DE69325389T2

DE69325389T2 - Verfahren zur stabile transformation von weizen

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Publication number: DE69325389T2
Application number: DE69325389T
Authority: DE
Inventors: Yin-Fu Chang; Andrea Itano; Stephen J. Mejza; Leslie Walker; James Wong
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 1992-12-16
Filing date: 1993-12-13
Publication date: 1999-11-25
Anticipated expiration: 2013-12-14
Also published as: DK0674715T4; EP0674715B1; EP0674715A1; EP0674715B2; ES2134925T5; WO1994013822A2; GR3031054T3; DE69325389T3; CA2151127A1; AU688297B2; DE69325389D1; CA2151127C; WO1994013822A3; ES2134925T3; US5610042A; ATE181364T1; DK0674715T3; AU5749394A; US5955362A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Transformation und Regeneration von fertilem transformiertem Weizen.
Weizen ist eine der wichtigsten Getreidenutzpflanzen in der Welt. Während er gegenwärtig in einem breiten Gürtel von Umgebungen gezüchtet wird, erfolgt die prominenteste Produktion von Weizen in den USA, China, Australien, Kanada, Indien und Europa.
Das meiste des produzierten Weizens wird als Mehl konsumiert. Brotweizen macht etwa 80% des gesamten Weizenkonsums aus.
Die Entwicklung eines effizienten Transformationssystems ist für die Molekularanalyse der Genexpression in Pflanzen notwendig. In Getreidenutzpflanzen wurde diese Entwicklung durch Schwierigkeiten verlangsamt, die bei der Pflanzenregeneration und der Unempfänglichkeit von Monocotylen gegenüber der durch Agrobakterium vermittelten Transformation auftraten. Der hauptsächliche Fortschritt, der bei der Transformation von Getreide erzielt wurde, bestand in der Produktion von transgenem Reis und Mais. Der Fortschritt bezüglich Weizen wurde durch die fehlende Möglichkeit, geeignete Techniken zur Regeneration der fertilen Pflanzen nach Transformation zu etablieren, behindert.
Es gibt eine Reihe von publizierten Berichten über eine vorübergehende Expression von Fremdgenen in Weizen. Jedoch betrifft der einzige Bericht über stabil transformierte Weizenpflanzen in Vasil et al. (Biotechnology 10(6), 1992, 667-74) ein arbeitsintensives Verfahren, das Transformanten mit niedriger Frequenz ergibt.
Daher besteht eine Notwendigkeit nach biotechnologischen Verfahren zur Entwicklung von Weizensorten mit hoher Ausbeute, hohem Nährpotential und Krankheitsresistenz. Solche Verfahren sind notwendig, um die gegenwärtig verwendeten traditionellen Züchtungsverfahren zu ergänzen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur stabilen Transformation von Weizen mit Nucleinsäuresequenzen von Interesse und die Regeneration von fertilen transgenen Weizenpflanzen. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren zur Produktion von stabil transformierten fertilen Weizenpflanzen, wobei das Verfahren umfaßt:
(a) Erhalt eines unreifen Embryos von einer Weizenpflanze,
(b) Plattierung des unreifen Embryos auf Wachstumsmedium,
(c) Bombardierung des unreifen Embryos mit einer DNA- Sequenz von Interesse 0 bis 10 Tage nach dem Plattieren,
(d) Erhalt des Embryos oder eines sich entwickelnden Callus; und
(e) Regeneration fertiler transformierter Pflanzen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden unreife Embryos mit Teilchen, die mit einer DNA-Sequenz von Interesse beschichtet sind, beschossen, wobei die Sequenz ein dhfr-Gen umfaßt, die beschossenen Embryos werden auf einem Medium, das Methotrexat enthält, gezüchtet, um das transformierte Gewebe zu selektieren, und fertile transformierte Pflanzen werden aus dem transformierten Gewebe regeneriert. Die Weizenembryos werden unter Verwendung eines Mikroprojektilbeschusses mit hoher Geschwindigkeit transformiert und stabil transformierte Pflanzen werden regeneriert. Das Verfahren produziert stabil transformierte, fertile Weizenpflanzen, die Nachkommen produzieren können, die stabil transformiert sind und die das Fremdgen von Interesse exprimieren.
Ein rasches hocheffizientes Verfahren zur stabilen Transformation von Weizenembryos und die Regeneration von transgenen Weizenpflanzen wird bereitgestellt. Das Verfahren umfaßt die stabile Transformation eines unreifen Weizenembryos und die Regeneration von Weizenpflanzen aus den transformierten Embryos. Zusätzlich können unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren fertile transgene Weizenpflanzen mit hoher Frequenz bis zur Reife gezüchtet werden. Die fertilen transformierten Pflanzen können transformierte Nachkommen produzieren, die das Fremdgen/die Fremdgene exprimieren.
Das Verfahren umfaßt die Unterwerfung der unreifen Weizenembryos einem Projektilbeschuß mit hoher Geschwindigkeit, wobei Nucleinsäuren oder insbesondere Gene von Interesse verwendet werden.
Insbesondere Ähren aus im Treibhaus gezüchteten Weizenpflanzen werden etwa 10 bis etwa 16, im allgemeinen etwa 12 Tage, nach der Anthese gewonnen. Die Körner werden von den Ähren abgetrennt, und die Oberfläche wird sterilisiert. Die Embryos werden dann herausgeschnitten und auf Wachstumsmedium plattiert. 0 bis 10 Tage nach der Exzision wird die DNA in den Embryo eingebracht, wobei eine Teilchenbeschußvorrichtung verwendet wird. Nach der DNA- Abgabe kann der Embryo oder der sich entwickelnde Callus ohne Selektionsdruck aufrechterhalten werden, und dann kann das Gewebe in Gegenwart oder Abwesenheit von Selektion regeneriert werden. Alternativ werden Pflanzen aus dem beschossenen Gewebe ohne Selektion regeneriert, und die regenerierten Pflanzen werden auf die Anwesenheit der abgegebenen DNA getestet.
Ferner umfassen Weizengewebe, die zur Transformation gemäß den hier beschriebenen Verfahren befähigt sind, Calli, Zellsuspensionskulturen, Antheren, Mikrosporen, Embryos, Infloreszenzen und dgl. Zellsuspensionskulturen können von Calli von Embryos, Blattgeweben, jungen Infloreszenzen, Antheren etc. abgeleitet sein.
Der Callus kann aus jedem Gewebe von Weizenpflanzen einschließlich Triticum aestivum und Triticum durum stammen. Bevorzugt ist das zur Initiation des Callus verwendete Gewebe unreifes Gewebe, wie unreife Embryos, unreife Infloreszenzen und der Grundteil der jungen Blätter. Alternativ kann der Callus von Antheren, Mikrosporen, reifen Embryos und im Prinzip jedem anderen Gewebe des Weizens, das zur Callusbildung befähigt ist oder sekundär von Embryos, abstammen. Ein besonders nützliches Gewebe zur Produktion eines regenerierbaren Callus ist das Skutellum von unreifen Weizenembryos. Hier bezeichnet der Ausdruck "Callus" regenerierbaren Callus, weiter aufteilbar in Typ I-Callus und Typ II-Callus, wie bei Mais definiert (vgl. beispielsweise Ozias-Atkins et al. (1982) Protoplasma 110: 95-105; Maddock et al. (1983) J. of Experimental Botany 34(144): 915-926; Green (1982) in: Fujiwara A. (Hrsg.) Proc. Sth Intl. Cong. Plant Tissue and Cell Culture, Maruzen Co., Tokyo, S. 107-108; Green et al. (1982) in: Downey K. et al. (Hrsg.) Molecular genetics of Plants and Animals, Miami Winter Symposium Series, Academic Press, New York, S. 147-157; und Tomes (1985), in: Bright S (Hrsg.) Cell Tissue and Cell Culture, Martinus Nijhoff/Dr. W. Junk Publishers, Dordrecht, Niederlande, S. 175-203).
Callus umfaßt Typ I und Typ II-Callus (Fig. 1), bevorzugt abgeleitet von unreifen Embryos, Infloreszenzen, Antheren oder Blättern, der von auf einem Medium, das Saccharose oder eine andere Kohlenstoffquelle enthält, gezüchteten Explantaten induziert wurde. Von besonderem Interesse ist Callus, der von unreifen Embryos auf einem Medium, das Maltose enthält, abgeleitet wurde, der nachstehend als Typ M- Callus oder Typ II-Callus, abgeleitet auf einem Maltose enthaltenden Medium, bezeichnet wird. So wird Callusgewebe von Typ M-Callus, Typ I-Callus und Typ II-Callus ausgewählt. In der Pflanzengewebskultur, insbesondere bei der Kultur des unreifen Getreideembryos, wurde Saccharose fast ausschließlich als Energiequelle, üblicherweise in Konzentrationen von 2 bis 3%, verwendet. Es wurde beschrieben, daß Maltose eine verbesserte Regeneration grüner Pflanzen aus Alfalfapetiolen und Weizenantheren besitzt. (Vgl. beispielsweise Strickland et al. (1987) Plant Science 48: 113-121; Stuart et al. US- Patent 4 801 545; Brettell et al. (1990) Plant Cell Reports 9: 14-16; Orshinsky et al. (1990) Plant Cell Reports 9: 365- 369; und Zhou et al. (1991) Plant Cell Reports 10: 63-66).
Es wird durch die Stufen der Erfindung anerkannt, daß das Verfahren die Züchtung von unreifen Embryos oder von sich entwickelndem Callus auf Gewebskulturmedium umfaßt. Allgemein nützlich für das hier beschriebene Verfahren ist die Verwendung eines Basalmediums aus Mikronährstoffen, Makronährstoffen, einer Kohlenstoffquelle, Eisen, Vitaminen und Pflanzenwachstumsregulatoren. Pflanzenwachstumsregulatoren sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen Auxine, Cytokinine und Gibberelline. Solche Regulatoren können von der Stufe im Verfahren und dem speziellen verwendeten Weizengenotyp abhängen.
Typ M-Callus (Fig. 2) kann direkt aus der Züchtung unreifer Embryos auf maltosehaltigem Medium erhalten werden. Der maltoseinduzierte Embryocallus ist verreibbar bzw. krümelig, granulär mit sichtbaren somatischen Embryos und wächst relativ langsam. Maltose kann dem Gewebskulturmedium in einer Konzentration von etwa 1 bis etwa 30%, bevorzugt etwa 11 bis etwa 18%, zugesetzt werden. Die Expositionszeit der Embryos gegenüber der Maltose kann im Bereich von etwa 3 bis etwa 42 Tagen, bevorzugt etwa 7 bis etwa 28 Tagen, liegen.
Für die Erfindung nützliche Pflanzenwachstumsregulatoren umfassen solche mit auxinartigen Funktionen, wie IAA, NAA, 2,4-D, 2,4,5-T-Dicamba, p-Chlorophenoxyessigsäure und dgl. Solche Regulatoren können dem maltosehaltigen Medium in einer Konzentration von etwa 0,5 mg/l bis etwa 100 mg/l, bevorzugt etwa 1 mg/l bis etwa 40 mg/l und am meisten bevorzugt etwa 2 bis etwa 10 mg/l, zugesetzt werden. 2,4-D ist der bevorzugte Pflanzenwachstumsregulator zur Induktion des Typ M-Callus von unreifen Weizenembryos, die auf einem maltosehaltigen Medium gezüchtet wurden.
Der Typ M-Callus kann als Zielgewebe für die Transformation verwendet werden. Er wird auch direkt bei der Erzeugung von Zellsuspensionskulturen oder bei der Erzeugung von Typ II-Callus verwendet. Unter Verwendung des Typ M-Callus oder des von Typ M-abgeleiteten Typ II-Callus wird eine regenerierbare Zellsuspensionskultur innerhalb von drei Monaten aus der Embryokultur erhalten. Dies ist viel kürzer als das herkömmliche Verfahren (mindestens 6 bis 8 Monate), bei dem Saccharose als Hauptkohlenhydratquelle im Medium verwendet wird. Der Typ M-abgeleitete Typ II-Callus und die Typ II-abgeleitete Zellsuspensionskulturen sind auch in hohem Maße regenerierbar. Bis zu 400 Pflanzen können pro g (Frischgewicht) eines solchen Typ II-Callus regeneriert werden.
Der Typ M-Callus und der Typ M-abgeleitete Typ IT-Callus ergeben fertile Pflanzen und Nachkommen. In der Tat produzieren bis zu etwa 89% der Pflanzen, die aus 9 Monate altem Typ M und Typ M-abgeleitetem Typ II-Callus regeneriert werden, Samen. Zusätzlich eignet sich der Typ M und der Typ II-Callus und die davon abgeleiteten Zellsuspensionskulturen für die Transformation. Sie ergeben eine große Anzahl von Transformanten und fertilen Pflanzen und Nachkommen.
Es gibt mehrere Vorteile bezüglich der Verwendung von Typ II-Callus als Zielgewebe. Zuerst ist Typ II-Callus zerreibbar, d. h. der Callus ist durch kleine Zellaggregate gekennzeichnet. Der Typ II-Callus ist auch in hohem Maße für die Etablierung regenerierbarer Zellsuspensionskulturen kompetent, ergibt eine große Anzahl von Transformanten, ist in hohem Maße regenerierbar und ergibt fertile Pflanzen und Nachkommen. Im allgemeinen spricht die Typ II-Calluskultur stärker auf Bombardierungsprotokolle und auf die Selektion von transformiertem Gewebe an.
Allgemeine Literaturstellen zur Initiierung von Callus umfassen Green EC (1982) in: Fujiwara A (Hrsg.) Proc. Sth Intl. Cong. Plant Tissue and Cell Culture, Maruzen Co., Tokyo, S. 107-108; und Maddock S. E. (1987) Plant Cell Rep. 6: 23-26); Antheren (vgl. z. B. Harris et al. (1988) Plant Cell Rep. 6 : 337-340, Jahne et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 82: 74-80, und Sun et al. (1989) Plant Cell Rep. 8: 313-316.
Die unreifen Embryos, die transformiert werden sollen, werden mit einer Vorrichtung für den dichten Partikelbeschuß beschossen. Partikelbeschuß bietet ein rasches Verfahren zur Transformation an. Vgl. im allgemeinen Finer et al. (1992) Plant Cell Reports 11: 323-328; Christou P. (1990) Physiologia Plantarum 79: 210-212; Wang et al. (1988) Plant Molecular Biology 11: 433-439; Daniell et al. (1991) Plant Cell Reports 9: 615-619; Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4305-4309; Klein et al. (1987) Nature 327: 70-73; Gordon-Kamm et al. (1990) The Plant Cell 2: 603- 618; Oard et al. (1990) Plant Physiol. 92: 334-339; Sanford J. C. (1990) Physiologia Plantarum 79: 206-209; Fromm et al. (1990) Bio/Technology 8: 833-839; Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87: 671-674; Sautter et al. (1991) Bio/Technology 9: 1080-1085; Iida et al. (1990) Theor. Appl. Genet. 80: 813-816; und Christou et al. (1991) Bio/Technology 9: 957-962.
Während mehrere Vorrichtungen zum Partikelbeschuß in der Literatur offenbart sind, ist eine bevorzugte Vorrichtung die Teilchenkanone, die in der WO 93/07256 offenbart ist, die hiermit unter Bezugnahme eingeschlossen ist. Eine solche offenbarte Teilchenkanone kann Teilchen, die genetisches Material tragen, in eine breite Vielzahl von Zellen einschleusen. Die Kanone umfaßt:
- einen Abflugblock zur Beschleunigung und Steuerung der Teilchen, die das genetische Material tragen;
- eine durch Inertgas betriebene Abschußvorrichtung zur präzisen Geschwindigkeitskontrolle des Abflugblocks;
- eine Stopp/Abstreifanordnung zum Stoppen des Abflugblocks und zum Erlauben eines freien Flugs der mit den genetischen materialbeschichten Teilchen in Richtung intakter Zellen; und
- begleitende Verschlüsse und Sicherheitsmaßnahmen.
Die Kanone besitzt eine raschen Feuerungszyklus sowie eine beständige Kraft und Genauigkeit der abgeschossenen Schüsse. Die Kanone liefert eine kontrollierte reproduzierbare einstellbare und sichere Austreibquelle. Ein zusätzlicher Nutzen der in der WO 93/07256 offenbarten Kanone ist die Tatsache, daß die Kanone weniger DNA für den Beschuß benötigt als andere Vorrichtungen, die im Stand der Technik bekannt sind. Jedoch sind andere Vorrichtungen für den Pflanzenzellbeschuß, wie beispielsweise das heliumbetriebene Beschleunigungssystem (Sanford et al., Technique-J. Meth. in Cell und Molec. Biol. 3: 3-16, 1991) in gleicher Weise bevorzugt.
Im allgemeinen werden die Embryos mindestens einmal beschossen. Jedoch können multiple Beschüsse der Embryos durchgeführt werden, um die Transformationsfrequenz zu verstärken. Das Unterwerfen der Embryos multiplen Schüssen von DNA-beschichteten Teilchen stellt eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar. Es wurde gezeigt, daß etwa zwei Schüsse pro Transformation die besten Ergebnisse ergeben.
Die als DNA-Träger bei den Beschüssen verwendeten Teilchen besitzen im allgemeinen einen Durchmesser von etwa 0,5 bis etwa 2,0 um, genauer etwa 1,0 um. Die Teilchen werden mit mindestens etwa 0,5 ug bis etwa 2,0 ug, bevorzugt mit etwa 1 ug DNA pro Gewicht der Teilchen beschichtet. Teilchen, die erfindungsgemäß nützlich sind, sind im Handel erhältlich. Beispielsweise können Goldteilchen von der BioRad Company verwendet werden.
Die Teilchenkanone der WO 93/07256 erlaubt die Kontrolle des Drucks. Ein Druck im Bereich von etwa 500 psi bis etwa 2500 psi, bevorzugt etwa 1900 psi, kann verwendet werden.
Die Embryos können einer Plasmolysebehandlung vor dem Beschuß, nach dem Beschuß oder bevorzugt sowohl vor als auch nach dem Beschuß unterworfen werden. Die Plasmolysebehandlung kann durch Verdünnen der Embryos in einem Flüssigmedium mit einem zugesetzten Osmotikum oder durch Überführen der Embryos in ein halbfestes Medium, das das Plasmolysemittel enthält, durchgeführt werden. Im allgemeinen kann das Osmotikum jeder Zucker, wie Sorbit, Mannit, Saccharose und dgl., sein. Das Wachstumsmedium kann zusätzlich Auxin umfassen.
Nach dem Beschuß werden die Embryos mehrere Tage im Dunkeln auf Wachstumsmedium mit Auxin gezüchtet. Typischerweise werden die Embryos etwa 5 bis etwa 10 Wochen, genauer etwa 1 bis etwa T Wochen, gezüchtet, bevor sie einem Selektionsdruck unterworfen werden.
Eine Anzahl von Selektionsmitteln und Resistenzgen sind auf dem Fachgebiet bekannt. (Vgl. beispielsweise Hauptmann et al. (1988) Plant Physiol. 86: 602-606; Dekeyser et al. (1988) Plant Physiol. 90: 217-223; Eichholtz et al. (1987) Somatic Cell and Molecular Genetics 13: 67-76; Meijer et al. (1991) Plant Molecular Biology 16: 807-820; und Dekeyser et al. (1989) 90: 217-223.) Inhibitoren, wie Aminoglycosidantibiotika, die die Translationsmaschinerie der prokaryotischen und eukaryotischen Zellen stören, können verwendet werden. Solche Inhibitoren umfassen Kanamycin, G418, Hygromycin etc. Solche Inhibitoren können durch Phosphorylierungsreaktionen, die durch die Produkte von entweder dem Tn 5-Neomycin-Phosphotransferase II (npt-II)-Gen oder dem Hygromycin B-Resistenzgen aus E. coli vermittelt werden, inaktiviert werden. (vgl. beispielsweise Herrera-Estrella et al. (1983) EMBO J 2: 987-995; Waldron et al. (1985) Plant Mol Biol 5: 103-108; und die darin zitierten Literaturstellen.)
Zusätzlich können Selektionsmittel, wie Bleomycin, Methotrexat und Phosphinothricin, verwendet werden. Günstige Ergebnisse wurden bei Verwendung von Methotrexat erhalten. Methotrexat bindet sich an die katalytische Stelle des Dihydrofolatreduktaseenzyms, was zu einem Mangel an Thymidylat und anschließendem Zelltod führt. (Weikheiser, WC (1961) J. Biol. Chem. 236 : 888-893.) Berichte in der Literatur zeigen an, daß chimere Konstrukte, die ein bakterielles oder Mausdhfr-Gen enthalten, Resistenz gegenüber niedrigen Spiegeln an Methotrexat in transformiertem Tabak, Rüben, Petunien und Reispflanzen verleihen können. (Vgl. Deßlock et al. EMBO J 3: 1681-1689; Brisson et al. Nature 310: 511-514; Eichholtz et al. (1987) Somatic Cell and Molecular Genetics 13: 67-76; und Dekeyser et al. (1989) Plant Physiol. 90: 217-223.). Medien, die Methotrexat oder Hygromycin umfassen, sind bevorzugte Medien für die Selektionsstufe, die bei der Züchtung von transformiertem Gewebe beteiligt ist.
Nach dem Wachstum auf Selektionsmedium darf das transformierte und selektierte Gewebe wachsen. Nach mehreren Wochen, etwa 4 bis etwa 30 Wochen, wird das Gewebe auf Medium zur Regeneration überführt.
Eines der Haupthindernisse für die Produktion von transformierten Weizenpflanzen waren Methoden zur Regeneration von Pflanzen aus transformierten Geweben. Im allgemeinen wird zur Pflanzenregeneration der transformierte Callus auf entweder einem hormonfreiem Medium, das Saccharose enthält, auf einem Medium, das ein Cytokinin enthält, oder auf einem Medium, das Auxin und Gibberellin enthält, gezüchtet. Die Calluskulturen werden an das Licht überführt. Die Pflanzenentwicklung wird in einem hormonfreien Medium oder einem Medium mit Auxin fortgesetzt. Nach der Entwicklung von Wurzeln und Schößlingen werden die Pflänzchen auf Boden überführt und bis zur Reife gezüchtet.
In mehren Stadien während des Prozesses wird DNA aus dem Gewebe (Callus und Pflanze) extrahiert und mit einer Sonde abgesucht, um die Transformation zu bestätigen. Im Stand der Technik sind Verfahren zur Isolierung von DNA aus Callus und Geweben sowie zur Bestätigung der Anwesenheit der interessierenden DNA verfügbar. Solche Methoden zur Bestätigung umfassen die PCR-Analyse sowie die Southern Hybridisierung. Vgl. Southern, EM (1975) J. Mol. Biol. 98: 503 und Mullis K. B. (1987) Meth in Enzymology 155: 335.
Wie einem Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich ist, kann, nachdem nun ein Verfahren zur stabilen Transformation von Weizen bereitgestellt wurde, jedes Gen von Interesse bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Beispielsweise kann eine Weizenpflanze gentechnisch erzeugt werden, um Krankheits- und Insektenresistenzgene, Gene, die einen Nährwert verleihen, Gene, die männliche und/oder weibliche Sterilität verleihen, antimycotische, antibakterielle oder antivirale Gene und dgl. zu exprimeren. Auf ähnliche Weise kann das Verfahren zum Transfer jeder Nucleinsäure zur Kontrolle der Genexpression verwendet werden. Beispielsweise könnte die zu transferierende DNA Antisense-RNA codieren.
Wenn Typ II-Callus als Zielgewebe verwendet wird, wird das Callusgewebe zweimal mit mit 1,0 Mm Goldteilchen beschichteter DNA beschossen. Die Bombardierungsparameter umfassen 1, 0 um Teilchen; 2 Schüsse pro Ziel; 0,6 Mg DNA pro Schuß; 1900 psi; Plasmolysebehandlung sowohl vor als auch nach dem Beschuß. Etwa 14 Tage nach dem Beschuß wird das beschossene Gewebe einer Selektion auf Methotrexat im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 20 ug/ml Methotrexat, genauer etwa 0,5 bis etwa 5 ug/ml Methotrexat, für etwa 4 Monate unterworfen. Um fertile Weizenpflanzen aus den transformierten Zellen zu regenerieren, wird das Gewebe in MS-Medium, das etwa 0,1 bis etwa 1,0 mg/l 2,4-D enthält, im Dunkeln überführt. Nachdem das Gewebe embryogene Strukturen gebildet hat, wird es auf MS-Medium, das etwa 0,5 bis etwa 1 mg/l NAA und etwa 0,5 bis etwa 10 mg/l GA enthält, überführt und für etwa zwei Wochen belichtet. Nach der Induktion von Schößlingen werden die Gewebe auf MS-Medium ohne Hormone oder MS-Medium halber Stärke, das etwa 0,1 bis etwa 1 mg/l NAA für die Wurzelinduktion enthält, überführt.
Unter Verwendung der hier beschriebenen Methoden werden transformierte Calluslinien mit einer hohen Effizienz, verglichen mit anderen veröffentlichten Berichten, erhalten. In der Tat bis zu 50% Effizienz kann festgestellt werden, wie durch PCR und/oder Southern Analyse bestätigt wird. Transformationsexperimente ergeben routinemäßig stabile Transformanten mit einer Frequenz von etwa 50%, basierend auf der Anzahl der pro Anzahl von Zielschüssen erhaltenen Transformanten. Ferner ergeben bei Verwendung von Methotrexatselektion die regenerierten Pflanzen einen positiven Test auf die Transformation.
Verbesserte embryogene Kulturen von Weizen können unter Verwendung von zuvor regeneriertem Material als Quelle für das Ausgangsmaterial erhalten werden. Solche verbesserten Kulturen werden als "rezyklierte bzw. zurückgeführte Linien" bezeichnet, da sie durch das Gewebskulturverfahren mehr als einmal zykliert werden. Das Ausgangsmaterial für diese verbesserten Kulturen kann entweder unreife Embryos, erhalten direkt aus regenerierten Pflanzen, sein oder das Ausgangsmaterial kann Samen aus regenerierten Pflanzen, die als Quelle für unreife Embryos gezüchtet wurden, sein. Die so abgeleiteten embryogenen Kulturen besitzen eine verbesserte Initiationsfrequenz und Fertilität der Regeneranten verglichen mit herkömmlichen nichtrezyklierten Linien. Diese Verbesserungen erhöhen signifikant die Leichtigkeit und Effizienz, mit der transgener Weizen und dessen Nachkommen erhalten werden können.
Nachdem die Erfindung nun allgemein beschrieben worden ist, dienen die folgenden Beispiele der Erläuterung und nicht der Beschränkung.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt Weizentyp II-Callus, der aus unreifen Embryos induziert wurde.
Fig. 2 zeigt Weizentyp M-Callus, der aus unreifen Embryos induziert wurde.

Beispiele:

I. Herstellung von Weizencallus, Genotyp UC703

Weizenpflanzen des Genotyps UC703 wurden bis zur Blütebildung gezüchtet und selbst bestäubt. Ähren, die Embryos mit einer Länge von 1 bis 2,5 mm enthielten, wurden von den Pflanzen entfernt und mit 10%iger Cloroxlösung 10 min sterilisiert. Die Embryos wurden aus den unreifen Samen entfernt und der Embryoachse nach unten in ein Murashige-Skoog-Medium, das 5 oder 10 mg/l 2,4-D, 13,7% Gew./Vol. Maltose, 100 mg/l Prolin und 100 mg/l Myoinosit enthielt und mit 0,7 bis 0,8% Gew./Vol. Phytagar oder 0,1 bis 0,2% Gelrit verfestigt war (Initiationsmedium), eingebracht. Nach einer dreiwöchigen Züchtung im Dunkeln bei 27ºC wurde ein bevorzugter Callus durch die Anwesenheit von gut ausgebildeten globulären, somatischen Embryos (Typ M-Callus), die sich auf dem Skutellum bestimmter. Explantate entwickelt hatten, erkannt. Diese Calli wurden entfernt und entweder in MS- Medium, das 1,0 bis 5,0 mg/l 2,4-D und 2 bis 3% Saccharose enthielt, oder in ein Medium, das eine verringerte Konzentration (5%) Maltose enthielt, eingebracht, bevor sie auf das Saccharosemedium gebracht wurden. Das Material wurde dann jede Woche in frischem MS-Medium, das 3% Saccharose enthielt, subkultiviert.

II. Genotypische Antwort von Weizen bei der TYP M-Callusinduktion

Weizenpflanzen des Genotyps UC703, MIT, Orofen, Yecoro rojo und Chris wurde bis zur Blütenbildung gezüchtet und selbst bestäubt. Unreife Embryos wurden aus den Ähren entnommen und auf einem Murashige-Skoog-Medium gezüchtet, das enthielt:
1 mg/l 2,4-D plus 2% Saccharose (1MS),
1 mg/l 2,4-D plus 2% Maltose (1MS2M),
1 mg/l 2,4-D plus 9% Maltose (1MS9M),
1 mg/l 2,4-D plus 13,7% Maltose (1MS13,7M), oder
10 mg/l 2,4-D plus 13,7% Maltose (10MS13,7M),
um die Typ M-Callusbildung zu induzieren. Nach dreiwöchiger Züchtung im Dunkeln bei 27ºC wurden die Induktionsfrequenz (%) des Typ M-Callus, des Typ I-Callus sowie nichtmorphogenetische Strukturen aus den unreifen Embryos der getesteten Genotypen bewertet.

III. Frequenz der Induktion von Typ M-Callus aus Weizengenotyp UC703

Weizenpflanzen des Genotyps UC703 wurden bis zur Blütenbildung gezüchtet und selbst bestäubt. Unreife Embryos wurden aus den Ähren entfernt und mit der Embryoachse nach unten auf Murashige-Skoog-Medium (MS-Medium), das 5 oder 10 mg/l 2,4-D und 13,7% Gew./Vol. Maltose enthielt und mit 0,8% Phytagar verfestigt worden war, eingebracht. Nach dreiwöchiger Züchtung im Dunkeln bei 27ºC wurde die Typ M- Callusinduktionsfrequenz aus den gezüchteten unreifen Embryos bewertet. Medium 1. MS + 5 mg/l 2,4-D + 13,7% Maltose
Typ M-Callusinduktionsfrequenz: 52% Medium 2. MS + 10 mg/l 2,4-D + 13,7% Maltose
Typ M-Callusinduktionsfrequenz: 44%

IV. Zellherstellung für den Beschuß

Die Zellen für den Beschuß wurden mit einer Plasmolysebehandlung vor und nach dem Beschuß behandelt. Das gepackte Zellvolumen wurde gemessen, und die Zellen wurden in 1MS- Flüssigmedium verdünnt, wobei ein Osmotikum zugesetzt wurde: 0,4 M Sorbit für Suspensionszellen und 0,6 M Sorbit für Calluszellen. Die Zellen wurden so verdünnt, daß das abschließend gepackte Zellvolumen pro Zielzelle 1/20 ml für eine Feinsuspension und 1/10 ml für Callus betrug. Die verdünnten Zellen wurden in einen 250 ml Kolben, der einen Rührstab enthielt, eingebracht und mindestens 30 min bis zu ein paar Stunden gerührt. Um die Zellen zu plattieren, wurden 2 ml aus dem Kolben entnommen und in das obere Ende eines Vakuumkolbens pipettiert, auf das ein Whatman-2,5 cm-GFA-Filter plaziert wurde. Das Vakuum wurde angelegt, bis die Zellen auf dem Filter getrocknet wurden. Die Filter wurden auf 60 · 15 mm Petri-Platten, die 5 ml festes Plasmolysemedium nach Beschuß enthielten, das 1MS ist, das 0,2 M Sorbit für Suspensionszellen oder 0,4 M Sorbit für Calluszellen enthält, ausgebracht. Zwei Filter wurden in jede Schale eingebracht.

V. Vektoren, die zum Beschuß verwendet wurden

Die folgenden Plasmide wurden für den Partikelbeschuß verwendet:
pSOG30 ist ein β-Glucuronidase-(Gus)-Expressionsvektor, der von dem Plasmid pBI121 abgeleitet ist, das von Clontech Laboratories, Palo Alto, Californien, bezogen wurde. Intron- 6 des Mais-Adhl-Gens wurde mittels PCR aus dem Plasmid pB428 amplifiziert, das in Bennetzen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 81: 4125-4128 (1987) beschrieben ist und in die BamHI-Spaltstelle von pBI121 ligiert, die zwischen dem CaMV 35S-Promotor und dem Gus-Gen liegt. Eine 17 bp große Leadersequenz des Chlorose-Flecken-Virus (clorotic mottle virus) von Mais (MCMV), das in Lommel et al., Virology 181: 382-385 (1991) beschrieben ist, wurde in den nichttranslatierten Leader des 35S-Gus-Gens insertiert. Die abschließende Genfusion enthält die Struktur: 355-Promotor- Adhl-intron 6-MCMV-Leader-Gus-Nos-Terminator, alle im pUC19- Vektorgerüst.
pSOG35 ist ein Dihydrofolatreduktase-(dhfr)-Expressionsvektor. Dieses Konstrukt wurde durch Fusion des 35S Promotors, Adhl-intron 6 und MCMV-Leader, der vorstehend beschrieben wurde, an das dhfr-Gen aus dem Plasmid pHCO, das in Bourouis und Jarry, EMBO J. 2: 1099-1104 (1983) beschrieben ist, abgeleitet. Die abschließend erhaltene Genfusion enthält die Struktur: 35S Promotor-Adhl-intron 6-MCMV- Leader-dhfr-Nos-Terminator, alle im Gerüst des pUC19-Vektors.
nTG48 umfaßt das Gus-Gen unter der Kontrolle des antherenspezifischen ant43D-Promotors und ein dhfr-Gen in einem pUC19-Gerüst. Er ist das Ergebnis aus der Kombination von vier verschiedenen DNA-Fragmenten. Fragment 1 wurde aus pSOG35 nach Restriktionsspaltung mit Hindlil und EcoRI erhalten. Das EcoRT-Ende des isolierten Fragments, das das dhfr-Gen enthält, wurde an ein Sall-Restriktionsende angepaßt. Das Fragment 2 bestand aus dem antherenspezifischen ant43D-Promotor, der aus dem Plasmid pCIB 3178 nach Restriktionsspaltung mit Hindill und XbaI isoliert wurde. Das Plasmid pCIB 3178 ist ausführlich in der europäischen Patentanmeldung Nr. 93810455.1 beschrieben, deren relevante Teile hiermit unter Bezugnahme eingeschlossen sind und wurde unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-18978 hinterlegt. Das Fragment 3 wurde aus dem Plasmid pSOG30 nach Restriktionsspaltung mit XbaI und EcoRI erhalten und enthielt das Gus-Gen, und das Fragment 4 entsprach dem im Handel erhältlichen Vektor pUC19, der mit SalI und EcoRI gespalten worden.

VI. Herstellung der Teilchen

Goldteilchen (1,0 um; von Bio-Rad) wurden durch Aliquotieren in ein Mikrozentrifugenröhrchen, Zugabe von etwa 1 ml 100% Ethanol, Verwirbeln, Herabzentrifugieren, Entfernen des Überstands und zweimaliges Wiederholen mit sterilem Wasser gewaschen. Nach dem abschließenden Waschen wurde möglichst viel Wasser entfernt, und die Polylysinlösung (0,02% Polylysin + 15 mM Ammoniumacetat) wurde zugesetzt, um die Teilchen vollständig zu benetzen. Die Teilchen wurden verwirbelt, zentrifugiert, und der Überstand wurde entfernt. Die Teilchen wurden über Nacht in einem Abzug mit laminarem Fluß oder 30 min unter einem sanften Stickstoffstrom trocknen gelassen.
Für eine "volle" Teilchenherstellung wurden 10 mg Teilchen ausgewogen und in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen, das einen Rührstab enthielt, eingebracht. 100 ul (1 ug/ul) DNA wurden zugesetzt und dann wurde verwirbelt. Dann wurden 10 ul 100 mM Na&sub2;HPO&sub4; zugesetzt, anschließend wurde verwirbelt. 10 ul 100 mM CaCl&sub2; wurden zugesetzt und dann wurde verwirbelt. Schließlich wurden 380 ul 100% Ethanol zugesetzt und dann wurde verwirbelt. Während die Suspension heftig gerührt wurde, wurden 3 ul auf Plastik- Flyer pipettiert (Projektile). Die Teilchen wurden auf den Flyern für mindestens 15 min vor dem Beschuß trocknen gelassen.

VII. Beschuß der Zellkulturen

Die Petri-Schale, die die Zellfilter enthielt, wurde auf die Plattform der Anordnung umgekehrt aufgebracht und über die Öffnung für den Teilchenflug zentriert. Der klare Rand wurde über den oberen Teil der Plattform gegeben. Ein Mikroprojektil wurde auf das Ende des Geschützverschlußblocks gegeben, und der Verschlußblock wurde geschlossen. Der "Arm"-Knopf wurde gedrückt, um das Reservoir mit der geeigneten Menge an Heliumgas (üblicherweise 1800 bis 1900 psi) zu füllen. Das Vakuum in der Kammer wurde auf etwa 27 mm angelegt. Nach Abschalten des Vakuums wurden die "Arm"- und "Feuer"-Knöpfe gedrückt. Der "Arm"-Knopf wurde dann in die "Off"-Position gedreht. Jeder Filter wurde üblicherweise zweimal beschossen.

VIII. Züchtung und Selektion nach dem Beschluß

Nach dem Beschuß wurden die Zellen über Nacht im Dunkeln gehalten. Am nächsten Tag wurden die Filter von dem Plasmolysemedium entfernt und auf 1MS-Medium gegeben. Die Selektion wurde 7 bis 10 Tage nach dem Beschluß für die Suspensionszellen und nach 14 Tagen für die Calluszellen angewandt. Die Zellen wurden von den Filtern abgekratzt und auf der Oberfläche der Platten, die 1MS plus 2 mg/l Methotrexat enthielten, ausgebreitet. (Transformanten wurden durch anfängliche Selektion auch mit 4 mg/l, Methotrexat erhalten.) Die Platten wurden im Dunkeln mehrere Wochen inkubiert. Resistente Kolonien, die nach ein paar Wochen auftraten, wurden auf 1MS + 4 mg/l Methotrexat überführt. Kolonien, die für etwa 3 bis 4 Wochen weiter proliferierten, wurden dann in "0,5MS"-Erhaltungsmedium überführt, das eine wäßrige Lösung von MS-Salzen, Vitaminen, Eisen, 3% Saccharose, 0,7% Agar, 0,5 mg/l 2,4-D ist. Das Gewebe wurde auf diesem Medium zweiwöchentlich subkultiviert, bis embryogene Strukturen auftraten oder das Gewebe für die Regeneration als geeignet erschien.

IX. Regeneration

Das Gewebe wurde auf MS-Medium, das entweder 3 mg/l BAP oder 1 mg/l NAA + 5 mg/l GA enthielt, überführt, und die Platten wurden an das Licht gebracht. Nach 2 bis 4 Wochen wurde das Gewebe in MS-Medium ohne Hormone überführt. Erschienene Schößlinge wurden in Behältnisse mit entweder MS- Medium ohne Hormone oder MS-Medium mit 0,5 mg/l NAA gegeben. Wenn ausreichend Wurzeln und Schößlingswachstum aufgetreten war, wurden die Pflänzchen in Bodenerde überführt und in ein Phytotron eingebracht.

X. Analyse der Transformanten

Etwa 20 mg Callusgewebe wurde für die PCR-Analyse verwendet. Die DNA wurde unter Verwendung des raschen Phenol/- Chloroform : Isoamylalkohol-Verfahrens extrahiert und 2 ul wurden pro Reaktion verwendet. Die Primer wurden so entwickelt, daß sie die Region von dem 5'-Ende des adh-Gens bis zu dem 3'-Ende des dhfr-Gens amplifizierten.

XI. Transformation von Weizen durch Mikroprolektilbeschuß des Typ II-Callus, der von dem Typ M-Callus abgeleitet ist

Der von dem Typ M-Callus abgeleitete Typ II-Callus wurde von unreifen Embryos des Frühlingsweizensgenotyps UC703 unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Methoden erhalten. Die so erhaltene Calluslinie mit der Bezeichnung UC703-0612 war zerreibbar, embryogen und vermehrte sich in vitro seriell. Eine Mikroprojektilvorrichtung wurde zur Abgabe von DNA an den Typ II-Callus verwendet. pSOG30 und pSOG35 wurden gleichzeitig auf Goldteilchen mit Mikrometergröße präzipitiert und in Pflanzenzellen eingeschleust.
Zwei Wochen nach dem Beschuß wurden die Zellen in Calluserhaltungsmedium, das 4 mg/l Methotrexat enthielt, überführt. Resistente Kolonien, die proliferierten, wurden über eine Zeitspanne von Monaten subkultiviert und dann in Abwe senheit von Methotrexat regeneriert. Die PCR-Analyse wurde an Callusproben durchgeführt, um die Anwesenheit des dhfr- Gens zu bestätigen. Eine Kolonie, SJ3-2A, produzierte eine T&sub0;-Pflanze (SJ3-2A-1) in vitro, die schließlich in Boden überführt wurde und im Treibhaus gezüchtet wurde.
Blattproben dieser Pflanze wurden auf Gus-Enzymaktivität unter Verwendung von Standardprotokollen (Jefferson, Plant Molecular Biology Reporter, Bd. 5, Nr. 4, 1987) getestet und waren positiv. Die DNA wurde aus dieser Pflanze extrahiert, und eine Southern Analyse bestätigte die Anwesenheit des dhfr-Gens.
Die Pflanze SJ3-2A-1 wurde bis zur Reife in einem Treibhaus gezüchtet und mit Wildtyppollen von UC703-Pf lanzen bestäubt. Zwei Samen entwickelten sich, von denen zwei unreife Embryos herausgeschnitten und gekeimt wurden. Ein gewonnener Embryo produzierte eine T1-Pflanze (bekannt als RE1), während der zweite herausgeschnittene Embryo auf Callusinduktionsmedium plaziert wurde und anschließend zehn T&sub1;- Pflanzen produzierte, von denen zwei als RE2 und RE3 bekannt sind. Blattproben aus RE1 wurden auf Gus-Enzymaktivität getestet und waren positiv. Die PCR-Analyse auf die Anwesenheit der 35S-Promotorsequenzen wurde an RE1, RE2 und RE3 durchgeführt, und alle drei Pflanzen waren positiv. Die Southern Analyse wurde durchgeführt, um auf die Anwesenheit von Gus und des Gens in diesen drei Nachkommenpflanzen zu suchen, und alle drei waren bezüglich des Gens positiv. T&sub1;- Pflanzen RE1, RE2 und RE3 (auch als RE2B bekannt), wurden mit Wildtyp UC703-Pollen bestäubt, um T&sub2;-Pflanzen zu produzieren. Viele Samen entwickelten sich auf jeder Pflanze und unreife Embryos wurden gewonnen und keimten in vitro. Fluorimetrische Gus-Tests wurden durchgeführt, und die Transformanten wurden aus einer Segregationspopulation identifiziert.

XII: Transformation von Weizen durch Mikroprojektilbeschuß von unreifen Embryos und Isolierung der Transformanten ohne Verwendung eines selektierbaren Markers oder Selektionsmittels

Unreife Embryos des Genotyps UC703 mit einer Länge von 0,75 bis 1,5 mm wurden herausgeschnitten und auf MS-Medium, das 5 mg/l 2,4-D und 3% Saccharose enthielt, plattiert, wobei 30 Embryos pro Platte aufgebracht wurden.
Zwei Plasmide wurden auf Goldteilchen mit Mikrometergröße kopräzipitiert und in Pflanzenzellen mit der DuPont- Biolistikvorrichtung unter Verwendung von Standardtechniken, wie in dem Betriebshandbuch publiziert, eingeschleust. Ein Plasmid pCIB3089 enthält den Blumenkohlmosaikvirus 35S-Promotor (Nature 313: 810-812, 1985) in Fusion an die cDNA des Maisanthocyaninregulatorgens B-peru (Plant. Mol. Biol. 17: 127-130, 1991 und Genes and Development 6: 864-875, 1992), wobei das Intron #2 aus dem Alkoholdehydrogenase I-Gen (Nucleic Acid Research 12: 3983-4000, 1984) zwischen das 3'- Ende der codierenden Sequenz und 5' an die 35S-Terminatorsequenz plaziert wurde. Das andere Plasmid, pCIB4436, enthält den CaMV 35S-Promotor (Nature 313: 810-812, 1985) in Fusion an die cDNA des Maisanthocyaninregulatorgens C1 (EMBO Journal 9: 2517-2522, 1990; Genes and Development 5: 298- 309, 1991; und Genes and Development 6: 864-875, 1992), wobei das Intron #9 des Mais-PEP-Carboxylasegens (Plant Mol. Biol. 12: 579-589, 1989) zwischen das 3'-Ende der codierenden Sequenz und 5' zu dem 35S-Terminator plaziert ist. Zusammen verhalten sich diese zwei Gene als bewertbarer Marker für die Transformation.
Nach 22 Tagen wurden die Embryos auf Typ I-Callusantwort bewertet und der Callus wurde in Proliferationsmedium überführt. 20 bis 94 Embryos zeigten eine Typ I-Callusantwort. Gewebe aus 11 der 20 ansprechenden Embryos wurde in Pflanzenregenerationsmedium etwa einen Monat später über führt. 11 Pflanzen wurden bis zur Reife im Treibhaus gezüchtet, und alle Pflanzen setzten Samen an. Eine Pflanze (JN11-1800-3#1) produzierte rötlich gefärbte Samen, vermutlich hervorgerufen durch die Expression von einem oder mehrerer der insertierten Regulatorgene. Fünf DNA-Proben wurden aus dieser Pflanze erhalten, und die PCR-Analyse wurde durchgeführt, um die Anwesenheit des 35S-Promotors des C1- Gens und des B-peru-Gens zu überprüfen. Die PCR-Ergebnisse waren für diese Sequenzen in drei unabhängigen Reaktionen positiv.
Um die T1-Regeneration zu analysieren, wurden 57 unreife Embryos aus dieser PCR-positiven Pflanze herausgeschnitten, gekeimt und analysiert. Von diesen waren 41 T&sub1;-Pflanzen PCR-positiv sowohl für das B-peru- als auch das C1-Gen. Es wurde gefunden, daß 22 vom Samen abgeleitete T&sub1;-Pflanzen ebenfalls PCR-positiv für diese Gene waren. Die Southern Analyse wurde an der Stammpflanze und drei PCR-positiven T1- Nachkommen durchgeführt. Alle waren für B-peru positiv und für C1 gemäß dieser Analyse negativ. Die T&sub2;-Generation wurde im Treibhaus zur Samenproduktion gezüchtet.

XIII: Transformation von Weizen durch Mikroprolektilbeschuß der unreifen Embryos unter Verwendung einer Plasmolysestufe mit hoher Saccharosekonzentration vor der Genabgabe

Unreife Embryos (Länge 0,75 bis 1,0 mm) des Weizengenotyps UC703 wurden auf Murashige-Skoog-Medium (Physiologia Plantarum 15: 473-497, 1962), das 3 mg/l 2,4-D und 3% Saccharose enthielt, gepflanzt. 20 Embryos wurden auf jede Platte des Mediums ausgebracht. Drei Tage später wurden die unreifen Embryos in das gleiche Medium überführt, das aber weitere 15% Saccharose enthielt; um das Gewebe vor der Genabgabe zu plasmolysieren.
Die Plasmide pAct1-D (The Plant Cell 2: 163-1.71, 1990) und pSOG35 wurden auf Goldteilchen mit Mikrometergröße unter Verwendung von Standardverfahren präzipitiert. Jede Platte von Embryos wurde zweimal mit der DuPont-Biolistics-Heliumvorrichtung unter Verwendung eines Berstdrucks von 900 psi beschossen. Insgesamt vier Zielplatten wurden unter Verwendung eines Standard-80-Mesh-Siebs beschossen und vier wurden ohne Sieb an der Stelle beschossen. Etwa 4 h nach dem Beschuß wurden die Embryos zurück in das Murashige-Skoog-Medium, das 3% Saccharose enthielt, überführt. Etwa einen Monat später wurden die Embryoexplantate mit sich entwickelndem embryogenem Callus in Regenerationsmedium (Murashige- Skoog + 1 mg/l NAA, 5 mg/l GA), das weiter 2 mg/l Methotrexat als Selektionsmittel enthielt, überführt. Nach etwa einem Monat wurden entwickelte Schlößlinge in größere sterile Behälter, die als "GA7s" bekannt sind, überführt, die Murashige-Skoog-Salze mit halber Stärke, 2% Saccharose und 2 mg/l Methotrexat enthielten.
Die DNA wurde aus vier isolierten Pflanzen extrahiert und, wie beschrieben, gezüchtet. Die PCR-Analyse auf die Anwesenheit des 35S-Promotors zeigte, daß zwei Pflanzen positiv waren. Diese transgenen Pflanzen wurden als SJ30-44 und SJ30-121 bezeichnet. Die Pflanze SJ30-121 wurde auf Gus-Aktivität getestet und erwies sich als stark positiv. Die Pflanzen wurden zur Vermehrung im Treibhaus in Boden überführt. Fertile transformierte Pflanzen wurden erhalten.

XIV: Transformation von Weizen durch Mikroprolektilbeschuß von unreifen Embryos unter Verwendung einer Plasmolysestufe mit hoher Maltosekonzentration vor der Genabgabe

Unreife Embryos (Länge 0,75 bis 1,0 mm) des Genotyps UC703 wurden auf Murashige-Skoog-Medium, das 3 mg/l 2,4-D und 3% Saccharose enthielt, plattiert. Nach etwa 4 h wurden die Embryos mit der Embryoachse nach unten auf Platten, die Murashige-Skoog-Medium mit 15% Maltose, 3% Saccharose und 3 mg/l 2,4-D enthielt, plattiert, mit einem von einem Stab unterstützten Filterpapier aus Agarose, das die gleichen Komponenten enthielt, überschichtet. Die Embryos wurden 2 bis 3 h vor dem Beschuß plasmolysieren gelassen.
DNA von pActl-D (The Plant Cell 2: 163-171, 1990) und pSOG35 wurde auf die Goldteilchen mit Mikrometergröße unter Verwendung von Standardverfahren präzipitiert. Vier Zielplatten mit 20 Embryos pro Ziel wurden zweimal mit der DuPont-Biolistics-Heliumvorrichtung unter Verwendung eines Berstdrucks von 1100 psi beschossen. Die Platten wurden mit einem 80 Mesh-Sieb, das zwischen der Trägerstufe und dem Ziel angebracht war, beschossen. Die Zielzellen wurden 24 h bei 26ºC im Dunkeln nach dem Beschuß gehalten, bevor die Stäbe mit den Embryos auf die Platten, die das Murashige- Skoog-Medium mit 3 mg/l 2,4-D und 3% Saccharose enthielten, gelegt werden. Die einzelnen Embryos wurden aus den Stäben entfernt und direkt auf frisches Medium der gleichen Zusammensetzung nach weiteren 48 h gebracht.
Etwa 6 Wochen nach der Genabgabe wurde das ansprechende Gewebe auf Murashige-Skoog-Medium mit 3 mg/l 2,4-D und 3% Saccharose mit 0,2 mg/l Methotrexat für eine dreiwöchige Periode gebracht. Das Gewebe wurde auf ein Regenerationsmedium aus Murashige-Skoog-Medium mit 1 mg/l Zeatinribosid und 1 mg/l Methotrexat gebracht. Nach zwei Wochen wurden regenerierende Pflänzchen in sterile Behälter mit der Bezeichnung "GA7s" mit Murashige-Skoog-Salzen halber Stärke, 2% Saccharose, 1 mg/l NAA und entweder 4 oder 8 mg/l Methotrexat gebracht.
Die DNA wurde aus dem Blattgewebe von vier Pflanzen, die von zwei verschiedenen Zielplatten abgeleitet sind, extrahiert, und die PCR wurde auf die Anwesenheit des dhfr- Gens durchgeführt. Alle vier waren bezüglich der Anwesenheit von dhfr positiv. Zwei der Pflanzen wurden in das Treibhaus zur Vermehrung geschickt.

XV: Entwicklung von verbesserten embryogenen Kulturen von Weizen unter Verwendung von zuvor regeneriertem Material als Kulturquelle

Um regenerierte Pflanzen als Ausgangsmaterial für derartige verbesserte Kulturen zu verwenden, wurden die Pflanzen aus dem maltoseinduzierten zerreibbaren Callus, der vorstehend beschrieben wurde, auf einem Murashige-Skoog-Medium mit 3 mg/l BAP und 3% Saccharose regeneriert. Dieser maltoseinduzierte zerreibare Callus war eine Typ II-Zellkultur, die mit UC703-0612 markiert war, das aus einem Cryopräservat aufgetaut worden war und auf Erhaltungsmedium (Murashige- Skoog-Medium + 1 mg/l 2,4-D + 3% Saccharose) vor der Regeneration gebracht wurde. Für die Embryokultur wurden Weizenähren aus den regenerierten Pflanzen gewonnen, mit 10% Cloroxlösung 10 min sterilisiert und mehrmals mit sterilem Wasser gespült. Unreife Embryos mit einer Größe von 1 bis 2 mm wurden aus den Caryopsen unter einem Dissektionsmikroskop entfernt und auf einem Murashige-Skoog-Medium mit entweder 5 oder 10 mg/l 2,4-D und 13,7 g/l Maltose oder auf einem Murashige-Skoog-Medium mit 2 mg/l 2,4-D und 3% Saccharose gezüchtet. Dieser neu induzierte zerreibbare Callus, der nun zurückgeführt wurde, wurde auf ein Murashige- Skoog-Medium mit 1 mg/l 2,4-D und 3% Saccharose zur Aufrechterhaltung oder für Beschußexperimente überführt. Die vorstehende Pflanzenregeneration und das Callusinduzierungsverfahren wurden dann wiederholt, um weitere Generationen von zerreibbarem Callus zu produzieren.
Als Kontrolle wurden Embryos von Wildtyppflanzen gewonnen und auf dem gleichen Maltosemedium gezüchtet. Die Induktionsfrequenz eines zerreibaren und embryogenen Callus aus den Embryos wurde aufgezeichnet und ist nachstehend gezeigt.
Um von regenerierten Pflanzen abgeleiteten Samen als Ausgangsmaterial zu verwenden, wurde eine Typ II-Zellkultur (UC703-0612), die von einem auf einem maltosehaltigen Medium gezüchteten Embryo produziert worden war, aus einem Cryopräservat aufgetaut und auf ein Erhaltungsmedium (Murashige- Skoog-Medium + 1 mg/l 2,4-D + 3% Saccharose) gegeben. Der Callus wurde dann auf ein Medium, das Murashige-Skoog- Grundsalze und 3 mg/l 6-BAP enthielt, zur Pflanzenregeneration gegeben. Die Samen wurden aus den regenerierten Pflanzen geerntet und dann im Boden gekeimt. Für die Embryokultur wurden Weizenähren aus den vom Samen abgeleiteten Pflanzen gewonnen, mit 10% Cloroxlösung 10 min sterilisiert und mehrmals mit sterilem Wasser gespült. Unreife Embryos mit einer Größe von 1 bis 2 mm wurden aus den Caryopsen unter einem Dissektionsmikroskop entfernt und auf einem Murashige- Skoog-Medium mit 2 oder 10 mg/l 2,4-D und 13,7 g/m Maltose oder einem MS-Medium mit 2 mg/l 2,4-D und 3% Saccharose gezüchtet. Der induzierte zerreibbare Callus wurde auf ein MS-Medium mit 1 mg/l 2,4-D und 3% Saccharose zur Aufrechterhaltung oder für Beschußexperimente überführt.
Als Kontrolle wurden Embryos aus Wildtyppflanzen gewonnen und auf dem gleichen Maltosemedium gezüchtet. Die Induk tionsfrequenzen des zerreibbaren und embryogenen Callus von den Embryos wurden aufgezeichnet und sind nachstehend gezeigt.

XVI: Transformation von Weizen unter Verwendung einer zurückcreführten embryogenen Kultur

Eine zurückgeführte embryogene Calluslinie mit der Bezeichnung 0612RC wurde, wie in dem vorstehenden Beispiel beschrieben, entwickelt. Der Callus wurde zum Beschuß durch Rühren und Plasmolyse für 2 bis 3 h in flüssigem Murashige- Skoog-Medium, das 1 mg/l 2,4-D, 3% Saccharose und 0,6 M Sorbit in einem Verhältnis von 1 Teil Zellen bis 16 Teilen Medium enthielt, präpariert. Jedes Ziel wurde unter Verwendung einer Vakuumfiltervorrichtung zur Befestigung von 3 ml des Zellgemisches auf Glasfaserfiltern hergestellt, die dann auf festes Murashige-Skoog-Medium mit 1 mg/l 2,4-D, 3% Saccharose und 0,4 M Sorbit gebracht wurden.
DNA aus dem Plasmid pTG48 (ant43/Gus/3Sdhfr) wurde auf Goldteilchen mit Mikrometergröße unter Verwendung von 0,1 M CaCl&sub2; und 0,1 M NaH&sub2;PO&sub4; präzipitiert.
Jedes Ziel wurde zweimal mit der in der WO 93/07256 beschriebenen Mikroprojektilvorrichtung unter Verwendung eines Gasdrucks von 1900 psi beschossen. Nach Genabgabe wurden die Filter und die Zellen von dem Sorbitmedium entfernt und auf Murashige-Skoog-Medium mit 1 mg/l 2,4-D und 3% Saccharose etwa 24 h später aufgebracht und 17 Tage wachsen gelassen, bevor sie auf das gleiche Medium, aber mit Einschluß von 1 mg/l Methotrexat, ausgebracht wurden. Die Selektionshöhe wurde 17 Tage später auf 2 mg/l Methotrexat erhöht.
Etwa 7 Wochen später wurden die Kolonien von den ursprünglichen Selektionsplatten entfernt und in frisches Medium, das 1 mg/l Methotrexat enthielt, überführt. Die Kolonien wurden als positiv auf die Anwesenheit des dhfr-Gens mittels PCR identifiziert. Das Gewebe wurde angehäuft und auf einem reduzierten 2,4-D-Spiegel (0,5 mg/l) gehalten, um die somatische Embryoreifung zu fördern. Die Pflänzchen wurden unter Verwendung von Murashige-Skoog-Medium mit 5 mg/l GA und 1 mg/l NAA regeneriert. Etwas Gewebe wurde durch Ausbringen auf Osmorafts in flüssigem Murashige-Skoog-Medium mit 3% Saccharose und 10 mg/l Zeatin regeneriert. Die Pflänzchen wurden in sterile Behälter mit der Bezeichnung "GA7s", die Murashige-Skoog-Salze halber Stärke, 2% Saccharose und 0,5 mg/l NAA enthielten, etwa 20 Wochen nach dem Beschuß überführt. Die Pflanzen wurden zur Vermehrung in das Treibhaus überführt. Fünf Pflanzen wurden mittels Southern analysiert, und die Anwesenheit des dhfr-Gens wurde bestätigt.
Alle in dieser Beschreibung erwähnten Publikationen und Patentanmeldungen zeigen das Können des Fachmann auf dem Gebiet, auf das sich die Erfindung bezieht an. Alle Publikationen und Patentanmeldungen sind hiermit unter Bezugnahme in dem gleichen Ausmaß eingeschlossen, als wenn jede einzelne Publikation oder Patentanmeldung ausführlich und einzeln als unter Bezugnahme eingeschlossen bezeichnet wäre.
Obwohl die vorstehende Erfindung in einem gewissen Ausmaß durch Erläuterung und Beispiele für die Zwecke der Klarheit des Verstehens beschrieben wurde, ist es offensichtlich, daß bestimmt Veränderungen und Modifikationen innerhalb des Umfangs der beigefügten Patentansprüche vorgenommen werden können.
Alle in dieser Beschreibung erwähnten Publikationen und Patentanmeldungen zeigen das Können des Fachmann auf dem Gebiet, auf das sich die Erfindung bezieht an. Alle Publikationen und Patentanmeldungen sind hiermit unter Bezugnahme in dem gleichen Ausmaß eingeschlossen, als wenn jede einzelne Publikation oder Patentanmeldung ausführlich und einzeln als unter Bezugnahme eingeschlossen bezeichnet wäre.
Obwohl die vorstehende Erfindung in einem gewissen Ausmaß durch Erläuterung und Beispiele für die Zwecke der Klarheit des Verstehens beschrieben wurde, ist es offensichtlich, daß bestimmt Veränderungen und Modifikationen innerhalb des Umfangs der beigefügten Patentansprüche vorgenommen werden können.

Claims

1. Verfahren zur Produktion von stabil transformierten fertilen Weizenpflanzen, umfassend:

(a) Erhalt eines unreifen Embryos aus einer Weizenpflanze;

(b) Plattierung des unreifen Embryos auf Wachstumsmedium;

(c) Beschuß des unreifen Embryos mit einer DNA-Sequenz von Interesse 0 bis 10 Tage nach der Plattierung;

(d) Erhalt des Embryos oder des sich entwickelnden Callus; und

(e) Regeneration fertiler transformierter Pflanzen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Beschuß die Unterwerfung des unreifen Embryos multiplen Schüssen von mit DNA beschichteten Teilchen umfaßt.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, wobei das Verfahren weiterhin eine Plasmolysebehandlung vor dem Beschuß umfaßt.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, wobei das Verfahren weiterhin eine Plasmolysebehandlung nach dem Beschuß umfaßt.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, wobei das Verfahren weiterhin eine Plasmolysebehandlung sowohl vor als auch nach dem Beschuß umfaßt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die DNA-Sequenz von Interesse ein Resistenzgen umfaßt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die DNA-Sequenz von Interesse ein Gen, das Nährwert, männliche und/oder weibliche Sterilität verleiht, oder ein antimykotisches, antibakterielles oder antivirales Gen umfaßt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die DNA-Sequenz von Interesse ein Gen, das Antisense-RNA codiert, umfaßt.

9. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die DNA-Sequenz von Interesse ein Krankheits- oder Insektenresistenzgen umfaßt.

10. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Resistenzgen das Neomycinphosphotransferase II-(npt-II)-Gen oder das Hygromycin B-Resistenzgen ist.

11. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die DNA-Sequenz von Interesse eine für Dihydrofolatreduktase-(dhfr) codierende Sequenz umfaßt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei der Embryo oder Callus von Stufe (d) auf einem Selektionsmedium gezüchtet wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Selektionsmedium Kanamycin, G418, Bleomycin, Methotrexat, Phosphinothricin oder Hygromicin umfaßt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Selektionsmedium Methotrexat umfaßt.

15. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das dhfr-Gen ein bakterielles Gen ist.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die fertile transformierte Pflanze, die in Stufe (e) erhalten wurde, das Gen von Interesse spezifisch in Antheren exprimiert.