DE10015458A1 - Verfahren zur raschen Herstellung von transgenen, markergen-freien Pflanzen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von transgenen, fertilen Pflanzen, insbesondere die Herstellung von transgenen Weizen und Roggen, durch Einführung von Fremd-DNA, ohne daß selektier- oder screenbare Marker-Gene oder Selektionsagenzien eingesetzt werden müssen unter Erreichung stabiler Vererbung der Transgenexpression in sexuellen Nachkommenschaften. DOLLAR A Kernpunkt des Verfahrens ist die Einführung von Fremd-DNA ohne Markergene in Pflanzengewebe, Kultur der Pflanzengewebe ohne Zusatz von Selektionsagenzien, Regeneration von Pflanzen aus vorgenannten Pflanzengewebe ohne Zusatz von Selektionsagenzien, DNA-Analyse der gebildeten Regeneratpflanzen und Selektion der transgenen Pflanzen. DOLLAR A Das Verfahren erfordert lediglich zwei bis drei Monate vom Zeitpunkt der Explantatgewinnung bis zur Übertragung der transgenen markergen-freien Pflanzen in Erde.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von transgenen, fertilen Pflanzen, insbesondere die Herstellung von transgenem Weizen und Roggen, ohne dass selektier- oder screenbare Marker-Gene oder Selektionsagenzien eingesetzt werden müssen, durch Einführung von Fremd-DNA unter Erreichung stabiler Vererbung der Transgenexpression in sexuellen Nachkommenschaften. Das Verfahren erfordert lediglich zwei bis drei Monate vom Zeitpunkt der Explantatgewinnung bis zur Übertragung der transgenen markergen-freien Pflanzen in Erde.

In den letzten 15 Jahren ist es möglich geworden, Gene durch rekombinante Gentechnik von einer großen Anzahl von Organismen auf Nutzpflanzen zu übertragen. Dieser Fortschritt hat enorme Möglichkeiten eröffnet, die Resistenz der Pflanzen gegen Schädlinge, Krankheiten und Herbizide zu verbessern, und sowohl Biosyntheseprozesse zu modifizieren, um die Qualität von Pflanzenprodukten zu verändern, als auch neue Wertstoffe in Nutzpflanzen zu erzeugen (Knutson et al. PNAS USA 89, 2624-2628 (1992); Piorier et al., Science 256, 520- 523 (1992); Vasil et al,. Bio/Technologie 10, 667-674 (1992)).

Drei alternative Transformationsmethoden werden gegenwärtig für Monokotyledonenspezies benutzt: direkter DNA-Transfer in isolierte Protoplasten (Shimamoto et al., Nature 338, 274-276 (1989)), partikelbeschuß-vermittelte DNA-Übertragung (Fromm et al. Bio/Technology 8, 833-839 (1990)), und Agrobacterium-vermittelte Transformation (Cheng et al. Plant Physiol. 115, 971-980 (1997)).

Die Protoplastenmethoden sind weithin für Reis benutzt worden, wobei DNA durch Liposomen, PEG und Elektroporation in Protoplasten übertragen wird. Eine große Anzahl transgener Pflanzen wurden in verschiedenen Laboratorien aufgezogen (Shimamoto et al. (1989); Datta et al. Bio/Technology 8, 736-740 (1990)), jedoch erfordert die Protoplastenmethode die Langzeitetablierung von embryogenen Suspensionskulturen. Einige Regenerate von Protoplastenkulturen sind unfruchtbar und phänotypisch abnormal infolge der langzeitigen Suspensionskultur (Davey et al. J Exp. Bot. 42, 1129-1169 (1991); Rhodes et al. Science 240, 204-207 (1988)).

Die partikelbeschuß- oder Agrobacterium-vermittelten Übertragungsmethoden können unreife Embryonen, von unreifen Embryonen abgeleitete Kalli oder regenerierbare meristematische Gewebe als Ziele verwenden. Nach Partikelbeschuß sind transgene Pflanzen von Reis, Gerste, Weizen und Roggen beschrieben worden (Christou et al. Bio/Technology 9, 957-962 (1991); Gordon-Kamm et al. Plant Cell 2, 603-6128 (1990); Somers et al. Bio/Technology 10, 1589-1594 (1992), Wan et al. Plant Physiol. 104, 37-48 (1994, Vasil et al. (1992), Castillo et al. Bio/Technology 12, 1366-1371 (1994) und nach Agrobacterium- vermittelten Gentransfer sind transgene Pflanzen von Reis, Gerste und Weizen beschrieben worden (Hiei et al. Plant J. 6, 271-282 (1994); Ishida et al. Nature Biotechnol. 14, 745-750 (1996); Tingay et al. Plant J. 11, 1369-1376 (1997); Cheng et al. Plant Physiol. 115, 971-980 (1997)).

Die partikelbeschuß- oder Agrobacterium-vermittelten Methoden erfordern gewöhnlich 2 bis 15 Monate, um transgene Weizenpflanzen zu erzeugen (Gorden-Kamm et al. (1990); Vasil et al. (1992); Weeks et al. Plant Physiol. 102, 1077-1084 (1993); Vasil et alö. (1992), Vasil et al. Bio/Technology 11, 1153-1158 (1993), Becker et al. Plant J. 5, 299-307 (1994), Altpeter et al. Plant Cell Rep. 16, 12-17 (1996); Cheng et al. Plant Physiol. 115, 971-980 (1997)).

Bisher gibt es nur einen Bericht, der die Erzeugung transgener Roggenpflanzen beschreibt. Dem biolistischen Gentransfer folgten Kallusselektion mittels eines entsprechenden selektiven Agenzes und die Regeneration von zwei transgenen Pflanzen (Castillo et al. Bio/Technology 12, 1366-1371 (1994)). Die Methode ist zeitaufwendig und erfordert 8 bis 9 Monate von der Gewinnung der Explantate bis zum Erhalt transgener Pflanzen. Außerdem leidet diese Methode an einem Verlust an Regenerierbarkeit des transgenen Kallus. Nur 33% der transgenen Kalli konnten noch regeneriert werden, nachdem die Selektion auf Expression des selektierbaren Markergens bar erfolgt war, das für die Phosphinotricin-Acetyl- Transferase kodiert. Darüber hinaus besagt die Tatsache, dass nur zwei unabhängige transgene Pflanzen, hervorgegangen aus einem einzigen Experiment erzeugt wurden, dass es sich um einen ersten Bericht über transgene Roggenpflanzen handeln muß und nicht um ein reproduzierbares Verfahren. Tatsächlich sind auch seit 1994 keine weiteren Berichte über transgene Roggenpflanzen veröffentlicht worden. Dieser Reproduzierbarkeitsgrad ist sicher zu gering für genetische Studien und für wirtschaftliche Anwendungen. Die Effizienz des beschriebenen Verfahrens war außerdem sehr gering, da 1383 Explantate benötigt wurde, um 2 transgene Roggenpflanzen zu erzeugen.

Bekanntermaßen werden selektierbare Markergene benutzt, um transgene Ereignisse während des in vitro-Prozesses der Pflanzentransformation zu identifizieren, aber sie stehen in keiner Beziehung zur Verbesserung der Nutzpflanze und sind deshalb nicht erforderlich, nachdem die transgene Pflanze einmal hergestellt worden ist. Selektierbare Markergene der Gruppe I kodieren z. B. Herbizid- oder Antibiotika-Resistenz und erlauben deshalb die Ausübung eines Selektiondrucks mittels eines entsprechenden cytotoxischen selektiven Agenzes, um Zellteilungen und Pflanzenregeneration in nichttransformiertem Gewebe zu unterdrücken (Velten und Schell Nucleic Acid Res. 13, 6981-6987 (1985)). Die Zugabe von Herbizid- oder Antibiotika-Komponenten als selektive Agentien zu Pflanzenzellen hat häufig einen negativen Effekt nicht nur auf die nichttransformierten Zellen sondern auch auf transgene Zellen und kann daher mit dem Regenerationsprozeß interferieren und speziell die Effizienz und Reproduzierbarkeit der Produktion transgener Pflanzen insbesondere bei "widerspenstigen" Arten wie Roggen und Weizen herabsetzen. Eine zweite Gruppe selektierbarer Marker unterstützt infolge ihres Einflusses auf den pflanzlichen Stoffwechsel Wachstum und Regeneration transformierter Zellen unter speziellen Kulturbedingungen, z. B. Phosphomannoseisomerase oder IPT (Joersbo et al. Physiol. Plant. 105, 109-111 (1999); Ebinuma et al. 94, 2117-2121 (1997)).

Wenn selektierbare Marker in transgenen Pflanzen bleiben, müssen ihre Genprodukte hinsichtlich ihres Effektes auf biologische Sicherheit und Umwelt analysiert werden. Derartige Sicherheitsuntersuchungen können die Kommerzialisierung transgener Pflanzen verzögern oder sogar blockieren. Die Reaktion der Öffentlichkeit auf das Problem der selektierbaren Marker bakterieller Herkunft kann einen negativen Effekt auf das kommerzielle Potential transgener Kulturpflanzen haben, auch wenn die Sicherheit der selektierbaren Marker wissenschaftlich nachgewiesen worden ist (Malik und Saroha J. Plant Biochem. Biotechnol. 8, 1-13 (1999)). Wenn multiple Transgene in denselben genetischen Hintergrund eingefügt werden müssen, sind mehrere verschiedene selektierbare Markergene erforderlich.

Um Risiko und Probleme, die mit selektierbaren Markern verbunden sind, zu verringern, sind Transformationssysteme entwickelt worden, welche die Eliminierung der Markergene nach der Transformation erlauben. In Cotransformationssystemen werden Markergene und Nutztransgene als unverknüpfte Fragmente in das Pflanzengenom eingefügt, und wenn sie in ungekoppelte Genloci gelangen, dann können sie in spaltenden sexuellen Nachkommenschaften getrennt werden. Die Gesamteffizienz für die Erzeugung der gewünschten markergen-freien aber nutztransgen-tragenden Ereignisse ist dabei gegenüber einer Erzeugung von nutztransgen-tragenden Ereignissen mit Beibehaltung der Markergene reduziert. Diese herabgesetzte Effizienz ist die Folge niedriger Kotransformationsraten und häufiger Integration unterschiedlicher Plasmide an gekoppelten Genloci ohne deren Segregation in der nachfolgenden Generation (McKnight et al. Plant Mol. Biol. 8, 439-445 (1987), Deblock und Debrouwer Theor. Appl. Genet. 82, 257-263 (1991), Komari et al. Plant J. 10, 165-174 (1996)). Gerichtetes Herausschneiden der selektierbaren Markergene mittels ortsspezifischer Rekombination (Russel et al. Mol. Gen. Genet. 234, 49-59 (1992)) oder Transpostions-vermittelter Repositionierung (Goldsbrough et al. Bio/Technology 11, 1286-1292 (1993)) gefolgt von Spaltung in Markergene und Nutztransgene in der sexuellen Nachkommenschaft sind erfolgreich zur Produktion Markergen-freier transgener Pflanzen eingesetzt worden. Jedoch ist die Konstruktion entsprechender relevanter Transformationsvektoren recht kompliziert und die Aktivierung der enzymgestützten Excision erfordert entweder recht zeitaufwendige sexuelle Kreuzungen gefolgt von Spaltungsanalysen (Goldsbrough et al. Bio/Technology 11, 1286-1292 (1993)) oder die transiente Expression der Excision-vermittelnden Enzyme. Die transiente Expression Excision-vermittelnder Enzyme geht häufig mit der Erzeugung unerwünschter stabiler Expression derartiger Enzyme einher (Gleave et al. Plant Mol. Biol. 40, 223-235 (1999), was die Effizienz der Erzeugung der gewünschten genetischen Ereignisse frei von Markergenen und frei von Excision- vermittelnden Enzymen weiter reduziert. In diesen Systemen hängt die Reproduzierbarkeit deshalb stark von der reproduzierbaren und präzisen Expression Excision-vermitttelnder Enzyme ab. Die Gesamteffizienz der Erzeugung der erwünschten genetischen Ereignisse ist im Vergleich zu transgenen Pflanzen mit Markergenen reduziert.

Daher lag der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein effizientes, rasches und einfaches Verfahren zur Herstellung transgener markergen-freier Pflanzen zu entwickeln. Insbesondere für bezüglich der Gewebekultur "widerspenstige" Pflanzenarten wie Monocotyledonen, Körnerleguminosen, Gehölzpflanzen, bevorzugt für Roggen und Weizen, kann ein Verfahren, welches den Einsatz von Selektionsagenzien vollständig vermeidet, eine erhöhte Wüchsigkeit und Regenerationsfähigkeit der transgenen Gewebekulturen erlauben. Ein wichtiger Aspekt der Erfindung ist, daß bei dem richtigen Timing von Gentransfer, Gewebekultur und Regenerationsbeginn ein hoher Anteil an transgenen Pflanzen neben nicht transgenen Pflanzen aus Gewebekulturen nach dem Gentransfer regeneriert werden kann und sich diese transgenen Pflanzen bereits während der in-vitro-Phase mittels DNA-Analyse von den nicht transgenen Regeneratpflanzen trennen lassen. Mit dem Verfahren sollen sonstige agronomische Merkmale wie insbesondere die Fortpflanzungsfähigkeit der regenerierten transgenen Pflanzen erhalten bleiben. Das Verfahren soll eine reproduzierbar hohe Transformationseffizienz aufweisen und auf ein weites Genotypenspektrum anwendbar sein.

Die Aufgabe wird gemäß den Ansprüchen realisiert. Erfindungsgemäß wird Fremd-DNA in regenerierbare Pflanzengewebe eingeführt, dabei kann jede Art von Fremd-DNA in Pflanzenarten eingeführt werden. Allgemein wird als Fremd-DNA jede Art von DNA bezeichnet, die von außen in Pflanzenzellen eingeführt wird. Methoden, um diese DNA in Pflanzenzellen einzuführen, sind dem Fachmann bekannt, wie z. B. ein Partikelbeschuß unter Verwendung einer Vorrichtung, die im US-Patent No. 5,179,022 beschrieben ist.

Die in Fremd-DNA eingeschlossene DNA-Art umfaßt DNA, die bereits in der Pflanzenzelle vorhanden ist, DNA von einer anderen Pflanze, DNA von einem anderen Organismus, oder extern erzeugte DNA, wie DNA-Sequenzen, die eine antisense-Botschaft von einem Pflanzengen enthalten, oder DNA-Sequenzen, die eine synthetische Version eines Gens enthalten, worin die Nukleotidsequenz modifiziert worden ist.

Der erste Schritt in der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass man regenerierbares Gewebe von einer Pflanze isoliert. Jedes regenerierbare Pflanzengewebe kann gemäß vorliegender Erfindung benutzt werden. Als regenerierbares Pflanzengewebe wird gewöhnlich ein Gewebe bezeichnet, das nach Einführung von Fremd-DNA zu einer differenzierten Pflanze regeneriert werden kann. Bevorzugt handelt es sich bei derartigem Gewebe um Kalli und/oder Embryoide von Antheren (Zhou and Konzak, Crop Sci. 29, 817-821 (1989)), Mikrosporen (Ziauddin et al., Plant Cell Rep. 11, 489-493 (1992)), Infloreszenzen (Barcelo et al., Plant J. 5, 583-592 (1994)), unreife oder reife zygotische Embryonen (Altpeter et al. Plant Cell Rep. 16, 12-17 (1996)), Samen (Zhong et al., Plant Cell Rep. 13, 1-6 (1993)) und Blattgewebe (Conger et al., Plant Cell Rep. 6, 345-347 (1987)) einschließen oder meristematische Gewebe, die durch Organogenese regenerieren (Zhang et al., Plant Cell Rep. 18, 959-966 (1999)).

In einer bevorzugten Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung wird ein unreifer Pflanzenembryo als Ausgangsmaterial benutzt. Unreife Embryonen können unter Verwendung bekannter Methoden nach dem Stand der Technik erzeugt werden. Zum Beispiel wurde die Erzeugung unreifer Weizenembryonen von Vasil et al. (1993) beschrieben und die Erzeugung unreifer Roggenembryonen von Castillo et al. (1994).

In einer alternativen Ausführungsvariante werden Kalli als regenerierbare Zielgewebe für den Gentransfer eingesetzt. Die bevorzugten Kalli sind embryogene Kalli, welche von unreifen Embryonen erzeugt werden. Derartige Kalli können durch Isolierung und Kultivierung unreifer Embryonen auf einem Nährmedium mit Kohlenhydraten und pflanzlichen Wachstumsregulatoren erzeugt werden. Kallus-erzeugende Medien sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt und jedes Kulturmedium oder jede Präparationsmethode kann verwendet werden.

Ist das regenerierbare Pflanzengewebe isoliert, besteht der zweite Schritt des Verfahrens in der Einführung von Fremd-DNA in das Pflanzengewebe. Dieser Prozess wird hier weiter als Transformation bezeichnet. Jede Methode kann zur Einführung von Fremd-DNA in regenerierbares Pflanzengewebe benutzt werden. Solche Methoden schließen Partikelbeschuß (Weeks et al,. (2993)); Vasil et al., (1992)), Agrobacterium-Transformation (Chan et al., Plant Mol. Biol. 22, 491-506 (1993)), Elektroporation von regenerierbarem Gewebe (Shillito et al., Bio/Technology 3, 1099-1103 (1985)), Siliziumcarbidfaser-vermittelte Genübertragung (Dalton et al., Plant Sci. 132, 31-43 (1999)) und Protoplasten-vermittelte Genübertragung (Shimamoto et al., (1989), Datta et al. (1990)) ein.

Gemäß der Erfindung wird das regenerierbare Gewebe bevorzugt unter Verwendung der Partikelbeschuß-Methode transformiert. Es wird bevorzugt Kallusgewebe, insbesondere embryogener Kallus, benutzt. Nach dem Partikelbeschuß kann dieser Kallus für kurze Zeit wachsen, ehe die Pflanzenregeneration initiiert wird, oder der Kallus kann unmittelbar an den Gentransfer anschließend unter Regenerationsbedingungen weiterkultiviert werden.

In einer bevorzugten Ausführungsvariante der Erfindung wird das regenerierbare Gewebe für eine kurze Periode nach der Einführung der Fremd-DNA, z. B. dem Partikelbeschuß, kultiviert. Das für diese Wachstumsperiode verwendete Nährmedium enthält keinerlei Selektionsmittel und dieses Nährmedium führt zu undifferenziertem Zellwachstum und unterdrückt die Pflanzenregeneration. Diese Kulturperiode wird kurz gehalten, wenn überhaupt eine verwendet wird und beträgt bis zu sechs Wochen, vorzugsweise dauert sie nicht länger als etwa vier Wochen und am besten nicht länger als 7 bis 17 Tage. Eine längere Periode undifferenzierten Wachstums ist gemäß vorliegender Erfindung nicht erforderlich.

Nach der Transformation und einer kurzen Phase mit undifferenziertem Gewebewachstum wird das regenerierbare Pflanzengewebe in ein Sprossinduktionsmedium übertragen, das die Regeneration von Pflanzen aus dem Gewebe induziert, wobei das zur Regeneration benutzte Sprossinduktionsmedium keinerlei Selektionsmittel enthält. Dies steht im Gegensatz zum bisherigen Stand der Technik, wonach regenerierbare Pflanzengewebe zunächst eine ausgedehnte Selektionsperiode durchlaufen müssen, ehe die regenerierbaren Gewebe in das Sprossinduktionsmedium übertragen werden (Vasil et al., 1993; Castillo et al., 1994), oder wonach regenerierbare Pflanzengewebe einer Selektionsperiode während der Exposition in einem Sprossinduktionsmedium ausgesetzt werden (EP 0709462).

Das für diesen Schritt benutzte Sprossinduktionsmedium kann jedes Medium sein, das die Bildung von Sprossen aus regenerierbarem Gewebe ermöglicht. Ein bevorzugtes Sprossinduktionsmedium ist frei von pflanzlichen Wachstumsregulatoren für die Spross- und Wurzelbildung aus regenerierbarem Gewebe (beispielsweise ein Medium nach Weeks et al., 1993).

Das regenerierbare Pflanzengewebe wird erfindungsgemäß so rasch wie möglich nach der Transformation in dieses Medium übertragen. Vorzugsweise geschieht dies zwischen einem Tag und 6 Wochen, vorzugsweise nicht später als 4 Wochen, am besten nicht später als 7 bis 17 Tage nach Einführung der Fremd-DNA.

Nachdem sich wenigstens ein Spross gebildet hat, wird ein kleiner Teil des Sprosses zur DNA-Extraktion abgenommen. Jede Methode zur DNA-Analyse, welche die Bestimmung kleiner DNA-Mengen erlaubt, ist mit dem vorliegenden Verfahren kompatibel. Erfindungsgemäß wurde vorzugsweise die Polymerasekettenreaktion benutzt, um transgene Pflanzen zu identifizieren. Die Identifizierung transgener Pflanzen kann vor oder nach der Übertragung der Pflanzen in Erdkultur erfolgen. Bevorzugt erfolgt die DNA-Analyse während der in vitro-Kultur der transgenen Pflanzen, was die arbeitsaufwendige Übertragung zahlreicher nicht-transgener Pflanzen in Erde vermeidet.

Die Pflanzen können dann in Erdkultur übertragen und nach dem Stand der Technik bis zur Samenbildung weiter kultiviert werden.

Das vorliegende erfindungsgemäße Verfahren ist durch zahlreiche Vorteile gekennzeichnet.

• 1. Das Verfahren ist nicht auf bestimmte Pflanzenarten beschränkt. Es hängt lediglich von der Verwendung regenerierbarer Pflanzengewebe und damit von Gewebekultur­ bedingungen, Verfahren und Gentransfermethoden ab, welche die Regenerationsfähigkeit transformierter Gewebe unterstützen und zugleich die Effizienz des Verfahrens fördern.
• 2. Mit der beschriebenen markerfreien Transformationsmethode wird eine höhere Transformationsfrequenz erreicht als in früher publizierten Fällen (Castillo et al., 1994). Diese Aussage über die Transformationsfrequenz gilt für jene Frequenz, die bei markerfreiem Verfahren beobachtet wurde, wobei komplizierte, die Effizienz verringernde Markereliminierungsexperimente unnötig sind. Infolge der raschen Erzeugung transgener Pflanzen, die von selektier- und screenbaren Markergenen frei sind, können Risikoermittlung und Kommerzialisierung der transgenen Pflanzen beschleunigt und vereinfacht werden. Die Anwendbarkeit dieser markerfreien Transformationsmethode auf z. B. Inzuchtlinien von Roggen erhöht die Reproduzierbarkeit bei dieser "widerspenstigen" und fremdbefruchtenden Pflanze. Pflanzen, die mit diesem Verfahren erzeugt werden, sind generell fertil.
• 3. Ein anderer erfindungsgemäßer Vorteil besteht darin, dass die bisherigen biolistischen Partikelbeschuß-Methoden 8 bis 9 Monate erfordern, um z. B. transgene Roggenpflanzen zu erhalten (Castilo et al., 1994). Die bombardierten generierbaren Gewebe wurden nach dem bisherigen Stand der Technik für 3 bis 4 Wochen auf Selektionsmedium subkultiviert, um eine Kallusvermehrung zu erlauben. Durch Verminderung der Zeit zur Kallusvermehrung erfordert die erfindungsgemäße rasche Methode nur 2 bis 3 Monate, um z. B. transgene Roggen- oder Weizenpflanzen zu erzeugen. Langzeitkultur vor und nach der Transformationsbehandlung und die Anwendung von Selektionsmitteln sind mit der erfindungsgemäßen Methode nicht erforderlich. Überraschend ist, dass auch nach Durchführung der markerfreie Transformationsmethode die transformierten Zellen ebenso schnell regenerieren wie nicht-transformierte Zellen und somit der Anteil an transgenen und nichttransgenen Pflanzen an den Gesamtregeneratpflanzen keine automatisierte molekulare Analyse erfordert, obwohl sich mit dieser die Effizienz des Verfahrens erhöhen lässt.
• 4. Die Regenerate waren sowohl in in vitro-Kultur als auch in Erdkultur kräftiger und gesünder als solche, die von Selektionsmedien stammen.

Die vorliegende Erfindung stellt somit ein schnelles, reproduzierbares und effizientes System zur Erzeugung von transgenen Pflanzen dar, die frei von selektier- oder screenbaren Markergenen sind. In einer bevorzugten Ausführungsvariante liefert die vorliegende Erfindung ein schnelles und effizientes Marker-freies Transformationssystem für monokotyledone Kulturpflanzen unter Verwendung von unreifen Embryonen als Ausgangsgewebe. Insbesondere ist das Verfahren für die Transformation und Regeneration von transgenen Roggen- und Weizenpflanzen einsetzbar. Die erfindungsgemäß regenerierten Pflanzen sind phänotypisch normal und voll fertil. Transgene Pflanzen, die frei von selektier- und screenbaren Markergenen sind, können bereits innerhalb von zwei bis drei Monaten nach der Präparation der Primärexplantate in Erdkultur überführt werden. Die Transgene werden stabil an die F1-Nachkommenschaft vererbt.

Mit dem Verfahren ist die Realisierung eines wesentlichen Ziels bei der Herstellung transgener Pflanzen gelungen, nämlich die öffentliche Akzeptanz von transgenen Kulturpflanzen durch Reduktion von nachteiligen Umwelteffekten, die die Verwendung selektierbarer Marker mit sich bringt, zu verbessern. Es kann mit dem einfachen und schnell durchführbaren Verfahren den regulatorischen Anforderungen der betreffenden Gewebe entsprochen werden, und es werden transgene Kulturpflanzen mit wertsteigernden Gensequenzen erzeugt, die frei von selektier- und screenbaren Markergenen sind.

Obwohl selektier- und screenbare Marker nicht erforderlich sind, können darüber hinaus (wenn notwendig) auch verschiedene selektierbare Markersysteme, einschließlich Herbizide wie Bialophos und ebenso Antibiotika, wie Paramomycin oder Hygromycin, oder andere screenbare Marker, wie GUS oder GFP, zusammen mit dem beschriebenen Verfahren benutzt werden.

Die erfindungsgemäß beschriebene rasche markerfreie Transformationsmethode produziert gewöhnlich auch einheitliche, nicht-chimärische Transformanten. Infolge der kurzen Gewebekulturzeit sind embryogene Kallussektoren auf dem Stadium der Regeneration klein. Daher wird nur ein Sproß von jedem Kallussektor regeneriert. Wie die PCR-Analyse auf stabile Transgenintegration zeigte, sind Blattsegmente von verschiedenen Teilen der transgenen Pflanzen einheitlich in der Transgenintegration. Nachkommenschaftsanalysen zeigten ebenfalls, dass die meisten der transgenen Pflanzen nach Selbstung im Verhältnis 3 : 1 zwischen transgenen und nicht-transgenen Pflanzen spalteten, wie für ein einzelnes dominantes Gen zu erwarten war.

Die vorliegende Erfindung kann für jede Pflanzenart benutzt werden. Sie ist insbesondere für Monokotyledonenarten brauchbar. Noch spezieller ist sie für Pflanzen brauchbar, die nicht für lange Zeit auf dem Kallusstadium gehalten werden können, ohne die Regenerationsfähigkeit zu verlieren. Zwei besonders brauchbare Spezies sind in der vorliegenden Erfindung Roggen und Weizen.

Es ist insbesondere hervorzuheben, dass zum ersten Mal die reproduzierbare Erzeugung von transgenem Roggen in ausreichender Anzahl für genetische Studien und kommerzielle Anwendungen möglich wurde. So konnte für Roggen und Weizen festgestellt werden, dass das Verfahren genotypunabhängig ist. Das heißt, dass diese Methode mit jeder Art von Roggen- und Weizensorte benutzt werden kann, einschließlich sowohl Winter- als auch Sommerweizen und -roggen. Sie kann verwendet werden, um transgene Pflanzen von Sommerroggen-Inzuchtlinien wie zum Beispiel BC2S3 oder Winterroggen-Inzuchtlinien wie DH9012/2, Sommerweizensorten wie z. B. Bobwhite und Winterweizenzuchtstämme wie Optimus zu erzeugen. D. h. das Verfahren ist sogar für homozygote Inzuchtlinien fremdbestäubender Arten wie Roggen und Elitegenotypen von Weizen anwendbar.

Mit den nachfolgenden Bespielen wird die Erfindung näher erläutert. Die Beispiele gelten in keiner Weise als Einschränkung der vorliegenden Erfindung.

Beispiele 1. Herstellung transgener Roggenpflanzen

Es wurden unreife Roggenembryonen 3 bis 7 Tage auf einem modifizierten MS (Murashige und Skoog, Physiol. Plant. 15: 473-497 (1962) nach Casillo et al (1994). Der partikelbeschuß der entstandenen Kalli mit einer konstitutiven Expressionskassette unter Kontrolle des Ubiquitin-Promotors und NOS-Terminators (Christensen und Quail, Transgenic Res. 4: 44-51 (1996) und zwei unterschiedlichen ungekoppelten Nutzgen cDNA's. Als Beispiele wurden cDNA's unterschiedlicher Fragmentlänge (Gamma-Tocopherolmethyltransferase aus Tabak und des Ferretingens aus Erbse) unter Kontrolle der genannten Sequenzen ins Roggengenom integriert. Die Kultivierung der Kalli nach dem Partikelbeschuß erfolgte für 7 bis 17 Tage in Kallusinduktionsmedium (Zusammensetzung wie bei Castillo et al. 1994) und danach für 6 Wochen in einem Sproßinduktionsmedium (Zusammensetzung wie bei Castillo et al. 1994). 4-6 Wochen nach Kulturbeginn aud dem Sprossinduktionsmedium hatten sich bewurzelte Sprosse gebildet. Von den Sprosspitzen wurden Proben entnommen, DNA extrahiert und mittels PCR eine DNA-Analyse durchgeführt. 20 der regenerierten Pflanzen von 1400 unterschiedlichen Kalli wiesen die transformierte Fremd-DNA auf. Diese Pflanzen wurden selektiert und in Erde gepflanzt. Gezeigt sind PCR-analysen unter Verwendung von Primerpaaren die in den die cDNA flankierenden Kontrollsequenzen (ubiquitin Promotor und nos Terminator) initiieren im Vergleich zur Plasmidkontrolle und Fragmentgrößenmarker (Abb. 1a) und PCR-Analysen unter Verwendung von Primerpaaren, die in dem ubiquitin Promotor und der jeweiligen cDNA initiieren im Vergleich zur Plasmidkontrolle und Fragmentgrößenmarker (Abb. 1b) sowie transgene markergen-freie Roggenpflanzen nach Überführung in Erdkulturen (Abb. 2).

Claims (14)

1. Verfahren zur Herstellung transgener markergen-freier Pflanzen, insbesondere solcher Kulturarten, die wie monokotyle Pflanzen, Körnerleguminosen oder Gehölzpflanzen als sehr "widerspenstig" in der Gewebekultur gelten, durch Einführung von Fremd- DNA gekennzeichnet durch

• a) Isolierung von regenerierbarem Gewebe von besagten Pflanzen und gegebenenfalls Kultivierung in einem an sich bekannten Gewebekulturmedium,
• b) Einführung der Fremd-DNA nach an sich bekannten Techniken, wobei die Fremd- DNA solche DNA-Sequenzen umfaßt, welche in den Pflanzen zur Verbesserung ihres Nutzens oder zur Erzeugung zusätzlicher Wertstoffe dient, ohne dass besagte DNA einen selektier- oder screenbaren Marker kodiert,
• c) gegebenenfalls nach kurzzeitiger Kultivierung für die Dauer von mehreren Stunden bis zu vier Wochen in dem unter a) genannten Gewebekulturmedium oder einem anderen Gewebekulturmedium, das keinerlei Selektionsmittel enthält und die Sprossinduktion durch Zugabe von Wachstumsregulatoren unterdrückt, Plazierung der Gewebe in einem an sich bekannten Sprossinduktionsmedium oder dem bevorzugten Sprossinduktionsmedium, das von besagtem Gewebe Sprosse und Wurzeln zu bilden gestattet, wobei das besagte Sprossinduktionsmedium keine Verbindungen zur Selektion regenerierbaren Gewebes enthält;
• d) nach Bildung von wenigstens einem Spross, Entnahme von Sprossgewebe zur DNA- Extraktion und DNA-Analyse mittels molekularer Methoden zum Nachweis von transgenen Pflanzen sowie
• e) Überführen der nach erfolgtem Gentransfer verifizierten transgenen Pflanzen in Erdkultur und
• f) weitere Kultivierung der transgenen Pflanzen zur Erreichung einer stabilen Vererbung der Transgenintegration und -expression in sexuellen Nachkommenschaften der transgenen Pflanzen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als regenerierbare Gewebe Kalli und/oder Embryoide von Antheren, Mikrosporen, Infloreszenzen, unreife oder reife Embryonen, Samen, Blattgewebe oder meristematische Gewebe die durch somatische Embryogenese oder Organogenese regenerieren, verwendet werden, bevorzugt embryogene Kalli, die aus unreifen Pflanzenembryonen in einem Nährmedium, das keinerlei Selektionsmittel enthält, erzeugt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass als regenerierbare Gewebe embryogene Kalli, induziert aus unreifen Embryonen von selbstbefruchteten homozygoten Spenderpflanzen in einem Gewebekulturmedium kurzzeitig kultiviert werden und die Einführung der Fremd-DNA in diese Kalli erfolgt und diese Gewebe über somatische Embryogenese oder Organogenese zu Pflanzen regeneriert werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als regenerierbare Gewebe Explantate wie unreife Embryonen oder unreife Infloreszensen verwendet werden, die Einführung der Fremd-DNA in diese Explantate erfolgt und diese Gewebe über somatische Embryogenese oder Organogenese zu Pflanzen regeneriert werden.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als regenerierbares Gewebe meristematisches Gewebe isoliert wird und die Einführung der Fremd-DNA in diese Gewebe oder daraus induzierte Kalli erfolgt und diese Gewebe über somatische Embryogenese oder Organogenese zu Pflanzen regeneriert werden.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das regenerierbare Gewebe aus einem weiten Spektrum von Genotypen und Kulturarten gewonnen wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass bei fremdbefruchtenden Kulturarten wie Roggen regenerierbares Gewebe aus homozygoten Inzuchtlinien verwendet wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass zur Gewebekultur ein Medium verwendet wird, das Nährsalze wie bei Murashige und Skoog 1962 beschrieben, Kohlenhydrate wie z. B. Saccharose und evtl. Wuchsstoffe wie Auxine oder Cytokinine enthält und vorzugsweise mit Phytagel oder Agarose verfestigt ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Plazierung der regenerierbaren Gewebe in dem Gewebekulturmedium mehrere Stunden bis zu vier Wochen erfolgt, vorzugsweise 3 bis 7 Tage vor Einführung der Fremd-DNA.

10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass als Fremd-DNA eingesetzt werden: DNA, die bereits in der Pflanzenzelle vorhanden ist, DNA von einer anderen Pflanze, DNA von einem anderen Organismus, oder extern erzeugte DNA, wie DNA-Sequenzen, die eine antisense-Botschaft von einem Pflanzengen enthalten, oder DNA-Sequenzen, die eine synthetische Version eines Gens enthalten, worin die Nukleotidsequenz modifiziert worden ist.

11. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Einführung der Fremd-DNA durch beliebige Gentransferverfahren wie z. B. Partikelbeschuß, Agrobacterium-Transformation, Elektroporation von regenerierbarem Gewebe, Siliziumcarbidfaser-vermittelte Genübertragung und Protoplasten-vermittelte Genübertragung erfolgt, bevorzugt durch Partikelbeschuß.

12. Verfähren nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Plazierung in dem Sprossinduktionsmedium nach mehreren Stunden bis zu vier Wochen nach Einführung der Fremd-DNA erfolgt, vorzugsweise 7 bis 17 Tage nach Einführung der Fremd-DNA.

13. Verfahren nach Anspruch 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass zur Sprossinduktion ein Medium verwendet wird, das Nährsalze wie bei Murashige und Skoog 1962 beschrieben, Kohlenhydrate wie Saccharose und bevorzugt keine Wuchsstoffe enthält und vorzugsweise mit Phytagel oder Agarose verfestigt ist.

14. Verfahren nach Anspruch 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass Selektions- und Screening-Marker-freie transgene monokotyledone Pflanzen, vorzugsweise Getreidepflanzen, hergestellt werden, insbesondere Weizen- und Roggen-Pflanzen.