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HINTERGRUND
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1. Technisches Gebiet
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Die
Erfindung betrifft Verfahren und Materialien, die in die Transformation
von Brassica durch Partikelbombardierung involviert sind.
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2. Hintergrundinformationen
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Brassica-Spezies
beinhalten eine große
Gruppe von landwirtschaftlich wichtigen Nutzpflanzen, die von dem
Menschen als Gemüse,
Speiseöle
und Gewürze
genutzt werden. Tatsächlich
macht die Brassica-Ölproduktion
mehr als 12 % der weltweiten Speiseöle aus. Um die Qualität von landwirtschaftlich
wichtigen Nutzpflanzen zu verbessern, haben die Züchter traditionell
auf konventionelle Züchtungsverfahren
vertraut. Durch die gegenwärtigen
Fortschritte in der molekularen Pflanzenbiologie und -genetik können die
Züchter
nun jedoch die Pflanzenqualität
durch das Einbringen von fremder DNA verbessern.
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Um
Pflanzen zu transformieren, sind verschiedene unterschiedliche Verfahren
verwendet worden. Ein gewöhnlich
verwendetes Verfahren beinhaltet das Bombardieren von Pflanzenzellen
mit Mikropartikeln, die mit der interessierenden DNA beschichtet
wurden. Tatsächlich
wurden Verfahren der Partikelbombardierung in weiten Kreisen verwendet,
um Getreide, Sojabohnen, Weizen und Reis zu transformieren. Versuche,
um Brassica-Spezies unter Verwendung der Partikelbombardierung zu
transformieren, waren jedoch nicht gleichermaßen erfolgreich. In der Tat erforderte
die einzige erfolgreiche Transformation von Brassica eine beträchtliche Manipulation
von Brassica-Embryos. Folglich vertrauen die Forscher gegenwärtig auf
alternative Ansätze,
wie beispielsweise Agrobacterium-vermittelte Verfahren, um Brassica
zu transformieren.
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ZUSAMMENFASSENDE
DARSTELLUNG
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Die
Erfindung beinhaltet die Transformation von Brassica-Spezies durch
Partikelbombardierung. Im Speziellen basiert die Erfindung auf dem
Auffinden einer schnellen und geeigneten Technik zur Gewebepräparation,
die zu Brassica-Zellen führt,
die in der Lage sind, kultiviert, durch Partikelbombardierung transformiert und
in Pflanzen regeneriert zu werden. Zusätzlich stellt die Erfindung
transformierte Zellen sowie regenerierte Pflanzen bereit, die zur
Reife heranwachsen und Samen bilden. Solche regenerierten Pflanzen
und deren Nachkommenschaft exprimieren stabil das transferierte
Nucleinsäuremolekül. Die Einfachheit
des hier beschriebenen erfundenen Verfahrens macht die Transformation
durch Partikelbombardierung in Brassica nicht nur möglich sondern
auch ökonomisch
durchführbar.
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Die
Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von transformierten
Brassica-Zellen bereit, das die Bombardierung von Zellen, die aus
nicht-embryonalem Brassica-Gewebe präpariert wurden, mit Mikroprojektilen,
die mit Nucleinsäure
beschichtet sind, und das Identifizieren von Zellen, die mit der
Nucleinsäure
transformiert sind, beinhaltet. Die Zellen, die mit der Nucleinsäure transformiert
sind, können
identifiziert werden, indem die bombardierten Zellen auf eine Flotationsvorrichtung
platziert werden, die Flotationsvorrichtung mit flüssigem Selektionsmedium
in Kontakt gebracht wird, und die Zellen selektiert werden, die überleben.
Dieses Verfahren kann ferner das Regenerieren von Brassica-Pflanzen
aus den transformierten Zellen involvieren. Die identifizierten
Zellen können
beispielsweise auf eine Flotationsvorrichtung platziert werden,
die mit flüssigem
Regenerationsmedium in Kontakt steht. Die aus dem nicht-embryonalen
Brassica-Gewebe präparierten Zellen
können
diploid sein. Ferner kann das nicht-embryonale Brassica-Gewebe aus einem
Sämling
stammen, z.B. einem 4–6
Tage alten sterilen Sämling.
Die Zellen können
aus nicht-embryonalem Brassica-Gewebe präpariert werden, indem das Gewebe
in Teile zerschnitten wird, und die Teile mit Induktionsmedium in
Kontakt gebracht werden. Die Zellen können z.B. aus nicht-embryonalem
Brassica-Gewebe durch ein Verfahren präpariert werden, das das Schneiden
eines Hypocotyls aus einem Sämling
in mehrere Scheiben, das Längs-in-Scheiben-Schneiden
und das In-Kontakt-Bringen
der epidermalen Seite der Längsscheiben
mit Induktionsmedium umfasst. Die Zellen können auch aus nicht-embryonalem
Brassica-Gewebe durch ein Verfahren präpariert werden, das das Mazerieren
des Gewebes zu einem Zellbrei umfasst. Die Zellen können beispielsweise
aus nicht-embryonalem Brassica-Gewebe durch ein Verfahren präpariert
werden, das das Entfernen des unteren Teils eines Hypocotyls von
einem Sämling,
das Kombinieren des verbleibenden oberen Teils, der die Triebspitze
enthält,
der Keimblätter
und 10–50
% des Hypocotyls mit Induktionsmedium, sowie das Mazerieren der
Kombination zu einem Zellbrei aufweist. Zusätzlich kann der Zellbrei mit
zellulärer
Substanz angereichert werden, die eine Größe von etwa 46 – 230 μm aufweist.
Die Nucleinsäure,
die verwendet wurde, um die Brassica-Zellen zu transformieren, kann
die Expression eines Polypeptides regulieren oder für ein Polypeptid
codieren. Z.B. kann die Nucleinsäure
für ein
Gegensinn-Molekül codieren,
wie beispielsweise ein Ribozym oder ein Gegensinn-Oligonucleotid.
Ferner kann das Brassica-Gewebe aus Brassica-Spezies stammen, wie
beispielsweise aus Brassica napus, Brassica juncea, Brassica carinata,
Brassica nigra, Brassica oleracea und Brassica campestris (auch
als "rapa" bezeichnet).
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Hierin
wird ferner ein Verfahren zur Kultivierung von Brassica-Gewebe beschrieben,
das das Platzieren von Brassica-Gewebe auf einer Flotationsvorrichtung
beinhaltet, die mit flüssigem
Medium in Kontakt steht. Bei diesem flüssigen Medium kann es sich
um Selektionsmedium handeln. Das Kultivieren von Brassica-Gewebe
auf Selektionsmedium kann zur Identifizierung von Brassica-Gewebe
führen,
das mit der Nucleinsäure
transformiert worden ist. Zusätzlich
kann es sich bei diesem flüssigen
Medium um Regenerationsmedium handeln. Das Kultivieren von Brassica-Gewebe auf Regenerationsmedium
kann zur Regeneration einer Brassica-Pflanze aus Brassica-Gewebe
führen.
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Sofern
nicht anders definiert, haben sämtliche
technische und wissenschaftliche Bezeichnungen, die hierin verwendet
werden, die gleiche Bedeutung, wie diese üblicherweise von einem Fachmann
verstanden wird, an den sich diese Erfindung richtet. Obwohl Verfahren
und Materialien, die zu denen ähnlich
oder äquivalent
sind, die hierin beschrieben werden, zur Durchführung oder zum Testen der vorliegenden
Erfindung verwendet werden können,
werden nachfolgend geeignete Verfahren und Materialien beschrieben.
Im Falle eines Widerspruches ist die vorliegende Beschreibung einschließlich der
Definitionen maßgeblich.
Ferner sind die Materialien, Verfahren und Beispiele lediglich illustrativ
und nicht einschränkend
zu verstehen.
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Weitere
Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden
detaillierten Beschreibung und aus den Ansprüchen.
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BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 ist
ein Diagramm, das das pIMC38-Konstrukt darstellt, das in den hierin
beschriebenen Experimenten verwendet wurde.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG
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Die
Erfindung stellt Verfahren und Materialien bereit, die die Transformation
von Brassica durch Partikelbombardierung betreffen. Im Speziellen
stellt die Erfindung Verfahren zur Präparierung von nicht-embryonalem
Brassica-Gewebe bereit, so dass Brassica-Zellen in der Lage sind,
kultiviert, durch Partikelbombardierung transformiert und in Pflanzen
regeneriert zu werden. Die Erfindung stellt ferner stabil transformierte
Brassica-Zellen sowie deren Nachkommen bereit. Transformierte Pflanzen
werden hierin auch als transgene Pflanzen bezeichnet.
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Gewebepräparation
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Eine
Zell- oder Gewebepräparation
wird als eine Gruppe von Zellen oder Geweben definiert, die auf eine
Art und Weise angeordnet sind, die für eine Partikelbombardierung
geeignet ist. Um eine erfolgreiche Transformation sicherzustellen,
wird mit der Zell- oder Gewebepräparation
eine relativ große
Anzahl von Zellen, vorzugsweise sich schnell teilende Zellen, bereitgestellt,
die an der Oberfläche
derart exponiert werden, dass sie Partikel, die mit einer Nucleinsäure beschichtet
sind, aufnehmen können.
Zusätzlich
müssen
die aufnehmenden Zellen in der Lage sein, das Wachstum fortzusetzen
und Pflanzen zu regenerieren. Eine Vielzahl von nicht-embryonalen
Brassica-Zell- oder -Gewebequellen kann dazu verwendet werden, um
Zell- oder Gewebepräparationen
zu präparieren,
die diese Kriterien erfüllen.
Beispielsweise können
Protoplasten aus Blättern,
isolierte Mirosporenkulturen, Stammgewebe und Hypocotylgewebe, die
aus Brassica stammen, als Quellen für Brassica-Zellen verwendet
werden. Die Verwendung von nicht-embryonalen Gewebequellen vereinfacht
das Transformationsverfahren erheblich. Typischerweise werden Hypocotylgewebe,
die aus jungen Sämlingen
präpariert
werden, die unter sterilen Bedingungen gewachsen sind, verwendet.
In diesem Fall kann das Hypocotyl in Längsscheiben geschnitten werden.
Alternativ kann ein oberer Teil eines Sämlings zu einem Zellbrei zerkleinert
werden. Solch ein oberer Teil kann die beiden Keimblätter, die
Triebspitze als auch den oberen Abschnitt des Hypocotyls umfassen.
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Ein
Zellbrei ist eine beliebige flüssige
Suspension von unlöslichem
Zellmaterial, das lebende Zellen enthält. Ein Mixer kann dazu verwendet
werden, um Brassica-Gewebe zu einem Zellbrei zu zerkleinern. Zusätzlich kann
ein Zellbrei in Gruppen, basierend auf der Größe des unlöslichen Zellmaterials, unterteilt
werden. Beispielsweise kann ein Zellbrei durch eine Reihe von Maschen
unterteilt werden, so dass unlösliches
Zellmaterial einer bestimmten Größe angereichert
wird. Ein Zellbrei mit einer beliebigen Größe kann zur Partikelbombardierung
verwendet werden, vorausgesetzt, der Zellbrei enthält lebende
Zellen. Beispielsweise kann ein Zellbrei mit Zellmaterial von etwa
35 μm bis
etwa 500 μm
Größe oder
etwa 46 μm
bis etwa 230 μm
Größe angereichert
sein und für
die Partikelbombardierung verwendet werden.
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Die
Brassica-Gewebepräparationen
können
diploide oder haploide Zellen enthalten. Werden diploide Zellen
verwendet, versteht es sich, dass die resultierenden transformierten
Zellen sehr wahrscheinlich an jeder Integrationsstelle heterozygot
sein werden. Mit anderen Worten, es ist äußerst unwahrscheinlich, dass
sich eine Kopie der eingebrachten Nucleinsäure in beiden Chromosomen an
der gleichen Stelle integriert. Bei der Verwendung von haploiden
Zellen können
die resultierenden transformierten Zellen jedoch mit Colchicin behandelt
werden, um die Chromosomenverdopplung zu induzieren. Deshalb werden
die resultierenden Zellen höchstwahrscheinlich
an jeder Integrationsstelle homozygot sein. Alternativ können aus
den resultierenden, transformierten, haploiden Zellen haploide Pflanzen
regeneriert werden. Diese haploiden Pflanzen können dann wiederum mit anderen
Pflanzen gekreuzt werden, um Pflanzen zu produzieren, die an bestimmten
Integrationsstellen entweder heterozygot oder homozygot sind. Ferner
werden Zellen, die eine eingebrachte Nucleinsäuresequenz in ihr Genom integrieren,
als stabil transformierte Zellen bezeichnet. Stabil transformierte Zellen
behalten typischerweise die eingebrachte Nucleinsäuresequenz
bei jeder Zellteilung. Zellen, die eingebrachte Nucleinsäuresequenzen
enthalten, die nicht in das Genom integriert sind, werden als transient
transformierte Zellen bezeichnet. Transient transformierte Zellen
verlieren typischerweise mit jeder Zellteilung einen Teil der eingebrachten
Nucleinsäuresequenz.
Folglich können
die transformierten Zellen entweder transient und/oder stabil transformiert
sein.
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Eine
nicht-embryonale Brassica-Gewebepräparation kann vor der Bombardierung
auf Induktionsmedium kultiviert werden, z.B. einem festen Induktionsmedium.
Typischerweise wird ein festes Medium aus flüssigem Medium durch Zugabe
von Agar hergestellt. Das Induktionsmedium enthält typischerweise Murashige und
Skoog (MS) -Medium, sowie relativ höhere Konzentrationen von Auxin,
z.B. 2,4-Dichlorophenoxyessigsäure
(2,4-D), und relativ niedrigere Konzentrationen von Cytokinin, z.B.
Kinetin. Beispielsweise können
1 mg/l von 2,4-D und 0,3 mg/l Kine tin zu dem MS-Medium hinzugegeben
und verwendet werden. Zusätzlich
wird die Gewebepräparation
auf dem Induktionsmedium üblicherweise
für 1–3 Tage
vor der Bombardierung kultiviert.
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Für die Zwecke
dieser Erfindung können
feste und/oder flüssige
Gewebekulturtechniken verwendet werden. Beispielsweise kann das
Induktions-, Selektions- und Regenerationsmedium entweder in fester
oder in flüssiger
Form vorliegen. Bei der Verwendung von festem Medium kann das Brassica-Gewebe
direkt auf das Medium platziert werden, oder es kann auf einen Filterstreifen
platziert werden, der dann mit dem Medium in Kontakt gebracht wird.
Bei der Verwendung von flüssigem
Medium kann das Brassica-Gewebe auf eine Flotationsvorrichtung platziert
werden, die mit dem flüssigen
Medium in Kontakt steht. Bei einer Flotationsvorrichtung handelt
es sich typischerweise um eine poröse Membran, die an anderer
Stelle beschrieben ist (US-Patent Nr. 5,324,657). Beispiele für Flotationsvorrichtungen,
Verfahren zur Verwendung von Flotationsvorrichtungen und Zusatzgeräte, die
in Flüssigkulturtechniken
zusätzlich
verwendet werden, können
unmittelbar von Anbietern wie beispielsweise Life Technologies (Rockville,
MD) und Osmotek Ltd. (Kiryat Weizmann Rehovot 76120, Israel) erhalten
werden. Typischerweise wird schneller wachsendes Gewebe auf Flüssigmedium
kultiviert. Beispielsweise kann flüssiges Selektionsmedium und
flüssiges
Regenerationsmedium zur Kultivierung von Brassica juncea-Gewebe
verwendet werden.
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Nucleinsäuremoleküle
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Es
können
entweder zirkuläre
oder lineare Nucleinsäuremoleküle verwendet
werden, um die Partikel zu beschichten, die dann wiederum dazu verwendet
werden, um Brassica zu transformieren. Ferner kann es sich bei diesen
Nucleinsäuremolekülen um RNA
oder DNA, einschließlich
cDNA, genomische DNA und synthetische (z.B. chemisch synthetisierte)
DNA handeln, die doppelsträngig
oder einzelsträngig
sein kann. Bei einer einzelsträngigen
Nucleinsäure
kann es sich um den Sinnstrang oder den Gegensinnstrang handeln.
Im Rahmen der Erfindung werden auch Fragmente dieser Moleküle in Erwägung gezogen
und können
beispielsweise durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) hergestellt
werden oder durch die Behandlung mit einer oder mehreren Restriktionsendonucleasen
gewonnen werden. RNA-Moleküle
können
beispielsweise durch Transkription in vitro hergestellt werden.
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Die
Nucleinsäuremoleküle der Erfindung
codieren typischerweise für
ein Polypeptid oder regulieren die Expression eines Polypeptides.
Beispielsweise kann eine cDNA verwendet werden, die für ein Enzym
oder ein Gegensinn-Molekül
codiert, das die Herstellung eines Enzyms verhindert. Der Begriff "Gegensinn-Molekül" umfasst ein beliebiges
Nucleinsäuremolekül, das Sequenzen
enthält,
die komplementär
zu dem Codierungsstrang des natürlicherweise
vorkommenden Polypeptides sind. Ein Gegensinn-Molekül kann ferner
flankierende Sequenzen beinhalten, z.B. regulatorische Sequenzen
oder Introns. Folglich werden im Rahmen der Erfindung als Gegensinn-Moleküle enzymatische
Nucleinsäuremoleküle, die
spezifisch auf RNA ausgerichtet sind und diese unter Verwendung
von komplementären
Gegensinnsequenzen, wie beispielsweise Ribozymen oder Gegensinn-Oligonucleotiden,
spalten, in Erwägung
gezogen. Diese Ribozyme können
jede allgemeine Struktur aufweisen, einschließlich, ohne Einschränkung, Haarnadel-,
Hammerkopf- oder Axtkopfstrukturen, vorausgesetzt, dass das Molekül RNA spaltet.
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Im
Allgemeinen liegt ein Nucleinsäuremolekül der Erfindung
in der Form eines Plasmides vor und enthält Sequenzen, die für ein Polypeptid
codieren, sowie die Expression des Polypeptides fördern, wenn
dies in einer Brassica-Zelle vorhanden ist. Die Sequenzen, die die
Polypeptidexpression fördern,
sind typischerweise regulatorische Sequenzen, die die Sequenzen
flankieren, die für
das Polypeptid codieren. Bei einem Polypeptid kann es sich um jedes
beliebige synthetisch hergestellte oder biologisch gewonnene Polypeptid
handeln. Ferner kann das Polypeptid natürlicherweise in Brassica vorkommen
oder heterolog zu Brassica sein. Folglich werden im Rahmen der Erfindung
Brassica-Polypeptide, Pflanzen-Polypeptide, Nicht-Pflanzen-Polypeptide, modifizierte
Polypeptide, synthetische Polypeptide und Teile von Polypeptiden
in Erwägung
gezogen.
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Die
Zusammensetzung der und Verfahren zur Konstruktion von Nucleinsäuremoleküle(n) zur
erfolgreichen Transformation von Pflanzen sind einem Fachman wohlbekannt.
So ist beispielsweise die Verwendung von geeigneten Nucleinsäurekomponenten,
wie beispielsweise Promotoren, Polyadenylierungssequenzen, selektierbare
Markersequenzen, Reportersequenzen, Enhancer, Introns und dergleichen
als Referenzen, die die spezifischen Zusammensetzungen der Komponenten
ausmachen, an anderer Stelle beschrieben (Weising et al., Ann. Rev.
Genetics 22:421-478
(1988)). Ferner sind geeignete Verfahren zur Konstruktion an anderer Stelle
beschrieben (Sambrook J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Es
ist wichtig, festzuhalten, dass die gleichen oder ähnliche
Zusammensetzungen und Verfahren hierin verwendet werden können, um
Nucleinsäuremoleküle herzustellen,
die nützlich
sind, um Brassica zu transformieren, da die spezifische Zusammensetzung
des Nucleinsäuremoleküls, das
dazu verwendet wird, um Brassica zu transformieren, für die vorliegende
Erfindung nicht entscheidend ist, und die Erfindung ist nicht abhängig von
der Zusammensetzung des verwendeten, spezifischen, transformierenden
Nucleinsäuremoleküls.
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Nucleinsäuremoleküle, die
besonders nützlich
sind, um Brassica zu transformieren, beinhalten DNA-Moleküle, die
ein für
die resultierende transformierende Brassica-Pflanze vorteilhaftes
Merkmal liefern oder verstärken.
Die DNA kann beispielsweise für
Polypeptide oder Gegensinn-Moleküle
codieren, die erhöhte Nährwerte,
höhere
Ernten, Schädlingsresistenz,
Krankheitsresistenz und dergleichen fördern. Spezifische Beispiele
umfassen, ohne Einschränkung,
eine heterologe Fettsäuredesaturase
oder Fettsäureelongase,
die die Fettsäurezusammensetzung
beeinflussen, ein Bt-Endotoxin-Gen oder einen Proteaseinhibitor,
welche Insekten Resistenz verleihen; ein bakterielles ESPS-Synthase-Gen,
das Resistenz gegenüber
dem Herbizid Glyphosat verleiht; und ein Chitinase- oder Glucan-endo-1,3-B-glucosidase-Gen,
das Fungizidengenschaften verleiht. Ferner kann das Nucleinsäuremolekül in Brassica
eingebracht werden, um als ein genetisches Werkzeug zu wirken, um
Mutanten zu generieren, und/oder die Identifizierung, genetische
Markierung oder die Isolierung von Segmenten von Brassica-DNA zu
unterstützen.
Zusätzliche
Nucleinsäuremoleküle, die
ein vorteilhaftes Merkmal bereitstellen, oder als genetisches Werkzeug nützlich sind,
sind einem Fachmann allgemein bekannt und werden im Rahmen der Erfindung
in Erwägung
gezogen.
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Das
Nucleinsäuremolekül, das in
Brassica eingebracht wird, kann ferner Nucleinsäuresequenzen enthalten, die
für einen
selektierbaren Marker, einen Reporter oder für beides codieren. Die Expression
dieser Sequenzen in Brassica kann die Identifizierung und Selektion
von Zellen erleichtern, die stabil, transient oder auf beide Art
und Weisen transformiert sind. Alternativ kann der selektierbare
Marker von einem separaten Nucleinsäuremolekül getragen werden, das unter
Verwendung eines Cotransformationsverfahrens eingebracht wird. Die
Sequenzen, die für
diese selektierbaren Marker und Reporter codieren, können von
geeigneten regulatorischen Sequenzen flankiert sein, die die Expression
in Brassica fördern.
Nützliche
selektierbare Marker sind im Stand der Technik wohlbekannt und umfassen
z.B. Antibiotika- und
Herbizid-Resistenz-Gene. Spezifische Beispiele solcher Gene sind
an anderer Stelle offenbart (Weising et al., Ann. Rev. Genetics
22:421–478 (1988)).
Ein typisches selektierbares Marker-Gen ist das Aminoglycosid-Phosphotransferase-Gen
des Transposons Tn5 (AphII), das für ein Polypeptid codiert, das
Resistenz gegenüber
den Antibiotika Kanamycin, Neomycin und G418 (Geneticin) verleiht.
Weitere selektierbare Marker, die im Stand der Technik bekannt sind, beinhalten
die Codierungssequenz der Hygromycin-B-Phosphotransferase (HPT),
die aus E. coli gewonnen werden kann, sowie jene Gene, die für Polypeptide
codieren, die Resistenz oder Toleranz gegenüber Glyphosat, Methotrexat,
Phosphinotricin, Imidazolinone, Sulfonylurea, Bromoxynil, Dalapon
und dergleichen verleihen. Die Expression von selektierbaren Marker-Genen,
die Herbizidresistenz oder -toleranz in den transformierten Brassica-Pflanzen
verleihen, ist kommerziell nützlich.
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Reporter-Gene,
die für
leicht nachweisbare Markerpolypeptide codieren, sind im Stand der
Technik wohlbekannt. Im Allgemeinen handelt es sich bei einem Reporter-Gen
um ein Gen, das im Empfängerorganismus
oder -gewebe nicht vorhanden ist oder exprimiert wird, und das für ein Polypeptid
codiert, dessen Expression durch eine leicht detektierbare Eigenschaft
manifestiert wird, z.B. eine phänotypische
Veränderung
oder enzymatische Aktivität.
Beispiele für
solche Repor ter werden an anderer Stelle gegeben (Weising et al.,
Ann. Rev. Genetics 22:421–478
(1988)). Typische Reporter umfassen das Grün-Fluoreszenz-Protein (GFP)
-Gen aus der biolumineszenten Qualle Aequorea victoria, Varianten
von GFP, das Chloramphenicolacetyltransferase-Gen aus Tn9 von E.
coli, das Betaglucuronidase-Gen aus dem uidA-Locus von E. coli und
Luciferase-Gene aus dem Glühwürmchen Photinus
pyralis. Vektoren, die Nucleinsäuresequenzen
von GFP und GFP-Varianten enthalten, sind kommerziell von Clontech
Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA) erhältlich. Die Anwendungshinweise
für GFP
(Living ColorsTM; PT2040-1; Clontech Laboratories,
Inc.) beschreiben sowohl GFP als auch GFP-Varianten.
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Die
regulatorischen Sequenzen, die hierin nützlich sind, beinhalten konstitutive,
induzierbare, gewebe- oder organspezifische, oder entwicklungsstadiumspezfische
Promotoren, die in Pflanzenzellen funktionieren. Geeignete Promotoren
sind an anderer Stelle offenbart (Weising et al., Ann. Rev. Genetics
22:421–478 (1988)).
Anschließend
folgt eine partielle repräsentative
Liste von Promotoren, die für
eine Verwendung hierin geeignet sind: regulatorische Sequenzen aus
der T-DNA von Agrobacterium tumefaciens, einschließlich Mannopinsynthase,
Nopalinsynthase und Octopinsynthase; Alkoholdehydrogenasepromotor
aus Getreide; lichtinduzierbare Promotoren, wie beispielsweise das
Gen für
die kleine Untereinheit der Ribulosebiphosphatcarboxylase aus einer
Vielzahl von Spezies; der Promotor für das Gen für das Hauptchlorophyll a/b-Bindeprotein; 35S-
und 19S-Promotoren des Blumenkohlmosaikvirus; entwicklungsabhängig regulierte
Promotoren, wie beispielsweise Oleosin-, Cruciferin-, Napin- und
Phaseolinpromotoren; des Weiteren synthetische oder andere natürliche Promotoren,
die entweder induzierbar oder konstitutiv sind, einschließlich jene
Promotoren, die die organspezifische Expression oder die Expression
in (einem) spezifischen Entwicklungsstadium/stadien der Pflanze
ausüben.
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Besonders
bevorzugte Promotoren sind jene, die die saatgutspezfische Expression
ermöglichen.
Solche Promotoren sind nützlich,
da Saatgut die Hauptquelle für
pflanzliche Öle
ist, und da die saatgutspezifische Expression mögliche potentielle schädliche Auswirkungen
in Nicht-Saatgut-Geweben verhindert. Beispiele für saatgutspezifische Promotoren
umfassen, ohne Einschränkung,
Promotoren von Saatgutspeicherproteinen, die in vielen Pflanzen
bis zu 90 % des gesamten Saatgutproteins ausmachen können. Die
Saatgutspeicherproteine werden genau reguliert und werden nahezu
ausschließlich
in Saatgut in höheren
Geweben und auf stadiumspezifische Art und Weise exprimiert (Higgins
et al., Ann. Rev. Plant Physiol. 35:191–221 (1984)). Ferner können verschiedene
Saatgutspeicherproteine zu verschiedenen Stadien der Saatgutentwicklung
exprimiert werden.
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Die
Expression von saatgutspezifischen Genen wurde in großem Detail
untersucht (siehe Übersichtsartikel
von Goldberg et al., Cell 56:149–160 (1989)). Es gibt gegenwärtig vielzählige Beispiele
für eine
saatgutspezifische Expression von Saatgutspeicherprotein-Genen in
transgenen zweikeimblättrigen
Pflanzen.
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Weitere
Beispiele für
saatgutspezifische Promotoren betreffen Gene, die während der
frühen
Embryogenese und Ölbiosynthese
exprimiert werden. Beispielsweise können native regulatorische
Sequenzen, einschließlich
der nativen Promotoren, von Fettsäuredesaturase-Genen nach deren
Isolation durch den Fachmann verwendet werden. Heterologe Promotoren
aus anderen Genen, die in die Saatgutöl-Biosynthese involviert sind, wie beispielsweise
jene der Isocitratlyase und Malatsynthase von Brassica napus (Comai
et al., Plant Cell 1:293–300
(1989)), Delta-9-Desaturase
aus Safflower (Thompson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2578–2582 (1991)),
und Castor (Shanklin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2510–2514 (1991)),
Acylträgerprotem
(ACP) aus Arabidopsis (Post-Beittenmiller et al., Nucl. Acids Res.
(1989) 17:1777), Brassica napus (Safford et al., Eur. j. Biochem.
174:287–295
(1988)), und Brassica campestris (Rose et al., Nucl. Acids Res. 15:7197
(1987)), β-Ketoacyl-ACP-Synthetase aus der
Gerste (Siggaard-Andersen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4114–4118 (1991)),
und Oleosin aus Zea mays (Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88:6181–6185 (1991)),
Sojabohne (Genbank-Zugriffsnummer: X60773) und Brassica napus (Lee
et al., Plant Physiol. 96:1395–1397
(1991)), sind von Nutzen.
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Ein
Nucleinsäuremolekül kann ferner
weitere Elemente enthalten, wie beispielsweise Introns, Enhancer,
Polyadenylierungssequenzen und dergleichen. Solche Elemente können gegebenenfalls
für die
Funktion des Nucleinsäuremoleküls nützlich sein,
obgleich sie eine bessere Expression oder Funktionsweise des Nucleinsäuremoleküls durch
das Beeinflussen der Transkription, Stabilität der mRNA oder dergleichen
ermöglichen.
Solche Elemente können
in das Nucleinsäuremolekül eingebracht
werden, sofern gewünscht,
um die optimale Leistungsfähigkeit
der transformierenden Nucleinsäure
in der Pflanzen zu erreichen. Eine ausreichende Expression kann
für einen
selektierbaren Marker, so dass dieser zufriedenstellend funktioniert,
häufig
jedoch ohne ein Intron erreicht werden.
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Um
festzustellen, ob eine bestimmte Kombination von Nucleinsäurekomponenten
wie gewünscht funktioniert,
können
Brassica-Empfängerzellen
stabil oder transient durch Partikelbombardierung mit einem Nucleinsäuremolekülkonstrukt
transformiert werden, das sowohl die bestimmte Kombination als auch
einen Reporter enthält.
Zu einer geeigneten Zeit nach der Transformation kann ein Assay
zur Expression des Reporters durchgeführt werden. Beispielsweise
führt ein
Assay zur Identifizierung der transienten Expression des Genes für die Betaglucuronidase
(GUS) aus E. coli (Jefferson et al., EMBO J. 6:3901–3907 (1987)).
In diesem Fall beträgt
eine geeignete Zeit für
die Durchführung
des Versuches etwa 1–3
Tage nach der Bombardierung. Die Verwendung des Transientassays
ist insbesondere wichtig, wenn ein Nucleinsäuremolekül verwendet wird, das Komponenten
enthält,
für die
zuvor nicht gezeigt oder bestätigt
wurde, dass diese mit den gewünschten
Brassica-Empfängerzellen
kompatibel sind.
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Partikelbombardierung
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Die
hierin beschriebenen Nucleinsäuremoleküle werden
in nicht-embryonale
Brassica-Gewebepräparationen
unter Verwendung eines Partikelbombardierungsverfahrens eingebracht.
Allgemeine Beschreibungen von geeigneten Partikelbombardierungsvorrichtungen
und Partikelbombardierungsverfahren werden an anderer Stelle gegeben
(Sanford et al., j. Part. Sci. Technol. 5:27–37 (1987)); Heiser W., "Optimization of Biolistic® transformation
using the helium-driven PDS-1000/He system" in US/EG Bulletin 1688, BIO-RAD; und Dunder
et al., "Comparison
of performance characteristics of different biolistic® devices" in US/EG Bulletin 1689,
BIO-RAD). Kurz gesagt,
führt das
Partikelbombardierungsverfahren, das auch als ein biolistisches
Verfahren bezeichnet wird, ein gewünschtes Nucleinsäuremolekül unter
Verwendung sehr kleiner Partikel einer Zelle zu, wobei die Partikel
aus einem biologisch inerten Material bestehen und mit einem Nucleinsäuremolekül beschichtet
wurden. Wenn die inerten Partikel mit dem Nucleinsäuremolekül beschichtet
werden und auf eine geeignete Geschwindigkeit beschleunigt werden,
dringt eines oder mehrere der Partikel in eine oder mehrere der
Zellen ein, wobei das Nucleinsäuremolekül von dem
Partikel freigesetzt und in der Zelle exprimiert wird. Während einige
der Zellen durch das Bombardierungsverfahren tödlich beschädigt werden, überleben
andere. Einige der Empfängerzellen,
die überleben,
behalten das eingebrachte Nucleinsäuremolekül und exprimieren es.
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Die
Partikel, die als Mikroprojektile bezeichnet werden, weisen im Allgemeinen
ein Material mit einer hohen Dichte auf, wie beispielsweise Wolfram
oder Gold. Sie sind mit dem interessierenden Nucleinsäuremolekül beschichtet.
Beschichtungsverfahren sind an anderer Stelle im Detail beschrieben
(Stanford et al., Methods Enzymol. 217:483–509 (1993) und Heiser W., "Optimization of Biolistic® transformation
using the helium-driven PDS-1000/He system" in US/EG Bulletin 1689, BIO-RAD). Die Mikroprojektile
werden dann auf die Oberfläche
eines Makroprojektils platziert, das dazu dient, die Antriebskraft
von einer geeigneten Energiequelle auf die Mikroprojektile zu übertragen.
Nachdem das Makroprojektil und die Mikroprojektile auf die passende Geschwindigkeit
beschleunigt wurden, treten diese mit einer Blockierungsvorrichtung
in Kontakt, die verhindert, dass das Makroprojektil seine Vorwärtsbewegung
fortführt,
ermöglicht
es jedoch den Mikroprojektilen, die mit den Nucleinsäuremolekülen beschichtet
sind, fortzuschreiten und in die Empfänger-Brassica-Zellen einzuschlagen. Geeignete
Vorrichtungen können
eine Vielzahl von Antriebskräften
verwenden, wie beispielsweise einen Hochdruckheliumtank, Schieß pulver
und Schockwellen aus einer elektrischen Bogenentladung (Sanford et
al., j. Part. Sci. Technol. 5:27–37 (1987)) und Sanford et
al., Technique 3:3–16
(1988)).
-
Ein
Protokoll zur Verwendung einer Schießpulvervorrichtung wird von
Klein T et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:4305–4309 (1988)
und Bio/Technology 6:599–563
(1988)) bereitgestellt und beinhaltet zwei Hauptschritte. Zuerst
werden Wolfram-Mikroprojektile beschichtet, wenn diese mit dem Nucleinsäuremolekül, Calciumchlorid
und der freien Base von Spermidin in einer speziellen Reihenfolge
in einer wässrigen
Lösung gemischt
werden. Die Konzentrationen der verschiedenen Komponenten können variiert
werden. Es kann beispielsweise jede beliebige Konzentration des
Nucleinsäuremoleküls verwendet
werden, vorausgesetzt, dass die Empfänger-Brassica-Zellen das transferierte
Nucleinsäuremolekül exprimieren.
Zweitens, während
der eigentlichen Bombardierung wird sowohl die Entfernung zwischen
den Empfängerzellen
und dem Ende des Laufs als auch das Vakuum in der Probenkammer eingestellt.
Diese Einstellungen sind an anderer Stelle beschrieben (Klein et
al., Bio/Technology 6:599–563
(1988)) und können
variiert werden.
-
Ein
Protokoll zur Verwendung einer Vorrichtung mit einem Tank von Hochdruckhelium
(Biolistic® PDS-1000/He
Particle Delivery System) wird von dem Hersteller (BIO-RAD, Hercules,
CA) bereitgestellt. Die spezifischen Bedingungen, wie beispielsweise
die Konzentration des Nucleinsäuremoleküls, das
zur Beschichtung der Mikroprojektile verwendet wird, der Heliumdruck,
der zur Beschleunigung der Mikroprojektile verwendet wird, und die
Entfernung der Stoppwand von der Probe, können variiert werden. Typischerweise wird
das Empfängergewebe
etwa 6 bis 9 cm unterhalb des Trägers
mit der Stoppplatte positioniert.
-
Die
spezifischen Brassica-Gewebepräparationen,
die hierin beschrieben werden, können
auf eine Petrischale oder eine andere Oberfläche platziert und auf im Wesentlichen
jede beliebige Art und Weise angeordnet werden, wobei klar ist,
dass (i) der Bereich in dem Zentrum der Schale die höchste Konzentration
von Nucleinsäuremolekül-beschichteten
Partikeln aufnimmt, und das Gewebe, das dort angeordnet ist, während der
Bombardierung geschädigt
werden kann, und (ii) die Anzahl von Partikeln, die eine Zelle erreichen,
abnimmt, so wie der Abstand der Zelle von dem Zentrum des Einschlagsbereiches
zunimmt, so dass die Zellen, die vom Zentrum der Schale weit entfernt
sind, möglicherweise
nicht bombardiert und transformiert werden. Das Biolistic® PDS-1000/He
Particle Delivery System (BIO-RAD, Hercules, CA) kann eine gleichmäßigere Verteilung
von Mikroprojektilen auf die Empfängerzellen liefern. Ein Maschenschild,
vorzugsweise aus Metall, kann wahlweise auf die Schale gelegt werden,
um ein Spritzen oder ein Herausschleudern des Gewebes zu verhindern.
Das Gewebe kann einmal oder mehrmals mit den Nucleinsäuremolekül-beschichteten Partikeln bombardiert
werden. Ferner können
die Zellen mit Partikeln bombardiert werden, die mit einem einzigen
Typ von Nucleinsäuremolekül oder mit
mehreren verschiedenen Nucleinsäuremolekülen beschichtet
sind. Gleichermaßen
kann eine Gewebepräparation
mit einer Ansammlung von Partikeln bombardiert werden, wobei die Ansammlung
verschiedene Sets enthält,
die jeweils mit einem unterschiedlichen Nucleinsäuremolekül beschichtet sind.
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Identifizierung
von transformierten Brassica
-
Nachdem
die Brassica-Gewebepräparation
mit den beschichteten Partikeln bombardiert wurde, und das Nucleinsäuremolekül einige
der Zellen penetriert hat, ist es erforderlich, Zellen zu identifizieren,
die sowohl das Nucleinsäuremolekül enthalten,
als auch eine ausreichende regenerative Kapazität beibehalten haben. Es können viele
Ansätze
dazu verwendet werden, um transformierte Pflanzenzellen zu identifizieren,
die einem Fachmann bekannt sind. Kurz gesagt, zwei allgemeine Ansätze, die
als nützlich
empfunden werden, werden beschrieben. Erstens, transformierte Brassica-Zellen
oder aus diesen regenerierte Pflanzen können auf das Vorhandensein
des Nucleinsäuremoleküls durch
verschiedene Standardverfahren gescreent werden, einschließlich, ohne
Einschränkung,
Versuche zu der Expression eines Reporters, der in dem Nucleinsäuremolekül enthalten
ist, und Bewertungen der phänotypischen
Auswirkungen, welche durch die Expression des Nucleinsäuremoleküls verursacht
werden, sofern zutreffend. Zweitens, eine selektierbare Markersequenz
kann zusammen mit oder als Teil des Nucleinsäuremoleküls übertragen werden. In diesem
Fall können
die Zellen durch die Verwendung eines selektiven Agens identifiziert
werden, um die Expression des selektierbaren Markers zu detektieren.
-
Die
Selektionsbedingungen müssen
derart gewählt
werden, dass ein Wachstum und die Akkumulation der transformierten
Zellen ermöglicht
wird, während
gleichzeitig das Wachstum der nicht-transformierten Zellen inhibiert
wird. Diese Situation kann durch die Tatsache verkompliziert werden,
dass die Vitalität
von individuellen Zellen in einer Population häufig hochgradig von der Vitalität der benachbarten
Zellen abhängt.
Ferner dürfen
die Selektionsbedingungen nicht so streng sein, dass die Pflanzenregenerationsfähigkeit
der transformierten Zellen und die Fertilität der resultierenden Pflanze
beeinträchtigt
werden. Folglich sollten die Auswirkungen des Selektionsagens auf
die Zellvitalität
und -morphologie bewertet werden. Dies kann vorausgehend durch das
experimentelle Produzieren einer Wachstumsinhibitionskurve für ein bestimmtes
selektives Agens und Gewebe bewerkstelligt werden, wodurch der Konzentrationsbereich
ermittelt wird, der das Wachstum nicht inhibiert.
-
Wenn
ein selektierbarer Marker verwendet wird, kann das bombardierte
Brassica-Gewebe entweder von der Bombardierung auf einem nicht-selektiven
Medium regeneriert werden oder direkt in das Medium gegeben werden,
das das Selektions-Agens enthält.
-
Selektionsverfahren
beinhalten typischerweise die Exposition des bombardierten Gewebes
an ein toxisches Agens. Das Gewebe kann sequentiellen Veränderungen
der Konzentration des Agens oder auch verschiedenen Selektionsrunden
unterzogen werden. Die speziellen Konzentrationen und Zykluslängen variieren typischerweise
in Abhängigkeit
von den Agenzien, die im Speziellen verwendet werden. Ferner kann
das Selektionsverfahren die Verwendung einer anfänglichen Selektionsrunde mit
einer relativ niedrigen Konzentration des toxischen Agens, und dann
(eine) weitere Runde(n) bei (einer) höheren Konzentrationen) beinhalten.
Dadurch wird ermöglicht,
dass das selektive Agens seinen toxischen Effekt langsam über einen
längeren
Zeitraum ausübt.
Anfänglich
kann die Konzentration des Agens derart sein, dass etwa ein 5–40 %-iger
Level der Wachstumsinhibition erfolgt, wie dies über eine Wachstumsinhibitionskurve
bestimmt wird. Das Ziel ist es, den transformierten Zellen ein Wachstum
und Teilungsaktivität
zu ermöglichen,
wobei vorzugsweise die untransformierten Zellen inhibiert werden,
allerdings nicht zu einem solchen Ausmaß, dass das Wachstum der transformierten
Zellen verhindert wird. Nachdem wenige individuelle transformierte
Zellen ausreichend gewachsen sind, kann das Gewebe in Medium überführt werden,
das eine höhere
Konzentration des toxischen Agens enthält, um im Wesentlichen sämtliche
untransformierten Zellen abzutöten.
Das Überführen in
höhere
Konzentrationen reduziert ferner die Möglichkeit, dass sich nicht-transformierte
Zellen an das Agens gewöhnen.
Bei einer höheren
Konzentration kann es sich um eine solche Konzentration handeln,
die etwa 30 bis 100 % Wachstum inhibiert. Die Länge des ersten Selektionszyklus
kann zwischen etwa 1 bis 4 Wochen liegen, typischerweise etwa 2
Wochen betragen. Spätere
Selektionszyklen können
zwischen etwa 1 bis etwa 12 Wochen, typischerweise zwischen etwa
2 bis etwa 10 Wochen liegen. Vermeintliche Brassica-Transformanten
können im
Allgemeinen vor einem Hintergrund von nicht-proliferierenden Zellen
als proliferierende Gewebe oder Zellen identifiziert werden. Das
bombardierte Brassica-Gewebe
kann ferner auf nicht-selektiven Medien zu verschiedenen Zeiten
während
des gesamten Selektionsverfahrens kultiviert werden.
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Nachdem
ein Sektor als ein vermeintlich transformierter Sektor identifiziert
wurde, kann die Transformation durch eine phänotypische und/oder genotypische
Analyse bestätigt
werden. Wenn ein Selektionsagens verwendet wird, umfasst die phänotypische
Analyse beispielsweise die Messung einer jeglichen Zunahme des Frischgewichtes
der vermeintlichen Transformante im Vergleich zu einer Kontrolle
bei verschiedenen Spiegeln des selektiven Agens. Weitere Analysen,
die verwendet werden können,
hängen
von der Funktion des transformierten Nucleinsäuremoleküls ab. Wenn beispielsweise
durch das Nucleinsäuremolekül ein Enzym
oder ein anderes Polypeptid codiert wird, können enzymatische oder immunologische
Assays durchgeführt
werden, die für
das spezielle Enzym spezifisch sind. Spezifische Bioassay- und chemische
Assaytechniken, die für
die Detektion der Expression der transformierten Nucleinsäuremoleküle geeignet
sind, sind im Stand der Technik wohlbekannt und werden hier nicht
wiederholt. Das Vorhandensein der Nucleinsäure selbst kann durch übliche Verfahren
bestätigt
werden, d.h. Southern blot, Northern blot oder PCR-Analyse oder
dergleichen.
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Regeneration
von Brassica-Pflanzen
-
Transformierte
Brassica-Zellen können
in Pflanzen regeneriert, und die Fertilität der resultierenden Pflanzen
kann bestimmt werden. Kurz gesagt, Zellen, die positiv auf die Transformation
getestet wurden, werden auf Medium platziert, das die Gewebedifferenzierung
und Pflanzenregeneration fördert.
Ein Beispiel für ein
Regenerationsmedium beinhaltet, ohne Einschränkung, MS-Medium, das relativ
geringere Konzentrationen von Auxin enthält, z.B. Indol-3-Essigsäure (IAA),
und relativ höhere
Konzentrationen von Cytokinin, z.B. Zeatin. Der spezifische Regenerationsprozess
kann in Übereinstimmung
mit Standardverfahren durchgeführt werden,
die im Stand der Technik wohlbekannt sind. Typischerweise haben
diese Verfahren eine Reduzierung des Spiegels von Auxin zur Folge.
Das Regenerationsmedium kann ferner das gleiche Selektionsagens
enthalten, das in dem Selektionsmedium verwendet wurde. Die regenerierten
Pflanzen können
in einem Wachstumsraum oder Gewächshaus
bis zur Reife wachsen gelassen werden, und geeignete Geschlechtskreuzungen
und Selbstungen werden durchgeführt.
-
Es
ist wichtig, festzuhalten, dass die Pflanzenregeneration, sofern
wichtig für
die vorliegende Erfindung, auf jede beliebige konventionelle Art
und Weise durchgeführt
werden kann. Wenn beispielsweise ein selektierbarer Marker in die
Zellen eingebracht wurde, kann dann ein Selektionsagens zu dem Regenerationsmedium
gegeben werden, um weiter zu bestätigen, dass die regenerierten
Pflänzchen
transformiert sind. Da die Regenerationstechniken wohlbekannt und
für die
vorliegende Erfindung nicht entscheidend sind, kann jede beliebige
Technik verwendet werden, die die Regeneration bewerkstelligt und
fertile Pflanzen liefert.
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Analyse der
Nachkommen
-
Die
Pflanzen, die von den transformierten Brassica regeneriert werden,
werden als R0-Generation oder R0-Pflanzen
bezeichnet. Die Saatgüter,
die durch verschiedene sexuelle Kreuzungen der R0-Generationspflanzen
produziert werden, werden als R1-Nachkommen
oder R1-Generationen bezeichnet. Wenn die R1-Saatgüter
keimen, werden die resultierenden Pflanzen auch als die R1-Generation bezeichnet.
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Die
R1-Generation sollte analysiert werden,
um die erfolgreiche Übertragung
und Vererbung des transformierten Nucleinsäuremoleküls zu bestätigen. Die Analyse kann unter
Verwendung von beliebigen Verfahren durchgeführt werden, die hierin beschrieben
sind, um Transformanten zu identifizieren, wobei zu berücksichtigen
ist, dass ein beliebiger Teil der Pflanze verwendet werden kann.
Ferner kann jede R1- oder spätere (z.B. R2, R3, R4 etc.)
Pflanze als auch F1- oder spätere (z.B.
F2, F3, F4 etc.) Pflanze analysiert werden.
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Aus
dem Vorstehenden ergibt sich, dass der Begriff "Nachkomme" Abkömmlinge
einer bestimmten Zelle, Zelllinie, Pflanze oder Pflanzenlinie, z.B.
Saatgüter,
die von einer Pflanzen entwickelt wurden, und Pflanzen, die von
solchen Saatgütern
gewonnen wurden, beinhaltet. Nachkommen einer solchen Pflanze beinhalten
Saatgüter,
die aus R0, R1,
R2 und Pflanzen nachfolgender Generationen
gewonnen wurden, Saatgüter,
die aus F1, F2,
F3 und nachfolgenden Generationen von Pflanzen
gewonnen wurden, oder Saatgüter,
die von BC1, BC2,
BC3 oder Pflanzen aus nachfolgenden Generationen
gewonnen wurden. Folglich beinhalten geselbstelte Nachkommen nicht
nur die R1-Nachkommen der anfänglichen
Selbstbestäubung,
sondern auch R2, R3 und nachfolgende
Generationen.
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Züchtung der
transgenen Brassica
-
Im
Allgemeinen ist der kommerzielle Wert der transformierten Brassica-Pflanzen, die hierin
produziert werden, am größten, wenn
das Nucleinsäuremolekül in viele
verschiedene Sorten eingebracht werden kann. Ein Landwirt baut typischerweise
verschiedene Sorten basierend auf Unterschieden in der Reife, Standfestigkeit
und anderen landwirtschaftlichen Merkmalen an. Ferner muss der Landwirt
eine Sorte basierend auf der geographischen Örtlichkeit auswählen, da
Sorten, die an eine spezielle Wachstumsumgebung angepasst sind, im
Allgemeinen wegen Unterschieden in solchen Merkmalen, wie Reife,
Krankheits- und Insektenresistenz, nicht an andere angepasst sind.
Insofern kann es vorteilhaft sein, wenn das Nucleinsäuremolekül in eine
größere Anzahl
von parentalen Brassica-Linien eingebracht wird, so dass viele Sorten
produziert werden können, die
das gewünschte
Nucleinsäuremolekül enthalten.
Dies kann auf konventionelle Art und Weise mit Hilfe von Zuchtprogrammen
erfolgen, in denen ein Konversionsvorgang (Rückkreuzung) durchgeführt wird,
indem die anfängliche
transgene, fertile Pflanze mit normalen Eliteinzuchtlinien gekreuzt
wird, und dann die Nachkommen mit den normalen Eltern rückgekreuzt
werden. Die Nachkommen aus dieser Kreuzung spalten sich derart auf,
dass einige Pflanzen das Nucleinsäuremolekül tragen werden, andere hingegen
nicht. Die Pflanzen, die das Nucleinsäuremolekül tragen, werden dann erneut
mit den normalen Pflanzen gekreuzt, was in Nachkommen resultiert,
die sich noch einmal aufspalten. Dieses Kreuzen wird wiederholt,
bis das ursprüngliche
normale Elternteil zu einer gentechnisch hergestellten Linie konvertiert
wurde, die das Nucleinsäuremolekül enthält und ferner
alle anderen wichtigen Eigenschaften besitzt, die ursprünglich in
dem Elternteil gefunden wurden. Ein separates Rückkreuzungsprogramm kann für jede Elitelinie
verwendet werden, die in eine gentechnisch hergestellte Elitelinie
konvertiert werden soll. Es kann für beide Elternteile notwendig
sein, dass diese für
das Nucleinsäuremolekül homozygot
sind. Die Brassica-Züchtung
und die Techniken und Fähigkeiten,
die erforderlich sind, um Gene von einer Linie oder einer Art zu
einer anderen zu transferieren, sind dem Fachmann wohlbekannt.
-
Verwendungen
von transgenen Brassica-Pflanzen
-
Transgene
Pflanzen, die wie hierin beschrieben produziert werden, sind für eine Vielzahl
von kommerziellen und Forschungszwecken nützlich. Transgene Pflanzen
können
zur Verwendung in der traditionellen Landwirtschaft hergestellt werden,
um Merkmale zu besitzen, die für
den Züchter
von Nutzen sind (z.B. landwirtschaftliche Merkmale, wie beispielsweise
Schädlingsresistenz
oder Ertragserhöhung),
die vorteilhaft für den
Konsumenten des Produktes sind, das aus der Pflanze gewonnen wird
(z.B. erhöhter
Nährwert
in der Nahrung für
den Menschen oder in dem Tierfutter), oder die von Vorteil für den Verarbeiter
von Nahrungsmitteln (z.B. verbesserte Verarbeitungsmerkmale) sind.
Chemische Bestandteile, wie beispielsweise Öle und Stärken von Brassica, können zu
Nahrungsmittel- oder industriellen Zwecken extrahiert werden, und
transgene Pflanzen können
hergestellt werden, um die Spiegel solcher Komponenten zu erhöhen oder
zu modifizieren. Die Pflanzen können
ferner zur Produktion von Saatgut für eine Vielzahl von Zwecken
verwendet werden.
-
Transgene
Pflanzen können
ferner in der gewerblichen Herstellung von Polypeptiden oder anderen Molekülen verwendet
werden, die von dem darin enthaltenen Nucleinsäuremolekül codiert werden, wobei das exprimierte
interessierende Molekül
aus den Pflanzenteilen, Saatgütern
und dergleichen extrahiert oder gereinigt wird. Ferner können Zellen
oder Gewebe aus transgenen Pflanzen kultiviert, in vitro wachsen
gelassen oder fermentiert werden, um die gewünschten Moleküle herzustellen,
oder anderen Zwecken dienen, wie beispielsweise der Forschung.
-
Die
transgenen Pflanzen können
ferner in gewerblichen Zuchtprogrammen verwendet werden, oder können gekreuzt
oder mit Pflanzen von verwandten Nutzpflanzen-Spezies gekreuzt oder
gezüchtet
werden. Verbessernde Eigenschaften, die von dem Nucleinsäuremolekül codiert
werden, können
von einer Brassica-Spezies auf eine andere Brassica-Spezies übertragen
werden, beispielsweise durch die Fusion von Protoplasten.
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Transgene
Pflanzen können
auf vielfältige
Art und Weise in der Forschung oder der Züchtung verwendet werden, einschließlich zur
Bildung von neuen mutierten Pflanzen durch Insertionsmuttergenese,
um vorteilhafte Mutanten zu identifizieren, die später durch
traditionelle Mutation und Selektion hergestellt werden könnten. Die
Verfahren der Erfindung können
auch dazu verwendet werden, um Pflanzen herzustellen, die einzigartige "Signatursequenzen" oder andere Markersequenzen
aufweisen, die dazu verwendet werden können, um proprietäre Linen
oder Arten zu identifizieren.
-
Die
Erfindung wird in den folgenden Beispielen weiter beschrieben, die
die Reichweite der in den Ansprüchen
beschriebenen Erfindung nicht einschränken.
-
BEISPIELE
-
Transformierte
Brassica-Pflanzen wurden durch Partikelbombardierung unter Verwendung
von spezifischen Gewebepräparationsverfahren
hergestellt.
-
Beispiel 1 – Brassica-Transformation
durch Verwendung eines Gewebescheibenpräparationsverfahrens
-
Sterilisierte
Saatgüter
der Brassica napus-Sorte Westar wurden auf MS-Medium mit Agar und 30 mM CaCl2 bis zur Keimung im Dunkeln für 5–6 Tage
wachsen gelassen. Die Sämlinge
hatten in diesem Stadium eine Höhe
von 3–6
cm mit Sprossspitzen. Der Vorteil der Verwendung von sterilen Sämlingen
als eine Gewebequelle ist, dass minimale Ausstattung, Zeit und Aufwand
erforderlich sind, um die Spendermaterialien aufrechtzuerhalten.
Die Hypocotylen dieser Sämlinge
wurden geerntet und in Stücke
von 2–3
cm Länge
geschnitten. Jedes Hypocotyl-Stück
wurde der Länge
nach in zwei Hälften
geschnitten und dann auf Induktionsmedium platziert, wobei die epidermale
Seite in Kontakt mit dem Medium gebracht wurde, d.h. die frisch
geschnittene Oberfläche
zeigte im Allgemeinen nach oben. Bei dem Induktionsmedium handelte
es sich um MS-Medium mit 0,5 bis 1,0 mg/l 2,4-Dichlorophenoxyessigsäure (2,4-D)
und 0,2 bis 0,3 mg/l Kinetin. Die Längsschnitte wurden eng zueinander
mit etwa 20 Stücken
pro Schale angeordnet. Nachdem diese für 1–2 Tage auf Induktionsmedium
kultiviert wurden, wurden die Längsschnitte
mit Nucleinsäure-beschichteten
Goldpartikeln bombardiert.
-
Das
Nucleinsäuremolekül, das dazu
verwendet wurde, um Partikel für
die Bombardierung und Transformation der nicht-embryonalen Brassica-Zellen
zu beschichten, war pIMC38 (1). Dieses
Konstrukt enthält
zwei Gene: das Neomycin-Phosphotransferase (NPTII)-Gen und das Beta-Glucuronidase
(GUS)-Gen. Beide Gene werden von einem CaMV-35S-Promotor reguliert
und mit einem Nopalin-Synthase (NOS)-Gen-Terminator
terminiert. Die 35S-NPTII-NOS- und 35S-GUS-NOS-Einheiten sind in entgegengesetzten
Richtungen angeordnet. Das NPTII-Gen dient als ein Selektionsmarker,
der bei korrekter Expression den transferierten Zellen in Kultur
eine Resistenz gegenüber
Kanamycin verleiht, und die transformierten Saatgüter resistent
gegenüber
Geneticin während
des Keimens macht.
-
Die
Vorrichtung, die dazu verwendet wurde, um nicht-embryonale Brassica-Zell-
oder Gewebepräparationen
zu bombardieren, war ein Biolistic® PDS-1000/He System (Dupont).
Das Verfahren für
die Partikelbombardierung folgt dem BioRad: US/EG Bulletin 1688
und 1689. Die spezifischen Metallpartikel, die verwendet wurden,
waren 0,6 μ oder
1,0 μ Goldpartikel.
-
Nach
der Bombardierung wurden die Längsschnitte
für 3 Tage
in Induktionsmedium kultiviert. Die Kulturen wurden dann in Selektionsmedium überführt. Das
Selektionsmedium war das gleiche wie das Induktionsmedium, außer dass
das Selektionsagens Kanamycin mit einer Endkonzentration von 25
mg/l hinzugegeben wurde. Nach 2–3
Wochen wurden die Kulturen in Regenerationsmedium überführt, das
2 mg/l Zeatin, 0,1 mg/l IAA und 25 mg/l Kanamycin enthielt. Diese
Zellen wurden etwa jeweils zwei Wochen später auf dem Regenerationsmedium
subkultiviert, bis grüne
Sprosse erschienen.
-
Eine
der regenerierten Pflanzen wurde selektiert (als "Peter" bezeichnet) und
auf das Vorhandensein von NPTII-Nucleinsäure analysiert. Im Speziellen
wurde Blattgewebe von "Peter" gesammelt, und die
DNA wurde aus diesen Zellen extrahiert und durch PCR unter Verwendung
von NPTII-spezifischen Primern analysiert. Diese Analyse ergab,
dass die Zellen von "Peter" NPTII-Nucleinsäure enthielten
(Tabelle I).
-
Regenerierte
Pflanzen wurden in einem Gewächshaus
bis zur Geschlechtsreife wachsen gelassen. Eine kontrollierte Bestäubung wurde
zwischen "Peter" und einer nicht-transgenen
kommerziellen B. napus-Art Quantum durchgeführt. "Peter" wurde ebenfalls selbstbestäubt.
-
R1-Saatgüter
von "Peter" wurden gewonnen,
und F1-Saatgüter wurden von der Quantum-x-"Peter"-Kreuzung gewonnen
und auf Geneticin-Resistenz getestet. Sterilisierte Saatgüter wurden
in Testmedium platziert, das 1,2 g/l Bacto-Agar und 50 mg/l oder
100 mg/l Geneticin (Gibco-LifeSciences, II811-023) enthielt. Die
Saatgüter
wurden in das Medium in ungefähr
0,1 bis 0,4 cm in die Tiefe gedrückt,
danach wurde der Keimungsstatus wöchentlich gemessen, und der
Endwert wurde nach drei Wochen aufgezeichnet. Die folgenden Beschreibungen
wurden verwendet, um den Keimungsstatus der Saatgüter einzustufen.
Typischerweise wachsen die nicht-transgenen
Saatgüter,
wenn diese in 50 mg/l Geneticin Testmedium wachsen gelassen wurden,
bis zu einer Höhe
von 1,5 cm, und weisen Keimblätter
auf, die grün
sind und gelb- bis braungefärbte
Ränder
aufweisen, wobei die Wurzeln nicht länger sind als 0,5 cm. Ferner
wachsen nicht-transgene Saatgüter
nicht in lebensfähige
Sämlinge
aus, nachdem diese für
zwei Wochen in dem 50 mg/l Geneticin-enthaltenden Testmedium verblieben
waren. Folglich wurden Saatgüter,
die in Sämlinge
mit grünen
Keimblättern
und einer Höhe von
größer als
2 cm und Wurzeln von länger
als 1 cm in 50 mg/l Geneticin-enthaltendem Testmedium auskeimen,
als NPTII-positiv definiert. Ferner wurden Saatgüter, die in 50 mg/l enthaltendem
Geneticin-Testmedium genauso schnell und normal keimen wie nicht-transgene
Saatgüter,
die in Geneticin-freiem
Medium wuchsen, mit "++" gekennzeichnet.
-
Tabelle
I. Analyse der regenerierten Pflanze "Peter", geselbstelte Nachkommen (R
1 und R
2), und gekreuzte Nachkommen
(F
1 und F
2)
-
- ++ = normale Vitalität,
normale Morphologie des Pflänzchens;
+ = moderate Vitalität,
normale Morphologie des Pflänzchens;
N/A = entfällt;
F1 = Quantum × Peter; Quantum ist eine nicht-transgene
kommerzielle B. Napus-Art.
-
Einige
R1-Saatgüter
aus der regenerierten Pflanze "Peter" (R0)
keimten normal, wenn diese auf Geniticin-enthaltendem Medium wuchsen,
was die Transformation von Brassica anzeigt (Tabelle I). Einige
R1-Sämlinge,
die die Geneticin-Selektion überlebten,
wurden in Erde überführt, selbstbestäubt, und
die R2-Saatgüter wurden gewonnen. Die meisten
dieser R2-Saatgüter keimten und wuschen auf
Geniticin-enthaltendem
Medium normal und kräftig.
F1 (Quantum × Peter)-Saatgüter keimten
auf Geneticin-enthaltendem Medium normal, jedoch nicht so kräftig, wie
die Geneticin-resistenten R1- oder R2-Saatgüter.
Folglich scheinen die Kopienzahl der NPTII-Nucleinsäure und die heterozygote Natur
der integrierten NPTII-Nucleinsäure
den Spiegel der NPTII-Expression zu beeinflussen. Einige F1-Sämlinge,
die die Geneticin-Selektion überlebten,
wurden in Erde überführt, selbstbestäubt, und
von Quantum x Peter wurden F2-Saatgüter gewonnen
und getestet. Etwa die Hälfte
dieser F2-Saatgüter keimten auf Geneticin-enthaltendem
Medium normal und kräftig.
Eine NPTII-spezifische
PCR-Analyse an R2-Pflanzen ergab ein positives
Signal, wodurch bestätigt
wurde, dass die NPTII-Nucleinsäure
in "Peter" integriert war.
Eine GUS-Färbung
war jedoch in allen Generationen von "Peter" negativ.
-
Beispiel 2 – Brassica-Transformation
unter Verwendung eines Präparationsverfahrens
zur Gewebeverkleinerung
-
Vier
bis sechs Tage alte sterile Sämlinge
der Brassica napus-Sorte Westar wurden geerntet, und der untere
Teil der Hypocotylen, die Samenhülle
und die Wurzeln wurden verworfen. Der verbleibende obere Teil des
Sämlings
enthielt 10 %–50
% des Hypocotyls, zwei Keimblätter
und die Sprossspitze. Dieser obere Teil wurde mit flüssigem Induktionsmedium
zu einem Zellbrei unter Verwendung eines Mixers zerkleinert. Im
Speziellen wurde der obere Teil von etwa 200 Sämlingen mit 30 ml Induktionsmedium
gemischt. Diese Mischung wurde in einem Mischer bei Raumtemperatur
mazeriert (Blender Model 33BL79, Warning Products Division, Dynamics
Corporation of America). Der resultierende Brei wurde über eine
Reihe von Maschen in Gruppen sortiert, die verschiedene Bereiche
von Gewebegrößen aufwiesen.
Die Gruppe mit einer Gewebegröße von 46–230 μm wurde gesammelt
und bei hoher Dichte auf 12 Filtermembranen (4 cm Durchmesser) kultiviert,
die auf einem festen Induktionsmedium platziert wurden. Nach 3 Tagen
der Kultivierung wurden die Filme, die zerkleinertes Gewebe enthielten,
mit Nucleinsäuremolekül-beschichteten
Goldpartikeln bombardiert, wie in Beispiel 1 beschrieben, und für weitere
3 Tage auf Induktionsmedium kultiviert. Die Kulturen wurden dann
für 2–3 Wochen
in Selektionsmedium überführt, gefolgt
von einer Kultivierung auf Regenerationsmedium, bis sich Schösslinge
regeneriert hatten.
-
Regenerierte
Pflanzen wurden auf das Vorhandensein von NPTII-Nucleinsäure analysiert, wie beschrieben
in Beispiel 1. Ferner wurden Teile solcher Pflanzen auf GUS-Expression
analysiert. Kurz, Zellen, die GUS exprimieren, erscheinen nach einem
GUS-Färbeversuch
blau. Der verwendete GUS-Färbeversuch
wurde im Detail von Anne-Marie Stopm in Sean R. Gallagher (ed.),
GUS Protocols: Using the GUS Gene as a Reporter of Gene Expression,
Seiten 103–113,
Academic Press, San Diego, California, 1992, beschrieben. Einige der
regenerierten Schösslinge
und Blätter
zeigten eine starke blaue Färbung
nach der GUS-Färbung,
was die Expression der transferierten fremden GUS-Nucleinsäuresequenzen
anzeigte.
-
Die
regenerierten Pflanzen wurden in Erde überführt und bis zur Reife wachsen
gelassen. Zehn R1-Saatgüter wurden auf Geneticin-Resistenz
durch den Saatgutkeimtest, der in Beispiel 1 beschrieben ist, getestet.
Sechs Saatgüter
zeigten keine Keimung. Zwei der vier verbleibenden Saatgüter waren
Geneticin-resistent, und die resultierenden Pflänzchen zeigten unter solchen
Bedingungen moderate Vitalität
(Tabelle II). Ferner keimten 17 R1-Saatgüter in Abwesenheit
von Geneticin, und ein Blattstück
eines jeden Sämlings
wurde auf GUS gefärbt,
wie oben beschrieben. Elf Saatgüter
hiervon zeigten eine starke blaue Färbung (Tabelle II). Die GUS-Färbung und
NPTII-spezifische PCR-Analyse mit R2-Pflanzen
ergab positive Signale. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse,
dass sowohl das NPTII-Gen als auch das GUS-Gen in das Genom integriert wurden
und erfolgreich auf die Nachkommen übertragen wurden.
-
Tabelle
2. Analyse der regenerierten Pflanzen, die unter Verwendung des
Verkleinerungsverfahrens hergestellt wurden.
-
- + = moderate Vitalität,
normale Morphologie des Pflänzchens;
N/A = entfällt
-
Beispiel 3 – Transformation
von Brassica juncea
-
Die
Brassica juncea-Linie DZJ-01 ist eine proprietäre Linie, die Gewebekultur- und Regenerationseigenschaften
aufweist, die vergleichbar sind mit jenen von anderen Brassica juncea-Linien.
Die Linie DZJ-01 wurde unter Verwendung des in Beispiel 2 beschriebenen
Verfahrens zur Präparation
von zerkleinertem Gewebe erfolgreich transformiert. Da DZJ-01-Gewebe
in Kultur schneller wächst
als Brassica napus-Gewebe, wurden einige Kultivierungsbedingungen
modifiziert. Im Speziellen wurde DZJ-01-Gewebe präpariert
und bombardiert, wie beschrieben in Beispiel 2. Nach der Bombardierung
wurde das Gewebe auf festem Induktionsmedium für sechs Tage wachsen gelassen.
Die Kulturen wurden dann auf ein Flotationsfloßsystem überführt und für acht Tage in flüssigem Selektionsmedium
kultiviert, wobei zu diesem Zeitpunkt das Medium gegen flüssiges Regenerationsmedium
ausgetauscht wurde. Diese beiden flüssigen Medien hatten die gleiche
Zusammensetzung wie die entsprechenden Medien in Beispiel 2, außer, dass
kein Agar verwendet wurde. Das Flotationsfloßsystem umfasste ein LifeRaft-Membran-Floß (Life
Technologies, Cat. No. 10518-017), eine LifeRaft-Flotationseinheit
(Life Technologies Cat. No. 10521-011) und ein Magenta-Gefäß mit LifeGuard
Membrane Vented Lid (Life Technologies Cat. No. 10678-019), und
wurde verwendet, wie von dem Hersteller beschrieben.
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Das
Regenerationsmedium wurde jede Woche erneuert, bis sich grüne Sprossspitzen
entwickelten. Nachdem sich die Schösslinge gebildet hatten, wurden
sie auf festes Regenerationsmedium überführt und dann auf festes hormonfreies
MS-Medium überführt.
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Eine
der regenerierten Pflanzen (als "J.J." bezeichnet) zeigte
eine starke blaue Färbung
in dem oben beschriebenen GUS-Färbeversuch.
Ferner zeigte die PCR-Analyse
unter Verwendung von GUS-spezifischen Primern starke positive Signale,
was anzeigte, dass die GUS-spezifischen Sequenzen vorhanden waren
(Tabelle III). Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass die
eingebrachte DNA in das Genom der R0-Pflanze
integriert wurde. Zum Zeitpunkt der Geschlechtsreife wurde "J.J." selbstbestäubt, und
die R1-Saatgüter wurden gewonnen. Um die
Integration zu bestätigen,
wurden R1-Saatgüter keimen gelassen, und die
resultierenden Pflänzchen
wurden auf GUS-Expression getestet. Einige der R1-Sämlinge zeigten
nach der GUS-Färbung eine
starke blaue Färbung,
was die Integration des GUS-Genes in das Brassica juncea-Genom anzeigte.
Ferner ergab die GUS-Färbung
und die NPTII-spezifische PCR-Analyse mit R2-Pflanzen
positive Signale, was zusätzlich
die Integration der GUS- und
NPTII-Gene in das Brassica juncea-Genom bestätigte.
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Tabelle
III. Analyse der regenerierten Brassica juncea-Pflanzen.
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ANDERE AUSFÜHRUNGSBEISPIELE
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Obwohl
die Erfindung im Zusammenhang mit der detaillierten Beschreibung
hiervon beschrieben wurde, gilt als vereinbart, dass die vorstehende
Beschreibung dazu vorgesehen ist, um zu illustrieren, und nicht um
die Reichweite der Erfindung zu beschränken, die durch den Umfang
der beigefügten
Ansprüche
definiert wird. Weitere Aspekte, Vorteile und Modifikationen liegen
im Umfang der folgenden Ansprüche.