HUT71320A - Novel plasmid for production of crm protein and diphtheria toxin - Google Patents

Description

A találmány uj, CRM protein és diftériatoxin termelésére alkalmas plazmidokra, valamint ezek alkalmazásával diftériatoxin és CRM proteinek előállítására vonatkozik.

A CRM197 protein a diftériatoxin nem-toxikus formája, de attól immunologiailag nem megkülönböztethető. A CRM197 protein a nem-toxikus B197^^OX“ fággal fertőzött C.diphtheriae-ben termelődik, amely fágot a toxigén corinefág β nitrozoguanidin mutagenézisével nyernek (Uchida,T. és munkatársai, 1971, Natúré New Biology, 233, 8-11). A CRM protein molekulatömege azonos a diftériatoxinéval, csak a szerkezeti génben egyetlen bázissal különbözik tőle, a guanin helyett adenint tartalmaz. Ez az egyetlen báziscsere az érett proteinben aminosav-szubsztituciót okoz (glicin helyett glutaminsav) és eliminálja a diftériatoxin toxikus tulajdonságát. A CRM197 protein egy biztonságos és hatásos T-sejt függő hordozó a szacharidok számára és jelenleg a Haemophilus influenzáé tip.b oligoszacharid CRM197 konjugátum vakcinában használják (HibTiter™; Lederle Praxis Biologicals, Rochester,Ν.Y.)

Jelentős mennyiségű CRM197 protein előállítását a vakcinákhoz való felhasználásra a protein kis mennyisége gátolja. Kifejlesztettek módszereket a CRM proteinek termelésének fokozására, a nem-toxikus korinefág B197 kettős lizogénjeinek (Rappuoli, R.,1983, Applied Env.Microbio.46,560-564;

USP 4 925 792; Rappuoli,R., 1983, J.Bacteriol., 153,1202-1210) alkalmazásával. Rappuoli közleménye szerint a kettős lizogén alkalmazásával akár háromszor nagyobb kitermelést is el lehet érni, mint a szingli lizogénekkel.A szingli lizogénekkel termelt CRM197 proteinek szintje kielégítő, de gazdaságilag nem megfelelő a CRM197 proteineket felhasználó vakcinák előállításához .

A korinefág β több lizogénjének bevitele a Corynebacterium diphtheriae törzsbe igen munkaigényes szkrinelő művelet, hogy kiválaszthatók legyenenek azon törzsek, amelyek nagy mennyiségben képesek a diftériatoxinnal keresztreakcióba lépő CRM197 protein, a diftériatoxin vagy más CRM proteinek termelésére. Továbbá ez az eljárás lehetőségeiben korlátozott, hogy csak rekombináns technikát alkalmazó protein expressziót végez. Szükséges ezért olyan eljárás kifejlesztése, amely képes jelentős mennyiségű diftériatoxin és CRM proteinek előállítására a gén kópia számának növelésére korinefág β alkalmazása nélkül; vagy úgy, hogy növeli ezen proteinek termelődését a korinefág β-ra lizogén törzsekből.

A találmány uj eljárásra és plazmidredszerre vonatkozik, amely alkalmas a diftériatoxin génből származtatott CRM197 proteint, a diftériatoxint és más CRM proteint kodoló gén manipulálására és bevezetésére, vonatkozik továbbá az ezzel transzformált mikroorganizmusokra. Egy különösen előnyös DNS plazmid, amelyet pPX 3511-ként jelölünk, az amely egyesíti a nem-toxikus betafág CRM197 proteinjének génjét és a pNG2-22 plazmidot. Az új plazmidrendszer képes a Corynebacterium diphtheriae törzsek olyan törzsekké való transzformálására, amelyek nagy mennyiségben expresszálják a CRM197 proteint több lizogén alkalmazása nélkül. A találmány szerinti megoldás egy elegáns eszköz a diftériatoxin génből származtatott CRM197 proteinek, diftériatoxin és más CRM proteinek expressziójának növelésére.

A gén expresszió továbbá manipulálható a promoter-erősség nőve• · • ♦·· · ··· • · · · · «·

- 4 lésével vagy a promoternek a vas-szabályozásból való eltávolításával. Egy előnyös kiviteli formánál a plazmidrendszer alkalmazható más, a CRM197 proteinnel, diftériatoxinnal vagy más CRM proteinnel genetikai fúzióban lévő proteinek expresszálására. A CRM197 proteinben, a diftériatoxinban vagy más, a diftériatoxin génből származtatott CRM proteinben található szabályozó és termelő (processing) szekvenciák alkalmazhatók idegen proteinek expresszálására Corynebacterium fajokban.

Az 1. ábrán bemutatjuk a pPX 3511 jelű rekombináns DNS plazmidot, amely tartalmazza a CRM197 génjét, az E.coliból származtatott pUC 18 klonozó vektort, amely tartalmazza a kloramfenikol rezisztencia (CmR) markert és a pNG2-22-ből származtatott replikációs origint (Serwold-Davis,T.M. és mtársai,1990, FÉM Microbiol.Lett., 66,119-124).

A 2. ábrán bemutatjuk a 12%-os SDS-PAGE gélt, amelyen láthatók a különböző C.diphtheriae C7 törzsekből termelt CRM197 proteinek (61,8 kdalton). Sáv A: nagy molekulatömegű standardok (BRL,200-14,3 kdalton); Sáv B: szingli lizogén Cl (B197)tox-. Sáv C: kettős lizogén C7(B197)^tox-;

Sáv D: nem-lizogén C7(-)^tox“ pPX 3511-gyel, klór-amfenikol (Cm2)(2μg/ml) nélkül tenyésztve; Sáv E: nem-lizogén C7(-)^tox“ pPX 3511-gyel, klór-amfenikollal (2Mg/ml) tenyésztve; Sáv F: szingli lizogén C7(B197)^tox“ pPX 3511-gyel klór-amfenikol nélkül (2Mg/ml) tenyésztve; Sáv G: szingli lizogén (C7(B197)t°^x~ klór-amfenikollal ( 2Mg/ml) tenyésztve.

A 3. ábrán bemutatjuk a pPX 3511 stabilitását

C.diphtheriae C7(B197)^tox- törzsben klór-amfenikol rezisztencia mint plazmid retenció indikátor felhasználásával, antibiotikus • · · · · • ··· · ··« • · · · · • · ·« · ·« szelekció nélkül.

A találmány új eljárásra és plazmidrendszerrre vonatkozik, amely alkalmas diftériatoxin, CRM197 és más a diftériatoxin génből származtatott proteinek előállítására olyan mennyiségben, amely elegendő vakcinákban való felhasználásra vagy más olyan helyeken, ahol ezen proteinek feldolgozható mennyisége szükséges. A plazmidrendszer hatásos eszköz a diftériatoxin gén vagy CRM gén Corynebacterium spp-be való bevezetésére és a kopiaszám növelésére. A plazmid saját független episzómával rendelkezik, amelynek saját replikációs funkciói vannak és így lehetővé teszi, hogy a plazmiddal extra kopiaszámú diftériatoxin vagy CRM gént vezessünk be a gazdatörzsekbe, amelyek nem képesek ilyen integrációra vagy amelyek előzőleg nem lettek B197^^OX_ fággal megfertőzve. így például a találmány szerinti plazmidot magában foglaló Corynebacterium fajok által termelt CRM197 protein mennyisége összemérhető, ha nem több, mint a B197tox- korinefággal fertőzött C.diphtheriae több lizogénje által expresszált CRM197 protein mennyisége.

A nagy mennyiségű proteinek termelésére képes találmány szerinti plazmidok a következőket tartalmazzák : a diftériatoxint vagy CRM proteint kodoló gént , amely a promoterét és a szabályozó szignálszekvenciáját is tartalmazza; a Corynebacterium replikációs originjét, úgy, hogy a kapott plazmid Corynebacterium spp.-be bevezethető; és egy szelektálható markert, amely adott esetben a többszörös klonozóhelyhez van kapcsolva. Ezt a plazmidot alkalmazzuk a Corynebacterium fajhoz tartozó mikroorganizmusok és különösen a Corynebacterium diphtheriae transzformálására olyan körülmények között, amelyek lehetővé • 4

- 6 teszik a diftériatoxin vagy CRM gén expresszálódását. A tenyésztés megfelelő körülményei a szakember számára nyilvánvalóak a gazdaorganizmustól függően. így például az optimális CRM197 vagy diftériatoxin vagy más CRM protein termelés érdekében szükséges, hogy a Corynebacterium spp. mikroorganizmust kis vastartalmú vagy késleltetett (deferated) közegben tartsuk.

A plazmid tartalmaz egy a diftériatoxin génből származtatott, a diftériatoxint vagy a CRM proteint kodoló gént. CRM proteinként, azaz kersztreakcióra képes anyagként, amely immunológiailag keresztreakcióra képes a diftériatoxinnal és amely felhasználható a találmány szerinti plazmid megkonstruálásához, a korlátozás szándéka nélkül, alkalmazhatjuk például a következőket: CRM45, CRM30, CRM228 vagy CRM176. A CRM197 proteint kodoló gént a diftériatoxinból (DT) származtatjuk, amelynek szekvenciáját Greenffield és mtársai írták le (Greenffield és mtársai 1983, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 80,6853-6857). A DT gén és a CRM197 gén közötti egyetlen különbség egy báziscsere a szerkezeti génben. A CRM gének közül néhánynak a nukleotidszekvenciáját Uchida és mtársai ismertették ( Uchida és mtársai, J. Biol.Chem., 248, 3838-3844, 1975). A teljes CRM gént, amely a szabályozó szekvenciáját is tartalmazza, polimeráz láncreakcióval (PCR) állíthatjuk elő. Más amplifikációs vagy szintetikus módszerek alkalmazhatók a CRM197 gén vagy más CRM gének előállításához.

A diftériatoxint és a CRM proteint kodoló génen lévő szabályozó szignálszekvencia lehetővé teszi, hogy a protein a közegbe kiváljon. így a kivált protein a közegbeől kinyerhető, és ismert eljárásokkal, így például sókicsapással és oszlopkomato• « • · ·♦ · ··· • · · · « · • · · · · · ·

- 7 gráfiával tisztítható,

A többszörös klonozó helyet előnyösen a pUC 18 plazmidból származtatjuk, de más egyéb forrásból, így például pBluescriptból származtatott klonozó helyek vagy más szintetikus többszörös klonozó helyek is alkalmazhatók. Más módszernél a többszörös klonozó hely mind eliminálható anélkül, hogy a plazmid működőképessége károsodna.Mindegyik esetben a plazmidba egy szelektálható marker gén van beépítve. Szelektálható marker génként bármilyen antibiotikus rezisztencia marker alkalmazható, így például a korlátozás szándéka nélkül említjük a következőket: amficilin, eritromicin, kloramfenikol, kanamicin. Először a corinebakterium érzékenységét teszteljük a kiválasztott antibiotikummal szemben. Előnyösen kloramfenikolt alkalmazunk, ha az expresszált proteint humán felhasználásra szánjuk, mivel a kloramfenikolt ilyen célokra a Food and Drug Administration már elfogadta. Más plazmid-szelekciós módszerk, így például nehézfém-reszisztencia vagy táplálkozási követelmény is alkalmazható az antibiotikus reszisztencia markerek helyett.

A találmány szerinti nagy termelésű plazmidok megalkotásához alkalmas replikációs origint előnyösen például a Corynebacterium spp.-ből származtatjuk. A pPX3511 plazmidhoz választott replikációs origint a Corynebacterium diphtheriae törzsből származtatjuk (lásd a példákat). Más corynebakterium replikációs originek is alkalmazhatók.

Egy előnyös kiviteli módnál a CRM197 protein nagy mennyiségű expresszióját érjük el az új, pPX 3511-ként jelölt DNS rekombináns plazmid alkalmazásával, amely képes a C.diphtheriae • · · · ·· «··· • ♦ ·

- 8 C7 törzsek olyan törzsekké való transzformálására, amelyek nagy mennyiségű CRM197 proteint termelnek. Az 1. ábrán bemutatott pPX3511 plazmid a diftériatoxinból származatott CRM197 gént tartalmazza (Greenffield és mtársai 1983, Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 80,6853-6857).A plazmid megmaradó része a pNG2-22 anya-plazmidból származik, amelybe a CRM197 gén van inszertálva.

A pPX 3511 plazmidot úgy állítjuk elő, hogy először a CRM197 gént a C.diphtheriae-ból amplifikáljuk polimeráz láncreakcióval (PCR).A CRM197 gént ezután a C.diphtheriae plazmidba klonozzuk, amely szelektálható markert, így például pNG2-t (Schiller és mtársai, 1980, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 18, 814-821) és pNG2-22-t (Serwold-Davis,T.M. és mtársai,1990,FÉM Microbiol.Lett. 66, 119-124) tartalmaz. Mindkét plazmid széles gazda-sávval rendelkezik és képesek alacsony kópiaszámmal (5-10 kópia/sejt) replikálódni minden eddig vizsgált coryneformában.

A pNG2 anya-plazmid természetben előforduló C.diphtheriae plazmid, amelyet eredetileg eritromicin-rezisztens klinikai törzsekből izoláltak. A pNG2 replikációs originje a 2,6kb EcoRI-Clal fragmensen található. Ezt a replikációs origint alkalmazzuk a pNG2-22 jelű klóramfenikol rezisztencia vektor (1. fenti Serwold-Davis hivatkozás) és a pCM 2,6 (Schmidt, 1991, Infect.Immun.,59,1899-1904) megalkotásához.

Az így nyert pPX 3511 plazmiddal ezután a C.diphtheriae C7 törzset elektroporációval transzformáljuk és így lehetővé tesszük, hogy baktérium CRM197 proteint termeljen B197^tox~ fág jelenléte nélkül. Más transzformációs módszerek, így például ···· ·· ···· ·· • · · · · · ··« · ...

• · · · · · • · · · · · · ismert fizikai és kémiai módszerek szintén alkalmazhatók (1.

pl. fenti Serwold-Davis hivatkozás). Ezt a pPX 3511 plazmid alkalmazásával végzett elektrotranszformációs módszert elvégezzük C.diphtheriae C7 (6197)^tox“ szingli lizogén alkalmazásával is a CRM197 mennyiségének növelésére. A transzformások által expresszált CRM197 protein mennyiségét összehasonlítjuk a szingli lizogén C.Diphtheriae C7(6197)^tox_ ATCC No.5328 és a kettős lizogén C.diphtheriae C7(6197)^toxMl, ATCC No.39255 amely nem foglalja magában a pPX 3511 plazmidot - által expresszált CRM197 protein mennyiségével .Megfigyeltük, hogy ha a pPX 3511 plazmidot a C.diphtheriae C7 törzsbe transzferáljuk, a transzformánsok képesek olyan mennyiségű CRM197 proteint expresszálni, amely azonos a C.diphtheriae kettős lizogén törzsekkel nyert mennyiséggel.

A találmány egy másik kiviteli formájánál az új plazmidot módosítjuk, hogy különböző képességű plazmid vektorokat nyerjünk. így például hely-specifikus mutagenézist alkalmazhatunk az egyetlen báziscsere helyreállítására a CRM197 proteinben, így az új plazmid expresszálná a diftériatoxint. Más változtatások is elvégezhetők a klonozott CRM197 gén szekvenciájában, hogy más diftériatoxin CRM proteint,így például a CRM45, CRM30, CRM228 vagy CRM176 proteineket expresszáljón ( Uchida és mtársai, J.Biol.Chem., 248, 3838-3844, 1973).

Rekombináns technika alkalmazásával más változtatások is elvégezhetők a CRM197 diftériatoxin szabályozó és termelő szekvenciájában ezen proteinek termelődésének további fokozása érdekében. így például a tox promoter szakaszt módosíthatjuk úgy, hogy a promoter mentes legyen vas-szabályozástól.

• ··· · ·«· • · · · « · ·· ·· · *·

Egy másik kiviteli formánál a plazmid vektor rendszert módosíthatjuk, a restrikciós enzim kodolóhely bevezetésére a CRM197 gén vagy hasonlóan kodolt diftériatoxin vagy CRM gén amino-terminusába. Más proteinekből származó DNS szekvenciáknak a klonozó helyekbe történő klonozása így megengedné, hogy a plazmid vektor ko-expresszáljón más rekombináns proteineket és antigéneket a CRM197 protein vagy hasonlóan kodolt diftériatoxin vagy CRM protein - amelyek mindegyike a tox promoter és szignál szekvencia irányítása alatt áll - amino-terminusán való fúziókkal. Továbbá, vagy más esetben a klonozó helyek beilleszthetők a CRM197, a diftériatoxin vagy más hasonlóan kodolt CRM protein karboxi-terminális részébe is más proteinek karboxi-terminális fúziókkal való expresszálására. A CRM197 szabályozó szekvencia jelenlétének köszönhetően a kapott fúziós protein a tenyészközegbe szekretálódik. Más esetben, csak a CRM197 szabályozó szignál szekvenciáját szükséges eszközként használni más proteinek tenyészközegbe szekretálodó formáinak expresszálására.

A találmány szerinti plazmidok előállítására alkalmas proteinek és antigének közé tartoznak például a szemcsés antigénekből, például baktériumokból,vírusokból, parazitákból vagy gombákból és sejtek és oldható antigének mikrokomponenseiből, így proteinekből, peptidekből, hormonokból és glükoproteinekből származó antigének. Különösen előnyösek a virális erdetű, gombákból, parazitákból vagy baktériumokból eredeő antigének, allergének, autoimmunitással vagy tumorokkal kapcsolatos antigének. Az antigének nyerhetők természetes forrásokból vagy előállíthatok rekombináns DNS technológiával vagy más • ·· • · · · · · ·· ·· · «♦

- 11 mesterséges utón is.

A felhasználható bakteriális antigének közé tartoznak a humán bakteriális patogénekkel kapcsolatos antigének, amelyek a korlátozás szándéka nélkül lehetnek például a következők: típusos vagy atipusos Haemophilus influenzáé, Escherichia coli, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneuomoniae, Streptococcus pyogenes, Branhamella catarrhalis, Vibrio cholerae, Neisseria gonorrhoeae, Bordetella pertussis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae és Clostridium tetani. Bizonoy specifikus bakteriális antigének tartalmaznak bakteriális felület és külső memebrán proteineket is (pl.Haemophilus influenzáé,Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae vagy Branhamella catarrhalis ) és bakteriális felületi proteineket (pl. a Streptococcus pyogenes M proteinje vagy a Streptococcus pneuomoniae 37 kdaltonos felüketi proteinje).

A patogén vírusokból származó virális antigének közé tartoznak a korlátozás szándéka pl. a következők: humán immunhiány vírus (I ésll típusok), humán T-sejt leukémia vírus I,II és III típusok), légzési syncytialis vírus, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, nem-A és nem-B hepatitis vírus, herpes simplex vírus ( I ésll tipusosk), citomegalovírus, influenza vírus, parainfluenza vírus, poliovírus, rotavírus, koronavírus, rubeola vírus, kanyaró vírus, bárányhimlő vírus, Epstein Barr vírus, adenovírus, papilloma vírus és sárgaláz vírus.

Ezen patogén vírusok közül néhány specifikus virális antigén tartalmazza a légzési syncytiális vírus ( RSV) F proteinjét (különösen F 283-315 pepiidet tartalmazó antigéneket • ·· • · «

11« ····«> · ·· ·· 4 «·

- 12 ismertetnek a W089/02935 számú, Respiratory Syncytial Vírus : Vaccines and Diagnostic Assays c. publikált szabadalmi bejelentésben) , N és G proteinjeit, a rotavírus VP4 (korábban VP3ként ismert), VP6 és VP7 polipeptidjeit, a humán immunhiány vírus burkoló glükoproteinjeit és a hepatitis prefelületi antigénjeit és a herpes B és D glükoproteineket.

Fungalis antigének származtathatók például a következő gombákból : Candida spp.( különösen albicans), Cryptococcus spp. ( különösen neoformans), Blastomyces spp. ( pl. dermatitidis), Histoplasma spp. (különösen capsulatum), Coccidroides spp. ( különösen immitis), Paracoccidroides spp. ( különösen brasiliensis) és Aspergillus spp. A parazita antigének közé tartoznak például a korlátozás szándéka nélkül a következők : Plasmodium spp., Eimeria spp., Schistosoma spp., Trypanosoma spp., Babesia spp., Leishmania spp., Cryptosporidia spp., Toxoplasma spp. és Pneumocytstis spp.

A találmányt közelebbről a következő nem-korlátozó példákkal illusztráljuk.

1. példa

Kons truktumok

Bakteriális törzsek

Minden klonozó művelethez E.coli DH5a (BRL,Gaithersburg,MD) törzset alkalmaztunk. Nem-toxikus, nem-lizogén C.diphtheriae C7(_)tox- ATCC5328 törzseket és nem-toxikus, szingli lizogén

C. diphtheriae C7(B198)^tox“ ATCC 5328 törzseket alkalmaztunk mind plazmid gazdaként mind kontrollként a CRM197 protein ex- • « « · 4 • *·· · ««« * · · · · « • * ·· 4 4 ·

- 13 pressziós vizsgálatoknál. A nem-toxikus, kettős lizogén C.diphtheriae C7(B197)tox- ATCC 39255 törzset alkalmaztuk kontrollként a CRM197 protein expressziós kísérleteknél.

Tenyésztés közege és körülményei

Az E.coli DH5a törzset rutinszerűen növesztettük szuper optimális húsleves (SOB) agar médiumon és SOB folyadékban 37°C hőmérsékleten (Sambrook,J. és mtársai,1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,NY). A C.diphtheriae C7 törzseket rutinszerűen tenyésztettük SOC agaron (1. Sambrook féle fenti hivatkozást) és folyadékon. ET ozmotikus agar közeget (Best,G.R. és M.L: Britz, 1986, Appl.Microbiol.Biotech. 23, 288-293) alkalmaztunk amikor az elektroporált sejtek lemeztenyésztését végeztük. Késleltetett CY tápközeget (Rappuoli,R.és mtársai,1983, J.bacteriol.,153, 1202) alkalmaztunk a CEM197 expressziót is magában foglaló kísérleteknél. 34μg/ml kloramfenikolt adagoltunk a pPX 3511 plazmidot tartalmazó E.coli DH5a és 2^g/ml-t a C.diphtheriae C7 törzsekhez.

A CRM197 gén klonozása

A CRM197 gént PCR ( polimeráz láncreakció) eljárással klonoztuk a C.diphtheriae C7 (B197)^^OX“ szingli lizogén DNS génszekvencia amplifikációjával oligonukleotid primerek alkalmazásával a diftériatoxin publikált szekvenciája alapján (Greenfield, L. és mtársai, 1983, Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80, 6853-6857) . A primereket úgy terveztük, hogy az egyik primer hozza létre az Sall/HincII restrikciós helyet a funkcionális gén kezdeténél és a másik az Xbal helyet a szerkezeti gén gén stop kodonja után. Ezeket és más hasonló primereket alkalmaz• * · · · · ··· · ·«« « · 4 · · · ·· ·· 4 ·4 tünk a CRM197 gén, a diftériatoxin gén vagy bármilyen más, a korinefág R által kodolt, a diftériatoxinhoz hasonló gén amplifikálására és klónozására.

A CRM197 PCR termékeket HincII-vel és Xbal-gyel emésztjük és Smal/Xbal-gyel emésztett pNG2-22 plazmidba ligáijuk, ami egy széles gazda-spektrumú kloramfenikol rezisztencia vektor olyan képességgel, hogy mind az Escherichia coli -bán mind a Corynebacterium spp-ben replikálódni képes. A ligátumot alkalmazzuk az E.coli DH5a törzs transzformálására és a rekombináns kolóniákat restrikciós analízissel szkrineljük a CRM197 gén jelenlétére. Az egyik izolátumot, a pPX 3511 plazmidot szekvenáljuk átlapoló primerek alkalmazásával annak ellenőrzésére, hogy van e bármilyen változás a CRM197 génben. A PCRnél valamint a szekvenálásnál alkalmazott oligonukleotid printereket Applied Biosystems 380B DNS szintetizátoron állítjuk elő. A PCR-t Perkin-Elmer Cetus DNS Thermal Cycler berendezéssel végezzük. A szekvenálást Applied Biosystem Sequencer 373A berendezéssel végezzük. A kapott plazmidot (pPX 3511) elektroporációval transzformáljuk nem-toxikus, nem-lizogén C.diphtheriae C7(-)^^ox“ törzsbe és nem-toxikus C.diphtheriae C7 (5197)^tox_, ATCC 5328 törzsbe.

C.diphtheriae C7 elektroporációja

A C.diphtheriae C7 törzset a pPX 3511 plazmid DNS-sel transzforrnáljuk elektroporációval a Corynebacterium glutamicun és Brevibacterium lactofermentum transzformálására kifejlesztett módszerek szerint ( Hayes, J.A. és M.L. Britz, 1989, FEMS Microbiol.Lett. 61, 329-334), kivéve, hogy 0,2% Tween-80-nal kiegészített SOC tápközeget alkalmaztunk. Az elektroporációt

BTX Transfector 100, Power Plus és Optimizor Graphic Pulse Analyzer és lmm-es küvetta alkalmazásával végeztük. A pPX 3511 plazmid jelenlétét a transzformált C.diphthriae C7 törzsekben plazmid-kimentéssel és restrikciós analízissel ellenőriztük.

2. példa

Expresszió Kvantitatív CRM197 expresszié vizsgálatok

A CRM197 termeléseket hasonlítottuk össze, úgy hogy C. diphtheriae C7 törzseket növesztettünk azonos körülmények között és összehasonlítottuk a tenyészet felülúszójában a kapott CRM proteinek mennyiségét. A törzsek kvantitatív összehasonlításánál 4 ml egyéjszakás tenyészetet hígítottunk ^od600⁼°í¹ értékre késleltetett CY tápközegben (30 ml végső térfogat 250 ml-es Erlenmeyer lombikban) és rázótenyésztéssel tenyésztettük 20 órán át 37°C-on. A pPX 3511 plazmidot tartalmazó törzseket antibiotikus szelekcióval és anélkül is (2 Mg/ml kloramfenikol) tenyésztettük. Inkubálás után a tenyészeteket centrifugáltuk a sejtek ektávolítására és a tenyészet felülúszóját 12%-os SDS-PAGE gélre vittük. A gélt coomassie-vel festettük és kvantitatív összehasonlítást végeztünk Bio-Rad Model 1650 Transmittance/Reflectance Scanning Densitometer és Hoefer Scientific GS 370 Analysis Package alkalmazásával. A rekombináns CRM197 protein és a lizogén B197^^OX” CRM197 protein antigén tulajdonságainak összehasonlítását a gél immunoblottingolásával és a CRM197 proteinnel szembeni monoklon antitesttel való próbával végeztük. A pPX 3511 plazmid által termelt CRM197 antigén tulajdonságait tekintve azonos a lizogén törzsek által termelt CRM197 proteinével.

pPX 3511 plazmid stabilitási vizsgálatai

A pPX 3511 plazmid stabilitását kloramfenikol rezisztencia megmaradásának vizsgálatával tanulmányoztuk, amely a plazmid retencióját indikálja antibiotikus szelekció nélkül. C. diphtheriae C7 (B197)^tox“ pPX3511 tenyészeteket növesztettünk SOC húsleves tápközegben - a sejtek csomósodásának megakadályozására 01% Tween-80-nal kiegészítve - 18 órán át (14-17 generáció) 37°C-on. A tenyészeteket ezután SOC agaron lemeztenyésztettük a kolóniaszám meghatározására és a következő generációhoz 1/10 -es hígítást végeztünk. Az SOC agar lemeztenyészeteket SOC agar 2Mg/ml kloramfenikolra replikáztuk és számoltuk a kloramfenikol rezisztenciát megtartó kolóniák százalékos arányát. Ezt a műveleltet ismételtük 60 generáción keresztül.

3.példa

Biológiai eredmények

A különböző C.diphtheriae törzsekből termelt CRM197 proteinek kvantitatív összehasonlítása, amelyet a coomassiefestett gélek denzitometriás vizsgálatával végeztünk (2. ábra), azt mutatja, hogy a pPX 3511 plazmidot tartalmazó törzsek 2x-es mennyiségű CRM197 proteint termelnek mint a szingli lizogének és ugyanannyit mint a kettős lizogének (1.1. táblázat). A pPX3511 plazmid stabilitását 60 generáción át a 3. ábrán mutatj uk be.

1.táblázat

C.diphtheriae C7 törzsek által termelt CRM197 protein mennyiségének aránya a szingli lizogén (8197)^tox_ áltermelt protein mennyiségéhez viszonyítva

Arány a szingli lizogénhez viszonyítva

Kettős lizogén (8197)tox”	2,2
pPX 3511(-)tox“ no, Cm2	2,8
pPX 3511(-)tox“, Cm2	1,9
pPX 3511(8197)tox-,no, Cm2	2,0
pPX 3511(8197)tox~, Cm2	2,4

Biológiai deponálás

A pPX 3511 plazmidot a Budapesti Egyezmény értelmében az American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 intézménynél 1993. február 12-én, ATCC 75415 szám alatt deponáltuk.Minden korlátozás a hozzáférhetőségre vonatkozóan megszűnik a szabadalom engedélyezésével a jelen bejelentésre. A deponálás érvényessége 30 év a deponálás napjától számítva vagy a szabadalom érvényességi ideje vagy még öt év attól a naptól számolva, amikor az utolsó mintát kérték a biológiai anyagból, ezek közül a leghosszabb. A deponálást megismétlik, ha az anyag életképessége megszűnik vagy ha nemreplikálható.

A szakember számára nyilvánvaló, hogy rutinkisérletekkel a bemutatott formáktól eltérő megvalósítási formákat is létrehozzon és nyilvánvaló, hogy ezek is a találmány oltalmi körébe tartoznak.

Claims (10)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Eljárás diftériatoxinnal keresztreakcióra képes diftériatoxin vagy CRM proteinek előállítására azzal jellemzve, hogy egy Corynebacterium fajhoz tartozó valamely mikroorganizmust egy plazmiddal transzforrnálünk, amely a következőket tartalmazza : a) a diftériatoxint vagy CRM proteint expresszáló gént, b) egy Corynebacterium replikációs origint, és c) egy szelektálható marker gént, majd az említett toxint vagy proteint a gén expresszáláshoz megfelelő körülmények között expresszáljuk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemzve, hogy a transzformálást elektroporációval végezzük.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemzve, hogy mikroorganizmusként Corynebacterium diphtheriae-t alkalmazunk.
4. 4. A 3.igénypont szerinti eljárás azzal jellemzve, hogy Corynebacterium diphtheriae törzsként C7 törzset alkalmazunk.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemzve, hogy CRM génként CRM197, CRM45, CRM30, CRM228 vagy CRM176 gént alkalmazunk.
6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemzve, hogy a replikációs origint a pNG2 Corynebacterium plazmidból származtatjuk.
7. 7. Plazmid a diftériatoxinnal keresztreakcióra képes diftériatoxin vagy CRM protein expresszálásához valamely gazdaszervezetben, amely a következőket tartalmazza:

   a) a diftériatoxint vagy CRM proteint kodoló gént,

   b) egy Corynebacterium replikációs origint,

   c) egy szelektálható markert, adott esetben a többszörös klonozó helyhez kapcsolva.
8. 8. A 7. igénypont szerinti plazmid, amelyben a proteint kodoló gén működőképesen kapcsolódik egy egy vagy több proteint, peptidet vagy ezek epitópját kodoló nukleotid s z ekvenc i áho z.
9. 9. A pPX 3511, ATCC No. 75415 plazmid.
10. 10. A Corynebacterium fajhoz tartozó mikroorganizmus, amely a 7. igénypont szerinti plazmiddal van transzformálva.