DE69334100T2

DE69334100T2 - Elk ligand, ein cytokin

Info

Publication number: DE69334100T2
Application number: DE69334100T
Authority: DE
Inventors: Stewart Seattle LYMAN; M. Patricia Poulsbo Beckmann; Peter R. Seattle BAUM
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1992-11-13
Filing date: 1993-11-15
Publication date: 2007-07-19
Anticipated expiration: 2013-11-16
Also published as: US5728813A; NZ258697A; AU669960B2; ATE350386T1; WO1994011384A1; US5627267A; US6540992B1; DK0669929T3; US5670625A; DE69334100D1; EP0669929A4; EP0669929A1; JPH08503368A; US5512457A; JP3560609B2; CA2148484A1; ES2279508T3; EP0669929B1; AU5667594A; US20040022767A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Das als elk bezeichnete Zelloberflächenprotein ist ein Mitglied einer Familie von Proteinen, die als die Tyrosinkinase-Rezeptoren bekannt sind. Proteine dieser Familie haben eine intrinsische Kinaseaktivität, die beider Ligandenbindung aktiviert wird (Ullrich et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:713, 1986). Ein partieller Klon von elk wurde zuerst in einer Rattenhirn cDNA Expressionsbibliothek entdeckt, die auf Proteine, die Tyrosin-Kinaseaktivität exprimieren, gescreent wurde (Letwin et al., Oncogene 3:621, 1988). Später wurde eine zusammengesetzte Sequenz, die die gesamte kodierende Region von elk umspannt, von partiellen Klonen abgeleitet, die von einer Rattenhirn cDNA Bibliothek und einer Rattenkleinhirn Bibliothek unter Verwendung des partiellen Klons als eine Sonde isoliert (Lhotak et al., Mol. Cell. Biol. 17:2496, 1991). Das elk Protein ist eng mit einer Reihe von anderen Rezeptor Tyrosinkinasen verwandt, einschließlich hek (Boyd et al. J. Biol. Chem. 267:3262, 1992 and Wicks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1611, 1992); die hek-Homologa mek4 und cek4 (Sajjadi et al. New Biol. 3:769, 1991); eek (Chan et al. Oncogene 6:1057, 1991); erk (Chan et al. supra.), eck (Lindberg et al. Mol. Cell. Biol. 10:6316, 1990); cek5 (Pasquale, E.B. Cell Regulation 2:523, 1991); und eph (Hirai et al. Science 238:1717, 1987). Die Proteine dieser Subfamilie sind nicht nur in ihren cytoplasmatischen Domänen sondern auch in ihren extrazellulären Domänen verwandt, welche 41 bis 68% identisch sind. Interessanterweise sind die Gewebe-Verteilungen von diesen verschiedenen Rezeptoren divers. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass die Expression von elk mRNA auf die Hoden und Hirn beschränkt ist (Lhotak et al., supra), wohingegen elk nicht nur in diesen zwei selben Geweben gefunden wird, sondern auch in der Lunge, im Darm, in der Niere, Milz, Eierstock sowie der Haut.
Liganden für die Rezeptor-Tyrosinkinasen sind einen diverse Gruppe von Proteinen, die das Wachstum, die Differenzierung und das Überleben von Zellen, die die Rezeptoren exprimieren, beeinflussen. Bis heute wurde kein Ligand für elk gefunden. Die Identifikation des mutmaßlichen Liganden würde sich beim Untersuchen der Natur von zellulären Vorgängen als nützlich erweisen, die durch das elk Protein reguliert sein können.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bietet ein neuartiges Cytokin mit der Bezeichnung elk Ligand (elk-L), das an den als elk bekannten Ratten-Zelloberflächenrezeptor bindet. Die vorliegende Erfindung bietet auch isolierte DNA, die das elk-L Protein kodieren, Expressionsvektoren, die die isolierte DNA enthalten, und ein Verfahren zum Erzeugen von elk-L durch Kultivieren von Wirtszellen, die die Expressionsvektoren enthalten, unter Bedingungen, die für die Expression des elk-L Proteins geeignet sind. Gegen das elk-L Protein gerichtete Antikörper oder ein immunogenes Fragment davon sind ebenfalls offenbart.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Im ersten Aspekt bietet die Erfindung eine isolierte DNA, die ein elk-L Protein kodiert, das zur Bindung an elk in der Lage ist, wobei besagte DNA eine Nukleotidsequenz aufweist, die zumindest 80% zu einer Sequenz identisch ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Nukleotiden 1-1041, 73-1041, 1-711 und 73-711 der SEQ ID NO:1.
In einem anderen Aspekt bietet die vorliegende Erfindung eine isolierte DNA, die ein elk-L Protein kodiert, das zur Bindung an elk in der Lage ist, wobei besagtes elk-L einen Aminosäure-Sequenz aufweist, die zumindest zu 80% zu einer Sequenz identisch ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuren 1-322 und 1-213 der SEQ ID NR:2.
In einem weiteren Aspekt bietet die vorliegende Erfindung gereinigtes biologisch aktives, reifes elk-L Protein, dadurch gekennzeichnet, dass die N-terminale Aminosäure-Sequenz Ala-Thr-Pro-Leu-Ala-Lys-Asn-Leu-Glu-Pro-Val-Ser ist.
In einem anderen Aspekt bietet die vorliegende Erfindung ein gereinigtes elk-L Protein, welches eine Aminosäure-Sequenz aufweist, die zumindest zu 80% zu einer Sequenz identisch ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuren 1-322 und 1-213 der SEQ ID NR:2.
Eine cDNA, die einen neuartigen Proteinliganden kodiert, der an das als elk bekannte Ratten Zelloberflächenprotein bindet, wurde in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung isoliert. Ebenfalls bereitgestellt sind Expressionsvektoren, die die elk-Ligand (elk-L) cDNA aufweisen, und Verfahren zum Herstellen von rekombinanten elk-L Polypeptiden durch Kultivieren von Wirtszellen, die die Expressionsvektoren enthalten, unter Bedingungen, die für die Expression von elk-L geeignet sind, und Gewinnen des exprimierten elk-L. Gereinigtes elk-L Protein ist ebenfalls durch die vorliegende Erfindung umfasst, einschließlich löslicher Formen des Proteins, die die extrazelluläre Domäne aufweist.
Die vorliegende Erfindung bietet auch elk-L oder antigene Fragmente davon, die als Immunogene fungieren können, um Antikörper zu erzeugen, die für die elk-L Immunogene spezifisch sind. Für elk-L spezifische monoklonale Antikörper oder antigene Fragmente davon können somit hergestellt werden.
Das hierin offenbarte neuartige Cytokin ist ein Ligand für elk, einem Ratten Zelloberflächen-Rezeptor, der ein Mitglied der Tyrosin-Kinase-Rezeptorfamilie ist. Mitglieder dieser Rezeptorfamilie weisen eine Kinase-Aktivität auf, die bei der Ligandenbindung aktiviert wird. Die Bindung von elk-L an elk auf der Zelloberfläche kann ein durch elk vermitteltes biologisches Signal auslösen. Eine Verwendung des elk Liganden der vorliegenden Erfindung ist als ein Forschungswerkzeug zum Untersuchen der Natur dieses biologischen Signals und der Rolle, die elk-L, im Zusammenhang mit elk, beim Wachstum oder der Differenzierung von Zellen, die den elk Rezeptor tragen, spielen kann. Die Expression von elk mRNA wurde im Hirn und Hoden von Ratten (Lhotok et al., supra) nachgewiesen und die Möglichkeit, das elk zur onkogenen Aktivierung in der Lage ist, wurde vorgeschlagen (Letwin et al., supra).
Die elk-L Polypeptide der vorliegenden Erfindung finden Verwendung als Protein-Reinigungsreagenzien und können auch in in-vitro-Untersuchungen für die Detektion von elk oder elk-L oder der Interaktion davon eingesetzt werden. Diese und andere Verwendungen von elk-Liganden werden später weiter diskutiert.
Um Zellen zu identifizieren, die für die Verwendung als Nukleinsäure-Quellen in dem Klonierungsansatz geeignet sind, wurden über 30 verschiedene Arten von murinen und menschlichen Zellen auf ihre Fähigkeit gescreent, elk (in der Form eines Fusionproteins, das Ratten elk und ein Antikörper Fc Polypeptid aufweist) zu binden.
Wie in Beispiel 2 beschrieben, zeigte keine der Zellarten eine nachweisbare elk-Bindung. Da Plazenta-Gewebe reich an Wachstums- und Differenzierungsfaktoren ist, wurde eine menschliche, plazentale cDNA Expressionsbibliothek mit Ratten elk/Fc in einem Versuch gescreent, ein elk-L Klon zu isolieren. Obwohl es nicht bekannt ist, ob Plazenta ein elk-L exprimiert oder nicht, und die Fähigkeit von Ratten elk an humanes elk-L zu binden ebenfalls unbekannt war, wurde humane elk-L cDNA erfolgreich isoliert, wie in Beispiel 3 beschrieben ist. Die DNA Sequenz und kodierte Aminosäure-Sequenz der kodierenden Region von einem humanen elk-L cDNA Klon sind in SEQ ID NR:1 und SEQ ID NR:2 dargelegt.
Humane elk-L cDNA, die die kodierende Region aufweist, wurde aus dem positiven Klon isoliert und in die SmaI Stelle (in die Mehrfachklonierungsstellen-Region) des Klonierungsvektors pBLUESCRIPT^®SK(-), erhältlich von Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, eingefügt. Der resultierende rekombinante in pBLUESCRIPT^®SK(-) Vektor, als Tele 7 bezeichnet, wurde, in E. coli DH5α Zellen bei der American Type Cuture Collection am 9. Oktober 1992 hinterlegt und die Hinterlegungsnummer ATCC 69085 zugeordnet. Die Hinterlegung erfolgte gemäß den Regeln des Budapester Vertrags.
Der Vergleich von sowohl der Nukleotid- als auch der kodierten Aminosäure-Sequenzen des humanen elk-L cDNA Klons mit den Genbank und Swisspro Datenbanken zeigte, dass die Sequenz des elk-Liganden einzigartig war. Eine Aminosäure-Sequenz wurden bei dieser Suche identifziert, die eine eingeschränkte Sequenzidentität mit dem elk-Liganden teilte. Diese Sequenz war für das B61 Protein, welches zuvor als das Produkt eines neuartigen unmittelbar-frühren Antwortgens, das durch TNF in menschlichen Nabelvenen Endothelzellen induziert wird, identifiziert wurde (Holzman et al., Mol. Cell. Biol. 10:5830, 1990). Alle vier der Cysteinreste in der extrazellulären Domäne der zwei Proteine sind konserviert, und die gesamte Aminosäure-Identität zwischen dem menschlichen elk-L und B61 ist 33%. Im Gegensatz zu dem elk Ligand wurde vom B61 Protein berichtet, dass es sezerniert wird, jedoch mit einem hydrophoben Schwanz endet und es wurde vorgeschlagen, dass es mit der Membran durch eine Glycosylphosphatidyl-Inositol-Bindung assoziiert ist (Holzmann et al., supra). Die Funktion des B61 Proteins ist unbekannt.
Der Begriff „elk-L", so wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Gattung von Polypeptiden, die in der Lage sind, elk zu binden und eine Homologie zu den hierin offenbarten nativen elk-L Polypeptiden zeigen, die eine Aminosäure-Sequenz aufweisen, die über 80% zu einer Aminosäure-Sequenz der SEQ ID NR:2 identisch ist. Menschlicher elk-L ist innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung, wie elk-L-Proteine sind, die von anderen Säugetierspezies abgeleitet sind, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Maus, Ratten, Rinder, Schwein, oder verschiedene Primatenzellen. So wie hierin verwendet, umfasst der Begriff „elk-L" Membran-gebundene Proteine (die eine cytoplasmatische Domäne, eine Transmembran-Region, und eine extrazelluläre Domäne aufweisen), sowie verkürzte Proteine, die die elk-Bindungseigenschaften beibehalten. Solche verkürzte Proteine umfassen, zum Beispiel, lösliches elk-L, die nur die extrazelluläre (Rezeptorbindungs-)Domäne aufweisen.
Die humane elk-L cDNA kann radiomarkiert sein und als eine Sonde verwendet werden, um andere Säugetier elk-L cDNAs durch Kreuz-Spezies Hybridisation zu isolieren. Zum Beispiel kann eine aus Plazenta-Gewebe von anderen Säugetier-Spezies hergestellte cDNA Bibliothek mit einer radiomakierten humanen elk-L cDNA gescreent werden, um einen positiven Klon zu isolieren. Alternativ können mRNAs, die von verschiedenen Zelllinien isoliert wurden, durch Northern-Hybridisierung gescreent werden, um eine geeignete Quelle von Säugetier elk-L mRNA für die Verwendung beim Klonieren eines elk-L Gens zu bestimmen.
Obwohl ein elk/Fc-Fusionsprotein in der Screening-Prozedur, später in Beispiel 3 beschrieben, eingesetzt wurde, kann elk verwendet werden, um Klone und Kandidaten Zelllinien für die Expression von elk-L Proteinen zu screenen. Das elk/Fc Fusionsprotein bietet jedoch den Vorteil, leichter gereinigt werden zu können. Zusätzlich bilden sich Disulfidbindungen zwischen den Fc-Regionen von zwei getrennten Fusionsproteinketten, wodurch Dimere erzeugt werden. Der dimere elk/Fc Rezeptor wurde für den potentiellen Vorteil der höheren Affinitätsbindung des elk Liganden ausgewählt, angesichts der Möglichkeit, dass der gesuchte Ligand multimer sein würde.
Andere Antikörper Fc-Regionen können durch die humane IgG1-Fc-Region, beschrieben in Beispiel 1, substituiert werden. Andere geeignete Fc-Regionen sind jene, die mit hoher Affinität zu Protein A oder Protein G binden können, und umfassen die Fc Region von murinem IgG1 oder Fragmente der humanen IgG1 Fc Region, z.B. Fragmente, die zumindest die Hinge-Region aufweisen, sodass sich Interketten-Disulfidbindungen bilden werden.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bietet lösliche elk-L-Polypeptide. Lösliche elk-L Polypeptide weisen die gesamte oder einen Teil der extrazellulären Domäne eines nativen elk-L auf, es fehlt ihnen jedoch die Transmembran-Region, die die Zurückhaltung des Polypeptids an einer Zellmembran bewirken würde. Lösliche elk-L Polypeptide weisen vorteilhafter Weise das native (oder ein heterologes) Signalpeptid auf, wenn es anfänglich synthetisiert werden, um die Sekretion zu fördern, jedoch wird das Signalpeptid bei der Sekretion von elk-L aus der Zelle abgespalten. Die löslichen elk-L Polypeptide, die verwendet werden können, behalten die Fähigkeit, den elk-Rezeptor zu binden. Lösliches elk-L kann ebenfalls einen Teil der Transmembran-Region oder einen Teil der cytoplasmatischen Domäne oder andere Sequenzen umfassen, vorausgesetzt, dass das lösliche elk-L Protein in der Lage ist, sezerniert zu werden.
Lösliches elk-L kann durch Abtrennen intakter Zellen, welche das gewünschte Protein exprimieren, von dem Kulturmedium, z.B. durch Zentrifugieren, und Untersuchen des Mediums (Überstand) auf die Gegenwart des gewünschten Protein identifiziert (und von seinen nicht-löslichen Membran-gebundenen Gegenstücken unterschieden) werden. Die Gegenwart von elk-L in dem Medium weist darauf hin, das das Protein von den Zellen sezerniert wurde und somit eine lösliche Form des gewünschten Proteins ist. Lösliches elk-L kann eine natürlich vorkommende Form dieses Proteins sein.
Die Verwendung von löslichen Formen von elk-L ist für bestimmte Anwendungen vorteilhaft. Die Reinigung des Proteins von rekombinanten Wirtszellen wird erleichtert, da die löslichen Proteine von den Zellen sezerniert werden. Ferner sind lösliche Proteine im Allgemeinen für die intravenöse Verabreichung geeigneter.
Beispiele von löslichen elk-L-Polypeptide umfassen jene, die die gesamte extrazelluläre Domäne eines nativen elk-L Proteins aufweisen. Ein solches lösliches elk-L Protein weist die Aminosäuren 1 (Ala) bis 213 (Lys) der SEQ ID NR:2 auf. Wenn anfänglich innerhalb einer Wirtszelle exprimiert, kann das lösliche Protein zusätzlich eines der heterologen Signalpeptide, die später beschrieben sind, aufweisen, das innerhalb der eingesetzten Wirtszelle funktionell ist. Alternativ kann das Protein das native Signalpeptid aufweisen, so dass das elk die Aminosäuren-24 (Met) bis 213 (Lys) der SEQ ID NR:2 aufweist. In einer Ausführungsform der Erfindung wird das lösliche elk-L anfänglich als ein Fusionsprotein, welches (vom N- zum C-Terminus) das Hefe α Faktor-Signalpeptid, das FLAG^®-Peptid, später und im U.S. Patent 5,011,912 beschrieben, und lösliches elk-L, das die Aminosäuren 1-213 der SEQ ID NR:2 aufweist, enthält. Dieses rekombinante Fusionsprotein wird in Hefezellen exprimiert und von diesen sezerniert. Das FLAG^®-Peptid erleichtert die Reinigung des Proteins, und kann nachfolgend von dem löslichen elk-L mittels boviner mucosaler Enterokinase abgespalten werden. DNA Sequenzen, die lösliche elk-L Proteine kodieren, sind durch die vorliegende Erfindung umfasst.
Verkürztes elk-L, einschließlich löslicher Polypeptide, können durch eine beliebige einer Reihe von herkömmlichen Techniken hergestellt werden. Eine gewünschte DNA Sequenz kann unter Verwendung bekannter Techniken chemisch synthetisiert werden. DNA Fragmente können ebenfalls durch Restriktionsendonuklease-Verdau einer klonierten DNA Sequenz mit voller Länge hergestellt werden, und durch Elektrophorese auf Agarosegelen isoliert werden. Linker, die Restriktionsendonuklease-Spaltungsstellen enthalten, können verwendet werden, um das gewünschte DNA Fragment in einen Expressionsvektor einzuführen, oder das Fragment kann an den Spaltungsstellen, die darin natürlich vorkommen, verdaut werden. Die bekannte Polymerase-Kettenreaktions-Prozedur kann ebenfalls verwendet werden, um eine DNA Sequenz zu isolieren, die ein gewünschtes Proteinfragment kodiert. Als eine weitere Alternative können bekannte Mutagenese-Techniken eingesetzt werden, um ein Stoppkodon an einem gewünschten Punkt, z.B. unmittelbar stromabwärts des Kodons für die letzte Aminosäure der extrazellulären Domäne einzuführen.
In einem anderen Ansatz kann die enzymatische Behandlung (z.B. unter Verwendung von Bal 31 Exonuklease) eingesetzt werden, um terminale Nukleotide von einem DNA Fragment zu entfernen, um ein Fragment mit einem bestimmten, gewünschten Terminus zu erhalten. Unter den kommerziell erhältlichen Linkern sind jene, die an die stumpfen Enden, die durch den Bal 31 Verdau erzeugt wurden, ligiert werden können, und welche Restriktionsendonukleasen-Spaltungsstelle(n) enthalten. Alternativ können Oligonukleotide, die den N oder C-Terminus eines DNA Fragments zu einem gewünschten Punkt rekonstruieren, synthetisiert werden. Das Oligonukleotid kann eine Restriktionsendonuklease Spaltungsstelle stromaufwärts der gewünschten Kodierungssequenz enthalten und ein Initiatorkodon (ATG) an dem N-Terminus der kodierenden Sequenz positionieren.
Die vorliegende Erfindung bietet gereinigte elk-L Polypeptide, sowohl rekombinante als auch nicht-rekombinate. Varianten und Derivate von nativen elk-L Proteinen, die die gewünschte biologische Aktivität (z.B. die Fähigkeit, elk zu binden) beibehalten, sind auch innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung. Elk-L Varianten können durch Mutationen von Nukleotidsequenzen, die native elk-L Polypeptide kodieren, erhalten werden. Eine elk-L Variante, wie hierin genannt, ist ein Polypeptid, das im Wesentlichen zu einem nativen elk-L homolog ist, jedoch eine Aminosäure-Sequenz aufweist, die sich von jener eines nativen elk-L (human, murin oder anderen Säugetier-Spezies) unterscheidet, aufgrund einer oder mehrerer Deletionen, Insertionen oder Substitutionen.
Die Variante Aminosäuresequenz ist zumindest zu 80% identisch mit einer nativen elk-L Aminosäuresequenz, am bevorzugtesten zu mindestens 90%. Die prozentuelle Identität kann, zum Beispiel, durch Vergleichen der Sequenzinformation unter Verwendung des GAP Computer Programms, Version 6,0, bestimmt werden, welches von Devereux et al. (Nucl. Acids Res.
12:387, 1984) beschrieben ist und von der University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG) erhältlich ist. Das GAP Programm nutzt das Ausrichtungsverfahren von Needleman und Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), wie von Smith und Waterman (Adv. Appl. Math 2:482, 1981) besprochen. Die bevorzugten Standardparameter für das GAP-Programm schließen ein: (1) eine unäre Vergleichsmatrix (die einen Wert von 1 für Identitäten und 0 für Nicht-Identitäten enthält) für Nukleotide und die gewichtete Vergleichsmatrix von Gribskov und Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986, wie von Schwartz und Dayhoff eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979, beschrieben; (2) eine Strafe von 3,0 für jede Lücke und eine zusätzliche Strafe von 0,10 für jedes Symbol in jeder Lücke; und (3) keine Strafe für Endlücken. Für elk-L Fragmente basiert die prozentuelle Identität auf jenem Anteil einen nativen elk-L Proteins, der im Fragment vorhanden ist.
Änderungen der nativen Sequenz können durch eine beliebige von einer Reihe von bekannten Techniken erzielt werden. Mutationen können an bestimmten Stellen durch das Synthetisieren von Oligonukleotiden eingefügt werden, die eine mutierte Sequenz enthalten, flankiert von Restriktionsstellen, welche die Ligation an Fragmente der nativen Sequenz ermöglichen. Nach der Ligation codiert die resultierende rekonstruierte Sequenz ein Analogon, das die gewünschte Aminosäure-Insertion, Substitution oder Deletion aufweist.
Alternativ dazu können Oligonukleotid-gerichtete, ortsspezifische Mutageneseverfahren angewendet werden, um ein geändertes Gen bereitzustellen, wobei bestimmte Kodons gemäß den erforderlichen Substitution, Deletion oder Insertion geändert sind. Beispielhafte Verfahren zur Durchführung der oben genannten Änderungen werden von Walder et al. (Gene 42:133, 1986); Bauer et al. (Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, Januar 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488, 1985); Kunkel et al. (Methods in Enzymol. 154:367, 1987); und in den US-Patentschriften Nr. 4,518,584 und 4,737,462 offenbart.
Varianten können konservativ substituierte Sequenzen enthalten, das heißt, dass ein bestimmter Aminosäurerest durch einen Rest ersetzt wird, der ähnliche physicochemische Eigenschaften aufweist. Beispiele für konservative Substitutionen schließen die Substitution eines aliphatischen Rests durch einen anderen ein, wie beispielsweise Ile, Val, Leu oder Ala durch einen anderen, oder Substitutionen eines polaren Rests durch einen anderen, wie zum Beispiel zwischen Lys und Arg; Glu und Asp; oder Gln und Asn. Andere konservative Substitutionen dieser Art, zum Beispiel Substitutionen ganzer Regionen mit ähnlichen Hydrophobizitätseigenschaften sind weithin bekannt.
Elk-L kann modifiziert werden, um elk-L-Derivate durch Bilden kovalenter oder aggregierender Konjugate mit anderen chemischen Anteilen wie Glycosylgruppen, Lipiden, Phosphaten, Acetylgruppen und dergleichen zu erzeugen. Kovalente Derivate von elk-L können durch Verknüpfen der chemischen Anteile zu funktionellen Gruppen auf elk-L-Aminosäure-Seitenketten oder am N-Terminus oder C-Terminus eines elk-L-Polypeptids oder der extrazellulären Domäne davon hergestellt werden. Andere Derivate von elk-L, die innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung liegen, schließen kovalente oder aggregierende Konjugate von elk-L oder seinen Fragmenten mit anderen Proteinen oder Polypeptiden ein, wie zum Beispiel durch Synthese in rekombinanter Kultur als N-terminale oder C-terminale Fusionen. Zum Beispiel kann das Konjugat eine Signal- oder Leader-Polypeptidsequenz (z.B. den α-Faktor-Leader von Saccharomyces) am N-Terminus eines elk-L-Polypeptids enthalten. Das Signal- oder Leader-Peptid lenkt den Transfer des Konjugats co-translational oder post-translational von seiner Synthesestelle zu einer Stelle innerhalb oder außerhalb der Zellmembran oder Zellwand.
elk-L-Polypeptidfusionen können Peptide aufweisen, welche hinzugefügt werden, um die Reinigung und Identifikation von elk-L zu erleichtern. Zu solchen Peptiden zählen zum Beispiel poly-His oder die antigenen Identifikationspeptide, die in der US-Patentschrift Nr. 5,011,912 und in Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988 beschrieben sind. Ein solches Peptid ist das Flag^®-Peptid, Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK), das stark antigen ist und mit einem Epitop ausgestattet ist, das mittels eines spezifischen monoklonalen Antikörpers reversibel gebunden ist, wodurch eine schnelle Prüfung und eine einfache Reinigung des exprimierten rekombinanten Proteins ermöglicht wird. Diese Sequenz wird spezifische durch bovine mucosale Enterokinase an dem Rest unmittelbar im Anschluss an das Asp-Lys-Paar gespalten. Fusionsproteine, die mit diesem Peptid begrenzt sind, können auch gegenüber einem intrazellulären Abbau in E. coli resistent sein. Ein Maus-Hybridom mit der Bezeichnung 4E11 erzeugt einen monoklonalen Antikörper, der das Peptid DYKDDDDK bei Vorhandensein bestimmter zweiwertiger Metall-Kationen bindet (wie in dem US-Patent 5,011,912 beschrieben) und wurde bei der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer HB 9259 hinterlegt.
Die vorliegende Erfindung schließt ferner elk-L Polypeptide mit oder ohne dazugehöriger Glycosylierung mit nativem Muster ein. Elk-L, das in Hefe oder Säugetier-Expressionssystemen (z.B. COS-7-Zellen) exprimiert ist, kann einem nativen elk-L Polypeptid in Bezug auf das Molekulargewicht und das Glycosylierungsmuster ähnlich sein oder sich von diesem deutlich unterscheiden, je nachdem, welches Expressionssystem gewählt wurde. Die Expression von elk-L Polypeptiden in bakteriellen Expressionssystemen, wie E. coli, stellt nicht-glycosylierte Moleküle bereit.
DNA Konstrukte, die verschiedene Additionen oder Substitutionen von Aminosäureresten oder Sequenzen, oder Deletionen von terminalen oder internen Resten oder Sequenzen kodieren, die für die biologische Aktivität oder Bindung nicht benötigt werden, können hergestellt werden. Zum Beispiel, können N-Glycosylierungsstellen in der elk-L extrazellulären Domäne modifiziert werden, um Glycosylierung auszuschließen, was die Expression eines homogeneren, reduzierten Kohlenhydrat-Analogons in Säugetier- und Hefeexpressionssystemen ermöglicht. N-Glycosylierungsstellen in eukaryotischen Polypeptiden sind durch eine Aminosäure-Dreiergruppe Asn-X-Y gekennzeichnet, wobei X irgendeine Aminosäure mit Ausnahme von Pro ist, und Y für Ser oder Thr steht. Das humane elk-L Protein weist eine solche Dreiergruppe bei den Aminosäuren 115-117 der SEQ ID NR:2 auf. Geeignete Modifikationen an der Nukleotidsequenz, welche diese Dreiergruppen codiert, führen zu Substitutionen, Additionen oder Deletionen, die das Anheftens von Kohlenhydratresten an die Asn-Seitenkette verhindern. Eine Änderung eines einzelnen Nukleotids, die so gewählt wird, dass Asn durch eine andere Aminosäure ersetzt wird, ist zum Beispiel ausreichend, um eine N-Glycosylierungsstelle zu inaktivieren. Bekannte Verfahren für das Inaktivieren von N-Glycosylierungsstellen in Proteinen schließen jene Verfahren ein, die in der US-Patentschrift 5,071,972 und in EP 276,846 beschrieben sind.
In einem anderen Beispiel können Sequenzen, die Cys-Reste codieren, die für die biologische Aktivität nicht wesentlich sind, geändert werden, um zu bewirken, dass die Cys-Reste entfernt oder durch andere Aminosäuren ersetzt werden, wodurch die Bildung von inkorrekten intramolekularen Disulfidbrücken bei Renaturierung verhindert wird. Andere Äquivalente werden durch Modifikation von benachbarten zweibasischen Aminosäureresten hergestellt, um die Expression in Hefesystemen zu verstärken, in denen KEX2-Proteaseaktivität vorhanden ist. EP 212,914 offenbart die Verwendung von ortsspezifischer Mutagenese, um KEX2-Proteaseverarbeitungsstellen in einem Protein zu inaktivieren. KEX2-Proteaseverarbeitungsstellen werden durch Entfernen, Hinzufügen oder Ersetzen von Resten inaktiviert, um Arg-Arg, Arg-Lys und Lys-Arg-Paare zu ändern und so das Auftreten dieser benachbarten basischen Reste zu beseitigen. Lys-Lys-Paare sind weitaus weniger anfällig für KEX2-Spaltung, und die Umwandlung von Arg-Lys oder Lys-Arg in Lys-Lys stellt einen konservativen und bevorzugten Ansatz für das Inaktivieren von KEX2-Stellen dar. Das humane elk-L enthält drei KEX2-Proteaseverarbeitungsstellen bei den Aminosäuren 242-243, 243-244 und 246-247 der SEQ ID NR:2.
Natürlich vorkommende elk-L Varianten sind ebenfalls durch die Erfindung umfasst. Beispiele von solchen Varianten sind Proteine, die von abwechselnden mRNA Spleißvorgängen oder von der proteolytischen Spaltung des elk-L Proteins herrühren, wobei die elk-L Bindungseigenschaft aufrechterhalten wird. Abwechselndes Spleißen von mRNA kann ein verkürztes, jedoch biologisch aktives elk-L Protein ergeben, wie zum Beispiel eine natürlich vorkommende, lösliche Form des Proteins. Zu Variationen, die der Proteolyse zugeschrieben werden können, zählen, zum Beispiel, Unterschiede in den N- oder C-Termini bei der Expression in unterschiedlichen Arten von Wirtszellen, aufgrund der proteolytischen Entfernung von einer oder mehreren terminalen Aminosäuren von dem elk-L Protein (im Allgemeinen von 1-5 terminalen Aminosäuren).
Nukleinsäuresequenzen innerhalb des Umfangs der Erfindung umfassen isolierte humane DNA und RNA Sequenzen, die an die hierin offenbarten nativen elk-L Nukleotidsequenzen unter Bedingungen mäßiger Stringenz oder hoher Stringenz hybridisieren und die biologisch aktives elk-L kodieren. Bedingungen mäßiger Stringenz beziehen sich auf Bedingungen, die in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Band 1, S. 101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) beschrieben sind. Bedingungen mäßiger Stringenz, wie in Sambrook et al. definiert, umfassen die Verwendung einer Vorwaschlösung von 5 × SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0) und Hybridisierungsbedingungen von etwa 55°C, 5 × SSC, über Nacht. Bedingungen hoher Stringenz umfassen höhere Temperaturen von Hybridisierung und Waschung. Der Fachmann wird erkennen, dass die Temperatur und Waschlösung-Salzkonzentration eingestellt werden können, wie gemäß von Faktoren, wie der Länge der Sonde notwendig ist.
Aufgrund der bekannten Degeneration des genetischen Codes kann mehr als ein Kodon dieselbe Aminosäure kodieren, somit kann eine DNA-Sequenz von der in SEQ ID NR:1 dargestellten Sequenz abweichen und dennoch ein elk-L mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NR:1 kodieren. Solche abweichenden DNA-Sequenzen können aus stillen Mutationen resultieren (z.B. die während der PCR-Amplifikation auftreten), oder können das Produkt einer vorsätzlichen Mutagenese einer nativen Sequenz sein.
Die vorliegende Erfindung bietet somit isolierte DNA Sequenzen, die biologisch aktives elk-L kodieren, ausgewählt aus: (a) DNA, die von der kodierenden Region eines nativen Säugetier elk-L Gens abgeleitet ist (z.B., cDNA, die die Nukleotidsequenz aufweist, die in SEQ ID NR:1 dargestellt ist); (b) DNA, die in der Lage ist, mit einer DNA von (a) unter mäßig stringenten Bedingungen zu hybridisieren und welche biologisch aktives elk-L kodiert; und (c) DNA, die als Folge des genetischen Kodes zu einer DNA, die in (a) oder (b) definiert ist, degeneriert ist und welche biologisch aktives elk-L kodiert. Die elk-L Proteine, die durch solche DNA Sequenzen kodiert sind, sind durch die vorliegende Erfindung umfasst.
Beispiele von elk-L Proteinen, die durch DNA kodiert sind, die von der nativen DNA-Sequenz der SEQ ID NR:1 variieren, wobei die Variante DNA mit der nativen DNA-Sequenz unter mäßig stringenten Bedingungen hybridisieren werden, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, elk-L Fragmente (lösliche und Membran-gebundene) und elk-L Proteine, die inaktivierte N-Glycosylierungsstellen, inaktivierte KEX-2 Protease-Bearbeitungsstellen, oder konservierte Aminosäure-Substitutionen, wie oben beschrieben, aufweisen. Elk-L Proteine, die durch DNA kodiert sind, die von anderen Säugetier-Spezies abgeleitet sind, wobei die DNA mit der humanen DNA der SEQ ID NR:1 hybridisieren wird, sind ebenfalls eingeschlossen.
Varianten, die die erforderliche Fähigkeit besitzen, an elk zu binden, können durch jede geeignete Untersuchung identifiziert werden. Biologische Aktivität von elk-L kann, zum Beispiel, durch Kompetition um die Bindung an die Ligandenbindungsdomäne von elk bestimmt werden (d.h. kompetitive Bindungsuntersuchung).
Eine Art einer Konkurrenzbindungsuntersuchung für ein elk-L Polypeptid verwendet ein radiomarkiertes, lösliches elk-L und intakte Zellen, die Zelloberflächen elk exprimieren. Anstelle von intakten Zellen könnte lösliches elk-L (wie ein elk/Fc-Fusionsprotein), das an eine Festphase durch die Interaktion von Protein A, oder Protein G mit der Fc-Region des Fusionsproteins gebunden ist. Eine andere Art von Konkurrenzbindungsuntersuchung benutzt radiomarkierte, lösliches elk. wie ein elk Fc Fusionsprotein, und intakte Zellen, die elk-L exprimieren. Alternativ könnte lösliches elk-L an eine Festphase gebunden sein.
Konkurrenzbindungsuntersuchungen können durch Folgen einer herkömmlichen Methodologie durchgeführt werden. Zum Beispiel kann radiomarkiertes elk-L verwendet werden, um mit einem mutmaßlichen elk-L Homologon zu konkurrieren, um die Bindungsaktivität gegen Oberflächen-gebundenes elk zu untersuchen. Qualitative Ergebnisse können durch kompetitive autoradiographische Plattenbindungsuntersuchungen erhalten werden, oder Scatchard-Diagramme können benutzt werden, um quantitative Ergebnisse zu erzeugen.
Alternativ kann lösliches elk an eine Festphase, wie eine Säulenchromatographie-Matrix oder ein ähnliches Substrat, das für die Analyse der Gegenwart eines nachweisbaren Anteils, wie ¹²⁵I, geeignet ist. Bindung an eine Festphase kann zum Beispiel, durch Binden eines elk/Fc-Fusionsproteins an eine Protein A- oder Protein G-enthaltende Matrix erreicht werden.
Die Bindungseigenschaften von elk-L (einschließlich von Varianten) können ebenfalls unter Verwendung des konjugierten, löslichen elk (zum Beispiel, ¹²⁵I-elk/Fc) in Konkurrenzuntersuchungen, ähnlich zu den oben beschriebenen, bestimmt werden. In diesem Fall werden jedoch intakte Zellen, die elk-L oder lösliches elk-L exprimieren und an ein festes Substrat gebunden sind, verwendet, um das Ausmaß zu messen, zu welchem eine Probe, die eine mutmaßliche elk Variante enthält, um die Bindung mit einem konjugierten, löslichen elk an elk-L konkurriert.
Der elk-L der vorliegenden Erfindung kann in Bindungsuntersuchungen verwendet werden, um Zellen, die elk exprimieren, zu ermitteln. Zum Beispiel kann elk-L oder eine extrazelluläre Domäne oder ein Fragment davon an einen nachweisbaren Anteil, wie ¹²⁵I, konjugiert werden. Die Radiomarkierung mit ¹²⁵I kann durch jede von vielen Standardmethodologien durchgeführt werden, die ein funktionelles ¹²⁵I-elk-L Molekül ergeben, das mit einer hochspezifischen Aktivität markiert ist. Alternativ kann ein anderer detektierbarer Anteil, wie ein Enzym, das eine kolorimetrische oder fluorometrische Reaktion katalysieren kann, Biotin oder Avidin verwendet werden. Zellen, die auf elk-Expression untersucht werden, können mit markiertem elk-L in Kontakt gebracht werden. Nach der Inkubation wird ungebundenes, markiertes elk-L entfernt und die Bindung wird unter Verwendung des nachweisbaren Anteils gemessen.
Die hierin offenbarten elk Ligandproteine können auch verwendet werden, um die biologische Aktivität von elk-Protein im Hinblick auf ihre Bindungsaffinität für elk-L zu messen. Zur Veranschaulichung sei angemerkt, dass elk-L in einer Bindungsaffinitätsstudie verwendet werden kann, um die biologische Aktivität eines elk-Proteins, das bei unterschiedlichen Temperaturen gelagert wurde, oder in unterschiedlichen Zellarten erzeugt wurde, zu messen. Die biologische Aktivität eines elk-Proteins kann somit ermittelt werden, bevor dieses zum Beispiel in einer Forschungsstudie verwendet wird.
Elk-L Proteine finden als Reagens Anwendung, das von den Verantwortlichen für „Qualitätssicherungsstudien" eingesetzt werden kann, z.B. um die Haltbarkeit und Stabilität des elk-Proteins unter verschiedenen Bedingungen zu überwachen. Zum Beispiel können elk-Liganden dazu verwendet werden, um zu bestimmen, ob die biologische Aktivität nach der Modifikation eines elk-Proteins beibehalten wird (z.B. chemische Modifikation, Verkürzung, Mutation usw.). Die Bindungsaffinität des modifizierten elk-Proteins für ein elk-L wird mit jener eines unmodifizierten elk-Proteins verglichen, um etwaige negative Auswirkungen der Modifikationen auf die biologische Aktivität von Elk festzustellen.
Eine unterschiedliche Verwendung eines elk-Liganden ist als ein Reagens in Proteinreinigungsprozeduren. Elk-L oder elk-L/Fc Fusionsproteine können an ein Festphasen-Trägermaterial durch herkömmliche Techniken gebunden werden, und verwendet werden, um elk durch Affinitätschromatographie zu reinigen.
elk-L Polypeptide können auch als Oligomere, wie Dimere oder Trimere existieren. Oligomere können durch Disulfidbindungen, die zwischen Cysteinresten auf unterschiedlichen elk-L Polypeptiden gebildet werden, verbunden werden. In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein elk-L Dimer durch Fusionieren von elk-L an die Fc-Region eines Antikörpers (z.B. IgG1) auf eine Weise erzeugt, die mit der Bindung von elk-L an die elk-Ligandenbindungsdomäne nicht interferiert. Das Fc Polypeptid wird vorzugsweise an den C-Terminus eines löslichen elk-L (welches nur die extrazelluläre Domäne aufweist) fusioniert. Die Herstellung von Fusionsproteinen, die heterologe Polypeptide aufweisen, die mit verschiedenen Abschnitten von Antikörper-abgeleiteten Polypeptiden (einschließlich der Fc-Domäne) fusioniert sind, wurde beschrieben, siehe z.B. Ashkenazi et. al. (PNAS USA 88:10535, 1991), und Byrn et. al. (Nature 344:677, 1990). Eine Genfusion, die das elk-L/Fc-Fusionsprotein kodiert, wird in einen geeigneten Expressionsvektor eingefügt. Den elk-L/Fc-Fusionsproteinen wird ermöglicht, sich ganz wie Antikörper-Moleküle zusammenzufinden, woraufhin sich zwischen den Ketten der Fc-Polypeptide Disulfid-Bindungen ausbilden, die zu einem bivalenten elk-L führen. Wenn Fusionsproteine sowohl mit schweren als auch mit leichten Ketten eines Antikörpers hergestellt werden, ist es möglich, ein elk-L Oligomer mit nicht weniger als vier elk-L-extrazellulären Regionen zu bilden. Alternativ können zwei lösliche elk-L Domänen mit einem Peptidlinker verbunden werden, wie die im U.S. Patent 5,073,627 beschriebene Gly₄SerGly₅Ser Linker-Sequenz.
Die vorliegende Erfindung bietet Oligomere der elk-L extrazellulären Domäne oder Fragmente davon, die durch Disulfid-Interaktionen verbunden sind, oder als Fusionspolymere mit oder ohne Spacer-Aminosäure-Bindungsgruppen exprimiert sind. Zum Beispiel kann ein Dimer der elk-L extrazellulären Domänen durch eine IgG Fc Region Bindungsgruppe verbunden sein.
Die vorliegende Erfindung bietet rekombinante Expressionsvektoren für die Expression von elk-L, und mit den Expressionsvektoren transformierte Wirtszellen. Jedes geeignete Expressionssystem kann verwendet werden. Die Vektoren umfassen eine elk-L DNA Sequenz, die mit geeigneten transkriptionalen oder translationalen regulatorischen Nukleotidsequenzen wirkungsmäßig verbunden sind, wie jenen, die von einem Säugetier-, mikrobiellen, viralen oder Insektengen abgeleitet sind. Beispiele von regulatorischen Sequenzen umfassen transkriptionale Promotoren, Operatoren, oder Verstärker, eine mRNA Ribosomenbindungsstelle, und geeignete Sequenzen, die die Transkription- und Translation-Initiierung und Termination steuern. Nukleotidsequenzen sind wirkungsmäßig verbunden, wenn die regulatorische Sequenz die elk-L DNA Sequenz funktionell betrifft. Somit ist eine Promotor-Nukleotidsequenz mit einer elk-L DNA Sequenz wirkungsmäßig verbunden, wenn die Promotor-Nukleotidsequenz die Transkription der elk-L DNA Sequenz steuert. Die Fähigkeit in der gewünschten Wirtszelle zu replizieren, die üblicherweise durch einen Replikationsursprung verliehen wird, und ein Selektionsgen, durch welches Transformanten identifiziert werden können, können zusätzlich in den Expressionsvektor eingebaut werden.
Zusätzlich können Sequenzen, die geeignete Signalpeptide kodieren, die für das elk-L Gen nicht nativ sind, in die Expressionsvektoren eingebaut werden. Zum Beispiel kann eine DNA Sequenz für ein Signalpeptid (Leitsequenz) im Rahmen mit der elk-L Sequenz fusioniert werden, so dass das elk-L anfänglich als ein Fusionsprotein translatiert ist, welches das Signalpeptid aufweist. Ein Signalpeptid, das in den beabsichtigen Wirtszellen funktionell ist, verstärkt die extrazelluläre Sekretion des elk-L Polypeptids. Das Signalpeptid wird von dem elk-L Polypeptid bei der Sekretion von elk-L aus der Zelle abgespalten.
Geeignete Wirtszellen für die Expression von eLK-L-Polypeptiden schließen Prokaryoten, Hefe oder höhere eukaryotische Zellen ein. Geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren zur Verwendung mit zellularen bakteriellen, fungalen, Hefe- und Säugetierwirten werden zum Beispiel in Pouwels et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York (1985) beschrieben. Zellfreie Translationssysteme können ebenfalls verwendet werden, um elk-L-Polypeptide unter Verwendung von RNAs zu erzeugen, die von hierin offenbarten DNA-Konstrukten abgeleitet sind.
Zu den Prokaryoten zählen Gram-negative und Gram-positive Organismen, zum Beispiel E. coli oder Bacilli. Geeignete prokaryotische Wirtszellen für die Transformation schließen zum Beispiel E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene andere Spezies innerhalb der Gattungen von Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus ein. In einer prokaryotischen Wirtszelle, wie E. Coli, kann ein elk-L-Polypeptid einen N-terminalen Methioninrest enthalten, um die Expression des rekombinanten Polypeptids in der prokaryotischen Wirtszelle zu erleichtern. Das N-terminale Met kann von dem exprimierten rekombinanten elk-L-Polypeptid abgespalten werden.
Expressionsvektoren für die Verwendung in prokaryotischen Wirtszellen weisen im Allgemeinen ein oder mehrere phänotypisch selektierbare Markergene auf. Ein phänotypisch selektierbares Markergen ist zum Beispiel ein Gen, welches ein Protein kodiert, dann eine Antibiotikaresistenz verleiht, oder das ein autotrophes Bedürfnis bereitstellt. Zu Beispielen von nützlichen Expressionsvektoren für prokaryotische Wirtszellen zählen jene, die von kommerziell erhältlichen Plasmiden abgeleitet sind, wie der Klonierungsvektor pBR322 (ATCCC 37017). pBR322 enthält Gene für Ampicillin und Tetracyclin-Resistenz und bietet somit einfache Mittel zum Identifizieren von transformierten Zellen. Ein geeigneter Promotor und eine elk-L DNA Sequenz werden in den pBR322 Vektor eingefügt. Andere kommerziell erhältliche Vektoren umfassen zum Beispiel pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und pGEM 1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA).
Für rekombinante prokaryotische Wirtszell-Expressionsvektoren häufig verwendete Promotorsequenzen umfassen β-Lactamase (Penicillinase), Lactose Promotorsystem (Chang et al., Nature 275:615, 1978; und Goeddel et al., Nature 281:544, 1979), Tryptophan (trp) Promotorsystem (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980; und EP-A-36776) und Tac Promoter (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 412, 1982). Ein besonders nützliches prokaryotisches Wirtzelle-Expressionssystem verwendet ein λ-P_L Promoter und eine cI857ts thermolabile Repressorsequenz. Von der American Type Culture Collection erhältliche Plasmidvektoren, die Derivate des λP_L Promotors aufweisen, umfassen Plasmid pHUB2 (resident in E. coli Stamm JMB9 (ATCC 37092)) und pPLc28 (resident in E. coli RR1 (ATCC 53082)).
Elk-L kann alternativ dazu in Hefe-Wirtszellen exprimiert werden, vorzugsweise von der Gattung der Saccharomyces (z.B. S. cerevisiae). Andere Hefegattungen wie Pichia, oder Kluyveromyces können ebenfalls verwendet werden. Hefevektoren werden oft eine Replikationsursprungssequenz von einem 2μ-Hefeplasmid, eine autonom replizierende Sequenz (ARS), eine Promotorregion, Sequenzen für eine Polyadenylierung, Sequenzen für die Transkriptionstermination und ein selektierbares Markierungsgen enthalten. Geeignete Promotorsequenzen für Hefevektoren schließen unter anderem Promotoren für Metallothionein, 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) oder andere glycolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; und Holland et al., Biochem. 17:4900, 1978) wie Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat-Iisomerase, 3-Phosphoglycerat-Mutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase ein. Andere geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung in der Hefeexpression werden ferner in Hitzeman, EPA-73,657 beschrieben. Eine weitere Alternative ist der Glucose-reprimierbare ADH2-Promotor, der von Russell et al. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) und Beier et al. (Nature, 300:724, 1982) beschrieben wird. Shuttle-Vektoren, die sowohl in Hefe als auch in E. coli replizierbar sind, können konstruiert werden, indem DNA-Sequenzen aus pBR322 zur Selektion und Replikation in E. coli (Amp^r Gen und Replikationsursprung) in die oben beschriebenen Hefevektoren eingefügt werden.
Die Hefe-α-Faktor-Leadersequenz kann verwendet werden, um die Sekretion des elk-L-Polypeptids zu steuern. Die α-Faktor-Leadersequenz wird oft zwischen die Promotorsequenz und die strukturelle Gensequenz eingefügt. Siehe z.B. Kurjan et al., Cell 30:933, 1982; Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330, 1984; US-Patentschrift 4,546,082 und EP 324,274 . Andere Leadersequenzen, die zur Erleichterung der Sekretion von rekombinanten Polypeptiden aus Hefewirten geeignet sind, sind den Fachleuten bekannt. Eine Leadersequenz kann in der Nähe ihres 3'-Endes modifiziert werden, um eine oder mehrere Restriktionsstellen zu enthalten. Dies erleichtert die Fusion der Leadersequenz an das strukturelle Gen.
Hefetransformationsprotokolle sind den Fachleuten bekannt. Ein solches Protokoll wird von Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978 beschrieben. Das Hinnen et al. Protokoll selektiert für Trp⁺ Transformanten in einem selektiven Medium, wobei das selektive Medium aus 0,67% Hefestickstoffbase, 0,5% Casaminosäuren, 2% Glucose, 10 μg/ml Adenin und 20 μg/ml Uracil besteht.
Hefewirtszellen, die durch Vektoren transformiert sind, welche eine ADH2-Promotorsequenz enthalten, können gezüchtet werden, um die Expression in einem „reichen" Medium zu induzieren. Ein Beispiel eines reichen Mediums ist ein Medium, das aus 1 Hefeextrakt, 2% Pepton und 1% Glucose, ergänzt durch 80 μg/ml Adenin und 80 μg/ml Uracil, besteht. Die De-Repression des ADH2-Promotors tritt ein, wenn Glucose in dem Medium erschöpft ist.
Es könnten auch Säugetier- oder Insekten-Wirtszellkultursysteme verwendet werden, um rekombinante elk-L Polypeptide zu exprimieren. Baculovirussysteme zur Erzeugung heterologer Proteine in Insektenzellen werden von Luckow und Summers, Bio/Technology 6:47 (1988) untersucht. Etablierte Zelllinien mit Säugetierursprung können auch verwendet werden. Beispiele für geeignete Säugetier-Wirtszelllinien schließen die COS-7-Linie von Affennierenzellen (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., Cell 23:175, 1981), L-Zellen, C127-Zellen, 3T3-Zellen (ATCC CCL 163), Chinesische Hamstereierstockzellen (CHO), HeLa-Zellen und BHK (ATCC CRL 10)-Zelllinien, sowie die CV-1/EBNA-1-Zelllinie ein, die aus der afrikanischen grünen Meerkatzen-Nierenzellinie CV1 (ATCC CCL 70) gewonnen wird, so wie von McMahan et al. (EMBO J. 10:2821, 1991) beschrieben ist.
Transkriptionale und translationale Steuersequenzen für Säugetierwirtszellen- Expressionsvektoren können aus viralen Genomen ausgeschnitten werden. Häufig verwendete Promotorsequenzen und Verstärkersequenzen werden aus dem Polyomavirus, Adenovirus 2, Simian Virus 40 (SV40) und dem humanen Cytomegalievirus gewonnen. DNA-Sequenzen, die aus dem SV40-Viralgenom gewonnen werden, zum Beispiel der SV40-Ursprung, der frühe und späte Promotor, Verstärker, Spleiß- und Polyadenylierungsstellen können verwendet werden, um andere genetische Elemente für die Expression einer Sequenz eines strukturellen Gens in einer Säugetierwirtszelle bereitzustellen. Virale frühe und späte Promotoren sind besonders nützlich, weil beide leicht aus einem viralen Genom als Fragment erhalten werden, das auch einen viralen Replikationsursprung enthalten kann (Fiers et al., Nature 273:113, 1978). Kleinere oder größere SV40-Fragmente können ebenfalls verwendet werden, vorausgesetzt, die ungefähr 250 bp Sequenz, die sich von der Hind III-Stelle zur BglI-Stelle erstreckt, die sich in der SV40 viralen Replikationsursprungsstelle befindet, ist eingeschlossen.
Beispielhafte Expressionsvektoren zur Verwendung in Säugetierwirtszellen können so konstruiert werden wie von Okayama und Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983) offenbart. Ein nützliches System für stabile Hochexpression von Säugetier-cDNAs in C127 Mäuse-Mamma-Epithelzellen kann im Wesentlichen so wie von Cosman et al. (Mol. Immunol. 23:935, 1986) beschrieben konstruiert werden. Ein nützlicher Hochexpressionsvektor, PMLSV N1/N4, beschrieben von Cosman et al., Nature 312:768, 1984, wurde als ATCC 39890 hinterlegt. Zusätzliche nützliche Säugetierexpressionsvektoren werden in EP-A-0367566 und PCT Veröffentlichung WO 91/18982 beschrieben. Die Vektoren können aus Retroviren gewonnen werden. Anstelle der nativen Signalsequenz, kann eine heterologe Signalsequenz hinzugefügt werden, wie die Signalsequenz für Interleukin-7 (IL-7), beschrieben in der US-Patentschrift 4,965,195, die Signalsequenz für den Interleukin-2-Rezeptor, beschrieben in Cosman et al., Nature 312:768 (1984), das Interleukin-4-Signalpeptid, beschrieben in EP 367,566 ; das Typ-I-Interleukin-1-Rezeptorsignalpeptid, beschrieben in der US-Patentschrift 4,968,607, und das Typ-II-Interleukin-1-Rezeptorsignalpeptid, beschrieben in EP 460,846 .
Die vorliegende Erfindung bietet im Wesentlichen homogenes elk-L Protein, welches durch rekombinante Expressionssysteme, wie oben beschrieben, oder durch Reinigen aus natürlich-vorkommenden Quellen hergestellt wird. Das elk-L kann im Wesentlichen zu Homogenität gereinigt werden, wie durch eine einzelne Bande bei der Analyse durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) angezeigt wird.
Ein Verfahren zur Herstellung des elk-L-Proteins weist das Züchten einer Wirtszelle auf, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der eine DNA-Sequenz enthält, welche elk-L codiert, unter Bedingungen, die ausreichen, um die Expression von elk-L zu fördern. Das elk-L-Protein wird dann in Abhängigkeit vom verwendeten Expressionssystem aus dem Kulturmedium oder den Zellextrakten gewonnen. Dem Fachmann wird klar sein, dass Verfahren zur Reinigung des rekombinanten elk-L in Abhängigkeit von Faktoren wie dem Typ der verwendeten Wirtszellen und in Abhängigkeit davon, ob das elk-L in das Kulturmedium ausgeschieden wird oder nicht, variieren werden.
Wenn zum Beispiel Expressionssysteme verwendet werden, welche das rekombinante Protein ausscheiden, kann das Kulturmedium zuerst mit Hilfe eines im Handel erhältlichen Proteinkonzentrationsfilters, zum Beispiel einer Amicon oder Millipore Pellicon Ultrafiltrationseinheit, konzentriert werden. Nach dem Konzentrationsschritt kann das Konzentrat auf eine Reinigungsmatrix wie ein Gelfiltrationsmedium aufgetragen werden. Alternativ dazu kann ein Anionenaustauschharz verwendet werden, zum Beispiel eine Matrix oder ein Substrat mit anhängenden Diethylaminoethyl (DEAE)-Gruppen. Die Matrizen können Acrylamid, Agarose, Dextran, Zellulose oder andere, bei der Proteinreinigung häufig verwendete Arten sein. Alternativ dazu kann ein Kationenaustauschschritt eingesetzt werden. Geeignete Kationenaustauscher schließen verschiedene unlösliche Matrizen ein, welche Sulfopropyl- oder Carboxymethylgruppen aufweisen. Sulfopropylgruppen werden bevorzugt. Schließlich können ein oder mehrere Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (RP-HPLC)- Schritte unter Verwendung von hydrophoben RP-HPLC-Medien (z. B. Silicagel mit anhängenden Methyl- oder anderen aliphatischen Gruppen) durchgeführt werden, um elk-L weiter zu reinigen. Einige oder alle der vorhergehenden Reinigungsschritte, können in unterschiedlichen Kombinationen eingesetzt werden, um ein im Wesentlichen homogenes rekombinantes Protein bereitzustellen.
Es ist auch möglich, eine Affinitätssäule zu verwenden, welche die ligandenbindende Domäne von elk enthält, um exprimierte elk-L Polypeptide einer Affinitätsreinigung zu unterziehen. elk-L-Polypeptide können aus einer Affinitätssäule unter Verwendung eines hohen Salz-Eluierungspuffer entfernt werden und danach zur Verwendung in einen niedrigeren Salzpuffer dialysiert werden. Alternativ dazu kann eine Affinitätssäule einen Antikörper aufweisen, der elk-L bindet. Beispiel 4 beschreibt ein Verfahren zum Benutzten von elk-L-Protein der Erfindung, um monoklonale Antikörper zu erzeugen, die gegen elk-L gerichtet sind.
Rekombinantes Protein, das in bakterieller Kultur erzeugt wird, wird für gewöhnlich durch anfängliches Zerreißen der Wirtszellen, Zentrifugation, Extraktion aus Zellpellets, im Fall eines unlöslichen Polypeptids, oder aus der überstehenden Flüssigkeit, im Fall eines löslichen Polypeptids, isoliert, gefolgt von einem oder mehreren Schritten der Konzentration, des Aussalzens, Ionenaustauschs, der Affinitätsreinigung oder Größenausschlusschromatographie. Schließlich kann die RP-HPLC für endgültige Reinigungsschritte verwendet werden. Mikrobielle Zellen können durch ein beliebiges, geeignetes Verfahren zerrissen werden, einschließlich eines Gefrier-Auftau-Zyklus, einer Beschallung, mechanischen Zerreißens oder der Verwendung von Zelllyse-Mitteln.
Transformierte Hefewirtszellen werden vorzugsweise benutzt, um elk-L als ein sezerniertes Polypeptid zu exprimieren. Dies vereinfacht die Reinigung. Das sezernierte rekombinante Polypeptid aus einer Hefewirtszell-Fermentation kann durch Verfahren gereinigt werden, die den Verfahren, die von Urdal et al. (J. Chromatog. 296:171, 1984) offenbart werden, analog sind. Urdal et al. beschreiben ein Verfahren, das zwei sequentielle, Umkehrphasen-HPLC-Schritte zur Reinigung von rekombinantem humanem IL-2 auf einer präparativen HPLC-Säule einschließt.
Nukleinsäurefragmente
Weiters offenbart ist die Verwendung eines isolierten Nukleinsäure-Moleküls, welche eine Sequenz von zumindest etwa 14 Nukleotiden der Nukleotidsequenz der SEQ ID NR:1 oder das DNA oder RNA-Komplement davon aufweist, für die Isolierung oder Ermittlung einer elk-L RNA oder DNA, oder für das Blockieren der Expression von elk-L Proteinen. Solche Fragmente weisen zumindest etwa 14 Nukleotide der in SEQ ID NR:1 dargestellten Sequenz auf. DNA und RNA Komplemente von besagten Fragmenten sind hierin beschrieben, zusammen mit sowohl einzelsträngigen als auch doppelsträngigen Formen der elk-L DNA.
Unter den Verwendungen von solchen elk-L Nukleinsäure-Fragmenten ist die Verwendung als eine Sonde. Solche Sonden können in Kreuz-Spezies Hybridisierungsprozeduren eingesetzt werden, um elk-L DNA von zusätzlichen Säugetier-Spezies zu isolieren. Als ein Beispiel kann eine Sonde, die der extrazellulären Domäne von elk-L entspricht, verwendet werden. Die Sonden finden ebenfalls Anwendung beim Ermitteln der Gegenwart von elk-L Nukleinsäuren in vitro Untersuchungen und in solchen Prozeduren wie Northern und Southern-Blots. Elk-L exprimierende Zellarten können identifiziert werden. Solche Verfahren sind weithin bekannt, und der Fachmann kann eine Sonde von geeigneter Länge, in Abhängigkeit der jeweiligen beabsichtigten Anwendung auswählen.
Andere nützliche Fragmente der elk-L-Nukleinsäuren schließen Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotide ein, welche eine Einzelstrang-Nukleinsäuresequenz (entweder RNA oder DNA) aufweisen, die imstande ist, an Ziel-elk-L-mRNA (Sinn) oder elk-L-DNA (Gegensinn)-Sequenzen zu binden. Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotide gemäß der vorliegenden Erfindung weisen ein Fragment der kodierenden Region von elk-L-cDNA auf. Ein solches Fragment enthält im Allgemeinen mindestens ungefähr 14 Nukleotide, vorzugsweise von ungefähr 14 bis ungefähr 30 Nukleotide. Die Fähigkeit, ein Gegensinn- oder ein Sinn-Oligonukleotid basierend auf einer cDNA-Sequenz zu gewinnen, welche ein bestimmtes Protein kodiert, ist zum Bespiel in Stein und Cohen Cancer Res. 48:2659, 1988 und in van der Krol et al. BioTechniques 6:958, 1988 beschrieben.
Das Binden von Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotiden an Ziel-Nukleinsäuresequenzen führt zur Bildung von Doppelsträngen, welche die Translation (RNA) oder Transkription (DNA) durch eines von mehreren Mitteln blockieren, einschließlich verstärkter Degradierung der Doppelstränge, verfrühter Termination der Transkription oder Translation oder durch andere Mittel. Die Gegensinn-Oligonukleotide können daher verwendet werden, um die Expression von elk-L-Proteinen zu blockieren. Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotide weisen ferner Oligonukleotide auf, welche modifizierte Zuckerphosphodiester-Hauptketten (oder andere Zuckerverbindungen wie die in WO 91/06629 beschriebenen) aufweisen, und wobei die Zuckerverbindungen endogenen Nukleasen gegenüber resistent sind. Solche Oligonukleotide mit resistenten Zuckerverbindungen sind in vivo stabil (d. h. imstande, enzymatischer Degradierung zu widerstehen), behalten aber die Sequenzspezifizität, um an Ziel-Nukleotidsequenzen binden zu können. Andere Beispiele von Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotiden schließen jene Oligonukleotide ein, die kovalent mit organischen Anteilen wie jenen, die in WO 90/10448 beschrieben sind, und anderen Anteilen verbunden sind, welche die Affinität des Oligonukleotids für eine Ziel-Nukleinsäuresequenz, wie Poly-(L-Lysin) erhöhen. Außerdem können interkalierende Wirkstoffe, wie Ellipticin, und alkylierende Wirkstoffe oder Metallkomplexe an Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotide angeheftet werden, um die Bindungsspezifizitäten des Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotids für die Ziel-Nukleotidsequenz zu ändern.
Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotide können in eine Zelle, welche die Ziel-Nukleinsäuresequenz enthält, durch ein beliebiges Gentransferverfahren eingeführt werden, einschließlich zum Beispiel CaPO₄-vermittelte DNA-Transfektion, Elektroporation oder durch Verwendung von Gentransfervektoren wie dem Epstein-Barr-Virus. Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotide werden in eine Zelle, welche die Ziel-Nukleinsäuresequenz enthält, vorzugsweise durch Einfügen des Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotids in einen geeigneten retroviralen Vektor eingefügt, wobei danach die Zelle mit dem Retrovirusvektor, der die eingefügte Sequenz enthält, entweder in vivo oder ex vivo in Kontakt gebracht wird. Geeignete retrovirale Vektoren schließen – ohne darauf beschränkt zu sein – jene ein, die aus dem Maus-Retrovirus M-MuLV, N2 (einem aus M-MuLV gewonnenem Retrovirus) oder den Doppelkopievektoren gewonnen werden, die mit DCT5A, DCT5B und DCT5C bezeichnet sind (siehe PCT-Anmeldung US 90/02656 = WO 90/13641).
Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotide können in eine Zelle, welche die Ziel-Nukleotidsequenz enthält, auch durch Bilden eines Konjugats mit einem ligandbindenden Molekül eingeführt werden, wie in WO 91/04753 beschrieben. Geeignete ligandbindende Moleküle schließen – ohne darauf beschränkt zu sein – Zelloberflächenrezeptoren, Wachstumsfaktoren, andere Cytokine oder andere Liganden ein, welche an Zelloberflächenrezeptoren binden. Vorzugsweise führt die Konjugation des ligandbindenden Moleküls zu keiner wesentlichen Beeinträchtigung der Fähigkeit des ligandbindenden Moleküls, an sein entsprechendes Molekül oder seinen entsprechenden Rezeptor zu binden oder den Eintritt des Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotids oder seiner konjugierten Version in die Zelle zu blockieren.
Alternativ dazu kann ein Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotid in eine Zelle, welche die Ziel-Nukleinsäuresequenz enthält, durch Bildung eines Oligonukleotid-Lipidkomplexes eingeführt werden, wie in WO 90/10448 beschrieben. Der Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotid-Lipidkomplex wird vorzugsweise innerhalb der Zelle durch eine endogene Lipase dissoziiert.
Die folgenden Beispiele sind bereitgestellt, um bestimmte Ausführungsformen zu illustrieren und nicht um den Umfang der Erfindung einzuschränken.
Beispiel 1
Herstellung von löslichem elk/Fc-Fusionsprotein
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines Expressionsvektors, der ein lösliches Elk/Fc-Fusionsprotein kodiert, für die Verwendung beim Ermitteln von cDNA Klonen, die ein elk Ligand (elk-L) kodiert. Eine DNA und eine kodierte Aminosäuresequenz für Ratten-Elk-cDNA wird in Lhotak et al. (Mol. Cell. Biol. 11, 2496, 1991) vorgestellt, das hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird. Das Ratten-Elk-Protein weist eine 538 Aminosäure extrazelluläre Domäne, eine 25 Aminosäure Transmembrandomäne und eine 419 Aminosäure cytoplasmatische Domäne auf.
Ein Ratten-Elk-cDNA-Fragment wurde an den N-Terminus von cDNA fusioniert, welche den Fc-Abschnitt eines humanen IgG1-Antikörpers kodiert. Die Ratten-Elk-cDNA wurde bei T. Pawson (Samuel Lunenfeld Research Institute, Mt. Sinai Hospital, Toronto) beschafft. Eine Asp718 Restriktions-Endonuklease-Schnittstelle wurde stromaufwärts von der Elk kodierenden Region eingeführt. Ein Asp 718-BglII-Fragment von Ratten-Elk-cDNA (welche die gesamte extrazelluläre Domäne, den Transmembranbereich und einen kleinen Abschnitt der cytoplasmatischen Domäne enthielt) wurde isoliert.
DNA, welche eine Einzelpolypeptidkette kodiert, welche die Fc-Region eines humanen IgG1-Antikörpers aufweist, wurde in die SpeI-Stelle des pBLUESCRIPT SK^®-Vektors kloniert, der von Stratagene Cloning Systems, La Jolla, Kalifornien, kommerziell erhältlich ist. Dieser Plasmidvektor ist in E. coli replizierbar und enthält ein Polylinker-Segment, das 21 einzigartige Restriktionsstellen einschließt. Eine einzigartige BglII-Stelle wurde in der Nähe des 5' Endes der eingefügten Fc Kodierungssequenz eingeführt, sodass die BglII Stelle die Codons für Aminosäuren drei und vier des Fc-Polypeptids umfasst.
Das kodierte Fc-Polypeptid erstreckt sich von der N-terminalen Hinge-Region zum nativen C-Terminus, d. h. ist eine Antikörper-Fc-Region mit im Wesentlichen voller Länge. Fragmente der Fc Regionen, z.B. jene, die an dem C-terminalen Ende verkürzt sind, können ebenfalls verwendet werden. Die Fragmente enthalten vorzugsweise mehrere Cysteinreste (zumindest die Cysteinreste in der Hinge-Region), um die Bildung von Interketten-Disulfiden zwischen den Fc-Polypeptid-Abschnitten von zwei getrennten elk/Fc Fusionsproteinen zu erlauben, wodurch, wie oben diskutiert, Dimere gebildet werden.
Das oben beschriebene Asp718-BglII-elk-cDNA-Fragment wurde in den pBLUESCRIPT SK^®-Vektor kloniert, der die Fc-cDNA enthielt, so dass die elk-cDNA stromaufwärts von der Fc-cDNA positioniert ist. Einzelstrang-DNA, die aus der resultierenden Genfusion gewonnen wurde, wurde durch das in Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488, 1985) und Kunkel et al. (Methods in Enzymol. 154:367, 1987) beschriebene Verfahren mutagenisiert, um die gesamte extrazelluläre Domäne von elk vollkommen an die Fc-Sequenz zu fusionieren. Die mutagenisierte DNA wurde sequenziert, um zu bestätigen, dass die richtigen Nukleotide entfernt wurden (d.h. dass der Transmembranbereich und die partielle DNA der cytoplasmatischen Domäne gelöscht wurden) und dass die Elk- und die Fc-Sequenz sich im selben Leserahmen befanden. Die Fusions-cDNA wurde dann herausgeschnitten und in einen Säugetier-Expressionsvektor mit der Bezeichnung pCAV/DHFR eingefügt. Der pCAV/DHFR-Vektor ist ähnlich dem pCAV/NOT, der in der PCT Anmeldung WO 90/05183 beschrieben ist, enthält jedoch zusätzlich ein Dihydrofolat-Reduktase (DHFR) Gen als einen selektierbaren Marker. Das DHFR Gen verleiht einen selektiven Vorteil gegenüber ansonsten DHFR^– Säugetierzellen, die den Vektor aufgenommen haben, wenn sie in der Gegenwart von Methotrexat (MTX) gezüchtet werden.
Das Elk/Fc-Fusionsprotein wird vorzugsweise in rekombinanten Säugetier-Zellkulturen synthetisiert. Der elk/Fc-Fusion enthaltende Expressionsvektor wurde in CV-1 Zellen (ATCC CCL 70) und COS-7 Zellen (ATCC CRL 1651), beide sind von Affenieren abgeleitet, transfiziert. Das elk/Fc Fusionsprotein-Expressionsniveau war sowohl in CV-1 als auch in COS-7 Zellen relativ gering. Folglich wurde die Expression in 293 Zellen (transformierte primäre humane embryonale Nierenzellen, ATCC CRL 1573) versucht.
Die Elk/Fc-Genfusion wurde in einen Säugetier-Expressionsvektor mit der Bezeichnung HAV-EO (Dower et al., J. Immunol. 142:4314, 1989) eingefügt. 293 Zellen, die mit dem HAV-EO/elk/Fc Vektor transfiziert sind, wurden in Rollerflaschen gezüchtet, um die transiente Expression des Fusionsproteins zu ermöglichen, das in das Kulturmedium über das Elk-Signalpeptid ausgeschieden wird. Das Elk/Fc-Fusionsprotein wurde an Protein-A-Sepharosesäule gereinigt, eluiert und verwendet, um Zellen auf die Fähigkeit, elk/Fc Protein zu binden, gescreent, wie in den Beispielen 2 und 3 beschrieben ist.
Beispiel 2: Screening von Zellen auf elk/Fc Bindung
Verschiedene Zellarten wurden auf die Fähigkeit, elk/Fc zu binden gescreent, um Kandidaten Zelltypen zu identifizieren, die als Nukleinsäure-Quellen in einem Versuch nützlich sind, ein elk-Ligand zu klonieren. Das rekombinante Ratten elk/Fc Protein, erzeugt und gereinigt in Beispiel 1, wurde unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Enzymobead-Radioiodierungs-Reagenzes (BioRad), gemäß den Herstellerangaben, radiomarkiert. Das ¹²⁵I-elk/Fc Protein zeigte keine spezifische Bindung an eine beliebige von mehreren getesteten Zelllinien. Bedenken, dass die direkte Markierung des elk/Fc Proteins mit Na¹²⁵I zu einem Verlust der biologischen Aktivität geführt haben, führte zu der Entwicklung einer zweistufigen Bindungsuntersuchung.
Die zweistufige Untersuchung umfasste das Inkubieren von Zellen mit nicht-radiomarkiertem elk/Fc, gefolgt durch einen ¹²⁵I-Maus-anti-humanem Fc-Antikörper. Der letztere Antikörper wird an den Fc-Anteil von jedem elk/Fc Fusionsprotein binden, das an die Zellen gebunden hat.
Der Maus-anti-humane Fc-Antikörper wurde von Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, erhalten. Dieser Antikörper zeigte eine minimale Bindung an Fc-Proteine, die an dem Fcγ-Rezeptor gebunden sind. Der Antikörper wurde mit Hilfe des Chloramin-T-Verfahrens markiert. In Kürze, eine P6 Säule wurde gemäß den Herstellerangaben hergestellt. In einem Mikrozentrifugen-Röhrchen wurden 10 μg Antikörper in 10 μl PBS aufgelöst. 2000 μCi von trägerfreiem Na¹²⁵I wurde hinzugefügt und die Lösung wurde gut gemischt. 15 μl einer frisch hergestellten Lösung von Chloramin-T (32 μg/ml in 0,05 M Natriumphosphat-Puffer (pH 7,2) wurde dann hinzugefügt und die Mischung wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Mischung wurde unmittelbar auf die P6 Säule aufgetragen. Der radiomarkierte Antikörper wurde dann von der Säule durch Sammeln von 100-150 μl Fraktionen des Eluats eluiert. Bindungsmedien (RPMI 1640, das 25 mg/ml Rinderserumalbumin, 2 mg/ml Natriumazid, 20 mM Hepes, pH 7,2 enthält) wurde zu den Peakfraktionen hinzugefügt, um das Gesamtvolumen jeder Fraktion auf 2 ml zu bringen. Die Radioiodinierung ergab spezifische Aktivitäten im Bereich von 5-10 × 10¹⁵ cpm/mmol Protein.
Die Screening-Prozedur war wie folgt. Etwa 2 × 10⁶ Zellen wurden in 96-Kammerplatten kultiviert. 150 μl Bindungsmedium wurde zu jeder Kammer hinzugefügt und die Zellen wurden dann in der Gegenwart oder Abwesenheit von elk/Fc für 1 Stunde bei 37°C unter leichtem Schütteln inkubiert. Die Zellen wurden von aus der Mischung durch Zentrifugation der 96-Kammerplatten sedimentiert, mit PBS gewaschen, erneut zentrifugiert, und in Bindungsmedium resuspendiert. Die Zellen wurden dann mit dem ¹²⁵I-Maus-anti-humanen Fc-Antikörper, wie oben beschrieben hergestellt, für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden ebenfalls mit ¹²⁵I-Maus anti-humanem Fc-Antikörper in der Gegenwart eines Überschusses eines unmarkierten anti-humanen Fc Antikörpers als eine Negativkontrolle inkubiert. Im Anschluss an eine einstündige Inkubation mit dem ¹²⁵I-Antikörper wurden die Zellen und ungebundener ¹²⁵I-Antikörper durch das Phatalat-Öl-Trennverfahren getrennt, im Wesentlichen wie in Dower et al., J. Immunol 132:751, 1984 beschrieben. Zell-gebundener und freier ¹²⁵I-Antikörper wurden auf einem Packard-Autogamma Zähler quantifiziert. Es wurden keine Zellarten gefunden, die elk/Fc in dieser Untersuchung binden.
Zellen, einschließlich zusätzlichen Zellarten, die zuvor nicht gescreent wurden, wurden auf elk/Fc Bindung durch eine dritte Prozedur untersucht. Zellen wurden mit elk/Fc inkubiert, gefolgt durch einen biotinylierten anit-humanen Fc-Antikörper, gefolgt durch Streptavidin-Phycoerythrin (Becton Dickinson). Der biotinylierte Antikörper wurde von Jackson Immunoresearch Laboratories gekauft. Streptavidin bindet an das Biotinmolekül, das an den Anti-humanen Fc-Antikörper gebunden ist, welcher wiederum an den Fc-Anteil des elk/Fc Fusionsproteins bindet. Phycoerythrin ist ein fluoreszierendes Phycobiliprotein, welches als eine nachweisbare Markierung dient. Das Niveau des Fluoreszenzsignals wurde für jede Zellart unter Verwendung eines FACScan^® Flusszytometers (Becton Dickinson) gemessen.
Die Zellen, die auf die Fähigkeit, elk/Fc zu binden, durch zumindest eine der drei oben beschriebenen Prozeduren gescreent wurden, umfassen etwa 30 unterschiedliche Zellarten, die in die folgenden allgemeinen Kategorien fallen: primäre, murine fötale Hirnzellen, murine fötale Leberzelllinien, murine, fötale Hirn-Zelllinien, und humane Lungenkarzinom (fibroblastoide) Zelllinien. Es wurden keinen Zelltypen, die für die elk/Fc Bindung als positiv erachtet werden, identifiziert.
Beispiel 3: Isolierung von elk-Ligand cDNA aus humaner Plazenta cDNA Bibliothek
Keine von den in Beispiel 2 untersuchten Zellarten zeigte eine nachweisbare elk/Fc Bindung. Eine humane plazentale cDNA Bibliothek wurde als eine mögliche Quelle von elk Ligand cDNA ausgewählt, da Plazentagewebe reich an Wachstums- und Differenzierungsfaktoren ist. Wie oben diskutiert ist, ist es wahrscheinlich, dass der elk-Ligand eine Rolle im Wachstum, beim Überleben oder bei der Differenzierung von Zellen, die elk (den entsprechenden Rezeptor) exprimieren, spielt. Die Tatsache, dass Plazenta relativ reich an Fc-Rezeptoren ist, stellt jedoch ein potentielles Problem für den Klonierungsversuch dar, da eine elk/Fc Fusion verwendet wurde, um Klone zu sceenen.
Eine humane plazentale cDNA Bibliothek in Plasmid pDC302 wurde, wie in Larsen et al. (J. Exp./Med., 172:1559, 1990) beschrieben, hergestellt. pDC302 ist ein Säugetier-Expressionvektor, der auch in E. coli repliziert (Mosley et al., Cell 59:335, 1989). In Kürze, plazentale cDNA wurde in die BglII Stelle von pDC302 durch ein Adapterverfahren, ähnlich zu jenem, das in Haymerle et al (Nucl. Acids Res. 74:8615, 1986) beschrieben ist, kloniert. E. coli Stamm DH5α Zellen, die mit der plazentalen cDNA Bibliothek in pDC302 transfiziert sind, wurden ausplattiert, um etwa 500 Kolonien pro Platte bereitzustellen. Kolonien wurden von jeder Platte abgeschabt, gepoolt, und Plasmid DNA wurde von jedem Pool hergestellt. Die zusammengefasste DNA, die etwa 2000 Kolonien repräsentiert, wurde dann verwendet, um eine subkonfluente Schicht von CV-1/EBNA-1 Zellen unter Verwendung von DEAE-DEXTRAN, gefolgt durch Chlorquin-Behandlung zu transfizieren, ähnlich zu jener, die in Luthman et al., Nucl. Acids Res. 11: 1295, 1983) und McCutchan et al, J. Natl. Cancer Inst. 41:351, 1986) beschrieben ist. Die CV-1/EBNA-1 Zelllinie (ATCC CRL10478) exprimiert EBV Kernantigen 1 konstitutiv, das von dem CMV unmittelbar-frühen Enhancer/Promotor angeleitet ist. CV1-EBNA-1 wurde von der Afrikanischen Grünen Meerkatzen Zelllinie CV-1 (ATCC CCL 70) abgeleitet, wie in McMahan et al. (EMBO J. 10:2821, 1991) beschrieben ist.
Um die CV-1/EBNA-1 Zellen mit der cDNA Bibliothek zu transfizierten, wurden die Zellen in vollständigem Medium (Dulbecco's modified Eagle'S Media (DMEM), welches 10% (v/v) fötales Kälberserum (FCS), 50 U/ml Penicillin, 50 U/ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin) enthält, gehalten und bei einer Dichte von 2 × 10⁵ Zellen/Kammer auf Objektträgern mit Einzelkammer ausplattiert. Die Objektträger wurden mit 1 ml humanem Fibronektin (10 μg/ml in PBS) für 30 Minuten vorbehandelt, gefolgt von 1 Waschung mit PBS. Die Medien wurden von der adhärenten Zellschicht entfernt und mit 1,5 ml vollständigem Medium, das 66,6 μM Chlorquinsulfat enthält, ersetzt. 0,2 ml DNA Lösung (2 μg DNA, 0,5 mg/ml DEAE-Dextran in vollständigem Medium, welches Chloroquin enthält) wurde dann hinzugefügt zu den Zellen und für 5 Stunden inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation wurden die Medien entfernt und die Zellen durch die Zugabe von vollständigem Medium, welches 10% DMSO enthält, für 2,5 bis 20 Minuten geschockt, gefolgt vom Austausch der Lösung mit frischem vollständigem Medium. Die Zellen wurden für 2 bis 3 Tage kultiviert, um die transiente Expression der eingefügten Sequenzen zu ermöglichen.
Transfizierte Monoschichten von CV-1/EBNA-1 Zellen wurden auf die Expression von elk-L durch Objektträger-Autoradiographie untersucht, und zwar im Wesentlichen wie in Gearing et al. (EMBO J. 8:3667, 1989) beschrieben ist. Transfizierte CV-1/EBNA-1 Zellen (an Objektträger mit Kammern gebunden) wurden einmal mit Bindungsmedium mit fettfreier Trockenmilch (BM-NFDM) (RMPI Medium 1640, welches 25 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA), 2 mg/ml Natriumazid, 20 mM HEPES, pH 7,2 und 50 mg/ml fettfreie Trockenmilch enthält) gewaschen. Die Zellen wurden dann mit elk/Fc in BM-NFDM (1 μg/ml) für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zell-Monoschichten in den Objektträgern mit Kammern dreimal mit BM-NFDM gewaschen, um ungebundenes elk/Fc Fusionsprotein zu entfernen und dann mit 40 ng/ml ¹²⁵I-Maus-anti-humanem Fc-Antikörper hergestellt, in Beispiel 2 (eine 1:50 Verdünnung), für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Zellen wurden dreimal mit BM-NFDM gewaschen, gefolgt von 2 Waschungen mit Phosphat-gepuffeter Salzlösung (PBS), um ungebundenen ¹²⁵I-Maus anti humanen Fc Antikörper zu entfernen. Die Zellen wurden durch Inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur in 2,5% Glutaraldehyd in PBS, pH 7,3 fixiert, zweimal mit PBS gewaschen und luftgetrocknet. Die Kammer-Objektträger, die die Zellen enthalten, wurden einem Phophorimager (Molecular Dynamics) über Nacht ausgesetzt, dann in Kodak GTNB-2 photographische Emulsion (6 × Verdünnung in Wasser) eingetaucht und in der Dunkelheit für 3-5 Tage bei 4°C in einer lichtundurchlässigen Box belichtet. Die Objektträger wurden dann für etwa 4 Minuten in Kodak D19 Entwickler (40g/500 ml Wasser) entwickelt, mit Wasser gespült und in Agfa G433C Fixierer fixiert. Die Objektträger wurden mit einem Mikroskop bei einer Vergrößerung von 25-40 × individuell untersucht und positive Zellen, die elk-L exprimieren, wurden durch die Gegenwart von autoradiographischen Silberkörner gegen einen hellen Hintergrund identifiziert.
Unter Verwendung des Objektträger-Autoradiographie-Ansatzes wurden etwa 300.000 cDNAs in Pools von ungefähr 2000 cDNAs gescreent, bis eine Untersuchung von einem Transfektantenpool mehrere Zellen für die elk/FC Bindung als eindeutig positiv zeigte. Dieser Pool wurde dann in Pools von 500 aufgeteilt und erneut durch Objektträger-Autoradiographie gescreent und ein positiver Klon wurde identifiziert. Individuelle Kolonien von diesem Pool von 500 wurden gescreent, bis ein einzelner Klon (Klon #E7) identifiziert wurde, welcher die Synthese eines Oberflächenproteins mit nachweisbarer elk/Fc Bindungsaktivität lenkt. Dieser Klon wurde isoliert und sein cDNA-Insert wurde sequenziert.
Die Nukleotid- und kodierten Aminosäuresequenzen der kodierenden Region der humanen elk Ligand cDNA von Klon E7 sind in SEQ ID NR:1 und 2 dargestellt. Das cDNA Insert ist 2111 bp lang. Es gibt drei offene Leserahmen mit einer vernünftigen Größe innerhalb dieser Sequenz, die Proteine von 82, 85 und 346 Aminosäuren kodieren könnten. Von diesen Drei fehlt den zwei kleinsten offenen Leserahmen gute Translations-Iniitierungskodons sowie eine Signalsequenz. Folglich ist die DNA und kodierten Aminosäure-Sequenz für den 346-Aminosäure offenen Leserahmen in SEQ ID NR:1 und 2 dargestellt. Das Protein der SEQ ID NR:2 ist ein Typ I Transmembran-Protein mit einem N-terminalen Signalpeptid (Aminosäuren-24 bis -1), einer extrazellulären Domäne (Aminosäuren 1-213), einer Transmembran-Domäne (Aminosäuren 214-241) und einer cytoplasmatischen Domäne (Aminosäuren 242-322). Das vorausgesagte Molekulargewicht des nativen Proteins im Anschluss an die Abspaltung der Signalsequenz ist 35.180 Daltons. Das reife Protein weist einen geschätzten pI von 9,006 auf. Es gibt 307 bp einer 5' nicht- kodierenden Sequenz und 763 bp einer 3' nicht-kodierenden Sequenz, die die kodierende Region flankieren.
Humane elk-L cDNA wurde aus Klon E7 durch Verdau mit Bsu361 (welches, stormabwärts des Stoppkodons spaltet) herausgeschnitten, gefolgt durch die Behandlung mit Klenow-Fragment, um die Bsu361-verdauten stumpfen Enden zu erzeugen, gefolgt durch Verdau mit SmaI (welches stromaufwärts des Initiierungskodons spaltet und stumpfe Ende erzeugt). Die herausgeschnittene cDNA, die die gesamte kodierende Region umfasst, wurde in die SmaI Stelle (in der Mehrfachklonierungsstelle) von pBLUESCRIPT^®SK(-) (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) kloniert. Der resultierende Vektor (mit der Bezeichnung Tele 7 in pBLUESCRIPT^®SK(-)) in E. coli DH5α wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC) am 9 Oktober, 1992 hinterlegt und die Zugangsnummer ATCC 69085 zugeordnet. Die Hinterlegung erfolgte gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags.
Beispiel 4: Monoklonale Antikörper gegen elk-L
Dieses Beispiel veranschaulicht ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen elk-L. elk-L wird in Säugetier-Wirtszellen wie COS-7 oder CV-1/EBNA-1 Zellen exprimiert und unter Verwendung der elk/Fc Affinitätschromatographie gereinigt. Gereinigtes elk-L (oder ein Fragment davon, wie die extrazelluläre Domäne) können verwendet werden, um unter Anwendung herkömmlicher Techniken, wie etwa jenen, die im US-Patent 4,411,993 beschrieben sind, monoklonale Antikörper zu erzeugen. Kurz gesagt, es werden Mäuse mit elk-L als ein Immungen, das in komplettem Freudschen Adjuvans emulgiert ist, immunisiert, wobei Mengen im Bereich von 10 bis 100 μg subkutan oder intraperitoneal injiziert werden. Zehn bis zwölf Tage später werden die immunisierten Tiere mit zusätzlichem elk-L, das in inkomplettem Freudschen Adjuvans emulgiert ist, re-immunisiert. Danach werden die Mäuse nach einem Wochen- bis Zweiwochen-Immunisierungsplan regelmäßig re-immunisiert. Durch retroorbitales Bluten oder Entfernen der Schwanzspitze werden regelmäßig Serumproben genommen, um mittels Dot-Blot-Assay oder ELISA (Enyzm-gebundene Immunosorbent-Untersuchung) auf elk-L Antikörper zu testen.
Nach Feststellung eines entsprechenden Antikörper-Titers wird positiven Tieren eine letzte intravenöse Injektion von elk-L in physiologischer Kochsalzlösung gegeben. Drei oder vier Tage später werden die Tiere getötet, die Milzzellen geerntet, und die Milzzellen werden mit einer Maus-Myelom-Zelllinie, z.B. NS1 oder vorzugsweise P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580) fusioniert. Die Fusionen erzeugen Hybridom-Zellen, die auf mehrere Mikrotiterplatten in einem selektivem HAT-Medium (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) aufgebracht werden, um eine Vermehrung von nicht fusionierten Zellen, Myelomhybriden und Milzzellhybriden zu hemmen.
Die Hybridomzellen werden mittels ELISA bei Anpassung der von Engvall et. al. in Immunochem. 8:871,1971 und in dem US-Patent 4,703,004 beschriebenen Verfahren auf eine Reaktivität mit gereinigtem elk-L getestet. Ein bevorzugtes Screening-Verfahren ist die von Beckmann et. al. (J. Immunol. 144:4212, 1990) beschriebene Antikörperfangtechnik. Positive Hybridomzellen können intraperitoneal in syngene BALB/c-Mäuse injiziert werden, um Asciten zu erzeugen, die hohe Konzentrationen monoklonaler Anti-elk-L-Antikörpern enthalten. Alternativ können Hybridomzellen mittels verschiedener Verfahren in vitro in Kolben oder Rollerflaschen herangezogen werden. In Maus-Asciten erzeugte monoklonale Antikörper können durch Ammoniumsulfat-Fällung, gefolgt von einer Gelausschlusschromatographie gereinigt werden. Alternativ kann auch eine Affinitätschromatographie, die auf der Antikörperbindung an Protein A oder Protein G beruht, oder auch eine Affinitätschromatographie, die auf der Bindung an elk-L beruht, angewendet werden.
Beispiel 5: Northern Blot Analyse
Um die Expression von elk-L in verschiedenen Geweben zu untersuchen, wurde ein Northern Blot von menschlichem Gewebe, der 2 μg poly A+ mRNA von einer Reihe von Gewebe (erhältlich von Clonetech, Palo Alto, CA) enthält, mit einer elk-L Ribosonde sondiert. 5' und 3' nicht kodierende Sequenzen wurden von der elk-Ligand cDNA durch Verdauen mit SmaI und BsuI entfernt und die kodierende Region wird in den pBluescript SK(-) Vektor (Stratagene Cloning Sstems, La Jolla, CA) eingefügt. Eine Ribosonde wurde durch Schneiden der elk-L cDNA mit SfiI und unter Verwendung des T3 RNA Polymerase Promotors hergestellt, um die äußersten 3' 450 Nukleotide der elk-L kodierende Sequenz zu transkribieren. Der Blot wurde mit der Riboprobe bei 63°C hybridisiert, dann gewaschen, zuerst mit 1 × SSC/0,1% SDS für 1 Stunde bei 68°C, dann mit 0,1 × SSC/0,1%SDS für 30 Minuten bei 68°C. Der Blot wurde einem Röntgenfilm bei –70°C für 11 Tage ausgesetzt, der zwischen zwei Verstärkerfolien eingeklemmt ist. Eine bedeutende 3,5 kb Nachricht wurde im Herz, der Plazenta, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere, und Bauchspeicheldrüse beobachtet.
Die elk-L mRNA war in nachweisbaren Konzentration im gesamten Erwachsenenhirn nicht vorhanden, obwohl das Hirn und die Hoden die einzigen Gewebe sind, von den berichtet wurde, dass die den elk Rezeptor exprimieren (Lhotak et al., supra). Es ist möglich, dass die Expression im Hirn auf einem sehr geringem Niveau ist, oder auf eine bestimmte Regionen) beschränkt ist, und deshalb durch die zuvor genannte Technik nicht detektiert wurde. Um dieses Gewebe weiters zu untersuchen, wurden zerschnittene Hirne von 8-Tage alten und jungen Erwachsenen Ratten mit elk-L DNA sondiert. Es erscheint, dass elk-L in dem sich entwickelnden Rattenhirn exprimiert wird, wobei das höchste Expressionsniveau im Riechkolben ist. Die Expression von elk-L in dem Riechkolben scheint sich im Erwachsenenalter fortzusetzen. Interessanterweise wird der Riechkolben während des Lebens eines Tieres aktiv regeneriert, im Gegensatz zum Rest des Hirns.
Ein zweiter Northern Blot offenbarte, dass die elk-L mRNA Expression durch TNF in menschlichen Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECS) hinaufreguliert ist. Es wurde gezeigt, dass B61 mRNA in HUVECS durch Behandeln der Zellen mit IL-1 oder TNF induzierbar ist (Holzman et al., supra). Angesichts der Homologie zwischen elk-L und B61 wurde ein Northern Blot von HUVEC mRNA (von entweder ruhenden Zellen oder mit TNF induzierten Zellen) mit der oben beschriebenen elk-L-Ribosonde sondiert. Die in anderen Geweben gefundene bedeutende 3,5 kb Art wurde im Anschluss an die Behandlung mit TNF spezifisch induziert.
BEISPIEL 6: Southern Blot-Analyse
Die Gegenwart von elk-L DNA in verschiedenen Spezies wurde wie folgt untersucht. Ein Blot bestehend aus den EcoRI-verdauten DNAs von einer Reihe von Spezies (Clonetech, Palo Alto, CA) wurde bei 63°C in Prähybridisierungspuffer prähybridisiert. Der Blot wurde dann mit einer zufälligen primed Klone E7 Sonde (entspricht der gesamten elk-L kodierenden Region) sondiert und mit hoher Stringenz (1 × SSC/0,1% SDS für 60 Minuten bei 63°C, dann 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 63°C für 30 Minuten) gewaschen. Das Bild des Bolts wurde auf einem Phosphorimager (Molecular Dynamics) entwickelt. Es wurde gefunden, dass das Gen in einer Vielzahl von Spezies stark konserviert ist, einschließlich Affen, Ratten, Maus, Hund, Kuh, Kaninchen, Huhn, und sogar Hefe.
BEISPIEL 7: Bindungsstudie
Um die Bindung von elk-L an den elk-Rezeptor zu untersuchen, wurde eine modifizierte indirekte Scatchard-Analyse erfunden. Diese indirekte Untersuchung war notwendig, da die direkte Radiomarkierung von elk/Fc die Bindungsspezifität von diesem Protein inaktivierte. Die Untersuchungsprozedur war wie folgt.
CV1-EBNA-1-Zellen (im Beispiel 3 beschrieben) in 12-Kammer-Platten (2,5 × 10⁵ Zellen/Kammer) wurden einem rekombinanten Expressionsvektor, der die Klon E7 elk-L cDNA enthält, transfiziert. Die transfizierten Zellen wurden für 2 Tage kultiviert, um die Expression des elk-L Proteins zu ermöglichen, dann mit BM-NFDM (das in Beispiel 2 beschriebene Bindungsmedium, das auch 50 mg/ml fettfreie Trockenmilch enthält) gewaschen und mit verschiedenen Konzentrationen des elk/Fc Fusionsprotein, hergestellt in Beispiel 1, für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit einer konstanten Sättigungskonzentration des ¹²⁵I-markierten Maus-anti-humanen IgG Antikörpers, hergestellt in Beispiel 2 (40 ng/ml), in Bindungsmedium unter leichtem Agitieren für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden dann durch Trypsinierung geerntet. Zellen und ungebundener ¹²⁵I Antikörper wurde durch ein Phthalat-Öl-Trennverfahren, wie im Wesentlichen bei Dower et al., J. Immunol 132:751, 1984) beschrieben, getrennt.
Die freien und zellgebundenen ¹²⁵I-Antikörper wurden auf einem Packard Autogamma-Zähler quantifiziert. Die Bindungskurve in dem Scatchard Koordinatensystem erneut graphisch abgebildet (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660, 1949). Affinitätsberechnungen wurden mit RS/1 (BBN Software, Boston, MA) auf einem Microvax-Computer erzeugt. Eine einzelne Hochaffinitätsbindungskomponente wurde identifiziert. Die auf den CV-/EBNA-1 Transfektanten exprimierten elk-L Bindungsstellen hatten eine Affinitätskonstante (K_A) von 1,08 × 10⁹ M^–1 für elk/Fc. Die Affinitätskonstante stimmt gut mit jener überein, die für die Bindung von elk/Fc an den nativen Liganden beobachtet wurde, der auf verschiedenen neutralen Ratten-Zelllinien exprimiert wird. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierte DNA, die ein elk-L Protein kodiert, das fähig ist elk zu binden, wobei die DNA eine Nucleotissequenz aufweist, die wenigstens 80% identisch ist mit einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Nucleotiden 1-1041, 73-1041, 1-711, und 73-711 der SEQ ID NR:1.
Isolierte DNA nach Anspruch 1, wobei die DNA eine Nucleotidsequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Nucleotiden 1-1041, 73-1041, 1-711, und 73-711 der SEQ ID NR:1.
Isolierte DNA, die ein elk-L Protein kodiert, das fähig ist elk zu binden, wobei das elk-L eine Aminosäuresequenz aufweist, die wenigstens 80% identisch ist mit einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuren 1-322 und 2-213 der SEQ ID NR:2.
Isolierte DNA nach Anspruch 3, wobei das elk-L eine Aminosäuresequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuren 1-322 und 1-213 der SEQ ID NR:2.
Expressionsvektor, der eine DNA Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 aufweist.
Verfahren zur Herstellung eines elk-L Proteins, welches Verfahren das Züchten einer Wirtszelle, die mit einem Vektor nach Anspruch 5 transformiert ist, unter die Expression von elk-L fördernden Bedingungen und das Gewinnen des elk-L Polypeptides aus der Kultur aufweist.
Gereinigtes biologisch aktives reifes elk-L Protein, dadurch gekennzeichnet, dass die N-terminale Aminosäuresequenz Ala-Thr-Pro-Leu-Ala-Lys-Asn-Leu-Glu-Pro-Val-Ser lautet.
Gereinigtes elk-L gemäß Anspruch 7, wobei das elk-L eine Aminosäuresequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus des Aminosäuren 1-322 und 1-213 der SEQ ID NR:2.
Gereinigtes elk-L Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die wenigstens 80% identisch ist mit einer Sequnez, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus des Aminosäuren 1-322 und 1-213 der SEQ ID NR:2.
Antikörper der spezifisch immunreaktiv ist mit einem elk-L Protein gemäß Anspruch 8.
Antikörper nach Anspruch 10, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Oligomer, das lösliche elk-L Proteine enthält, wobei jedes der löslichen elk-L Proteine eine Aminosäuresequenz aufweist, die wenigstens 80% identisch ist mit der Sequenz der Reste 1-213 der SEQ ID NR:2, wobei das Oligomer fähig ist elk zu binden.
Oligomer nach Anspruch 12, wobei das Oligomer zwei oder drei lösliche elk-L Proteine aufweist.
Oligomer nach Anspruch 12 oder 13, wobei die Aminosäuresequenz des elk-L Proteins die Aminosäuren 1-213 der SEQ ID NR:2 sind.
Fusionsprotein, das ein lösliches elk-L-Protein und ein Fc Protein aufweist, wobei das lösliche elk-L Protein eine Aminosäuresequenz aufweist, die wenigstens 80% identisch ist mit der Sequenz der Reste 1-213 der SEQ ID NR:2.
Fusionsprotein nach Anspruch 15, wobei die Aminosäuresequenz des elk-L Proteins die Aminosäuren 1-213 der SEQ ID NR:2 sind.
Dimer, das zwei Fusionsproteine gemäß Anspruch 15 oder 16 aufweist.