type 4, Spectrum) und auf Blutagarplatten enthaltend 200 μg/ml Streptomycin kultiviert, um sowohl zu diskriminieren und um Wettbewerb zwischen dem Wachstum von eingeführten Streptokokken und normalen Organismen der Flora zu vermeiden. Die Kulturen wurden über Nacht bei 37°C wachsen gelassen und hinsichtlich der Gegenwart von beta-hemoglytischen Streptokokken bewertet. Mäuse, welche nach der Herausforderung starben, wurden autopsiert und deren Milz wurde aseptisch entfernt und auf Streptomycin kultiviert, um sowohl zu unterscheiden als auch um Wettbewerb zwischen dem Wachstum von eingeführten Streptokokken und den Organismen der normalen Flora vorzubeugen. Kulturen wurden über Nacht bei 37°C wachsen gelassen, und hinsichtlich der Gegenwart von Beta-hemolytischen Streptokokken bewertet. Mäuse, welche nach der Herausforderung starben, wurden autopsiert und deren Milz wurde aseptisch entfernt und auf Streptomycinenthaltendem Blutagar wachsen gelassen.
Die Resultate der Studie sind in Tabelle I gezeigt.
TABELLE I Halskulturen nach intranasaler und oraler Herausforderung von Mäusen, geimpft intranasal mit Wildtyp oder rekombinanten Vacciniavirus
B. Experiment II
Wie gesehen werden wird, unterschied sich die pharyngeale Kolonisierung von Tieren, die mit Wildtypvirus immunisiert wurden, signifikant von denjenigen, die mit dem VV:M6'-Rekombinant immunisiert wurden. Von den VV:M6'-geimpften Tieren in beiden Dosierungsgruppen waren nur 16% der 152 insgesamt entnommenen Abstriche positiv, wobei 10 (6%) > 110 CFU ergaben, während 69% der 115 Swabs positiv in der Wildtypgruppe waren, wobei 40 (35%) > 100 CFU zeigten. Durchschnittliche waren > 70% der Tiere, die mit Wildtypvirus immunisiert wurden, kulturpositiv für Gruppe A-Streptokokken bei jedem Abstrich-Tag bis zu 10 Tage nach der Herausforderung. Dies wird mit > 30%-Kolonisierung von Mäusen, die mit dem VV:M6'-Virus immunisiert wurden und über dieselbe Zeitperiode nach der Herausforderung kultiviert wurden, verglichen. Diese Zahlen sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.
TABELE II Zusammenfassung der Halskulturresultate von Mäusen, die intranasal mit entweder Wildtyp- oder rekombinanten Vacciniaviurs geimpft wurden¹
Tabelle 1 zeigt die Resultate von zwei unterschiedlichen Experimenten, bei denen unterschiedliche Mäusegruppen mit entweder dem Wildtyp VV-Vaccin oder mit VV:M6'-Vaccin behandelt wurden, und danach herausgefordert wurden. Wie in der ersten Gruppe von 17 gesehen wird, wurden 65% der Tiere, die mit dem Wildtypvirus immunisiert waren, 1 Tag nach der Streptokokkenherausforderung kolonisiert und verblieben im wesentlichen so oder starben während der Dauer dieses Experimentes. In der zweiten Gruppe von 8 wurden 100 der Mäuse am Tag 1 kolonisiert und mehr als die Hälfte von ihnen war am Tag 8 tot. In VV:M6'-immunisierten Mäusen zeigten 0/20 (0%) in Experiment I und nur 3/8 (38%) in Experiment 2 eine positive Halskultur am ersten Tag nach der Herausforderung. Nur 18% von allen Mäusen, die mit VV:M6' geimpft wurden, starben während der Experimente, während 48% von allen Mäusen, die mit dem Wildtyp geimpft wurden, starben. Milzkulturen, die den toten Tieren entnommen wurden, ergaben beta-hemolytische Streptokokken.
Kinetische ELISA, angewendet wie beschrieben durch Bessen und Fischetti, Infect. Immun., 56,2666 (1988) und Fischetti et al J. Immunol. 141, 3592 (1988) (auf die hiermit voll inhaltlich Bezug genommen wird), wurde verwendet, um die Gegenwart von Antikörpern zu bestätigen. Zum Zeitpunkt der Streptokokkenherausforderung (4 Wochen nach der Immunisierung) war M-Protein-spezifisches IgG signifikant in dem Serum von VV:M6'-geimpften Tieren erhöht und abwesend in den Tieren, die Wildtypvirus erhielten. Vergleichsweise hohe Spiegel von Antikörpern gegen Vacciniaviren wurde in sowohl Wildtyp- als auch in VV:M6-immunisierten Tieren beobachtet.
Beispiel 3: Virusaufbau (FPV:M6')
Der Insertionsplasmid pVV3:M6', der das M6'-Gen enthält, wird hergestellt wie ausgeführt in Beispiel 1, und wird in einen nicht-essentiellen Ort in das Genom eines abgeschwächten Geflügelpockenvirus (FPV) (FP-1-Strang) inseriert. Das Gen wird zwischen zwei HincII-Sites eines 900 by PvuII-Fragmentes des FP-1-Genoms mit anschließender Deletion von ungefähr 30 by inseriert. Der rekombinante Geflügelpockenvirus FPV:M6' wird durch Verfahren hergestellt, die oben in Beispiel 1 für den Vacciniavirus beschrieben sind. Andere vorher beschriebene Verfahren für den Geflügelpockenvirus und für den Vacciniavirus, respektive, wie in Taylor et al, supra, oder wie in Panicali et al, "Construction of poxyviruses as cloning vectors: Protective insertion of the thymidine kinase gene Brom herpes simplex virus into the DNA of infectious vaccinia virus", Proc. Natl Acad. Sci. USA 1982, 79, 4927, auf das hiermit voll inhaltlich Bezug genommen wird, können ebenso verwendet werden, um das Insertionsplasmid und den rekombinanten Geflügelpockenvirus herzustellen. Die Struktur des FPV:M6'-Rekombinants, die Sequenz der Kreuzungsregionen und die Expression der chimären transkriptionalen Einheit werden durch DNA-Sequenzieren, Northern-Blot-Hybridisierung und Nuklease S1-Mapverfahren verifiziert. Das rekombinante Virus (FPV:M6') wird wachsen gelassen, aufgereinigt und dann vorsichtig analysiert, um zu verifizieren, daß das M6'-Insert vorhanden ist, intakt ist und aktiv in virusinfizierten Zellen transkribiert wird.
Die Strukturen des M6'-Gens und des M6'-Proteins sind in 5 und 6 unter Verwendung von Standardsymbolen für deren Bestandteile gezeigt.
Beispiel 4: Viruswirksamkeit (FPV:M6')
Mäusegruppen werden mit entweder FPV:M6-Virus oder dem Wildtypstamm immunisiert und werden danach mit M6 Gruppe A-Streptokokken in Übereinstimmung mit den Verfahren, die in Beispiel 2 aufgeführt sind, herausgefordert. Auf ähnliche Weise wird die Bestätigung der Gegenwart von Antikörpern ausgeführt, wie ausgeführt in Beispiel 2. Die erhaltenen Resultate sind im wesentlichen die gleichen, wie in Beispiel 2 ausgeführt.
Die Resultate der vorangehenden Beispiele zeigen klar die Fähigkeit des rekombinanten Vacciniavirus und des rekombinanten Geflügelpockenvirus der Erfindung, ausreichende Mengen an M6'-Protein zu exprimieren, um eine Immunantwort hervorzurufen, um gegen Streptokokkenkolonisierung in Säugetieren zu schützen.
Neue Produkte, die jetzt beschrieben wurden, beinhalten das M6'-Gen, das Plasmid pW3:M6', das das M6'-Gen enthält, das M6'-Protein und die rekombinanten Viren VV:M6' und FPV:M6'. Ohne zuzugeben, daß ein Bedarf besteht, dies zu tun, wird ausgeführt, daß eine Probe des pVV3:M6'-Plasmids in E. coli bei der American Type Culture Collection unter der Zugangsnummer 68003 hinterlegt wurde; und eine Probe des rekombinanten Vacciniavirus VV:M6' wurde ebenso unter der Zugangsnummer ATCC VR 2242 hinterlegt.
Fachleute werden erkennen, daß, während die Erfindung unter Bezugnahme auf spezifische Produkte beschrieben wurde, sdie Erfindung nicht auf diese spezifischen Produkte limitiert ist. Das Konzept der Erfindung kann unter Verwendung von Produkten ausgeführt werden, die ähnliche Aktivitäten haben, und sie könnten durch chemische Synthese, genetisches Engineering oder andere Techniken hergestellt werden. Beispielsweise kann das M6'-Gen durch die Hinzufügung oder Deletion von einem oder mehreren Codons modifiziert werden und das resultierende modifizierte M6'-Gen wird, wenn es in einen Virus, so wie einen Vacciniavirus oder einen Geflügelpockenvirus, inkorporiert wird, die Expression von modifizierten M6-Proteinen mit derselben oder im wesentlichen derselben schützenden Kapazität für Säugetiere gegen bakterielle Infektion anregen. Auch wenn diese Offenbarung von einer "konservierten exponierten Region" spricht, wird verstanden werden, daß nicht jede solche Region, die in jedem Streptokokkenstamm gefunden wird, tatsächlich identisch sein wird, noch werden die Gene, die sie produzieren, identisch sein. Sie werden jedoch im wesentlichen die gleiche Aktivität haben, d. h. das Gen wird ein Protein von derselben allgemeinen Region des M-Proteins produzieren, und das Protein wird Schutz gegen streptokokkale Infektion zur Verfügung stellen. All solche Modifikationen an den neuen Produkten dieser Erfindung sind im Umfang der Erfindung enthalten.
Die Vaccine dieser Erfindung werden typischerweise für nasale, orale oder parenterale Verabreichung, in Übereinstimmung mit Standardtechniken, die dem Fachmann in der Pharmazeutik gut bekannt sind, hergestellt werden. Beispiele solcher Zusammensetzungen beinhalten feste Zusammensetzungen für orale Verabreichung, so wie Kapseln, Tabletten, Pillen und ähnliches, flüssige Präparationen für die orale Verabreichung, Suspensionen, Sirup oder Elixiere und Präparationen für die parenterale Verabreichung, so wie sterile Suspensionen oder Emulsionen. Viele dieser Zusammensetzungen können für die nasale Verabreichung unter Verwendung einer Verpackungsart, mit der die Zusammensetzung durch die Anwendung von Luft oder einem anderen Gas, druckübertragen werden kann, adoptiert werden. Sie werden ebenso in der Form von sterilen Feststoffzusammensetzungen produziert, welche in sterilem Wasser, physiologischer Salzlösung oder Glucose suspendiert werden können.
Alle solche Zusammensetzungen werden eine ausreichende Menge an modifiziertem Vacciniavirus und/oder Geflügelpockenvirus enthalten, um eine schützende Antwort in dem Wirt zu generieren oder ein anderes injizierbares orales oder nasales Medium kurz vor der Verwendung.
Das Produkt kann in lyophilisierter Form zum Rekonstitutieren in isotonischem wäßrigen Salzpuffer zur Verfügung gestellt werden.
Optimale Dosierungen und Umstände für einen gegebenen Säugetierwirt können leicht durch den Fachmann ermittelt werden. Viele Faktoren, die Ärzten und Veterinärmedizinern gut bekannt sind, werden in Betracht gezogen werden, prinzipiell Alter und Gewicht, ebenso wie der Verabreichungsweg. Booster-Techniken, so wie sie mit anderen Vaccinen verwendet werden, können verwendet werden.
Nachdem die bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung nun im Detail beschrieben wurden, wird verstanden werden, daß die Erfindung, definiert durch die anhängenden Ansprüche, nicht durch bestimmte Details limitiert ist, die in der obigen Beschreibung ausgeführt sind, da viele offensichtliche Variationen davon möglich sind, ohne vom Geist oder Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen.

Claims

Rekombinantes Vaccinia- oder Geflügelpockenvirus, welche eine DNA Sequenz umfassen, die für ein M6-abgeleitetes Protein kodiert, welches in der Lage ist, eine Immunschutzantwort auf eine Streptokokken-Infektion in einem Säugetier hervorzurufen, wobei das Protein die Aminosäuresequenz a) des M6' Proteins aus 5 hat; oder b) der konservierten exponierten Region des M6 Proteins von Position 210 bis zu Position 298 aus 1 hat.
Virus gemäß Anspruch 1 als ein Medikament.
Impfstoff gegen Streptokokken-Infektion, welcher einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und ein Virus gemäß Anspruch 1 umfaßt.
Impfstoff gemäß Anspruch 3 für intranasale und/oder orale Verabreichung.
Verwendung eines Virus gemäß Anspruch 1 zum Herstellen eines Impfstoffs gegen Streptokokkeninfektion.
Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei der Impfstoff für intranasale und/oder orale Verabreichung ist.