FI112090B - Menetelmä, plasmidi ja mikro-organismi difteriatoksiinin tai sen kanssa ristireagoivan CRM-proteiinin tuottamiseksi - Google Patents

Menetelmä, plasmidi ja mikro-organismi difteriatoksiinin tai sen kanssa ristireagoivan CRM-proteiinin tuottamiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI112090B
FI112090B FI941050A FI941050A FI112090B FI 112090 B FI112090 B FI 112090B FI 941050 A FI941050 A FI 941050A FI 941050 A FI941050 A FI 941050A FI 112090 B FI112090 B FI 112090B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
plasmid
diphtheria toxin
crm197
gene
protein
Prior art date
Application number
FI941050A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI941050A (fi
FI941050A0 (fi
Inventor
Benjamin J Metcalf
Original Assignee
Wyeth Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wyeth Corp filed Critical Wyeth Corp
Publication of FI941050A0 publication Critical patent/FI941050A0/fi
Publication of FI941050A publication Critical patent/FI941050A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI112090B publication Critical patent/FI112090B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

112090
Menetelmä, plasmidi ja mikro-organismi difteriatoksiinin tai sen kanssa ristireagoivan CRM-proteiinin tuottamiseksi
Tausta 5 CRM197-proteiini on difteriatoksiinin ei-toksinen muoto, mutta se ei ole immunologisesti erotettavissa difteriatoksiinista. CRM197:ää tuottaa C. diphtheriae, joka on infektoitu ei - toksigeenisella faagilla ,Sl97tox'; joka on tehty toksigeenisen korynefaagi /3: n nitrosoguanidiinimuta-10 geneesilla (Uchida, T. et ai., Nature New Biology 233 (1971) 8 - 11). CRM197-proteiinilla on sama molekyylipaino kuin difteriatoksiinilla, mutta se eroaa siitä rakenne-geenissä olevan yhden emäksen muutoksen verran (guaniinin muutos adeniiniksi). Tämä yhden emäksen muutos aiheuttaa 15 aminohapon korvautumisen (glysiini glutamiinihapolla) kypsässä proteiinissa ja poistaa difteriatoksiinin toksiset ominaisuudet. CRM197-proteiini on turvallinen ja tehokas T-solusta riippuvainen sakkaridien kantaja ja sitä käytetään nykyisin Haemophilus influenzae tyyppi b -oligosakka-20 ridin CRM197 konjugaatti -rokotteessa (HibTiter™; Lederle Praxis Biologicals, Rochester, N. Y.).
: Huomattavien CRM197-proteiinimäärien tuottaminen » > · ,···. rokotustarkoituksiin on estynyt alhaisen proteiinituoton • t 'takia. On kehitetty tekniikoita tukemaan CRM-proteiinien • · , 25 tuotantoa käyttämällä ei-toksigeenisen korynefaagi /3197 :n *;;; kaksoislysogeeneja (Rappuoli, R., Applied Env. Microbio.
*·* * 46 (1983) 560 - 564; US-patenttijulkaisu 4 925 792, myönnetty R. Rappuolille; ja Rappuoli, R. , J. Bacteriol. 153 • *.·* (1983) 1202 - 1210) . Rappuoli raportoi kaksoislysogeenien • tt<! 30 CRM197-saantoja jopa kolme kertaa suuremmiksi kuin yksin- kertaisten lysogeenien. CRM197:n tuottotasot yksinkertai-silla lysogeeneilla ovat riittäviä mutta eivät taloudelli-sesti tyydyttäviä sellaisten rokotteiden tuottamiseen, joissa käytetään CRM197-proteiinia.
35 Korynofaagi β:η moninkertaisten lysogeenien viemi nen Corynebacterium diphtheriae1 n on työläs seulontamene- 2 112090 telmä niiden kantojen identifioimiseksi, jotka kykenevät tuottamaan ylimäärin CRM197-proteiinia, difteriatoksiinia tai muita CRM-proteiineja, jotka ristireagoivat difteriatoksiinin kanssa. Lisäksi tämän menetelmän kyky manipu-5 loida proteiinin ekspressiota standardeja geenitekniikoita käyttäen on rajoittunut. Sen vuoksi olisi hyödyllistä kehittää menetelmä, joka voi tuottaa huomattavia määriä difteriatoksiinia ja CRM-proteiineja lisäämällä geenin kopio-lukua käyttämättä korynefaagi /3:aa; tai lisäämällä näiden 10 proteiinien tuotantotasoja korynefaagi β-.lle lysogeenisis-tä kannoista.
Keksinnön yhteenveto
Keksintö koskee uutta menetelmää ja plasmidijärjestelmää CRM197:ää, difteriatoksiinia ja muita difteri-15 atoksiinigeenistä johdettuja CRM-proteiineja koodaavan geenin manipuloimiseksi ja viemiseksi siihen sekä näillä järjestelmillä transformoituja mikro-organismeja.
Tarkemmin keksintö koskee menetelmää difteriatoksiinin tai difteriatoksiinin kanssa ristireagoivan CRM-20 proteiinin tuottamiseksi, plasmidia difteriatoksiinin tai difteriatoksiinin kanssa ristireagoivan CRM-proteiinin ekspressoimiseksi isännässä ja lajin Corynebacterium diph-,··*, theriae kannan C7 mikro-organismi. Keksinnön mukaiselle " . menetelmälle on tunnusomaista, se mitä patenttivaatimuk- 25 sessa 1 sanotaan. Keksinnön mukaiselle plasmidille on tun-·;; nusomaista se, mitä patenttivaatimuksissa 4 ja 6 sanotaan.
"·’ * Keksinnön mukaiselle mikro-organismille on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 7 sanotaan, i *,· Kuvataan erittäin edullinen DNA-plasmidi, joka on 30 nimetty pPX 3511 :ksi ja joka yhdistää ei-toksigeenisen β-faagin CRM197-geenin ja plasmidin pNG2-22. Uusi plasmidi-
I I I
järjestelmä kykenee transformoimaan Corynebacterium dipht-"* heriae -kantoja kannoiksi, jotka voivat ekspressoida suu- ria määriä CRM197-proteiinia käyttämättä moninkertaisia • · · 35 lysogeeneja. Keksintö tarjoaa erinomaisen keinon CRM197:n, difteriatoksiinin ja muiden difteriatoksiinigeenistä joh- 3 112090 dettujen CRM-proteiinien proteiiniekspression kasvattamiseksi. Geeniekspressiota voidaan myös manipuloida lisäämällä promoottorin voimakkuutta tai poistamalla promoottori raudansäätelystä. Edullisissa suoritusmuodoissa plasmi-5 dijärjestelmää voidaan käyttää ekspressoimaan muita proteiineja geenifuusioina CRM197:n, difteriatoksiinin tai muiden difteriatoksiinigeenistä johdettujen CRM-proteiinien kanssa. Säätelevää ja tuottavaa sekvenssiä CRM197:stä, difteriatoksiinista tai muista difteriageenistä johdetuis-10 ta CRM-proteiineista voidaan käyttää ekspressoimaan vieraita proteiineja Corynebacterium-lajeissa.
Kuvioiden lyhyt kuvaus
Kuviossa 1 on rekombinantti DNA-plasmidi, nimeltään pPX 3511, joka sisältää CRM197-geenin, monikloonaus-15 kohdan, joka on peräisin E. colin kloonausvektorista pUC 18, joka sisältää kloramfenikoliresistenssi(CmR) -markke-rin ja replikaation aloituskohdan, joka on peräisin pNG2-22-plasmidista (Serwold-Davis, T. M. et ai., FEM Microbiol. Lett. 66 (1990) 119 - 124).
20 Kuviossa 2 on 12-%:inen SDS-PAGE-geeli, joka osoittaa CRM197:n (61,8 kilodaltonia) tuotannon erilaisis- ; .·. ta CL_ diphtheriae C7 -kannoista. Sarake A: molekyylipai- • · · noitaan korkeat standardit (BRL, 200 - 14,3 kilodaltonia); • ·
Sarake B: yksinkertainen lysogeeni C 7 (/3197)tox’; Sarake C: 25 kaksinkertainen lysogeeni C7 (/3197) tox~; Sarake D: ei-lyso- ··’ geeninen C7(-)tox", jossa pPX 3511, joka on kasvatettu il- '·’ ' man kloramfenikolia (Cm2) (2 /xg/ml) ; Sarake E: ei-lyso- geeninen C7()tox", jossa pPX 3511, joka on kasvatettu klo-
• · I
• V ramfenikolin kanssa (2 μ$/ττ\1) ; Sarake F; yksinkertainen :>(i: 30 lysogeeni C7 (/3197)tox', jossa pPX 3511, joka on kasvatettu .·!·, ilman kloramfenikolia (2 μg/ml); Sarake G: yksinkertainen lysogeeni C7 (/3197)tox", joka on kasvatettu kloramfenikolis-sa (2 Mg/ml) .
Kuviossa 3 nähdään pPX 3511 -plasmidin stabiili-' 35 suus C. diphtheriae C7 (/3197) tox~: ssa käyttämällä kloram- 4 112090 fenikoliresistenssiä indikaattorina plasmidin retentiolle ilman antibioottiselektiota.
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus
Keksintö koskee uutta menetelmää ja plasmidijär-5 jestelmää difteriatoksiinin, CRM197:n ja muiden difteri-atoksiinigeenistä johdettujen CRM-proteiinien tuottamiseksi sellaisia määriä, jotka ovat riittäviä käytettäväksi rokotteissa ja muissa käyttötarkoituksissa, joissa tarvitaan riittäviä, toimivia määriä näitä proteiineja. Plasmi-10 dijärjestelmä tarjoaa tehokkaan keinon difteriatoksiini- geenin tai CRM-geenin viemiselle ja kopioluvun lisäämiselle Corynebacterium-lajeilla. Plasmidissa on oma itsenäinen episomi, jolla on omat replikaatiofunktionsa, mikä aiheuttaa sen, että plasmidi voi viedä ylimääräisiä kopioita 15 difteriatoksiini- tai CRM-geeniä isäntäkantoihin, jotka eivät kykene tällaiseen integraatioon tai joita ei ennen ole infektoitu /3l97tox‘-faagilla. Esimerkiksi esillä olevan keksinnön mukaisen plasmidin sisältämien Corynebacterium-lajien tuottamat CRM197-proteiinitasot ovat verrattavissa, 20 elleivät parempia, kuin CRM-proteiinisaannot, ekspressoi- dut C. diphtheriae1 n monilysogeeneillä, jotka on infektoi-: tu korynefaagi /3l97tox’: 11a .
·· Tämän keksinnön mukaiset tuottotasoltaan korkeat * · plasmidit sisältävät geenin, joka koodaa difteriatoksiinia i · , 25 tai CRM-proteiinia mukaan lukien sen promoottorin ja sää- ;;; telysignaalisekvenssin, Corynebacter ium1 n replikaation ’·’ ' aloituskohdan, sellaisen, että tuloksena syntyvä plasmidi voidaan viedä Corynebacterium-laj eihin, ja selektiivisen • *.· markkerin, joka mahdollisesti liitetään monikloonauskoh- !(i>! 30 taan. Tätä plasmidia käytetään Corynebacterium-laj ien, ja ,·*·, erityisesti Corynebacter ium diphtheriae -lajin mikro-orga- ... nismien transformoimiseksi, olosuhteissa, jotka ovat riit- T täviä helpottamaan difteriatoksiini- tai CRM-geenin eks- pressiota. Sopivat kasvuolosuhteet ovat ilman muuta ilmei-.* ί 35 siä alan ammattimiehelle isäntäorganismista riippuen. Esimerkiksi optimaaliselle CRM197.-n, difteriatoksiinin tai 5 112090 muiden CRM-proteiinien tuotannolle Corynebacterium-lajeis-sa on välttämätöntä pitää mikro-organismi rautapitoisuudeltaan matalassa alustassa tai alustassa, josta rauta on poistettu.
5 Plasmidi sisältää geenin, joka koodaa difteriatok siinia tai CRM-proteiinia, joka on johdettu difteriatok-siinigeenistä. Esimerkkejä CRM-proteiineista, ts. Cross-Reacting Materials -proteiineista, jotka immunologisesti ristireagoivat difteriatoksiinin kanssa, joita voidaan 10 käyttää tämän keksinnön plasmidirakennelmissa, ovat, näihin rajoittumatta, CRM197, CRM45, CRM30, CRM228 ja CRM176. Geeni, joka koodaa CRM197-proteiinia, on peräisin difteriatoksiinista (DT), jonka sekvenssin on julkaissut Greenfield et ai. (Greenfield, L. et ai., Proc. Natl. Acad. 15 Sei. USA 80 (1983) 6853 - 6857). Ero DT-geenin ja CRM197- geenin välillä on yhden emäksen muutos rakennegeenissä. Uchida, T. et ai. (J. Biol. Chem. 248 (1975) 3838 - 3844) on julkaissut joidenkin CRM-geenien nukleotidisekvenssit. Koko CRM-geeni, sen säätelysignaalisekvenssi mukaan luet-20 tuna, voidaan tuottaa polymeraasiketjureaktiolla (PCR). Muita amplifiointitekniikoita tai synteettisiä tekniikoita I > · : .·. voidaan käyttää CRM197-geenin tai muiden CRM-geenien tuot- ···’ tamiseksi.
• · • ·
Difteriatoksiinia ja CRM-proteiinia koodaavan gee-25 nin säätelysignaalisekvenssi aiheuttaa sen, että proteiini * i · ···· erittyy kasvatusalustaan. Näin erittyvä proteiini voidaan i » i '·’ ’ saada talteen kasvatusalustasta ja puhdistaa tunnettuja tekniikoita, kuten suolasaostusta ja pylväskromatografiaa, « ♦ * • V käyttäen.
* · ·
; 30 Monikloonauskohta on edullisesti peräisin pUC
18:sta, mutta muista lähteistä peräisin olevia monikloo- • · · .*,! nauskohtia voidaan käyttää, esimerkiksi pBluescript: iä tai • » muita synteettisiä monikloonauskohtia. Vaihtoehtoisesti monikloonauskohta voidaan poistaa kokonaan vaikuttamatta : : 35 plasmidin operoitavuuteen. Kummassakin tapauksessa selek tiivinen markkeri inkorporoidaan plasmidiin. Mitä tahansa 6 112090 antibioottiresistenssimarkkeria voidaan käyttää selektiivisenä markkerina, kuten ampisilliinia, erytromysiinia, kloramfenikolia, kanamysiiniä, näihin kuitenkaan rajoittumatta. Ensin testataan korynebakteerin herkkyys valitta-5 valle antibiootille. Kloramfenikoli on edullinen, mikäli ekspressoituvia proteiineja on tarkoitus käyttää ihmisille, koska elintarvike- ja lääkehallitus (Food and Drug Administration) on hyväksynyt kloramfenikolin tällaiseen tarkoitukseen. Muita plasmidiselektiomenetelmiä, kuten 10 raskasmetalliresistenssiä ja ravinnevaatimuksia, voidaan käyttää vaihtoehtoina antibioottiresistenssimarkkereille.
Replikaation aloituskohdat, joka ovat edullisia rakennettaessa tämän keksinnön mukaisia suurituottoisia plasmideja, ovat peräisin Corynebacterium-lajeista. pPX 15 3511:een valitun replikaation aloituskohta on peräisin Co rynebacterium diphtheriae1sta. Katso esimerkit. Muita Co-rynebacter-aloituskohtia voidaan käyttää.
Edullisessa suoritusmuodossa CRM197-proteiinin korkea ekspressiotaso saavutetaan käyttämällä uutta rekom-20 binanttia DNA-plasmidia, joka on nimetty pPX 3511:ksi ja joka voi transformoida C. diphtheriae C7 -kantoja kannoik-: si, jotka tuottavat suuria määriä CRM197-proteiinia. Plas- ]···’ midi pPX 3511, joka nähdään kuviossa 1, sisältää CRM197- geenin, joka on peräisin difteriatoksiinista. (Greenfield, • « * · · 25 L. et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80 (1983) 6853 - ·;;; 6857) . Plasmidin jäljelle jäävä osa on johdettu kantaplas- '·’ ’ midista pNG2-22:sta, johon CRM197-geeni on pantu sisään.
Plasmidi pPX 3511 tuotetaan ensin amplifioimalla • V C. diphtheriae1 n CRM197-geeniä polymeraasiketjureaktiolla : : 30 (PCR). CRM197-geeni kloonataan sen jälkeen C. diphtheriae t·’., -plasmidiin, joka sisältää selektiivisen markkerin, kuten !.! pNG2:n (Schiller, J. et ai., Antimicrobial Agents and Che- > · *” motherapy 18 (1980) 814 - 821) ja pNG2-22:n (Serwold- ,7 Davis, T. M. et ai., FEM Microbiol. Lett. 66 (1990) 119 - : 35 124) . Näillä molemmilla plasmideilla on laaja isäntävali- koima, ja ne voivat replikoida matalalla kopioluvulla (5 - 7 112090 10 kopiota/solu) kaikissa tähän asti testatuissa koryne-muodoissa.
Kantaplasmidi pNG2 on luonnollinen C. diphtheriae -plasmidi, joka eristettiin alunperin erytromysiiniresis-5 tentistä kliinisestä kannasta. pNG2:n replikaation aloituskohta sisältyy 2,6 kiloemäksen EcoRI-Clal-fragmenttiin. Tätä replikaation aloituskohtaa on käytetty luomaan klo-ramfenikoliresistenttivektori nimeltään pNG2-22 (Serwold-Davis et ai., ibid.) ja pCM 2,6 (Schmit, Infect. Immun. 59 10 (1991) 1899 - 1904).
C. diphtheriae C7 -kanta transformoidaan sen jälkeen tuloksena olevalla plasmidilla, pPX 3511:llä, elekt-roporaation avulla, jolloin bakteeri kykenee tuottamaan CRM197: ää ilman faagi /3l97tox~:n läsnäoloa. Muita transfor-15 maatiotekniikoita, kuten tunnettuja fysikaalisia ja kemi
allisia tapoja (Serwold-Davis et ai., ibid.), voidaan käyttää. Tämä tekniikka, elektrotransformaatio pPX
3511:llä, suoritetaan myös käyttämällä C. diphtheriae C7 (/3197) tox‘: ta, yksinkertaista lysogeenia, lisäämään CRM197-20 proteiinin tuotantotasoa. Transformanttien ekspressoimia CRM197-proteiinitasoja verrataan yksinkertaisen lysogeenin I C. diphtheriae C7 (/3197)tox":n, ATCC No 5388, ja kaksinker-
.*··. täisen lysogeenin C. diphtheriae C7 (,6197)tox’ Ml:n, ATCC
i i>; No 39 255, jotka eivät sisällä pPX 3511 -plasmidia, eks- i · 25 pressiotasoihin. Havaitaan että, kun plasmidi pPX 3511 transfektoidaan C. diphtheriae C7 -kantaan, transformantit φ · · ’·’ * voivat ekspressoida CRM197:ää määriä, jotka vastaavat C.
diphtheriae -kaksoislysogeenikantoja.
: ’.· Muissa keksinnön suoritusmuodoissa uusi plasmidi- • * * yj 30 vektori modifioidaan aikaansaamaan sarjan erilaisia plas-midivektoreita, joilla on erilaisia kykyjä. Voidaan esi- # i » merkiksi käyttää kohdennettua mutageneesiä korjaamaan yh- • φ den emäksen muutos CRM197:ssä, siten että uusi plasmidi ekspressoisi difteriatoksiinia. Muita muutoksia voidaan 35 tehdä kloonattuun CRM197-geenisekvenssiin siten, että se ekspressoi muita tunnettuja difteriatoksiini-CRM-proteii- 8 112090 neja, kuten CRM45:ää, CRM30:a, CRM228:aa ja CRM176:ta (Uc-hida, T. et ai., J. Biol. Chem. 248 (1973) 3838 - 3844).
Rekombinantti-DNA-tekniikoita käyttäen difteriat-oksii nin CRM197:n säätely- ja tuottosekvensseihin tai 5 muihin samalla tavoin kloonattuihin difteriatoksiini- tai CRM-geeneihin tehtyjä muutoksia voidaan käyttää edelleen näiden proteiinien tuotannon lisäämiseksi. Esimerkiksi tox-promoottorialuetta voidaan modifioida siten, että promoottori vapautuu raudan säätelystä.
10 Eräässä suoritusmuodossa plasmidivektorijärjestel- mä voidaan modifioida siten, että restriktioentsyymin kloonauskohdat viedään CRM197-geenin tai vastaavasti kloonatun difteriatoksiini- tai CRM-geenin aminopäähän. Muista proteiineista peräisin olevien DNA-sekvenssien kloonaus 15 kloonauskohtiin aiheuttaisi sen, että plasmidivektori eks-pressoisi samalla muita rekombinanttiproteiineja tai antigeenejä aminoterminaalisina fuusioina CRM197-proteiinin tai samalla tavoin kloonatun difteriatoksiinin tai CRM-proteiinin kanssa, kaikkien ollessa tox-promoottorin ja 20 -signaalisekvenssin ohjauksen alaisina. Lisäksi tai vaih-toehtoisesti kloonauskohdat voidaan viedä CRM197:n, difte-: .·. riatoksiinin tai vastaavasti kloonatun CRM:n karboksiter- * » i
* » » I
,···. minaaliosaan, muiden proteiinien ekspressoimiseksi karbok- * · siterminaalisina fuusioina. CRM197-säätelysignaalisekvens- • · . 25 sin läsnäolon vuoksi tuloksena syntyvä fuusioproteiini *;;; erittyisi kasvatusalustaan. Vaihtoehtoisesti tarvitsee • · · '·’ ‘ käyttää vain CRM197:n säätelysignaalisekvenssiä muiden proteiinien erittyvien muotojen ekspressoimiseksi kasva-: V tusalustaan.
·,,,· 30 Keksinnön mukaiselle tuottoplasmidille sopivia proteiineja ja antigeenejä ovat tietyt antigeenit, kuten **· f...t bakteeri-, virus-, parasiitti- ja sieniperäiset ja solujen * · mikrokomponentit ja liukoiset antigeenit, kuten proteii-nit, peptidit, hormonit ja glykoproteiinit. Erityisen mie-35 lenkiintoisia antigeenejä ovat virus-, sieni-, parasiitti-ja bakteeriantigeenit, allergeenit, autoimmuniteettiin 9 112090 liittyvät antigeenit tai kasvaimeen assosioituneet antigeenit. Antigeenit voidaan saada luonnosta, tai ne voidaan tuottaa rekombinantti-DNA-teknologialla tai muilla synteettisillä tavoilla.
5 Mielenkiintoisia bakteeriantigeeneja ovat ihmisen bakteeripatogeeneihin assosioituneet antigeenit, mukaan lukien mutta ei näihin rajoittuen esimerkiksi, tyypitettävissä oleva ja ei-tyypitettävissä oleva Haemophilus influenzae, Escherichia cold., Neisseria meningitidis, Strep-10 tococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Branhamella catarrhalis, Vibrio cholerae, Neisseria gonorrhoeae, Bor-detella pertussis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae ja Clostridium tetani. Jotkut spesifiset bakteeriantigeenit sisältävät bakteerin 15 pinta- ja ulkomembraaniproteiineja (esim. Haemophilus influenzae 1 n, Neisseria meningitidis1 n, Neisseria gonorrhoeae 1 n tai Branhamella catarrhalis1 n antigeeni) ja bakteerin pintaproteiineja (esim. Streptococcus pyogenes1 n M-proteiini tai Streptococcus pneumoniae1 n 37 kilodaltonin 20 pintaproteiini).
; Patogeenisten virusten virusantigeeneja ovat, mut- : ta eivät näihin rajoitu, ihmisen immuunipuutosvirus (tyy- .··*, pit I ja II, ihmisen T-soluleukemiavirus (tyypit I, II ja
Ill), "respiratory syncytial" -virus, hepatiitti A, hepa- • · 25 tiitti B, hepatiitti C, non-A- ja non-B-hepatiittivirus, *;;; herpes simplex -virus (tyypit I ja II) , sytomega 1 ovirus, • · · ’·' ’ influenssavirus, parainfluenssavirus, poliovirus, rotavi rus, koronavirus, rubellavirus, tuhkarokkovirus, vesirok-i kovirus, Epstein Barr -virus, adenovirus, papillomavirus 3 0 ja keltakuumevirus.
Näiden patogeenisten virusten monia spesifisiä vi- • * » rusantigeene j a ovat F-proteiini (erityisesti antigeenit, jotka sisältävät F-peptidin 283 - 315, kuvattu julkaisussa WO89/02 935, jonka otsikko on "Respiratory Syncytial Vi-35 rus: Vaccines and Diagnostic Assays" ja kirjoittajat Para-diso, P. et ai.) ja "respiratory syncytial" -viruksen
!o 11209G
(RSV) N- ja G-proteiinit, rotaviruksen polypeptidit VP4 (tunnettu ennen VP3:na), VP6 ja VP7, ihmisen immuunipuu-tosviruksen vaippaglykoproteiinit, hepatiitti B:n pinta-ja esipinta-antigeenit ja herpeksen glykoproteiinit B ja 5 D.
Sieniantigeenit voivat olla peräisin sienistä mukaan lukien, mutta näihin rajoittumatta, Candida-laj it (erityisesti albicans), Cryptococcus -laj it (erityisesti neoformans) , Blastomyces-laj it (esim. dermatitidis), His-10 toplasma-laj it (erityisesti capsulatum), Coccidroides- lajit (erityisesti immitis) , Paracoccidroides-laj it (erityisesti brasiliensis) ja Aspergillus-laj it. Esimerkkejä parasiittiantigeeneista ovat, näihin rajoittumatta, Plas-modium-laj it, Elmeriä-lajit, Schistosoma-laj it, Trypano-15 soma-lajit, Babesia-lajit, Leishmania-laj it, Cryptospori- dia-lajit, Toxoplasma-lajit ja Pneumocystis-lajit.
Keksintöä valaistaan edelleen seuraavin, ei-ra-joittavin, esimerkein:
Esimerkki 1: Rakennelmat 20 Bakteerikannat I E. coli DH5a:aa (BRL, Gaithersburg, MD) käytetään kaikkiin kloonausmenetelmiin. Ei-toksigeenisiä, ei-lyso-geenisiä C. diphtheria C7(-)tox’ -kantoja, ei-toksigee-; nisiä, yksinkertaisesti lysogeenisiä C. diphtheriae 25 C7 (βΐ97)tox" ATCC No 5328 -kantoja käytetään sekä plasmidi-
i I
;;; isäntinä että kontrolleina CRM197-proteiinin ekspres- i i » ’·’ ' siotutkimuksissa. Ei-toksigeenista, kaksoislysogeenistä C.
diphtheriae C7 (/5197) tox~ ATCC No 39255 -kantaa käytetään * '.· kontrollina CRM197-proteiinin ekspressiokokeissa .
: 3 0 Kasvatusalusta ja viljelyolosuhteet E. coli DH5a:aa kasvatetaan rutiinisti superopti- • * » maalinen liemi (SOB) -agaralustassa ja SOB-nesteessä 37° • * C:ssa (Sambrook, J. et ai., 1989, Molecular Cloning: A La-boratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold 35 Spring Harbor, NY) . C. diphtheriae C7 -kantoja viljellään rutiinisti SOC-agarilla (Sambrook, J. et al. , ibid.) ja X1 112090 -nesteessä. ET-osmoottista agaralustaa (Best, G. R. ja M.
L. Britz, Appi. Microbiol. Biotech. 23 (1986) 288 - 293) käytetään, kun maljataan elektroporoituja soluja. CY-alustaa, josta rauta on poistettu, (Rappuoli, R. et al. , 5 J. Bacteriol. 153 (1983) 1202) käytetään kokeissa, jotka sisältävät CRM197:n ekspression. Kloramfenikolia lisätään 34 μg/ml E. coli DH5o;- ja 2 μg/ml C. diphtheriae C7 -kantoihin, jotka sisältävät pPX 3511 -plasmidin.
CRM197-geenin kloonaus 10 CRM197-geeni kloonataan amplifroimalla PCR:llä (polymeraasiketjureaktio) geenisekvenssi C. diphtheriae Cl (jSl97)tox" -yksinkertaisen lysogeenin DNA: sta käyttäen oli-gonukleotidialukkeita, jotka perustuvat difteriatoksiinin julkaistuun sekvenssiin (Greenfield, L. et ai., Proc. 15 Natl. Acad. Sei. USA 80 (1983) 6853 - 6857). Alukkeet suunnitellaan siten, että yksi aluke tekisi Sall/HincII-restriktiokohdan funktionaalisen geenin alkuun ja toinen tekisi Xbal-kohdan rakennegeenin lopetuskodonin jälkeen. Näitä tai samanlaisia alukkeita käytetään CRM197-geenin, 20 difteriatoksiinigeenin tai minkä tahansa korynefaagi β: n koodaaman difteriatoksiinigeenin kaltaisen CRM-geenin amp-; .·. lifiointiin ja kloonaukseen.
CRM197:n PCR-tuotteet digestoidaan Hindi :11a ja
• I
Xbal:llä ja ligoidaan Smal/Xbal-digestoituun pNG2-22:een, • * , 25 kloramfenikoliresistenttiin vektoriin, joka hyväksyy usei- • ) · • · ·; ta isäntiä ja kykenee replikoitumaan sekä Echerichia co- a i » ’·* * lj^ssa että Corynebacterium-lajeissa. Ligaatiota käytetään transformoimaan E. coli DH5o; ja rekombinantit pesäkkeet • · > • seulotaan restriktioanalyysillä CRM197-geenin läsnäolon • · 1 : 30 toteamiseksi. Yksi isolaatti, pPX 3511 sekvenoidaan käyt- täen limittäisiä alukkeita CRM197-geenin muutosten tar- i t · kistamiseksi. Oligonukleotidialukkeet, joita käytettiin • » *; PCR:ssä ja sekvenoinnissa, syntetisoidaan Applied Biosys- terns 380B DNA-syntetisaattorissa. PCR suoritetaan Perkin-: : 35 Elmer Cetus DNA Thermal Cycler -laitteella. Sekvenointi tehdään käyttäen Applied Biosystems Sequencer 373A -lai- i2 112090 tetta. Tuloksena syntyvä plasmidi (pPX 3511) siirretään elektroporaation avulla ei-toksigeeniseen, ei-lysogee- niseen C. diphtheriae C7 (-)tox" -kantaan ja ei-toksigeeni-seen C. diphtheriae C7 (jö197)tox~ -kantaan, ATCC No 5328.
5 C. diphtheriae C7:n elektroporaatio C. diphtheriae C7 transformoidaan plasmidi pPX 3511 -DNA:11a elektroporaation avulla käyttäen Corynebac-terium glutamicum1n ja Brevibacterium lactofermentum'n transformaatioon kehitettyä menetelmää (Hayes, J. A. ja M.
10 L. Britz, FEMS Microbiol. Lett. 61 (1989) 329 - 334), sillä poikkeuksella, että käytettiin SOC-alustaa, johon lisättiin 0,2 % Tween-80:aa. Elektroporaatioon käytettiin
BTX Transfector 100:aa, jossa on Power Plus ja Optimizor Graphic Pulse Analyzer ja 1 mm:n gap-kyvetit. Plasmidi pPX
15 3511:n läsnäolo transformoiduissa C. diphtheriae C7 -kan noissa tarkistettiin vapautetun plasmidin restriktioana-lyysillä.
Esimerkki 2: Ekspressio 197
Kvantitatiiviset CRM -ekspressiotutkimukset 20 CRM197:n tuotannon vertailu tehdään kasvattamalla ··. C. diphtheriae C7 -kantoja samanlaisissa olosuhteissa ja • · vertaamalla CRM197:n määrää viljelysupernatantissa. Kanto-
I I
.V jen kvantitatiivisessa vertailussa 4 ml:n yli yön kasva- tuksia laimennetaan siten, että OD600 = 0,1 CY-alustassa, » » · * · 25 josta rauta on poistettu (30 ml:n lopullinen tilavuus
• I I
250 ml:n Erlenmeyer-pullossa) ja kasvatettiin ravistelussa
I » I
V ’ 20 tuntia 37 °C:ssa. pPX 3511:ä sisältävät kannat kasvate taan sekä ilman antibioottiselektiota että sen kanssa • t * | ’,·* (2 Mg/ml kloramfenikolia) . Inkuboinnin jälkeen kasvatukset 30 sentrifugoidaan solujen poistamiseksi ja 20 μΐ kasvatussu-pernatantteja ajetaan 12-%:isessa SDS-PAGE-geelissä. Geeli i * » i.) värjätään Coomassie-värillä ja kvantitatiivinen vertailu ’;· tehdään käyttäen Bio-Rad Model 1650 Transmittance/Ref- lectance Scanning Densitometer -laitetta, jossa on Hoefer : 35 Scientific GS 370 Analysis Package. Rekombinantin CRM197- proteiinin ja lysogeenisen /3l97tox' CRM197-proteiinin anti- 13 112090 geenisten ominaisuuksien vertailu suoritetaan tekemällä immunoblotting geelistä ja tutkimalla se CRM197-mono-klonaalivasta-ainekoettimen avulla. pPX 3511:n tuottama CRM197 on antigeenisesti identtinen lysogeenisten kantojen 5 tuottamalle CRM197:lle.
Plasmidi pPX 3511:n stabiilisuuskokeet Plasmidi pPX 3511:n stabiilisuus tutkitaan käyttäen kloramfenikoliresistenssin pysyvyyttä plasmidisäilyvyy-den indikaattorina ilman antibiootti selektiota. C. dipht-10 heriae C7 (/3197)tox" pPX 3511 :n viljelmiä kasvatetaan 18 tuntia (14 - 17 sukupolvea) 37 °C:ssa SOC-liemessä, johon on lisätty 0,l-%:inen Tween-80 solujen kokkaroitumisen estämiseksi. Sen jälkeen viljelmät maljataan SOC-agarille pesäkkeiden laskua varten ja laimennettiin 1:10 seuraavaa 15 sukupolvea varten. SOC-agarmaljat kopiomaljattiin SOC- agarille, 2 μg/ml kloramphenikolia, ja niiden pesäkkeiden prosenttiosuus, jotka säilyttivät kloramfenikoliresistens-sin, laskettiin. Tämä toistettiin 60 sukupolvesta. Esimerkki 3: Biologiset tulokset 20 Eri C. diphtheriae C7 -kantojen CRM197-tuotannon kvantitatiivinen vertailu Coomassie-värjättyjen geelien densitometriaa käyttäen (kuvio 2) osoittaa, että pPX 3511 -kannat tuottavat noin kaksi kertaa enemmän CRM197:ää kuin yksinkertainen lysogeeni ja yhtä paljon kuin kaksinkertai-25 nen lysogeeni (taulukko 1) . Plasmidi pPX 3511:n stabiili- ··1· suus 60 sukupolven ajan nähdään kuviossa 3.
• · 1 • · 1 · • · » • • « • · · • 1 φ ·
• I
• · 1 I » · » » · • 1 » 14 112090
Taulukko 1 CRM197:n tuotanto C. diphtheriae C7 -kannoilla ilmaistuna miten monta kertaa suurempi tuotanto on yksinkertaiseen lysogeeniin (/3197)tox^: een nähden 5 Kertaa suurempi kuin yksinkertaisella lysogeenilla (/3197)tox' Kaksoislysogeeni (/3197) tox~ 2,2 pPX 3511 (~)tox" no, Cm2 2,8 10 pPX 3511 (-)tox", Cm2 1,9 pPX 3511 (/3197)tox" no, Cm2 2,0 pPX 3511 (/3197)tox", Cm2 2,4
Biologinen talletus
Plasmidi pPX 3511 talletettiin Budapest-sopimuksen 15 mukaisesti American Type Culture Collection'iin (ATCC), 12 301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20 852, 12.02.1993 ja sille on annettu ATCC Accesion Number 75 415. Kaikki talletetun materiaalin yleisölle kohdistetut rajoitukset sen saatavuudesta poistetaan peruuttamat-20 tomasti, kun tälle hakemukselle myönnetään patentti. Talletusta pidetään yllä julkisessa talletuslaitoksessa aina-: .·. kin 30 vuoden ajan talletuksen päivämäärästä tai patentin .···, voimassaoloajan tai viiden vuoden ajan sen päivämäärän jälkeen, jolloin on tullut viimeisin pyyntö toimittaa näy-, 25 te biologisesta materiaalista, sen mukaan mikä näistä ”” ajoista on pisin. Talletus korvataan mikäli se muuttuu • t t *·’ käyttökelvottomaksi tai ei-kopioitavaksi .
Alan ammattimiehet havaitsevat tai kykenevät saa- i · · • V maan selville, käyttämällä ainoastaan rutiinimenetelmiä, • · · 30 monia yhtäläisyyksiä tämän spesifisesti kuvatun keksinnön spesifisiin suoritusmuotoihin. Tällaiset yhtäläisyydet hi aiotaan sisällyttää seuraavaan suojapiiriin.
• · ·

Claims (7)

112090
1. Menetelmä difteriatoksiinin tai difteriatoksiinin kanssa ristireagoivan CRM-proteiinin tuottamiseksi, 5 tunnettu siitä, että transformoidaan lajin Co-rynebacterium diphtheriae kannan C7 mikro-organismi, kuten Corynebacterium diphtheriae -kanta C7, ATCC 5328, plasmi-dilla, joka sisältää a) geenin, joka koodaa difteriatoksiinia tai CRM-10 proteiinia, b) Corynebacterium1n replikaation aloituskohdan ja c) selektiivisen markkerin, ja ekspressoidaan toksiinia tai proteiinia olosuhteissa, jotka ovat riittäviä geenin ekspressoimiseksi mik-15 ro-organismilla.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että transformaatiomenetelmänä on elektroporaatio.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että replikaation aloituskohta on peräisin Corynebacterium-plasmidista pNG2.
4. Plasmidi difteriatoksiinin tai difteriatoksii- • » · nin kanssa ristireagoivan CRM-proteiinin ekspressoimiseksi ’···’ isännässä, tunnettu siitä, että se sisältää: * ' 25 a) geenin, joka koodaa difteriatoksiinia tai CRM- proteiinia, v ‘ b) Corynebacterium'n replikaation aloituskohdan, ja c) selektiivisen markkerin, mahdollisesti kyphotic 30 tynä monikloonauskohtaan.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen plasmidi, tunnettu siitä, että proteiinia koodaava geeni on operatiivisesti kytketty nukleotidisekvenssiin, joka koo- •j* daa yhtä tai useampia proteiineja, peptidejä tai epitoop- 35 peja. 16 112090
6. Plasmidi pPX 3511, ATCC-talletusnumero 75 415.
7. Lajin Corynebacterium diphtheriae kannan C7 mikro-organismi, tunnettu siitä, että se on transformoitu patenttivaatimuksen 4 mukaisella plasmidil- 5 la. t i * t * » t 112090
FI941050A 1993-03-05 1994-03-04 Menetelmä, plasmidi ja mikro-organismi difteriatoksiinin tai sen kanssa ristireagoivan CRM-proteiinin tuottamiseksi FI112090B (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US2728393A 1993-03-05 1993-03-05
US2728393 1993-03-05

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI941050A0 FI941050A0 (fi) 1994-03-04
FI941050A FI941050A (fi) 1994-09-06
FI112090B true FI112090B (fi) 2003-10-31

Family

ID=21836767

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI941050A FI112090B (fi) 1993-03-05 1994-03-04 Menetelmä, plasmidi ja mikro-organismi difteriatoksiinin tai sen kanssa ristireagoivan CRM-proteiinin tuottamiseksi

Country Status (21)

Country Link
US (1) US5614382A (fi)
EP (1) EP0616034B1 (fi)
JP (1) JP4144813B2 (fi)
KR (1) KR100316004B1 (fi)
CN (1) CN1100757A (fi)
AT (1) ATE280235T1 (fi)
AU (1) AU686126B2 (fi)
BR (1) BR1100634A (fi)
CA (1) CA2116914C (fi)
CZ (1) CZ39394A3 (fi)
DE (1) DE69434079T2 (fi)
DK (1) DK0616034T3 (fi)
ES (1) ES2231770T3 (fi)
FI (1) FI112090B (fi)
HU (1) HUT71320A (fi)
IL (1) IL108822A (fi)
NO (1) NO313758B1 (fi)
NZ (1) NZ260027A (fi)
PT (1) PT616034E (fi)
SK (1) SK24094A3 (fi)
ZA (1) ZA941548B (fi)

Families Citing this family (123)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE460179T1 (de) * 1995-04-14 2010-03-15 Us Gov Health & Human Serv Verfahren zur herbeiführung einer immuntoleranz mit hilfe von immuntoxinen
US7288254B2 (en) 1995-10-30 2007-10-30 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, Nih Use of immunotoxins to induce immune tolerance to pancreatic islet transplantation
US7696338B2 (en) 1995-10-30 2010-04-13 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Immunotoxin fusion proteins and means for expression thereof
US7517527B2 (en) 1995-10-30 2009-04-14 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Immunotoxin with in vivo T cell suppressant activity and methods of use
US7125553B1 (en) 1996-04-15 2006-10-24 The United States of America as represented by the Department of Health and Human Services c/o Centers for Disease Control and Prevention Methods of inducing immune tolerance using immunotoxins
WO1998039425A2 (en) * 1997-03-05 1998-09-11 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Vectors and methods for expression of mutant proteins
ATE433998T1 (de) 1997-03-05 2009-07-15 Us Health Divalent anti-t-zellen immuntoxinen und deren verwendung
US6676943B1 (en) 1997-04-24 2004-01-13 Regents Of The University Of Minnesota Human complement C3-degrading protein from Streptococcus pneumoniae
CN1086945C (zh) * 1997-06-03 2002-07-03 胡章英 白喉口服液
GB9923060D0 (en) * 1999-09-29 1999-12-01 Chiron Spa Vaccine
MX339524B (es) 2001-10-11 2016-05-30 Wyeth Corp Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica.
GB0211118D0 (en) * 2002-05-15 2002-06-26 Polonelli Luciano Vaccines
WO2004011027A1 (en) * 2002-07-30 2004-02-05 Baxter International Inc. Chimeric multivalent polysaccharide conjugate vaccines
US7785608B2 (en) * 2002-08-30 2010-08-31 Wyeth Holdings Corporation Immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease
US7301554B2 (en) * 2002-09-20 2007-11-27 Ricoh Company, Ltd. Light scanning device, scanning line adjusting method, scanning line adjusting control method, image forming apparatus, and image forming method
DK2336147T3 (da) 2003-12-17 2014-06-10 Wyeth Llc Beta-immunogen-peptid-bærerkonjugater og fremgangsmåder til fremstilling deraf
PT1701968E (pt) 2003-12-17 2015-09-11 Wyeth Llc Conjugados de transportadores de péptidos imunogénicos e métodos para produzir os mesmos
GB0505996D0 (en) 2005-03-23 2005-04-27 Glaxosmithkline Biolog Sa Fermentation process
US7709001B2 (en) 2005-04-08 2010-05-04 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
EP2425854A1 (en) 2005-04-08 2012-03-07 Wyeth LLC Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
TW200806315A (en) 2006-04-26 2008-02-01 Wyeth Corp Novel formulations which stabilize and inhibit precipitation of immunogenic compositions
US8808707B1 (en) 2006-05-08 2014-08-19 Wyeth Llc Pneumococcal dosing regimen
US9107880B2 (en) 2006-05-31 2015-08-18 Silvio Buzzi Pharmaceutical use of protein molecules immunologically correlated to diptheria toxin
AR064642A1 (es) 2006-12-22 2009-04-15 Wyeth Corp Polinucleotido vector que lo comprende celula recombinante que comprende el vector polipeptido , anticuerpo , composicion que comprende el polinucleotido , vector , celula recombinante polipeptido o anticuerpo , uso de la composicion y metodo para preparar la composicion misma y preparar una composi
CN101265288B (zh) * 2007-03-13 2012-03-21 齐鲁制药有限公司 Crm197突变体的纯化方法
DK2424562T3 (en) 2009-04-30 2015-12-07 Coley Pharm Group Inc Pneumococcal vaccine and uses thereof
ES2959890T3 (es) 2009-06-22 2024-02-28 Wyeth Llc Composiciones y procedimientos para preparar composiciones inmunogénicas de conjugado de polisacárido capsular de serotipo 8 de Staphylococcus aureus
MX2012000044A (es) 2009-06-22 2012-01-30 Wyeth Llc Composiciones inmunogenicas de antigenos de staphylococcus aureus.
IT1398927B1 (it) 2009-06-25 2013-03-28 Consorzio Interuniversitario Per Lo Sviluppo Dei Sistemi A Grande Interfase Csgi Espressione batterica di un gene artificiale per la produzione di crm197 e derivati.
AU2010201410B2 (en) * 2010-03-30 2015-04-30 Pelican Technology Holdings, Inc. High level expression of recombinant CRM197
AU2011238711B2 (en) 2010-03-30 2015-06-18 Pelican Technology Holdings, Inc. High level expression of recombinant toxin proteins
DK2575870T3 (en) 2010-06-04 2017-02-13 Wyeth Llc vaccine Formulations
WO2011154878A1 (en) 2010-06-07 2011-12-15 Pfizer Vaccines Llc Ige ch3 peptide vaccine
EP2608805B1 (en) 2010-08-23 2017-07-05 Wyeth LLC STABLE FORMULATIONS OF NEISSERIA MENINGITIDIS rLP2086 ANTIGENS
JP5976652B2 (ja) 2010-09-10 2016-08-24 ワイス・エルエルシー 髄膜炎菌ｏｒｆ２０８６抗原の非脂質化変異体
MX346245B (es) 2011-06-01 2017-03-13 Univ Xiamen Proteina de fusion que comprende el mutante crm197 no toxico de toxina de difteria.
CA2960030C (en) 2012-03-09 2020-02-25 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
SA115360586B1 (ar) 2012-03-09 2017-04-12 فايزر انك تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها
US9169304B2 (en) 2012-05-01 2015-10-27 Pfenex Inc. Process for purifying recombinant Plasmodium falciparum circumsporozoite protein
KR102057217B1 (ko) 2012-06-20 2020-01-22 에스케이바이오사이언스 주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
US9777076B2 (en) 2012-07-16 2017-10-03 Pfizer Inc. Saccharides and uses thereof
CN102766647A (zh) * 2012-07-25 2012-11-07 天津康希诺生物技术有限公司 在白喉杆菌中稳定复制的表达载体及含该载体的白喉杆菌
EP3421051B1 (en) 2012-08-16 2020-05-13 Pfizer Inc Glycoconjugation processes and compositions
CA2896552A1 (en) 2012-10-03 2014-04-10 Novartis Ag Immunogenic compositions
KR20140075201A (ko) 2012-12-11 2014-06-19 에스케이케미칼주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
KR20140075196A (ko) 2012-12-11 2014-06-19 에스케이케미칼주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
SI2935299T1 (sl) 2012-12-20 2019-12-31 Pfizer Inc. Postopek glikokonjugacije
JP6359561B2 (ja) 2013-01-04 2018-07-18 オービーアイ ファーマ インコーポレイテッド 高い炭水化物抗原密度を有するワクチン及び新規サポニンアジュバント
WO2014136064A2 (en) 2013-03-08 2014-09-12 Pfizer Inc. Immunogenic fusion polypeptides
US9707153B2 (en) 2013-04-24 2017-07-18 Corning Incorporated Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients
CN104140972B (zh) * 2013-05-07 2018-01-23 上海惠盾生物技术有限公司 白喉毒素突变体crm197的制备方法
CN105705467B (zh) 2013-08-26 2019-09-27 康宁股份有限公司 用于化学强化的玻璃的局部退火的方法
CA2923129C (en) 2013-09-08 2020-06-09 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
US11708411B2 (en) 2013-12-20 2023-07-25 Wake Forest University Health Sciences Methods and compositions for increasing protective antibody levels induced by pneumococcal polysaccharide vaccines
US11160855B2 (en) 2014-01-21 2021-11-02 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
AU2015208820B2 (en) 2014-01-21 2020-05-14 Pfizer Inc. Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides and conjugates thereof
IL246738B1 (en) 2014-01-21 2024-04-01 Pfizer Capsular polysaccharides of Streptococcus pneumoniae and their conjugates
PE20161095A1 (es) 2014-01-21 2016-10-26 Pfizer Composiciones inmunogenicas que comprenden antigenos de sacaridos capsulares conjugados y uso de los mismos
KR102282930B1 (ko) 2014-01-31 2021-07-27 피나 바이오솔루션스, 엘엘씨 Crm197 및 관련 단백질의 발현 및 정제
ES2930318T3 (es) 2014-02-14 2022-12-09 Pfizer Conjugados glucoproteicos inmunogénicos
US9815886B2 (en) 2014-10-28 2017-11-14 Adma Biologics, Inc. Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency
BR112017010718A2 (pt) 2014-11-20 2017-12-26 Biological E Ltd polinucleotídeo otimizado por códon para expressão de alto nível de crm197
IL252915B2 (en) 2015-01-15 2024-04-01 Pfizer Immunogenic preparations for use in pneumococcal vaccines
BR112017017460A2 (pt) 2015-02-19 2018-04-10 Pfizer Inc. composições de neisseria meningitidis e métodos das mesmas
TWI718144B (zh) 2015-05-04 2021-02-11 美商輝瑞股份有限公司 Ｂ型鏈球菌多醣－蛋白質軛合物、製造軛合物之方法、含軛合物之免疫原性組成物、及其用途
RS61440B1 (sr) 2015-06-23 2021-03-31 Biological E Ltd Multivalentna pneumokokna konjugatna vakcina
JP6994453B2 (ja) 2015-07-21 2022-01-14 ファイザー・インク コンジュゲート化莢膜糖類抗原を含む免疫原性組成物、それを含むキットおよびこれらの使用
WO2017085586A1 (en) 2015-11-20 2017-05-26 Pfizer Inc. Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines
EP3426785A4 (en) 2016-03-10 2019-12-25 The Johns Hopkins University METHOD FOR PRODUCING AGGREGATE-FREE MONOMER DIPHTHERIETOXINFUSION PROTEINS AND THERAPEUTIC USES
US11965009B2 (en) 2016-03-10 2024-04-23 The Johns Hopkins University Methods of producing aggregate-free monomeric diphtheria toxin fusion proteins and therapeutic uses
US11203626B2 (en) 2016-03-10 2021-12-21 The Johns Hopkins University Methods of producing aggregate-free monomeric diphtheria toxin fusion proteins and therapeutic uses
WO2017220753A1 (en) 2016-06-22 2017-12-28 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
EP3269385A1 (en) 2016-07-12 2018-01-17 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
CA3031799A1 (en) 2016-08-05 2018-02-08 Sanofi Pasteur, Inc. Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
KR102467074B1 (ko) 2016-08-05 2022-11-11 사노피 파스퇴르 인코포레이티드 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
UA126385C2 (uk) 2016-09-30 2022-09-28 Байолоджикал І Лімітед Композиції полівалентної пневмококової вакцини, що містять кон'югати полісахарид-білок
US10751402B2 (en) 2016-11-09 2020-08-25 Pfizer Inc. Immunogenic compositions and uses thereof
WO2018126229A2 (en) 2016-12-30 2018-07-05 Sutrovax, Inc. Polypeptide-antigen conjugates with non-natural amino acids
US11951165B2 (en) 2016-12-30 2024-04-09 Vaxcyte, Inc. Conjugated vaccine carrier proteins
AU2018208844B2 (en) 2017-01-20 2021-02-25 Pfizer Inc. Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines
SG10202111092UA (en) 2017-01-31 2021-11-29 Pfizer Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
KR102650073B1 (ko) 2017-01-31 2024-03-20 머크 샤프 앤드 돔 엘엘씨 스트렙토코커스 뉴모니아 혈청형 19f 유래의 협막 다당류 단백질 접합체의 제조 방법
KR101908590B1 (ko) 2017-02-01 2018-10-16 (주)포바이오코리아 Crm197의 용해성 단백질 발현 및 정제 방법
CA3052621A1 (en) 2017-02-03 2018-08-09 Schadeck, Eva Barbara Haemophilus influenzae saccharide-carrier conjugate compositions and uses thereof
US10259865B2 (en) 2017-03-15 2019-04-16 Adma Biologics, Inc. Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection
IL270075B2 (en) 2017-04-22 2024-06-01 Biological E Ltd An improved method for producing a high level of CRM
EP3678654B1 (en) 2017-09-07 2024-06-26 Merck Sharp & Dohme LLC Pneumococcal polysaccharides and their use in immunogenic polysaccharide-carrier protein conjugates
KR102481327B1 (ko) 2017-12-06 2022-12-23 머크 샤프 앤드 돔 엘엘씨 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드-단백질 접합체를 포함하는 조성물 및 그의 사용 방법
KR102475419B1 (ko) * 2018-07-16 2022-12-07 주식회사 유바이오로직스 Crm197을 고농도로 발현하는 코리네박테리움 균주
US11260119B2 (en) 2018-08-24 2022-03-01 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
CN109100517A (zh) * 2018-10-08 2018-12-28 武汉生命科技股份有限公司 一种用于检测白喉抗体的抗原蛋白、试剂盒及制备方法
EP3893926A1 (en) 2018-12-12 2021-10-20 Pfizer Inc. Immunogenic multiple hetero-antigen polysaccharide-protein conjugates and uses thereof
PE20211888A1 (es) 2018-12-19 2021-09-22 Merck Sharp & Dohme Composiciones que comprenden conjugados de polisacarido de streptococcus pneumoniae con proteina y sus metodos de uso
JP7239509B6 (ja) 2019-02-22 2023-03-28 ファイザー・インク 細菌多糖類を精製するための方法
JP2022528158A (ja) 2019-04-10 2022-06-08 ファイザー・インク コンジュゲート化莢膜糖抗原を含む免疫原性組成物、それを含むキットおよびその使用
WO2021021729A1 (en) 2019-07-31 2021-02-04 Sanofi Pasteur Inc. Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate compositions and methods of using the same
CN114667343A (zh) 2019-11-01 2022-06-24 辉瑞大药厂 大肠杆菌组合物及其方法
CA3171864A1 (en) 2020-02-21 2021-08-26 Pfizer Inc. Purification of saccharides
IL295632A (en) 2020-02-23 2022-10-01 Pfizer Escherichia coli preparations and their methods
EP3900739A1 (en) 2020-04-21 2021-10-27 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Synthetic streptococcus pneumoniae saccharide conjugates to conserved membrane protein
EP3919076A1 (en) 2020-06-02 2021-12-08 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Synthetic oligosaccharide vaccines against streptococcus pneumoniae with microparticle adjuvant formulations
US20230321212A1 (en) 2020-08-26 2023-10-12 Pfizer Inc. Group b streptococcus polysaccharide-protein conjugates, methods for producing conjugates, immunogenic compositions comprising conjugates, and uses thereof
TW202227128A (zh) 2020-09-17 2022-07-16 美商詹森藥物公司 多價疫苗組成物及其用途
US20230383324A1 (en) 2020-10-22 2023-11-30 Pfizer Inc. Methods for purifying bacterial polysaccharides
CA3199610A1 (en) 2020-10-27 2022-05-05 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
EP4240410A1 (en) 2020-11-04 2023-09-13 Pfizer Inc. Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines
JP2023549736A (ja) 2020-11-10 2023-11-29 ファイザー・インク コンジュゲートさせた莢膜糖抗原を含む免疫原性組成物およびその使用
US20220202923A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Pfizer Inc. E. coli fimh mutants and uses thereof
KR20220102871A (ko) 2021-01-14 2022-07-21 (주)셀트리온 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물
TW202245835A (zh) 2021-02-04 2022-12-01 美商默沙東有限責任公司 用於肺炎球菌結合物疫苗之奈米乳化液佐劑組合物
WO2022234416A1 (en) 2021-05-03 2022-11-10 Pfizer Inc. Vaccination against pneumoccocal and covid-19 infections
JP2024517780A (ja) 2021-05-03 2024-04-23 ファイザー・インク 細菌およびベータコロナウイルス感染症に対するワクチン接種
EP4346893A2 (en) 2021-05-28 2024-04-10 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2022249106A2 (en) 2021-05-28 2022-12-01 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
AU2023207315A1 (en) 2022-01-13 2024-06-27 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2023161817A1 (en) 2022-02-25 2023-08-31 Pfizer Inc. Methods for incorporating azido groups in bacterial capsular polysaccharides
WO2023218322A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Pfizer Inc. Process for producing of vaccine formulations with preservatives
WO2024084397A1 (en) 2022-10-19 2024-04-25 Pfizer Inc. Vaccination against pneumoccocal and covid-19 infections
WO2024089001A1 (en) 2022-10-24 2024-05-02 Idorsia Pharmaceuticals Ltd Vaccine against klebsiella pneumoniae
WO2024110827A1 (en) 2022-11-21 2024-05-30 Pfizer Inc. Methods for preparing conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2024110839A2 (en) 2022-11-22 2024-05-30 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2024116096A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Pfizer Inc. Pneumococcal conjugate vaccine formulations
WO2024121280A1 (en) 2022-12-08 2024-06-13 Idorsia Pharmaceuticals Ltd Vaccine against klebsiella pneumoniae

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH660375A5 (it) * 1983-02-08 1987-04-15 Sclavo Spa Procedimento per la produzione di proteine correlate alla tossina difterica.
FR2549855B1 (fr) * 1983-07-29 1987-03-27 Grp Genie Genetique Sequence nucleotidique codant pour le peptide signal de la toxine diphterique, vecteur contenant cette sequence nucleotidique, leur application a la transformation de micro-organismes et compositions peptidiques obtenues

Also Published As

Publication number Publication date
AU686126B2 (en) 1998-02-05
EP0616034A3 (en) 1996-10-16
DK0616034T3 (da) 2005-02-21
JPH06292593A (ja) 1994-10-21
KR940021731A (ko) 1994-10-19
CA2116914C (en) 2005-02-08
NO940774L (no) 1994-09-06
ZA941548B (en) 1994-10-03
EP0616034B1 (en) 2004-10-20
NO940774D0 (no) 1994-03-04
BR1100634A (pt) 1999-12-07
EP0616034A2 (en) 1994-09-21
KR100316004B1 (ko) 2002-02-19
HU9400657D0 (en) 1994-05-30
NO313758B1 (no) 2002-11-25
FI941050A (fi) 1994-09-06
ES2231770T3 (es) 2005-05-16
IL108822A0 (en) 1994-06-24
SK24094A3 (en) 1995-03-08
CN1100757A (zh) 1995-03-29
AU5759594A (en) 1994-09-08
CZ39394A3 (en) 1995-02-15
FI941050A0 (fi) 1994-03-04
CA2116914A1 (en) 1994-09-06
DE69434079T2 (de) 2005-02-24
HUT71320A (en) 1995-11-28
PT616034E (pt) 2005-02-28
ATE280235T1 (de) 2004-11-15
JP4144813B2 (ja) 2008-09-03
IL108822A (en) 2004-09-27
US5614382A (en) 1997-03-25
DE69434079D1 (de) 2004-11-25
NZ260027A (en) 1996-03-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI112090B (fi) Menetelmä, plasmidi ja mikro-organismi difteriatoksiinin tai sen kanssa ristireagoivan CRM-proteiinin tuottamiseksi
FI101632B (fi) Menetelmä Bordetella pertussis-toksiinin alayksikön analogien valmista miseksi ja niitä koodaavia rekombinantti-DNA-molekyylejä
EP0863211A1 (en) Expression of recombinant fusion proteins in attenuated bacteria
JPS58126789A (ja) レースレオニンの製造法
US8147841B2 (en) Clostridium toxin, and process for the preparation of immunogenic composition
AU743165B2 (en) Live attenuated bacteria of the species Actinobacillus pleuropneumoniae
JPH02291271A (ja) 発現伝播体を有する組成物
CA3091583A1 (en) Expression of pneumococcal surface protein a (pspa)
EP0742829B1 (en) Expression of heterologous proteins in attenuated bacteria using the htra-promoters
US7144576B1 (en) Modified pertussis toxin
AU2002301780B2 (en) Clostridium toxin and method for preparing immunogenic compositions
AU623867C (en) Recombinant DNA-derived bordetella toxin subunit analogs
AU2007201975B2 (en) Clostridium Toxin and Method for Preparing Immunogenic Compositions
EA045199B1 (ru) ЭКСПРЕССИЯ ПНЕВМОКОККОВОГО ПОВЕРХНОСТНОГО БЕЛКА А (PspA)

Legal Events

Date Code Title Description
MA Patent expired