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Diese Erfindung betrifft Viren, so
wie Vacciniaviren und Geflügelpockenviren,
die so modifiziert sind, daß sie
die DNA-Sequenz (das Gen) enthalten, welche in einem Säugetier,
einschließlich
Menschen, bewirkt, daß ein
Protein exprimiert wird, welches der konservierten, exponierten
Region des M6-Proteins entspricht. Sie betrifft ebenso die Verwendung
solch modifizierter Produkte als Vaccine, um gegen Streptokokkeninfektion zu
schützen.
Weiterhin betrifft sie Plasmide oder andere Vektoren, die dieses
Gen tragen.
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Verwandte Anmeldungen
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Diese Anmeldung ist eine Teilanmeldung
der U.S.-Anmeldung,
Seriennummer 07/369,118, eingereicht am 21. Juni 1989. Ebenfalls
wird die gleichzeitig eingereichte Anmeldung von Fischetti erwähnt, Anmeldeseriennummer
............... eingereicht ............ 1990 (Anwalt Docket Nr.
18106B), welche eine Teilanmeldung der Anmeldung mit der Seriennummer
07/315,588, eingereicht am 27. Februar 1989, ist, welche wiederum
eine Teilanmeldung der Anmeldung mit der Seriennummer 173,380, eingereicht
am 25. März
1988, ist, wobei auf jede von denen hiermit vollinhaltlich Bezug
genommen wird.
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Hintergrund
der Erfindung
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Ungefähr 30 Millionen Fälle von
Gruppe A-Streptokokkeninfektionen
treten jedes Jahr in den Vereinigten Staaten auf, von denen die
am häufigsten
auftretende eine akute Streptokokkenpharyngitis ist, welche vorwiegend
bei Kindern des Schulalters gefunden wird. Bis zu 5% der Pharyngitisfälle, welche
unbehandelt geblieben sind, oder welche nicht effektiv behandelt wurden,
können
zu akutem rheumatischen Fieber führen, eine
Krankheit, welche schließlich
in Herzschäden
resultieren kann. Während
dies nicht ein Hauptproblem in den Vereinigten Staaten ist, sind
diese Streptokokken-Folgeerkrankungen
ein signifikantes Problem in den Entwicklungsnationen der Welt.
Beispielsweise wurde geschätzt,
daß annähernd 6
Millionen Kinder des Schulalters in Indien an rheumatischen Herzkrankheiten
leiden.
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Das M-Protein der Gruppe A-Streptokokken
ist ein faserförmiges
Dimer aus Helices, die in einem coiled coil angeordnet sind, welches
sich bis zu etwa 50 nm von der Oberfläche dieser Organismen erstreckt. Es
ist ein fibrilläres
Molekül,
von denen mehr als 80 serologische M-Typen existieren. Das Protein
läßt den Streptokokkus
resistent gegenüber
nicht-immuno-Phagozytose sein. Es ist der Hauptvirulenzfaktor von
streptokokkalen Bakterien.
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Daher gibt es über 80 unterschiedliche Serotypen
von Gruppe A-Streptokokken, so daß ein Vaccin, das auf den typspezifischen
Epitopen basiert, nicht praktikabel sein könnte. Im allgemeinen wurde
bis jetzt kein befriedigendes Vaccin entwickelt, das Schutz gegen
streptokokkale Infektion verleiht, auch wenn signifikante und teure
Aufwendungen in dieser Richtung unternommen worden sind.
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Es gibt einen starken Antrieb, ein
sicheres und effektives Vaccim gegenüber A-Streptokokken zu entwickeln.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Es wurde nun überraschenderweise herausgefunden,
daß ein
Polypeptid, das der konservierten exponierten Region des M-Proteins
entspricht (hierin manchmal als "M6'-Protein" bezeichnet), eine schützende Immunantwort
hervorrufen kann, wenn es einem Säugetier verabreicht wird. Das
M6'-Polypeptid kann
durch Modifizieren des Genoms eines Virus der Familie der Pockenviren
hergestellt werden, so wie das Vaccinia-Orthopockenvirus oder das
Geflügelpocken-Avipockenvirus,
so daß sie
ein genetisch hergestelltes Gen enthalten ("das M6'-Gen"),
welches das M6'-Protein
exprimiert. Das M6'-Protein
kann einem Säugetier
verabreicht werden durch Verabreichung eines modifizierten Vacciniavirus
oder Geflügelpockenvirus,
das das Gen enthält, das
für das
Protein codiert, an ein Säugetier.
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Daher stellt die vorliegende Erfindung
ein Protein zur Verfügung,
das in der Lage ist, eine Immunschutzantwort gegen streptokokkale
Infektion in einem Säugetier
hervorzurufen, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz umfaßt, welche
gleich oder im wesentlichen gleich der Aminosäurerestsequenz in der konservierten
exponierten Region des M6-Proteins ist. Die vorliegende Erfindung
stellt ebenso das M6'-Protein
zur Verfügung.
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Weiterhin stellt die vorliegende
Erfindung ein Gen zur Verfügung,
das für
ein Protein codiert, das in der Lage ist, eine Immunschutzantwort
gegenüber
streptokokkaler Infektion in einem Säugetier hervorzurufen, wobei
das Protein eine Aminosäuresequenz
umfaßt,
welche gleich oder im wesentlichen gleich ist, wie die Aminosäurerestsequenz
in der konservierten exponierten Region des M6-Proteis. Die vorliegende
Erfindung stellt ebenso das M6'-Gen
zur Verfügung.
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Zusätzlich stellt die vorliegende
Erfindung ein Plasmid zur Verfügung,
welches ein Gen enthält,
das für ein
Protein codiert, das in der Lage ist, eine Immunschutzantwort auf
streptokokkale Infektion in einem Säugetier hervorzurufen, wobei
das Protein eine Aminosäuresequenz
umfaßt,
welche gleich oder im wesentlichen gleich ist, wie eine Aminosäurerestsequenz
in der konservierten exponierten Region des M6-Proteins. Das codierende
Gen kann das M6'-Gen
sein.
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Die vorliegende Erfindung stellt
ebenso ein Virus zur Verfügung,
vorzugsweise aus der Familie der Pockenviren, enthaltend ein Gen,
das für
ein Protein codiert, das in der Lage ist, eine Immunschutzantwort
gegenüber
streptokokkaler Infektion in einem Säugetier hervorzurufen, wobei
das Protein eine Aminosäuresequenz
umfaßt,
welche gleich oder im wesentlichen gleich ist, wie eine Aminosäurerestsequenz
in der konservierten exponierten Region des M6-Proteins. Typische
Pockenviren beinhalten Vaccinia- oder Geflügelpocken-Viren; das Geflügelpockenvirus
ist ein bevorzugter Virus. Das Gen, das das Virus enthalten kann,
ist das M6'-Gen.
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Allgemeiner stellt die vorliegende
Erfindung ein Virus zur Verfügung,
das ein Gen enthält,
das für
ein Oberflächenantigen
oder ein Teil davon eines Prokaryonts enthält, wobei das Oberflächenantigen
oder der Teil davon verantwortlich für die Virulenz des Prokaryonten
ist. Typische Viren beinhalten diejenigen der Familie der Pockenviren,
insbesondere Vaccinia und Geflügelpocken;
wobei Geflügelpocken
ein bevorzugter Virus ist. Das Oberflächenantigen oder der Teil davon
kann ein Protein sein, das in der Lage ist, eine Immunschutzantwort
in einem Säugetier
hervorzurufen, welches eine Aminosäuresequenz umfaßt, welche
gleich oder im wesentlichen gleich ist, wie eine Aminosäurerestsequenz
in der konservierten exponierten Region des M6-Proteins. Der Prokaryont
kann ein Bakterium sein, insbesondere Streptokokken. Das Gen, das
das Virus enthalten kann, ist das M6'-Gen.
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Ebenso stellt die vorliegende Erfindung
ein Vaccin zur Verfügung,
welches einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und ein Virus umfaßt, das
ein Gen enthält,
das für
ein Oberflächenantigen
oder einen Teil davon eines Prokaryonts codiert, wobei das Oberflächenantigen
oder der Teil davon verantwortlich für die Virulenz des Prokaryonts
ist; und das Virus in einer ausreichenden Menge für ein ausreichendes
Antigen oder einen Teil davon vorhanden ist, um eine schützende Antwort
auf eine Infektion hervorzurufen, die durch den Prokaryont verursacht
wird. Das Oberflächenantigen
oder der Teil davon kann ein Protein sein, das in der Lage ist,
eine Immunschutzantwort auf Streptokokkeninfektion in einem Säugetier
hervorzurufen, welches eine Aminosäuresequenz umfaßt, welches
die gleiche ist, oder im wesentlichen die gleiche ist, wie eine
Aminosäurerestsequenz
in der konservierten exponierten Region des M6-Proteins; und das
Virus ist in einer ausreichenden Menge für ausreichendes Protein vorhanden,
um eine Schutzantwort auf eine Streptokokkeninfektion hervorzurufen.
Der Prokaryont kann ein Bakterium sein, insbesondere Streptokokken.
Wiederum beinhalten typische Viren diejenigen der Familie der Pockenviren,
insbesondere Vaccinia und Geflügelpocken;
Geflügelpocken
sind bevorzugt; und das Gen, das das Virus enthalten kann, ist das
M6'-Gen.
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Weiterhin stellt die vorliegende
Erfindung ein Verfahren zum Kontrollieren von prokaryontischer Infektion
in einem Säugetier
mit Bedarf für
solche Kontrolle zur Verfügung,
welches die Verabreichung eines Virus, der ein Gen enthält, das
für ein
Oberflächenantigen
oder einen Teil davon eines Prokaryonts codiert, an das Säugetier
umfaßt,
wobei das Oberflächenantigen
oder der Teil davon für
die Virulenz des Prokaryonts verantwortlich ist und das Virus in
einer ausreichenden Menge für
ausreichendes Antigen oder eines Teils davon verabreicht wird, um
eine Antikörperantwort
auf eine Infektion, die durch das Prokaryont verursacht wird, hervorzurufen.
Das Oberflächenantigen
oder der Teil davon kann ein Protein sein, das in der Lage ist,
eine Immunschutzantwort auf Streptokokkeninfektion in einem Säugetier
hervorzurufen, welches eine Aminosäuresequenz umfaßt, welche
gleich oder im wesentlichen gleich der Aminosäuresequenz in der konservierten
exponierten Region des M6-Proteins ist; das Virus wird in einer
ausreichenden Menge verabreicht, damit das Protein eine Antikörperantwort
hervorrufen kann, die ausreichend ist, um eine solche Kontrolle
zu bewirken. Der Prokaryont kann ein Bakterium sein, insbesondere
Streptokokken. Wiederum beinhalten typische Viren diejenigen der
Familie der Pockenviren, insbesondere Vaccinia und Geflügelpocken;
Geflügelpocken
sind bevorzugt; und das Gen, das das Virus enthalten kann, ist das
M6'-Gen.
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Die vorliegende Erfindung stellt
zusätzlich
ein Gen zur Verfügung,
das für
ein Segment eines Oberflächenantigens
oder eines Teils davon eines Prokaryonts codiert, wobei das Oberflächenantigen
für die
Virulenz des Prokaryonts verantwortlich ist; und das Segment des
Oberflächenantigens
oder des Teils davon in der Lage ist, eine Immunschutzantwort auf
die Infektion, die durch den Prokaryont in einem Säugetier
verursacht wird, hervorzurufen. Dies ist kein Naturprodukt, da das
Codieren ein Segment eines Oberflächenantigens oder einen Teil
davon und nicht das gesamte Antigen betrifft.
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Ebenso stellt die vorliegende Erfindung
einen Plasmid zur Verfügung,
das ein Gen enthält,
das für
ein Segment eines Oberflächenantigens
oder eines Teils davon eines Prokaryonts codiert, wobei das Oberflächenantigen
für die
Virulenz des Prokaryonts verantwortlich ist; und das Codieren des
Gens nicht natürlicherweise
in dem Plasmid vorhanden ist.
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Der Ausdruck "das codierende Gen, das natürlicherweise
nicht in dem Plasmid vorhanden ist" wird verwendet, so daß klar ist,
daß ein
Naturprodukt sich nicht innerhalb des Umfangs dieser Erfindung befindet. Beispielsweise
wurde das neue M6'-Gen
dieser Erfindung in dem neuen Plasmid pVV3:M6' bei der American Type Culture Collection
hinterlegt. Die Hinterlegung bestand aus einer Probe des pVV3:M6'-Plasmids in E. coli unter
der Zugangsnummer 68003. Das M6'-Gen
ist natürlicherweise
nicht in einem Plasmid von E. coli vorhanden; oder "das codierende Gen
(das M6'-Gen) ist
natürlicherweise
nicht in dem Plasmid (von E. coli) vorhanden". Auf gleiche Weise wird der Begriff "Segment eines Oberflächenantigens
oder eines Teils davon" verwendet,
so daß die
Gene und Plasmide innerhalb des Umfanges davon nicht Naturprodukte
beinhalten, oder nicht das beinhalten, was bereits bekannt ist,
z. B. das M6-Gen oder der Plasmid pVV3:M6.
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Auf gleiche Weise stellt die vorliegende
Erfindung ein Vaccin zur Verfügung,
das einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und ein Virus umfaßt, vorzugsweise
aus der Familie der Pockenviren, enthaltend ein Gen, das für ein Protein
codiert, das in der Lage ist, eine Immunschutzantwort auf streptokokkale
Infektion in einem Säugetier
hervorzurufen, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz umfaßt, welche
dieselbe oder im wesentlichen dieselbe ist, wie eine Aminosäurerestsequenz
in der konservierten exponierten Region des M6-Proteins; und das
Virus ist in einer ausreichenden Menge für ausreichendes Protein vorhanden,
um eine Schutzantwort gegenüber
Streptokokkeninfektion hervorzurufen. Wiederum beinhalten typische
Pockenviren Vaccinia und Geflügelpocken;
Geflügelpocken
sind bevorzugt; und das Gen, das das Virus enthalten kann, ist das M6'-Gen.
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Die vorliegende Erfindung stellt
zusätzlich
ein Verfahren zum Kontrollieren von streptokokkaler Infektion in
einem Säugetier
zur Verfügung,
das einer solchen Kontrolle bedarf, welches die Verabreichung eines Virus
aus der Familie der Pockenviren an das Säugetier umfaßt, welches
ein Gen enthält,
das für
Protein codiert, das in der Lage ist, eine Immunoschutzantwort auf
streptokokkaler Infektion in einem Säugetier hervorzurufen, wobei
das Protein eine Aminosäuresequenz
umfaßt,
welche gleich oder im wesentlichen gleich ist, wie die Aminosäuresequenz
in der konservierten exponierten Region des M6-Proteins; das Virus
wird in einer ausreichenden Menge verabreicht, damit das Protein
eine Antikörperantwort
hervorrufen kann, die Ausreicht, um eine solche Kontrolle zu bewirken.
Wiederum beinhalten typische Pockenviren Vaccinia und Geflügelpocken;
Geflügelpocken
sind bevorzugt; und das Gen, das das Virus enthalten kann, ist das
M6'-Gen.
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Der Begriff "die gleiche oder im wesentlichen die
gleiche" wird hierin
verwendet, um die Sequenz von Aminosäuren in Proteinen in dieser
Erfindung zu beschreiben, die die wünschenswerte Aktivität aufweisen,
da solche Proteine entweder identisch mit der exponierten konservierten
Region des M6-Proteins von Gruppe A-Streptokokken sind oder so ähnlich zu
diesem Segment sind, daß sie
die gleiche Aktivität
haben. Keine nicht angemessene Experimentiertätigkeit ist erforderlich, um
Proteine zu bestimmen, welche so ähnlich zu der konservierten
exponierten Region des M6-Proteins sind, daß sie die gleiche Aktivität wie diejenigen
haben, welche gleich sind, wie die Region. Der Fachmann kann vom Lesen
dieser Beschreibung homologe Polypeptide herstellen, die dieselbe
Aktivität
und im wesentlichen die gleiche Sequenz haben, wie die exponierte
konservierte Region des M6-Proteins. Beispielsweise können die
Termini verlängert
werden, z. B. um einen Anker zur Verfügung zu stellen, der das Protein
an ein Bindemittel bindet. Ein Protein mit derselben Aktivität und einem
hohen Grad an Homologie mit der konservierten exponierten Region
kann einfacher synthetisiert werden oder weniger teuer herzustellen
sein, und dieses Protein wird als innerhalb des Umfangs der vorliegenden
Erfindung befindlich angesehen.
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Um die Begriffe, die hierin verwendet
werden, weiterhin zu verdeutlichen, sind die Proteine der vorliegenden
Erfindung nicht das gesamte M-Protein, sondern haben eher die gleiche
oder im wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz wie die konservierte,
exponierte Region des M6-Proteins der Gruppe A-Streptokokken (oder eines Teils davon).
Die Polypeptide dieser Erfindung werden nicht als natürlich auftretend
angesehen. Um die Proteine dieser Erfindung zu erhalten, werden
Viren genetisch modifiziert, um diese Proteine zu exprimieren. Jedoch,
nachdem hierin die konservierte, exponierte Region des M6-Proteins
der Gruppe A-Streptokokken
und die Verwendbarkeit davon offenbart ist, kann die Synthese der
Proteine durch selektive enzymatische oder chemische Spaltung des
M-Proteins oder durch Festphasensynthese (siehe Anmeldung von Fischetti,
erwähnt
unter „Verwandte
Anmeldungen") erreicht
werden. Die hierin offenbarten Proteine sind keine Naturprodukte,
ob sie aus der Genexpression eines modifizierten Virus oder aus
anderer Synthese resultieren, da diese Proteine hierin nicht das
gesamte M-Protein sind, sondern die gleichen oder im wesentlichen
die gleichen sind, wie eine Aminosäuresequenz in nur einem Teil
des M-Proteins; wobei der Teil die konservierte exponierte Region
des M-Proteins (oder
einen Teil davon) umfaßt.
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Weiterhin haben die hierin offenbarten
Proteine nicht dieselben Charakteristika und dieselbe Verwendbarkeit
wie irgendein M-Protein oder ein anderes natürlich auftretendes Protein,
da das M-Protein aufgrund der Variabilität der Spezies des M-Proteins
aus unterschiedlichen Stämmen
von Streptokokken nicht zum Schutz gegen streptokokkale Infektionen
verwendet werden kann, während
die Proteine hierin verwendet werden können, um Vaccine herzustellen,
die Schutz ermöglichen,
welcher nicht stammspezifisch ist. Daher sind die hierin offenbarten
Proteine keine Naturprodukte, da sie nicht als distinkte Einheiten
in der Natur existieren und niemals vorher produziert wurden und
da kein Naturprodukt dieselben Eigenschaften hat, wie diese Proteine.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnung
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1 zeigt
die vollständige
Aminosäuresequenz
des M6-Proteins des Stammes D471 der Gruppe A-Streptokokkenkultur von der Rockefeller
University-Sammlung.
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2 illustriert
ein Modell des vollständigen
M6-Proteins vom
Stamm D471, wie es auf der Zellwand existiert.
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3 und 4 zeigen die Strategie, die
verwendet wurde, um die Produkte dieser Erfindung herzustellen.
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5 und 6 zeigen die Strukturen des
M6'-Proteins und das
M6'-Gen.
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7 zeigt
die Anordnung der bevorzugten Peptide der konservierten Region.
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Detaillierte
Beschreibung
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Es wird aus 2 ersehen werden, daß ein Teil des M-Proteins,
der Carboxyterminus, in das Peptidoglykan der Zellwand und in die
cytoplasmatische Membran eingebettet ist. Ein Segment des M-Moleküls wird
durch das Kohlenhydrat der Zellwand geschützt, welches aus einem Rhamnosegerüst (offener
Kreis) und aus N-Acetylglykosaminzweigen
(geschlossene Kreise) zusammengesetzt ist. Der distale Aminoterminus
des M-Proteins ist
nicht-helical. Das meiste des M-Moleküls zwischen dem Kohlenhydratschutz
und der nicht-helicalen Region ist auf der Oberfläche des
Streptokokkus exponiert.
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1 ist
die vollständige
Aminosäuresequenz
eines M-Proteins von einem spezifischen Stamm. M-Proteine von anderen
Stämmen
werden im allgemeinen dieselben strukturellen Eigenschaften und
Konfirmationen haben, aber die Aminosäuresequenzen werden variieren.
Die Hauptvariationen treten in Richtung des Aminoterminus auf. Die
Moleküle
werden mehr und mehr konserviert in Richtung des Carboxyendes. Daher
steigt die Homologie innerhalb der M-Moleküle von unterschiedlichen Serotypen
progressiv an Orten an, welche näher
am Carboxyterminus und proximaler an der Zellwand sind. Die konservierte
exponierte Region verläuft
etwa von Position 170 bis zu Position 299 und wird im allgemeinen
als die Region angesehen, die bei dem Ile bei Position 210 beginnt.
Die konservierte exponierte Region befindet sich vorzugsweise zwischen etwa
Position 210 und ungefähr
Position 298. Als Balance des Moleküls wird die konservierte nichtexponierte Region
angesehen. Diese Erfindung betrifft die konservierte exponierte
Region des M-Proteinmoleküls.
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Es ist die Variabilität am Aminoterminus,
welche für
die antigene Variation des M-Proteins verantwortlich ist. Typspezifische
Antikörper,
welche Schutz gegen einen Serotyp ermöglichen, sind nicht wirksam
darin, einer Infektion durch andere Serotypen in einem Opsonophagozytose-Assay
zu widerstehen. Daher ist es für ein
Individuum theoretisch möglich,
vielfach mit unterschiedlichen Streptokokkenstämmen infiziert zu werden, und
jede Infektion wird fortfahren, bis das Immunsystem Antikörper gegen
die typspezifische Nterminale Region des M-Moleküls generiert hat.
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Es wird vermutet, daß die C-Repeat-Region
des M-Proteins aus
hochkonservierten C-Repeat-Blocks besteht, unterbrochen durch Spacer-Sequenzen,
welche weniger gut unter den unterschiedlichen Serotypen konserviert
sein können
(siehe 7). Die hochkonservierten
C1- und C2-Repeat-Blocks
sind benachbart an der Zellwand angeordnet, d. h. in Typ 6-Streptokokken.
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Insbesondere zeigt 7, daß das Aminoende des M-Proteins typspezifisch
ist (antigenisch variabel). Sequenzen in Position 298–441 sind
im allgemeinen zellverbunden. Innerhalb der konservierten Region
tritt die C-Repeat-Region auf, die aus dem C1-Block, Spacer und
dem C2-Block besteht. Die nichttypspezifischen Eptiope von M6, welche
unter anderen M-Proteinserotypen bis zu variierenden Graden geteilt
werden, sind hier angeordnet. Monoklonale und affinitätsaufgereinigte
Antipeptidantikörper,
welche zu der B-Repeat-Region und der Pepsin-Site des M6-Proteins
mappen, werden unter nur 10% bis 17% der mehr als 50 unterschiedlichen
Serotypen geteilt. Im Gegensatz dazu werden Antikörper, welche
zu der anschließenden
C-Repeat-Region mappen, unter etwa 60% bis 70% der Serotypen geteilt.
Während
Proteine dieser Erfindung sich von dem B5-Repeat-Block durch die
C-Repeat-Region und sogar von dem B4-Repeat-Block zu dem Carboxyterminus für breitbasierenden
Schutz erstrecken können,
ist es bevorzugt, daß das
Protein gleich oder im wesentlichen gleich der konservierten exponierten
Region ist, welche von etwa Position 170 bis zu Position 299 verläuft, und es
ist sogar besonders bevorzugt, daß die Proteine gleich oder
im wesentlichen gleich der Region sind, die von etwa Position 235 bis
zu Position 299 verläuft;
d. h. vollständig
innerhalb der hochkonservierten C-Repeat-Region enthalten sind.
In der folgenden Diskussion beziehen sich Nummern in Klammern, die
auf das Wort Peptid oder Protein oder Polypeptid folgen, so wie "Peptid (240–260)" auf ein Peptid oder
Protein oder Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, welche dieselbe
oder im wesentlichen dieselbe ist, wie die Sequenz in dem M6-Protein,
die sich von der Position der ersten Nummer bis zur Position der
zweiten Nummer erstreckt.
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Absorptions-Assays mit Antipeptid-Fabs
zeigen an, daß ein
Klasse I-spezifischer mAb (10B6) zu Peptid (240–260)
mappt, während
andere Klasse I-spezifischen mAbs (10FS) zu beiden Peptiden (240–260)
und Peptid (272–292)
mappen. Zusätzlich
haben Antipeptidantikörper,
die gegen Peptid (240–260)
und Peptid (272–292)
gerichtet sind, substantielle Immunoreaktivität mit den extrahierten Formen
von verschiedenen Klasse II M-Proteinen auf dem Western-Blot, auch
wenn Antipeptidantikörper
gegen Peptid (248–269)
und Peptid (256–277)
Klasse I-spezifisch sein können.
Daher, innerhalb einer schmalen Region der C-Repeat-Region des M6-Proteins können sich
sowohl Klasse I-spezifische als auch geteilte antigene Determinanten
befinden. Daher wird ein Vaccin, das aus Antigenen besteht, die
der C-Repeat-Region entsprechen, sowohl gegen Klasse I- als auch
gegen Klasse II-Streptokokken schützen.
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Daher, zusätzlich zu Proteinen, welche
gleich oder im wesentlichen gleich sind, wie die Sequenz der konservierten
exponierten Region des M6-Proteins, gibt es eine Präferenz für Proteine,
welche gleich oder im wesentlichen ähnlich zu der Sequenz der C-Repeat-Region
oder zu Teilen davon sind. Ähnlich
bevorzugte Proteine beinhalten Polypeptid (216–235),
Polypeptid (248–269),
Polypeptid (275–284),
Polypeptid (240–260), Polypeptid –(256–277)
und Polypeptid (272–292)
(siehe Anmeldung von Fischetti, erwähnt unter Verwandte Anmeldungen).
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Vaccine für die Verwendung zum Schutz
gegen streptokokkale Infektion wurden vorher vorgeschlagen. Diese
Vaccine wurden hergestellt aus Polypeptiden aus dem hypervariablen
Aminoende des Moleküls. Sie
genossen einigen Erfolg beim Zurverfügungstellen von typspezifischer
Immunität
gegen homologe Serotypen. Deren Leistung wurde verbessert durch
Inkorporieren von verschiedenen typspezifischen Determinanten in
das gleiche multivalente Vaccin. Jedoch, gegeben das enorme Aufgebot
an existierenden M-Serotypen, ist dieses kein attraktives Verfahren.
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Gruppe A-Streptokokken sind weitverbreitete
humane Pathogene, welche für
nasopharyngeale Infektionen und Impetigo verantwortlich sind. Es
gibt ungefähr
30 Millionen Fälle
von Gruppe A-streptokokkalen Infektionen jedes Jahr allein in den
Vereinigten Staaten. Trotz der Tatsache, daß streptokokkale Infektion
erfolgreich mit Antibiotika behandelt werden kann, verursacht sie
in der Zwischenzeit häufig
erhebliches Unbehangen und einen Produktivitätsverlust. Ein kleiner Prozentsatz
von infizierten Individuen, die mit streptokokkaler Infektion in
Verbindung stehen, entwickeln ernsthaftere Krankheiten, so wie rheumatisches
Fieber und Glomerulonephritis. In Entwicklungsländern ist rheumatisches Fieber
die Hauptursache für
Herzkrankheiten unter Kindern. Daher gibt es einen starken Antrieb,
ein sicheres und effektives Vaccin gegen Gruppe A-Streptokokken zu
entwickeln.
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Die Erfahrung zeigt, daß streptokokkale
Infektionen, insbesondere Pharangytis, im allgemeinen auf Kinder
limitiert sind. Das Auftreten von Infektions-Peaks ist im Alter
von 6–8.
Erwachsene sind anscheinend resistenter gegen solche Infektionen,
vermutlich, da sie eine Immunität
aufgebaut haben, welche effektiv gegen die meisten Serotypen ist.
Daher könnte
eine immunologische Antwort gegen streptokokkale Infektionen vorhanden
sein, welche Antikörper
produziert, welche Epitope für
die meisten, wenn nicht für
alle streptokokkale Serotypen produziert. Es wurde herausgefunden,
daß solche
Epitope in der konservierten Region des M-Proteins vorhanden sind,
welche nicht durch deren Nähe
zur Zellwand geschützt
sind, d. h. in der konservierten exponierten Region des M-Proteins.
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Während
die Identität
der Aminosäuren
in dieser Region etwas unter den Serotypen variiert, verläuft sie
im allgemeinen von etwa Aminosäure 170 bis
zur Position 299 auf dem M-Proteinmolekül, vorzugsweise von Position 210 bis
zu 198 oder 299 und sogar mehr bevorzugt von etwa Position 235 bis
zu etwa Position 299.
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Polypeptide oder Proteine aus dieser
Region sind in der Lage, eine schützende Immunantwort hervorzurufen
und rufen sie hervor, wenn sie einem Säugetier verabreicht werden,
das einen Bedarf für
einen Schutz gegen streptokokkale Infektion hat.
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Wie bekannt ist, hat der menschliche
Körper
verschiedene Verfahren, sich gegen Infektionen durch Mikroorganismen
zu schützen.
Eines ist das adaptive System, in welchem die Immunantwort auf einen
eindringenden Organismus in der Produktion von IgG-Antikörpern resultiert,
welche durch Ermöglichen
der Opsonisierung und Phagocytose funktionieren, die durch Komplement
vermittelt wird. Ein anderes ist die Produktion oder Aktivierung
von IgA, welches das vorwiegende Immunogloglulin in seromucosen
Sekretionen, so wie Speichel, Tracheobronchialsekretionen, Colostrum,
Milch- und Genital-Harn-Sekretionen ist. IgG wird ebenso in diesen
Sekretionen gefunden, jedoch in geringern Konzentrationen. Sekretions-IgA
(sIgA) ist eine dimere Form des IgA, geschützt vor Proteolyse durch den
Sekretionsbestandteil. Eine Funktion von IgA ist es, zu vermeiden,
daß infektiöse Mikroorganismen
sich am mukösen
Gewebe anhaften, es kolonisieren und invasieren.
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Ein gegenwärtig bevorzugtes Verfahren
für die
Praxis dieser Empfindung involviert im Prinzip die Stimulation des
sekretorischen Immunsystems, insbesondere sIgA durch intranasale
oder orale Verabreichung. Es kann eine concomitante Produktion von
IgG vorliegen und beides kann zur Immunisierung beitragen. Die Erfindung
wird im Prinzip beschrieben werden, wie auf dieses Verfahren angewandt.
Die Polypeptide der Erfindung können
ebenfalls verwendet werden, um IgA als die prinzipielle Antwort
auf die parenterale Verabreichung durch die concomitante Produktion
von Niedrigspiegel-IgA zu stimulieren.
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Vacciniavirus und Geflügelpockenvirus
sind Mitglieder der Familie der Pockenviren. Innerhalb der Familie
der Pockenviren befinden der Genus Orthopockenvirus und der Genus
Avipockenvirus, inter alia. Es gibt mehr als 20 Viren in der Familie
der Pockenviren, einschließlich
Viren, die für
Blattern, Kuhpocken, Geflügelpocken
und menschliche Krankheiten verantwortlich sind.
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Geflügelpocken befinden sich im
Genus Avipockenvirus, wobei Vaccinia und Blattern im Genus Orthopockenviren
angeordnet sind. Der Genus Avipockenvirus beinhaltet ebenso Kanarienpocken,
Juncopocken, Taubenpocken, Spatzenpocken, Starpocken und Truthahnpocken.
Charakteristika von Pockenviren beinhalten, daß die Virons groß sind,
klotzförmig
(oder ovoid im Falle des Genus Parapockenvirus), ungefähr 300–450 mal
170–260
nm in der Größe, mit
einer externen Hülle,
einer Beschichtung von tubulären
Strukturen und einer internen Struktur, die aus einem DNA-enthaltenem
Kern und einem oder zwei lateralen Körpern besteht. Das Genom besteht
aus einem einzigen Molekül
dsDNA mit kovalent geschlossenen Enden ("hairpins") mit einer Größe von 130-280 kbp. Die Viren haben mehr als 100
Proteine und verschiedene Enzyme (einschließlich DNA-abhängiger RNA-Polymerase, Guanylmethyltransferase
und Poly (A) Polymerase). Initiale Transkription tritt innerhalb
des Viruskerns auf, was zu der Synthese von frühen Proteinen führt, von
denen einige zur Unbeschichtung von viraler DNA führen, was
weitere Transkription und DNA-Replikation erlaubt. Replikation und Aufbau
tritt in dem Cytoplasma im Viroplasma auf ("virale Fabriken") und Virions werden freigesetzt durch Knospung
(extrazelluläre
eingehüllte
Virions) oder durch Zellzerstörung
(intrazelluläre
eingehüllte
Virions). Es gibt ein gewöhnliches
Pockenvirusgruppenantigen (Nucleoproteinantigen) und Viren, die
Mitglied des Genus Orthopockenviren sind, produzieren ein Nichtvirion-Hemagglutinin.
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Diese Erfindung wird prinzipiell
beschrieben werden, da sie sich auf Vaccinia und Geflügelpocken
als Vektor für
das Gen beziehen, das die konservierte, exponierte Region des M-Proteins
exprimiert, aber andere Vektoren (Viren, insbesondere Mitglieder
der Pockenviren) können
ebenso verwendet werden. Auf ähnliche Art
und Weise können
andere Gene für
Antigene von Prokaryonten verwendet werden, welche verantwortlich für die Virulenz
der Prokaryonten sind. Geflügelpocken
ist ein bevorzugter Vektor, da etwa 1 in 100.000 Personen, die Vaccinia
ausgesetzt sind, eine nachteilige Reaktion zeigen (z. B. Encephalitis),
während
keine solche Reaktion bekannt ist, die von der Aussetzung gegenüber Geflügelpocken
resultiert. Zusätzlich
ist der natürliche
Wirtsbereich des Geflügelpockenvirus
auf Vogelarten limitiert (siehe Taylor et al, "Protective immunity against avian influenca
induced by fowlpox virus recombinant", Vaccine, Band 6, Dezember 1988, Seite
504, worauf hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird). Der Geflügelpockenstamm,
der hierin FP-1 genannt wird, ist ein Duvette-Stamm, modifiziert,
um als ein Vaccin in tagealten Hühnern
verwendet zu werden; der Stamm ist ein kommerzieller Stamm, der
als 0 DCEP 25/CE67/2309 Oktober 1980 bezeichnet wird, und ist erhältlich vom
Institut Merieux, Inc.
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Vaccinia und Geflügelpocken sind eukaryontische
Viren, welche die meisten Phasen ihrer respektiven reproduktiven
Zyklen innerhalb des Cytoplasmas der Wirtszelle vervollständigen.
Sie sind nichttransformierende Viren, d. h. die virale DNA wird
nicht in das Wirtsgenom integriert, noch verursachen irgendwelche
viralen Genprodukte Transformation. Die Viren werden als nicht-onkogen
angesehen. Vaccinia wird seit ungefähr 200 Jahren bei Vaccinen
für die
Inokulation gegen Blattern verwendet und der medizinische Berufsstand ist
sehr gut mit den Eigenschaften des Virus vertraut, wenn er in einem
Vaccin verwendet wird. Auch wenn die Inokulation mit Vaccinia nicht
ohne Risiko ist, sind die Risiken insgesamt sehr gut bekannt, gut
definiert und das Virus wird als relativ gutartig angesehen.
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Paoletti et al in U.S.-Patent Nummer
4,603,112, 4,722,848 und 4,769,300 haben Verfahren für die Produktion
von Vacciniastämmen
beschrieben, in welchem das Vacciniagenom modifiziert wurde, beispielsweise durch
die Einführung
eines Gens, welches natürlicherweise
nicht vorhanden ist. Die Verfahren dieser Patente sind im allgemeinen
auf die Herstellung der Produkte dieser Erfindung anwendbar. Und
auf jedes der U.S.-Patente Nr. 4,603,112, 4,722,848 und 4,769,330
wird hiermit vollinhaltlich Bezug genommen. In WO89/03429, publiziert
am 20. April 1989 (PCT/US88/02816, Prioritätsanmeldungen U.S.-Anmeldungen
090,711, 110,335, 186,054 und 234,390, eingereicht am 27. August
1987, respektive 20. Oktober 1987, 25. April 1988 und 23. August
1989), auf die hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird, führt Paoletti
Verfahren für
die Produktion von Geflügelpockenstämmen aus,
in welchen das Geflügelpockengenom
modifiziert wurde, beispielsweise durch Einführung eines Gens, welches natürlicherweise
nicht vorhanden ist. Jedoch, weder diese Publikation noch die vorher
erwähnten
Paoletti-Patente lehrt oder suggeriert das Einführen eines Gens für ein Oberflächenantigen
(oder eines Teils davon) eines Prokaryonts, welches verantwortlich
für die
Virulenz des Prokaryonts ist, in ein Virus, insbesondere Vaccinia
oder Geflügelpocken;
und, insbesondere lehren die vorher erwähnten Paoletti-Publikationen
und -Patente nicht, noch suggerieren sie das Einführen eines
Gens für
die konservierte exponierte Region des M-Proteins (oder eines Teils
davon) in ein Virus, insbesondere ein Vacciniavirus oder ein Geflügelpockenvirus.
Weiterhin stellen Paoletti in WO89/03429 keine praktische Verwendbarkeit
für die
Einführung
von prokaryontischer DNA in einen Virus zur Verfügung: Paolettis einzige Verwendung
von prokaryontischer DNA ist die von dem LacZ-Gen, welches beta-Galactosidase
in ziemlich jedem System exprimiert und gewöhnlich lediglich als Farbmarker
verwendet wird. Die Expression von beta-Galactosidase durch Einführung des
LacZ-Gens in einen Virus ist nicht eine Lehre dafür oder ein
Vorschlag dazu zu verursachen, daß ein Virus ein Antigen (oder
ein Teil davon), welches für
die Virulenz eines Prokaryonts verantwortlich ist durch die Insertion
von prokaryontischer DNA für
dieses Antigen (oder eines Teils davon) in den Virus exprimiert.
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Es wurde daher nun entdeckt, daß ein modifizierter
Virus, vorzugsweise ein Geflügelpockenvirus
oder ein Vacciniavirus, enthaltend in deren Genom ein genetisch
eingefügtes
Gen, exprimierend ein Antigen, das für die Virulenz eines Prokaryonts
verantwortlich ist, vorzugsweise das M6'-Gen oder ein Gen, das die konservierte,
exponierte Region des M6-Proteins (M6'-Protein)
enthält,
erfolgreich verwendet werden kann, um eine Immunantwort in einem
Säugetierwirt
hervorzurufen, welche ausreichend ist, um einen Wirt gegen Infektionen zu
schützen,
die durch den Prokaryont, z. B. streptokokkale Infektionen, so wie
streptokokkale Pharangytis, verursacht werden.
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Die verwendete Strategie, einen angemessenen
rekombinanten Virus anzusammeln und zu isolieren, der das M6'-Gen enthält und das
M6'-Gen exprimiert,
ist in 3 und 4 gezeigt. Die Produktion
von neuem Virus verwendet den bekannten Plasmid pVV3:M6, hergestellt
wie beschrieben durch Hruby et al in Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Band 85, Seiten 5714–5717,
August 1988, Microbiology (auf das hierin voll inhaltlich Bezug genommen
wird), um den neuen Plasmid pWVV3:M6' herzustellen, welcher verwendet wird,
um das Chimäre M6'-Gen in das Vacciniaoder
vorzugsweise das Geflügelpockenvirusgenom
einzuführen,
um den rekombinanten Virus VV:M6' oder
FPV:M6' herzustellen.
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Es wurde herausgefunden, daß die neuen
Vaccinia oder Geflügelpockenviren,
die das vollständige Genfragment
der konservierten Region des M6-Proteins enthalten, d. h. enthaltend
das M6'-Gen zum
Exprimieren eines trunkierten M6-Proteins, hierin identifiziert
als das M6'-Protein,
signifikanten Schutz gegen bakterielle mucosale Kolonisierung verleihen
wird, wenn es als prophylaktisches Vaccin verwendet wird. Aus Bequemlichkeitsgründen wird
das neue Vacciniavirus hierin als das VV:M6'-Virus benannt werden; und das neue Geflügelpockenvirus
wird hierin als FPV:M6'-Virus
bezeichnet werden.
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Die folgenden nicht-limitierenden
Beispiele sind lediglich zum Zwecke der Illustration gegeben und sind
nicht limitierend für
diese Erfindung auszulegen, wobei viele offensichtliche Variationen
möglich
sind, ohne vom Geist oder Umfang der Erfindung abzuweichen.
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BEISPIELE
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Beispiel 1: Virusaufbau
(VV:M6')
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3 zeigt
die Struktur des VV:M6'-rekombinanten
Virus. Der obere Teil der Figur ist eine schematische Darstellung
der strukturellen Haupteigenschaften des Proteins, für das der
M6-Open-Reading-Frame codiert, mit konservierten und variablen Regionen
unter den angezeigten unterschiedlichen M-Serotypen. Siehe Hollingshead
et al, J. Biol. Chem. 261, 1677 (1986). Die A-, B-, C- und D-Aminosäuren-Repeat-Blocks
sind angezeigt, ebenso wie die Prolin-Glycin-(Pro/Gly)-reiche Region
und der Membrananker (Memb. Anker). Unter Verwendung der angezeigten
FokI-Site wurde die konservierte 3'-Hälfte
des M6-Gens in einem Plasmidvektor, wie hierunter beschrieben, subkloniert.
Die genomische Struktur des rekombinanten VV:M6' ist am unteren Ende der Figur gezeigt.
Das M6'-Insert grenzt
an das konstitutive 7,6 kDa-virale Thymidinkinasegen (dicke Pfeile)
an. Die ungefähren
Anordnungen der frühen
(Pe) und späten
(Pγ) transkriptionalen
Start-Sites sind angezeigt, ebenso wie die Zeit, die für die Terminierung
des frühen
Transkripts (Tτ)
verwendet wird. Die Struktur des VV:M6'-Rekombinants, die Sequenz der Kreuzungsregionen
und die Expression der chimären
transkriptionalen Einheit wurde durch DNA-Sequenzierung, Northern-Blot-Hybridisierung
und Nuclease Sl-Mappingverfahren
verifiziert.
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In dem ersten Schritt für die Konstruktion
von VV:M6', wie
gezeigt in 4, wurde
der PVV:M6-Plasmid mit FokI (schneidet bei Position 751 der
M6-Sequenz) und mit ClaI (schneidet am 3'-Ende des Inserts) geschnitten. Das
Fragment, das der 3'-Hälfte des
M6-Gens entspricht, wurde isoliert, die ausgesparten Enden wurden
unter Verwendung von Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I eingefüllt und
das blunt-endige Fragment wurde in die SmaI-Site von M13mp 19 RF
DNA kloniert. Eine rekombinante Phage, die das Insert in der richtigen
Orientierung enthielt, wurde durch Hybridisierung mit einer strangspezifischen
Oligonukleotidesonde identifiziert. Einzel-strängige DNA wurde hergestellt
und als Substrat für
Oligonukleotid-gerichtete site-spezifische Mutagenese verwendet,
entworfen, um ein G zwischen den Positionen 769 und 770 des
Inserts einzuführen.
Diese Veränderung, welche
durch Sangers Dideoxynukleotid-Sequenzierungsverfahren
verifiziert wurde, resultierten in dem Lys-209-Codon des M6-Open-Reading-Frames,
das in ein Anin-frame-AGT-Codon umgewandelt wird. Das mutagenisierte
Insert (M6') wurde
aus der Phagen-DNA unter Verwendung von EcoRI und BamHI ausgeschnitten,
welche an dem 5'-,
beziehungsweise an dem 3'-Ende
des M6'-Inserts
schneidet. Die ausgesparten Enden wurden mit Klenow bluntiert und
das Fragment wurde blunt-endig in die BamHI-Site des pVV3-Insertionsplasmids
ligiert, welcher ebenso mit Klenow aufgefüllt wurde. Restriktionskarte
und Nukleotidsequenzverfahren wurden verwendet, um einen rekombinanten
Plasmid auszuwählen,
der das M6'-Insert
in der korrekten Orientierung hinsichtlich des w 7,5 kDa-Promoterelements
enthielt. Dieser pVV3:M6-rekombinante Plasmid wurde verwendet, um
das Chimäre
Gen in das VV-Genom unter Verwendung von Standardmarkertransfertechnologie
einzuführen.
Dann wurde das rekombinante Virus (VV:M6') wachsen gelassen, auf gereinigt und
dann vorsichtig analysiert, um zu verifizieren, daß das M6'-Insert vorhanden
war, intakt war und aktiv in Virus-infizierten Zellen transkribiert
wurde. Die Struktur des. M6'-Gens
und des M6'-Proteins
sind in 5 und 6 unter Verwendung von Standardsymbolen
für die
Bestandteile gezeigt.
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Beispiel 2: Viruswirksamkeit
(VV:M6')
-
Mäusegruppen
(Schweizer CDl, Jackson Labs) wurden intranasal mit entweder dem
VV:M6'-Virus oder
dem Wildtyp-Stamm in einer Dosis von 107 bis
zu 108 plaqueformenden Einheiten (PFU)/Maus
immunisiert. Nach vier Wochen wurden die Mäuse sowohl intranasal als auch
oral mit M6 Gruppe A-Streptokokken (Stamm 543/192 von der Rockefeller
University Collection) herausgefordert, welche resistent gegenüber 200 μg/ml Streptomycin
gemacht wurden. Alle Tiere waren zu 4-5/Käfig während des Experimentes eingesperrt. Die
Präparation
des Stammes für
die Herausforderung war wie beschrieben von Bessen und Fischetti
in Infect. Immun. 56,2666 (1988). Zwei separate Herausforderungen
wurden ausgeführt
unter Verwendung von unterschiedlichen Dosen von Streptokokken-
(6 × 106 oder 1 × 107 -koloniebildenden
Einheiten (CFU/Maus). In jedem Falle wurden 20 μl der streptokokkalen Suspension
in jedes Nasenloch verabreicht und zusätzliche 10 μl wurden oral verabreicht. Beginnend
24 Stunden nach der Herausforderung und in 24 bis 72 Stundenintervallen für zehn Tage
danach wurde ein Abstrich aus dem Rachen entnommen (Calgiswab type
4, Spectrum) und auf Blutagarplatten enthaltend 200 μg/ml Streptomycin
kultiviert, um sowohl zu diskriminieren und um Wettbewerb zwischen
dem Wachstum von eingeführten
Streptokokken und normalen Organismen der Flora zu vermeiden. Die
Kulturen wurden über
Nacht bei 37°C
wachsen gelassen und hinsichtlich der Gegenwart von beta-hemoglytischen
Streptokokken bewertet. Mäuse,
welche nach der Herausforderung starben, wurden autopsiert und deren
Milz wurde aseptisch entfernt und auf Streptomycin kultiviert, um
sowohl zu unterscheiden als auch um Wettbewerb zwischen dem Wachstum
von eingeführten
Streptokokken und den Organismen der normalen Flora vorzubeugen.
Kulturen wurden über
Nacht bei 37°C
wachsen gelassen, und hinsichtlich der Gegenwart von Beta-hemolytischen
Streptokokken bewertet. Mäuse,
welche nach der Herausforderung starben, wurden autopsiert und deren
Milz wurde aseptisch entfernt und auf Streptomycinenthaltendem Blutagar
wachsen gelassen.
-
Die Resultate der Studie sind in
Tabelle I gezeigt.
-
TABELLE
I
Halskulturen nach intranasaler und oraler Herausforderung
von Mäusen,
geimpft intranasal mit Wildtyp oder rekombinanten Vacciniavirus
-
-
Wie gesehen werden wird, unterschied
sich die pharyngeale Kolonisierung von Tieren, die mit Wildtypvirus
immunisiert wurden, signifikant von denjenigen, die mit dem VV:M6'-Rekombinant immunisiert
wurden. Von den VV:M6'-geimpften
Tieren in beiden Dosierungsgruppen waren nur 16% der 152 insgesamt
entnommenen Abstriche positiv, wobei 10 (6%) > 110 CFU ergaben, während 69% der 115 Swabs positiv
in der Wildtypgruppe waren, wobei 40 (35%) > 100 CFU zeigten. Durchschnittliche waren > 70% der Tiere, die
mit Wildtypvirus immunisiert wurden, kulturpositiv für Gruppe
A-Streptokokken bei jedem Abstrich-Tag bis zu 10 Tage nach der Herausforderung.
Dies wird mit > 30%-Kolonisierung von
Mäusen,
die mit dem VV:M6'-Virus immunisiert
wurden und über
dieselbe Zeitperiode nach der Herausforderung kultiviert wurden,
verglichen. Diese Zahlen sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.
-
TABELE
II
Zusammenfassung der Halskulturresultate von Mäusen, die
intranasal mit entweder Wildtyp- oder rekombinanten Vacciniaviurs
geimpft wurden
1
-
-
Tabelle 1 zeigt die Resultate von
zwei unterschiedlichen Experimenten, bei denen unterschiedliche Mäusegruppen
mit entweder dem Wildtyp VV-Vaccin oder mit VV:M6'-Vaccin behandelt
wurden, und danach herausgefordert wurden. Wie in der ersten Gruppe
von 17 gesehen wird, wurden 65% der Tiere, die mit dem Wildtypvirus
immunisiert waren, 1 Tag nach der Streptokokkenherausforderung kolonisiert
und verblieben im wesentlichen so oder starben während der Dauer dieses Experimentes.
In der zweiten Gruppe von 8 wurden 100 der Mäuse am Tag 1 kolonisiert und
mehr als die Hälfte
von ihnen war am Tag 8 tot. In VV:M6'-immunisierten Mäusen zeigten 0/20 (0%) in Experiment
I und nur 3/8 (38%) in Experiment 2 eine positive Halskultur am ersten
Tag nach der Herausforderung. Nur 18% von allen Mäusen, die
mit VV:M6' geimpft
wurden, starben während
der Experimente, während
48% von allen Mäusen,
die mit dem Wildtyp geimpft wurden, starben. Milzkulturen, die den
toten Tieren entnommen wurden, ergaben beta-hemolytische Streptokokken.
-
Kinetische ELISA, angewendet wie
beschrieben durch Bessen und Fischetti, Infect. Immun., 56,2666 (1988)
und Fischetti et al J. Immunol. 141, 3592 (1988) (auf die hiermit
voll inhaltlich Bezug genommen wird), wurde verwendet, um die Gegenwart
von Antikörpern
zu bestätigen.
Zum Zeitpunkt der Streptokokkenherausforderung (4 Wochen nach der Immunisierung)
war M-Protein-spezifisches IgG signifikant in dem Serum von VV:M6'-geimpften Tieren
erhöht
und abwesend in den Tieren, die Wildtypvirus erhielten. Vergleichsweise
hohe Spiegel von Antikörpern
gegen Vacciniaviren wurde in sowohl Wildtyp- als auch in VV:M6-immunisierten Tieren beobachtet.
-
Beispiel 3: Virusaufbau
(FPV:M6')
-
Der Insertionsplasmid pVV3:M6', der das M6'-Gen enthält, wird
hergestellt wie ausgeführt
in Beispiel 1, und wird in einen nicht-essentiellen Ort
in das Genom eines abgeschwächten
Geflügelpockenvirus
(FPV) (FP-1-Strang)
inseriert. Das Gen wird zwischen zwei HincII-Sites eines 900 by PvuII-Fragmentes
des FP-1-Genoms mit anschließender
Deletion von ungefähr
30 by inseriert. Der rekombinante Geflügelpockenvirus FPV:M6' wird durch Verfahren
hergestellt, die oben in Beispiel 1 für den Vacciniavirus beschrieben
sind. Andere vorher beschriebene Verfahren für den Geflügelpockenvirus und für den Vacciniavirus,
respektive, wie in Taylor et al, supra, oder wie in Panicali et
al, "Construction
of poxyviruses as cloning vectors: Protective insertion of the thymidine
kinase gene Brom herpes simplex virus into the DNA of infectious
vaccinia virus",
Proc. Natl Acad. Sci. USA 1982, 79, 4927, auf das hiermit voll inhaltlich
Bezug genommen wird, können
ebenso verwendet werden, um das Insertionsplasmid und den rekombinanten
Geflügelpockenvirus
herzustellen. Die Struktur des FPV:M6'-Rekombinants, die Sequenz der Kreuzungsregionen
und die Expression der chimären transkriptionalen
Einheit werden durch DNA-Sequenzieren, Northern-Blot-Hybridisierung und
Nuklease S1-Mapverfahren verifiziert. Das rekombinante Virus (FPV:M6') wird wachsen gelassen,
aufgereinigt und dann vorsichtig analysiert, um zu verifizieren,
daß das
M6'-Insert vorhanden
ist, intakt ist und aktiv in virusinfizierten Zellen transkribiert
wird.
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Die Strukturen des M6'-Gens und des M6'-Proteins sind in 5 und 6 unter Verwendung von Standardsymbolen
für deren
Bestandteile gezeigt.
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Beispiel 4: Viruswirksamkeit
(FPV:M6')
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Mäusegruppen
werden mit entweder FPV:M6-Virus oder dem Wildtypstamm immunisiert
und werden danach mit M6 Gruppe A-Streptokokken in Übereinstimmung
mit den Verfahren, die in Beispiel 2 aufgeführt sind, herausgefordert.
Auf ähnliche
Weise wird die Bestätigung
der Gegenwart von Antikörpern
ausgeführt,
wie ausgeführt
in Beispiel 2. Die erhaltenen Resultate sind im wesentlichen die
gleichen, wie in Beispiel 2 ausgeführt.
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Die Resultate der vorangehenden Beispiele
zeigen klar die Fähigkeit
des rekombinanten Vacciniavirus und des rekombinanten Geflügelpockenvirus
der Erfindung, ausreichende Mengen an M6'-Protein zu exprimieren, um eine Immunantwort
hervorzurufen, um gegen Streptokokkenkolonisierung in Säugetieren
zu schützen.
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Neue Produkte, die jetzt beschrieben
wurden, beinhalten das M6'-Gen,
das Plasmid pW3:M6',
das das M6'-Gen
enthält,
das M6'-Protein
und die rekombinanten Viren VV:M6' und FPV:M6'. Ohne zuzugeben, daß ein Bedarf besteht, dies
zu tun, wird ausgeführt,
daß eine
Probe des pVV3:M6'-Plasmids
in E. coli bei der American Type Culture Collection unter der Zugangsnummer
68003 hinterlegt wurde; und eine Probe des rekombinanten Vacciniavirus
VV:M6' wurde ebenso
unter der Zugangsnummer ATCC VR 2242 hinterlegt.
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Fachleute werden erkennen, daß, während die
Erfindung unter Bezugnahme auf spezifische Produkte beschrieben
wurde, sdie Erfindung nicht auf diese spezifischen Produkte limitiert
ist. Das Konzept der Erfindung kann unter Verwendung von Produkten
ausgeführt
werden, die ähnliche
Aktivitäten
haben, und sie könnten
durch chemische Synthese, genetisches Engineering oder andere Techniken
hergestellt werden. Beispielsweise kann das M6'-Gen durch die Hinzufügung oder
Deletion von einem oder mehreren Codons modifiziert werden und das
resultierende modifizierte M6'-Gen
wird, wenn es in einen Virus, so wie einen Vacciniavirus oder einen
Geflügelpockenvirus,
inkorporiert wird, die Expression von modifizierten M6-Proteinen
mit derselben oder im wesentlichen derselben schützenden Kapazität für Säugetiere
gegen bakterielle Infektion anregen. Auch wenn diese Offenbarung
von einer "konservierten
exponierten Region" spricht,
wird verstanden werden, daß nicht
jede solche Region, die in jedem Streptokokkenstamm gefunden wird,
tatsächlich
identisch sein wird, noch werden die Gene, die sie produzieren,
identisch sein. Sie werden jedoch im wesentlichen die gleiche Aktivität haben,
d. h. das Gen wird ein Protein von derselben allgemeinen Region
des M-Proteins produzieren, und das Protein wird Schutz gegen streptokokkale
Infektion zur Verfügung
stellen. All solche Modifikationen an den neuen Produkten dieser
Erfindung sind im Umfang der Erfindung enthalten.
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Die Vaccine dieser Erfindung werden
typischerweise für
nasale, orale oder parenterale Verabreichung, in Übereinstimmung
mit Standardtechniken, die dem Fachmann in der Pharmazeutik gut
bekannt sind, hergestellt werden. Beispiele solcher Zusammensetzungen
beinhalten feste Zusammensetzungen für orale Verabreichung, so wie
Kapseln, Tabletten, Pillen und ähnliches,
flüssige
Präparationen
für die
orale Verabreichung, Suspensionen, Sirup oder Elixiere und Präparationen
für die
parenterale Verabreichung, so wie sterile Suspensionen oder Emulsionen.
Viele dieser Zusammensetzungen können
für die
nasale Verabreichung unter Verwendung einer Verpackungsart, mit
der die Zusammensetzung durch die Anwendung von Luft oder einem
anderen Gas, druckübertragen
werden kann, adoptiert werden. Sie werden ebenso in der Form von
sterilen Feststoffzusammensetzungen produziert, welche in sterilem
Wasser, physiologischer Salzlösung
oder Glucose suspendiert werden können.
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Alle solche Zusammensetzungen werden
eine ausreichende Menge an modifiziertem Vacciniavirus und/oder
Geflügelpockenvirus
enthalten, um eine schützende
Antwort in dem Wirt zu generieren oder ein anderes injizierbares
orales oder nasales Medium kurz vor der Verwendung.
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Das Produkt kann in lyophilisierter
Form zum Rekonstitutieren in isotonischem wäßrigen Salzpuffer zur Verfügung gestellt
werden.
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Optimale Dosierungen und Umstände für einen
gegebenen Säugetierwirt
können
leicht durch den Fachmann ermittelt werden. Viele Faktoren, die Ärzten und
Veterinärmedizinern
gut bekannt sind, werden in Betracht gezogen werden, prinzipiell
Alter und Gewicht, ebenso wie der Verabreichungsweg. Booster-Techniken,
so wie sie mit anderen Vaccinen verwendet werden, können verwendet
werden.
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Nachdem die bevorzugten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung nun im Detail beschrieben wurden, wird
verstanden werden, daß die
Erfindung, definiert durch die anhängenden Ansprüche, nicht
durch bestimmte Details limitiert ist, die in der obigen Beschreibung
ausgeführt
sind, da viele offensichtliche Variationen davon möglich sind,
ohne vom Geist oder Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen.