DE69325389T3

DE69325389T3 - Verfahren zur stabilen Transformation von Weizen

Info

Publication number: DE69325389T3
Application number: DE69325389T
Authority: DE
Inventors: Yin-Fu Carrboro CHANG; James Richard Milpitas WONG; Andrea Berkeley ITANO; Stephen J. Union City MEJZA; Leslie San Diego WALKER
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 1992-12-16
Filing date: 1993-12-13
Publication date: 2007-02-08
Anticipated expiration: 2013-12-14
Also published as: WO1994013822A3; GR3031054T3; ES2134925T3; AU688297B2; AU5749394A; DE69325389D1; CA2151127C; EP0674715B1; US5955362A; US5610042A; EP0674715A1; ES2134925T5; DE69325389T2; WO1994013822A2; DK0674715T4; EP0674715B2; ATE181364T1; DK0674715T3; CA2151127A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Transformation und Regenera tion von fruchtbarem transformiertem Weizen.
Weizen ist eine der wichtigsten Getreideanbauten in der Welt. Obwohl er derzeit in einem weiten Bereich von Umgebungen kultiviert wird, erfolgt die am stärksten vorherrschende Produktion von Weizen in den USA, in China, Australien, Kanada, Indien und Europa.
Der Großteil der Weizenproduktion wird als Mehl verbraucht. Brotweizen macht ca. 80 % des Gesamtverbrauchs von Weizen aus.
Die Entwicklung eines effizienten Transformationssystems ist notwen dig für die molekulare Analyse der Genexpression in Pflanzen. In Getreidekulturpflanzen wurde diese Entwicklung durch Schwierigkeiten verlangsamt, die bei der Pflanzenregeneration und bei der Unzugänglichkeit von einkeimblättrigen Pflanzen für die Agrobacterium-vermittelte Transformation angetroffen werden. Der meiste Fortschritt, der in der Transformation von Getreidearten gemacht wurde, war in der Erzeugung von transgenem Reis und Mais. Der Fortschritt bei Weizen wurde durch die Unfähigkeit behindert, geeignete Techniken zur Regeneration von fruchtbaren Pflanzen nach der Transformation zu etablieren.
Es gibt eine Anzahl veröffentlichter Berichte zur transienten Expression von Fremdgenen in Weizen. Jedoch involviert der einzige Bericht über stabil transformierte Weizenpflanzen von Vasil et al. (Biotechnology 10(6); 1992, 667-74) ein arbeitsintensives Verfahren, das Transformanten mit geringer Häufigkeit liefert.
Deshalb besteht ein Bedarf an biotechnologischen Verfahren zur Entwicklung von ertragreichen, nährstoffreichen und krankheitsresistenten Weizensorten. Solche Verfahren sind notwendig zur Ergänzung der derzeit verwendeten herkömmlichen Züchtungsverfahren.
Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zur stabilen Transformation von Weizen mit Nukleinsäuresequenzen von Interesse und zur Regeneration von fruchtbaren transgenen Weizenpflanzen gerichtet. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren zur Herstellung von stabil transformierten fruchtbaren Weizenpflanzen, wobei das Verfahren wie in Anspruch 1 definiert ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden unreife Embryos mit Partikel bombardiert, die mit einer DNA-Sequenz von Interesse beschichtet sind, wobei die Sequenz ein dhfr-Gen umfaßt, die bombardierten Embryos werden auf Medium kultiviert, das Methotrexat enthält, um transformiertes Gewebe zu selektieren, und fruchtbare transformierte Pflanzen werden aus dem transformierten Gewebe regeneriert. Die Weizenembryos werden unter Verwendung von Hochgeschwindigkeits-Mikroprojektilbombardierung transformiert, und stabil transformierte Pflanzen werden regeneriert. Das Verfahren erzeugt stabil transformierte fruchtbare Weizenpflanzen, die Nachkommenschaft erzeugen können, die stabil transformiert ist und das Fremdgen von Interesse exprimiert.
Ein schnelles hocheffizientes Verfahren zur stabilen Transformation von Weizenembryos und Regeneration von transgenen Weizenpflanzen wird bereitgestellt. Das Verfahren involviert die stabile Transformation eines unreifen Weizenembryos und Regeneration von Weizenpflanzen aus transformierten Weizenembryos. Zusätzlich können unter Verwendung der Verfahren der Erfindung fruchtbare transgene Weizenpflanzen zur Reife mit hoher Häufigkeit kultiviert werden. Die fruchtbaren transformierten Pflanzen können transformierte Nachkommenschaft erzeugen, die das (die) Fremdgen(e) exprimiert.
Das Verfahren involviert das Unterwerfen von unreifen Weizenembryos der Hochgeschwindigkeits-Projektilbombardierung unter Verwendung von Nukleinsäure oder insbesondere Genen von Interesse.
Insbesondere werden Ähren von im Gewächshaus kultivierten Weizenpflanzen ca. 10 bis 16 und allgemein ca. 12 Tage nach der Blütezeit gesammelt. Körner werden von den Ähren getrennt und oberflächensterilisiert. Embryos werden dann ausgeschnitten und auf Wachstumsmedium ausplattiert. 0 bis 10 Tage nach dem Ausschneiden wird DNA auf den Embryo unter Verwendung einer Partikelbombardierungsvorrichtung übertragen. Nach der DNA-Übertragung wird der Embryo oder der sich entwickelnde Kallus ohne Selektionsdruck aufrechterhalten, und dann wird das Gewebe in Gegenwart von Selektion regeneriert.
Es wird durchgehend in den Schritten der Erfindung erkannt, daß das Verfahren die Kultivierung von unreifen Embryos oder sich entwickelndem Kallus auf Gewebekulturmedium involviert. Allgemein nützlich im hier durchgehend beschriebenen Verfahren ist die Verwendung eines Basismediums, das Mikronährstoffe, Makronährstoffe, eine Kohlenstoffquelle, Eisen, Vitamine und Pflanzenwachstumsregulatoren umfaßt. Pflanzenwachstumsregulatoren sind fachbekannt und schließen Auxine, Cytokinine und Gibberilline ein. Solche Regulatoren können vom Schritt im Verfahren und dem besonderen verwendeten Weizen-Genotyp abhängen.
In der Erfindung nützliche Pflanzenwachstumsregulatoren schließen diejenigen mit auxinartigen Funktionen wie IAA, NAA, 2,4-D, 2,4,5-T, Dicamba, p-Chlorphenoxyessigsäure und dgl. ein. Solche Regulatoren können zum maltosehaltigen Medium in einer Menge von ca. 0,5 bis ca. 100 mg/l, bevorzugt ca. 1 bis ca. 40 mg/l und am meisten bevorzugt ca. 2 bis ca. 10 mg/l gegeben werden.
Die zu transformierenden unreifen Embryos werden mit einer Bombardierungsvorrichtung mit hoher Partikelzahl bombardiert. Die Partikelbombardierung liefert ein schnelles Transformationsverfahren. Siehe allgemein Finer et al. (1992) Plant Cell Reports 11: 323-328; Christou P. (1990), Physiologia Plantarum 79:210-212; Wang et al. (1998), Plant Molecular Biology 11:433-439; Daniell et al. (1991), Plant Cell Reports 9:615-618; Klein et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4305-4309; Klein et al. (1987) Nature 327: 70-73; Gordon-Kamm et al. (1990), The Plant Cell 2:603-618; Oard et al. (1990) Plant Physiol. 92:334-339; Sanford J.C. (1990), Physilogia Plantarum 79:206-209; Fromm et al. (1990), Bio/Technology 8:833-839; Christou et al. (1988), Plant Physiol. 87:671-674; Sautter et al. (1991), Bio/Technology 9:1080-1085; Iida et al. (1990), Theor. Appl. Genet. 80:813-813; und Christou et al. (1991), Bio/Technology 9:957-962.
Während mehrere Partikelbombardierungsvorrichtungen in der Literatur offenbart werden, ist eine bevorzugte Vorrichtung die Partikelkanone, die in WO 93/07256 offenbart wird, hier durch Verweis eingeführt. Eine solche offenbarte Partikelkanone kann Partikel, die genetisches Material tragen, in eine große Vielzahl von Zellen einführen. Die Kanone umfaßt:

– einen gleitenden Block zur Beschleunigung und Ausrichtung von Partikeln, die genetisches Material tragen;
– eine von Inertgas angetriebene Abschußvorrichtung, die zur genauen Geschwindigkeitskontrolle des gleitenden Blocks fähig ist;
– eine Stopp/Abstreifanordnung zum Anhalten des gleitenden Blocks und Erlauben des freien Flugs der mit dem genetischen Material beschichteten Partikel auf intakte Zellen; und
– Bedienungsschlösser und Sicherheitsmerkmale.

Die Kanone hat einen schnellen Abschußzyklus sowie eine durchgehende Kraft und Genauigkeit der abgefeuerten Schüsse. Die Kanone liefert eine kontrollierte, reproduzierbare, einstellbare und sichere Vortriebsquelle. Ein zusätzlicher Nutzen der in WO 93/07256 offenbarten Kanone besteht darin, daß die Kanone weniger DNA für die Bombardierung als andere fachbekannte Vorrichtungen benötigt. Jedoch sind andere Vorrichtungen zur Bombardierung von Pflanzenzellen, wie zum Beispiel das mit Helium angetriebene Beschleunigungssystem (Sanford et al., Technique – J. Meth. in Cell und Molec. Biol. 3:3-16, 1991), gleichsam bevorzugt.
Allgemein werden die Embryos wenigstens einmal beschossen. Jedoch können mehrfache Beschüsse der Embryos zur Steigerung der Transformationshäufigkeit durchgeführt werden. Somit stellt das Unterwerfen der Embryos mehrfachen Beschüssen durch mit DNA beschichtete Partikeln eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar. Ca. zwei Schüsse pro Transformation haben die besten Ergebnisse gezeigt.
Die als DNA-Träger in den Bombardierungen verwendeten Partikel hatten allgemein einen Durchmesser von ca. 0,5 bis ca. 2,0 μm, insbesondere ca. 1,0 μm. Die Partikel werden mit wenigstens ca. 0,5 bis ca. 2,0 μg, bevorzugt mit ca. 1 μg DNA pro Gewicht der Partikel beschichtet. In der Erfindung nützliche Partikel sind handelsüblich. Zum Beispiel können Goldpartikel von BioRad Company verwendet werden.
Die Partikelkanone aus WO 93/07256 erlaubt die Kontrolle des Drucks. Ein Druck im Bereich von ca. 500 bis ca. 2500 psi, bevorzugt ca. 1900 psi kann verwendet werden.
Die Embryos können einer Plasmolysebehandlung vor der Bombardierung, nach der Bombardierung oder bevorzugt sowohl vor als auch nach der Bombardierung unterworfen werden. Die Plasmolysebehandlung kann durch Verdünnen von Embryos in einem flüssigen Medium mit hinzugegebenem Osmotikum oder durch Überführen der Embryos auf halbfestes Medium, das ein Plasmolysemittel enthält, durchgeführt werden. Allgemein kann das Osmotikum jeder Zucker wie Sorbit, Mannit, Saccharose und dgl. sein. Das Wachstumsmedium kann zusätzlich Auxin umfassen.
Nach der Bombardierung werden die Embryos für mehrere Tage in der Dunkelheit auf Wachstumsmedium mit Auxin kultiviert. Die Embryos werden für 1 bis 10 Wochen, insbesondere 1 bis 7 Wochen kultiviert, bevor sie dem Selektionsdruck unterworfen werden.
Eine Anzahl von Selektionsmitteln und Resistenzgenen sind fachbekannt (siehe zum Beispiel Hauptmann et al. (1988), Plant Physiol. 86; 602-606; Dekeyser et al. (1988), Plant Physiol. 90: 217-223; Eichholz et al. (1987), Somatic Cell and Molecular Genetics 13: 67-76; Meijer et al. (1991), Plant Molecular Biology 16: 807-820; und Dekeyser et al. (1989) 90: 217-223). Inhibitoren wie Aminoglycosid-Antibiotika, die mit der Translationsmaschinerie von prokaryontischen und eukaryontischen Zellen wechselwirken, können verwendet werden. Solche Inhibitoren schließen Kanamycin, G418, Hygromycin etc. ein. Solche Inhibitoren können durch Phosphorylierungsreaktionen inaktiviert werden, die durch die Produkte entweder des Tn 5 Neomycinphosphotransferase II (npt-II)-Gens oder des Hygromycin B-Resistenzgens aus E. coli vermittelt werden (siehe zum Beispiel Herrera-Estrella et al. (1983) EMBO J. 2: 987-995; Waldron et al. (1985), Plant Mol. Biol. 5: 103-108; und darin zitierte Verweise).
Zusätzlich können Selektionsmittel wie Bleomycin, Methotrexat und Phosphinothricin verwendet werden. Vorteilhafte Ergebnisse wurden unter Verwendung von Methotrexat erreicht. Methotrexat bindet an das katalytische Zentrum des Dihydrofolatreduktase-Enzyms, was zu einem Mangel an Thymidylat und anschließendem Zelltod führt (Weikheiser W.C. (1961), J. Biol. Chem. 236: 888-893). Berichte in der Literatur weisen darauf hin, daß chimäre Konstrukte, die ein bakterielles oder Mäuse-dhfr-Gen enthalten, Resistenz gegen geringe Mengen von Methotrexat in transformierten Tabak-, Rüben-, Petunien- und Reispflanzen verleihen können (siehe DeBlock et al., EMBO J. 3: 1681-1689; Brisson et al., Nature 310: 511-514; Eichholtz et al. (1987), Somatic Cell and Molecular Genetics 13: 67-76; und Dekeyser et al. (1989), Plant Physiol. 90: 217-223). Medien, die Methotrexat oder Hygromycin umfassen, sind bevorzugte Medien für den Selektionsschritt, der an der Kultivierung von transformiertem Gewebe beteiligt ist.
Eines der Haupthindernisse für die Produktion von transformierten Weizenpflanzen waren Verfahren zur Regeneration von Pflanzen aus transformierten Geweben. Allgemein wird für die Pflanzenregeneration transformierter Kallus auf entweder einem hormonfreien Medium, das Saccharose enthält, oder einem Medium, das ein Cytokin enthält, oder einem Medium, das Auxin und Gibberillin enthält, kultiviert. Die Kalluskulturen werden in das Licht überführt. Die Pflanzenentwicklung wird auf einem hormonfreiem Medium oder Medium mit Auxin fortgesetzt. Nach der Entwicklung von Wurzeln und Schößlingen werden die Pflänzchen auf Boden übertragen und zur Reife kultiviert.
In mehreren Stufen entlang des Prozesses wird DNA aus dem Gewebe (Kallus und Pflanze) extrahiert und zur Bestätigung der Transformation sondiert. Verfahren sind auf diesem Gebiet für die Isolation von DNA aus Kallus und Geweben sowie zur Bestätigung der Gegenwart von DNA von Interesse verfügbar. Solche Verfahren zur Bestätigung schließen die PCR-Analyse sowie die Southern-Hybridisierung ein. Siehe E.M. Southern (1975), J. Mol. Biol. 98-503 und Mullis, K.B. (1987), Meth. in Enzymology 155:335.
Wie für einen Fachmann ersichtlich sein wird, kann jetzt, da ein Verfahren zur stabilen Transformation von Weizen bereitgestellt wurde, jedes Gen von Interesse in den Verfahren der Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel kann eine Weizenpflanze manipuliert werden, um Krankheits- und Insektenresistenzgene, Gene die Nährwert verleihen, Gene zur Verleihung von männlicher und/oder weiblicher Sterilität, Antipilz-, antibakterielle oder antivirale Gene und dgl. zu exprimieren. Gleichsam kann das Verfahren verwendet werden, um beliebige Nukleinsäure zu übertragen, um die Genexpression zu kontrollieren. Zum Beispiel könnte die zu übertragende DNA Antisense-RNA codieren.
Unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren werden transformierte Kalluslinien mit einer höheren Effizienz im Vergleich mit anderen veröffentlichten Berichten erhalten. Tatsächlich kann bis zu 50 % Effizienz beobachtet werden, wie durch PCR und/oder Southern-Analyse bestätigt. Transformationsexperimente liefern routinemäßig stabile Transformanten mit einer Häufigkeit von so viel ca. 50 % auf Basis der Anzahl von Transformanten, die pro Anzahl von Zielbeschuß erhalten werden. Außerdem erweisen sich unter Verwendung von Methotrexat-Selektion regenerierte Pflanzen als positiv für die Transformation.
Verbesserte embryogene Kulturen von Weizen können unter Verwendung von zuvor regeneriertem Material als Quelle des Ausgangsmaterials erhalten werden. Solche verbesserten Kulturen werden als "recyclierte Linien" bezeichnet, da sie durch den Gewebekulturprozeß mehr als einmal "cycliert" sind. Das Ausgangsmaterial für diese verbesserten Kulturen kann entweder unreife Embryos sein, die direkt aus regenerierten Pflanzen erhalten werden, oder das Ausgangsmaterial kann Samen aus regenerierten Pflanzen sein, die als Quelle für unreife Embryos kultiviert werden. Die so abgeleiteten embryogenen Kulturen haben eine verbesserte Starthäufigkeit und Fruchtbarkeit von Regeneranten im Vergleich zu herkömmlichen, nicht-recyclierten Linien. Diese Verbesserungen erhöhen signifikant die Leichtigkeit und Effizienz, mit der transgener Weizen und seine Nachkommenschaft erhalten werden.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt Weizenkallus Typ II, der aus unreifen Embryos induziert ist.
2 zeigt Weizenkallus Typ M, der aus unreifen Embryos induziert ist.
Beispiele:
I. Herstellung von Weizenkallus, Genotyp UC703
Weizenpflanzen des Genotyps UC703 wurden zur Blüte kultiviert und selbstbestäubt. Ähren, die Embryos mit einer Länge von 1 bis 2,5 mm enthielten, wurden aus den Pflanzen entfernt und mit 10 % Clorox-Lösung für 10 Minuten sterilisiert. Embryos wurden aus den unreifen Samen entfernt und mit der Embryoachse nach unten auf das Murashige-Skoog-Medium plaziert, das 5 oder 10 mg/l 2,4-D, 13,7 % G/V Maltose, 100 mg/l Prolin und 100 mg/l myo-Inosit enthielt, verfestigt mit 0,7-0,8 % G/V Phytagar oder 0,1-0,2 % Gelrite (Startmedium). Nach einer dreiwöchigen Kultur in der Dunkelheit bei 27°C wurde ein bevorzugter Kallus durch die Gegenwart von wohlgeformten globulären, somatischen Embryos (Kallus Typ M) erkannt, die sich auf dem Scutellum bestimmter Explantate entwickelten. Diese Kalli wurden entfernt und entweder auf MS-Medium, das 1,0 bis 5,0 mg/l 2,4-D und 2-3 % Saccharose enthielt, oder auf ein Medium plaziert, das eine reduzierte Menge (5 %) von Maltose enthielt, bevor sie auf das Saccharosemedium plaziert wurden. Das Material wurde dann jede Woche auf frischem MS-Medium, das 3 % Saccharose enthielt, subkultiviert.
II. Genotypische Reaktion von Weizen in der Typ M Kallusinduktion
Weizenpflanzen vom Genotyp UC703, MIT, Orofen, Yecoro rojo und Chris wurden zur Blüte kultiviert und selbstbestäubt. Unreife Embryos wurden aus Ähren entfernt und auf Murashige-Skoog-Medium, das folgendes enthielt:
1 mg/l 2,4-D plus 2 % Saccharose (1MS),
1 mg/l 2,4-D plus 2 % Maltose (1MS2M),
1 mg/l 2,4-D plus 9 % Maltose (1MS9M),
1 mg/l 2,4-D plus 13,7 % Maltose (1MS13, 7M) oder
1,0 mg/l 2,4-D plus 13,7 % Maltose (10MS13, 7M)
zur Induzierung von Typ M-Kallusbildung kultiviert. Nach drei Wochen Kultur in der Dunkelheit bei 27°C wurden die Induktionshäufigkeit (%) von Typ M-Kallus, Typ I-Kallus sowie nicht-morphogenen Strukturen aus den unreifen Embryos der untersuchten Genotypen bewertet.
III. Typ M-Kallusinduktionshäufigkeit von Weizen Genotyp UC703
Weizenpflanzen vom Genotyp UC703 wurde zur Blüte kultiviert und selbstbestäubt. Unreife Embryos wurden aus den Ähren entfernt und mit der Embryoachse nach unten auf Murashige-Skoog-Medium (MS) plaziert, das 5 oder 10 mg/l 2,4-D und 13,7 % G/V Maltose enthielt, verfestigt mit 0,8 % Phytagar. Nach 3 Wochen Kultur in der Dunkelheit bei 27°C wurde die Typ M-Kallusinduktionshäufigkeit aus den kultivierten unreifen Embryos bewertet.
IV. Zellvorbereitung zur Bombardierung
Die Zellen zur Bombardierung wurden einer Plasmolysebehandlung vor und nach der Bombardierung unterworfen. Das gepackte Zellvolumen wurde gemessen, und die Zellen wurden in IMS-Flüssigmedium mit hinzugegebenem Osmotikum verdünnt: 0,4 M Sorbit für Suspensionszellen und 0,6 M Sorbit für Kalluszellen. Die Zellen wurden so verdünnt, daß das fertige gepackte Zellvolumen pro Ziel 1/20 ml für eine feine Suspension und 1/10 ml für Kallus betrug. Verdünnte Zellen wurden in einen 250 ml-Kolben gegeben, der einen Rührstab enthielt, und für mindestens 30 Minuten bis hin zu einigen Stunden gerührt. Zum Ausplattieren der Zellen wurden 2 ml aus dem Kolben abgezogen und auf einen Vakuumkolben pipetiert, auf den ein Whatman 2,5 cm-GFA-Filter gegeben worden war. Das Vakuum wurde angelegt, bis die Zellen auf dem Filter getrocknet waren. Die Filter wurden auf 60 × 15 mm-Petrischalen gegeben, die 5 ml von festem Post-Bombardierungsplasmolysemedium enthielten, das 1MS ist, das 0,2 M Sorbit für Suspensionszellen oder 0,4 M Sorbit für Kalluszellen enthält. Zwei Filter wurden auf jede Schale ausplattiert.
V. Für die Bombardierung verwendete Vektoren
Die folgenden Plasmide wurden für die Partikelbombardierung verwendet:
pSOG30 ist ein aus Plasmid pBl121 stammender β-Glucuronidase-(Gus)-Expressionsvektor, erworben von Clontech Laboratories, Palo Alto, Kalifornien. Intron 6 des Mais-Adh1-Gens wurde durch PCR aus Plasmid pB428 amplifiziert, beschrieben in Bennetzen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 81: 4125-4128 (1987), und in den BamHI-Ort von pBl121 ligiert, der zwischen dem CaMV 35S-Promotor und dem Gus-Gen ist. Eine 17 bp-Leitsequenz aus dem chlorotischen Maisscheckungsvirus (MCMV), beschrieben in Lommel et al., Virology 181: 382-385 (1991) wurde in die nicht-translatierte Leitsequenz des 35S-Gus-Gens inseriert. Die fertige Genfusion enthält die Struktur 35S- Promotor-Adh1-Intron 6-MCMV-Leitsequenz-Gus-Nos-Terminator, alle im pUC19-Vektorgerüst.
pSOG35 ist ein Dihydrofolatreduktase-(dhfr)-Expressionsvektor. Dieses Konstrukt wurde abgeleitet durch Fusionieren des 35S-Promotors, Adh1-Intron 6 und der MCMV-Leitsequenz, wie oben beschrieben, an das dhfr-Gen aus Plasmid pHCO, beschrieben in Bourouis and Jarry, EMBO J. 2: 1099-1104 (1983). Die fertige Genfusion enthält die Struktur 35S-Promotor-Adh1-Intron 6-MCMV-Leitsequenz-dhfr-Nos-Terminator, alle im pUC19-Vektorgerüst.
pTG48 umfaßt das Gus-Gen unter der Kontrolle des staubbeutelspezifischen ant43D-Promotors und ein dhfr-Gen in einem pUC19-Gerüst. Es ist das Ergebnis aus der Kombination von 4 unterschiedlichen DNA-Fragmenten. Fragment 1 wurde aus pSOG35 nach Restriktionsschneiden mit HindIII und EcoRI erhalten. Das EcoRI-Ende des isolierten Fragments, das das dhfr-Gen enthält, wurde an ein SalI-Restriktionsende angepaßt. Fragment 2 bestand aus dem staubbeutelspezifischen ant43D-Promotor, isoliert aus Plasmid pCIB 31778 nach Restriktionsschneiden mit HindIII und XbaI. Plasmid pCIB 3178 wird im Detail in der europäischen Patentanmeldung Nr. 93810455.1 beschrieben, deren relevante Teile hier durch Verweis eingeführt werden, und wurde unter der Eingangs-Nr. NRRL B-18978 hinterlegt. Fragment 3 wurde aus Plasmid pSOG30 nach Restriktionsschneiden mit XbaI und EcoRI erhalten und enthielt das Gus-Gen, und Fragment 4 entsprach dem handelsüblichen Vektor pUC19, geschnitten mit SalI und EcoRI.
VI. Partikelzubereitung
Goldpartikel (1,0 μm; von Bio-Rad) wurden durch Aufteilen in ein Mikrozentrifugenröhrchen, Zugeben von ~1 ml 100%igem Ethanol, Verwirbeln, Auszentrifugieren, Entfernen des Überstands und zweimaliges Wiederholen mit sterilem Wasser gewaschen. Nach der letzten Spülung wurde so viel Wasser wie möglich entfernt, und Polylysin-Lösung (0,02 % Polylysin + 15 mM Ammoniumacetat) wurde zur vollständigen Bedeckung der Partikel hinzugegeben. Die Partikel wurden verwirbelt, auszentrifugiert und der Überstand entfernt. Die Partikel wurden über Nacht in einem Abzug mit laminarem Luftzug oder für 30 Minuten unter einem vorsichtigem Stickstoffstrom trocknen gelassen.
Für eine "vollständige" Partikelzubereitung wurden 10 mg Partikel ausgewogen und in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, das einen Rührstab enthielt. 100 μl (1 μg/μl) DNA wurden hinzugegeben, gefolgt von Verwirbeln. Dann wurden 10 μl 100 mM Na₂HPO₄ hinzugegeben, gefolgt von Verwirbeln. 10 μl 100 mM CaCl₂ wurden hinzugegeben, gefolgt von Verwirbeln. Schließlich wurden 380 μl 100%iges Ethanol hinzugegeben, gefolgt von Verwirbeln. Während die Suspension kräftig gerührt wurde, wurden 3 μl auf Kunststoffträger (Projektile) pipettiert. Die Partikel wurden auf den Trägern für wenigstens 15 Minuten vor der Bombardierung trocknen gelassen.
VII. Bombardierung von Zellkulturen
Die Petrischale, die die Zellfilter enthielt, wurde auf die Plattform auf dem Ständer umgedreht und über der Partikelflugöffnung zentriert. Der klare Deckel wurde über die Oberseite der Plattform plaziert. Ein Mikroprojektil wurde auf den Verschlußstift plaziert und der Verschluß geschlossen. Der "Spann"-Knopf wurde gedrückt, um das Rservoir mit der entsprechenden Menge an Heliumgas zu füllen (gewöhnlich 1800-1900 psi). Das Vakuum in der Kammer wurde auf ~27 mm eingestellt. Nachdem das Vakuum abgestellt worden war, wurden die "Spann"- und "Feuer"-Knöpfe gedrückt. Der "Spann"-Knopf wurde dann in die "Aus"-Position geschoben. Jeder Filter wurde gewöhnlich zweimal beschossen.
VIII. Post-Bombardierungskultur und Selektion
Nach der Bombardierung wurden die Zellen über Nacht in der Dunkelheit gehalten. Am nächsten Tag wurden die Filter aus dem Plasmolysemedium entfernt und auf 1 MS-Medium plaziert. Die Selektion wurde 7 bis 10 Tage nach der Bombardierung für Suspensionszellen und nach 14 Tagen für Kalluszellen eingesetzt. Die Zellen wurden von den Filtern abgeschabt und auf der Oberfläche von Platten ausgebreitet, die 1MS plus 2 mg/l Methotrexat enthielten. (Transformanten wurden auch durch anfängliches Selektieren mit 4 mg/l Methotrexat erhalten.) Die Platten wurden in der Dunkelheit für mehrere Wochen inkubiert. Resistente Kolonien, die nach einigen Wochen entstehen, wurden auf 1 MS + 4 mg/l Methotrexat überführt. Kolonien, die sich für ca. 3-4 Wochen weiter vermehren, werden dann auf "0,5MS"-Erhaltungsmedium überführt, das eine wäßrige Lösung von MS-Salzen, Vitaminen, Eisen, 3 % Saccharose, 0,7 % Agar und 0,5 mg/l 2,4-D ist. Das Gewebe wurde zweiwöchentlich auf diesem Medium subkultiviert, bis embryogene Strukturen erschienen oder das Gewebe zur Regeneration geeignet erschien.
IX. Regeneration
Gewebe wurde auf MS-Medium überführt, das entweder 3 mg/l BAP oder 1 mg/l NAA + 5 mg/l GA enthielt, und die Platten wurden in das Licht überführt. Nach 2-4 Wochen wurde Gewebe auf MS-Medium ohne Hormone überführt. Schößlinge, die erschienen, wurden in Behälter mit entweder MS-Medium ohne Hormone oder MS-Medium mit 0,5 mg/l NAA plaziert. Wenn ausreichend Wurzel- und Schößlingswachstum erfolgt war, wurden die Pflänzchen in den Boden überführt und in eine Klimakammer gesetzt.
X. Transformantenanalyse
Ca. 20 mg Kallusgewebe wurden für die PCR-Analyse verwendet. DNA wurde unter Verwendung eines schnellen Phenol/Chloroform:Isoamylalkohol-Verfahrens extrahiert, und 2 μl wurden pro Reaktion verwendet. Primer wurden zur Amplifikation der Region aus dem 5'-Ende des adh-Gens bis zum 3'-Ende des dhfr-Gens geschaffen.
XI. Transformation von Weizen durch Mikroprojektilbombardierung von aus Typ M-Kallus abgeleitetem Typ II-Kallus
Aus Typ M-Kallus abgeleiteter Typ II-Kallus wurde aus unreifen Embryos des Frühjahrsweizen vom Genotyp UC703 unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren erhalten. Die als UC703-0612 bezeichnete resultierende Kalluslinie war bröckelig, embryogen und wurde seriell in vitro vermehrt. Eine Mikroprojektilvorrichtung wurde zur Übertragung von DNA auf den Typ II-Kallus verwendet. pSOG30 und pSOG35 wurden auf Goldpartikel von Mikrometergröße kopräzipitiert und in Pflanzenzellen eingeführt.
Zwei Wochen nach der Bombardierung wurden die Zellen auf Kallus-Erhaltungsmedium übertragen, das 4 mg/l Methotrexat enthielt. Resistente Kolonien, die sich vermehrten, wurden über einen Zeitraum von Monaten subkultiviert und dann in Abwesenheit von Methotrexat regeneriert. PCR-Analyse erfolgte an Kallusproben zur Bestätigung der Gegenwart des dhfr-Gens. Eine Kolonie, SJ3-2A, erzeugte eine T₀-Pflanze (SJ3-2A-1) in vitro, die schließlich auf Boden übertragen und im Gewächshaus kultiviert wurde. Blattproben aus dieser Pflanze wurden auf Gus-Enzymaktivität unter Verwendung von Standardprotokollen (Jefferson, Plant Molecular Biology Reporter Bd. 5, Nr. 4, 1987) untersucht und waren positiv. DNA wurde aus dieser Pflanze extrahiert, und eine Southern-Analyse bestätigte die Gegenwart des dhfr-Gens.
Pflanze SJ3-2A-1 wurde zur Reife in einem Gewächshaus kultiviert und mit Pollen vom Wildtyp aus UC703-Pflanzen bestäubt. Zwei Samen entwickelten sich, aus denen unreife Embryos ausgeschnitten und gekeimt wurden. Ein gewonnener Embryo erzeugte eine T₁-Pflanze (bekannt als RE1), während der zweite gewonnene Embryo auf Kallusinduktionsmedium plaziert wurde und anschließend 10 T₁-Pflanzen erzeugte, von denen zwei als RE2 und RE3 bekannt sind. Blattproben aus RE1 wurden auf Gus-Enzymaktivität untersucht und waren positiv. Eine PCR-Analyse auf Gegenwart von 35S-Promotorsequenzen erfolgte an RE1, RE2 und RE3, und alle drei Pflanzen waren positiv. Eine Southern Analyse erfolgte zur Sondierung auf Gegenwart des Gus-Gens in diesen drei Nachkommenschaftspflanzen, und alle drei waren positiv für das Gen. T₁-Pflanzen RE1, RE2 und R3 (auch als RE2B) bekannt, wurden mit UC703-Pollen vom Wildtyp bestäubt, um T₂-Pflanzen zu erzeugen. Viele Samen entwickelten sich auf jeder Pflanze und unreife Embryos wurden gewonnen und in vitro gekeimt. Fluorimetrische Gus-Tests wurden durchgeführt, und Transformanten wurden aus einer aufspaltenden Population identifiziert.
XII. Transformation von Weizen durch Mikroprojektilbombardierung von unreifen Embryos und Isolation von Transformanten ohne Verwendung eines selektierbaren Markers oder Selektionsmittels
Unreife Embryos vom Genotyp UC703 mit einer Länge von 0,75-1,5 mm wurden ausgeschnitten und auf MS-Medium, das 5 mg/l 2,4-D und 3 % Saccharose enthielt, mit 30 Embryos pro Platte ausplattiert.
Zwei Plasmide wurden auf Goldpartikel von Mikrometergröße kopräzipitiert und in Pflanzenzellen durch die DuPont Biolistics-Vorrichtung unter Verwendung von Standardtechniken, wie sie im Betriebshandbuch veröffentlicht sind, eingeführt. Ein Plasmid, pCIB3089, enthält den Blumenkohlmosaikvirus 35S-Promotor (Nature 313:810-812, 1985), fusioniert an die cDNA aus dem Maisanthocyanin-regulatorischen Gen B-peru (Plant. Mol. Biol. 17:127-130, 1991 und Genes and Development 6:846-875, 1992), wobei Intron #2 aus dem Alkoholdehydrogenase 1-Gen (Nucleic Acid Research 12:3983-4000, 1984) zwischen dem 3'-Ende der codierenden Sequenz und 5' zur 35S-Terminatorsequenz plaziert ist. Das andere Plasmid, pCIB4436, enthält den CaMV 35S-Promotor (Nature 313:810-812, 1985), fusioniert an die cDNA aus dem Mais-Anthocyanin-regulatorischen Gen C1 (EMBO Journal 9:2517-2522, 1990; Genes and Development 5:298-309, 1991; und Genes and Development 6: 864-875, 1992), wobei Intron #9 aus dem Mais-PEP-Carboxylase-Gen (Plant Mol. Biol. 12:579-589, 1989) zwischen dem 3'-Ende der codierenden Sequenz und 5' zum 35S-Terminator plaziert ist. Zusammen funktionieren diese zwei Gene als bewertbarer Marker für die Transformation.
Nach 22 Tagen wurden die Embryos auf Typ I-Kallusreaktion bewertet, und Kallus wurde auf ein Proliferationsmedium überführt. 20 der 49 Embryos zeigten eine Typ I-Kallusreaktion. Gewebe aus 11 der 20 reagierenden Embryos wurde auf Pflanzenregenerationsmedium ca. 1 Monat später überführt. 11 Pflanzen wurden zur Reife im Gewächshaus kultiviert, und alle Pflanzen setzten Samen an. Eine Pflanze (JN11-1800-3#1) erzeugte rötlich gefärbtes Saatgut, vermutlich verursacht durch Expression eines oder mehrerer der inserierten regulatorischen Gene. 5 DNA-Proben wurden aus dieser Pflanze erhalten, und die PCR-Analyse erfolgte zur Überprüfung auf Gegenwart des 35S-Promotors, des C1-Gens und des B-peru-Gens. Die PCR-Ergebnisse waren positiv für diese Sequenzen in drei unabhängigen Reaktionen.
Zur Analyse der T₁-Generation wurden 57 unreife Embryos aus diesen PCR-positiven Pflanzen ausgeschnitten, gekeimt und analysiert. Darunter waren 41 T₁-Pflanzen PCR-positiv für sowohl das B-peru als auch das C1-Gen. 22 aus Saatgut stammende T₁-Pflanzen wurden auch als PCR-positiv für diese Gene festgestellt. Eine Southern-Analyse erfolgte an den Elternpflanzen und 3 PCR-positiven T₁-Nachkommen. Alle waren positiv für B-peru und negativ für C1 gemäß dieser Analyse. Die T2-Generation wurde im Gewächshaus zur Saatguterzeugung kultiviert.
XIII. Transformation von Weizen durch Mikroprojektilbombardierung von unreifen Embryos unter Verwendung eines Plasmolyseschrittes mit hoher Saccharosekonzentration vor der Genübertragung
Unreife Embryos (0,75-1,0 mm Länge) des Weizen-Genotyps UC703 wurden auf Murashige-Skoog-Medium (Physiologia Plantarum 15: 473-497, 1962) ausplattiert, das 3 mg/l 2,4-D und 3 % Saccharose enthielt. 20 Embryos wurden auf jede Platte mit Medium plaziert. 3 Tage später wurden die unreifen Embryos auf das gleiche Medium übertragen, das jedoch zusätzlich 15 % Saccharose enthielt, um das Gewebe vor der Genübertragung zu plasmolysieren.
Die Plasmide pAct1-D (The Plant Cell 2:163-171, 1990) und pSOG35 wurden auf Goldpartikeln von Mikrometergröße unter Verwendung von Standardverfahren präzipitiert. Jede Platte mit Embryos wurde zweimal mit der Heliumvorrichtung DuPont Biolistic unter Verwendung eines Berstdrucks von 900 psi beschossen. Insgesamt vier Zielplatten wurden unter Verwendung des Standardtiters mit 80 mesh bombardiert, und vier Platten wurden ohne das eingebaute Gitter beschossen. Ca. 4 Stunden nach der Bombardierung wurden die Embryos zurück auf Murashige-Skoog-Medium, das 3 % Saccharose enthielt, überführt. Ca. einen Monat später wurden die Embryo-Explantate mit sich entwickelndem embryogenem Kallus auf Regenerationsmedium überführt (Murashige-Skoog + 1 mg/l NAA, 5 mg/l GA), das ferner 2 mg/l Methotrexat als Selektionsmittel enthielt. Nach ca. 1 Monat wurden sich entwickelnde Schößlinge auf als "GA7s" bekannte größere sterile Behälter übertragen, die halbkonzentrierte Murashige-Skoog-Salze, 2 % Saccharose und 2 mg/l Methotrexat enthielten.
DNA wurde aus vier wie beschrieben isolierten und kultivierten Pflanzen extrahiert. Die PCR-Analyse auf Gegenwart des 35S-Promotors zeigte, daß zwei Pflanzen positiv waren. Diese transgenen Pflanzen wurden als SJ30-44 und SJ30-121 bezeichnet. Die Pflanze SJ30-121 wurde auf Gus-Aktivität untersucht und erwies sich als stark positiv. Die Pflanzen wurden auf Erde zur Vermehrung im Gewächshaus übertragen. Fruchtbare transformierte Pflanzen wurden erhalten.
XIV. Transformation von Weizen durch Mikroporjektilbombardierung von unreifen Embryos unter Verwendung eines Plasmolyseschrittes mit hoher Maltose-Konzentration vor der Genübertragung
Unreife Embryos (0,75-1,0 mm Länge) vom Genotyp UC703 wurden auf Murashige-Skoog-Medium ausplattiert, das 3 mg/l 2,4-D und 3 % Saccharose enthielt. Nach ca. 4 Stunden wurden die Embryos mit der Embryoachse nach unten auf Platten ausplattiert, die Murashige-Skoog-Medium mit 15 % Maltose, 3 % Saccharose und 3 mg/l 2,4-D enthielten, überschichtet mit einem auf Filterpapier geträgerten Block von Agarose, der die gleichen Komponenten enthielt. Man ließ die Embryos für 2-3 Stunden vor der Bombardierung plasmolysieren.
DNA als pAct1-D (The Plant Cell 2: 163-171, 1990) und pSOG35 wurde auf Goldpartikel von μm-Größe unter Verwendung von Standardverfahren präzipitiert. Vier Zielplatten mit 20 Embryos pro Ziel wurden zweimal mit der Heliumvorrichtung DuPont Biolistics unter Verwendung eines Berstdrucks von 1100 psi beschossen. Die Platten wurden mit einem Gitter mit 80 mesh zwischen dem Trägerstand und dem Ziel beschossen. Die Ziele wurden nach der Bombardierung bei 26°C für 24 Stunden in die Dunkelheit gestellt, bevor die Blöcke mit den Embryos auf Platten gelegt wurden, die Murashige-Skoog-Medium mit 3 mg/l 2,4-D und 3 % Saccharose enthielten. Die individuellen Embryos wurden von den Platten entfernt und direkt auf frisches Medium der gleichen Zusammensetzung nach weiteren 48 Stunden plaziert.
Ca. 6 Wochen nach der Genübertragung wurde das reagierende Gewebe auf Murashige-Skoog-Medium mit 3 mg/l 2,4-D und 3 % Saccharose mit 0,2 mg/l Methotrexat für einen 3-wöchigen Zeitraum plaziert. Das Gewebe wurde dann auf ein Regenerationsmedium plaziert, das Murashige-Skoog-Medium mit 1 mg/l Zeatinribosid und 1 mg/l Methotrexat umfaßte. Nach 2 Wochen wurden sich regenerierende Pflänzchen in als "GA7s" bezeichnete sterile Behälter mit halbkonzentrierten Murashige-Skoog-Salzen, 2 % Saccharose, 1 mg/l NAA und entweder 4 oder 8 mg/l Methotrexat plaziert.
DNA wurde aus Blattgewebe von 4 Pflanzen extrahiert, die aus zwei unterschiedlichen Zielplatten stammten, und eine PCR wurde auf Gegenwart des dhfr-Gens durchgeführt. Alle vier waren positiv für die Gegenwart des dhfr. Zwei der Pflanzen wurden in das Gewächshaus zur Vermehrung überführt.
XV. Entwicklung von verbesserten embryogenen Kulturen von Weizen unter Verwendung von zuvor regeneriertem Material als Kulturquelle
Zur Verwendung von regenerierten Pflanzen als Ausgangsmaterial für solche verbesserten Kulturen wurden Pflanzen aus dem oben beschriebenen Maltose-induzierten bröckeligen Kallus auf einem Murashige-Skoog-Medium mit 3 mg/l BAP und 3 % Saccharose regeneriert. Dieser Maltose-induzierte bröckelige Kallus war eine mit UC703-0612 markierte Typ II-Zellkultur, aufgetaut aus Gefrierkonservierung und plaziert auf ein Erhaltungsmedium (Murashige-Skoog-Medium + 1 mg/l 2,4-D + 3 % Saccharose) vor der Regeneration. Für die Embryokultur wurden Weizenähren aus den regenerierten Pflanzen gesammelt, mit 10 % Clorox-Lösung für 10 min sterilisiert und mehrmals mit sterilem Wasser gespült. Unreife Embryos mit einer Größe von 1-2 mm wurden aus Karyopsen unter einem Seziermikroskop entfernt und auf einem Murashige-Skoog-Medium mit entweder 5 oder 10 mg/l 2,4-D und 13,7 g/l Maltose oder auf einem Murashige-Skoog-Medium mit 2 mg/l 2,4-D und 3 % Saccharose kultiviert. Dieser neu induzierte bröckelige Kallus, jetzt recycliert, wurde auf Murashige-Skoog-Medium mit 1 mg/l 2,4-D und 3 % Saccharose zur Erhaltung oder für Bombardierungsexperimente überführt. Die obige Pflanzenregeneration und der Kallusinduktionsprozeß wurden dann zur Erzeugung zukünftiger Generationen von bröckeligem Kallus wiederholt. Als Kontrolle wurden Embryos aus Pflanzen vom Wildtyp gesammelt und auf dem gleichen Maltosemedium kultiviert. Die Induktionshäufigkeit eines bröckeligen und embryogenen Kallus aus den Embryos wurde aufgezeichnet und ist nachfolgend gezeigt.
Zur Verwendung von Saatgut, das aus regenerierten Pflanzen als Ausgangsmaterial stammte, wurde eine Typ II-Zellkultur (UC703-0612), die aus einem auf maltosehaltigem Medium kultivierten Embryo erzeugt wurde, aus der Gefrierkonservierung aufgetaut und auf ein Erhaltsmedium plaziert (Murashige-Skoog-Medium + 1 mg/l 2,4-D + 3 % Saccharose). Der Kallus wurde dann auf ein Medium, das Murashige-Skoog-Basissalze und 3 mg/l 6-BAP enthielt, zur Pflanzenregeneration gegeben. Samen wurden aus den regenerierten Pflanzen geerntet und dann im Boden gekeimt. Zur Embryokultur wurden Weizenähren aus den aus dem Saatgut stammenden Pflanzen gesammelt, mit 10 % Clorox-Lösung für 10 min sterilisiert und mehrmals mit sterilem Wasser gespült. Unreife Embryos mit einer Größe von 1-2 mm wurden aus Karyopsen unter einem Seziermikroskop entfernt und auf einem Murashige-Skoog-Medium mit 2 oder 10 mg/l 2,4-D und 13,7 g/l Maltose oder auf einem MS-Medium mit 2 mg/l 2,4-D und 3 % Saccharose kultiviert. Der induzierte bröckelige Kallus wurde auf ein MS-Medium mit 1 mg/l 2,4-D und 3 % Saccharose zum Erhalt oder für Bombardierungsexperimente übertragen.
Als Kontrolle wurden Embryos aus Pflanzen vom Wildtyp gesammelt und auf dem gleichen Maltosemedium kultiviert. Die Induktionshäufigkeiten eines bröckeligen und embryogenen Kallus aus den Embryos wurden aufgezeichnet und sind nachfolgend gezeigt.
XVI. Transformation von Weizen unter Verwendung einer recyclierten embryogenen Kultur
Eine mit 0612RC bezeichnete recyclierte embryogene Kalluslinie wurde wie im obigen Beispiel beschrieben entwickelt. Kallus wurde zur Bombardierung durch Rühren und Plasmolyse für 2-3 Stunden in flüssigem Murashige-Skoog-Medium, das 1 mg/l 2,4-D, 3 % Saccharose und 0,6 M Sorbit enthielt, in einem Verhältnis von 1 Teil Zellen auf 16 Teile Medium vorbereitet. Jedes Ziel wurde unter Verwendung einer Vakuumfiltervorrichtung präpariert, um 3 ml der Zellmischung an Glasfaserfilter zu befestigen, die dann auf festes Murashige-Skoog-Medium mit 1 mg/l 2,4-D, 3 % Saccharose und 0,4 M Sorbit plaziert wurden.
DNA aus Plasmid pTG48 (ant43/Gus/35Sdhfr) wurde auf Goldpartikel von Mikrometergröße unter Verwendung von 0,1 M CaCl₂ und 0,1 M NaH₂PO₄ präzipitiert.
Jedes Ziel wurde zweimal mit der in WO 93/07256 beschriebenen Mikroprojektilvorrichtung unter Verwendung eines Gasdrucks von 1900 psi beschossen. Nach der Genübertragung wurden die Filter und Zellen aus dem Sorbitmedium entfernt und auf Murashige-Skoog-Medium mit 1 mg/l 2,4-D und 3 % Saccharose ca. 24 Stunden später plaziert und für 17 Tage kultiviert, bevor sie auf das gleiche Medium, aber mit 1 mg/l Methotrexat, plaziert wurden. Der Selektionsgrad wurde auf 2 mg/l Methotrexat 17 Tage später erhöht.
Ca. 7 Wochen später wurden Kolonien aus den ursprünglichen Selektionsplatten auf frisches Medium entfernt, das 1 mg/l Methotrexat enthielt. Die Kolonien wurden als positiv für die Gegenwart des dhfr-Gens durch PCR identifiziert. Das Gewebe wurde vereinigt und bei einer reduzierten 2,4-D-Konzentration (0,5 mg/l) gehalten, um die somatische Embryoreifung zu unterstützen. Pflänzchen wurden unter Verwendung von Murashige-Skoog-Medium mit 5 mg/l GA und 1 mg/l NAA regeneriert. Etwas Gewebe wurden durch Plazieren auf Osmorafts in flüssigem Mursashige-Skoog-Medien mit 3 % Saccharose und 10 mg/l Zeatin regeneriert. Pflänzchen wurden auf als "GA7s" bezeichnete sterile Behälter, die halbkonzentrierte Murashige-Skoog-Salze, 2 % Saccharose und 0,5 mg/l NAA enthielten, ca. 20 Wochen nach der Bombardierung überführt. Die Pflänzchen wurden in das Gewächshaus zur Vermehrung überführt. 5 Pflanzen wurden durch Southern-Analysen analysiert, und die Gegenwart des dhfr-Gens wurde bestätigt.
Alle in dieser Beschreibung genannten Veröffentlichungen und Patentanmeldungen sind indikativ für das fachliche Können der Fachleute, an die sich diese Erfindung richtet. Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen werden hier durch Verweis in dem gleichen Ausmaß eingeführt, als ob jede individuelle Veröffentlichung oder Patentanmeldung spezifisch und individuell als durch Verweis eingeführt angegeben wäre.
Obwohl die vorhergehende Erfindung in einem gewissen Detail zur Veranschaulichung und als Beispiel für die Zwecke der Verständnisklarheit beschrieben wurde, ist es offensichtlich, daß gewisse Veränderungen und Modifikationen im Umfang der anhängenden Ansprüche durchgeführt werden können.
Alle in dieser Beschreibung genannten Veröffentlichungen und Patentanmeldungen sind indikativ für das fachliche Können der Fachleute, an die sich diese Erfindung richtet. Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen werden hier durch Verweis in dem gleichen Ausmaß eingeführt, als ob jede individuelle Veröffentlichung oder Patentanmeldung spezifisch und individuell als durch Verweis eingeführt angegeben wäre.
Obwohl die vorhergehende Erfindung in einem gewissen Detail zur Veranschaulichung und als Beispiel für die Zwecke der Verständnisklarheit beschrieben wurde, ist es offensichtlich, daß gewisse Veränderungen und Modifikationen im Umfang der anhängenden Ansprüche durchgeführt werden können.
ANGABEN ZU EINEM HINTERLEGTEN MIKROORGANISMUS ODER ANDEREM BIOLOGISCHEN MATERIAL (Regel 13^bis PCT)

Claims

Verfahren zur Herstellung von stabil transformierten fruchtbaren Weizenpflanzen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst. (a) Ausschneiden eines unreifen Embryos aus einer Weizenpflanze; (b) Ausplattieren des ausgeschnittenen unreifen Embryos auf Wachstumsmedium; (c) Bombardieren des ausgeschnittenen und ausplattierten unreifen Embryos mit einer DNA-Sequenz von Interesse 0 bis 10 Tage nach dem Ausschneiden; (d) Halten des Embryos oder sich entwickelnden Kallus für 1 bis 10 Wochen in der Dunkelheit auf Wachstumsmedium mit Auxin ohne Selektionsdruck; und (e) Regenerieren von fruchtbaren transformierten Pflanzen daraus in Gegenwart von Selektion.
Verfahren gemäss Anspruch 1, worin das Bombardieren das Unterwerfen des unreifen Embryos mehrfachen Schüssen mit Partikeln umfasst, die mit DNA überzogen sind.
Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, worin das Verfahren ferner eine Plasmolysebehandlung vor der Bombardierung umfasst.
Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, worin das Verfahren ferner eine Plasmolysebehandlung nch der Bombardierung umfasst.
Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, worin das Verfahren ferner eine Plasmolysebehandlung sowohl vor als auch nach der Bombardierung umfasst.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die DNA-Sequenz von Interesse ein Resistenzgen umfasst.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die DNA-Sequenz von Interesse ein Gen, das Nährwert, männliche und/oder weibliche Sterilität verleiht, oder ein Antipilz-, antibakterielles oder antivirales Gen umfasst.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die DNA-Sequenz von Interesse ein Gen umfasst, das Antisense-RNA codiert.
Verfahren gemäss Anspruch 6, worin die DNA-Sequenz von Interesse ein Krankheits- oder Insektenresistenzgen umfasst.
Verfahren gemäss Anspruch 6, worin das Resistenzgen das Neomycinphosphotransferase II-(npt-II)-Gen oder das Hygromycin B-Resistenzgen ist.
Verfahren gemäss Anspruch 6, worin die DNA-Sequenz von Interesse eine Dihydrofolatreduktase (dhfr) codierende Sequenz umfasst.
Verfahren gemäss Anspruch 11, worin das dhfr-Gen ein bakterielles Gen ist.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 12, worin die in Schritt (e) erhaltene fruchtbare transformierte Pflanze das Gen von Interesse spezifisch in Staubbeuteln exprimiert.