JP2007521248A - ヒト化抗ｃｃｒ２抗体および該抗体を使用する方法 - Google Patents

ヒト化抗ｃｃｒ２抗体および該抗体を使用する方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、哺乳動物（例えばヒト）ＣＣ−ケモカイン受容体２（ＣＣＲ２）または該受容体の一部に結合し、そして該受容体へのリガンドの結合を遮断するヒト化抗体または機能するその断片に関する。本発明はさらに、哺乳動物ＣＣＲ２を有する細胞とそのリガンドの相互作用を阻害する方法に関し、そして療法的方法、予防的方法および診断法における該抗体および断片の使用に関する。

Description

発明の背景
過去数年間に渡って、ケモカインと称される白血球化学誘引剤／活性化因子の増加しつつあるファミリーが記載されてきている（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ， Ｊ．Ｊ．ら， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ９：６１７−６４８（１９９１）；ＳｃｈａｌｌおよびＢａｃｏｎ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ６：８６５−８７３（１９９４）；Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ， Ｍ．ら， Ａｄｖ． Ｉｍｕｎｏｌ．， ５５：９７−１７９（１９９４））。このファミリーメンバーは、ＩＬ−１βまたはＴＮＦαなどの初期炎症仲介因子に反応して、多くの細胞種に産生され、そして分泌される。ケモカイン・スーパーファミリーは、２つの主な部門：α−ケモカイン（またはＣＸＣケモカイン）およびβ−ケモカイン（ＣＣケモカイン）を含む。α−ケモカイン部門には、ＩＬ−８、好中球活性化ペプチド−２（ＮＡＰ−２）、黒色腫増殖刺激活性（ＭＧＳＡ／ｇｒｏまたはＧＲＯα）、およびＥＮＡ−７８などのタンパク質が含まれ、これらは各々、主に好中球に対して、誘引効果および活性化効果を有する。β−ケモカイン部門のメンバーは、単球、リンパ球、好塩基球、および好酸球などの他の細胞種に影響を及ぼし（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ， Ｊ．Ｊ．ら， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ９：６１７−６４８（１９９１）；Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ， Ｍ．ら， Ａｄｖ． Ｉｍｕｎｏｌ．， ５５：９７−１７９（１９９４）；ＭｉｌｌｅｒおよびＫｒａｎｇｅｌ， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １２：１７−４６（１９９２）；Ｊｏｓｅ， Ｐ．Ｊ．ら， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １７９：８８１−１１８（１９９４）；Ｐｏｎａｔｈ， Ｐ．Ｄ．ら， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ９７：６０４−６１２（１９９６））、そして単球走化タンパク質１〜４（ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４およびＭＣＰ−５）、ＲＡＮＴＥＳ、およびマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−ｌα、ＭＩＰ−１β）などのタンパク質が含まれる。最近、ＣＸ３Ｃケモカインと称される、新規クラスの膜結合ケモカインが同定されてきている（Ｂａｚａｎ， Ｊ．Ｆ．ら， Ｎａｔｕｒｅ ３８５：６４０−６４４（１９９７））。ケモカインは、走化性の誘発、脱顆粒、脂質仲介因子の合成、およびインテグリン活性化など、白血球に対して、ある範囲の炎症誘発効果を仲介することも可能である（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ， Ｊ．Ｊ．ら， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ９：６１７−６４８（１９９１）；Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ， Ｍ．ら， Ａｄｖ． Ｉｍｕｎｏｌ．， ５５：９７−１７９（１９９４）；Ｍｉｌｌｅｒ， Ｍ．Ｄ．およびＫｒａｎｇｅｌ， Ｍ．Ｓ．， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １２：１７−４６（１９９２））。最近、特定のβ−ケモカインが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ヒトＴ細胞株のＨＩＶ−１感染を抑制することが示されてきている（Ｃｏｃｃｈｉ， Ｆ．ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ（ワシントンＤＣ）， ２７０：１８１１−１８１５（１９９５））。
ケモカインは、７回膜貫通（７ＴＭＳ）Ｇタンパク質共役型受容体に結合する（Ｍｕｒｐｈｙ， Ｐ．Ｍ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １２：５９３−６３３（１９９４））。ＣＣケモカインまたはβケモカインのいくつかの既知の受容体には、ＭＩＰ−１αおよびＲＡＮＴＥＳに結合する、ＣＣＲ１（Ｎｅｏｔｅ， Ｋ．ら， Ｃｅｌｌ， ７２：４１５−４２５（１９９３）；Ｇａｏ， Ｊ．Ｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １７７：１４２１−１４２７（１９９３））；ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３およびＭＣＰ−４を含むケモカインに結合する、ＣＣＲ２（Ｃｈａｒｏ， Ｉ．Ｆ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１：２７５２−２７５６（１９９４）；Ｍｙｅｒｓ， Ｓ．Ｊ．ら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０：５７８６−５７９２（１９９５）；Ｇｏｎｇら， Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２：１１６８２−１１６８５（１９９７）；Ｇａｒｃｉａ−Ｚｅｐｅｄａら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５７：５６１３−５６２６（１９９６））；エオタキシン、ＲＡＮＴＥＳおよびＭＣＰ−３を含むケモカインに結合する、ＣＣＲ３（Ｐｏｎａｔｈ， Ｐ． Ｄ．ら， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８３：２４３７−２４４８（１９９６））；ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌα、およびＲＡＮＴＥＳに反応してシグナル伝達することが見出されている、ＣＣＲ４（Ｐｏｗｅｒ， Ｃ．Ａ．ら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０：１９４９５−１９５００（１９９５））；並びに、ＭＩＰ−ｌα、ＭＩＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳに反応してシグナル伝達することが示されている、ＣＣＲ５（Ｂｏｒｉｎｇ， Ｌ．ら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７１（１３）：７５５１−７５５８（１９９６）；Ｒａｐｏｒｔ， Ｃ．Ｊ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ，２７１：１７１６１−１７１６６（１９９６）；およびＳａｍｓｏｎ， Ｍ．ら， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３５：３３６２−３３６７（１９９６））が含まれる。
ＣＣＲ２は、いくつかの白血球サブセットの表面で発現され、そしてカルボキシ末端領域をコードするｍＲＮＡの選択的スプライシングのため、２つのわずかに異なる型（ＣＣＲ２ａおよびＣＣＲ２ｂ）で発現されるようである（Ｃｈａｒｏら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：２７５２−２７５６（１９９４））。ＭＣＰ−１は、単球、リンパ球および好塩基球に作用し、走化性、顆粒放出、呼吸バースト、並びにヒスタミン放出およびサイトカイン放出を誘導する。研究によって、ＭＣＰ−１が、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、肉芽腫性疾患および多発性硬化症などの疾患病理に関連付けられることが示唆されてきている（Ｋｏｃｈ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９０：７７２−７９（１９９２）；Ｈｏｓａｋａら， Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９７：４５１−４５７（１９９４）；Ｓｃｈｗａｒｔｚら， Ａｍ． Ｊ． Ｃａｒｄｉｏｌ． ７１（６）：９Ｂ−１４Ｂ（１９９３）；Ｓｃｈｉｍｍｅｒら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６０：１４６６−１４７１（１９９８）；Ｆｌｏｒｙら， Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ． ６９：３９６−４０４（１９９３）；Ｇｏｎｇら， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８６：１３１−１３７（１９９７））。さらに、ＣＣＲ２は、ＨＩＶの共同受容体として作用することも可能である（Ｃｏｎｎｏｒら， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８５：６２１−６２８（１９９７））。したがって、ＣＣＲ２受容体アンタゴニストは、重要な療法剤の新規クラスに相当することも可能である。
発明の概要
本発明は、哺乳動物ＣＣ−ケモカイン受容体２（ＣＣＲ２、ＣＫＲ−２、ＭＣＰ−１ＲＡまたはＭＣＰ−１ＲＢとも称される）または該受容体の一部に結合する抗体または機能するその断片（例えば抗原結合性断片）（抗ＣＣＲ２）に関する。１つの態様において、本発明の抗体またはその断片は、ヒトまたはアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）のＣＣＲ２またはその一部に特異性を有する。別の態様において、本発明の抗体または断片は、受容体へのリガンド（例えばＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＣＰ−５、エオタキシン）の結合を遮断し、そして受容体へのリガンドの結合に関連する機能（例えば白血球輸送）を阻害する。例えば、本明細書に記載するように、ヒトまたはアカゲザルのＣＣＲ２またはその一部に結合する、本発明の抗体およびその断片は、受容体へのケモカイン（例えばＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＣＰ−５、エオタキシン）の結合を遮断し、そして受容体へのケモカインの結合に関連する機能を阻害することも可能である。１つの態様において、抗体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＬＳ１３２．１Ｄ９（１Ｄ９）、あるいはヒトＣＣＲ２またはヒトＣＣＲ２の一部への結合に関して、１Ｄ９と競合可能な抗体である。前述の抗体の機能する断片もまた、想定される。
別の態様において、本発明の抗体または機能する断片は、ヒトＣＣＲ２またはその一部に結合し、そして該受容体へのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）結合を阻害し、それによって、受容体へのＨＩＶの結合に関連する機能（例えばＨＩＶ抗原放出および感染性）を阻害する。１つの態様において、抗体は、モノクローナル抗体１Ｄ９、あるいはヒトＣＣＲ２またはヒトＣＣＲ２の一部への結合に関して、１Ｄ９と競合可能な抗体である。
本発明はまた、哺乳動物ＣＣＲ２または該受容体の一部に結合し、そして他の抗ＣＣＲ２抗体に比較してＣＣＲ２またはＣＣＲ２を含む組成物の蛍光染色強度の増加を提供する、抗体またはその機能する断片（例えば抗原結合性断片）にも関する。１つの態様において、抗体は、モノクローナル抗体１Ｄ９またはＬＳ１３２．８Ｇ２（８Ｇ２）、あるいはヒトＣＣＲ２またはヒトＣＣＲ２の一部への結合に関して、１Ｄ９または８Ｇ２と競合可能な抗体である。
本発明はまた、ＣＣＲ２に結合特異性を有するヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片であって、前記免疫グロブリンが非ヒト起源（例えばげっ歯類）の抗原結合性領域、およびヒト起源の免疫グロブリンの少なくとも一部（例えばヒト・フレームワーク領域、ガンマ型のヒト定常領域）を含む、前記ヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片にも関する。１つの態様において、本明細書記載のヒト化免疫グロブリンまたはその断片は、ＣＣＲ２への結合に関して、１Ｄ９と競合可能である。好ましい態様において、該ヒト化免疫グロブリンの抗原結合性領域は、モノクローナル抗体１Ｄ９に由来する（例えばそれぞれ、図７（配列番号９）および図８（配列番号１０）に示すような軽鎖および重鎖の可変領域を含む、免疫グロブリン）。いくつかの態様において、ヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片は、ヒト起源の定常領域のすべてまたは一部、例えばヒト重鎖定常領域および／またはヒト軽鎖定常領域のすべてまたは一部をさらに含むことも可能である。いくつかの態様において、ヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性部分は、１以上の突然変異、例えばＦｃ受容体への結合および／または補体を固定する能力を減少させる１以上の突然変異を有する、ヒト定常領域のすべてまたは一部を含むことも可能である。例えば、ヒト定常領域またはその一部は、ヒト・ガンマ定常領域の残基２３５および２３７に突然変異を含む、重鎖定常領域、例えばガンマ重鎖定常領域、またはその一部であることも可能である。残基２３５の突然変異は、ロイシンからアラニンであることも可能である。残基２３７の突然変異は、グリシンからアラニンであることも可能である。１つの態様において、ヒト化免疫グロブリンには、配列番号１１０の重鎖定常領域および／または配列番号１１２の軽鎖定常領域のすべてまたは一部が含まれる。
ヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片は、非ヒト起源の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）、およびヒト・フレームワーク領域由来のフレームワーク領域（ＦＲ）を含む、抗原結合性領域を含むことも可能である。１つの側面において、ＣＣＲ２に結合特異性を有するヒト化免疫グロブリンは、ＣＣＲ２に結合する非ヒト起源の抗体由来の少なくとも１つのＣＤＲおよびヒト起源の軽鎖由来（例えばＨＦ−２１／２８由来）のＦＲを含む軽鎖、並びにＣＣＲ２に結合する非ヒト起源の抗体由来のＣＤＲおよびヒト起源の重鎖由来（例えば４Ｂ４’ＣＬ由来）のＦＲを含む重鎖を含む。別の側面において、軽鎖は、１Ｄ９抗体の軽鎖由来の３つのＣＤＲを含み、そして重鎖は、１Ｄ９抗体の重鎖由来の３つのＣＤＲを含む。いくつかの態様において、ヒト化免疫グロブリンには、配列番号１１０の重鎖定常領域および／または配列番号１１２の軽鎖定常領域のすべてまたは一部がさらに含まれる。
本発明はまた、ヒト化免疫グロブリン軽鎖およびその抗原結合性断片（例えば１Ｄ９抗体の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、並びにヒト軽鎖ＦＲを含むもの）に関し、そしてヒト化免疫グロブリン重鎖およびその抗原結合性断片（例えば１Ｄ９抗体の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、並びにヒト重鎖ＦＲを含むもの）にも関する。好ましい態様において、本発明は、本明細書記載のヒト化重鎖および軽鎖（例えば図７に示す軽鎖の可変領域（配列番号９）を含むヒト化軽鎖、図８に示す重鎖の可変領域（配列番号１０）を含むヒト化重鎖）に関する。１以上のヒト化軽鎖および／または重鎖を含むヒト化免疫グロブリンもまた、含まれる。
本発明はまた、ＣＣＲ２に結合特異性を有し、重鎖および軽鎖を含む、ヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片であって、前記軽鎖が、ネズミ・モノクローナル抗体１Ｄ９由来の少なくとも１つの相補性決定領域およびヒト抗体ＨＦ−２１／２８の軽鎖由来のフレームワーク領域を含み、そして前記重鎖が、ネズミ・モノクローナル抗体１Ｄ９由来の少なくとも１つの相補性決定領域およびヒト抗体４Ｂ４’ＣＬの重鎖由来のフレームワーク領域を含む、前記ヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片にも関する。１つの態様において、軽鎖は、１Ｄ９抗体の軽鎖由来の３つの相補性決定領域を含み、そして重鎖は、１Ｄ９抗体の重鎖由来の３つの相補性決定領域を含む。別の態様において、１Ｄ９の軽鎖由来の相補性決定領域は、配列番号９のアミノ酸２４〜３９、配列番号９のアミノ酸５５〜６１および配列番号９のアミノ酸９４〜１０２であり、そして１Ｄ９の重鎖由来の相補性決定領域は、配列番号１０のアミノ酸３１〜３５、配列番号１０のアミノ酸５０〜６８および配列番号１０のアミノ酸１０１〜１０６である。いくつかの態様において、ヒト化免疫グロブリンには、配列番号１１０の重鎖定常領域および／または配列番号１１２の軽鎖定常領域のすべてまたは一部がさらに含まれる。
本発明はさらに、ＣＣＲ２に結合特異性を有し、軽鎖および相補的重鎖を含む、ヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片であって、前記軽鎖が配列番号１２を含む可変領域を含む、前記ヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片に関する。いくつかの態様において、軽鎖は、ヒト起源の軽鎖定常領域、例えばヒト起源のカッパ軽鎖定常領域の、すべてまたは一部をさらに含むことも可能である。好ましくは、軽鎖定常領域には、配列番号１１２の軽鎖定常領域のすべてまたは一部が含まれる。本発明はまた、ＣＣＲ２に結合特異性を有し、重鎖および相補的軽鎖を含む、ヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片であって、前記重鎖が配列番号１７を含む可変領域を含む、前記ヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片に関する。いくつかの態様において、重鎖は、ヒト起源の重鎖定常領域、例えばヒト起源のガンマ重鎖定常領域の、すべてまたは一部をさらに含むことも可能である。好ましくは、重鎖定常領域には、配列番号１１０の重鎖定常領域のすべてまたは一部が含まれる。好ましい態様において、本発明は、ＣＣＲ２に結合特異性を有し、重鎖および軽鎖を含む、ヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片であって、前記軽鎖が配列番号１２を含む可変領域を含み、そして前記重鎖が配列番号１７を含む可変領域を含む、前記ヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片に関する。他の好ましい態様において、本発明は、軽鎖および重鎖を有する、ヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片であって、該軽鎖が、配列番号１２を含む可変領域、および配列番号１１２のすべてまたは一部を含む定常領域を含み、そして該重鎖が、配列番号１７を含む可変領域、および配列番号１１０のすべてまたは一部を含む定常領域を含む、前記ヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片に関する。１つの態様において、ヒト化免疫グロブリンまたは抗原結合性断片は、ＣＣＲ２への結合に関して、ネズミ抗体１Ｄ９と競合可能である。さらなる態様において、ヒト化免疫グロブリンまたは抗原結合性断片は、ＣＣＲ２へのリガンドの結合を阻害する。いくつかの態様において、ヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片には、少なくとも２つの軽鎖および少なくとも２つの重鎖が含まれる。
本発明はさらに、本発明のヒト化免疫グロブリン（例えば一本鎖抗体）をコードする核酸配列を含む単離核酸分子とともに、本発明のヒト化免疫グロブリン軽鎖（例えば配列番号１０９または配列番号９８を含む軽鎖可変領域をコードする配列および／または配列番号１１３、配列番号１１７、またはその一部を含む軽鎖定常領域をコードする配列）または重鎖（例えば配列番号１０８または配列番号９７を含む軽鎖可変領域をコードする配列および／または配列番号１１１、配列番号１１５、またはその一部の重鎖定常領域をコードする配列）をコードする配列を含む単離核酸分子に関する。例えば、本発明は、ネズミ１Ｄ９モノクローナル抗体由来の抗原結合性領域をコードする第一の核酸配列；およびヒト起源の免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部をコードする第二の核酸配列を含む、ヒト化免疫グロブリン軽鎖または重鎖をコードする核酸（例えば融合核酸）を提供する。１つの態様において、本発明は、配列番号１０９を含む第一の核酸および配列番号１１３またはその一部を含む第二の核酸を含むヒト化軽鎖をコードする核酸（例えば融合核酸）を提供する。別の態様において、本発明は、配列番号１０８を含む第一の核酸および配列番号１１１またはその一部を含む第二の核酸を含むヒト化重鎖をコードする核酸（例えば融合核酸）を提供する。
本発明はまた、本発明のヒト化免疫グロブリン（例えば一本鎖抗体）をコードする核酸配列を含む単離核酸分子とともに、ヒト化免疫グロブリン軽鎖（例えば配列番号１２、１３、１４、または１５のアミノ酸配列をコードする配列および／または配列番号１１１、１１６またはその一部のアミノ酸をコードする配列）または重鎖（例えば配列番号１７、１８、１９または２０のアミノ酸配列をコードする配列および／または配列番号１１０、１１４またはその一部のアミノ酸配列をコードする配列）をコードする配列を含む単離核酸分子にも関する。
本発明はさらに、ＣＣＲ２に結合特異性を有するヒト化免疫グロブリンまたはこうした免疫グロブリンの鎖をコードする核酸分子を含む構築物に関する。例えば、ヒト化免疫グロブリン軽鎖をコードする遺伝子（例えば融合遺伝子）を含む発現ベクターであって、ＣＣＲ２に結合特異性を有する非ヒト抗体の軽鎖由来のＣＤＲ、およびヒト起源の軽鎖由来のフレームワーク領域をコードするヌクレオチド配列を含む、前記発現ベクターを提供する。ヒト化免疫グロブリン重鎖をコードする遺伝子を含む発現ベクターであって、ＣＣＲ２に結合特異性を有する非ヒト抗体の重鎖由来のＣＤＲ、およびヒト起源の重鎖由来のフレームワーク領域をコードするヌクレオチド配列を含む、前記発現ベクターが、こうした構築物の別の例である。１つの態様において、発現ベクターは、軽鎖可変領域をコードする第一の核酸配列、例えば配列番号１０９、および軽鎖定常領域をコードする第二の核酸配列、例えば配列番号１１３またはその一部を含む、軽鎖をコードする核酸を含むことも可能である。別の態様において、発現ベクターは、重鎖可変領域をコードする第一の核酸配列、例えば配列番号１０８、および重鎖定常領域をコードする第二の核酸配列、例えば配列番号１１１またはその一部を含む、重鎖をコードする核酸を含むことも可能である。いくつかの態様において、発現ベクターは、本明細書記載の軽鎖をコードする核酸および本明細書記載の重鎖をコードする核酸を含むことも可能である。いくつかの態様において、発現ベクターは、軽鎖（例えば配列番号１２の軽鎖可変領域および／または配列番号１１２またはその一部の重鎖定常領域）および／または重鎖（例えば配列番号１７の重鎖可変領域および／または配列番号１１０またはその一部の重鎖定常領域）を発現するであろう。軽鎖可変領域、軽鎖定常領域、重鎖可変領域および重鎖定常領域の１以上をコードする核酸は、５’端または３’端の１以上にさらなる配列（例えば制限酵素部位および／または隣接配列）をさらに含むことも可能であり、こうしたさらなる配列は、ベクターに適切に挿入された場合、ポリペプチドの一部として発現されるアミノ酸をコードしない。例えば、配列番号９８、１１７、９７および１１５のヌクレオチド配列は、ポリペプチドの一部として発現されない、さらなる配列を含む。
本発明はまた、本発明の核酸分子を含む１以上の構築物を含む、本発明の核酸分子を含む、宿主細胞にも関する。１つの態様において、本発明は、ヒト化免疫グロブリン軽鎖をコードする第一の組換え核酸、およびヒト化免疫グロブリン重鎖をコードする第二の組換え核酸を含む宿主細胞であって、前記の第一の核酸が、ネズミ１Ｄ９抗体の軽鎖由来のＣＤＲおよびヒト起源の軽鎖由来のフレームワーク領域をコードするヌクレオチド配列を含み；そして前記の第二の核酸が、ネズミ１Ｄ９抗体の重鎖由来のＣＤＲおよびヒト起源の重鎖由来のフレームワーク領域をコードするヌクレオチド配列を含む、前記宿主細胞に関する。１つの態様において、宿主細胞は、軽鎖可変領域をコードする第一の配列、例えば配列番号１０９、および軽鎖定常領域をコードする第二の配列、例えば配列番号１１３またはその一部を含む、軽鎖をコードする核酸を含むことも可能である。別の態様において、宿主細胞は、重鎖可変領域をコードする第一の配列、例えば配列番号１０８、および重鎖定常領域をコードする第二の配列、例えば配列番号１１１またはその一部を含む、重鎖をコードする核酸を含むことも可能である。好ましい態様において、宿主細胞には、本明細書記載の軽鎖をコードする核酸および本明細書記載の重鎖をコードする核酸が含まれる。
本発明はまた、ヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片を調製する方法であって、ヒト化免疫グロブリンの発現に適した条件下で本発明の宿主細胞を維持し、それによって、ヒト化免疫グロブリン鎖（単数または複数）が発現され、そしてヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片が産生されることを含む、前記方法も提供する。該方法はさらに、ヒト化免疫グロブリンを単離する工程を含むことも可能である。
本発明のヒト化免疫グロブリンおよびその抗原結合性断片は、ネズミまたは他の非ヒト対応物より免疫原性でない可能性もある。したがって、本明細書記載のヒト化免疫グロブリンおよびその抗原結合性断片を、ヒトにおける療法剤として使用して、例えば粘膜リンパ組織へのリンパ球ホーミングを調節して、それによって炎症反応を減少させることも可能である。
本発明はさらに、診断または療法（予防を含む）に使用するための本発明のヒト化免疫グロブリンに関する。１つの態様において、本発明は、組織の白血球浸潤と関連する疾患の治療に、例えば炎症性疾患、自己免疫疾患、移植片拒絶、ＨＩＶ感染、およびアテローム性動脈硬化症などの単球仲介性障害の治療に使用するための、本発明のヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片に関する。
別の側面において、本発明は、組織の白血球浸潤と関連する疾患の治療用の医薬、例えば炎症性疾患、自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化症などの単球仲介性障害、移植片拒絶、またはＨＩＶ感染の治療における医薬を製造するための、本発明のヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片の使用に関する。
本発明はさらに、哺乳動物（例えばヒト、非ヒト霊長類またはネズミ）ＣＣＲ２を有する細胞とそのリガンドの相互作用を阻害する方法であって、哺乳動物ＣＣＲ２またはＣＣＲ２の一部に結合する抗体または機能するその断片、例えば本明細書記載の抗体またはその抗原結合性断片の有効量と、細胞を接触させることを含む、前記方法に関する。適切な細胞には、顆粒球や、単球、マクロファージ、好塩基球および好酸球などの白血球、マスト細胞、およびＴ細胞を含むリンパ球（例えばＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ２５＋細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞）、並びにＣＣＲ２を発現する組換え細胞（例えばトランスフェクションした細胞）などのＣＣＲ２を発現する他の細胞が含まれる。特定の態様において、抗体は、１Ｄ９、あるいはヒトＣＣＲ２またはヒトＣＣＲ２の一部への結合に関して、１Ｄ９と競合可能な抗体である。
本発明の別の態様は、哺乳動物ＣＣＲ２を有する細胞とケモカインの相互作用を阻害する方法であって、ＣＣＲ２または前記受容体の一部に結合する抗体または機能するその断片、例えば本明細書記載の抗体または機能するその断片の有効量と、前記細胞を接触させることを含む、前記方法に関する。該方法の１つの態様において、抗体または機能するその断片は、１Ｄ９、１Ｄ９の抗原結合性断片、あるいは１Ｄ９と同じかまたは類似のエピトープ特異性を有する抗体またはその断片のいずれか１以上である。さらに、本発明は、ＣＣＲ２へのケモカインの結合に関連する機能を阻害する方法であって、哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質または前記受容体の一部に結合する抗体または機能するその断片、例えば本明細書記載の抗体または機能するその断片の有効量を投与することを含む、前記方法に関する。該方法の１つの側面において、抗体または機能するその断片は、１Ｄ９、１Ｄ９の抗原結合性断片、あるいは１Ｄ９と同じかまたは類似のエピトープ特異性を有する抗体またはその断片のいずれか１以上である。
本発明の別の側面は、細胞による、哺乳動物ＣＣＲ２または該受容体の一部の発現を同定する方法である。該方法にしたがって、細胞またはその分画（例えば膜分画）を含む組成物を、哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質または該受容体の一部に結合する抗体または機能するその断片（例えば１Ｄ９または８Ｇ２）、例えば本明細書記載の抗体または機能するその断片と、抗体の結合に適した条件下で接触させ、そして前記抗体または断片および前記タンパク質またはその一部の間の複合体の形成を検出する。複合体が直接または間接的に検出されると、細胞上に受容体が存在する指標となる。本発明はまた、生物学的試料における、ＣＣＲ２またはその一部の存在を検出する際に使用するキットであって、哺乳動物ＣＣ−ケモカイン受容体２または前記受容体の一部に結合する抗体または機能するその断片、例えば本明細書記載の抗体または機能するその断片、並びに前記抗体または断片および前記タンパク質またはその一部の間の複合体の存在を検出するのに適した、１以上の補助的試薬を含む、前記キットにも関する。
本発明にやはり含まれるのは、哺乳動物ＣＣＲ２機能の阻害剤および／または促進剤を含む、哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質に結合するさらなるリガンドまたは他の物質を同定する方法である。例えば、本発明の抗体または機能するその断片との競合アッセイによって、前記抗体または断片と同じかまたは類似の結合特異性を有する剤(agent)を同定することも可能である。したがって、本発明はまた、受容体機能の阻害剤（例えばアンタゴニスト）または促進剤（例えばアゴニスト）を含む、ＣＣＲ２受容体に結合するリガンドまたは他の物質を同定する方法も含む。１つの態様において、ＣＣＲ２受容体タンパク質を天然に発現する細胞、あるいは適切な宿主細胞であって、前記細胞に導入された核酸によってコードされるＣＣＲ２受容体または変異体を発現するように操作されている、前記細胞を、リガンド、受容体機能の阻害剤または促進剤の有効性を同定し、そして評価するアッセイにおいて、用いる。こうした細胞はまた、発現された受容体タンパク質またはポリペプチドの機能を評価するのにも有用である。
したがって、本発明はまた、哺乳動物ＣＣＲ２またはそのリガンド結合性変異体に結合する剤を検出するかまたは同定する方法であって、試験しようとする剤を、本発明の抗体または抗原結合性断片（例えばモノクローナル抗体１Ｄ９、１Ｄ９と同じかまたは類似のエピトープ特異性を有する抗体、１Ｄ９の抗原結合性断片、モノクローナル抗体８Ｇ２、８Ｇ２と同じかまたは類似のエピトープ特異性を有する抗体、および８Ｇ２の抗原結合性断片）および哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質またはそのリガンド結合性変異体を含む組成物と合わせることを含む、前記方法にも関する。前述の構成要素を、抗体または抗原結合性断片が哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質またはそのリガンド結合性変異体に結合するのに適した条件下で合わせることも可能であり、そして本明細書記載の方法または他の適切な方法にしたがって、直接または間接的いずれかで、哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質またはリガンド結合性変異体への抗体または断片の結合を検出するかまたは測定する。適切な対照（例えば試験しようとする剤の非存在下）に比較して、形成される複合体量が減少すれば、剤が前記受容体または変異体に結合する指標となる。哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質またはそのリガンド結合性変異体を含む組成物は、組換えＣＣＲ２タンパク質またはそのリガンド結合性変異体を有する細胞の膜分画であることも可能である。抗体またはその断片を、放射性同位体、スピン標識、抗原標識、酵素標識、蛍光基および化学発光基などの標識で標識することも可能である。これらのアッセイおよび類似のアッセイを用いて、ＣＣＲ２に結合し、そして受容体への結合に関して本明細書記載の抗体と競合することも可能な、受容体機能の阻害剤または促進剤を含む、リガンド（例えばＣＣＲ２と相互作用するケモカイン）または他の物質を含む、剤を検出することも可能である。
本発明にしたがって、リガンド、受容体機能の阻害剤または促進剤を、適切なアッセイにおいて同定し、そして療法効果に関して、さらに評価することも可能である。受容体機能の阻害剤を用いて、受容体活性を阻害する（減少させるかまたは防止する）ことも可能であり、そしてリガンドおよび／または促進剤を用いて、示される場合の正常の受容体機能を誘導する（誘発するかまたは増進させる）ことも可能である。本発明はまた、炎症性疾患、自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化症、および移植片拒絶、またはＨＩＶ感染を治療する方法であって、個体（例えばヒトなどの哺乳動物）に、受容体機能（例えばケモカイン結合またはＨＩＶ結合）の阻害剤を投与することを含む、前記方法も提供する。本発明はさらに、個体に新規リガンドまたは促進剤を投与し、例えば感染性疾患および癌の治療に有用な、白血球機能の選択的刺激への新規アプローチを提供することによって、受容体機能を刺激する方法を提供する。
本発明の別の側面は、哺乳動物ＣＣＲ２またはその一部を発現する細胞のＨＩＶ感染を阻害する方法であって、哺乳動物ＣＣＲ２または該受容体の一部に結合し（例えば本明細書記載の抗体または機能するその断片）、そしてＨＩＶ結合および感染を阻害する抗体または機能するその断片の有効量と、細胞を接触させることを含む、前記方法に関する。本発明の特定の態様において、抗体または機能するその断片は、１Ｄ９、１Ｄ９と同じかまたは類似のエピトープ特異性を有する抗体、ヒトＣＣＲ２への結合に関して１Ｄ９と競合可能な抗体、およびその抗原結合性断片のいずれかである。
本発明にやはり含まれるのは、患者においてＨＩＶを阻害する（例えば治療する）方法であって、哺乳動物ＣＣＲ２または前記受容体の一部に結合し（例えば本明細書記載の抗体または機能するその断片）、そしてＣＣＲ２受容体へのＨＩＶ結合を阻害する抗体または機能するその断片の有効量を、患者に投与することを含む、前記方法である。抗ＣＣＲ２抗体または断片を、単独で、または１以上のさらなる療法剤、例えばＨＩＶ感染の共同受容体に結合し、そして前記共同受容体への結合を阻害する１以上の抗体、例えば抗ＣＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ５抗体、および／または抗ＣＸＣＲ４抗体と組み合わせて投与することも可能である。
本発明の別の側面はまた、個体においてＨＩＶ感染を防止するかまたは阻害する方法であって、ＣＣＲ２に結合し（例えば本明細書記載の抗体または機能するその断片）、そしてＣＣＲ２へのＨＩＶ結合を阻害する抗体または機能するその断片の有効量を、個体に投与することを含む、前記方法にも関する。該方法にしたがって、ＨＩＶ感染の防止には、感染した個体において、新規細胞の感染を防止する（減少させるかまたは排除する）ための治療、あるいはＨＩＶに曝露される可能性もあるか、または曝露された可能性もあるか、または曝露された個体において、感染を防止するための治療が含まれる。例えば、ＨＩＶ感染個体、ＨＩＶ感染女性の胎児、または医療従事者などの個体を、本発明の方法にしたがって治療することも可能である。
本発明はまた、患者において白血球輸送を阻害する方法であって、哺乳動物ＣＣＲ２または前記受容体の一部に結合し（例えば本明細書記載の抗体または機能するその断片）、そして該受容体へのリガンドの結合に関連する機能を阻害する抗体または機能するその断片の有効量を、患者に投与することを含む、前記方法も含む。
本発明はまた、炎症性障害などのＣＣＲ２仲介性障害を阻害するかまたは治療する方法であって、哺乳動物ＣＣＲ２または前記受容体の一部に結合し（例えば本明細書記載の抗体または機能するその断片）、そしてＣＣＲ２仲介性機能を阻害する抗体または機能するその断片の有効量を、患者に投与することを含む、前記方法にも関する。例えば、本発明は、血管系の狭窄または再狭窄を阻害するかまたは治療する方法であって、哺乳動物ＣＣＲ２または前記受容体の一部に結合し、そしてＣＣＲ２仲介性機能を阻害する抗体または機能するその断片の有効量を、患者に投与することを含む、前記方法に関する。
本発明はさらに、療法（予防を含む）または診断において使用するための、本明細書に記載するような抗体またはその断片（例えば、ヒト化モノクローナル抗体１Ｄ９またはその抗原結合性断片）に関し、そして本明細書に記載するようなＣＣＲ２仲介性障害、または他の疾患もしくは炎症状態の治療用の医薬製造のためのこうした抗体または断片の使用に関する。
本発明にやはり含まれるのは、本明細書記載の抗体または免疫グロブリンいずれかの免疫グロブリン軽鎖または重鎖あるいはそれらの断片である。こうした抗体または免疫グロブリンあるいはその断片をコードする核酸、ベクター、および該ベクターで形質転換された細胞もまた含まれることも可能である。
発明の詳細な説明
本発明の態様は、哺乳動物ＣＣ−ケモカイン受容体２（ＣＣＲ２、ＣＫＲ−２、ＭＣＰ−１ＲＡまたはＭＣＰ−１ＲＢ）またはＣＣＲ２の一部に結合する抗体（抗ＣＣＲ２）または機能するその断片に関する。１つの態様において、抗体は、ヒトまたはアカゲザルのＣＣＲまたはその一部に特異性を有する。１つの態様において、抗体（免疫グロブリン）は、単離および／または組換え哺乳動物ＣＣＲ２またはその一部（例えばペプチド）に対して、あるいは哺乳動物ＣＣＲ２を発現する宿主細胞に対して作成される。好ましい態様において、抗体は、ヒトＣＣＲ２受容体（単数または複数）（例えばＣＣＲ２ａおよび／またはＣＣＲ２ｂ）またはその一部に特異的に結合し、そして特に好ましい態様において、抗体は、天然存在または内因性ヒトＣＣＲ２に特異性を有する。本明細書において、「ＣＣ−ケモカイン受容体２」（「ＣＣＲ２」）は、ＣＣ−ケモカイン受容体２ａおよび／またはＣＣ−ケモカイン受容体２ｂを指す。哺乳動物ＣＣＲ２に特徴的な１以上の機能、例えば結合活性（例えばリガンド、阻害剤および／または促進剤結合）、シグナル伝達活性（例えば哺乳動物Ｇタンパク質の活性化、細胞質ゾル遊離カルシウム濃度［Ｃａ２＋］ｉの迅速でそして一過性の増加の誘導）、および／または細胞反応の刺激（例えば走化性、エキソサイトーシスまたは白血球による炎症性仲介因子放出の刺激、インテグリン活性化）を阻害可能な抗体または機能するその断片もまた、本発明に含まれ、例えばＣＣＲ２へのリガンド（すなわち１以上のリガンド）の結合を阻害可能な抗体、および／またはリガンドに反応した、ＣＣＲ２に仲介される１以上の機能を阻害可能な抗体がある。例えば、１つの側面において、抗体または機能するその断片は、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＣＰ−５および／またはエオタキシンなどの天然リガンドと受容体の相互作用を阻害する（減少させるかまたは防止する）ことも可能である。別の側面において、ＣＣＲ２に結合する抗体または機能するその断片は、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＣＰ−５および／またはエオタキシンおよび／またはＨＩＶの、哺乳動物ＣＣＲ２（例えばヒトＣＣＲ２、非ヒト霊長類ＣＣＲ２、ネズミＣＣＲ２）への結合を阻害することも可能である。本発明の抗体または機能するその断片は、白血球輸送、細胞へのＨＩＶ進入、Ｔ細胞活性化、炎症性仲介因子放出および／または白血球脱顆粒を含む、ヒトＣＣＲ２に仲介される機能を阻害することも可能である。好ましくは、抗体または断片は、少なくとも約０．１ｘ１０−８Ｍ、好ましくは少なくとも約１ｘ１０−９Ｍ、そしてより好ましくは少なくとも約３ｘ１０−９Ｍの親和性で、ＣＣＲ２に結合可能である。特定の態様において、抗体または機能するその断片は、ケモカインが誘導する（例えばＭＣＰ−１が誘導する）、細胞（例えばＰＢＭＣ）の走化性の阻害を、約１５０μｇ／ｍｌ未満で、好ましくは約１００μｇ／ｍｌ未満で、より好ましくは約５０μｇ／ｍｌ未満で、そしてさらにより好ましくは約２０μｇ／ｍｌ未満で示す。
本発明のさらなる態様において、本発明の抗体または機能するその断片は、ＣＣＲ２へのＣＣＲ２リガンド（例えばケモカイン）の結合を、約１．０μｇ／ｍｌ未満、好ましくは約０．０５μｇ／ｍｌ未満、そしてより好ましくは約０．００５μｇ／ｍｌ未満のＩＣ５０で阻害することも可能である。
本明細書に記載するように、１Ｄ９および８Ｇ２と称される、ＣＣＲ２に特異的なネズミ・モノクローナル抗体を産生した。好ましい態様において、本発明の抗体は、ヒトＣＣＲ２に結合し、そして本明細書記載のネズミ１Ｄ９または８Ｇ２抗体と同じかまたは類似のエピトープ特異性を有する。ヒトＣＣＲ２への（例えばヒトＣＣＲ２を有する細胞、例えばＣＣＲ２を有するトランスフェクタント、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤＲ４５ＲＯ＋細胞、ＣＤ２５＋細胞、単球、樹状細胞、マクロファージおよび好塩基球への）結合に関して、ネズミ１Ｄ９モノクローナル抗体と競合する能力によって、ネズミ１Ｄ９モノクローナル抗体と同じかまたは類似のエピトープ特異性を持つ抗体を同定することも可能である。同様に、ヒトＣＣＲ２への結合に関して、ネズミ８Ｇ２モノクローナル抗体と競合する能力によって、ネズミ８Ｇ２モノクローナル抗体と同じかまたは類似のエピトープ特異性を持つ抗体を同定することも可能である。受容体キメラ（Ｒｕｃｋｅｒら， Ｃｅｌｌ ８７：４３７−４４６（１９９６））を用いて、ｍＡｂ １Ｄ９および８Ｇ２の結合部位が、ヒトＣＣ−ケモカイン受容体２のアミノ末端ドメインに、具体的には該タンパク質のほぼアミノ酸１〜ほぼアミノ酸３０を含むエピトープにマッピングされてきている。これらの技術または他の適切な技術を用いて、本発明の抗体と同じかまたは類似のエピトープ特異性を有する抗体を同定することも可能である。ｍＡｂ １Ｄ９および８Ｇ２は、ＣＣＲ２受容体のアミノ末端ドメイン、例えば該受容体タンパク質のほぼアミノ酸番号１〜ほぼアミノ酸番号３０にエピトープ特異性を有する。したがって、本発明は、哺乳動物ＣＣ−ケモカイン受容体２のアミノ末端ドメインまたはその一部、そして特に哺乳動物ＣＣ−ケモカイン受容体２のほぼアミノ酸１〜ほぼアミノ酸３０を含むエピトープに結合する抗体または機能するそのドメインに関する。
本発明はまた、本明細書記載の抗体の少なくとも２つと同じかまたは類似のエピトープ特異性を有する、二重特異性抗体または機能するその断片（例えばＦ（ａｂ’）２）にも関する（例えば、米国特許第５，１４１，７３６号（Ｉｗａｓａら）、米国特許第４，４４４，８７８号、第５，２９２，６６８号、第５，５２３，２１０号（すべてＰａｕｌｕｓらに対するもの）および米国特許第５，４９６，５４９号（Ｙａｍａｚａｋｉら）を参照されたい）。例えば、本発明の二重特異性抗体は、ｍＡｂ １Ｄ９および８Ｇ２と同じかまたは類似のエピトープ特異性を有することも可能であり、例えば哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質のアミノ末端ドメインまたはその一部に結合する。
本発明記載の抗体を産生するハイブリドーマ細胞株は、１９９８年７月１７日、ＬｅｕｋｏＳｉｔｅ， Ｉｎｃ．， ２１５ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ ０２１４２， Ｕ．Ｓ．Ａ．（現Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．， ７５ Ｓｉｄｎｅｙ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ ０２１３９， Ｕ．Ｓ．Ａ．）の代理として、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０， Ｕ．Ｓ．Ａ．に、寄託番号ＨＢ−１２５４９（１Ｄ９）およびＨＢ−１２５５０（８Ｇ２）のもとで寄託された。本発明はまた、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ−１２５４９およびＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ−１２５５０のもとに寄託されたハイブリドーマ細胞株とともに、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ−１２５４９およびＨＢ−１２５５０のもとに寄託されたハイブリドーマ細胞株が産生するモノクローナル抗体にも関する。
本発明の抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであることも可能であり、そして用語「抗体」は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体両方を含むよう意図される。さらに、８Ｇ２を利用する、本明細書記載の方法はまた、８Ｇ２の機能する断片（例えば抗原結合性断片）、８Ｇ２と同じかまたは類似のエピトープ特異性を有する抗体、およびその組み合わせであって、場合によって、８Ｇ２と同じでもまた類似でもないエピトープ特異性を有する抗体または断片と組み合わせたものを利用することも可能であることも理解され；同様に、１Ｄ９を利用すると記載される方法はまた、１Ｄ９の機能する断片、１Ｄ９と同じかまたは類似のエピトープ特異性を有する抗体、およびその組み合わせであって、場合によって、１Ｄ９と同じでもまた類似でもないエピトープ特異性を有する抗体または断片と組み合わせたものを利用することも可能であることも理解される。適切な免疫原、例えば単離および／または組換え哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質またはその一部、あるいは合成分子、例えば合成ペプチドに対して、本発明の抗体を作成することも可能である。好ましい態様において、受容体を発現する細胞、例えばトランスフェクションした細胞を、免疫原として、または受容体に結合する抗体に関するスクリーニングにおいて、使用することも可能である。
本発明の抗体およびその断片は、本明細書に記載するような療法適用、診断適用および研究適用に有用である。本発明は、療法（予防を含む）または診断（例えば本明細書に記載するような特定の疾患または状態の診断）において使用するための本発明の抗体または機能するその一部（例えば、ｍＡｂ １Ｄ９もしくは８Ｇ２、またはその抗原結合性断片、あるいは本明細書に記載するような、他のＣＣＲ−２結合抗体またはその断片）、および本明細書に記載するような疾患または状態の治療において使用する医薬の製造のためのこうした抗体または機能するその一部の使用を含む。
免疫抗原の調製、並びにポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体産生を、本明細書に記載するように、または他の適切な技術を用いて、行うことも可能である。多様な方法が記載されてきている（例えば、Ｋｏｈｌｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５−４９７（１９７５）およびＥｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：５１１−５１９（１９７６）；Ｍｉｌｓｔｅｉｎら， Ｎａｔｕｒｅ ２６６：５５０−５５２（１９７７）；Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉら、米国特許第４，１７２，１２４号；Ｈａｒｌｏｗ， Ｅ．およびＤ． Ｌａｎｅ， １９８８， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２（補遺２７， ９４年夏）， Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．ら監修（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：ニューヨーク州ニューヨーク）， 第１１章， （１９９１）を参照されたい）。一般的に、適切な不死細胞株（例えばＳＰ２／０などの骨髄腫細胞株）と抗体産生細胞を融合させることによって、ハイブリドーマを産生することも可能である。抗体産生細胞は、好ましくは脾臓またはリンパ節のものであり、目的の抗原で免疫した動物から得られる。選択的培養条件を用いて、融合細胞（ハイブリドーマ）を単離し、そして限界希釈によってクローニングすることも可能である。適切なアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）によって、望ましい結合特性を持つ抗体を産生する細胞を選択することも可能である。
ヒト抗体または人工的抗体を含めて、ＣＣＲ２に結合する抗体を産生するかまたは単離するのに適した他の方法を用いることも可能であり、こうした方法には例えば、ライブラリーから組換え抗体（例えば一本鎖ＦｖまたはＦａｂ）を選択する方法、またはヒト抗体のレパートリーを産生可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）の免疫に頼る方法が含まれる（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：２５５１−２５５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら， Ｎａｔｕｒｅ， ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、米国特許第５，５４５，８０６号；Ｓｕｒａｎｉら、米国特許第５，５４５，８０７号を参照されたい）。
一本鎖抗体、およびキメラ抗体、ヒト化抗体または霊長類化抗体（ＣＤＲ−移植抗体）とともに、異なる種由来の部分を含むキメラ抗体またはＣＤＲ移植一本鎖抗体等もまた、本発明および用語「抗体」に含まれる。これらの抗体の多様な部分を、慣用的技術によって化学的にともに連結することも可能であるし、または遺伝子操作技術を用いて隣接タンパク質として調製することも可能である。例えば、キメラ鎖またはヒト化鎖をコードする核酸を発現させて、隣接タンパク質を産生することも可能である。例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許第０，１２５，０２３ Ｂ１号；Ｂｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号；Ｂｏｓｓら、欧州特許第０，１２０，６９４ Ｂｌ号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｍ．Ｓ．ら、ＷＯ ８６／０１５３３；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｍ．Ｓ．ら、欧州特許第０，１９４，２７６ Ｂ１号；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号；Ｗｉｎｔｅｒ、欧州特許第０，２３９，４００ Ｂ１号；並びにＱｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号、第５，６９８，７６１号および第５，６９８，７６２号を参照されたい。また、霊長類化抗体に関しては、Ｎｅｗｍａｎ， Ｒ．ら， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １０：１４５５−１４６０（１９９２）を、そして一本鎖抗体に関しては、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号およびＢｉｒｄ， Ｒ．Ｅ．ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４２：４２３−４２６（１９８８）も参照されたい。
さらに、キメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体または一本鎖抗体の断片を含む、抗体の機能する断片もまた、産生可能である。前述の抗体の機能する断片は、由来する全長抗体の少なくとも１つの結合機能および／または調節機能を保持する。好ましい機能する断片は、対応する全長抗体の抗原結合機能（例えば哺乳動物ＣＣＲ２に結合する能力）を保持する。特に好ましい機能する断片は、結合活性、シグナル伝達活性、および／または細胞反応の刺激などの、哺乳動物ＣＣＲ２に特徴的な１以上の機能を阻害する能力を保持する。例えば、１つの態様において、機能する断片は、ＣＣＲ２と、１以上のそのリガンド（例えば、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＣＰ−５および／またはエオタキシン）の相互作用を阻害することも可能であり、そして／または白血球輸送、細胞へのＨＩＶ進入、Ｔ細胞活性化、炎症性仲介因子放出および／または白血球脱顆粒などの、受容体が仲介する機能の１以上を阻害することも可能である。
例えば、限定されるわけではないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２断片を含む、哺乳動物ＣＣＲ２受容体またはその一部に結合可能な抗体断片が、本発明に含まれる。例えば酵素切断によって、または組換え技術によって、こうした断片を産生することも可能である。例えば、パパイン切断またはペプシン切断は、それぞれ、Ｆａｂ断片またはＦ（ａｂ’）２断片を生成することも可能である。１以上の停止コドンが天然停止部位の上流に導入されている抗体遺伝子を用いた多様な一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）型で、抗体を産生することもまた可能である。例えば、Ｆ（ａｂ’）２重鎖部分をコードするキメラ遺伝子を設計して、重鎖のＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含めることも可能である。
本発明は、ＣＣＲ２に結合特異性を有するヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片であって、非ヒト起源（例えばげっ歯類）の抗原結合性領域、およびヒト起源の免疫グロブリンの少なくとも一部（例えばヒト・フレームワーク領域、ヒト定常領域またはその一部）を含む、前記ヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片にも関する。１つの態様において、ヒト化免疫グロブリンには、ＣＣＲ２に結合する非ヒト起源の抗原結合性領域およびヒト定常領域由来の定常領域が含まれる。別の態様において、ＣＣＲ２に結合するヒト化免疫グロブリンは、非ヒト起源の相補性決定領域およびヒト起源の可変フレームワーク領域、並びに場合によって、ヒト起源の定常領域を含む。好ましくは、ＣＣＲ２に結合するヒト化免疫グロブリンには、非ヒト起源の相補性決定領域、ヒト起源の可変フレームワーク領域およびヒト起源の定常領域の少なくとも一部、例えばヒト起源のガンマ定常領域の少なくとも一部および／またはヒト起源のカッパ定常領域の少なくとも一部が含まれる。定常領域には、本明細書記載の１以上の突然変異が含まれることも可能である。いくつかの態様において、ヒト化免疫グロブリンは、重鎖および軽鎖を含むことも可能であり、ここで軽鎖はＣＣＲ２に結合する非ヒト起源の抗体由来の相補性決定領域およびヒト起源の軽鎖由来のフレームワーク領域を含み、そして重鎖はＣＣＲ２に結合する非ヒト起源の抗体由来の相補性決定領域およびヒト起源の重鎖由来のフレームワーク領域を含む。
１つの態様において、ヒト化免疫グロブリンは、ヒトＣＣＲ２への結合に関して、ネズミ１Ｄ９または８Ｇ２モノクローナル抗体と競合可能である。好ましい態様において、ヒト化免疫グロブリンの抗原結合性領域は、（ａ）１Ｄ９モノクローナル抗体由来である（例えば１Ｄ９軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および／または１Ｄ９重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むヒト化免疫グロブリンにおけるように）か、または（ｂ）８Ｇ２モノクローナル抗体由来である（例えば８Ｇ２軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および／または８Ｇ２重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むヒト化免疫グロブリンにおけるように）。キメラ抗体またはＣＤＲ移植一本鎖抗体もまた、用語、ヒト化免疫グロブリンに含まれる。
本発明はまた、ヒト化免疫グロブリン軽鎖またはその抗原結合性断片、あるいはヒト化免疫グロブリン重鎖またはその抗原結合性断片にも関する。１つの態様において、本発明は、非ヒト起源の軽鎖ＣＤＲ（すなわち１以上のＣＤＲ）およびヒト軽鎖フレームワーク領域を含むヒト化軽鎖に関する。いくつかの態様において、ヒト化免疫グロブリン軽鎖は、さらに、ヒト起源の定常領域、例えばヒト起源のカッパ軽鎖定常領域の、少なくとも一部を含むことも可能である。別の態様において、本発明は、非ヒト起源の重鎖ＣＤＲ（すなわち１以上のＣＤＲ）およびヒト重鎖フレームワーク領域を含むヒト化免疫グロブリン重鎖に関する。いくつかの態様において、ヒト化免疫グロブリン重鎖は、さらに、ヒト起源の定常領域、例えばヒト起源のガンマ重鎖定常領域の、少なくとも一部を含むことも可能である。定常領域は、本明細書記載の１以上の突然変異を含むことも可能である。ＣＤＲは、非ヒト免疫グロブリン由来であることも可能である。
天然存在免疫グロブリンは、共通のコア構造を有し、該コア構造において、２つの同一の軽鎖（約２４ｋＤ）および２つの同一の重鎖（約５５ｋＤまたは７０ｋＤ）が四量体を形成する。各鎖のアミノ末端部分は、可変（Ｖ）領域として知られ、そして各鎖の残りのより保存された定常（Ｃ）領域とは区別可能である。軽鎖の可変領域内には、Ｊ領域として知られるＣ末端部分がある。重鎖の可変領域内には、Ｊ領域に加えてＤ領域がある。免疫グロブリン中のアミノ酸配列変動の大部分は、超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）として知られるＶ領域中の３つの分離された位置に限定され、この領域は、抗原結合に直接関与する。これらの領域は、アミノ末端から、それぞれ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と称される。ＣＤＲは、より保存されるフレームワーク領域（ＦＲ）によって、定位置に配置される。これらの領域は、アミノ末端から、それぞれ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４と称される。ＣＤＲ領域およびＦＲ領域の位置および番号付け体系は、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔら， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版， 米国保健社会福祉省， 米国政府印刷局（１９９１））に定義されている。
ヒト免疫グロブリンは、重鎖のアイソタイプに応じて、クラスおよびサブクラスに分類可能である。クラスには、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥが含まれ、重鎖はそれぞれ、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）またはイプシロン（ε）型のものである。サブクラスには、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡｌおよびＩｇＡ２が含まれ、重鎖はそれぞれ、γ１、γ２、γ３、γ４、α１およびα２型のものである。選択されるクラスまたはサブクラスのヒト免疫グロブリン分子は、カッパ（κ）軽鎖またはラムダ（λ）軽鎖いずれかを含有することも可能である。例えば、Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｗｏｎｓｉｅｗｉｃｚ， Ｍ．Ｊ．監修， 第４５章， ｐｐ． ４１−５０， Ｗ．Ｂ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ， ペンシルバニア州フィラデルフィア（１９９１）；Ｎｉｓｏｎｏｆｆ， Ａ．， Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， 第２版， 第４章， ｐｐ． ４５−６５， Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．， マサチューセッツ州サンダーランド（１９８４）を参照されたい。
用語「免疫グロブリン」は、本明細書において、全抗体および生物学的に機能するその断片を含む。こうした生物学的に機能する断片は、対応する全長抗体の少なくとも１つの抗原結合機能（例えば抗体１Ｄ９のＣＣＲ２に対する特異性）を保持し、そして好ましくは、ＣＣＲ２と１以上のそのリガンド（例えば、ＨＩＶ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＣＰ−５、エオタキシン）の相互作用を阻害する能力を保持する。使用可能な生物学的に機能する抗体断片の例には、ＣＣＲ２に結合可能な断片、例えば一本鎖抗体、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片およびＦ（ａｂ’）２断片が含まれる。酵素切断によって、または組換え技術によって、こうした断片を産生することも可能である。例えば、パパイン切断またはペプシン切断を用いて、それぞれ、Ｆａｂ断片またはＦ（ａｂ’）２断片を生成することも可能である。１以上の停止コドンが天然停止部位の上流に導入されている抗体遺伝子を用いた多様な一部切除型で、抗体を産生することもまた可能である。例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片の重鎖をコードするキメラ遺伝子を設計して、重鎖のＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含めることも可能である。本明細書において、ヒト化免疫グロブリン重鎖または軽鎖の抗原結合性断片は、相補鎖と対形成した際、抗原に結合する断片を意味すると意図される。すなわち、ヒト化軽鎖の抗原結合性断片は、可変領域を含む重鎖（例えばネズミ、キメラ、ヒト化）と対形成した際に抗原に結合するであろうし、そしてヒト化重鎖の抗原結合性断片は、可変領域を含む軽鎖（例えばネズミ、キメラ、ヒト化）と対形成した際に抗原に結合するであろう。
用語「ヒト化免疫グロブリン」は、本明細書において、異なる起源の免疫グロブリンの部分を含む免疫グロブリンであって、少なくとも１つの部分がヒト起源である、前記免疫グロブリンを指す。例えば、ヒト化抗体は、必要な特異性を持つ非ヒト起源（例えばマウス）の免疫グロブリン由来の部分、およびヒト起源の免疫グロブリン配列（例えばキメラ免疫グロブリン）由来の部分をふくむことができ、これらを慣用技術（例えば合成）によって化学的に連結するか、または遺伝子操作技術を用いて隣接ポリペプチドとして調製することも可能である（例えばキメラ抗体のタンパク質部分をコードするＤＮＡを発現させて、隣接ポリペプチド鎖を産生することも可能である）。本発明のヒト化免疫グロブリンの別の例は、非ヒト起源の抗体由来のＣＤＲ、およびヒト起源の軽鎖および／または重鎖由来のフレームワーク領域を含む、１以上の免疫グロブリン鎖を含有する免疫グロブリン（例えばフレームワーク変化を含むまたは含まない、ＣＤＲ移植抗体）である。キメラ抗体またはＣＤＲ移植一本鎖抗体もまた、用語、ヒト化免疫グロブリンに含まれる。例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許第０，１２５，０２３ Ｂ１号；Ｂｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号；Ｂｏｓｓら、欧州特許第０，１２０，６９４ Ｂｌ号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｍ．Ｓ．ら、ＷＯ ８６／０１５３３；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｍ．Ｓ．ら、欧州特許第０，１９４，２７６ Ｂ１号；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号；Ｗｉｎｔｅｒ、欧州特許第０，２３９， ４００ Ｂ１号；Ｐａｄｌａｎ， Ｅ．Ａ．ら、欧州特許出願第０，５１９，５９６ Ａ１号を参照されたい。また、一本鎖抗体に関しては、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号；Ｈｕｓｔｏｎ、米国特許第５，４７６，７８６号；およびＢｉｒｄ， Ｒ．Ｅ．ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４２：４２３−４２６（１９８８）も参照されたい。
例えば、望ましいヒト化鎖をコードする遺伝子（例えばｃＤＮＡ）を調製するため、合成核酸および／または組換え核酸を用いて、ヒト化免疫グロブリンを産生することも可能である。例えば、ＰＣＲ突然変異誘発法を用いて、ヒト化可変領域をコードする核酸（例えばＤＮＡ）配列を構築し、先にヒト化された可変領域由来のＤＮＡテンプレートなどの、ヒトまたはヒト化鎖をコードするＤＮＡ配列を改変することも可能である（例えば、Ｋａｍｍａｎ， Ｍ．ら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １７：５４０４（１９８９））；Ｓａｔｏ， Ｋ．ら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５３：８５１−８５６（１９９３）；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ， Ｂ．Ｌ．ら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９（９）：２４７１−２４７６（１９９１）；並びにＬｅｗｉｓ， Ａ．Ｐ．およびＪ．Ｓ． Ｃｒｏｗｅ， Ｇｅｎｅ， １０１：２９７−３０２（１９９１）を参照されたい）。これらの方法または他の適切な方法を用いて、変異体もまた容易に産生可能である。１つの態様において、クローニングされた可変領域の突然変異を誘発して、そして望ましい特異性を持つ変異体をコードする配列を選択することも可能である（例えばファージライブラリーから；例えばＫｒｅｂｂｅｒら、米国特許第５，５１４，５４８号；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、ＷＯ ９３／０６２１３、１９９３年４月１日公表）。
ヒト化免疫グロブリンの抗原結合性領域（非ヒト部分）は、ＣＣＲ２に結合特異性を有する非ヒト起源の免疫グロブリン（ドナー免疫グロブリンと称される）に由来することも可能である。例えば、適切な抗原結合性領域は、ネズミ・モノクローナル抗体１Ｄ９に由来することも可能である。他の供給源には、げっ歯類（例えばマウス、ラット）、ウサギ、ブタ、ヤギまたは非ヒト霊長類（例えばサル）などの非ヒト供給源から得られるＣＣＲ２特異的抗体が含まれる。さらに、他のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、例えば１Ｄ９抗体と同じかまたは類似のエピトープに結合する抗体を作成することも可能である（例えば、Ｋｏｈｌｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５−４９７（１９７５）；Ｈａｒｌｏｗら， １９８８， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， （ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２（補遺２７， ９４年夏）， Ａｕｓｕｂｅｌら監修（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：ニューヨーク州ニューヨーク）， 第１１章（１９９１））。
例えば、適切な哺乳動物（例えばマウス、ラット、ウサギまたはヒツジ）において、適切な免疫原に対して抗体を作成することも可能である。ＣＣＲ２を有する細胞、ＣＣＲ２を含有する膜分画、およびＣＣＲ２の免疫原性断片が、適切な免疫原の例である。抗体産生細胞（例えばリンパ球）を、例えば免疫動物のリンパ節または脾臓から単離することも可能である。次いで、細胞を適切な不死化細胞（例えば骨髄腫細胞株）に融合させて、それによってハイブリドーマを形成することも可能である。選択的培養技術を使用して、融合させた細胞を単離することも可能である。適切なアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）によって、望ましい特異性を持つ抗体を産生する細胞を選択することも可能である。ＣＣＲ２に結合特異性を有する非ヒト起源の免疫グロブリンを、抗体ライブラリー（例えば非ヒトＦａｂ分子を含むファージライブラリー）から得ることもまた可能である。
１つの態様において、ヒト化免疫グロブリンの抗原結合性領域は、非ヒト起源のＣＤＲを含む。この態様において、ＣＣＲ２に結合特異性を有するヒト化免疫グロブリンは、非ヒト起源のＣＤＲを少なくとも１つ含む。例えば、ＣＤＲは、ヒト化免疫グロブリンが、非ヒト起源の１以上の免疫グロブリン由来の、実質的な重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３、並びに／あるいは軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３を含み、そして生じたヒト化免疫グロブリンがＣＣＲ２に結合特異性を有するように、非ヒト起源の免疫グロブリンの軽鎖および重鎖可変領域に由来することも可能である。好ましくは、選択される鎖の３つのＣＤＲはすべて、ドナーの対応する鎖のＣＤＲと実質的に同一であり、そしてより好ましくは、軽鎖および重鎖の３つのＣＤＲはすべて、対応するドナー鎖のＣＤＲと実質的に同一である。１つの態様において、本発明は、ＣＣＲ２に結合特異性を有する免疫グロブリンであって、１Ｄ９抗体の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むヒト化軽鎖またはその抗原結合性断片、および重鎖、例えばヒト重鎖を含む、前記免疫グロブリンに関する。本発明はまた、ＣＣＲ２に結合特異性を有する免疫グロブリンであって、１Ｄ９抗体の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むヒト化重鎖またはその抗原結合性断片、および軽鎖、例えばヒト軽鎖を含む、前記免疫グロブリンも含む。
本発明はまた、ＣＣＲ２に結合特異性を有し、軽鎖および重鎖を含む、免疫グロブリンであって、軽鎖が、非ヒト起源の抗体（例えば１Ｄ９）の少なくとも１つのＣＤＲおよびフレームワーク（例えば配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１０７）、並びにヒト起源の定常領域（例えば配列番号１１２）を含み、そして重鎖が、非ヒト起源（例えば１Ｄ９由来）の可変領域およびヒト起源の定常領域を含む、前記免疫グロブリンにも関する。本発明はまた、これらの免疫グロブリンの抗原結合性断片も提供する。本発明はまた、ＣＣＲ２に結合特異性を有し、軽鎖および重鎖を含む、免疫グロブリンであって、軽鎖が、非ヒト起源（例えば１Ｄ９由来）の可変鎖およびヒト起源の定常領域を含み、そして重鎖が、非ヒト起源の抗体（例えば１Ｄ９）の少なくとも１つのＣＤＲおよびフレームワーク（例えば配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０）、並びにヒト起源の定常領域（例えば配列番号１１０）を含む、前記免疫グロブリンにも関する。本発明はまた、これらの免疫グロブリンの抗原結合性断片も提供する。
ヒト起源（ヒト部分）のものであるヒト化免疫グロブリンまたは免疫グロブリン鎖の一部は、いかなる適切なヒト免疫グロブリンまたは免疫グロブリン鎖に由来することも可能である。例えば、ヒト定常領域またはその一部は、存在する場合、アレル変異体を含めて、ヒト抗体のκまたはλ軽鎖、および／またはγ（例えばγ１、γ２、γ３、γ４）、μ、α（例えばα１、α２）、δまたはε重鎖に由来することも可能である。エフェクター機能を調整するため、特定の定常領域（例えばＩｇＧ１）、その変異体または一部を選択することも可能である。例えば、突然変異定常領域（変異体）を融合タンパク質に取り込んで、Ｆｃ受容体への結合および／または補体を固定する能力を最小限にすることも可能である（例えば実施例３を参照されたい；また、Ｗｉｎｔｅｒら、ＧＢ ２，２０９，７５７ Ｂ；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＷＯ ８９／０７１４２；Ｍｏｒｇａｎら、ＷＯ ９４／２９３５１、１９９４年１２月２２日も参照されたい）。突然変異Ｌ２３５ＡおよびＧ２３７Ａは、ヒトＦｃ受容体への定常領域の結合を阻害し、そしてＡＤＣＣ反応の開始を阻害し、そして本明細書に援用される、米国特許第５，９８５，２７９号および国際公報第ＷＯ９８／０６２４８号に以前記載されてきている。免疫グロブリン鎖の残基の番号付けは、ＥＵインデックスのものである。Ｋａｂａｔら，（１９９１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７：１７０９−１９を参照されたい。本発明のヒト化免疫グロブリンは、１以上の：ヒト起源の軽鎖定常領域（例えば配列番号１１２）；およびヒト起源の重鎖定常領域を含むことも可能である。ヒト化抗体の重鎖定常領域は、突然変異重鎖定常領域、例えば突然変異Ｌ２３５ＡおよびＧ２３７Ａの１以上を有する重鎖定常領域、例えば配列番号１１０の重鎖定常領域をさらに含むことも可能である。
存在する場合、ヒト・フレームワーク領域（例えば軽鎖可変領域のもの）は、好ましくは、抗原結合性領域ドナーの類似の領域または同等の領域（例えば軽鎖可変領域）に配列類似性を有するヒト抗体可変領域由来である。ヒト化免疫グロブリンのヒト起源の部分のフレームワーク領域の他の供給源には、ヒト可変コンセンサス配列が含まれる（例えばＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ， Ｃ．Ａ．ら， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４：７７３−７８３（１９９１）；Ｃａｒｔｅｒら、ＷＯ ９４／０４６７９、１９９４年３月３日公表を参照されたい）。例えば、非ヒト部分を得るのに用いる抗体または可変領域の配列を、Ｋａｂａｔら， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版， 米国保健社会福祉省， 米国政府印刷局（１９９１）に記載されるようなヒト配列と比較することも可能である。特に好ましい態様において、ヒト化免疫グロブリン鎖のフレームワーク領域は、非ヒトドナー（例えばネズミ抗体１Ｄ９）の可変領域と、少なくとも約６０％の全配列同一性、好ましくは少なくとも約７０％の全配列同一性、そしてより好ましくは少なくとも約８５％の全配列同一性を有するヒト可変領域由来である。ヒト部分はまた、非ヒトドナーの同等の部分（例えばＦＲ）と比較した際、用いている特定の部分（例えばＦＲ）内で、少なくとも約６５％の配列同一性、そして好ましくは少なくとも約７０％の配列同一性を有するヒト抗体から得られうる。
１つの態様において、ヒト化免疫グロブリンは、ヒト起源の抗体の１以上の鎖に由来するフレームワーク領域（ＦＲ）を少なくとも１つ含む。したがって、ＦＲは、ヒト起源の１以上の抗体由来のＦＲ１および／またはＦＲ２および／またはＦＲ３および／またはＦＲ４を含むことも可能である。好ましくは、選択されるヒト化鎖のヒト部分には、ヒト起源の可変領域に由来するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４が含まれる（例えばヒト免疫グロブリン鎖由来、ヒトコンセンサス配列由来）。
本発明で使用する非ヒト起源およびヒト起源の免疫グロブリン部分は、これらが由来する免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの一部と、あるいはその変異体と、同一の配列を有する。こうした変異体には、１以上の残基の付加、欠失、または置換によって異なる突然変異体が含まれる。上述のように、非ヒト起源であるＣＤＲは、非ヒトドナーと実質的に同一であり、そして好ましくは非ヒトドナーのＣＤＲと同一である。実施例２に記載するように、ヒト起源のフレームワーク領域のある残基を、ドナーの対応する位由来の残基で置換するものなどの、フレームワーク領域中の変化を作成することも可能である。１以上のアミノ酸の欠失、挿入および置換を含む、１以上の突然変異を、フレームワーク領域中に作成することも可能である。実施例２におけるヒト化１Ｄ９抗体の設計において、こうした置換のいくつかを記載する。選択されるヒト化抗体または鎖に関して、本明細書に記載するように、フレームワーク突然変異を設計することも可能である。好ましくは、ヒト化免疫グロブリンは、非ヒトドナーのものに類似であるかまたはそれより優れた親和性で、ＣＣＲ２に結合可能である。非ヒトドナーまたはアクセプターヒト鎖の突然変異誘発を含む、多様な適切な方法によって、変異体を産生することも可能である。
本発明のヒト化免疫グロブリンは、ヒトＣＣＲ２に結合特異性を有する。好ましい態様において、本発明のヒト化免疫グロブリンは、結合機能（例えばＣＣＲ２に特異性を有する、同じかまたは類似のエピトープ特異性を有する）、および／または阻害機能（例えばＣＣＲ２依存性機能をｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏで阻害する能力、例えばＣＣＲ２を有する細胞のそのリガンド（例えばケモカイン）への結合を阻害する能力）など、ネズミ抗体１Ｄ９の機能特性を少なくとも１つ有する。したがって、好ましいヒト化免疫グロブリンは、ネズミ抗体１Ｄ９の結合特異性、ネズミ抗体１Ｄ９のエピトープ特異性（例えばＣＣＲ２（例えばＣＣＲ２を有する細胞上）への結合に関して、ネズミ１Ｄ９、キメラ１Ｄ９抗体、またはヒト化１Ｄ９抗体と競合可能である）、および／またはネズミ抗体１Ｄ９の阻害機能を有することも可能である。
標準的免疫学的方法によって、例えばヒト化免疫グロブリンおよびＣＣＲ２（例えばＣＣＲ２を含む膜分画、ＣＣＲ２を有する細胞上、ＣＣＲ２をコードする核酸を含み、ＣＣＲ２を発現する、ヒト細胞株または組換え宿主細胞）間の複合体の形成を監視するアッセイを用いて、ＣＣＲ２に結合特異性を有するヒト化免疫グロブリンの結合機能を検出することも可能である。必要な特異性を持つヒト化免疫グロブリン（例えばライブラリー由来）の同定および／または単離のための方法において、結合アッセイおよび／または接着アッセイまたは他の適切な方法もまた使用可能である（例えばＣＣＲ２を有する細胞およびそのリガンド（例えばＨＩＶ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＣＰ−５、エオタキシン）間の接着を監視するアッセイ、または他の適切な方法）。
本発明で使用する非ヒト起源およびヒト起源の免疫グロブリンの一部には、軽鎖、重鎖、並びに軽鎖および重鎖の一部が含まれる。これらの免疫グロブリンの一部は、免疫グロブリンから得られるかまたはそれに由来することも可能であるし（例えば一部を新規合成することによって）、あるいは望ましい特性（例えばＣＣＲ２結合、配列類似性）を有する免疫グロブリンまたはその鎖をコードする核酸分子を産生し、そして発現させることも可能である。合成および／または組換え核酸を用いて、望ましいヒト化鎖をコードする遺伝子（例えばｃＤＮＡ）を調製し、ヒト起源および非ヒト起源の望ましい部分（例えば抗原結合性領域、ＣＤＲ、ＦＲ、Ｃ領域）を含むヒト化免疫グロブリンを産生することも可能である。鎖の一部を調製するため、望ましい位置に１以上の停止コドンを導入することも可能である。例えば、ＰＣＲ突然変異誘発法を用い、存在するＤＮＡ配列を改変して、新規に設計されたヒト化可変領域をコードする核酸（例えばＤＮＡ）配列を構築することも可能である（例えば、Ｋａｍｍａｎ， Ｍ．ら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７：５４０４（１９８９）を参照されたい）。同じかまたは非常に類似のヒト可変領域に基づく、先にヒト化された可変領域のＤＮＡテンプレートに、新規ＣＤＲをコードするＰＣＲプライマーをハイブリダイズさせることも可能である（Ｓａｔｏ， Ｋ．ら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５３：８５１−８５６（１９９３））。テンプレートとして使用するための、類似のＤＮＡ配列が入手不能である場合、可変領域配列をコードする配列を含む核酸を、合成オリゴヌクレオチドから構築することも可能である（Ｋｏｌｂｉｎｇｅｒ， Ｆ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ８：９７１−９８０（１９９３）を参照されたい）。シグナルペプチドをコードする配列もまた、核酸に取り込むことも可能である（例えば合成時に、ベクターへの挿入に際して）。天然シグナルペプチド配列が入手不能である場合、別の抗体由来のシグナルペプチド配列を使用することも可能である（例えば、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ， Ｃ．Ａ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４：７７３−７８３（１９９１）を参照されたい）。これらの方法、本明細書記載の方法または他の適切な方法を用いると、変異体を容易に産生可能である。１つの態様において、クローニングされた可変領域の突然変異を誘発して、そして望ましい特異性を持つ変異体をコードする配列を選択することも可能である（例えばファージライブラリーから；例えばＫｒｅｂｂｅｒら、米国特許第５，５１４，５４８号；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、ＷＯ ９３／０６２１３、１９９３年４月１日公表）。
本発明は、ヒト化免疫グロブリン軽鎖またはその抗原結合性断片であって、配列番号９の軽鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも機能する部分を含むアミノ酸配列を有する、前記軽鎖またはその抗原結合性断片に関する。好ましい態様において、アミノ酸配列は、配列番号９の少なくとも１つ、好ましくは２つ、そしてより好ましくは３つのＣＤＲを含む。本発明はまた、ヒト化免疫グロブリン重鎖またはその抗原結合性断片であって、配列番号１０に示す重鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも機能する部分を含むアミノ酸配列を有する、前記重鎖またはその抗原結合性断片にも関する。好ましい態様において、アミノ酸配列は、配列番号１０の少なくとも１つ、好ましくは２つ、そしてより好ましくは３つのＣＤＲを含む。本明細書に記載するネズミ配列はすべて、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）に由来することに注目されたい。
本発明の１つの態様にしたがって、ＣＣＲ２に結合特異性を有する、ヒト化免疫グロブリン軽鎖またはその抗原結合性断片は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１０７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことも可能である。本発明の別の態様にしたがって、ＣＣＲ２に結合特異性を有する、ヒト化免疫グロブリン重鎖またはその抗原結合性断片は、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、および配列番号２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことも可能である。特定の態様において、本発明のヒト化免疫グロブリンは、ＣＣＲ２に結合特異性を有する軽鎖またはその抗原結合性断片であって、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１０７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、前記軽鎖またはその抗原結合性断片、並びにＣＣＲ２に結合特異性を有する重鎖またはその抗原結合性断片であって、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、および配列番号２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、前記重鎖またはその抗原結合性断片を、両方、含むことも可能である。こうしたヒト化免疫グロブリンは、配列番号１１２のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域、またはその一部、および／または配列番号１１０のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域、またはその一部をさらに含むことも可能である。
１つの態様において、本発明は、ＣＣＲ２に結合特異性を有するヒト化免疫グロブリンであって、配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖および相補的重鎖を含む、前記ヒト化免疫グロブリン、またはＣＣＲ２に結合特異性を有する前記ヒト化免疫グロブリンの抗原結合性断片に関する。別の態様において、本発明は、ＣＣＲ２に結合特異性を有するヒト化免疫グロブリンであって、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖および相補的軽鎖を含む、前記ヒト化免疫グロブリン、またはＣＣＲ２に結合特異性を有する前記ヒト化免疫グロブリンの抗原結合性断片に関する。相補的軽鎖または相補的重鎖は、それぞれ、選択される重鎖または軽鎖と会合可能であり、前記相補的重鎖および軽鎖を含む免疫グロブリンが、ＣＣＲ２に結合特異性を有する能力を生じるものである。好ましい態様において、本発明は、ＣＣＲ２に結合特異性を有するヒト化免疫グロブリンであって、配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖および配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、前記ヒト化免疫グロブリン、またはＣＣＲ２に結合特異性を有する前記ヒト化免疫グロブリンの抗原結合性断片に関する。別の好ましい態様において、ヒト化免疫グロブリンは、配列番号１１２のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域、またはその一部、および／または配列番号１１０のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域、またはその一部をさらに含むことも可能である。
別の態様において、本発明のヒト化免疫グロブリンは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖、並びに配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖の両方を含むか、またはＣＣＲ２に結合特異性を有する前記免疫グロブリンの抗原結合性断片を含む。さらなる態様において、本発明のヒト化免疫グロブリンは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖、並びに配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖の両方を含むか、またはＣＣＲ２に結合特異性を有する前記免疫グロブリンの抗原結合性断片を含む。さらなる態様において、本発明のヒト化免疫グロブリンは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖、並びに配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖の両方を含むか、またはＣＣＲ２に結合特異性を有する前記免疫グロブリンの抗原結合性断片を含む。別の態様において、本発明のヒト化免疫グロブリンは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖、並びに配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖の両方を含むか、またはＣＣＲ２に結合特異性を有する前記免疫グロブリンの抗原結合性断片を含む。別の態様において、本発明のヒト化免疫グロブリンは、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む軽鎖、並びに配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖の両方を含むか、またはＣＣＲ２に結合特異性を有する前記免疫グロブリンの抗原結合性断片を含む。
別の態様において、本発明のヒト化免疫グロブリンは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１０７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖、並びに配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖の両方を含むか、またはＣＣＲ２に結合特異性を有する前記免疫グロブリンの抗原結合性断片を含む。別の態様において、本発明のヒト化免疫グロブリンは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１０７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖、並びに配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖の両方を含むか、またはＣＣＲ２に結合特異性を有する前記免疫グロブリンの抗原結合性断片を含む。さらなる態様において、本発明のヒト化免疫グロブリンは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１０７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖、並びに配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖の両方を含むか、またはＣＣＲ２に結合特異性を有する前記免疫グロブリンの抗原結合性断片を含む。さらなる態様において、本発明のヒト化免疫グロブリンは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１０７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖、並びに配列番号２０のアミノ酸配列を含む重鎖の両方を含むか、またはＣＣＲ２に結合特異性を有する前記免疫グロブリンの抗原結合性断片を含む。
１つの態様において、ＣＣＲ２に結合特異性を有する、ヒト化免疫グロブリン軽鎖または抗原結合性断片は、配列番号１０９を含む核酸分子にコードされることも可能である。ヒト化免疫グロブリン軽鎖またはその抗原結合性断片は、さらに、配列番号１１３の核酸にコードされる定常領域を含むことも可能である。好ましくは、ヒト化免疫グロブリン軽鎖は、配列番号１０９の核酸にコードされ、そして配列番号１１３の核酸に連結される。別の態様において、ＣＣＲ２に結合特異性を有する、ヒト化免疫グロブリン重鎖またはその抗原結合性断片は、配列番号１０８を含む核酸分子にコードされることも可能である。ヒト化免疫グロブリン重鎖またはその抗原結合性断片は、さらに、配列番号１１１の核酸分子にコードされる定常領域を含むことも可能である。好ましくは、ヒト化免疫グロブリン軽鎖は、配列番号１０８の核酸にコードされ、そして配列番号１１１の核酸に連結される。
本発明はまた、ＣＣＲ２に結合特異性を有し、非ヒト起源の軽鎖可変領域およびヒト定常領域（例えば軽鎖定常領域）を含む、キメラ免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片にも関する。本発明はさらに、ＣＣＲ２に結合特異性を有し、非ヒト起源の重鎖可変領域およびヒト定常領域（例えば重鎖定常領域）を含む、キメラ免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片に関する。別の態様において、ＣＣＲ２に結合特異性を有するキメラ免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片は、非ヒト起源の軽鎖可変鎖領域および非ヒト起源の重鎖可変領域を含み、そしてヒト定常領域（例えばヒト軽鎖定常領域および／またはヒト重鎖定常領域）をさらに含む。
核酸および構築物
本発明はまた、本発明のヒト化免疫グロブリンあるいはヒト化免疫グロブリン軽鎖または重鎖をコードする核酸配列を含む、単離および／または組換え（例えば実質的に純粋なものを含む）核酸にも関する。
本明細書において、「単離された」と称される核酸分子は、起源の供給源のゲノムＤＮＡまたは細胞性ＲＮＡの核酸（例えば細胞に、またはライブラリーなどの核酸混合物に存在するようなもの）から分離されており、そして本明細書記載の方法または他の適切な方法によって得られる核酸分子を含み、これには、本質的に純粋な核酸分子、化学合成によって産生される核酸分子、生物学的方法および化学的方法の組み合わせによって産生される核酸分子、および単離された組換え核酸分子が含まれる（例えばＤａｕｇｈｅｒｔｙ， Ｂ．Ｌ．ら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９（９）：２４７１−２４７６（１９９１）；Ｌｅｗｉｓ， Ａ．Ｐ．およびＪ．Ｓ． Ｃｒｏｗｅ， Ｇｅｎｅ， １０１：２９７−３０２（１９９１）を参照されたい）。
本明細書において、「組換え」と称される核酸分子は、組換えＤＮＡ方法論によって産生されている核酸分子であり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および／または制限酵素を用いたベクターへのクローニングなど、人工的組み換えの方法に頼る方法によって生成されたものが含まれる。「組換え」核酸分子はまた、細胞の天然機構を通じて起こる組換え事象から生じるが、望ましい組換え事象が許容され、そして起こりうるように設計された核酸を細胞に導入した後に選択されるものでもある。
本発明はまた、より具体的には、ヒト化１Ｄ９免疫グロブリン（すなわち非ヒト部分がネズミ・モノクローナル抗体１Ｄ９に由来する、本発明のヒト化免疫グロブリン）またはその鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、単離および／または組換え核酸分子にも関する。１つの態様において、軽鎖は、１Ｄ９抗体の軽鎖由来の３つの相補性決定領域を含み、そして重鎖は、１Ｄ９抗体の重鎖由来の３つの相補性決定領域を含む。こうした核酸分子には、例えば、（ａ）ヒト化１Ｄ９免疫グロブリンの重鎖可変領域（例えば図８および図２１の重鎖可変領域）のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列を含む核酸分子（例えば配列番号９６のヌクレオチド５８〜４１１）；（ｂ）ヒト化１Ｄ９免疫グロブリンの軽鎖可変領域（例えば図７および図２２の軽鎖可変領域）のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列を含む核酸分子（例えば配列番号９５のヌクレオチド５２〜３９０）；（ｃ）ヒト化１Ｄ９免疫グロブリンの軽鎖または重鎖可変領域の少なくとも機能する一部（例えば前記鎖を含むヒト化免疫グロブリンの抗原結合に十分な一部）をコードする配列を含む核酸分子が含まれる。１つの態様において、核酸は、図２１に示すようなまたは実質的に示すような、あるいは図２２に示すようなまたは実質的に示すような、可変領域のヌクレオチド配列を含み、二本鎖または一本鎖ポリヌクレオチドを含む。（多様な図が、可変領域より大きいポリペプチドを例示する（すなわち、シグナルペプチドコード配列または定常領域コード配列の一部を含む）ことも可能であるが、特定の図の可変領域への言及は、示した配列の可変領域部分を含むことが意味される）。別の好ましい態様において、軽鎖またはその抗原結合性部分をコードする核酸配列には、配列番号１０９のヌクレオチド配列および／または配列番号１１３のヌクレオチド配列が含まれる。別の好ましい態様において、重鎖またはその抗原結合性部分をコードする核酸には、配列番号１０８のヌクレオチド配列および／または配列番号１１１のヌクレオチド配列が含まれる。遺伝暗号の縮重のため、選択されるポリペプチドをコードする、多様な核酸を作成することも可能である。したがって、本発明はまた、配列番号１２の可変軽鎖をコードする核酸および／または配列番号１１２の定常軽鎖をコードする核酸を含む、軽鎖をコードする核酸も特徴とする。本発明はまた、配列番号１７の可変重鎖をコードする核酸および／または配列番号１１０の定常重鎖をコードする核酸を含む、重鎖をコードする核酸も特徴とする。これらの基準を満たす単離および／または組換え核酸分子は、ヒト化１Ｄ９抗体または上に論じるようなその変異体の配列に同一の配列をコードする核酸分子を含むことも可能である。
本発明の核酸分子を、ＣＣＲ２に結合特異性を有するヒト化免疫グロブリンの産生に用いることも可能である。例えば、配列をさらに操作するため、または適切な宿主細胞において、コードされるポリペプチドを産生するため、本発明のヒト化免疫グロブリンをコードする核酸分子（例えばＤＮＡ）を、適切な構築物（例えばベクター）に取り込むことも可能である。こうした核酸を含有するベクターは、好ましくは、本明細書記載のヒト化免疫グロブリンを発現し、例えば、配列番号１２の可変軽鎖、配列番号１１２の定常軽鎖、配列番号１７の可変重鎖、および配列番号１１０の重鎖定常領域の１以上を発現する。ベクターに挿入する核酸配列には、例えば、１以上の端にさらなる配列（例えば制限エンドヌクレアーゼ部位、ベクターまたは隣接配列中で利用可能な部位に相補的な制限エンドヌクレアーゼ）を含むことも可能であり、こうしたさらなる配列がベクターに適切に挿入された場合、ベクターは、これらのさらなる配列にコードされるアミノ酸を発現しないであろう。こうしたさらなる配列を含む核酸配列の例を、配列番号９８、配列番号１１７、配列番号９７および配列番号１１５に示す。
ベクターには、リーダー配列および安定な免疫グロブリンドメイン（例えば定常領域）間の機能可能な連結が含まれることも可能であり、こうした連結には、制限エンドヌクレアーゼを用いた消化を受け入れる配列が含まれる。機能可能な連結内に操作して入れられる、好ましい制限エンドヌクレアーゼ部位には、ＥｃｏＲＶ、ＰｐｕＭＩまたはＭｆｅＩおよびＢｌｐＩまたはＢｓｉＷＩが含まれるが、ＤＮＡカセットと組み合わせて用いる、特定の望ましいさらなる配列に対応するため、さらなる部位または別の部位を操作することも可能である。制限部位を操作する方法（例えば部位特異的突然変異誘発）および配列解析を通じた好ましい部位の決定は、当該技術分野に周知である。連結内に制限部位を操作して入れると、さらなる免疫グロブリン配列（例えば可変領域）が続いて取り込まれることが可能になり、さらなる配列がリーダーおよび安定なドメイン（例えば定常領域）と機能可能に連結して取り込まれて、完全に機能可能な免疫グロブリン分子をコードする核酸の産生が可能になる（例えばさらなる可変配列のクローニング後、該配列がリーダーおよび定常領域とインフレームなままであり、リーダー、可変ドメインおよび定常ドメインを含む免疫グロブリンタンパク質をコードする核酸が産生される）。
挿入配列の５’端および３’端が、ＤＮＡカセット中で利用可能な部位に相補的な、制限エンドヌクレアーゼ利用可能配列を含む、免疫グロブリン可変ドメイン核酸配列を単離することも可能である。１つの態様において、当該技術分野に知られるＰＣＲ技術を用いて、免疫グロブリン可変配列を単離し、この場合、適切な配置でＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼ配列を取り込むように、プライマー配列を操作して、免疫グロブリンＤＮＡカセットに取り込まれた際に機能可能な連結を可能にする。
ターゲティング分子
本発明はまた、ターゲット細胞とＣＣＲ２発現細胞の相互作用を達成可能なターゲティング分子にも関する。ターゲティング分子には、哺乳動物ＣＣＲ２に結合可能な第一の結合性部分、およびターゲット細胞表面上に発現される分子に結合可能な第二の結合性部分が含まれる。好ましいターゲット細胞には、腫瘍細胞およびウイルス感染細胞が含まれる。腫瘍細胞上でより高いレベルでまたはユニークに発現される多様な分子（例えば、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ジシアロガングリオシドＧ３、癌胎児抗原、ＣＤ３０などの腫瘍抗原）および／またはウイルス感染細胞上でそのように発現される分子（例えば、インフルエンザウイルス赤血球凝集素、エプスタイン−バーウイルスＬＭＰ−１、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２糖タンパク質、ＨＩＶ ｇｐ１６０、ＨＩＶ ｇｐ１２０などのウイルス抗原）が、当該技術分野に知られる。ターゲティング分子は、望ましいターゲット細胞上に発現される分子に結合する、適切な結合性の第二の部分いずれを含有することも可能である（例えば、その解説が完全に本明細書に援用される、Ｒｉｎｇ、米国特許第５，９４８，６４７号を参照されたい）。適切な結合性部分には、例えば、哺乳動物ＣＣＲ２またはターゲット細胞の表面上に発現される分子に結合する、タンパク質およびペプチド（翻訳後修飾型、例えばグリコシル化型、リン酸化型、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）型を含む）、糖、脂質、ペプチド擬似体、小有機分子、核酸および他の剤が含まれる。適切な結合性部分を、本明細書記載の結合アッセイなどの、適切な方法いずれを用いて同定することも可能である。
好ましい態様において、第一の結合性部分は、例えば、哺乳動物ＣＣＲ２に結合する、本発明のヒト化免疫グロブリン、またはその抗原結合性断片（例えばＦａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２）であることも可能である。第二の結合性部分は、例えば、標的細胞上に発現される分子に結合する抗体（例えば第二のヒト化免疫グロブリン）またはその抗原結合性断片であることも可能である。ターゲティング分子が、ヒト化抗ＣＣＲ２免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片である、第一の結合性部分を含む場合、ヒト化抗ＣＣＲ２免疫グロブリンが、ＣＣＲ２へのリガンドの結合を阻害しないことが好ましい。
第一の結合性部分は、直接または間接的に、多様な適切な連結を通じて、第二の結合性部分に結合することも可能である。例えば、第一の結合性部分および第二の結合性部分が、どちらもタンパク質またはペプチドである場合、該部分は、隣接ポリペプチド（すなわち融合タンパク質）の一部であることも可能である。ターゲティング分子が融合タンパク質である場合、第一の結合性部分および第二の結合性部分を、適切な配置いずれかで、ポリペプチド上に配置することも可能である。第一の結合性部分および第二の結合性部分は、ペプチドリンカー（すなわち１以上のペプチドリンカー）を通じて間接的に結合することも可能であるし、またはペプチド結合を通じて、互いに直接結合することも可能である。
結合性部分が、隣接ポリペプチドの一部でない場合、これらは、第一の部分上の官能基（またはその活性化誘導体）と第二の部分上の第二の官能基（またはその活性化誘導体）の反応によって形成される化学結合によって、直接結合することも可能である。例えば、２つのチオールが反応してジスルフィド結合を形成することも可能であるし、そしてアミンがカルボン酸またはハロゲン化アシルと反応してアミドを形成することも可能である。使用可能な、多様な他の適切な反応が、当該技術分野に知られる（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， Ｇ．Ｔ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：カリフォルニア州サンディエゴ（１９９６）を参照されたい）。結合性部分は、適切なリンカー（例えばペプチドリンカー）を通じて間接的に結合することも可能である。一般的に、リンカーは、第一の結合性部分および／または第二の結合性部分と結合を形成するように反応可能な、２つの反応基を含有する。２つの異なる反応基を含有するリンカー（例えばヘテロ二官能性リンカー）を用いて、第一の結合性部分を第二の結合性部分に選択的にコンジュゲート化することも可能である。タンパク質、核酸、ペプチド、ビタミン、糖、脂質、小有機分子および他の適切な剤間でコンジュゲートを形成するのに適した多くのリンカーが知られる（例えば、米国特許第５，８５６，５７１号、第５，８８０，２７０号；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ， Ｇ．Ｔ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：カリフォルニア州サンディエゴ（１９９６）を参照されたい）。
好ましくは、ターゲティング分子の結合性部分の独立の活性（例えば結合活性、化学誘引活性）は、別個の分子実体としての結合性部分の活性と有意には異ならない。例えば、第一の結合性部分が、ＣＣＲ２に結合するヒト化免疫グロブリンまたは抗原結合性断片である場合、遊離抗体または抗原結合性断片の親和性の約１０００の係数内で、好ましくは１００の係数内で、より好ましくは１０の係数内で、または実質的に同じ親和性で、ターゲティング分子がＣＣＲ２に結合することも可能である。いかなる適切な方法を用いて、これらの好ましい特性を持つターゲット分子を調製することも可能である。次いで、結合に関して（例えばＥＬＩＳＡによって）、そして化学誘引活性に関して、生じたターゲティング分子をアッセイすることも可能である。
１つの態様において、ターゲティング分子は、哺乳動物ＣＣＲ２およびターゲット細胞上に発現される分子（例えば腫瘍抗原、ウイルス抗原）に特異性を有する、二重特異性ヒト化抗体またはその二重特異性抗原結合性断片（例えばＦ（ａｂ’）２）である。二重特異性抗体は、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａｓ）およびハイブリッド・ハイブリドーマによって分泌されることも可能である。適切なアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）を用いて、二重特異性抗体に関して、トリオーマおよびハイブリッド・ハイブリドーマの上清をアッセイすることも可能であり、そして慣用法を用いて、二重特異性抗体を精製することも可能である。次いで、本明細書記載の方法にしたがって、これらの抗体をヒト化することも可能である。したがって、本発明は、ＣＣＲ２およびターゲット細胞上に発現される抗原に結合特異性を有する、ヒト化二重特異性抗体または該二重特異性抗体の二価抗原結合性断片である、ターゲティング分子を提供する。本発明はまた、患者において、ターゲット細胞とＣＣＲ２所持細胞の相互作用を達成する方法であって、ＣＣＲ２およびターゲット細胞上の抗原に結合特異性を有する、ヒト化二重特異性抗体または該二重特異性抗体の二価抗原結合性断片である、ターゲティング分子の有効量を患者に投与することを含む、前記方法にも関する。
ＣＣＲ２に特異性を有するヒト化免疫グロブリンを産生する方法
本発明の別の側面は、ＣＣＲ２に結合特異性を有するヒト化免疫グロブリンを調製する方法に関する。例えば、適切な宿主細胞において、ＣＣＲ２に結合特異性を有するヒト化免疫グロブリンをコードする１以上の組換え核酸を発現させることによって、ヒト化免疫グロブリンを得ることも可能である。
ＣＣＲ２に結合特異性を有するヒト化免疫グロブリンの発現に適した構築物または発現ベクターもまた、提供する。構築物を適切な宿主細胞に導入することも可能であるし、そして本発明のヒト化免疫グロブリンを発現する細胞を産生し、そして培養中で維持することも可能である。適切な宿主細胞は、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびまたは他の適切な細菌などの細菌細胞を含む原核細胞、あるいは真菌細胞または酵母細胞（例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ））、または他のより低次の真核細胞、および昆虫由来（例えばＳｆ９昆虫細胞（ＷＯ ９４／２６０８７、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ、１９９４年１１月２４日公表））または哺乳動物由来（例えばＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１６５０）およびＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１６５１）などのＣＯＳ細胞、ＣＨＯ（例えばＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−９０９６）、２９３（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ−１５７３）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ−２）、ＣＶ１（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ−７０）、ＷＯＰ（Ｄａｉｌｅｙら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ５４：７３９−７４９（１９８５））、３Ｔ３、２９３Ｔ（Ｐｅａｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ９０：８３９２−８３９６（１９９３））、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０、ＨｕＴ７８細胞等（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．ら監修 Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．，（１９９３）を参照されたい）のより高次の真核生物の細胞などの、真核細胞であることも可能である。本発明の抗体を発現するため、好ましい哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）が含まれる（例えばＲ．Ｊ． ＫａｕｆｍａｎおよびＰ．Ａ． Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５９：６０１−６２１に記載されるようなＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに用いられる、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ， （１９８０）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０に記載されるｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞が含まれる）。
ＣＣＲ２に結合特異性を有するヒト化免疫グロブリンを産生する宿主細胞を、以下のように産生することも可能である。例えば、望ましいヒト化免疫グロブリンのコード配列のすべてまたは一部をコードする核酸を、核酸ベクター、例えばＤＮＡベクター、例えばプラスミド、ウイルス、または発現に適した他のレプリコンに挿入することも可能である。単一コピーまたは多コピーで維持されるか、または宿主細胞染色体に組み込まれるベクターを含む、多様なベクターが利用可能である。
適切な発現ベクターは、限定されるわけではないが、以下の１以上を含む、いくつかの構成要素を含有することも可能である：複製起点；選択可能マーカー遺伝子；１以上の発現調節要素、例えば転写調節要素（例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーター）、および／または１以上の翻訳シグナル；膜ターゲティングまたは分泌のためのシグナル配列またはリーダー配列。構築物において、ベクターまたは他の供給源によって、シグナル配列を提供することも可能である。例えば、免疫グロブリンの転写シグナルおよび／または翻訳シグナルを用いて、発現を指示することも可能である。
適切な宿主細胞における発現のためのプロモーターを提供することも可能である。プロモーターは恒常性または誘導性であることも可能である。例えば、コードされるポリペプチドの発現をプロモーターが指示するように、ヒト化免疫グロブリンまたは免疫グロブリン鎖をコードする核酸に、機能可能であるようにプロモーターを連結することも可能である。原核生物宿主に適した多様なプロモーター（例えば大腸菌ではｌａｃ、ｔａｃ、Ｔ３、Ｔ７プロモーター）および真核生物宿主に適したプロモーター（例えば酵母アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１）、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＥＦ−１α）が入手可能である。
さらに、発現ベクターは、典型的には、ベクターを有する宿主細胞の選択のための選択可能マーカー、および複製可能発現ベクターの場合は複製起点を含む。抗生物質耐性または薬剤耐性を与える産物をコードする遺伝子が、一般的な選択可能マーカーであり、そして原核細胞（例えばβ−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性）、テトラサイクリン耐性のためのＴｅｔ遺伝子）および真核細胞（例えばネオマイシン（Ｇ４１８またはジェネテシン）、ｇｐｔ（ミコフェノール酸）、アンピシリン、またはハイグロマイシン耐性遺伝子）で使用することも可能である。ジヒドロ葉酸レダクターゼマーカー遺伝子は、多様な宿主において、メトトレキセートを用いた選択を可能にする。宿主の栄養要求マーカーの遺伝子産物（例えばＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３）をコードする遺伝子は、しばしば、酵母における選択可能マーカーとして用いられる。ウイルス（例えばバキュロウイルス）またはファージベクター、およびレトロウイルスベクターなどの、宿主細胞のゲノムに組み込み可能なベクターの使用もまた、意図される。１つの態様において、ベクターはｐＬＫＴＯＫ３８である。本発明はまた、これらの発現ベクターを有する細胞にも関する。
ヒト化免疫グロブリン軽鎖をコードする融合遺伝子を含む発現ベクターであって、前記遺伝子が、ＣＣＲ２に結合特異性を有する非ヒト抗体の軽鎖由来のＣＤＲおよびヒト起源の軽鎖由来のフレームワーク領域、並びに場合によって定常領域、例えば本明細書記載の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含む、前記発現ベクターも本発明に含まれる。
したがって、本発明は、ヒト化免疫グロブリン軽鎖をコードする遺伝子を含む発現ベクターであって、前記遺伝子が、ＣＣＲ２に結合特異性を有する非ヒト抗体の軽鎖由来のＣＤＲおよびヒト起源の軽鎖由来のフレームワーク領域をコードするヌクレオチド配列、並びに場合によって、軽鎖定常領域、例えば本明細書記載の軽鎖定常領域のすべてまたは一部をコードするヌクレオチド配列を含む、前記発現ベクターを含む。本発明はまた、ヒト化免疫グロブリン重鎖をコードする遺伝子を含む発現ベクターであって、前記遺伝子が、ＣＣＲ２に結合特異性を有する非ヒト抗体の重鎖由来のＣＤＲおよびヒト起源の重鎖由来のフレームワーク領域をコードするヌクレオチド配列、並びに場合によって、重鎖定常領域、例えば本明細書記載の重鎖定常領域のすべてまたは一部をコードするヌクレオチド配列を含む、前記発現ベクターにも関する。１つの態様において、非ヒト抗体は、ネズミ抗体１Ｄ９である。本発明はまた、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞も含む。本発明はまた、ネズミ・モノクローナル抗体１Ｄ９由来の抗原結合性領域をコードする第一の核酸配列；およびヒト起源の免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部、または本明細書に記載するようなヒト起源の免疫グロブリンの突然変異定常領域をコードする第二の核酸配列を含む、ヒト化免疫グロブリン軽鎖または重鎖をコードする単離または組換え遺伝子にも関する。
本発明はまた、ヒト化免疫グロブリン軽鎖またはその断片をコードする第一の組換え核酸分子およびヒト化免疫グロブリン重鎖またはその断片をコードする第二の組換え核酸分子を含む、宿主細胞（例えばＣＣＲ２に特異性を有するヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片を発現するもの）であって、前記の第一の核酸分子が、ネズミ抗体１Ｄ９の軽鎖由来のＣＤＲおよびヒト起源の軽鎖由来のフレームワーク領域をコードするヌクレオチド配列を含み、そして前記の第二の核酸分子が、ネズミ抗体１Ｄ９の重鎖由来のＣＤＲおよびヒト起源の重鎖由来のフレームワーク領域をコードするヌクレオチド配列を含む、前記宿主細胞にも関する。第一の核酸分子はさらに、本明細書記載の軽鎖定常領域のすべてまたは一部をコードする核酸分子を含むことも可能であり、そして／または第二の核酸分子はさらに、本明細書記載の重鎖定常領域のすべてまたは一部をコードする核酸分子を含むことも可能である。本発明はまた、ヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片を調製する方法であって、本発明の宿主細胞を、ヒト化免疫グロブリンの発現に適した条件下で維持し、それによってヒト化免疫グロブリン鎖を発現させて、そしてＣＣＲ２に特異性を有するヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片を産生する。該方法は、ヒト化免疫グロブリンまたはその断片を単離する工程をさらに含むことも可能である。
例えば、ＣＣＲ２に結合特異性を有するヒト化免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードする核酸分子（すなわち１以上の核酸分子）、またはこうした核酸分子（単数または複数）を含む構築物（すなわち１以上の構築物）を、核酸分子（単数または複数）が機能可能であるように１以上の発現調節要素に連結されるように（例えばベクター中、細胞内プロセスによって生成される構築物中、宿主細胞ゲノムに取り込まれて）、選択される宿主細胞に適した方法（例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、感染）によって、適切な宿主細胞に導入することも可能である。宿主細胞を発現に適した条件下（例えば、誘導剤の存在下、適切な塩、増殖因子、抗生物質、栄養補助物質等を補った適切な培地中）に維持することも可能であり、それによってコードされるポリペプチド（単数または複数）を産生する。望ましい場合、コードされるタンパク質（例えばヒト化１Ｄ９抗体）を、例えば宿主細胞、培地、ミルクから単離することも可能である。このプロセスは、トランスジェニック動物の宿主細胞における発現を含む（例えばＷＯ ９２／０３９１８、ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、１９９２年３月１９日公表）。
融合タンパク質のＮ末端位置、Ｃ末端位置、または内部で、ヒト化免疫グロブリンまたは免疫グロブリン鎖が、非免疫グロブリン部分（すなわち天然に見られるような免疫グロブリンでは生じない部分）に連結されている、融合タンパク質を産生することも可能である。例えば、ｐＥＴベクター（例えばｐＥＴ−１５ｂ、Ｎｏｖａｇｅｎ）、ファージベクター（例えばｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、または他のベクター（例えばｐＲＩＴ２ＴプロテインＡ融合ベクター、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）などの適切な発現ベクターに、免疫グロブリン配列をコードする核酸を挿入することによって、いくつかの態様を産生することも可能である。生じた構築物を、発現に適した宿主細胞に導入することも可能である。発現に際して、適切なアフィニティーマトリックスによって、細胞溶解物から、いくつかの融合タンパク質を単離するかまたは精製することも可能である（例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．ら監修， Ｖｏｌ． ２， 補遺２６， ｐｐ． １６．４．１−１６．７．８（１９９１）を参照されたい）。
療法的方法および組成物
本発明は、（１）ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでＣＣＲ２に結合可能であり；そして／または（２）ＣＣＲ２の活性または機能、例えば（ａ）結合機能（例えばＣＣＲ２がリガンドに結合する能力）および／または（ｂ）組織における白血球の補充および／または集積を含む、白血球輸送を調節可能である、ヒト化免疫グロブリンを提供する。好ましくは、ヒト化免疫グロブリンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでＣＣＲ２に選択的に結合し、そしてＣＣＲ２が仲介する相互作用を阻害することが可能である。１つの態様において、ヒト化免疫グロブリンは、ＣＣＲ２に結合可能であり、そしてＣＣＲ２の１以上のリガンド（例えばＨＩＶ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＣＰ−５、エオタキシン）への結合を阻害可能である。
本発明のヒト化免疫グロブリンは、研究、診断および療法における適用で、多様なプロセスにおいて有用である。例えば、これらを用いて、ＣＣＲ２またはその変異体を検出し、単離し、そして／または精製して（例えばアフィニティー精製または他の適切な方法による）、そしてＣＣＲ２構造（例えばコンホメーション）および機能を研究することも可能である。本発明のヒト化免疫グロブリンはまた、診断適用（例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ）において用いるか、または療法（予防を含む）適用においてＣＣＲ２機能を調節するのに用いることも可能である。
例えば、本発明のヒト化免疫グロブリンを用いて、試料（例えば組織または体液、例えば炎症性浸出物、血液、血清、腸液、ＣＣＲ２を有する細胞上）中のＣＣＲ２レベルを検出し、そして／または測定することも可能である。例えば、試料（例えば組織および／または体液）を個体から得て、そして化学発光アッセイ、ラジオイムノアッセイ、および免疫組織学を含む、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの方法を含む、適切な免疫学的方法を用いて、ＣＣＲ２発現を検出し、そして／または測定することも可能である。１つの態様において、試料中の選択されたＣＣＲ２を検出する方法であって、ＣＣＲ２へのヒト化免疫グロブリンの特異的結合に適した条件下で、本発明のヒト化免疫グロブリンと試料を接触させ、そして形成される抗体−ＣＣＲ２複合体を検出することを含む、前記方法を提供する。方法の適用において、ヒト化免疫グロブリンを用いて、ＣＣＲ２反応性および／または発現に関して（例えば免疫組織学的に）、炎症組織（例えばヒト由来）に対して正常組織を解析して、特定の状態およびＣＣＲ２の発現増加の間の関連（例えば罹患組織におけるもの）を検出することも可能である。本発明のヒト化免疫グロブリンは、炎症組織に対して正常組織におけるＣＣＲ２の存在を評価する免疫学的方法を可能にし、これを通じて、疾患の存在、疾患進行および／または炎症性疾患における抗ＣＣＲ２インテグリン療法の有効性を評価することも可能である。さらに、本発明のヒト化免疫グロブリンは、ＣＣＲ２発現と関連する望ましくない細胞増殖、例えばＣＣＲ２を発現する癌の進行を通じて、ＣＣＲ２の存在を評価する方法を提供する。
本発明のヒト化免疫グロブリンを用いて、ＣＣＲ２に調節される結合機能および／または白血球（例えばリンパ球、単球）輸送を調節する（例えば阻害する（減少させるかまたは防止する））こともまた可能である。例えば、組織の白血球（例えばリンパ球、単球）浸潤に関連する疾患の治療において、該方法にしたがって、リガンド（すなわち１以上のリガンド）へのＣＣＲ２の結合を阻害するヒト化免疫グロブリンを投与することも可能である。さらに、リガンド（すなわち１以上のリガンド）へのＣＣＲ２の結合を阻害するヒト化免疫グロブリンを、ＨＩＶの治療法にしたがって投与することも可能である。こうした疾患を治療するため、本発明の有効量のヒト化免疫グロブリン（すなわち１以上）を個体（例えば哺乳動物、例えばヒトまたは他の霊長類）に投与する。
ヒト化免疫グロブリンを、ＣＣＲ２のそのリガンドへの結合を阻害するのに有効な量で投与する。療法のため、有効量は、望ましい療法（予防を含む）効果を達成するのに十分な量（例えばＣＣＲ２仲介性結合および／またはシグナル伝達を減少させるかまたは防止するのに十分な量）であろう。ヒト化免疫グロブリンを単回用量または多数用量で投与することも可能である。当該技術分野に知られる方法によって、投薬量を決定することも可能であるし、そしてこれは例えば、個体の年齢、感受性、許容度および全体の健康状態に応じることも可能である。抗体の適切な投薬量は、治療あたり、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０．０ｍｇ／ｋｇ体重であることも可能である。例えば、用量は、約１ｍｇ／ｋｇ体重〜約７ｍｇ／ｋｇ体重、約３ｍｇ／ｋｇ体重〜約５ｍｇ／ｋｇ体重であることも可能である。
本発明の方法にしたがって、ヒト化免疫グロブリンを単独で、または別の剤と組み合わせて個体（例えばヒト）に投与することも可能である。ヒト化免疫グロブリンを、さらなる剤の前に、さらなる剤とともに、またはさらなる剤に続いて投与することも可能である。したがって、本発明には、本発明のヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片および適切なキャリアーを含む薬剤組成物が含まれる。１つの態様において、リガンドへのＣＣＲ２の結合を阻害する、１より多いヒト化免疫グロブリンを投与する。別の態様において、本発明のヒト化免疫グロブリンに加えて、さらなるモノクローナル抗体を投与する。さらに別の態様において、さらなる薬理学的活性成分（例えば抗炎症化合物、例えばスルファサラジン、別の非ステロイド性抗炎症化合物、またはステロイド性抗炎症化合物）を、本発明のヒト化免疫グロブリンと組み合わせて投与することも可能である。
多様な投与経路が可能であり、こうした経路には、必ずしも限定されるわけではないが、治療しようとする疾患または状態に応じて、非経口（例えば静脈内、動脈内、筋内、皮下注射）、経口（例えば食餌）、局所、吸入（例えば気管支内、鼻内または経口吸入、点鼻投与（ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｄｒｏｐｓ））、または直腸が含まれる。非経口投与が好ましい投与様式である。
配合物は、選択する投与経路に応じて多様であろう（例えば溶液、エマルジョン）。投与しようとするヒト化抗体を含む適切な組成物を、生理学的に許容しうるビヒクルまたはキャリアー中で調製することも可能である。溶液またはエマルジョンのため、適切なキャリアーには、例えば、水性またはアルコール性／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁物が含まれ、生理食塩水および緩衝媒体が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンガーのデキストロース溶液、デキストロースおよび塩化ナトリウム溶液、乳酸化リンガー溶液または不揮発性油が含まれることも可能である。静脈内ビヒクルには、多様な添加物、保存剤、または液体、栄養補充剤または電解質補充剤が含まれることも可能である（一般的には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， 第１７版， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， ペンシルバニア州， １９８５を参照されたい）。吸入のため、化合物を可溶化し、そして投与のため、適切なディスペンサー（例えばアトマイザー、ネブライザーまたは加圧エアロゾル・ディスペンサー）に装填することも可能である。
したがって、本発明には、細胞のＨＩＶ感染を阻害する方法であって、本発明のヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片を含む組成物の有効量と、細胞を接触させることを含む、前記方法が含まれる。本発明はまた、患者においてＨＩＶを治療するかまたはＨＩＶ感染を阻害する方法であって、本発明のヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片の有効量を含む組成物を、患者に投与することを含む、前記方法にも関する。
本発明はまた、哺乳動物ＣＣＲ２またはＣＣＲ２の機能する部分へのケモカインの結合に関連する機能を阻害する方法であって、ＣＣＲ２またはその一部を含む組成物と、本発明のヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片の有効量を接触させ、ここで前記ヒト化免疫グロブリンが、哺乳動物ＣＣＲ２へのケモカインの結合を阻害し、そしてＣＣＲ２へのケモカインの結合に関連する１以上の機能を阻害することを含む、前記方法にも関する。例えば、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＣＰ−５、エオタキシンおよびその組み合わせからなる群より、ケモカインを選択することも可能である。
本発明はまた、患者において白血球輸送を阻害する方法であって、哺乳動物ＣＣＲ２に結合し、そして受容体へのリガンドの結合を阻害する、本発明のヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片の有効量を含む組成物を、患者に投与することを含む、前記方法にも関する。例えば、リガンドはケモカイン（例えばＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＣＰ−５、エオタキシン）またはＨＩＶであることも可能である。
本発明はまた、ＣＣＲ２を発現する第一の細胞とリガンド（例えばＣＣＲ２のリガンドを発現する第二の細胞上のもの）の相互作用を阻害する方法であって、本発明のヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片の有効量と第一の細胞を接触させ、特に前記免疫グロブリンまたは断片がＣＣＲ２へのリガンドの結合を阻害することを含む、前記方法にも関する。例えば、細胞は、リンパ球、単球、顆粒球、Ｔ細胞、好塩基球、およびＣＣＲ２またはその一部をコードする組換え核酸を含む細胞からなる群より選択されることも可能である。１つの態様において、リガンドは、ケモカイン（例えばＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＣＰ−５、エオタキシン）である。別の態様において、リガンドはＨＩＶである。
本発明はまた、患者においてＣＣＲ２仲介性障害を治療する方法であって、哺乳動物ＣＣＲ２に結合する、本発明のヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片の有効量を、患者に投与することを含む、前記方法も含む。障害には、限定されるわけではないが、アレルギー、アテローム発生、アナフィラキシー、悪性腫瘍、慢性および急性炎症性障害、ヒスタミンおよびＩｇＥ仲介性アレルギー反応、ショック、および関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症、狭窄、再狭窄、同種移植片拒絶、線維症、喘息、強皮症、炎症性糸球体症、および免疫関連疾患が含まれることも可能である。
特定の態様において、本発明は、患者において再狭窄を阻害する方法であって、哺乳動物ＣＣＲ２に結合する、本発明のヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片の有効量を、患者に投与することを含む、前記方法に関する。本発明はまた、ＣＣＲ２仲介性疾患または障害の療法または診断に使用するための、あるいはこれらを治療するのに使用するための、本発明のヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片も含む。本発明はまた、ＣＣＲ２仲介性疾患治療用の医薬製造のための、本発明のヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片の使用も含む。
抗イディオタイプ抗体もまた提供する。抗イディオタイプ抗体は、別の抗体の抗原結合部位と会合する抗原決定基を認識する。第二の抗体を産生するのに用いた動物と同じ種の動物、そして好ましくは同じ系統の動物を免疫することによって、第二の抗体に対して、抗イディオタイプ抗体を調製することも可能である。例えば、米国特許第４，６９９，８８０号を参照されたい。
本発明はまた、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ−１２５４９およびＨＢ−１２５５０のもとに寄託されたハイブリドーマ細胞株とともに、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ−１２５４９およびＨＢ−１２５５０のもとに寄託されたハイブリドーマ細胞株が産生するモノクローナル抗体にも関する。本発明の細胞株は、モノクローナル抗体の産生以外の使用を有する。例えば、本発明の細胞株を他の細胞（例えば適切に薬剤で印を付けたヒト骨髄腫、マウス骨髄腫、ヒト−マウス・ヘテロ骨髄腫またはヒトリンパ芽球腫細胞）と融合させて、さらなるハイブリドーマを産生し、そしてこうして、モノクローナル抗体をコードする遺伝子のトランスファーを提供することも可能である。さらに、該細胞株を、抗ＣＣＲ２免疫グロブリン鎖をコードする核酸の供給源として使用することも可能であり、該核酸を単離し発現させることも可能である（例えば、適切な技術いずれかを用いて、他の細胞にトランスファーして（例えばＣａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号））。例えば、再配置された抗ＣＣＲ２軽鎖または重鎖を含むクローンを単離する（例えばＰＣＲによって）ことも可能であるし、あるいは細胞株から単離したｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを調製することも可能であり、そして抗ＣＣＲ２免疫グロブリン鎖をコードするｃＤＮＡクローンを単離することも可能である。したがって、抗体の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸、またはその一部を得て、そして多様な宿主細胞において、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系において、特定の免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその変異体（例えばヒト化免疫グロブリン）を産生する組換えＤＮＡ技術にしたがって、用いることも可能である。例えば、ｃＤＮＡを含む核酸、またはヒト化免疫グロブリンまたは免疫グロブリン鎖などの変異体をコードするその誘導体を、核酸が１以上の発現調節要素に機能可能であるように連結されるように（例えばベクター中、または宿主細胞ゲノムに組み込まれて）、適切な原核生物ベクターまたは真核生物ベクター（例えば発現ベクター）に入れて、そして適切な方法（例えば形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、感染）によって適切な宿主細胞に導入することも可能である。産生のため、宿主細胞を発現に適した条件下（例えば、誘導剤の存在下、適切な塩、増殖因子、抗生物質、栄養補助物質等を補った適切な培地中）に維持して、それによってコードされるポリペプチドを産生することも可能である。望ましい場合、コードされるタンパク質を（例えば宿主細胞、培地、ミルクから）回収し、そして／または単離することも可能である。この産生法は、トランスジェニック動物の宿主細胞における発現を含むことが認識されるであろう（例えばＷＯ ９２／０３９１８、ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、１９９２年３月１９日公表）。
本明細書において、本発明の抗体および機能するその断片は、ＣＣＲ２へのリガンドの結合を遮断し（阻害し）、そして／またはＣＣＲ２へのリガンドの結合に関連する機能を阻害することも可能である。以下に論じるように、多様な方法を用いて、ＣＣＲ２へのリガンドの結合の阻害および／または受容体へのリガンドの結合に関連する機能を評価することも可能である。
結合アッセイ
本明細書において、「哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質」は、天然存在または内因性の哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質を指し、そして天然存在または内因性の対応する哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質のものと同じアミノ酸配列を有するタンパク質（例えば組換えタンパク質）を指す。したがって、本明細書に定義するように、この用語には、哺乳動物ＣＣＲ２の成熟受容体タンパク質、多型変異体またはアレル変異体、および他のアイソフォーム（例えば選択的スプライシングまたは他の細胞プロセスによって産生されるもの）、および前述のものの修飾型または非修飾型（例えばグリコシル化型、非グリコシル化型）が含まれる。哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質は、単離および／または組換えタンパク質（合成的に産生されたタンパク質を含む）であることも可能である。天然存在または内因性の哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質には、成熟ＣＣＲ２などの野生型タンパク質、多型変異体またはアレル変異体、および哺乳動物（例えばヒト、非ヒト霊長類）において天然存在である他のアイソフォーム、例えばタンパク質のカルボキシ末端の選択的スプライシングで産生される受容体タンパク質のＣＣＲ２ａ型およびＣＣＲ２ｂ型などが含まれる。こうしたタンパク質を、例えば哺乳動物ＣＣＲ２を天然に産生する供給源から回収するかまたは単離することも可能である。これらのタンパク質および天然存在または内因性の対応する哺乳動物ＣＣＲ２と同じアミノ酸配列を有する哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質は、対応する哺乳動物の名称で称される。例えば、対応する哺乳動物がヒトである場合、該タンパク質は、ヒトＣＣＲ２タンパク質と称される（例えば適切な宿主細胞で産生される、組換えヒトＣＣＲ２）。
哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質の「機能する変異体」には、機能する断片、機能する突然変異体タンパク質、および／または機能する融合タンパク質（例えば突然変異誘発および／または組換え技術を介して産生される）が含まれる。一般に、哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質の断片または一部には、成熟哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質に比較して、アミノ酸（すなわち１以上のアミノ酸）の欠失（すなわち１以上の欠失）を有するものが含まれる（Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失または内部欠失など）。成熟哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質に比較して、隣接アミノ酸のみが欠失されているか、または非隣接アミノ酸が欠失されている、断片または部分もまた、想定される。
一般的に、哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質の突然変異体には、１以上の隣接または非隣接アミノ酸残基の付加、欠失および／または置換によって異なる、哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質の天然変異体または人工変異体が含まれる（例えば受容体キメラ）。こうした突然変異は、例えば、（他のＣＸＣおよび／またはＣＣケモカイン受容体に比較して）保存領域または非保存領域、細胞外領域、細胞質領域、または膜貫通領域にあることも可能である。
一般的に、融合タンパク質は、第一の部分として、哺乳動物ＣＣＲ２（例えばヒトＣＣＲ２）を含み、この第一の部分に、天然に見られるような哺乳動物ＣＣＲ２には存在しない第二の部分が、ペプチド結合を介して連結される。したがって、第二の部分は、アミノ酸、オリゴペプチドまたはポリペプチドであることも可能である。第一の部分は、融合タンパク質に対して、Ｎ末端位置、Ｃ末端位置、または内部に存在することも可能である。１つの態様において、融合タンパク質は、第一の部分としてアフィニティーリガンド（例えば酵素、抗原、エピトープタグ）を含み、そして第二の部分はリンカー配列およびヒトＣＣＲ２またはその一部を含む。
哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質の「機能する断片または部分」、「機能する突然変異体」および／または「機能する融合タンパク質」は、本明細書記載の哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質に特徴的な少なくとも１つの機能、例えば結合活性、シグナル伝達活性および／または細胞反応を刺激する能力を有する、単離および／または組換えタンパク質またはポリペプチドを指す。好ましい機能する変異体は、リガンド（すなわちＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＣＰ−５および／またはエオタキシンなどの１以上のリガンド）に結合することも可能であり、そして本明細書において、「リガンド結合性変異体」と称される。
１つの態様において、哺乳動物ＣＣＲ２の機能する変異体は、前記哺乳動物ＣＣＲ２と少なくとも約８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、そしてより好ましくは前記哺乳動物ＣＣＲ２と少なくとも約９５％の配列同一性を共有する。ヒトＣＣＲ２ａおよびＣＣＲ２ｂの核酸およびアミノ酸配列は、米国特許第５，７０７，８１５号に記載される。デフォルトパラメーターなどの適切なパラメーターを用いて、Ｂｌａｓｔｘプログラム（バージョン１．４）などの、適切なプログラムを用いて配列同一性を決定することも可能である。１つの態様において、Ｂｌａｓｔｘ検索のパラメーターは、スコアリングマトリックスＢＬＯＳＵＭ６２、Ｗ＝３である。別の態様において、機能する変異体は、天然存在核酸分子とは異なるが、遺伝暗号の縮重のため、哺乳動物ＣＣＲ２またはその一部をコードする核酸配列を含む。
単離および／または組換え哺乳動物ＣＣＲ２または機能するその変異体を含む組成物を、結合に適した条件下で維持することも可能であり、哺乳動物ＣＣＲ２または変異体を、試験しようとする抗体または断片と接触させ、そして直接または間接的に結合を検出するかまたは測定する。１つの態様において、ＣＣＲ２を天然に発現する細胞、あるいは哺乳動物ＣＣＲ２またはその変異体をコードする組換え核酸配列を含む細胞を用いる。受容体発現に適した条件下で細胞を維持する。結合に適した条件下で（例えば適切な結合緩衝液中で）、細胞を抗体または断片と接触させ、そして標準的技術によって、結合を検出する。結合を測定するため、適切な対照に比較して（例えば抗体の非存在下で測定したバックグラウンドに比較して、第二の抗体（すなわち標準）の結合に比較して、未トランスフェクション細胞への抗体の結合と比較して）、結合の度合いを測定することも可能である。受容体または受容体を含むリポソームを含有する膜分画などの細胞分画を、全細胞の代わりに用いることも可能である。
１つの態様において、適切な標識（例えば蛍光標識、同位体標識、抗原またはエピトープ標識、酵素標識）で抗体を標識し、そして標識を検出することによって、結合を測定する。別の態様において、標識した第二の抗体によって、結合した抗体を検出することも可能である。例えば、競合剤として、非標識抗体またはリガンドを用いて、競合または置換によって、結合の特異性を評価することも可能である。
結合阻害アッセイを用いて、ＣＣＲ２に結合して、ＣＣＲ２または機能する変異体へのリガンド（例えばＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＣＰ−５および／またはエオタキシン）などの別の化合物の結合を阻害する抗体またはその断片を同定することも可能である。例えば、抗体の非存在下でのリガンドの結合に比較した際、（抗体の存在下での）ＣＣＲ２のリガンドの結合の減少を検出するかまたは測定する、結合アッセイを行うことも可能である。単離および／または組換え哺乳動物ＣＣＲ２または機能するその変異体を含む組成物を、リガンドおよび抗体と同時に、またはいずれかの順序で、次々に、接触させることも可能である。抗体の存在下でリガンドの結合の度合いが減少すれば、抗体によって結合が阻害されることの指標となる。例えば、リガンドの結合は減少するかまたは消滅することも可能である。
１つの態様において、抗体または断片による、哺乳動物ＣＣＲ２またはその変異体へのリガンド（例えばＭＣＰ−１などのケモカイン）の結合の直接阻害を監視する。例えば、抗体が、哺乳動物ＣＣＲ２への１２５Ｉ標識ＭＣＰ−１、１２５Ｉ標識ＭＣＰ−２、１２５Ｉ標識ＭＣＰ−３、１２５Ｉ標識ＭＣＰ−４、１２５Ｉ標識ＭＣＰ−５、または１２５Ｉ標識エオタキシンの結合を阻害する能力を、監視することも可能である。ＣＣＲ２または機能するその変異体を有する適切な細胞、例えば単離血液細胞（例えばＴ細胞、ＰＢＭＣ）、またはＣＣＲ２を天然に発現する適切な細胞株、または哺乳動物ＣＣＲ２をコードする核酸を含有する細胞株、または前記細胞由来の膜分画を用いて、こうしたアッセイを行うことも可能である。
ＣＣＲ２に結合する抗体の存在を同定する他の方法が利用可能であり、こうした方法には例えば、他の適切な結合アッセイ、またはシグナル伝達機能および／または細胞反応（例えば白血球輸送）の刺激を含む、受容体結合に誘発される事象を監視する方法がある。
本発明の抗体の阻害効果を結合阻害アッセイで評価可能であることが理解されるであろう。該方法において、受容体結合に関する抗体間の競合を評価することもまた可能である。この方式で同定される抗体をさらに評価して、該抗体が結合後に、ＣＣＲ２の他の機能を阻害するように作用したかどうかを決定し、そしてまたはそれらの療法的有用性を評価することも可能である。
シグナル伝達アッセイ
ＣＣＲ２に、リガンドまたは促進剤、例えばアゴニストが結合すると、このＧタンパク質共役型受容体によるシグナル伝達が生じ、そしてＧタンパク質とともに他の細胞内シグナル伝達分子の活性が刺激される。適切な方法いずれかを用いて、化合物（例えば抗体またはその断片）によるシグナル伝達機能の誘導を監視することも可能である。こうしたアッセイを用いて、ＣＣＲ２の抗体アゴニストを同定することも可能である。アッセイにおいて、リガンドまたは促進剤を用い、そしてリガンドまたは促進剤に誘導される活性を抗体が阻害する能力を評価して、抗体または機能するその断片の阻害活性を決定することも可能である。
当該技術分野に知られる方法または他の適切な方法によって、受容体結合が誘発するＧタンパク質活性、例えばＧＴＰのＧＤＰへの加水分解、またはその後のシグナル伝達事象、例えば細胞内（細胞質ゾル）遊離カルシウム濃度［Ｃａ２＋］ｉの迅速でそして一過性の増加の誘導をアッセイすることも可能である（例えば、Ｎｅｏｔｅ， Ｋ．ら， Ｃｅｌｌ， ７２：４１５−４２５ １９９３）；Ｖａｎ Ｒｉｐｅｒら， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １７７：８５１−８５６（１９９３）；Ｄａｈｉｎｄｅｎ， Ｃ．Ａ．ら， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １７９：７５１−７５６（１９９４）を参照されたい）。
例えば、ハイブリッドＧタンパク質共役型受容体を用いる、Ｓｌｅｄｚｉｅｗｓｋｉらの機能アッセイを用いて、リガンドまたは促進剤が、受容体に結合し、そしてＧタンパク質を活性化する能力を監視することも可能である（その解説が本明細書に援用される、Ｓｌｅｄｚｉｅｗｓｋｉら、米国特許第５，２８４，７４６号）。
評価しようとする抗体またはその断片の存在下で、こうしたアッセイを行うことも可能であり、そして、既知の方法および／または本明細書記載の方法を用いて、抗体または断片が、リガンドまたは促進剤によって誘導される活性を阻害する能力を測定することができる。
走化性および細胞刺激のアッセイ
走化性アッセイを用いて、抗体または機能するその断片が、哺乳動物ＣＣＲ２または機能するその変異体へのリガンドの結合を遮断し、そして／または受容体へのリガンドの結合に関連する機能を阻害する能力を評価することもまた、可能である。これらのアッセイは、化合物に誘導されるｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの細胞の機能的遊走に基づく。実施例に記載するように、例えば９６ウェル走化性プレートを利用するアッセイにおいて、または走化性を評価する当該技術分野に認識される他の方法を用いて、走化性を評価することも可能である。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏの経内皮走化性アッセイの使用が、Ｓｐｒｉｎｇｅｒら（その解説が本明細書に援用される、Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、ＷＯ ９４／２０１４２、１９９４年９月１５日公表；Ｂｅｒｍａｎら， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｎｖｅｓｔ． １７：６２５−６７７（１９８８）もまた参照されたい）に記載される。内皮を渡る、コラーゲンゲル内への遊走もまた記載されてきている（Ｋａｖａｎａｕｇｈら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４６：４１４９−４１５６（１９９１））。例えば、マウスＬ１−２プレＢ細胞または走化可能な他の適切な宿主細胞の安定なトランスフェクタントを、走化性アッセイに用いることも可能である。
一般的に、走化性アッセイは、適切な細胞（例えば白血球（例えばリンパ球、好酸球、好塩基球））が、障壁（例えば内皮、フィルター）内へまたは障壁を渡って、増加したレベルの化合物に向かい、障壁の第一の表面から、相対する第二の表面に進む、定方向移動または遊走を監視する。膜またはフィルターは、適切な細胞が、フィルター内へまたはフィルターを渡って、増加したレベルの化合物に向かい、フィルターの第一の表面から、フィルターの相対する第二の表面に進む、定方向移動または遊走を監視するのに好適な障壁を提供する。いくつかのアッセイにおいて、接着を促進する物質、例えばＩＣＡＭ−１、フィブロネクチンまたはコラーゲンで、膜をコーティングする。こうしたアッセイは、白血球「ホーミング」のｉｎ ｖｉｔｒｏ近似を提供する。
例えば、適切な容器（含有手段）において、第一のチャンバーから、微小多孔膜内へ、または該膜を渡って、試験しようとする抗体を含有し、そして該膜によって第一のチャンバーと分離されている第二のチャンバーに向かう、細胞の遊走の阻害を検出するかまたは測定することも可能である。例えばニトロセルロース、ポリカーボネートを含む、化合物に反応した特異的遊走を監視するのに適した孔サイズを有する適切な膜を選択する。例えば、約３〜８ミクロン、そして好ましくは約５〜８ミクロンの孔サイズを用いることも可能である。孔サイズは、フィルター上で均一であるか、または適切な孔サイズの範囲内にあることも可能である。
遊走および遊走の阻害を評価するため、標準的技術（例えば顕微鏡）を用いて、フィルター内への遊走距離、フィルターの第二の表面に接着したままとなる、フィルターを横断した細胞の数、および／または第二のチャンバーに集積する細胞の数を決定することも可能である。１つの態様において、細胞を検出可能標識（例えば放射性同位体、蛍光標識、抗原またはエピトープ標識）で標識して、そして適切な方法（例えば放射能、蛍光を検出することによるもの、イムノアッセイ）を用いて、膜に接着し、そして／または第二のチャンバーに存在する、標識の存在を決定することによって、抗体または断片の存在下および非存在下で、遊走を評価することも可能である。適切な対照に比較して（例えば抗体の非存在下で測定したバックグラウンド遊走に比較して、第二の化合物（すなわち標準）に誘導される遊走の度合いに比較して、抗体に誘導される未トランスフェクション細胞の遊走に比較して）、抗体アゴニストに誘導される遊走の度合いを決定することも可能である。
１つの態様において、特に、Ｔ細胞、単球または哺乳動物ＣＣＲ２を発現する細胞に関して、経内皮遊走を監視することも可能である。この態様において、内皮細胞層を通じた遊出を評価する。細胞層を調製するため、場合によって、コラーゲン、フィブロネクチン、または他の細胞外マトリックスタンパク質などの物質でコーティングし、内皮細胞の付着を促進して、内皮細胞を微小多孔フィルターまたは膜上で培養することも可能である。好ましくは、集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）単層が形成されるまで、内皮細胞を培養する。単層形成には、多様な哺乳動物内皮細胞が利用可能であり、これには、例えば静脈内皮、動脈内皮または微小血管内皮、例えばヒト臍静脈内皮細胞（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ、カリフォルニア州サンディエゴ）が含まれる。特定の哺乳動物受容体に反応する走化性をアッセイするには、同じ哺乳動物の内皮細胞が好ましい；が、異なる哺乳動物種または属由来の内皮細胞もまた、使用可能である。
一般的に、細胞が、膜またはフィルター内へまたはこれらを渡って、増加したレベルの化合物の方向に向かい、フィルターの第一の表面から、フィルターの相対する第二の表面に進む、定方向遊走を検出することによって、アッセイを行い、ここでフィルターは、第一の表面上に内皮細胞層を含有する。第一の表面に隣接した領域から、膜内へまたは膜を渡って、フィルターの反対側に置かれた化合物に向かって、定方向遊走が生じる。第二の表面に隣接した領域に存在する化合物の濃度は、第一の表面に隣接した領域に存在するものより高い。
抗体阻害剤に関して試験するのに用いる１つの態様において、遊走可能であり、そして哺乳動物ＣＣＲ２受容体を発現する細胞を含む組成物を、第一のチャンバーに入れることも可能である。第一のチャンバー中の細胞の走化性を誘導可能な（化学誘引機能を有する）１以上のリガンドまたは促進剤を含む組成物を、第二のチャンバーに入れる。好ましくは、細胞を第一のチャンバーに入れる少し前に、または細胞と同時に、試験しようとする抗体を含む組成物を、好ましくは第一のチャンバーに入れる。このアッセイにおいて、受容体に結合可能な抗体または機能するその断片であって、そして哺乳動物ＣＣＲ２を発現する細胞の走化性がリガンドまたは促進剤に誘導されるのを阻害可能な前記抗体または機能するその断片は、受容体機能の阻害剤（例えば刺激機能の阻害剤）である。抗体または断片の存在下で、リガンドまたは促進剤に誘導される遊走の度合いが減少すれば、阻害活性の指標となる。別個の結合研究（上記を参照されたい）を行って、抗体が受容体に結合した結果、阻害が生じたのか、または異なる機構を介して発生したかを決定することも可能である。
組織における化合物（例えばケモカインまたは抗体）の注射に反応した、組織の白血球浸潤を監視するｉｎ ｖｉｖｏアッセイを以下に記載する（炎症モデルを参照されたい）。ｉｎ ｖｉｖｏホーミングのこれらのモデルは、炎症部位への遊出および走化性によって、細胞がリガンドまたは促進剤に反応する能力を測定し、そして抗体またはその断片がこの遊出を遮断する能力を評価する。
本明細書に記載する方法に加えて、受容体を含有する適切な宿主細胞を用いて、活性受容体に誘導される細胞反応を監視することによって、ＣＣＲ２の刺激機能に対する抗体または断片の効果を評価することも可能である。
哺乳動物ＣＣＲ２機能のさらなるリガンド、阻害剤および／または促進剤の同定
本発明の抗体および断片の結合および機能を評価するのに使用可能な上述のアッセイを適応させて、哺乳動物ＣＣＲ２または機能するその変異体に結合するさらなるリガンドまたは他の物質とともに、哺乳動物ＣＣＲ２機能の阻害剤および／または促進剤を同定することも可能である。例えば、本発明の抗体または機能するその部分との競合アッセイによって、前記抗体またはその一部のものと同じかまたは類似の結合特異性を有する剤を同定することも可能である。したがって、本発明はまた、受容体のリガンドまたは哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質に結合する他の物質とともに、受容体機能の阻害剤（例えばアンタゴニスト）または促進剤（例えばアゴニスト）を同定する方法を含むことも可能である。１つの態様において、哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質または機能するその変異体を有する細胞（例えば白血球、細胞株、または適切な宿主細胞であって、前記細胞に導入された核酸にコードされる哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質または機能する変異体を発現するように操作されている前記細胞）を、受容体機能の阻害剤または促進剤を含む、受容体に結合するリガンドまたは他の物質の有効性を同定し、そして評価するアッセイにおいて、用いる。こうした細胞はまた、発現された受容体タンパク質またはポリペプチドの機能を評価する際にも有用である。
本発明にしたがって、受容体に結合するリガンドおよび他の物質、受容体機能の阻害剤および促進剤を適切なアッセイにおいて同定し、そして療法効果に関してさらに評価することも可能である。受容体機能の阻害剤を用いて、受容体活性を阻害する（減少させるかまたは防止する）ことも可能であるし、そしてリガンドおよび／または促進剤を用いて、適応する場合の、正常な受容体機能を誘導する（誘発するかまたは増進させる）ことも可能である。したがって、本発明は、自己免疫疾患および移植片拒絶を含む炎症性疾患を治療する方法であって、受容体機能の阻害剤を個体（例えば哺乳動物）に投与することを含む、前記方法を提供する。本発明はさらに、受容体機能の新規リガンドまたは促進剤を個体に投与することによって、受容体機能を刺激する提供する方法を提供し、例えば、感染性疾患および癌の治療に有用である、白血球機能の選択的刺激への新たなアプローチを提供する。
本明細書において、哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質の「リガンド」は、哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質に結合する物質の特定のクラスを指し、これには、天然リガンドおよび天然リガンドの合成型および／または組換え型が含まれる。哺乳動物ＣＣＲ２陽性細胞に指向性を有する感染性病原体（例えばＨＩＶなどのウイルス）もまた、哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質に結合することも可能である。選択される哺乳動物受容体の天然リガンドは、哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質のものと同じ哺乳動物起源のものである（例えばＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＣＰ−５および／またはエオタキシンなどのケモカイン）。好ましい態様において、哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質のリガンド結合は高親和性で起こる。
本明細書において、「阻害剤」は、哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質（例えばヒトＣＣＲ２）に特徴的な少なくとも１つの機能、例えば結合活性（例えばリガンド結合、促進剤結合、抗体結合）、シグナル伝達活性（例えば哺乳動物Ｇタンパク質の活性化、細胞質ゾル遊離カルシウム濃度［Ｃａ２＋］ｉの迅速でそして一過性の増加の誘導）、および／または細胞反応機能（例えば走化性、エキソサイトーシスまたは白血球による炎症性仲介因子放出の刺激）を阻害する（減少させるかまたは防止する）物質である。阻害剤はまた、細胞へのＨＩＶ進入を阻害する物質でもある。用語、阻害剤は、受容体に結合するアンタゴニスト（例えば抗体、天然リガンドの突然変異体、小分子量有機分子、リガンド結合の他の競合阻害剤）、および結合せずに受容体機能を阻害する物質（例えば抗イディオタイプ抗体）を含む物質を指す。
本明細書において、「促進剤」は、哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質（例えばヒトＣＣＲ２）に特徴的な少なくとも１つの機能、例えば結合活性（例えばリガンド結合、阻害剤および／または促進剤結合）、シグナル伝達活性（例えば哺乳動物Ｇタンパク質の活性化、細胞質ゾル遊離カルシウム濃度［Ｃａ２＋］ｉの迅速でそして一過性の増加の誘導）、および／または細胞反応機能（例えば走化性、エキソサイトーシスまたは白血球による炎症性仲介因子放出の刺激）を促進する（誘導するか、引き起こすか、増進するかまたは増加させる）物質である。用語、促進剤は、受容体に結合するアゴニスト（例えば抗体、別の種由来の天然リガンドの相同体）、および結合せずに受容体機能を促進する物質（例えば会合するタンパク質を活性化することによる）を含む物質を指す。好ましい態様において、アゴニストは、天然リガンドの相同体以外のものである。
したがって、本発明はまた、リガンド、阻害剤、促進剤、および哺乳動物ＣＣＲ２受容体または機能する変異体に結合する他の物質を含む、哺乳動物ＣＣ−ケモカイン受容体２またはそのリガンド結合性変異体に結合する剤を、検出するかまたは同定する方法にも関する。該方法にしたがって、試験しようとする剤、本発明の抗体または抗原結合性断片（例えば８Ｇ２、１Ｄ９、８Ｇ２または１Ｄ９のものと同じかまたは類似のエピトープ特異性を有する抗体、およびその抗原結合性断片）および哺乳動物ＣＣ−ケモカイン受容体２またはそのリガンド結合性変異体を含む組成物を、合わせることも可能である。哺乳動物ＣＣ−ケモカイン受容体２またはそのリガンド結合性変異体への抗体または抗原結合性断片の結合に適した条件下で、前述の構成要素を合わせ、そして本明細書記載の方法または他の適切な方法にしたがって、哺乳動物ＣＣ−ケモカイン受容体２またはリガンド結合性変異体への抗体または断片の結合を直接または間接的いずれかで検出するかまたは測定する。適切な対照（例えば試験しようとする剤の非存在下のもの）と比較して、形成される複合体の量が減少していれば、剤が前記受容体または変異体に結合した指標となる。哺乳動物ＣＣ−ケモカイン受容体２またはそのリガンド結合性変異体を含む組成物は、組換えケモカイン受容体２タンパク質またはそのリガンド結合性変異体を有する細胞の膜分画であることも可能である。抗体またはその断片を、放射性同位体、スピン標識、抗原またはエピトープ標識、酵素標識、蛍光基および化学発光基などの標識で標識することも可能である。
１つの態様において、本発明は、哺乳動物ＣＣ−ケモカイン受容体２またはそのリガンド結合性変異体に結合する剤を検出するかまたは同定する方法であって、試験しようとする剤、本発明の抗体または抗原結合性断片（例えば１Ｄ９、８Ｇ２、１Ｄ９または８Ｇ２と同じかまたは類似のエピトープ特異性を有する抗体、あるいはその抗原結合性断片）および哺乳動物ＣＣ−ケモカイン受容体２またはそのリガンド結合性変異体を有する細胞を合わせることを含む、前記方法に関する。ＣＣＲ２タンパク質またはそのリガンド結合性変異体への抗体または抗原結合性断片の結合に適した条件下で、前述の構成要素を合わせ、そして本明細書記載の方法およびまたは他の適切な方法によって、哺乳動物ＣＣ−ケモカイン受容体２または変異体への抗体または断片の結合を直接または間接的いずれかで検出するかまたは測定する。適切な対照と比較して、形成される複合体の量が減少していれば、剤が前記受容体または変異体に結合した指標となる。抗体またはその断片を、放射性同位体、スピン標識、抗原またはエピトープ標識、酵素標識、蛍光基および化学発光基からなる群より選択される標識で標識することも可能である。これらのアッセイおよび類似のアッセイを用いて、ＣＣＲ２に結合し、そして受容体への結合に関して本明細書記載の抗体と競合することも可能な、受容体機能の阻害剤または促進剤を含む、リガンド（例えばケモカインまたはＣＣＲ２と相互作用するＨＩＶの株）または他の物質を含む、剤を検出することも可能である。
上述のアッセイを、単独で、あるいは互いに組み合わせて、または他の適切な方法と組み合わせて用いて、哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質に結合するリガンドまたは他の物質、および哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質または変異体の阻害剤または促進剤を同定することも可能である。本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ法を、多数の試料をプロセシングする（例えば９６ウェル形式）ハイスループットスクリーニングに適応させることも可能である。ハイスループットスクリーニングに適したレベルで、哺乳動物ＣＣＲ２（例えばヒトＣＣＲ２）を発現する細胞を用いることも可能であり、そしてしたがって、こうした細胞は、受容体に結合するリガンドまたは他の物質、および哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質の阻害剤または促進剤の同定および／または単離に特に有用である。多様な方式で、受容体の発現を監視することも可能である。例えば、受容体またはその一部に結合する、本発明の抗体を用いて、発現を監視することも可能である。また、商業的に入手可能な抗体を用いて、受容体タンパク質またはポリペプチドを含む抗原タグまたはエピトープタグ付き融合タンパク質（例えばＦＬＡＧタグ付き受容体）の発現を検出することも可能であり、そして望ましいレベルを発現する細胞を選択することも可能である。
哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質または機能するその変異体をコードする核酸を発現系に取り込んで、受容体タンパク質またはポリペプチドを産生することも可能である。単離および／または組換え哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質または変異体、例えば哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質または変異体をコードする組換え核酸を含む構築物で安定にまたは一過性にトランスフェクションされた細胞において発現された受容体、または受容体を含有する細胞分画（例えばトランスフェクション細胞由来の膜分画、受容体を取り込んだリポソーム）中のものを、受容体機能に関する試験で用いることも可能である。望ましい場合、受容体をさらに精製することも可能である。受容体機能の試験をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで行うことも可能である。
ヒトＣＣＲ２などの単離および／または組換え哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質または機能するその変異体を本発明の方法で用いることも可能であり、ここで、本明細書に記載するように受容体機能を監視するか、または他の適切な技術を用いることによって、化合物の効果を評価する。例えば、安定または一過性トランスフェクタント（例えばバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞、マウスＬ１／２プレＢ細胞の安定トランスフェクタント）を結合アッセイで用いることも可能である。例えば、走化可能なＪｕｒｋａｔ細胞または他の適切な細胞（例えばマウスＬ１／２プレＢ細胞）の安定トランスフェクタントを走化性アッセイで用いることも可能である。
本発明の方法にしたがって、化合物を個々にスクリーニングすることも可能であるし、または本明細書の方法にしたがって、１以上の化合物を同時に試験することも可能である。化合物混合物を試験する場合、上記プロセスによって選択される化合物を分離し（適切なように）、そして適切な方法（例えばＰＣＲ、配列決定、クロマトグラフィー、質量分析）によって、同定することも可能である。これらの方法にしたがって、試験試料における１以上の化合物の存在（例えばリガンド、阻害剤、プロモーター）もまた決定することも可能である。
コンビナトリアル化学合成または他の方法によって産生された、化合物（例えば有機化合物、組換えまたは合成ペプチド、「ペプトイド」、核酸）の巨大コンビナトリアルライブラリーを試験することも可能である（例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ， Ｒ．Ｎ．ら， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ３７：２６７８−２６８５（１９９４）および該文献に引用される参考文献；また、タグ付き化合物に関しては、Ｏｈｌｍｅｙｅｒ， Ｍ．Ｈ．Ｊ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：１０９２２−１０９２６（１９９３）およびＤｅＷｉｔｔ， Ｓ．Ｈ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：６９０９−６９１３（１９９３）；Ｒｕｔｔｅｒ， Ｗ．Ｊ．ら、米国特許第５，０１０，１７５号；Ｈｕｅｂｎｅｒ， Ｖ．Ｄ．ら、米国特許第５，１８２，３６６号；およびＧｅｙｓｅｎ， Ｈ．Ｍ．、米国特許第４，８３３，０９２号も参照されたい）。本発明の方法によって、コンビナトリアルライブラリーから選択される化合物は、ユニークなタグを所持し、クロマトグラフィー法による個々の化合物の同定が可能である。
１つの態様において、ファージディスプレイ方法論を用いる。例えば、哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質または機能する変異体、本発明の抗体または機能するその部分、およびポリペプチドを提示するファージ（例えばファージまたはライブラリーなどのファージコレクション）を、抗体またはその一部が哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質または変異体に結合するのに適した条件下で（例えば適切な結合緩衝液中で）合わせることも可能である。標準的技術または他の適切な方法を用いて、抗体またはその一部と競合して、そして哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質または変異体に結合することも可能なファージを検出するかまたは選択することも可能である。適切な溶出緩衝液を用いて、結合したファージを受容体から分離することも可能である。例えば、イオン強度の変化またはｐＨの変化は、ファージの遊離につながることも可能である。あるいは、溶出緩衝液は、化合物の結合を破壊するように設計された単数または複数の遊離構成要素（例えばディスプレイされたペプチドの受容体への結合を破壊することも可能な１以上の化合物、例えば競合的に結合を阻害するリガンド、阻害剤、および／または促進剤）を含むことも可能である。場合によって、選択プロセスを反復するか、または別の選択工程を用いて、受容体に結合するファージをさらに富化させることも可能である。ディスプレイされたポリペプチドを性質決定することも可能である（例えばファージＤＮＡを配列決定することによる）。同定されたポリペプチドを産生し、そして結合に関して、そして阻害剤機能または促進剤機能に関して、さらに試験することも可能である。こうしたペプチドの類似体であって、増加した安定性または他の望ましい特性を有するであろう前記類似体を産生することも可能である。
１つの態様において、ランダム配列核酸にコードされるＮ末端ペプチドを伴うコートタンパク質を含む、融合タンパク質を発現しそしてディスプレイするファージを産生することも可能である。哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質または変異体および抗ＣＣＲ２抗体または機能するその一部を発現する適切な宿主細胞をファージと合わせ、結合したファージを選択し、回収し、そして性質決定する（例えば、Ｇタンパク質共役型受容体とともに用いるファージディスプレイ法を論じる、Ｄｏｏｒｂａｒ， Ｊ．およびＧ． Ｗｉｎｔｅｒ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２４４：３６１（１９９４）を参照されたい）。
哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質に結合する、可能なリガンドまたは他の物質、あるいは該タンパク質の阻害剤および／または促進剤の他の供給源には、限定されるわけではないが、ＣＣＲ２リガンドの変異体が含まれ、これには、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＣＰ−５および／またはエオタキシンの天然存在変異体、合成変異体または組換え変異体を含むＣＣＲ２リガンド変異体、他の化学誘引剤またはケモカインなどの物質、その変異体、低分子量有機分子、他の阻害剤および／または促進剤（例えば抗ＣＣＲ２抗体、アンタゴニスト、アゴニスト）、他のＧタンパク質共役型受容体リガンド、阻害剤および／または促進剤（例えばアンタゴニストまたはアゴニスト）、および哺乳動物ＣＣＲ２受容体の可溶性部分、例えば受容体機能を阻害しうる適切な受容体ペプチドまたは類似体（例えばＭｕｒｐｈｙ， Ｒ．Ｂ．、ＷＯ ９４／０５６９５を参照されたい）が含まれる。
炎症モデル
炎症のｉｎ ｖｉｖｏモデルが入手可能であり、これを用いて、ｉｎ ｖｉｖｏで、療法剤としての本発明の抗体および断片の効果を評価することも可能である。例えば、ケモカインおよび哺乳動物ＣＣＲ２と反応する抗体またはその断片を、適切な動物、例えばウサギ、マウス、ラット、モルモットまたはアカゲザルに皮内注射した際の白血球浸潤を監視することも可能である（例えば、Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ， Ｊ．ら， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １７６：５９−６５（１９９２）；Ｚａｃｈａｒｉａｅ， Ｃ．Ｏ．Ｃ．ら， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７１：２１７７−２１８２（１９９０）；Ｊｏｓｅ， Ｐ．Ｊ．ら， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７９：８８１−８８７（１９９４）を参照されたい）。１つの態様において、白血球（例えば好酸球、顆粒球）浸潤に関して、皮膚生検を組織学的に評価する。別の態様において、走化および血管外遊出が可能な標識細胞（例えば１１１Ｉｎで標識した、哺乳動物ＣＣＲ２を発現する安定トランスフェクション細胞）を動物に投与する。例えば、試験動物にリガンドまたはアゴニストを投与する前、投与するのと同時に、または投与した後に、評価しようとする抗体または断片を投与することも可能である。阻害剤の非存在下での浸潤の度合いに比較した際、抗体の存在下で、浸潤の度合いが減少していれば、阻害の指標となる。
診断適用および療法適用
本発明の抗体および断片は、研究適用、診断適用および療法適用を含む、多様な適用で有用である。１つの態様において、抗体を適切な標識（例えば蛍光標識、化学発光標識、同位体標識、抗原またはエピトープ標識、あるいは酵素標識）で標識する。例えば、これらを用いて、受容体またはその一部を単離し、そして／または精製し、そして受容体構造（例えばコンホメーション）および機能を研究することも可能である。
さらに、本発明の多様な抗体を用いて、例えばＴ細胞（例えばＣＤ８＋細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞）、単球および／または受容体遺伝子でトランスフェクションされた細胞上の、ＣＣＲ２を検出するか、または受容体の発現を測定することも可能である。したがって、これらはまた、診断または研究目的のため、細胞選別（例えばフローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別）などの適用にも有用性を有する。
本発明の抗ＣＣＲ２抗体は、診断適用に有用である。抗ＣＣＲ２抗体またはその断片を用いて、抗ＣＤ４が疾患段階の診断指標として用いられているのと類似の方式で、ＨＩＶ感染個体におけるこの受容体の発現を監視することも可能である。
典型的には、診断アッセイは、ＣＣＲ２への抗体またはその断片の結合から生じる複合体の形成を検出することを含む。診断目的のため、抗体または抗原結合性断片を標識することも、また標識しないことも可能である。抗体または断片を直接標識することも可能である。多様な標識が使用可能であり、限定されるわけではないが、放射性核種、蛍光剤、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤およびリガンド（例えばビオチン、ハプテン類）が含まれる。多くの適切な免疫アッセイが当業者に知られる（例えば米国特許第３，８１７，８２７号；第３，８５０，７５２号；第３，９０１，６５４号および第４，０９８，８７６号を参照されたい）。未標識の場合、例えば凝集アッセイにおけるように、適切な手段を用いて、抗体または断片を検出することも可能である。未標識抗体または断片を、抗体を検出するのに使用可能な、別の（すなわち１以上の）適切な試薬、例えば第一の抗体と反応する標識抗体（例えば第二の抗体）（例えば抗イディオタイプ抗体または未標識免疫グロブリンに特異的な他の抗体）、または他の適切な試薬（例えば標識プロテインＡ）と組み合わせて用いることもまた、可能である。
１つの態様において、対象の抗体または断片、あるいは第二の抗体が酵素にコンジュゲート化されている、酵素イムノアッセイにおいて、本発明の抗体または断片を利用することも可能である。哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質を含む生物学的試料を、対照の抗体と合わせた場合、抗体およびＣＣＲ２タンパク質間で結合が生じる。１つの態様において、哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質を発現する細胞を含有する試料、例えばヒト血液を、対照の抗体と合わせ、そして抗体、および抗体に認識されるエピトープを含むヒトＣＣＲ２タンパク質を有する細胞間で、結合が生じる。これらの結合細胞を未結合試薬から分離し、そして例えば、酵素が作用した際に発色するかまたは他の検出可能な変化を生じる酵素の基質と試料を接触させることによって、細胞に特異的に結合した抗体−酵素コンジュゲートの存在を決定することも可能である。別の態様において、対象の抗体は未標識であることも可能であり、そして第二の標識抗体を添加して、この第二の抗体が対象の抗体を認識することも可能である。
生物学的試料において、哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質の存在を検出するのに用いるキットもまた、調製可能である。こうしたキットには、哺乳動物ＣＣ−ケモカイン受容体２または前記受容体の一部に結合する抗体または機能するその断片とともに、抗体または断片およびＣＣＲ２またはその一部の間の複合体の存在を検出するのに適した、１以上の補助試薬が含まれるであろう。本発明の抗体組成物を単独でまたは他のエピトープに特異的なさらなる抗体と組み合わせて、凍結乾燥型で提供することも可能である。標識または未標識であることも可能である抗体が、補助成分（例えばＴｒｉｓ、ホスフェートおよびカーボネートなどの緩衝剤、安定化剤、賦形剤、殺生剤および／または不活性タンパク質、例えばウシ血清アルブミン）とともに、キット中に含まれることも可能である。例えば、補助成分を伴う凍結乾燥混合物として、抗体を提供することも可能であるし、または使用者が組み合わせられるように、補助成分を別個に提供することも可能である。一般的に、これらの補助成分は、活性抗体の量に基づいて、重量約５％未満で存在し、そして通常、抗体濃度に基づいて、少なくとも重量約０．００１％の総量で存在するであろう。モノクローナル抗体に結合可能な第二の抗体を使用する場合、こうした抗体をキット中で、例えば別個のバイアルまたは容器中で提供することも可能である。第二の抗体は、存在する場合、典型的には標識され、そして類似の方式で、上述の抗体配合物と配合することも可能である。
同様に、本発明はまた、細胞による、哺乳動物ＣＣＲ２または該受容体の一部の発現を検出し、そして／または定量化する方法であって、細胞またはその分画（例えば膜分画）を含む組成物を、哺乳動物ＣＣＲ２または該受容体の一部に結合する抗体または機能するその断片（例えば１Ｄ９および／または８Ｇ２）と、抗体またはその断片の結合に適した条件下で接触させ、そして結合を監視する、前記方法にも関する。抗体およびＣＣＲ２またはその一部の間の複合体の形成の指標となる、抗体の検出は、受容体が存在する指標となる。例えば、見出し「結合アッセイ」以下に上述したように、細胞への抗体の結合を決定することも可能である。該方法を用いて、個体由来の細胞上（例えば血液、唾液または他の適切な試料などの体液などの試料中）のＣＣＲ２の発現を検出することも可能である。例えばフローサイトメトリーによって、Ｔ細胞または単球表面上のＣＣＲ２の発現レベルを決定し、そして発現レベル（例えば染色強度）を疾患感受性、進行またはリスクと相関させることもまた可能である。
ケモカイン受容体は、身体全体の、特に炎症部位への白血球の遊走に機能する。血管系からの炎症性細胞遊出は、白血球および内皮細胞接着タンパク質および細胞特異的化学誘引剤および活性化因子の相互作用を伴う３工程プロセスによって、制御されている（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， Ｔ．Ａ．， Ｃｅｌｌ， ７６：３０１−３１４（１９９４）；Ｂｕｔｃｈｅｒ， Ｅ．Ｃ．， Ｃｅｌｌ， ６７：１０３３−１０３６（１９９１）；Ｂｕｔｃｈｅｒ， Ｅ．Ｃ．およびＰｉｃｋｅｒ， Ｌ．Ｊ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ（ワシントンＤＣ）， ２７２：６０−６６（１９９６））。これらは：（ａ）白血球セレクチンおよび内皮細胞炭水化物間の低親和性相互作用；（ｂ）白血球化学誘引剤受容体および化学誘引剤／活性化因子間の高親和性相互作用；および（ｃ）白血球インテグリンおよび免疫グロブリンスーパーファミリーの内皮細胞接着タンパク質間の密着結合である。異なる白血球サブセットは、セレクチン、化学誘引剤受容体、およびインテグリンの異なるレパートリーを発現する。さらに、炎症は、内皮細胞接着タンパク質の発現、並びに化学誘引剤および白血球活性化因子の発現を改変する。その結果、血管外部位への白血球補充の選択性を制御する際、非常に多様性がある。白血球化学誘引剤受容体の活性化が、セレクチン仲介性細胞回転からインテグリン仲介性密着結合への遷移を引き起こすと考えられる点で、第二の工程は非常に重要である。この結果、白血球が血管周囲部位に移る準備ができる。化学誘引剤／化学誘引剤受容体の相互作用はまた、経内皮遊走および組織内での局在にも非常に重要である（Ｃａｍｐｂｅｌｌ， Ｊ．Ｊ．ら， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １３４：２５５−２６６（１９９６）；Ｃａｒｒ， Ｍ．Ｗ．ら， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ４：１７９−１８７（１９９６））。この遊走は、炎症病巣に向かう化学誘引剤の濃度勾配によって指示される。
ＣＣＲ２は、白血球輸送に重要な役割を有する。ＣＣＲ２は、特定の炎症部位へのＴ細胞またはＴ細胞サブセットまたは単球の遊走に重要なケモカイン受容体であり、そしてしたがって、抗ＣＣＲ２ ｍＡｂを用いて、特にＴ細胞機能不全、例えば自己免疫疾患、またはアレルギー反応に関連するか、あるいは単球が仲介する障害、例えばアテローム性動脈硬化症に関連する、Ｔ細胞または単球の遊走を阻害する（減少させるかまたは防止する）ことも可能である。したがって、本発明の抗体およびその断片を用いて、研究適用および療法適用において、受容体機能を調節することもまた可能である。例えば、本明細書記載の抗体および機能する断片は、阻害剤として作用して、（ａ）受容体への（例えばリガンド、阻害剤または促進剤の）結合、（ｂ）受容体シグナル伝達機能、および／または（ｃ）刺激機能を阻害する（減少させるかまたは防止する）ことも可能である。受容体機能の阻害剤として作用する抗体は、リガンドまたは促進剤結合を直接または間接的に（例えばコンホメーション変化を引き起こすことによって）遮断することも可能である。例えば、抗体は、リガンドの結合を阻害することによって、または脱感作によって（リガンド結合の阻害を伴い、または伴わず）、受容体機能を阻害することも可能である。受容体に結合する抗体は、受容体機能のアゴニストとして作用して、受容体への結合に際して、受容体機能、例えば受容体のシグナル伝達および／または刺激機能（例えば白血球輸送）を誘発するかまたは刺激することもまた、可能である。
したがって、本発明は、哺乳動物（例えばヒト患者）において白血球輸送を阻害する方法であって、本発明の抗体または機能する断片の有効量を哺乳動物に投与することを含む、前記方法を提供する。本発明の抗体または断片の投与は、疾患状態の軽減または排除を生じることも可能である。
本発明の抗体、または機能するその断片を用いて、ケモカインの結合によるＣＣＲ２受容体の活性化が関係すると見なされる障害を治療することもまた可能である。例えば、抗体または機能するその断片（例えば１Ｄ９および／または８Ｇ２または機能するその断片）を用いて、アレルギー、アテローム発生、アナフィラキシー、悪性腫瘍、慢性および急性炎症、ヒスタミンおよびＩｇＥ仲介性アレルギー反応、ショック、および関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症、狭窄、再狭窄、同種移植片拒絶、線維症、喘息、および炎症性糸球体症を治療することも可能である。
ＣＣＲ２受容体機能の阻害剤（抗体または適切なその断片を含む）を用いて治療することも可能なヒトまたは他の種の疾患または状態には、限定されるわけではないが：
−喘息、アレルギー性鼻炎、過敏性肺疾患、過敏性肺炎、間質性肺疾患（ＩＬＤ）（例えば特発性肺線維症、あるいは関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎、全身性硬化症、シェーグレン症候群、多発性筋炎または皮膚筋炎に関連するＩＬＤ）などの呼吸性アレルギー疾患；慢性閉塞性肺疾患、例えば気腫および慢性気管支炎；アナフィラキシーまたは過敏性反応、薬剤アレルギー（例えばペニシリン、セファロスポリンに対するもの）、昆虫刺傷アレルギー；炎症性腸疾患、例えばクローン病および潰瘍性大腸炎；脊椎関節症；強皮症（例えば全身性強皮症）および混合性結合組織障害；乾癬および炎症性皮膚病、例えば皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、蕁麻疹；脈管炎（例えば壊死性脈管炎、皮膚脈管炎、および過敏性脈管炎）を含む、炎症性またはアレルギー性疾患および状態；
−関節炎（例えば関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、胃腸疾患に関連する関節炎、および反応性関節炎）、多発性硬化症および他の脱ミエリン疾患、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、若年性糖尿病、強直性脊椎炎、未分化脊椎関節症および若年性脊椎関節症（若年性関節リウマチを含む）、糸球体腎炎などの腎炎群、自己免疫甲状腺炎、ベーチェット病などの自己免疫疾患；
−同種移植片拒絶、異種移植片拒絶または移植片対宿主疾患、および臓器移植関連動脈硬化症を含む移植片拒絶（例えば移植におけるもの）
−アテローム性動脈硬化症；
−皮膚または臓器の白血球浸潤を伴う癌、ＣＣＲ２を発現する癌、例えば固形腫瘍（例えば乳癌）または液性腫瘍、ＣＣＲ２リガンドを発現する癌、例えば固形腫瘍または液性腫瘍、およびＣＣＲ２の異常でそして基準からはずれた発現を有する癌；
−血管系、特に動脈、例えば冠状動脈の狭窄または再狭窄、例えば血管性介入（例えば外科的介入、療法的介入または機械的介入）とともに新生内膜過形成から生じる狭窄または再狭窄。例えば、典型的には血管の管腔開口部の狭窄を生じる再狭窄は、限定されるわけではないが、血管移植法、バルーンによって行われる血管形成術を含む血管形成術、アテローム切除術、レーザーまたは他の適切な方法（例えば経皮経管的冠動脈形成術（ＰＣＴＡ））、ステント留置術（例えば機械的または生物学的血管内ステント留置術）、血管バイパス法またはその組み合わせとともに、狭窄または閉塞した血管を治療するのに用いられる他の方法を含む、血管傷害から生じることも可能である；
−肝線維症（例えばアルコールが誘導する肝臓疾患、他の毒素および薬剤に関連する肝臓線維症、慢性肝炎、急性肝炎、環境的損傷および自己免疫肝炎）、肺、腎臓または心臓の線維性障害、および炎症性脊椎関節症、例えば強直性脊椎炎などの、線維性障害；
−虚血障害、例えば虚血性心臓疾患（例えば心筋梗塞、不安定狭心症、狭心症、虚血性心筋疾患、無症候性（サイレント）狭心症）；
−虚血性ＣＮＳ疾患、虚血性脳卒中、一過性虚血性発作（ＴＡＩ）を含む、心臓血管疾患；
−虚血性再灌流傷害、例えば臓器系の傷害、血管バイパス移植（例えばＣＡＢＧ、末梢バイパス移植）などの外科的状態、虚血性腎疾患、引き続く虚血を伴うかまたは伴わない腎動脈狭窄および腎動脈（単数または複数）のアテローム性塞栓性（ａｔｈｅｒｏｅｍｂｏｌｉｃ）疾患、並びに虚血性大腸炎；
−限定されるわけではないが、虚血性再灌流などの再灌流傷害、特定の血液学的悪性腫瘍、サイトカイン誘導性毒性（例えば敗血症ショック、内毒素ショック）、多発性筋炎、皮膚筋炎、およびサルコイドーシスを含む肉芽腫性疾患を含む、阻害しようとする望ましくない炎症反応を治療可能である、他の疾患または状態（ＣＣＲ２仲介性疾患または状態を含む）
が含まれる。
ＣＣＲ２受容体機能の促進剤（抗体またはその断片を含む）を用いて治療可能な、ヒトまたは他の種の疾患または状態には、限定されるわけではないが：
−ＡＩＤＳなどの免疫不全症候群の個体、免疫抑制を引き起こす、放射線療法、化学療法、自己免疫疾患の療法または他の薬剤療法（例えばコルチコステロイド療法）を受けている個体におけるもの；並びに受容体機能の先天性不全または他の原因による免疫抑制などの、免疫抑制
が含まれる。
本発明の抗ＣＣＲ２抗体は、１以上のケモカインの結合を遮断して、それによって、上記障害を導く１以上の事象の下流カスケードを遮断することも可能である。
ＣＣＲ２のアンタゴニストである、抗体および機能するその断片をＡＩＤＳとともに特定の炎症性疾患の療法剤として用いることも可能である。ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２は、ヒトにおける後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因病原体である。ＡＩＤＳは、部分的に、ＨＩＶ感染個体において、ＣＤ４＋ Ｔリンパ球が枯渇することから生じる。ＨＩＶ−１は、主に、Ｔリンパ球、単球／マクロファージ、樹状細胞、および中枢神経系ではミクログリアに感染する。これらの細胞はすべて、ＣＤ４糖タンパク質を発現し、これがＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の受容体として働く。ターゲット細胞へのＨＩＶの効率的な進入は、ウイルス外部エンベロープ糖タンパク質、ｇｐ１２０の、アミノ末端ＣＤ４ドメインへの結合に依存する。ウイルス結合後、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質は、ウイルスおよび宿主細胞膜の融合を仲介して、進入プロセスを完了する。感染細胞表面上で発現されるＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質が指示する膜融合は、細胞−細胞融合を導き、合胞体を生じる。
最近、ＣＤ４だけでなく、宿主細胞因子が、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質仲介性膜融合の効率を決定することが示唆されてきている。ある範囲のＣＤ４発現細胞が、実験室適応ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質に仲介される感染および細胞融合を補助するのを、ＨＵＭＳＴＳＲ、ＬＥＳＴＲ、または「フュージン」と称される７回膜貫通受容体（７ＴＭＲ）が可能にすることが示されてきている（Ｆｅｎｇ， Ｙ．ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ（ワシントンＤＣ）， ２７２：８７２−８７７（１９９６））。ＨＵＭＳＴＳＲに対する抗体は、実験室適応ＨＩＶ−１単離体による細胞融合および感染を遮断したが、マクロファージ指向性初代ウイルスによるｉｎ ｖｉｔｒｏの感染は遮断しなかった（Ｆｅｎｇ， Ｙ．ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ（ワシントンＤＣ）， ２７２：８７２−８７７（１９９６））。
ケモカイン受容体および関連分子が初代臨床的ＨＩＶ−１単離体の感染を促進する能力を持つことが、いくつかのグループによって、最近報告されてきている（例えば、Ｂａｔｅｓ， Ｐ．， Ｃｅｌｌ， ８６：１−３（１９９６）；Ｃｈｏｅ， Ｈ．ら， Ｃｅｌｌ， ８５：１１３５−１１４８（１９９６）；Ｄｏｒａｎｚら， Ｃｅｌｌ ８５：１１４９−１１５８（１９９６）を参照されたい）。これらの研究によって、ＨＩＶ−１感染の初期段階において、ケモカイン受容体ファミリーの多様なメンバーが関与することが、初代ＨＩＶ−１単離体のウイルス指向性およびβ−ケモカイン阻害を説明するのに役立つことが示された。
本発明はまた、哺乳動物ＣＣＲ２またはその一部を発現する細胞のＨＩＶ感染（例えば新規感染および／または合胞体形成）を阻害する方法であって、哺乳動物ＣＣＲ２または前記受容体の一部に結合する、抗体または機能するその断片の有効量を含む組成物と、細胞を接触させることを含む、前記方法もまた、提供する。組成物はまた、限定されるわけではないが、抗ＣＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ５抗体、および抗フュージン抗体を含む、ＨＩＶに対して有効である１以上のさらなる剤を含むことも可能である。
多様な方法を用いて、本発明の抗体の存在下での、細胞へのＨＩＶの結合および／またはＨＩＶによる細胞の感染を評価することも可能である。例えば、受容体へのｇｐ１２０またはその一部の結合、ＨＩＶ感染および合胞体形成を評価するアッセイを用いることも可能である（例えばＣｈｏｅ， Ｈ．ら， Ｃｅｌｌ， ８５：１１３５−１１４８（１９９６）を参照されたい）。これらの方法および他の適切な方法を用いて、本発明の抗体が、これらのプロセスを阻害する能力を評価することも可能である。
さらに、本発明は、患者においてＨＩＶを治療する方法であって、哺乳動物ＣＣＲ２または前記受容体の一部に結合する、抗体または機能するその断片の有効量を含む組成物を、患者に投与することを含む、前記方法もまた、提供する。やはり、組成物はまた、限定されるわけではないが、抗ＣＣＲ３抗体、抗ＣＣＲ５抗体、および抗フュージン抗体を含む、ＨＩＶに対して有効である１以上のさらなる剤を含むことも可能である。ＨＩＶを治療するための抗体の療法的使用には、予防的使用（例えばＨＩＶに曝露される可能性もあるかまたは曝露された可能性もある患者の治療のため）が含まれる。例えば、ＨＩＶに曝露される可能性もあるかまたは曝露された可能性もある（例えば針刺しによって）医療従事者を、該方法にしたがって治療することも可能である。別の例は、避妊手段をとっていない性的接触または避妊の失敗後に、ウイルスに曝露された患者の治療である。
ＡＩＤＳでは、多剤治療が最も見込みがあるようである。特に新規細胞のウイルス感染を遮断することによって、ＨＩＶ感染を阻害する抗ケモカイン受容体アンタゴニストを薬剤治療措置に添加することも可能である。したがって、ヌクレオシド類似体（例えばＡＺＴ、３ＴＣ、ｄｄＩ）および／またはプロテアーゼ阻害剤などの１以上の他の療法剤と組み合わせた、本発明の抗体または断片の投与が想定され、そしてこうした投与は、ＨＩＶ治療措置への重要な追加を提供する。１つの態様において、ヒト化抗ＣＣＲ２ ｍＡｂを（すなわち１以上の）療法剤と組み合わせて用いて、新規細胞の融合および／または感染を防止することによって、患者からウイルス負荷を減少させる。こうした抗体はまた、分娩前後の感染を防止するのにも有用でありうる。
本発明の別の側面は、個体においてＨＩＶ感染を防止する方法であって、ＣＣＲ２に結合する抗体または機能するその断片の有効量を、個体に投与することを含む、前記方法に関する。該方法にしたがったＨＩＶ感染防止には、感染個体において新規細胞の感染を防止する（減少させるかまたは排除する）ため、あるいはＨＩＶに曝露される可能性もあるか、曝露された可能性もあるか、または曝露された個体において、感染を防止するための治療が含まれる。例えば、本発明の方法にしたがって、ＨＩＶ感染個体、ＨＩＶ感染女性の胎児、または医療従事者などの個体を治療することも可能である。
投与様式
適切な経路によって、本発明の１以上の抗体または断片を、単独で、または別の薬剤もしくは剤と組み合わせて（該薬剤もしくは剤の前に、それらと同時に、またはそれらの後に）、あるいは外科的介入、機械的介入もしくは療法介入の前に、それらと同時にまたはそれらの後に、個体に投与することも可能である。例えば、本発明の抗体を、他のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体と組み合わせて（例えば限定されるわけではないがＣＣＲ３およびＣＣＲ５を含む他のケモカイン受容体に結合する抗体と組み合わせて）、あるいは現存する血漿製剤、例えば商業的に入手可能な、予防的または療法的治療で用いられる、ガンマグロブリンおよび免疫グロブリン製剤と組み合わせて、用いることもまた可能である。本発明の抗体または断片を、抗生物質および／または抗微生物剤と組み合わせて投与する、別個に投与する組成物として用いることも可能である。
有効量の抗体または断片（すなわち１以上の抗体または断片）を投与する。有効量は、示されるように、投与条件下で、望ましい療法（予防を含む）効果を達成するのに十分な量、例えばＣＣＲ２機能の阻害、そしてしたがって炎症反応またはＨＩＶ感染の阻害に十分な量、あるいはＣＣＲ２機能の促進に十分な量である。単回用量または多用量で、抗体または断片を投与することも可能である。当該技術分野に知られる方法によって、投薬量を決定することも可能であり、そしてこれは、例えば、選択される抗体または断片、被験者の年齢、薬剤に対する感受性および許容性、並びに全体の健康状態に応じる。抗体およびその抗原結合性断片、例えばヒト抗体、ヒト化抗体およびキメラ抗体、および抗原結合性断片はしばしば、他の種の療法剤よりも低い頻度で投与可能である。例えば、抗体の有効量は、毎日、毎週、隔週、または毎月投与される、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５または１０ｍｇ／ｋｇの範囲であることも可能である。
多様な投与経路が可能であり、治療しようとする疾患または状態に応じて、限定されるわけではないが、経口、食餌、局所、非経口（例えば静脈内、動脈内、筋内、皮下注射または注入）、吸入（例えば気管支内、眼内、鼻内または経口吸入、点鼻剤）が含まれる。他の適切な投与法にはまた、再装填可能または生体分解性装置および徐放ポリマー装置が含まれることも可能である。他の剤との併用療法の一部として、本発明の薬剤組成物を投与することもまた可能である。
投与しようとする抗体または断片の配合物は、選択する投与経路および配合物（例えば溶液、エマルジョン、カプセル）に応じて多様であろう。生理学的に許容しうるビヒクルまたはキャリアー中で、抗体または機能するその断片を含む適切な薬剤組成物を調製することも可能である。抗体および／または断片の混合物もまた、使用可能である。溶液またはエマルジョンでは、適切なキャリアーには、例えば、水性またはアルコール性／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁物が含まれ、生理食塩水および緩衝媒体が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンガーのデキストロース溶液、デキストロースおよび塩化ナトリウム溶液、乳酸化リンガー溶液または不揮発性油が含まれることも可能である。多様な適切な水性キャリアーが当業者に知られ、水、緩衝水、緩衝生理食塩水、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）、デキストロース溶液およびグリシンが含まれる。静脈内ビヒクルには、多様な添加物、保存剤、または液体、栄養補充剤または電解質補充剤が含まれることも可能である（一般的には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， 第１６版， Ｍａｃｋ監修， １９８０を参照されたい）。組成物は場合によって、生理学的条件を近似するのに必要とされるような、製薬的に許容しうる補助物質、例えばｐＨ調整剤および緩衝剤および毒性調整剤、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムおよび乳酸ナトリウムを含有することも可能である。当該技術分野に知られる凍結乾燥および再構築技術にしたがって、本発明の抗体および断片を貯蔵のため凍結乾燥し、そして使用前に適切なキャリアー中で再構築することも可能である。当業者に周知の方法にしたがって、選択される媒体中の活性成分（単数または複数）の最適濃度を経験的に決定することも可能であり、そしてこうした最適濃度は、望ましい最終的な薬剤配合物に応じるであろう。吸入のため、抗体または断片を可溶化し、そして投与のため、適切なディスペンサー（例えばアトマイザー、ネブライザーまたは加圧エアロゾル・ディスペンサー）に装填することも可能である。
本発明はここで、以下の実施例によって例示されるが、該実施例は、いかなる意味でも、限定することを意図しない。本明細書に引用するすべての参考文献の解説は、本明細書に援用される。
（実施例１）
材料：
以下の材料を、示す供給源から得た：
ＰＥ−コンジュゲート化抗ＣＤ１６、ＰＥ−コンジュゲート化ストレプトアビジン、およびビオチン化抗ヒトＩｇＥを、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（カリフォルニア州サンディエゴ）から得た。ＦＩＴＣコンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧをＪａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ペンシルバニア州ウェストグローブ）から得た。
ＦＡＣＳ溶解緩衝液をＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ（カリフォルニア州マウンテンビュー）から、そして［１２５Ｉ］−ＭＣＰ−１をＮＥＮ（マサチューセッツ州ボストン）から得た。
細胞、細胞株、および組織培養
１０％胎児Ｃｌｏｎｅ Ｉ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、メリーランド州ガイザーズバーグ）、５０ユニット／ｍｌペニシリン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、および５５μＭ β−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を補ったＲＰＭＩ−１６４０中で、ネズミ・プレＢリンパ腫細胞株Ｌ１／２を維持した。他の細胞株には、８００μｇ／ｍｌの活性Ｇ４１８を補った上述の培地中で増殖させた、ＣＣＲ１（Ｃａｍｐｂｅｌｌ， Ｊ．ら（１９９６） Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．， １３４：２５５−２６６）、ＣＣＲ５（Ｗｕら， Ｎａｔｕｒｅ ３８４：１７９−１８３（１９９６））いずれかを発現する、Ｌ１／２細胞のトランスフェクタントが含まれた。ＡＴＣＣの指示にしたがって、ＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ２０２）を増殖させた。Ｐｏｎａｔｈら， Ｊ． Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．， ９７：６０４−６１２（１９９６）に記載されるように、ヘパリン処理血から、ＰＢＭＣを精製した。
ＣＣＲ２ｂ発現構築物および安定トランスフェクタントの調製
記載されるような（Ｑｉｎ， Ｓ．ら（１９９６）Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２６：６４０−６４７）ＲＴ−ＰＣＲ増幅によって、ヒトＣＣＲ２ｂ（Ｃｈａｒｏら（１９９４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１：２７５２）のコード領域を得た。オリゴ（ｄＴ）プライミングを用いて、ｃＤＮＡを作成し、そして示すようなＣＣＲ２ｂ配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｕ０３９０５；Ｃｈａｒｏら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：２７５２−２７５６（１９９４））の位置に対応するプライマーの以下のセットを用いた入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲによって、ＣＣＲ２ｂコード領域の増幅を達成した：
Figure 2007521248
ＣＤ５シグナルペプチドリーダー配列（Ａｒｕｆｆｏら， Ｃｅｌｌ ６１：１３０３−１３１３（１９９０））を含有するように、ＣＣＲ２Ｂ ｃＤＮＡコード領域を修飾した。このペプチドの予測されるアミノ酸配列は：
Figure 2007521248
である。
テンプレートとしてＣＣＲ２ｂ ｃＤＮＡを、そしてＢａｍＨＩ制限部位を含有し、ＣＤ５シグナルペプチド配列およびＣＣＲ２ｂのアミノ末端配列をコードする２つの重複５’プライマー、並びにＣＣＲ２ｂコード領域内部に位置する３’プライマーを用いるＰＣＲを用いた。
Figure 2007521248
２７８塩基対の増幅断片をＢａｍＨＩおよびＡｐａＩで消化し、そして生じた２０９塩基対断片を、ＣＣＲ２ｂ ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｕ０３９０５）の２０６位のＡｐａＩ部位に挿入して、ＣＣＲ２の内因性５’塩基対断片を置換した。該受容体の開始メチオニンの直前にＣＤ５シグナルペプチドリーダー配列を有するＣＣＲ２ｂをコードする生じた配列を、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）のＢａｍＨＩおよびＸｈｏ１部位に挿入して、哺乳動物発現プラスミドｐＣＤ５ＭＣＰＲＢを生成した。ＣＤ５−ＣＣＲ２ｂ断片をｐＣＤＥＦ３（Ｇｏｌｄｍａｎら， （１９９６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２１：１０１３−１０１５）のＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ部位にサブクローニングし、そしてこの構築物をＣＣＲ２ｂＤＥＦ３と命名した。この発現ベクターにおいて、挿入された遺伝子の発現は、ＥＦ−１αプロモーターに駆動される。
エレクトロポレーションの前日、５０ｍｌのＬ１／２細胞を４ｘ１０５細胞／ｍｌで植え付けた。エレクトロポレーション当日、１ｘ１０６／ｍｌの密度に増殖させた細胞を、培地から遠心分離し、そして８００μｌの室温のエレクトロポレーション緩衝液（Ｚａｊａｃら， ＤＮＡ ７：５０９−５１３）に再懸濁した。１２０ｍＭ Ｌ−グルタミン酸（Ｓｉｇｍａ）、７ｍＭ 酢酸マグネシウム（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、４．３ｍＭグルコース（Ｓｉｇｍａ）、１７ｍＭ Ｋ Ｐｉｐｅｓ、ｐＨ６．９（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭ ＥＧＴＡ（Ｓｉｇｍａ）、５ｍＭ ＡＴＰ、ｐＨ７．０（Ｓｉｇｍａ）。ＳｃａＩで直線化し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出して、そしてイソプロパノール沈殿させた、２５μｇのＣＣＲ２ｂＤＥＦ３プラスミドＤＮＡを０．４ｃｍの隙間のエレクトロポレーション・キュベットに入れた。再懸濁した細胞をキュベットに添加し、そして４５０ボルト、９６０μＦｄで、単回パルスを適用した。次いで、キュベットから、１５ｍｌのＬ１／２増殖培地（上述の通り）を含有するＴ−７５フラスコに細胞を移し、そして３日間増殖させ、その時点で細胞を培地から遠心分離し、そして１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）および０．８ｍｇ／ｍｌ活性Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）をさらに補ったＬ１／２増殖培地に再懸濁した。
走化性による、ＣＣＲ２ｂを発現している細胞の選択
トランスフェクション細胞を１１日間増殖させ、この時点で、新鮮な増殖培地に１：２０に分割した。第１６日、走化性によって細胞を選択した。０．５％ＢＳＡを補ったＲＰＭＩ １６４０（ＲＰＭＩ／ＢＳＡ）中の１ｎＭ ＭＣＰ−１ ６００μｌを、３．０ミクロン孔の２４ウェル走化性プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の下部チャンバーに入れ、そして１００μｌのＲＰＭＩ／ＢＳＡ中の１ｘ１０６ ＣＣＲ２ｂＤＥＦ３細胞を上部チャンバーに入れた。３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター中、細胞が遊走するのを４時間２０分間可能にし、その時点で、上部チャンバーを取り除いた。ＭＣＰ−１に反応した細胞が遊走するのに十分に長いが、バックグラウンドを低く維持するのに十分に短いため、実験時点で、このインキュベーション時間を選択した。
ＦＡＣＳ選別による、ＣＣＲ２ｂ発現細胞の二次選択
膜を渡り、そして下部チャンバー内へ遊走した細胞を増殖させ、そして無菌ＦＡＣＳ選別によってさらに精製した。１０００万のＣＣＲ２ｂＤＥＦ３細胞を培地から遠心分離し、１％熱不活性化ウシ胎児血清（「ＨＩ ＦＣＳ」）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を補った２．５ｍｌ ＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）および２．５ｍｌ無菌ろ過抗ＣＣＲ２ｂアミノ末端ペプチド抗体上清５Ａ１１に再懸濁した。細胞および抗体を混合し、そして氷上で３０分間インキュベーションした。次いで、細胞をＰＢＳ（＋）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で２回洗浄し、そして１％ ＨＩ ＦＣＳを補ったＰＢＳ（＋）中、無菌ろ過した、ＦＩＴＣコンジュゲート化アフィニティー精製Ｆ（ａｂ１）２ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の１：２５０希釈５ｍｌ中に再懸濁した。細胞を氷上、暗所で３０分間インキュベーションし、そして次いで、ＰＢＳ（＋）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で２回洗浄した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）上で細胞を選別し、そして最も明るい４％の細胞を収集した（ＦＬ１＞３ｘ１０２）。
選別した細胞を増殖させ、そして上と同じプロトコルを用いて、再選別した。最も明るい１％の細胞を収集した（ＦＬ１＞３ｘ１０３）。
モノクローナル抗体産生
ＣＣＲ２ｂに対するｍＡｂを産生するため、トランスフェクタントを連続的に監視して、発現レベルが低下していないことを確実にした。ＦＡＣＳ染色を定期的に行って、二次抗体としてのヤギ抗マウスＩｇＧ ＦＩＴＣとともに、抗ＣＣＲ２ｂ抗体上清５Ａ１１を用いて、トランスフェクタント上の受容体発現を確実にした。
２０００万のＣＣＲ２ｂＤＥＦ３．Ｌ１／２細胞をＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）中で洗浄し、そして０．２ｍｇ／ｍｌマイトマイシンＣを加えたＲＰＭＩ １６４０中、３７℃で３０分間インキュベーションした。次いで、細胞をＰＢＳ（＋）で２回洗浄し、そして０．５ｍｌ ＰＢＳ（＋）中の２ｘ１０７細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスに腹腔内注射した。これを、２週間間隔で、あと２回反復した。４回目、２ｘ１０７細胞を０．２５ｍｌ中に再懸濁し、そして静脈内注射した。静脈内注射の３日後、マウスを屠殺し、そして脾臓を取り除き、そして記載されるように（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， ニューヨーク， １９９２）、細胞をＳＰ２／０細胞株と融合させた。
このマウスセットは、以前に、２つの異なる細胞株とともに、合成ペプチドで何度も免疫されているが、数回融合させても、ＣＣＲ２陽性細胞を染色する抗体は生成されなかった。高レベルのＣＣＲ２ｂを発現するＣＣＲ２ｂＤＥＦ３．Ｌ１／２細胞株を用いた上記の４回の免疫は、記載する抗体を得るのに非常に重要であった。
限界希釈による、ＣＣＲ２トランスフェクタントの単細胞クローンの選択
マウスに最後の注射を行った後、２回選別した細胞を再び増殖させ、そして次いで、限界希釈によってさらに精製した。９６ウェルプレート中、ウェルあたり１および０．５細胞で、細胞を蒔いた。ウェルあたり０．５細胞の希釈からサブクローニングされた細胞を増殖させ、そして二次抗体としてのヤギ抗マウスＩｇＧ ＦＩＴＣとともに抗ＣＣＲ２ｂ抗体上清５Ａ１１を用いて、間接的免疫蛍光ＦＡＣＳ解析によって、ＣＣＲ２ｂ発現に関して試験した。該方法は、染色体積が１００μｌであったことを除いて、上述のものと同一であった。４つの陽性を選択し、そして凍結した。
陽性モノクローナル抗体の同定
ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＆ Ｃｏ．、カリフォルニア州マウンテンビュー）を用いた免疫蛍光染色解析を用いて、ＣＣＲ２ｂ受容体と反応するモノクローナル抗体を同定した。二次抗体としてヤギ抗マウスＩｇＧ ＦＩＴＣを用いて、９６ウェル形式で、ハイブリドーマ培養上清をアッセイした。ＣＣＲ２ｂＤＥＦ３．Ｌ１／２細胞を用いて、ＣＣＲ２ｂと反応するモノクローナル抗体を同定し、そして未トランスフェクションＬ１／２細胞を用いて、他の細胞表面タンパク質と反応するモノクローナル抗体を除去した。
ＦＡＣＳ染色−培養細胞
培養トランスフェクタント細胞株を染色するため、９６ウェルポリスチレンＶ底プレートにおいて、０．５ｘ１０６細胞を、５０μｌのＰＢＳ＋１％ＦＣＳに再懸濁した。５０μｌの一次抗体上清またはＨＴ培地（陰性対照）を添加し、そして試料を４℃で３０分間インキュベーションした。１００μｌのＰＢＳを添加し、そして遠心分離によって細胞をペレットにし、そしてＰＢＳで１回洗浄した。ＦＩＴＣコンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（１：２５０希釈）を含有する１００μｌＰＢＳ＋１％ＦＣＳにペレットを再懸濁し、そして暗所、４℃で３０分間インキュベーションした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、そしてＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｅｎｓｏｎ）を用いて、ＦａｃＳｃａｎサイトメーターでのフローサイトメトリーによって解析した。同じ日に解析しない場合、細胞をＰＢＳ／１％ホルムアルデヒドで固定した。モノクローナル１Ｄ９および８Ｇ２は、ＣＣＲ２トランスフェクタントを染色するが、ＣＣＲ１またはＣＣＲ５トランスフェクタントは染色しない（図１）。
ＦＡＣＳ染色−全血
１００μｌの全血を１００μｌの１Ｄ９抗体ハイブリドーマ上清またはＨＴ培地（陰性対照）と混合し、そして４℃で３０分間インキュベーションした。ＰＢＳで１回洗浄した後、１００μｌのＦＩＴＣコンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（１：２５０希釈）を各試料に添加し、そして暗所、４℃で３０分間インキュベーションした。次いで、二次染色を行う場合、試料をＰＢＳで１回洗浄し、そうでなければＰＢＳでさらに２回洗浄した。２色染色では、１回の洗浄後、５μｌのマウス血清を細胞ペレットに添加し、混合し、そして暗所、４℃で５分間インキュベーションした。第二の一次抗体（または陰性対照としてのＰＢＳ）を添加し（１０μｌ抗ＣＤ１６、１００μｌ １：２００希釈の抗ＩｇＥ）、そして暗所、４℃で３０分間インキュベーションした。次いで試料をＰＢＳで１回洗浄し、そして１００μｌのストレプトアビジンＰＥ（１：２００ ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）に再懸濁し、そして暗所、４℃で１５分間インキュベーションした。各試料にＦＡＣＳ溶解緩衝液を２ｍｌ添加し、そして暗所中、室温で１５分間、または試料が透明になるまでインキュベーションすることによって、赤血球を溶解した。遠心分離によって細胞をペレットにし、そして２００μｌを除いてすべての上清を吸引した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｅｎｓｏｎ）を用いて、ＦａｃＳｃａｎサイトメーター上でのフローサイトメトリーによって試料を解析した。ＣＣＲ２ｂは、大部分の単球、リンパ球の下位集団、および顆粒球のサブセット上で発現される（図２）。ＣＣＲ２ｂは、末梢血のＩｇＥ陽性集団（好塩基球）上で発現される（図３）。
ＭＣＰ−１結合アッセイ
２．５μｇ ＴＨＰ−１膜タンパク質または５００，０００ＰＢＭＣいずれかおよび０．１ｎＭの［１２５Ｉ］−ＭＣＰ−１を含有する、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．４、１ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０２％アジ化ナトリウム、０．５％ＢＳＡ（ＨＢＢ）最終体積０．１ｍｌ中で、ＭＣＰ−１結合を行った。多様な濃度の未標識ＭＣＰ−１、１Ｄ９抗体、または陰性対照ＩｇＧ２ａを含むことによって、競合結合実験を行った。未標識ＭＣＰ−１を２５００倍過剰で添加した後、非特異的結合を測定した。試料を室温で６０分間インキュベーションし、そして０．３％ポリエチレンイミンにあらかじめ浸した９６ウェルＧＦ／Ｂフィルタープレートを通じたろ過によって、結合したトレーサーおよび未結合トレーサーを分離した。０．５Ｍ ＮａＣｌをさらに補ったＨＢＢ中でフィルターを洗浄し、乾燥させ、そして液体シンチレーション計測によって、結合した放射能の量を決定した。ｍＡｂ １Ｄ９は、ＴＨＰ−１細胞膜への［１２５Ｉ］ＭＣＰ−１結合を約０．００４μｇ／ｍｌ（およそ０．０２ｎＭ；図４）のＩＣ５０で阻害し、そして新鮮ＰＢＭＣへの結合を０．０４μｇ／ｍｌ（およそ０．２ｎＭ；図５）のＩＣ５０で阻害する。
ＰＢＭＣの走化性
３μｍ孔サイズの９６ウェル走化性プレート（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ、メリーランド州キャビンジョン）を用いて、走化性をアッセイした。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離を用いる標準法によって単離したＰＢＭＣを、ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡで洗浄し、そして次いで、走化性アッセイ培地（ＨＢＳＳ／１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／０．５％脂肪酸不含ＢＳＡ）で最終濃度１０ｘ１０６細胞／ｍｌに再懸濁した。走化性アッセイ培地中、多様な濃度の抗ＣＣＲ２抗体、１Ｄ９、または非特異的ネズミＩｇＧ２ａとともに、室温で２０分間、細胞をプレインキュベーションした。同じ希釈の抗体をケモカインと混合し、そして３０μｌの混合物を走化性プレートの下部ウェル各々に添加した。下部ウェルを膜で覆い、そして２５μｌの細胞および抗体混合物をフィルター上部に添加する。プレートを５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃でおよそ８０分間インキュベーションする。遊走が完了したら、膜を取り除き、そして下部ウェルとともに、プレートを−８０℃で３０分間インキュベーションして、内容物を凍結させる。プレートを３７℃で１０分間融解する。供給者に提供される溶解緩衝液中の１：４００希釈のＣｙＱｕａｎｔ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）６μｌを各ウェルに添加し、そして４８５励起／５３５発光で、ＣｙｔｏＦｌｏｕｒ蛍光プレート読取装置を用いて決定される蛍光強度によって示されるように、細胞遊走を定量化する。ｍＡｂ １Ｄ９は、ＭＣＰ−１が誘導する新鮮ＰＢＭＣの走化性を阻害するが、ＲＡＮＴＥＳが誘導する走化性を阻害しない（図６Ａおよび６Ｂ）。ＭＣＰ−１が誘導する新鮮ＰＢＭＣの走化性の阻害は、１０μｇ／ｍｌ（．４０ｎＭ）で示されている。
（実施例２）
モノクローナル抗体１Ｄ９のヒト化
１Ｄ９モノクローナル抗体は、ヒトにおいて免疫原性である可能性があり、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応を誘発する可能性もある。このＨＡＭＡ反応の結果、通常、身体からマウスモノクローナル抗体が迅速に一掃され、したがって、１Ｄ９モノクローナル抗体が有しうるいかなる療法効果も制限される。したがって、ヒトにおけるこの抗体の免疫原性を減少させ、そしてその療法能力を最大限にするため、１Ｄ９マウスモノクローナル抗体のヒト化を行った。以下の実施例は、１Ｄ９アミノ酸配列データの詳細な解析、ネズミ１Ｄ９ ＦＶドメインの分子モデルの構築、およびマウス抗体のヒト化成功のための設計戦略を提供する。この設計戦略によって、カッパ軽鎖可変（ＶＫ）領域および重鎖可変（ＶＨ）領域両方のいくつかのヒト化型の設計が生じた。総合すると、ヒト化ＶＨ領域には、選択されるヒトＶＨ領域のＦＲ中、最大１６のアミノ酸変化が含まれた。これらの変化を、ヒト化ＶＨ領域の４つの型の間で細分した。さらに、やはり設計したヒト化ＶＫ領域の４つの型に、選択されるヒトＶＫ領域のＦＲ中の１２のアミノ酸変化が含まれた。
マウス１Ｄ９カッパ軽鎖可変領域の配列解析
１Ｄ９ ＶＫ領域のアミノ酸配列（図７）を他のマウスカッパ軽鎖可変領域と比較し、そしてまた、Ｋａｂａｔデータベース（Ｋａｂａｔら， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版， 米国保健社会福祉省， 米国政府印刷局（１９９１））において可変領域が細分されたサブグループのコンセンサス配列とも比較した。この解析から、１Ｄ９ ＶＫ領域は、マウスカッパサブグループＩＩのマウスコンセンサス配列と最も緊密にマッチすることが見出された（同一性＝７９．４６％、類似性８２．１４％）。１Ｄ９カッパ軽鎖可変領域のＦＲのみをマウスサブグループＩＩにおいて比較すると、同一性パーセントは８７．５％に増加し、一方、類似性パーセントは８８．７５％に増加した。さらに、マウス１Ｄ９ ＶＫ領域は、７０／３ネズミＶＫ生殖系列遺伝子の翻訳に優れた相同性を示した（図１３）。したがって、上記証拠によって、１Ｄ９配列が、マウスＶＫ領域の特色を示していることが明らかに立証された。
マウス１Ｄ９重鎖可変領域の配列解析
１Ｄ９ ＶＨ領域の類似の解析（図８）によって、該領域が、Ｋａｂａｔデータベース（Ｋａｂａｔら， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版， 米国保健社会福祉省， 米国政府印刷局（１９９１））において、マウス重鎖サブグループＩＩＩｃのコンセンサス配列に最も緊密にマッチすることが見出された。１Ｄ９のマウス重鎖可変領域アミノ酸配列およびマウスサブグループＩＩＩｃのコンセンサス配列間の同一性は、７０．９４％であり、一方、類似性は７６．０７％と計算された。１Ｄ９ ＶＨ領域のＦＲのみをマウスサブグループＩＩＩｃに比較すると、同一性パーセントは７５．８６％に増加し、一方、類似性は８０．４６％に増加した。マウス１Ｄ９ ＶＨ領域はまた、とりわけＭＬＲ−ＲＦ２４ＢＧネズミＶＨ生殖系列遺伝子の翻訳に優れた相同性を示した（図１４）。したがって、上記証拠によって、１Ｄ９配列が、マウスＶＨ領域の特色を示していることが確証された。
１Ｄ９ドメインの分子モデリング
１Ｄ９抗体のヒト化可変領域の設計を補助するため、ネズミ１Ｄ９ ＦＶ領域および８つのＣＤＲ移植変異体の一連の分子モデルを構築した。Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｍｉｔｅｄ（ＯＭＬ）に供給され、そして利用される、ＡｂＭ分子モデリングパッケージを用いて、これを行った。Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎデータベースから入手可能な抗体Ｘ線結晶構造をフォーマットして、ＡｂＭでのモデリングに用いるのを可能にした。
１Ｄ９可変領域のＦＲを、類似の構造的に解析された免疫グロブリン可変領域由来のＦＲに対してモデリングした。同一アミノ酸側鎖を元来の配向に維持する一方、ミスマッチした側鎖を元来の１Ｄ９ ＦＶにおけるように置換した。ＶＫ鎖およびＶＨ鎖両方に関して、１Ｄ９のＦｖフレームワーク領域のモデルとして、Ｆａｂ Ｂｖ０４−０１ ＶＫ領域のＦＲの主鎖原子を用いた（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ ＰＤＢコード１ｎｂｖ、２．０Ｄまで解析）。Ｆａｂ Ｂｖ０４−０１の配列は、ネズミ１Ｄ９およびそのヒト化変異体の可変領域配列に優れてマッチした。Ｆａｂ Ｂｖ０４−０１およびネズミ１Ｄ９およびヒト化配列間の同一性は、ＶＫ配列では７６％〜７８％、そしてＶＨ配列では７４％〜８４％の範囲であった。既知の構造を持つＡｂＭを試験すると、モデリングしている配列とあまりマッチしないＦＲ構造を使用した場合、ＣＤＲループの位置および配向に有意にそして不都合に影響しうることから、ＦＲ主鎖相同性は、いかなるモデルの品質にも重要な要因であることが示されている。
ＣＤＲ Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１およびＨ２の主鎖構造に関しては、すべてのモデルのコンホメーションを、図９および図１０に示すクラスを用いて、修飾なしに、ＡｂＭに用いられる規範的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）クラスから採った。
Ｌ１ループの主鎖構造に関しては、ネズミ１Ｄ９ ＶＫ領域のループコンホメーションをＡｂＭ由来の規範的クラス４から採った。この規範的クラスは、Ｃｈｏｔｈｉａおよびその同僚に記載されるものに基づく（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９７：９０１（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａら， Ｎａｔｕｒｅ ３４：８７７（１９８９）；Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：１７５（１９９０）；およびＣｈｏｔｈｉａら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２７：７９９（１９９２））が、元来の論文が公表されてから入手可能になった構造を考慮に入れて、修飾されている。既知のループ構造のＡｂＭ予測の実行を試験すると、この方式で生成されたＣＤＲループは、通常、非常に正確に、すなわち１〜１．５ÅのＲＭＳ偏差内にモデリングされることが示されている。
１Ｄ９ ＶＨ領域のＨ３ループは、長さ６残基で比較的短い。ＢｒｏｏｋｈａｖｅｎデータバンクのＸ線構造からの主鎖コンホメーションに関する検索を用いて、このループをモデリングした。このような短いループでは、既知のＸ線構造から、ループが利用可能なコンホメーション空間を飽和するのに十分なループコンホメーションがある。プログラムが使用するデータベースに構造が含まれていない新規抗体構造を用いてＡｂＭによる予測を試験することによって、このサイズのＣＤＲ Ｈ３ループに関しては、正確さは少なくとも２．０Åである可能性があることが示される。
明らかな立体衝突がないようにモデル全体を調整した後、ＭＡＣＲＯＭＯＤＥＬで実行されるようなエネルギー最小化に供して、望ましくない原子接触を軽減し、そしてファンデルワールス相互作用および静電相互作用を最適化した。
ヒト化１Ｄ９ ＶＫ抗体変異体の設計
１Ｄ９抗体のヒト化可変領域設計の第一の工程は、ヒト化１Ｄ９ ＶＫ領域の基礎として働くであろうヒトカッパ軽鎖可変領域の選択であった。このプロセスの補助として、１Ｄ９ ＶＫ領域をまず、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版， 米国保健社会福祉省， 米国政府印刷局（１９９１））に定義されるような４つのヒトカッパ軽鎖可変領域サブグループのコンセンサス配列に比較した。マウス１Ｄ９軽鎖可変領域は、ヒトカッパ軽鎖サブグループＩＩのコンセンサス配列に最も類似であり、全可変領域に渡って７６．２％の同一性を、そしてＦＲ内のみでは８２．５％の同一性を示した。類似性に関して測定した場合、これらの値は、全体で７９．７％に、そしてＦＲ内のみでは８５．０％に増加した。その結果、該領域は、一般的に、カッパサブグループＩＩ由来のヒトカッパ軽鎖可変領域配列によくマッチするようであった。
次いで、マウス１Ｄ９ ＶＫを、公的に利用可能なヒト可変領域の個々の配列の記録される例すべてに比較した。図１５は、この解析を通じて同定された、マウス１Ｄ９ ＶＫ領域に最適にマッチする１７の配列を示す。全体として、この検索アルゴリズムは、マウス１Ｄ９ ＶＫ領域に対する最適のマッチとして、ヒトＶＫ領域抗体０３６５２１（Ｒｈｅｉｎｎｅｃｋｅｒら， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． １５７（７）：２９８９−９７（１９９６））を選択した。しかし、この抗体に関して、元となる論文を再検討すると、ハイブリドーマから該遺伝子をレスキューするのに、ネズミオリゴヌクレオチドプライマーを用いていたことが明らかになった。これは、Ｋａｂａｔデータベースに示唆されるように、この抗体が、実際はネズミ抗体であってヒト抗体ではないことを意味した。したがって、データベース検索によって選択された、ネズミ１Ｄ９ ＶＫ領域に次に最適にマッチするものは、抗体ＨＦ−２１／２８（ＫａｂａｔデータベースＩＤ番号００５０５６；Ｃｈａｓｔａｇｎｅｒら， Ｇｅｎｅ． １０１（２）：３０５−６（１９９１））由来のヒトＶＫ領域であった。該ヒト配列は、全体で、１Ｄ９ ＶＫ領域に７９．３％、そしてＦＲ内のみでは８５．０％の同一性を有した。類似性に関して測定すると、これらの値は、全体で８３．９９％、そしてＦＲ内のみでは８７．５％に増加する。さらに、重要なＦＲアミノ酸は、他の候補ヒトカッパ軽鎖可変領域におけるよりも、ＨＦ−２１／２８ ＶＫ領域でより保存的に保存されていた。その結果、ＨＦ−２１／２８カッパ軽鎖可変領域ＦＲが、１Ｄ９抗体カッパ軽鎖可変領域ヒト化のためのヒトアクセプター配列として選択された。
不運なことに、ヒトＨＦ−２１／２８ＶＫ領域のＦＲ４の最後の残基（Ｋａｂａｔ番号付け体系にしたがうと１０７位）は、Ｋａｂａｔデータベースにも、またこの可変領域配列を最初に単離した著者らにも定義されていなかった。したがって、Ｋａｂａｔヒトカッパ軽鎖サブグループ６−ＩＩ（Ｋａｂａｔら， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版， 米国保健社会福祉省， 米国政府印刷局（１９９１））に記載される可変領域配列において、この位で最も一般的に見られるアミノ酸を挿入することにした。したがって、Ｋａｂａｔヒトカッパ軽鎖サブグループＫ−ＩＩの配列の８５．７％がこの位でリジンを有することが見出された、Ｋａｂａｔデータベースの解析に基づいて、ＦＲ４の１０７位に、リジンを付加した。次いで、これは、１Ｄ９カッパ軽鎖（１Ｄ９ＲＫＡ）の最初のヒト化型の基礎となり、本質的に、１Ｄ９ ＶＫ領域のＣＤＲおよびＨＦ−２１／２８ ＶＫ領域のＦＲを含んだ。図１９Ａ〜１９Ｃは、ヒト化１Ｄ９ ＶＫ領域のこの最初のＣＤＲ移植型のアミノ酸配列を明示する。
設計プロセスの次の工程は、ヒトアクセプターＨＦ−２１／２８ ＶＫ領域ＦＲのアミノ酸配列を研究して、これらのアミノ酸残基のいずれかが、抗原への結合に不都合に影響を及ぼす可能性があるかを決定することであった。これは、抗原との相互作用を通じて直接引き起こされるか、またはＣＤＲループのコンホメーションまたは配向を改変することによって、間接的に引き起こされることも可能である。これは、１Ｄ９可変領域、すなわちＶＫ領域およびＶＨ領域両方のモデルの利用可能性を通じてのみ可能になる、困難なプロセスであった。それでもなお、抗原結合に影響を及ぼすようである、マウス１Ｄ９ ＦＲのアミノ酸いずれも、ヒト化１Ｄ９抗体における変換に関して、次に考慮した。どのネズミ残基を保存するかを決定する際に、以下の点に注意を向けた：
超可変ループの規範的構造（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９７：９０１（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａら， Ｎａｔｕｒｅ ３４：８７７（１９８９）；Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：１７５（１９９０）；およびＣｈｏｔｈｉａら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２７：７９９（１９９２））が保存されていることは非常に重要であった。その結果、ヒト化１Ｄ９可変領域において、これらの規範的構造の一部であるマウスＦＲ残基がすべて保存されていることが非常に重要であった（図９および図１０）。
１Ｄ９抗体可変領域の配列を、他のマウス抗体由来の類似の配列に比較して、抗原結合に重要な役割を有することの指標となりうる、異常なまたは稀な残基を同定した。次いで、１Ｄ９可変領域遺伝子のマウスモデルを用いて、これを調べた。
また、モデルを直接解析して、ヒト化ＦＲに存在しない他のマウスＦＲ残基のいずれかが、何らかの点で抗原結合に影響を及ぼしうるかどうかを試験し、そして予測した。
カッパ軽鎖および重鎖可変領域の個々のヒトアクセプター配列の、該アクセプター配列が属するヒト可変領域サブグループのコンセンサス配列への比較もまた、行った。抗原結合に不都合に影響しうるため、ヒトドナー配列に特異ないかなるアミノ酸の同定も重要であった。
選択されるヒト軽鎖および重鎖可変領域は、２つの異なるヒト抗体に由来するであろうため、ドナーおよびアクセプターのカッパ軽鎖可変領域両方のドメイン間パッキング残基を注意深く解析しなければならない（Ｃｈｏｔｈｉａら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８６：６５１（１９８５））。これは、ヒト化１Ｄ９抗体のＣＤＲループ構造のコンホメーションに関わりなく、この領域のいかなるミスパッキングも、抗原結合に際して劇的な影響を有する可能性もあるためであった。
ドナー、マウス１Ｄ９ ＶＫ領域およびアクセプター、ヒトＨＦ−２１／２８ ＶＫ領域間には、１２のアミノ酸相違があるが、ヒト化ＦＲにおいて、２つのマウス残基のみを保存するのが、結合親和性に十分に重要であると見なされた。１Ｄ９ＲＫＢに導入された最初のＦＲ変化は、３６位に位置した。この残基は、Ｖｅｒｎｉｅｒ残基（ＦｏｏｔｅおよびＷｉｎｔｅｒ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２４：４８７（１９９２））であり、そしてＣｈｏｔｈｉａおよびその同僚（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９７：９０１（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａら， Ｎａｔｕｒｅ ３４：８７７（１９８９）；Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：１７５（１９９０）；およびＣｈｏｔｈｉａら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２７：７９９（１９９２））に定義されるような、Ｌ１ループ構造の重要な構造決定残基であると予測される。どちらの残基も疎水性であるが、ヒトＰｈｅは、この位でより大きく、そしてこの位でＬｅｕおよびＰｈｅを持つＸ線構造は、Ｐｈｅが存在する場合、立体障害によって、３４Ａｓｎの側鎖が反対の方向を指すことを示す。したがって、１Ｄ９カッパ軽鎖のヒト化成功には、この位が非常に重要であると見なされた。
１Ｄ９ＲＫＢヒト化型に取り込まれた第二の変化は、残基３７、すなわちＧｌｎ３７Ｌｅｕであった。これは保存的変化であるが、ＣＤＲ１の根元の非常に保存された領域で生じた。この型において、３６位のネズミＬｅｕ残基とともに、このネズミＬｅｕ残基を保存することによって、ヒト化抗体の親和性が保存可能であると考えられた。
ヒト化ＶＫ領域の２つの他の型もまた、ヒト化１Ｄ９抗体のＦＲ操作の構造上および結合親和性の結果を検討するため、構築に関して考慮した。１Ｄ９ＲＫＣは、突然変異Ｇｌｎ１００Ｇｌｙを除いて、１Ｄ９ＲＫＢに本質的に同一であった。これらの２つの残基間で分子の大きさには劇的な相違があり、そしてしたがって、この型を作成して、この変化が抗体構造および全体の抗体親和性に関して、再形成ヒトカッパ軽鎖のＦＲに及ぼす結果を検討した。１Ｄ９ＲＫＤは、１Ｄ９ＲＫＣに記載される修飾を含有し、そしてさらに、ＦＲの変化、Ｇｌｎ１７Ｈｉｓを含有した。ＧｌｎおよびＨｉｓは、大きさが類似であり、そしてどちらも弱く極性であったが、この位のマウス残基（Ｈｉｓ）は、すべてのマウスＶＫ配列のうちで非常に稀であり（全体で０．０７％、しかしマウスＫａｂａｔサブグループＩＩ配列では見られなかった）、そしてヒトＶＫ配列ではまったく見られたことがなかった。逆に、Ｇｌｎ残基は、マウス（全体で１６．１６％であり、そしてマウスＫａｂａｔサブグループＩＩ配列では６．１２％）およびヒト（全体で５．００％であり、そしてヒトＫａｂａｔサブグループＩＩ配列では３９．７％）配列両方で、この位でより一般的に見られる。したがって、単純にこの位ではＨｉｓが稀であるため、分子モデリングデータからこれを支持する明らかな証拠はないものの、これが結合に重要である可能性もあると示唆される。
上に提唱するヒト化１Ｄ９抗体ＶＫ領域変異体すべてのアミノ酸配列の説明を図１１に提供する。
ヒト化１Ｄ９ ＶＨ抗体変異体の設計
マウス１Ｄ９抗体のヒト化ＶＨ領域の設計においても同様に、第一の工程は、ヒト化１Ｄ９ ＶＨ領域の基礎として働くであろうアクセプターヒト重鎖可変領域の選択であった。１Ｄ９ ＶＨ領域を、３つのヒト重鎖可変領域サブグループのコンセンサス配列にまず比較すると、ヒト重鎖サブグループＩＩＩのコンセンサス配列に最も類似であることが見出され、全体で６９．２３１％の同一性、そしてＦＲ間のみでは７８．１６１％の同一性であった。類似性に関して測定した場合、これらの値は、全体で７４．３５９％に、そしてＦＲ内のみでは８２．７５９％に増加した。
次いで、マウス１Ｄ９ ＶＨ領域を、公的に利用可能なヒト可変領域の個々の配列の記録される例すべてに比較した。図１７Ａ〜Ｂは、この解析を通じて同定された、マウス１Ｄ９ ＶＨ領域に最適にマッチする２４の配列を示す。全体として、この検索アルゴリズムは、マウス１Ｄ９ ＶＨ領域に対する最適のマッチとして、抗体４Ｂ４’ＣＬ由来のヒトＶＨ領域（ＫａｂａｔデータベースＩＤ番号０００４９０；Ｓａｎｚら， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． １４２：８８３（１９８９））を選択した。このクローンのＶＨ領域は、全体で、１Ｄ９ ＶＨ領域に６７．２％の同一性であり、ＦＲのみを比較した場合、値は８０．９５％に増加した（図１８Ａ〜Ｂ）。類似性に関して測定すると、これらの値は、全体で６９．６６％に、そしてＦＲ内のみでは８４．５２％に増加した。したがって、ここでも潜在的なヒトアクセプターＶＨ配列には最も相同ではなかったが、このヒトＦＲが、１Ｄ９重鎖のヒト化型の基礎となった。
設計プロセスの次の工程は、ヒトアクセプター４Ｂ４’ＣＬ ＶＨ領域ＦＲのアミノ酸配列を研究して、これらのアミノ酸残基のいずれかが、抗原への結合に不都合に影響を及ぼす可能性があるかどうかを決定することであった。ここでも、ＯＭＬによって構築した分子モデルがこの設計プロセスにおいて重要であり、ここからヒト化１Ｄ９抗体の第一の型（１Ｄ９ＲＨＡ）およびそれに続く型において変換すべき、ネズミ１Ｄ９ ＶＨ領域ＦＲ中のいくつかのアミノ酸を同定した（図１２および図２０Ａ〜Ｃ）。ドナーマウス１Ｄ９およびアクセプターヒト４Ｂ４’ＣＬ ＶＨ領域のＦＲ間には１６のアミノ酸相違があり、そして最大５つのネズミ残基が、ヒト化ＦＲにおける保存に関して考慮された（図１２）。
１Ｄ９ＲＨＡは、ヒト４Ｂ４’ＣＬ抗体ＶＨ領域のＦＲに遺伝子挿入された、ネズミ１Ｄ９抗体ＶＨ領域のＣＤＲからなった。１Ｄ９ＲＨＢは、２つのＦＲ１突然変異、Ｔｈｒ２８ＳｅｒおよびＳｅｒ３０Ａｓｎは別にして、１Ｄ９ＲＨＡ型と同一であった。これらの変化は、Ｈ１ループコンホメーションに非常に重要であると考えられる、ＦｏｏｔｅおよびＷｉｎｔｅｒ（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２４：４８７（１９９２））に定義されるようなＶｅｒｎｉｅｒアミノ酸に相当するため、これらの変化を作成した。残基２７〜３０は、Ｈ１ループ自体の一部であると見なされ、そしてしたがって、このループの正しいコンホメーションおよび配向にさらにより重要であり、その保存が正当であることがさらにより強く立証される。したがって、これらの２つの残基は、１Ｄ９ＲＨＢ中のヒト４Ｂ４’ＣＬ ＶＨ配列のＦＲに作成した変化の総計に相当した。１Ｄ９ＲＨＣは、Ｇｌｙ４９ＡｌａおよびＰｈｅ６７Ｔｙｒの位に２つのさらなる変化を含有する以外、１Ｄ９ＲＨＢ型と同一であった。Ｇｌｙ４９Ａｌａは、保存的変化であった。しかし、残基４９位は、Ｖｅｒｎｉｅｒ残基（ＦｏｏｔｅおよびＷｉｎｔｅｒ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２４：４８７（１９９２））であると同定されており、Ｈ２超可変ループ構造に重要であって、したがって、この型ではネズミＡｌａ残基を保存することにした。残基６７位もまた、Ｖｅｒｎｉｅｒ残基位であり、ＣＤＲループコンホメーションを維持するのに重要であると同定された。Ｔｙｒは、ヒトＶＨ配列で非常に稀にしか見られず（全体で０．０８％）、そしてこの位のネズミＶＨ領域では今までに見出されたことがない。このことから、この残基は体細胞突然変異から生じたのに違いない。したがって、分子モデルによると、その位置がＣＤＲ２に近いことを考慮し、そしてそのＶｅｒｎｉｅｒ残基状態を考慮して、この位でネズミＴｙｒ残基を保存することにした。１Ｄ９ＲＨＤは、Ｔｈｒ９３Ｖａｌ突然変異を除いて、１Ｄ９ＲＨＣと同一であった。この残基は、ＶＨ／ＶＫ両方のパッキング残基として重要であることが同定されている（Ｃｈｏｔｈｉａら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８６：６５１（１９８５））。さらに、この残基は、分子モデルによれば、ＣＤＲループＨ１およびＨ３間に埋め込まれた位置にあり、この位でネズミＶａｌ残基を保存する決定が支持される。上述のヒト化ＶＨ領域変異体のすべてのアミノ酸配列の説明を図１２に提供する。
１Ｄ９のヒト化型によるＭＣＰ−１結合の阻害
図２５は、１Ｄ９ＲＨＡＶＨ重鎖（図１２）および１Ｄ９ＲＫＡＶＫ軽鎖（図１１）を含む、ネズミｍＡｂ １Ｄ９およびｍＡｂ １Ｄ９のヒト化型が、全ＴＨＰ−１細胞への［１２５Ｉ］−ＭＣＰ−１の結合を阻害する能力を例示する。０．５ｘ１０６のＴＨＰ−１細胞を、異なる希釈の抗体試料を含む、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％ＢＳＡ、０．０５％アジ化ナトリウム（結合緩衝液）中、３７℃で１０分間インキュベーションした。結合緩衝液中の等体積の［１２５Ｉ］−ＭＣＰ−１を、最終濃度０．１ｎＭになるよう添加し、そして３７℃でさらに３０分間インキュベーションした。細胞を希釈し、そして等体積の、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む結合緩衝液（洗浄緩衝液）とボルテックスし、そして遠心分離（ベンチトップ遠心分離装置、７０００ｒｐｍ、２分間）によってペレットにした。上清を除去した後、ペレットを２００μｌの洗浄緩衝液中でボルテックスし、先と同じように回転させ、そして上清を取り除いた。細胞を１００μｌの洗浄緩衝液中に再懸濁し、そしてガンマカウンター（Ｃｏｂｒａ、Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）上でカウントした。Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアを用いて、データ解析を行った。
（実施例３）
組み合わせた免疫グロブリンＤＮＡカセットベクターの生成
Ｇ４１８（ＮＥＯ）に対する耐性のための遺伝子を含有する主鎖ベクターとして、ｐｃＤＮＡ３を用いて、研究条件における容易な選択を可能にした。部位特異的突然変異誘発によって、ｐｃＤＮＡ３から、ＳｐｅＩ制限部位を除去した。プラスミドｐｃＤＥＦ３由来のＥＦ−１ａプロモーター（元来はｐＢＯＳ）をｐｃＤＮＡ３に挿入し、こうしてＣＭＶプロモーターを除去した。
部位特異的突然変異誘発を用いて、ｐｃＤＮＡ３クローニングリンカー中のＢａｍＨＩ部位およびＥＦ−１ａプロモーター内のＭｆｅＩクローニング部位を除去し、そしてＢａｍＨＩ部位をポリＡ領域の３’に付加した。これによって、単一ベクター中で、重鎖および軽鎖活性領域を組み合わせることが可能になり、そしてメチルトレキセート（ｍｅｔｈｙｌｔｒｅｘａｔｅ）への耐性を与える遺伝子カセットＤＨＦＲを含む、他の選択可能マーカーいずれの付加も可能になるであろう。
重鎖カセット（そのプロモーターおよびポリアデニル化領域を含む）を多様な単一カセットベクターから、対応する軽鎖カセットベクターにサブクローニングして、組み合わせた２カセットベクターを生成した（図２６）。組み合わせを表１に要約する。すべての組み合わせベクターは、図２７に示すものと類似の全体構造を有した。
ｐＬＫＴＯＫ５５およびｐＬＫＴＯＫ５７を組み合わせることによって生成されるｐＬＫＴＯＫ５８ベクターを用いて、ヒトカッパ定常領域およびヒトＩｇＧ１定常領域を天然型で含有する抗体を産生することも可能である。ｐＬＫＴＯＫ５６およびｐＬＫＴＯＫ５７を組み合わせることによって生成されるｐＬＫＴＯＫ５９ベクターを用いて、ヒトカッパ定常領域、並びにＬ２３５ＡおよびＧ２３７Ａの位で突然変異を含有するヒトＩｇＧ１−ＦｃＲｍｕｔ定常領域を含有する抗体を産生することも可能である。これらの突然変異は、ヒトＦｃ受容体に該定常領域が結合するのを阻害し、そしてＡＤＣＣ反応の開始を阻害する。こうした突然変異は、本明細書に援用される、米国特許第５，９８５，２７９号および国際公報第ＷＯ９８／０６２４８号に先に記載されている。ｐＬＫＴＯＫ５５またはｐＬＫＴＯＫ５６およびｐＬＫＴＯＫ７２を組み合わせることによって生成されるｐＬＫＴＯＫ９２およびｐＬＫＴＯＫ７３ベクターを用いて、ヒトラムダ定常領域およびヒトＩｇＧ１−ＷＴ（ｐＬＫＴＯＫ９２）またはヒトＩｇＧ１−ＦｃＲｍｕｔ（ｐＬＫＴＯＫ７３）いずれかを含有する抗体を産生することも可能である。
ｐＬＫＴＯＫ６５またはｐＬＫＴＯＫ６６およびｐＬＫＴＯＫ６７を組み合わせることによって生成されるベクター、ｐＬＫＴＯＫ６８およびｐＬＫＴＯＫ６９を用いて、マカクカッパ定常領域およびマカクＩｇＧ１定常領域を含有する抗体を産生することも可能である。ｐＬＫＴＯＫ６８の定常領域は、カニクイザルおよびアカゲザル両方のＩｇＧ１−ＷＴである。ｐＬＫＴＯＫ６９の定常領域は、Ｌ２３５ＡおよびＧ２３７Ａ突然変異を含有するＩｇＧ１−ＦｃＲｍｕｔであり、そして理論的には、マカクＦＣ受容体への定常領域の結合を阻害するはずである。カッパ定常領域は、カニクイザルおよびアカゲザル両方に発現される２つのカッパ定常領域の一方であり、したがってどちらのサル種にも天然と認識されるはずである。
ｐＬＫＴＯＫ６０またはｐＬＫＴＯＫ６１およびｐＬＫＴＯＫ６２を組み合わせることによって生成されるベクターｐＬＫＴＯＫ６３およびｐＬＫＴＯＫ６４を用いて、マウスカッパ定常領域およびマウスＣ５７ＢＬ／６ ＩｇＧ２ａ定常領域を含有する抗体を産生することも可能である。ｐＬＫＴＯＫ６３の定常領域は、マウスにおいてＩｇＧ２ａの天然コンホメーションであり、そして構造および機能がヒトＩｇＧ１に最も緊密にマッチするアロタイプである。ｐＬＫＴＯＫ６４の定常領域は、Ｌ２３５ＡおよびＧ２３７Ａの位（Ｆｃ領域Ｉ）、並びにＥ３１８Ａ（Ｆｃ領域ＩＩ）の位に突然変異を持つネズミＩｇＧ１を含有し、この突然変異がマウスＦＣ受容体への定常領域の結合を阻害し、そしてＡＤＣＣ反応の開始を阻害する（Ｉｓａａｃｓ ＪＤら Ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． ＩＩ． Ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｃ ｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆ Ｃ（Ｈ）１ ａｎｄ Ｃ（Ｈ）３ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ． １９９８． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６１（８）：３８６２−９を参照されたい）。
表１． 組み合わせ発現ベクターの組成
Figure 2007521248
（実施例４）
ＤＮＡカセット挿入配列の生成：抗体可変領域の適合
損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）抗体を生成することによってこれらのベクターを試験するため、モノクローナル抗体１Ｄ９由来の可変領域をＰＣＲ適合させて、望ましい制限酵素部位（ＶＨではＭｆｅＩおよびＢｌｐＩ、ヒトおよびマカクのＶＫではＰｐｕＭＩおよびＢｓｉＷＩ、並びにマウスＶＫではＰｐｕＭＩおよびＣｌａＩ）を付加した。１Ｄ９抗体は、本明細書に援用される国際公報第ＷＯ００／０５２６５号および第ＷＯ０１／５７２２６号に先に記載されている。適合させたら、これらのセットおよび他のセットいずれの可変領域も、多様な発現ベクターにクローニングすることも可能である。
５’プライマーがＶＨリーダーの末端７コドン（ＭｆｅＩ制限酵素を含む）およびハイブリドーマＶＨの最初の７〜９コドンを含むように、ＶＨ領域のプライマーを設計する。３’プライマーは、ハイブリドーマＶＨの７〜９コドンの後に、ＩｇＧ１定常領域の３コドンを含んだ（ＢｌｐＩ制限酵素を含む）。可変領域を適合させるために用いるプライマーを表２に示す（大文字はベクターにコードされるすべての抗体が同一配列であることを示し；小文字は個々の抗体の配列によって決定される）。
５’プライマーがＶＫリーダーの末端６コドン（ＰｐｕＭＩ制限酵素を含む）およびハイブリドーマＶＫの最初の７〜９コドンを含むように、ＶＫ領域のプライマーを設計する（表２）。ヒト３’プライマーは、ハイブリドーマＶＨの７〜９コドンの後に、ヒトカッパ定常領域の４コドンを含んだ（ＢｓｉＷＩ制限酵素を含む）。マウス３’プライマーは、ハイブリドーマＶＨの７〜９コドンの後に、マウスカッパ定常領域の１２コドンを含んだ（ＣｌａＩ制限酵素を含む）（表２）。ハイブリドーマ１Ｄ９ ＶＨ遺伝子を適合させるのに用いたプライマーは、ｎ１Ｄ９ＶＨ５およびｎ１Ｄ９ＶＨ３であった。ハイブリドーマ１Ｄ９ ＶＫ遺伝子を適合させるのに用いたプライマーは、ｎ１Ｄ９ＶＫ５およびｎ１Ｄ９ＶＫ３であった。適合させた１Ｄ９ ＶＨおよびＶＫ遺伝子を標準的２工程クローニングで、ベクターにクローニングして、完全プラスミドを生成した（図２８）。
表２． すべての発現ベクターへのクローニングのため、１Ｄ９ ＶＨおよびＶＫを適合させるプライマー
（大文字はすべての抗体に関して同一である。小文字は、個々の抗体の配列によって決定される）
Figure 2007521248
（実施例５）
系の試験：抗体産生の相対速度の決定
タンパク質産生レベル、正しいフォールディングの率および細胞からの輸送の速度が、分泌されるタンパク質の高産生を決定する。タンパク質産生量の主要素は、プロモーターの関数である。
細胞からの抗体のフォールディングおよび輸送が成功するには、２つのタンパク質が産生され、そして適切に会合しなければならない。重鎖および軽鎖の濃度が類似であることが、抗体の会合、フォールディングおよび輸送を補助しうると考えられる。細胞内に１抗体鎖が過剰となると、細胞死につながりうる。我々は、各抗体鎖がそれ自体のプロモーターからポリアデニル化部位までを有するカセットを生成すると、２つの鎖のタンパク質産生が同等になる可能性が増加すると考えた。この系はまた、ｃＤＮＡ挿入物を用い、翻訳後修飾の必要性を排除している。多様性が減少すれば、他のＲＮＡ種のレベルが減少し、そして望ましいＲＮＡ種のレベルが増加することも可能である。
この系を試験し、そして最適なプロモーターの組み合わせを決定するため、ＣＭＶまたはＥＦ−１ａプロモーターいずれかを用いてベクターを生成した（米国特許第５，２２５，３４８号および第５，２６６，４９１号；Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ Ｓ， Ｎａｇａｔａ Ｓ． ｐＥＦ−ＢＯＳ， ａ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ． １９９０ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １８（１７）：５３２２を参照されたい）。どちらの場合でも、部位特異的突然変異誘発によって、これらのカセット内の、クローニングに干渉するであろう制限部位を除去した。ＣＭＶからＳｐｅＩクローニング部位を除去し、そしてＥＦ−１ａからＭｆｅＩクローニング部位を除去した。ＥＧＦＰカセットを用いて試験すると、これらの変化が、プロモーターの一般的な機能に認識しうる変化を生じないことが立証された。また、突然変異ＣＭＶプロモーターとベータ−キネシンＩＲＥＳの組み合わせを用いてベクターを生成して、抗体産生が増加するかどうかを確かめた。
ベクターｐｃＤＮＡ３は、Ｇ４１８（ＮＥＯ）に対する耐性のための遺伝子を含有して、研究条件において、容易な選択が可能であるため、該ベクターを主鎖ベクターとして用いた。このベクター内に、突然変異ＣＭＶプロモーター、ベータ−キネシンＩＲＥＳを伴う突然変異ＣＭＶプロモーターまたは突然変異ＥＦ−１ａプロモーターをクローニングした。
クローニングを補助するための変化をベクター主鎖に行い、こうした変化には、プロモーター５’のＭｆｅＩクローニング部位の除去が含まれた。ｐｃＤＮＡ３クローニングリンカーのＢａｍＨＩ部位を除去し、そしてポリアデニル化領域の３’にＢａｍＨＩ部位を付加した。この隣接ＢａｍＨＩ部位によって、そのプロモーターおよびポリアデニル化領域を含む重鎖カセット（ＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩ断片として）を、軽鎖カセットを含有するベクターにトランスファーすることが可能になる。クローニング後、単一のＢａｍＨＩ部位が残り、これによって、メトトレキセートへの耐性を与えるＤＨＦＲ遺伝子カセットを含む、他の選択可能マーカーいずれかを後で付加することが可能になる。
３つのマッチしたベクターを構築して、系を試験した。各々は、軽鎖カセット（そのプロモーターおよびポリアデニル化領域を含む）の後に重鎖カセット（そのプロモーターおよびポリアデニル化領域を含む）を含む単一ベクターであった。３つのベクターはすべて、挿入物構築において記載する方法によって、ヒトＣカッパ遺伝子に機能可能であるように付着した１Ｄ９ ＶＫ、およびヒトＩｇＧ１−ＦｃＲｍｕｔ遺伝子に機能可能であるように付着した１Ｄ９ ＶＨを含有する。該ベクターは、プロモーター組み合わせにおいてのみ異なった。ベクターｐＬＫＴＯＫ３４は、突然変異ＣＭＶプロモーターに駆動される軽鎖および重鎖カセット両方を有した。ベクターｐＬＫＴＯＫ３６は、ベータ−キネシンＩＲＥＳと組み合わせた突然変異ＣＭＶプロモーターに駆動される軽鎖および重鎖カセット両方を有した。ベクターｐＬＫＴＯＫ３８は、突然変異ＥＦ−１ａプロモーターに駆動される軽鎖および重鎖カセット両方を有した。
完全なベクターをＣＨＯ細胞にトランスフェクションし、そしてＧ４１８培地中で選択した。この培地は、ネオマイシン耐性遺伝子を含有しないすべての細胞の死を生じる。Ｇ４１８中で５日間選択した後、細胞をトリプシン処理し、単細胞懸濁物を作成して、そして１、５または１０細胞／ウェルの率で９６ウェルプレートに蒔いた。選択第５日、大部分のＧ４１８非耐性細胞は、死ぬようにプログラムされるであろう。これらのクローンを拡大し、そして反復して試験して、高産生レベルを保持する能力を決定した。
９６ウェルプレート中で１０日間置いた後、プレートを視覚的にスコア付けして、単一ＣＨＯクローンを含有するウェルを選択する。２週間の時点で、ウェルをヒト重鎖および軽鎖に対するＦａｂ’でコーティングし、そして酵素ＨＲＰに付着させたプロテインＡで発色させるＥＬＩＳＡによって測定されるように、損なわれていない抗体を産生し、そして分泌する能力に関して、これらを試験する。
多様なトランスフェクションにおいて、試験した単一クローンのウェルの５０〜７０％が有意な量の抗体を産生しており、そして通常、７０％＋がトランスファー後も産生を保持した。
酪酸（ＣＭＶ産生を増幅するのに必要）を含む、および含まない条件両方で、５日間に渡って抗体を産生する能力に関して、最適なクローンを試験した。ＣＭＶｍｕｔ細胞は、酪酸処理なしで平均０．５μｇ／ｍｌを産生し、そして酪酸処理を行うと１．８μｇ／ｍｌを産生すると決定された。ＣＭＶｍｕｔ／ＩＲＥＳ細胞は、酪酸処理なしで平均０．７μｇ／ｍｌを産生し、そして酪酸処理を行うと０．２μｇ／ｍｌを産生した。ＥＦ−１ａ細胞は、酪酸処理なしで平均１２２．６μｇ／ｍｌを産生し、そして酪酸処理を行うと５０．２μｇ／ｍｌを産生した。結果によって、ＥＦ−１ａプロモーターが１００倍量の抗体を産生したことが示された。
それ自体のプロモーターで駆動され、そしてそれ自体のポリアデニル化領域を有する抗体の２つの鎖が、類似の率で２つのタンパク質が産生されるのを可能にすることは十分にありうることである。２つの鎖が類似の量を有することで、おそらく、正しくそして迅速な会合、フォールディングおよびＣＨＯ細胞からの輸送が補助される。生成される抗体の機能試験によって、この系を用いて産生された抗体が、元来の１Ｄ９ハイブリドーマに産生されるものと類似の方式で機能することが立証された。
本発明は、好ましい態様に言及して具体的に示され、そして記載されているが、付随する請求項に含まれる本発明の範囲から逸脱することなく、形式および詳細に多様な変化を行うことが可能であることが、当業者には理解されるであろう。
図１Ａ〜１Ｏは、ｍＡｂ １Ｄ９および８Ｇ２がＣＣＲ２トランスフェクタントを染色するが、ＣＣＲ５またはＣＣＲ１トランスフェクタントを染色しないことを例示する、蛍光活性化細胞スキャニング（ＦＡＣＳ）ヒストグラムプロフィールである。Ｌ１／２（本明細書において、Ｌ１．２とも称される）ネズミ・プレＢリンパ腫宿主細胞を、示したようにＣＣＲ２、ＣＣＲ５およびＣＣＲ１でトランスフェクションし、そして異なる受容体特異性を持つ抗体で染色した。フローサイトメトリーによって染色を解析した。 図１Ａ〜１Ｏは、ｍＡｂ １Ｄ９および８Ｇ２がＣＣＲ２トランスフェクタントを染色するが、ＣＣＲ５またはＣＣＲ１トランスフェクタントを染色しないことを例示する、蛍光活性化細胞スキャニング（ＦＡＣＳ）ヒストグラムプロフィールである。Ｌ１／２（本明細書において、Ｌ１．２とも称される）ネズミ・プレＢリンパ腫宿主細胞を、示したようにＣＣＲ２、ＣＣＲ５およびＣＣＲ１でトランスフェクションし、そして異なる受容体特異性を持つ抗体で染色した。フローサイトメトリーによって染色を解析した。 図１Ａ〜１Ｏは、ｍＡｂ １Ｄ９および８Ｇ２がＣＣＲ２トランスフェクタントを染色するが、ＣＣＲ５またはＣＣＲ１トランスフェクタントを染色しないことを例示する、蛍光活性化細胞スキャニング（ＦＡＣＳ）ヒストグラムプロフィールである。Ｌ１／２（本明細書において、Ｌ１．２とも称される）ネズミ・プレＢリンパ腫宿主細胞を、示したようにＣＣＲ２、ＣＣＲ５およびＣＣＲ１でトランスフェクションし、そして異なる受容体特異性を持つ抗体で染色した。フローサイトメトリーによって染色を解析した。 図１Ａ〜１Ｏは、ｍＡｂ １Ｄ９および８Ｇ２がＣＣＲ２トランスフェクタントを染色するが、ＣＣＲ５またはＣＣＲ１トランスフェクタントを染色しないことを例示する、蛍光活性化細胞スキャニング（ＦＡＣＳ）ヒストグラムプロフィールである。Ｌ１／２（本明細書において、Ｌ１．２とも称される）ネズミ・プレＢリンパ腫宿主細胞を、示したようにＣＣＲ２、ＣＣＲ５およびＣＣＲ１でトランスフェクションし、そして異なる受容体特異性を持つ抗体で染色した。フローサイトメトリーによって染色を解析した。 図１Ａ〜１Ｏは、ｍＡｂ １Ｄ９および８Ｇ２がＣＣＲ２トランスフェクタントを染色するが、ＣＣＲ５またはＣＣＲ１トランスフェクタントを染色しないことを例示する、蛍光活性化細胞スキャニング（ＦＡＣＳ）ヒストグラムプロフィールである。Ｌ１／２（本明細書において、Ｌ１．２とも称される）ネズミ・プレＢリンパ腫宿主細胞を、示したようにＣＣＲ２、ＣＣＲ５およびＣＣＲ１でトランスフェクションし、そして異なる受容体特異性を持つ抗体で染色した。フローサイトメトリーによって染色を解析した。 図１Ａ〜１Ｏは、ｍＡｂ １Ｄ９および８Ｇ２がＣＣＲ２トランスフェクタントを染色するが、ＣＣＲ５またはＣＣＲ１トランスフェクタントを染色しないことを例示する、蛍光活性化細胞スキャニング（ＦＡＣＳ）ヒストグラムプロフィールである。Ｌ１／２（本明細書において、Ｌ１．２とも称される）ネズミ・プレＢリンパ腫宿主細胞を、示したようにＣＣＲ２、ＣＣＲ５およびＣＣＲ１でトランスフェクションし、そして異なる受容体特異性を持つ抗体で染色した。フローサイトメトリーによって染色を解析した。 図１Ａ〜１Ｏは、ｍＡｂ １Ｄ９および８Ｇ２がＣＣＲ２トランスフェクタントを染色するが、ＣＣＲ５またはＣＣＲ１トランスフェクタントを染色しないことを例示する、蛍光活性化細胞スキャニング（ＦＡＣＳ）ヒストグラムプロフィールである。Ｌ１／２（本明細書において、Ｌ１．２とも称される）ネズミ・プレＢリンパ腫宿主細胞を、示したようにＣＣＲ２、ＣＣＲ５およびＣＣＲ１でトランスフェクションし、そして異なる受容体特異性を持つ抗体で染色した。フローサイトメトリーによって染色を解析した。 図１Ａ〜１Ｏは、ｍＡｂ １Ｄ９および８Ｇ２がＣＣＲ２トランスフェクタントを染色するが、ＣＣＲ５またはＣＣＲ１トランスフェクタントを染色しないことを例示する、蛍光活性化細胞スキャニング（ＦＡＣＳ）ヒストグラムプロフィールである。Ｌ１／２（本明細書において、Ｌ１．２とも称される）ネズミ・プレＢリンパ腫宿主細胞を、示したようにＣＣＲ２、ＣＣＲ５およびＣＣＲ１でトランスフェクションし、そして異なる受容体特異性を持つ抗体で染色した。フローサイトメトリーによって染色を解析した。 図１Ａ〜１Ｏは、ｍＡｂ １Ｄ９および８Ｇ２がＣＣＲ２トランスフェクタントを染色するが、ＣＣＲ５またはＣＣＲ１トランスフェクタントを染色しないことを例示する、蛍光活性化細胞スキャニング（ＦＡＣＳ）ヒストグラムプロフィールである。Ｌ１／２（本明細書において、Ｌ１．２とも称される）ネズミ・プレＢリンパ腫宿主細胞を、示したようにＣＣＲ２、ＣＣＲ５およびＣＣＲ１でトランスフェクションし、そして異なる受容体特異性を持つ抗体で染色した。フローサイトメトリーによって染色を解析した。 図１Ａ〜１Ｏは、ｍＡｂ １Ｄ９および８Ｇ２がＣＣＲ２トランスフェクタントを染色するが、ＣＣＲ５またはＣＣＲ１トランスフェクタントを染色しないことを例示する、蛍光活性化細胞スキャニング（ＦＡＣＳ）ヒストグラムプロフィールである。Ｌ１／２（本明細書において、Ｌ１．２とも称される）ネズミ・プレＢリンパ腫宿主細胞を、示したようにＣＣＲ２、ＣＣＲ５およびＣＣＲ１でトランスフェクションし、そして異なる受容体特異性を持つ抗体で染色した。フローサイトメトリーによって染色を解析した。 図１Ａ〜１Ｏは、ｍＡｂ １Ｄ９および８Ｇ２がＣＣＲ２トランスフェクタントを染色するが、ＣＣＲ５またはＣＣＲ１トランスフェクタントを染色しないことを例示する、蛍光活性化細胞スキャニング（ＦＡＣＳ）ヒストグラムプロフィールである。Ｌ１／２（本明細書において、Ｌ１．２とも称される）ネズミ・プレＢリンパ腫宿主細胞を、示したようにＣＣＲ２、ＣＣＲ５およびＣＣＲ１でトランスフェクションし、そして異なる受容体特異性を持つ抗体で染色した。フローサイトメトリーによって染色を解析した。 図１Ａ〜１Ｏは、ｍＡｂ １Ｄ９および８Ｇ２がＣＣＲ２トランスフェクタントを染色するが、ＣＣＲ５またはＣＣＲ１トランスフェクタントを染色しないことを例示する、蛍光活性化細胞スキャニング（ＦＡＣＳ）ヒストグラムプロフィールである。Ｌ１／２（本明細書において、Ｌ１．２とも称される）ネズミ・プレＢリンパ腫宿主細胞を、示したようにＣＣＲ２、ＣＣＲ５およびＣＣＲ１でトランスフェクションし、そして異なる受容体特異性を持つ抗体で染色した。フローサイトメトリーによって染色を解析した。 図１Ａ〜１Ｏは、ｍＡｂ １Ｄ９および８Ｇ２がＣＣＲ２トランスフェクタントを染色するが、ＣＣＲ５またはＣＣＲ１トランスフェクタントを染色しないことを例示する、蛍光活性化細胞スキャニング（ＦＡＣＳ）ヒストグラムプロフィールである。Ｌ１／２（本明細書において、Ｌ１．２とも称される）ネズミ・プレＢリンパ腫宿主細胞を、示したようにＣＣＲ２、ＣＣＲ５およびＣＣＲ１でトランスフェクションし、そして異なる受容体特異性を持つ抗体で染色した。フローサイトメトリーによって染色を解析した。 図１Ａ〜１Ｏは、ｍＡｂ １Ｄ９および８Ｇ２がＣＣＲ２トランスフェクタントを染色するが、ＣＣＲ５またはＣＣＲ１トランスフェクタントを染色しないことを例示する、蛍光活性化細胞スキャニング（ＦＡＣＳ）ヒストグラムプロフィールである。Ｌ１／２（本明細書において、Ｌ１．２とも称される）ネズミ・プレＢリンパ腫宿主細胞を、示したようにＣＣＲ２、ＣＣＲ５およびＣＣＲ１でトランスフェクションし、そして異なる受容体特異性を持つ抗体で染色した。フローサイトメトリーによって染色を解析した。 図１Ａ〜１Ｏは、ｍＡｂ １Ｄ９および８Ｇ２がＣＣＲ２トランスフェクタントを染色するが、ＣＣＲ５またはＣＣＲ１トランスフェクタントを染色しないことを例示する、蛍光活性化細胞スキャニング（ＦＡＣＳ）ヒストグラムプロフィールである。Ｌ１／２（本明細書において、Ｌ１．２とも称される）ネズミ・プレＢリンパ腫宿主細胞を、示したようにＣＣＲ２、ＣＣＲ５およびＣＣＲ１でトランスフェクションし、そして異なる受容体特異性を持つ抗体で染色した。フローサイトメトリーによって染色を解析した。 図２Ａ〜２Ｌは、大部分の単球、リンパ球の亜集団、および顆粒球の小サブセット上のＣＣＲ２発現を示すＦＡＣＳドットプロットである。３つの抗ＣＣＲ２ ｍＡｂ（ＣＣＲ２アミノ末端の最初の３２アミノ酸からなるペプチドを免疫原として用いて生成した、５Ａ１１、並びに、ＣＣＲ２ｂ Ｌ１／２細胞トランスフェクタントを免疫原として用いて、本明細書に記載するように生成した１Ｄ９および８Ｇ２）の１つで、全血細胞を染色した。フローサイトメトリーによって染色を解析し、そして前方光散乱および側方光散乱を用いて、リンパ球、顆粒球、および単球集団をゲート設定した。Ｘ軸は、前方光散乱（細胞サイズの測定値）に相当し、そしてＹ軸は、ＣＣＲ２に関する染色の蛍光強度に相当する。陰性対照染色のレベルを線で示す。 図２Ａ〜２Ｌは、大部分の単球、リンパ球の亜集団、および顆粒球の小サブセット上のＣＣＲ２発現を示すＦＡＣＳドットプロットである。３つの抗ＣＣＲ２ ｍＡｂ（ＣＣＲ２アミノ末端の最初の３２アミノ酸からなるペプチドを免疫原として用いて生成した、５Ａ１１、並びに、ＣＣＲ２ｂ Ｌ１／２細胞トランスフェクタントを免疫原として用いて、本明細書に記載するように生成した１Ｄ９および８Ｇ２）の１つで、全血細胞を染色した。フローサイトメトリーによって染色を解析し、そして前方光散乱および側方光散乱を用いて、リンパ球、顆粒球、および単球集団をゲート設定した。Ｘ軸は、前方光散乱（細胞サイズの測定値）に相当し、そしてＹ軸は、ＣＣＲ２に関する染色の蛍光強度に相当する。陰性対照染色のレベルを線で示す。 図２Ａ〜２Ｌは、大部分の単球、リンパ球の亜集団、および顆粒球の小サブセット上のＣＣＲ２発現を示すＦＡＣＳドットプロットである。３つの抗ＣＣＲ２ ｍＡｂ（ＣＣＲ２アミノ末端の最初の３２アミノ酸からなるペプチドを免疫原として用いて生成した、５Ａ１１、並びに、ＣＣＲ２ｂ Ｌ１／２細胞トランスフェクタントを免疫原として用いて、本明細書に記載するように生成した１Ｄ９および８Ｇ２）の１つで、全血細胞を染色した。フローサイトメトリーによって染色を解析し、そして前方光散乱および側方光散乱を用いて、リンパ球、顆粒球、および単球集団をゲート設定した。Ｘ軸は、前方光散乱（細胞サイズの測定値）に相当し、そしてＹ軸は、ＣＣＲ２に関する染色の蛍光強度に相当する。陰性対照染色のレベルを線で示す。 図２Ａ〜２Ｌは、大部分の単球、リンパ球の亜集団、および顆粒球の小サブセット上のＣＣＲ２発現を示すＦＡＣＳドットプロットである。３つの抗ＣＣＲ２ ｍＡｂ（ＣＣＲ２アミノ末端の最初の３２アミノ酸からなるペプチドを免疫原として用いて生成した、５Ａ１１、並びに、ＣＣＲ２ｂ Ｌ１／２細胞トランスフェクタントを免疫原として用いて、本明細書に記載するように生成した１Ｄ９および８Ｇ２）の１つで、全血細胞を染色した。フローサイトメトリーによって染色を解析し、そして前方光散乱および側方光散乱を用いて、リンパ球、顆粒球、および単球集団をゲート設定した。Ｘ軸は、前方光散乱（細胞サイズの測定値）に相当し、そしてＹ軸は、ＣＣＲ２に関する染色の蛍光強度に相当する。陰性対照染色のレベルを線で示す。 図２Ａ〜２Ｌは、大部分の単球、リンパ球の亜集団、および顆粒球の小サブセット上のＣＣＲ２発現を示すＦＡＣＳドットプロットである。３つの抗ＣＣＲ２ ｍＡｂ（ＣＣＲ２アミノ末端の最初の３２アミノ酸からなるペプチドを免疫原として用いて生成した、５Ａ１１、並びに、ＣＣＲ２ｂ Ｌ１／２細胞トランスフェクタントを免疫原として用いて、本明細書に記載するように生成した１Ｄ９および８Ｇ２）の１つで、全血細胞を染色した。フローサイトメトリーによって染色を解析し、そして前方光散乱および側方光散乱を用いて、リンパ球、顆粒球、および単球集団をゲート設定した。Ｘ軸は、前方光散乱（細胞サイズの測定値）に相当し、そしてＹ軸は、ＣＣＲ２に関する染色の蛍光強度に相当する。陰性対照染色のレベルを線で示す。 図２Ａ〜２Ｌは、大部分の単球、リンパ球の亜集団、および顆粒球の小サブセット上のＣＣＲ２発現を示すＦＡＣＳドットプロットである。３つの抗ＣＣＲ２ ｍＡｂ（ＣＣＲ２アミノ末端の最初の３２アミノ酸からなるペプチドを免疫原として用いて生成した、５Ａ１１、並びに、ＣＣＲ２ｂ Ｌ１／２細胞トランスフェクタントを免疫原として用いて、本明細書に記載するように生成した１Ｄ９および８Ｇ２）の１つで、全血細胞を染色した。フローサイトメトリーによって染色を解析し、そして前方光散乱および側方光散乱を用いて、リンパ球、顆粒球、および単球集団をゲート設定した。Ｘ軸は、前方光散乱（細胞サイズの測定値）に相当し、そしてＹ軸は、ＣＣＲ２に関する染色の蛍光強度に相当する。陰性対照染色のレベルを線で示す。 図２Ａ〜２Ｌは、大部分の単球、リンパ球の亜集団、および顆粒球の小サブセット上のＣＣＲ２発現を示すＦＡＣＳドットプロットである。３つの抗ＣＣＲ２ ｍＡｂ（ＣＣＲ２アミノ末端の最初の３２アミノ酸からなるペプチドを免疫原として用いて生成した、５Ａ１１、並びに、ＣＣＲ２ｂ Ｌ１／２細胞トランスフェクタントを免疫原として用いて、本明細書に記載するように生成した１Ｄ９および８Ｇ２）の１つで、全血細胞を染色した。フローサイトメトリーによって染色を解析し、そして前方光散乱および側方光散乱を用いて、リンパ球、顆粒球、および単球集団をゲート設定した。Ｘ軸は、前方光散乱（細胞サイズの測定値）に相当し、そしてＹ軸は、ＣＣＲ２に関する染色の蛍光強度に相当する。陰性対照染色のレベルを線で示す。 図２Ａ〜２Ｌは、大部分の単球、リンパ球の亜集団、および顆粒球の小サブセット上のＣＣＲ２発現を示すＦＡＣＳドットプロットである。３つの抗ＣＣＲ２ ｍＡｂ（ＣＣＲ２アミノ末端の最初の３２アミノ酸からなるペプチドを免疫原として用いて生成した、５Ａ１１、並びに、ＣＣＲ２ｂ Ｌ１／２細胞トランスフェクタントを免疫原として用いて、本明細書に記載するように生成した１Ｄ９および８Ｇ２）の１つで、全血細胞を染色した。フローサイトメトリーによって染色を解析し、そして前方光散乱および側方光散乱を用いて、リンパ球、顆粒球、および単球集団をゲート設定した。Ｘ軸は、前方光散乱（細胞サイズの測定値）に相当し、そしてＹ軸は、ＣＣＲ２に関する染色の蛍光強度に相当する。陰性対照染色のレベルを線で示す。 図２Ａ〜２Ｌは、大部分の単球、リンパ球の亜集団、および顆粒球の小サブセット上のＣＣＲ２発現を示すＦＡＣＳドットプロットである。３つの抗ＣＣＲ２ ｍＡｂ（ＣＣＲ２アミノ末端の最初の３２アミノ酸からなるペプチドを免疫原として用いて生成した、５Ａ１１、並びに、ＣＣＲ２ｂ Ｌ１／２細胞トランスフェクタントを免疫原として用いて、本明細書に記載するように生成した１Ｄ９および８Ｇ２）の１つで、全血細胞を染色した。フローサイトメトリーによって染色を解析し、そして前方光散乱および側方光散乱を用いて、リンパ球、顆粒球、および単球集団をゲート設定した。Ｘ軸は、前方光散乱（細胞サイズの測定値）に相当し、そしてＹ軸は、ＣＣＲ２に関する染色の蛍光強度に相当する。陰性対照染色のレベルを線で示す。 図２Ａ〜２Ｌは、大部分の単球、リンパ球の亜集団、および顆粒球の小サブセット上のＣＣＲ２発現を示すＦＡＣＳドットプロットである。３つの抗ＣＣＲ２ ｍＡｂ（ＣＣＲ２アミノ末端の最初の３２アミノ酸からなるペプチドを免疫原として用いて生成した、５Ａ１１、並びに、ＣＣＲ２ｂ Ｌ１／２細胞トランスフェクタントを免疫原として用いて、本明細書に記載するように生成した１Ｄ９および８Ｇ２）の１つで、全血細胞を染色した。フローサイトメトリーによって染色を解析し、そして前方光散乱および側方光散乱を用いて、リンパ球、顆粒球、および単球集団をゲート設定した。Ｘ軸は、前方光散乱（細胞サイズの測定値）に相当し、そしてＹ軸は、ＣＣＲ２に関する染色の蛍光強度に相当する。陰性対照染色のレベルを線で示す。 図２Ａ〜２Ｌは、大部分の単球、リンパ球の亜集団、および顆粒球の小サブセット上のＣＣＲ２発現を示すＦＡＣＳドットプロットである。３つの抗ＣＣＲ２ ｍＡｂ（ＣＣＲ２アミノ末端の最初の３２アミノ酸からなるペプチドを免疫原として用いて生成した、５Ａ１１、並びに、ＣＣＲ２ｂ Ｌ１／２細胞トランスフェクタントを免疫原として用いて、本明細書に記載するように生成した１Ｄ９および８Ｇ２）の１つで、全血細胞を染色した。フローサイトメトリーによって染色を解析し、そして前方光散乱および側方光散乱を用いて、リンパ球、顆粒球、および単球集団をゲート設定した。Ｘ軸は、前方光散乱（細胞サイズの測定値）に相当し、そしてＹ軸は、ＣＣＲ２に関する染色の蛍光強度に相当する。陰性対照染色のレベルを線で示す。 図２Ａ〜２Ｌは、大部分の単球、リンパ球の亜集団、および顆粒球の小サブセット上のＣＣＲ２発現を示すＦＡＣＳドットプロットである。３つの抗ＣＣＲ２ ｍＡｂ（ＣＣＲ２アミノ末端の最初の３２アミノ酸からなるペプチドを免疫原として用いて生成した、５Ａ１１、並びに、ＣＣＲ２ｂ Ｌ１／２細胞トランスフェクタントを免疫原として用いて、本明細書に記載するように生成した１Ｄ９および８Ｇ２）の１つで、全血細胞を染色した。フローサイトメトリーによって染色を解析し、そして前方光散乱および側方光散乱を用いて、リンパ球、顆粒球、および単球集団をゲート設定した。Ｘ軸は、前方光散乱（細胞サイズの測定値）に相当し、そしてＹ軸は、ＣＣＲ２に関する染色の蛍光強度に相当する。陰性対照染色のレベルを線で示す。 図３Ａ〜３Ｉは、ＩｇＥおよびＣＣＲ２に関する２色染色を用いて、ｍＡｂ１Ｄ９が、末梢血（好塩基球）におけるＩｇＥ陽性集団を染色することを示す、ＦＡＣＳドットプロットである。全血細胞をまず、示すように、陰性対照抗体（抗Ｆｌａｇ）、抗ＣＣＲ２抗体１Ｄ９、または抗ＣＸＣＲ１抗体いずれかで染色し、そして抗マウスＦＩＴＣコンジュゲートによって検出した。示すように、ＰＢＳ、あるいはＩｇＥまたはＣＤ１６に特異的なビオチン化抗体いずれかを用いて、第二の染色を行い、そしてストレプトアビジン−フィコエリトリンで検出した。フローサイトメトリーによって染色を解析した。 図３Ａ〜３Ｉは、ＩｇＥおよびＣＣＲ２に関する２色染色を用いて、ｍＡｂ１Ｄ９が、末梢血（好塩基球）におけるＩｇＥ陽性集団を染色することを示す、ＦＡＣＳドットプロットである。全血細胞をまず、示すように、陰性対照抗体（抗Ｆｌａｇ）、抗ＣＣＲ２抗体１Ｄ９、または抗ＣＸＣＲ１抗体いずれかで染色し、そして抗マウスＦＩＴＣコンジュゲートによって検出した。示すように、ＰＢＳ、あるいはＩｇＥまたはＣＤ１６に特異的なビオチン化抗体いずれかを用いて、第二の染色を行い、そしてストレプトアビジン−フィコエリトリンで検出した。フローサイトメトリーによって染色を解析した。 図３Ａ〜３Ｉは、ＩｇＥおよびＣＣＲ２に関する２色染色を用いて、ｍＡｂ１Ｄ９が、末梢血（好塩基球）におけるＩｇＥ陽性集団を染色することを示す、ＦＡＣＳドットプロットである。全血細胞をまず、示すように、陰性対照抗体（抗Ｆｌａｇ）、抗ＣＣＲ２抗体１Ｄ９、または抗ＣＸＣＲ１抗体いずれかで染色し、そして抗マウスＦＩＴＣコンジュゲートによって検出した。示すように、ＰＢＳ、あるいはＩｇＥまたはＣＤ１６に特異的なビオチン化抗体いずれかを用いて、第二の染色を行い、そしてストレプトアビジン−フィコエリトリンで検出した。フローサイトメトリーによって染色を解析した。 図３Ａ〜３Ｉは、ＩｇＥおよびＣＣＲ２に関する２色染色を用いて、ｍＡｂ１Ｄ９が、末梢血（好塩基球）におけるＩｇＥ陽性集団を染色することを示す、ＦＡＣＳドットプロットである。全血細胞をまず、示すように、陰性対照抗体（抗Ｆｌａｇ）、抗ＣＣＲ２抗体１Ｄ９、または抗ＣＸＣＲ１抗体いずれかで染色し、そして抗マウスＦＩＴＣコンジュゲートによって検出した。示すように、ＰＢＳ、あるいはＩｇＥまたはＣＤ１６に特異的なビオチン化抗体いずれかを用いて、第二の染色を行い、そしてストレプトアビジン−フィコエリトリンで検出した。フローサイトメトリーによって染色を解析した。 図３Ａ〜３Ｉは、ＩｇＥおよびＣＣＲ２に関する２色染色を用いて、ｍＡｂ１Ｄ９が、末梢血（好塩基球）におけるＩｇＥ陽性集団を染色することを示す、ＦＡＣＳドットプロットである。全血細胞をまず、示すように、陰性対照抗体（抗Ｆｌａｇ）、抗ＣＣＲ２抗体１Ｄ９、または抗ＣＸＣＲ１抗体いずれかで染色し、そして抗マウスＦＩＴＣコンジュゲートによって検出した。示すように、ＰＢＳ、あるいはＩｇＥまたはＣＤ１６に特異的なビオチン化抗体いずれかを用いて、第二の染色を行い、そしてストレプトアビジン−フィコエリトリンで検出した。フローサイトメトリーによって染色を解析した。 図３Ａ〜３Ｉは、ＩｇＥおよびＣＣＲ２に関する２色染色を用いて、ｍＡｂ１Ｄ９が、末梢血（好塩基球）におけるＩｇＥ陽性集団を染色することを示す、ＦＡＣＳドットプロットである。全血細胞をまず、示すように、陰性対照抗体（抗Ｆｌａｇ）、抗ＣＣＲ２抗体１Ｄ９、または抗ＣＸＣＲ１抗体いずれかで染色し、そして抗マウスＦＩＴＣコンジュゲートによって検出した。示すように、ＰＢＳ、あるいはＩｇＥまたはＣＤ１６に特異的なビオチン化抗体いずれかを用いて、第二の染色を行い、そしてストレプトアビジン−フィコエリトリンで検出した。フローサイトメトリーによって染色を解析した。 図３Ａ〜３Ｉは、ＩｇＥおよびＣＣＲ２に関する２色染色を用いて、ｍＡｂ１Ｄ９が、末梢血（好塩基球）におけるＩｇＥ陽性集団を染色することを示す、ＦＡＣＳドットプロットである。全血細胞をまず、示すように、陰性対照抗体（抗Ｆｌａｇ）、抗ＣＣＲ２抗体１Ｄ９、または抗ＣＸＣＲ１抗体いずれかで染色し、そして抗マウスＦＩＴＣコンジュゲートによって検出した。示すように、ＰＢＳ、あるいはＩｇＥまたはＣＤ１６に特異的なビオチン化抗体いずれかを用いて、第二の染色を行い、そしてストレプトアビジン−フィコエリトリンで検出した。フローサイトメトリーによって染色を解析した。 図３Ａ〜３Ｉは、ＩｇＥおよびＣＣＲ２に関する２色染色を用いて、ｍＡｂ１Ｄ９が、末梢血（好塩基球）におけるＩｇＥ陽性集団を染色することを示す、ＦＡＣＳドットプロットである。全血細胞をまず、示すように、陰性対照抗体（抗Ｆｌａｇ）、抗ＣＣＲ２抗体１Ｄ９、または抗ＣＸＣＲ１抗体いずれかで染色し、そして抗マウスＦＩＴＣコンジュゲートによって検出した。示すように、ＰＢＳ、あるいはＩｇＥまたはＣＤ１６に特異的なビオチン化抗体いずれかを用いて、第二の染色を行い、そしてストレプトアビジン−フィコエリトリンで検出した。フローサイトメトリーによって染色を解析した。 図３Ａ〜３Ｉは、ＩｇＥおよびＣＣＲ２に関する２色染色を用いて、ｍＡｂ１Ｄ９が、末梢血（好塩基球）におけるＩｇＥ陽性集団を染色することを示す、ＦＡＣＳドットプロットである。全血細胞をまず、示すように、陰性対照抗体（抗Ｆｌａｇ）、抗ＣＣＲ２抗体１Ｄ９、または抗ＣＸＣＲ１抗体いずれかで染色し、そして抗マウスＦＩＴＣコンジュゲートによって検出した。示すように、ＰＢＳ、あるいはＩｇＥまたはＣＤ１６に特異的なビオチン化抗体いずれかを用いて、第二の染色を行い、そしてストレプトアビジン−フィコエリトリンで検出した。フローサイトメトリーによって染色を解析した。 図４は、ｍＡｂ １Ｄ９が、ＴＨＰ−１細胞膜への［１２５Ｉ］ＭＣＰ−１結合を阻害することを例示する。３．０μｇのＴＨＰ−１膜タンパク質を、多様な濃度の１Ｄ９またはアイソタイプマッチ抗ＣＸＣＲ３抗体１Ｃ６の存在下で、０．１ｎＭ［１２５Ｉ］ＭＣＰ−１とインキュベーションした。ろ過によって、結合したものから未結合のものを分離し、そしてシンチレーション計測することにより、結合したトレーサーの量を決定した。データを解析して、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈソフトウェアとともに４パラメータ・ロジスティック方程式を用いた非線形回帰によって、ＩＣ５０値を決定した。 図５は、ｍＡｂ １Ｄ９が、新鮮なヒトＰＢＭＣへの［１２５Ｉ］ＭＣＰ−１結合を阻害することを例示する。新鮮な単離末梢血単核細胞（５００，０００）を、多様な濃度の１Ｄ９またはアイソタイプマッチ抗ＣＸＣＲ３抗体１Ｃ６の存在下で、０．１ｎＭ［１２５Ｉ］ＭＣＰ−１とインキュベーションした。ろ過によって、結合したものから未結合のものを分離し、そしてシンチレーション計測することにより、結合したトレーサーの量を決定した。データを解析して、図４のように、ＩＣ５０値を決定した。 図６Ａおよび６Ｂは、ｍＡｂ １Ｄ９が、ＭＣＰ−１が誘導する新鮮ＰＢＭＣの走化性を阻害するが、ＲＡＮＴＥＳが誘導する走化性を阻害しないことを示すグラフである。図６Ａは、抗体を伴わず、あるいは０．１または１０μｇ／ｍｌの１Ｄ９または非特異的ネズミＩｇＧ２ａを伴った場合の、１０ｎＭ ＭＣＰ−１に対するＰＢＭＣの走化性アッセイの結果を示す。自発的な非特異的遊走もまた示す。図６Ｂは、抗体を伴わないか、１０μｇ／ｍｌの１Ｄ９または１０μｇ／ｍｌの非特異的ネズミＩｇＧ２ａを伴った場合の、１０ｎＭ ＲＡＮＴＥＳに対するＰＢＭＣの走化性アッセイの結果を示す。ＲＡＮＴＥＳの非存在下での自発的な非特異的遊走もまた示す。 図７は、ネズミ１Ｄ９抗体のカッパ軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号９）を示す。ＣＤＲを太字で強調する。 図８は、ネズミ１Ｄ９抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。ＣＤＲを太字で強調する。 図９は、ネズミ１Ｄ９ ＶＫ領域のＣＤＲの規範的クラスを例示する。「Ｃｈｏｔｈｉａ規範的クラス」は、Ｃｈｏｔｈｉａおよびその同僚に定義されるような規範的クラス（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９７：９０１（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａら， Ｎａｔｕｒｅ ３４：８７７（１９８９）；Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：１７５（１９９０）；およびＣｈｏｔｈｉａら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２７：７９９（１９９２））を用いたことを示し、一方、「Ｍａｒｔｉｎ規範的クラス」は、ＭａｒｔｉｎおよびＴｈｏｒｎｔｏｎに定義される規範的クラス（ＭａｒｔｉｎおよびＴｈｏｒｎｔｏｎ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６３：８００（１９９６））を用いたことを示す。ＦＲ残基を太字で強調する。 図１０は、ネズミ１Ｄ９ ＶＨ領域のＣＤＲの規範的クラスを例示する。「Ｃｈｏｔｈｉａ規範的クラス」は、Ｃｈｏｔｈｉａおよびその同僚に定義されるような規範的クラス（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９７：９０１（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａら， Ｎａｔｕｒｅ ３４：８７７（１９８９）；Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：１７５（１９９０）；およびＣｈｏｔｈｉａら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２７：７９９（１９９２））を用いたことを示し、一方、「Ｍａｒｔｉｎ規範的クラス」は、ＭａｒｔｉｎおよびＴｈｏｒｎｔｏｎに定義される規範的クラス（ＭａｒｔｉｎおよびＴｈｏｒｎｔｏｎ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６３：８００（１９９６））を用いたことを示す。ＦＲ残基を太字で強調する。 図１１は、ヒト化１Ｄ９ ＶＫ領域の多様な型のアミノ酸配列を示す（それぞれ、配列番号１２〜１５および１０７）。１Ｄ９ ＶＫ領域残基（配列番号９）およびヒトＨＦ−２１／２８ ＶＫ領域（配列番号１１）配列がマッチする箇所を点［．］で示す。特定の残基位にアミノ酸が存在しない箇所をダッシュ［−］で示す。ＨＦ−２１／２８ ＦＲ中のアミノ酸が、ヒト化１Ｄ９ ＶＫ領域で変化している箇所を、太字で強調する。ＣＤＲを術語［＝＝Ｌ１＝＝］の使用によって示す。用いた番号付けは、Ｋａｂａｔら， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版， 米国保健社会福祉省， 米国政府印刷局（１９９１）にしたがっている。 図１２は、ヒト化１Ｄ９ ＶＨ領域の多様な型のアミノ酸配列を示す（それぞれ、配列番号１７〜２０）。１Ｄ９ ＶＨ領域残基（配列番号１０）およびヒト４Ｂ４’ＣＬ ＶＨ領域配列（配列番号１６）がマッチする箇所を点［．］で示す。特定の残基位にアミノ酸が存在しない箇所をダッシュ［−］で示す。４Ｂ４’ＣＬ中のアミノ酸が、ヒト化１Ｄ９ ＶＨ領域で変化している箇所を、太字で強調する。ＣＤＲを術語［＝＝Ｈ１＝＝］の使用によって示し、一方、［−−−−−］はＨ１構造ループの部分を示す。用いた番号付けは、Ｋａｂａｔら， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版， 米国保健社会福祉省， 米国政府印刷局（１９９１）にしたがっている。 図１３は、ネズミ１Ｄ９ ＶＫ領域の一部（配列番号２１）と、マウス生殖系列ＶＫ遺伝子配列（それぞれ配列番号２２〜３３）の比較を示す。「同一残基」は、ネズミ１Ｄ９ ＶＫ領域に対する、マウス生殖系列ＶＫ領域中の同一残基の数に相当する。１Ｄ９ ＶＫ領域配列およびマウス生殖系列ＶＫ領域配列がマッチする箇所を点［．］で示す。特定の残基位にアミノ酸が存在しない箇所をダッシュ［−］で示す。 図１４は、ネズミ１Ｄ９ ＶＨ領域の一部（配列番号３４）と、マウス生殖系列ＶＨ遺伝子配列（それぞれ配列番号３５〜５３）の比較を示す。「同一残基」は、ネズミ１Ｄ９ ＶＨ領域に対する、マウス生殖系列ＶＨ領域中の同一残基の数に相当する。１Ｄ９ ＶＨ領域配列およびマウス生殖系列ＶＨ領域配列がマッチする箇所を点［．］で示す。特定の残基位にアミノ酸が存在しない箇所をダッシュ［−］で示す。 図１５は、ネズミ１Ｄ９ ＶＫ領域（配列番号９）と、最も相同な１７のヒトＶＫアミノ酸配列（それぞれ配列番号５４〜７０）の比較を示す。「ＩＤ」は、ネズミ１Ｄ９ ＶＫ領域に対するヒトＶＫ配列の同一性パーセントに相当する。１Ｄ９ ＶＫ領域残基およびヒトＶＫ領域配列がマッチする箇所を点［．］で示す。特定の残基位にアミノ酸が存在しない箇所をダッシュ［−］で示す。「Ｓ」はＦＶドメインの表面上のアミノ酸位を示す。「Ｃ」は、ＦＶドメインのコア内に位置する残基を示す。ＣＤＲから５Å以内の残基を、大文字を用いて明示し、一方、さらに遠くに位置する残基を小文字で示す。ＣＤＲ自体を、術語＝＝Ｌ１＝＝の使用によって示す。「ｖ」は、ＦＲ中に位置するＶｅｒｎｉｅｒ残基（ＦｏｏｔｅおよびＷｉｎｔｅｒ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２４：４８７（１９９２））を示す。ヒトＶＫ領域配列中の下線で示した残基は、最も近いヒトＶＫ生殖系列遺伝子と異なる。用いた番号付けは、Ｋａｂａｔら， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版， 米国保健社会福祉省， 米国政府印刷局（１９９１）にしたがっている。 図１６は、ネズミ１Ｄ９ ＶＫ領域と、最も相同な１７のヒトＶＫアミノ酸配列の比較を示す。「ＩＤ」は、ネズミ１Ｄ９ ＶＫ領域に対するヒトＶＫ配列の同一性パーセントを示す。「表面」は、表面上の同一残基の数を示す。「コア」は、ＦＶドメインのコア内にある同一残基の数を示す。「ＣＤＲ」は、ＣＤＲ内の同一残基の数を示す。「ＦＲ」はＦＲ内の同一残基の数を示す。「ＦＲ表面」は、表面暴露されている同一残基の数を示す。「ＦＲコア」は、ＦＶドメインのコア内に位置する同一残基の数を示す。「ＣＤＲ近傍ＦＲ」は、ＣＤＲから５Å以内のＦＲアミノ酸のうちの同一残基の数に相当する。「Ｖｅｒｎｉｅｒ」は、１４のＶｅｒｎｉｅｒアミノ酸（ＦｏｏｔｅおよびＷｉｎｔｅｒ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２４：４８７（１９９２））のうちの同一残基の数を示す。「ＶＫ」は、ＶＫ遺伝子内の同一残基の数を示す。「Ｊ鎖」は、Ｊ鎖遺伝子内の同一残基の数を示す。「Ｌ１長さ」〜「Ｌ３長さ」は、各ＣＤＲ内の残基の数を定義し、一方、「Ｌ１クラス」〜「Ｌ３クラス」は、ＭａｒｔｉｎおよびＴｈｏｒｎｔｏｎ（ＭａｒｔｉｎおよびＴｈｏｒｎｔｏｎ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６３：８００（１９９６））記載のＣＤＲの規範的クラスを記載する。 図１７Ａ〜１７Ｂは、ネズミ１Ｄ９ ＶＨ領域（配列番号１０）と、最も相同な２４のヒトＶＨアミノ酸配列（それぞれ配列番号７１〜９４）の比較を示す。「ＩＤ」は、ネズミ１Ｄ９ ＶＨ領域に対するヒトＶＨ配列の同一性パーセントに相当する。１Ｄ９ ＶＨ領域残基およびヒトＶＨ領域配列がマッチする箇所を点［．］で示す。特定の残基位にアミノ酸が存在しない箇所をダッシュ［−］で示す。「Ｓ」はＦＶドメインの表面上のアミノ酸位を示す。「Ｃ」は、ＦＶドメインのコア内に位置する残基を示す。ＣＤＲから５Å以内の残基を、大文字を用いて明示し、一方、さらに遠くに位置する残基を小文字で示す。ＣＤＲ自体を、術語＝＝Ｈ１＝＝の使用によって示す。「ｖ」は、ＦＲ中に位置するＶｅｒｎｉｅｒ残基（ＦｏｏｔｅおよびＷｉｎｔｅｒ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２４：４８７（１９９２））を示す。ヒトＶＨ領域配列中の下線で示した残基は、最も近いヒトＶＨ生殖系列遺伝子と異なる。用いた番号付けは、Ｋａｂａｔら， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版， 米国保健社会福祉省， 米国政府印刷局（１９９１）にしたがっている。 図１７Ａ〜１７Ｂは、ネズミ１Ｄ９ ＶＨ領域（配列番号１０）と、最も相同な２４のヒトＶＨアミノ酸配列（それぞれ配列番号７１〜９４）の比較を示す。「ＩＤ」は、ネズミ１Ｄ９ ＶＨ領域に対するヒトＶＨ配列の同一性パーセントに相当する。１Ｄ９ ＶＨ領域残基およびヒトＶＨ領域配列がマッチする箇所を点［．］で示す。特定の残基位にアミノ酸が存在しない箇所をダッシュ［−］で示す。「Ｓ」はＦＶドメインの表面上のアミノ酸位を示す。「Ｃ」は、ＦＶドメインのコア内に位置する残基を示す。ＣＤＲから５Å以内の残基を、大文字を用いて明示し、一方、さらに遠くに位置する残基を小文字で示す。ＣＤＲ自体を、術語＝＝Ｈ１＝＝の使用によって示す。「ｖ」は、ＦＲ中に位置するＶｅｒｎｉｅｒ残基（ＦｏｏｔｅおよびＷｉｎｔｅｒ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２４：４８７（１９９２））を示す。ヒトＶＨ領域配列中の下線で示した残基は、最も近いヒトＶＨ生殖系列遺伝子と異なる。用いた番号付けは、Ｋａｂａｔら， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版， 米国保健社会福祉省， 米国政府印刷局（１９９１）にしたがっている。 図１８Ａ〜１８Ｂは、ネズミ１Ｄ９ ＶＨ領域と、最も相同な２４のヒトＶＨアミノ酸配列の比較を示す。「ＩＤ」は、ネズミ１Ｄ９ ＶＨ領域に対するヒトＶＨ配列の同一性パーセントを示す。「全体」は、ネズミ１Ｄ９ ＶＨ領域の全体に比較した際の、ヒトＶＨ領域全体の同一残基の数を示す。「表面」は、表面上の同一残基の数を示す。「コア」は、ＦＶドメインのコア内にある同一残基の数を示す。「ＣＤＲ」は、ＣＤＲ内の同一残基の数を示す。「ＦＲ」はＦＲ内の同一残基の数を示す。「ＦＲ表面」は、表面暴露されている同一残基の数を示す。「ＦＲコア」は、ＦＶドメインのコア内に位置する同一残基の数を示す。「ＣＤＲ近傍ＦＲ」は、ＣＤＲから５Å以内のＦＲアミノ酸のうちの同一残基の数に相当する。「Ｖｅｒｎｉｅｒ」は、１４のＶｅｒｎｉｅｒアミノ酸（ＦｏｏｔｅおよびＷｉｎｔｅｒ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２４：４８７（１９９２））のうちの同一残基の数を示す。「ＶＨ」は、ＶＨ遺伝子内の同一残基の数を示す。「Ｊ鎖」は、Ｊ鎖遺伝子内の同一残基の数を示す。「Ｈ１サイズ」〜「Ｈ３サイズ」は、各ＣＤＲ内の残基の数を定義し、一方、「Ｈ１クラス」〜「Ｈ２クラス」は、ＭａｒｔｉｎおよびＴｈｏｒｎｔｏｎ（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６３：８００（１９９６））記載のＣＤＲの規範的クラスを記載する。 図１８Ａ〜１８Ｂは、ネズミ１Ｄ９ ＶＨ領域と、最も相同な２４のヒトＶＨアミノ酸配列の比較を示す。「ＩＤ」は、ネズミ１Ｄ９ ＶＨ領域に対するヒトＶＨ配列の同一性パーセントを示す。「全体」は、ネズミ１Ｄ９ ＶＨ領域の全体に比較した際の、ヒトＶＨ領域全体の同一残基の数を示す。「表面」は、表面上の同一残基の数を示す。「コア」は、ＦＶドメインのコア内にある同一残基の数を示す。「ＣＤＲ」は、ＣＤＲ内の同一残基の数を示す。「ＦＲ」はＦＲ内の同一残基の数を示す。「ＦＲ表面」は、表面暴露されている同一残基の数を示す。「ＦＲコア」は、ＦＶドメインのコア内に位置する同一残基の数を示す。「ＣＤＲ近傍ＦＲ」は、ＣＤＲから５Å以内のＦＲアミノ酸のうちの同一残基の数に相当する。「Ｖｅｒｎｉｅｒ」は、１４のＶｅｒｎｉｅｒアミノ酸（ＦｏｏｔｅおよびＷｉｎｔｅｒ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２４：４８７（１９９２））のうちの同一残基の数を示す。「ＶＨ」は、ＶＨ遺伝子内の同一残基の数を示す。「Ｊ鎖」は、Ｊ鎖遺伝子内の同一残基の数を示す。「Ｈ１サイズ」〜「Ｈ３サイズ」は、各ＣＤＲ内の残基の数を定義し、一方、「Ｈ１クラス」〜「Ｈ２クラス」は、ＭａｒｔｉｎおよびＴｈｏｒｎｔｏｎ（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６３：８００（１９９６））記載のＣＤＲの規範的クラスを記載する。 図１９Ａ〜１９Ｃは、１Ｄ９抗体カッパ軽鎖可変領域の第一のヒト化型（１Ｄ９ＲＫＡ）および第二のヒト化型（１Ｄ９ＲＫＢ）の設計につながるアミノ酸配列並列を示す。第７列において、特定の残基位でマウス１Ｄ９に同一であるアミノ酸は示しておらず；「−」は、この残基位に位置するアミノ酸がないことを示す。ボールド体は、ＦＲおよびＣＤＲ中で、ヒトアミノ酸残基が対応するマウス残基に置換された位を示す。「Δ」は、１Ｄ９ＲＫＡのヒトＦＲ中の変化の番号付けを示す。「マウス１Ｄ９ ＶＫ」は、ネズミ１Ｄ９カッパ軽鎖可変領域由来のＶＫ領域のアミノ酸配列を示す。「マウス６−ＩＩ」は、Ｋａｂａｔサブグループ６−ＩＩ由来のマウスＶＫ領域のコンセンサス配列を示す。「ヒト６−ＩＩ」は、Ｋａｂａｔサブグループ６−ＩＩ由来のヒトＶＫ領域のコンセンサス配列を示す。「ＨＦ−２１／２８」は、ヒトＨＦ−２１／２８抗体由来の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す（Ｃｈａｓｔａｇｎｅｒら， Ｇｅｎｅ １０１（２）：３０５−６（１９９１））。括弧内の数字（００５０５６）は、ＫａｂａｔデータベースＩＤ番号である。「表面またはコア」は、抗体可変領域の両鎖の残りの残基に対するアミノ酸の位置を示す。ＣＤＲから５Å以内の残基を大文字で示す。「１Ｄ９ＲＫＡ」は、ヒト化１Ｄ９ ＶＫ領域の第一の型のアミノ酸配列を示す。「１Ｄ９ＲＫＢ」は、ヒト化１Ｄ９ ＶＫ領域の第二の型のアミノ酸配列を示す。 図１９Ａ〜１９Ｃは、１Ｄ９抗体カッパ軽鎖可変領域の第一のヒト化型（１Ｄ９ＲＫＡ）および第二のヒト化型（１Ｄ９ＲＫＢ）の設計につながるアミノ酸配列並列を示す。第７列において、特定の残基位でマウス１Ｄ９に同一であるアミノ酸は示しておらず；「−」は、この残基位に位置するアミノ酸がないことを示す。ボールド体は、ＦＲおよびＣＤＲ中で、ヒトアミノ酸残基が対応するマウス残基に置換された位を示す。「Δ」は、１Ｄ９ＲＫＡのヒトＦＲ中の変化の番号付けを示す。「マウス１Ｄ９ ＶＫ」は、ネズミ１Ｄ９カッパ軽鎖可変領域由来のＶＫ領域のアミノ酸配列を示す。「マウス６−ＩＩ」は、Ｋａｂａｔサブグループ６−ＩＩ由来のマウスＶＫ領域のコンセンサス配列を示す。「ヒト６−ＩＩ」は、Ｋａｂａｔサブグループ６−ＩＩ由来のヒトＶＫ領域のコンセンサス配列を示す。「ＨＦ−２１／２８」は、ヒトＨＦ−２１／２８抗体由来の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す（Ｃｈａｓｔａｇｎｅｒら， Ｇｅｎｅ １０１（２）：３０５−６（１９９１））。括弧内の数字（００５０５６）は、ＫａｂａｔデータベースＩＤ番号である。「表面またはコア」は、抗体可変領域の両鎖の残りの残基に対するアミノ酸の位置を示す。ＣＤＲから５Å以内の残基を大文字で示す。「１Ｄ９ＲＫＡ」は、ヒト化１Ｄ９ ＶＫ領域の第一の型のアミノ酸配列を示す。「１Ｄ９ＲＫＢ」は、ヒト化１Ｄ９ ＶＫ領域の第二の型のアミノ酸配列を示す。 図１９Ａ〜１９Ｃは、１Ｄ９抗体カッパ軽鎖可変領域の第一のヒト化型（１Ｄ９ＲＫＡ）および第二のヒト化型（１Ｄ９ＲＫＢ）の設計につながるアミノ酸配列並列を示す。第７列において、特定の残基位でマウス１Ｄ９に同一であるアミノ酸は示しておらず；「−」は、この残基位に位置するアミノ酸がないことを示す。ボールド体は、ＦＲおよびＣＤＲ中で、ヒトアミノ酸残基が対応するマウス残基に置換された位を示す。「Δ」は、１Ｄ９ＲＫＡのヒトＦＲ中の変化の番号付けを示す。「マウス１Ｄ９ ＶＫ」は、ネズミ１Ｄ９カッパ軽鎖可変領域由来のＶＫ領域のアミノ酸配列を示す。「マウス６−ＩＩ」は、Ｋａｂａｔサブグループ６−ＩＩ由来のマウスＶＫ領域のコンセンサス配列を示す。「ヒト６−ＩＩ」は、Ｋａｂａｔサブグループ６−ＩＩ由来のヒトＶＫ領域のコンセンサス配列を示す。「ＨＦ−２１／２８」は、ヒトＨＦ−２１／２８抗体由来の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す（Ｃｈａｓｔａｇｎｅｒら， Ｇｅｎｅ １０１（２）：３０５−６（１９９１））。括弧内の数字（００５０５６）は、ＫａｂａｔデータベースＩＤ番号である。「表面またはコア」は、抗体可変領域の両鎖の残りの残基に対するアミノ酸の位置を示す。ＣＤＲから５Å以内の残基を大文字で示す。「１Ｄ９ＲＫＡ」は、ヒト化１Ｄ９ ＶＫ領域の第一の型のアミノ酸配列を示す。「１Ｄ９ＲＫＢ」は、ヒト化１Ｄ９ ＶＫ領域の第二の型のアミノ酸配列を示す。 図２０Ａ〜２０Ｃは、１Ｄ９抗体カッパ軽鎖可変領域の第一のヒト化型（１Ｄ９ＲＨＡ）および第二のヒト化型（１Ｄ９ＲＫＢ）の設計につながるアミノ酸配列並列を示す。第７列において、特定の残基位でマウス１Ｄ９に同一であるアミノ酸は示していない。「−」は、この残基位に位置するアミノ酸がないことを示す。ボールド体は、ＦＲおよびＣＤＲ中で、ヒトアミノ酸残基が対応するマウス残基に置換された位を示す。「Δ」は、１Ｄ９ＲＨＡのヒトＦＲ中の変化の番号付けを示す。「マウス１Ｄ９ ＶＨ」は、ネズミ１Ｄ９重鎖可変領域由来のＶＨ領域のアミノ酸配列を示す。「マウスＩＩＩｃ」は、ＫａｂａｔサブグループＩＩＩｃ由来のマウスＶＨ領域のコンセンサス配列を示す。「ヒトＩＩＩ」は、ＫａｂａｔサブグループＩＩＩ由来のヒトＶＨ領域のコンセンサス配列を示す。「４Ｂ４’ＣＬ」は、ヒト４Ｂ４’ＣＬ抗体由来の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す（Ｓａｎｚら， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４２：８８３（１９８９））。括弧内の数字（０００４９０）は、ＫａｂａｔデータベースＩＤ番号である。「表面またはコア」は、抗体可変領域の両鎖の残りの残基に対するアミノ酸の位置を示す。ＣＤＲから５Å以内の残基を大文字で示す。「１Ｄ９ＲＨＡ」は、ヒト化１Ｄ９ ＶＨ領域の第一の型のアミノ酸配列を示す。「１Ｄ９ＲＨＢ」は、ヒト化１Ｄ９ ＶＨ領域の第二の型のアミノ酸配列を示す。 図２０Ａ〜２０Ｃは、１Ｄ９抗体カッパ軽鎖可変領域の第一のヒト化型（１Ｄ９ＲＨＡ）および第二のヒト化型（１Ｄ９ＲＫＢ）の設計につながるアミノ酸配列並列を示す。第７列において、特定の残基位でマウス１Ｄ９に同一であるアミノ酸は示していない。「−」は、この残基位に位置するアミノ酸がないことを示す。ボールド体は、ＦＲおよびＣＤＲ中で、ヒトアミノ酸残基が対応するマウス残基に置換された位を示す。「Δ」は、１Ｄ９ＲＨＡのヒトＦＲ中の変化の番号付けを示す。「マウス１Ｄ９ ＶＨ」は、ネズミ１Ｄ９重鎖可変領域由来のＶＨ領域のアミノ酸配列を示す。「マウスＩＩＩｃ」は、ＫａｂａｔサブグループＩＩＩｃ由来のマウスＶＨ領域のコンセンサス配列を示す。「ヒトＩＩＩ」は、ＫａｂａｔサブグループＩＩＩ由来のヒトＶＨ領域のコンセンサス配列を示す。「４Ｂ４’ＣＬ」は、ヒト４Ｂ４’ＣＬ抗体由来の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す（Ｓａｎｚら， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４２：８８３（１９８９））。括弧内の数字（０００４９０）は、ＫａｂａｔデータベースＩＤ番号である。「表面またはコア」は、抗体可変領域の両鎖の残りの残基に対するアミノ酸の位置を示す。ＣＤＲから５Å以内の残基を大文字で示す。「１Ｄ９ＲＨＡ」は、ヒト化１Ｄ９ ＶＨ領域の第一の型のアミノ酸配列を示す。「１Ｄ９ＲＨＢ」は、ヒト化１Ｄ９ ＶＨ領域の第二の型のアミノ酸配列を示す。 図２０Ａ〜２０Ｃは、１Ｄ９抗体カッパ軽鎖可変領域の第一のヒト化型（１Ｄ９ＲＨＡ）および第二のヒト化型（１Ｄ９ＲＫＢ）の設計につながるアミノ酸配列並列を示す。第７列において、特定の残基位でマウス１Ｄ９に同一であるアミノ酸は示していない。「−」は、この残基位に位置するアミノ酸がないことを示す。ボールド体は、ＦＲおよびＣＤＲ中で、ヒトアミノ酸残基が対応するマウス残基に置換された位を示す。「Δ」は、１Ｄ９ＲＨＡのヒトＦＲ中の変化の番号付けを示す。「マウス１Ｄ９ ＶＨ」は、ネズミ１Ｄ９重鎖可変領域由来のＶＨ領域のアミノ酸配列を示す。「マウスＩＩＩｃ」は、ＫａｂａｔサブグループＩＩＩｃ由来のマウスＶＨ領域のコンセンサス配列を示す。「ヒトＩＩＩ」は、ＫａｂａｔサブグループＩＩＩ由来のヒトＶＨ領域のコンセンサス配列を示す。「４Ｂ４’ＣＬ」は、ヒト４Ｂ４’ＣＬ抗体由来の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す（Ｓａｎｚら， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４２：８８３（１９８９））。括弧内の数字（０００４９０）は、ＫａｂａｔデータベースＩＤ番号である。「表面またはコア」は、抗体可変領域の両鎖の残りの残基に対するアミノ酸の位置を示す。ＣＤＲから５Å以内の残基を大文字で示す。「１Ｄ９ＲＨＡ」は、ヒト化１Ｄ９ ＶＨ領域の第一の型のアミノ酸配列を示す。「１Ｄ９ＲＨＢ」は、ヒト化１Ｄ９ ＶＨ領域の第二の型のアミノ酸配列を示す。 図２１は、ネズミ抗体１Ｄ９重鎖可変領域のヌクレオチド配列、相補体およびコードされるアミノ酸配列を示す。リーダー配列および定常領域の一部もまた示す。例示するヌクレオチド配列は配列番号９６であり、相補配列は配列番号９９であり、そしてアミノ酸配列は配列番号１００である。 図２２は、ネズミ抗体１Ｄ９カッパ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列、相補体およびコードされるアミノ酸配列を示す。リーダー配列および定常領域の一部もまた示す。例示するヌクレオチド配列は配列番号９５であり、相補配列は配列番号１０１であり、そしてアミノ酸配列は配列番号１０２である。 図２３は、ヒト化重鎖１Ｄ９ＲＨＡのヌクレオチド配列を示す。示す酵素部位を、ベクターｐＬＫＴＯＫ４１へのクローニングのために付加した。該ベクターはまた、ヒトのリーダーおよび定常領域も有する。例示するヌクレオチド配列は配列番号９７であり、相補配列は配列番号１０３であり、そしてアミノ酸配列は配列番号１０４である。 図２４は、ヒト化軽鎖１Ｄ９ＲＫＡのヌクレオチド配列を示す。示す酵素部位を、ベクターｐＬＫＴＯＫ４１へのクローニングのために付加した。該ベクターはまた、ヒトのリーダーおよび定常領域も有する。ブラケット内のＹは、ｐＬＫＴＯＫ４１のＥｃｏＲＶクローニング部位にクローニングした際、アスパラギン酸に変化する残基を示す。例示するヌクレオチド配列は配列番号９８であり、相補配列は配列番号１０５であり、そしてアミノ酸配列は配列番号１０６である。 図２５は、ネズミｍＡｂ １Ｄ９およびｍＡｂ １Ｄ９のヒト化型（１Ｄ９ＲＨＡＶＨの重鎖、１Ｄ９ＲＫＡＶＫの軽鎖）が、全ＴＨＰ−１細胞への［１２５Ｉ］−ＭＣＰ−１の結合を阻害する能力の比較を例示する。ネズミ１Ｄ９（ｍｕｓ−１Ｄ９）のデータポイントを黒塗りの三角形として示す。１Ｄ９のヒト化型（ｈｕｍ−１Ｄ９）のデータポイントを黒塗りの正方形として示す。 図２６は、単一の組み合わせの免疫グロブリンＤＮＡカセットベクターに、重鎖カセットおよび軽鎖カセットをトランスファーする、構築プロセスを示す。組み合わせベクターを生成するため、プロモーター、ｎＶＨＬ、ＩｇＧ定常領域およびポリアデニル化領域を含む重鎖カセットを、軽鎖カセットを含むベクターのＢａｍＨＩ部位に、ＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩ断片としてクローニングすることも可能である。ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩは粘着端を有し、そしてどちらの部位も連結の際に失われる。 図２７は、完全組み合わせ重鎖および軽鎖免疫グロブリンＤＮＡカセット抗体発現ベクターの構造を示す。 図２８は、組み合わせ重鎖および軽鎖免疫グロブリンＤＮＡカセット抗体発現ベクターに、望ましい可変配列（ＶＨおよびＶＫ）を取り込むためのクローニングプロセスを示す。

Claims (11)

  1. ＣＣＲ２に結合特異性を有し、そして配列番号１７のアミノ酸配列および配列番号１１０のアミノ酸配列またはその一部を含む、ヒト化免疫グロブリン重鎖またはその抗原結合性断片。
  2. 可変領域および定常領域を有し、可変領域が配列番号１０８の核酸配列にコードされる、請求項１のヒト化免疫グロブリン重鎖またはその抗原結合性断片。
  3. 可変領域および定常領域を有し、定常領域が配列番号１１１の核酸配列またはその一部にコードされる、請求項１のヒト化免疫グロブリン重鎖またはその抗原結合性断片。
  4. 可変領域および定常領域を有し、可変領域が配列番号１０８の核酸配列にコードされ、そして定常領域が配列番号１１１の核酸配列またはその一部にコードされる、請求項１のヒト化免疫グロブリン重鎖またはその抗原結合性断片。
  5. ＣＣＲ２に結合特異性を有し、そして配列番号１２のアミノ酸配列および配列番号１１２のアミノ酸配列を含む、ヒト化免疫グロブリン軽鎖またはその抗原結合性断片。
  6. 可変領域および定常領域を有し、可変領域が配列番号１０９の核酸配列にコードされる、請求項５のヒト化免疫グロブリン軽鎖またはその抗原結合性断片。
  7. 可変領域および定常領域を有し、定常領域が配列番号１１３の核酸配列またはその一部にコードされる、請求項５のヒト化免疫グロブリン軽鎖またはその抗原結合性断片。
  8. 可変領域および定常領域を有し、可変領域が配列番号１０９の核酸配列にコードされ、そして定常領域が配列番号１１３の核酸配列またはその一部にコードされる、請求項５のヒト化免疫グロブリン軽鎖またはその抗原結合性断片。
  9. ＣＣＲ２に結合特異性を有し、そして重鎖および軽鎖を有する、ヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性部分であって、重鎖が配列番号１７のアミノ酸配列および配列番号１１０のアミノ酸配列またはその一部を含み、そして軽鎖が配列番号１２のアミノ酸配列を含む、前記ヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片。
  10. 軽鎖が配列番号１１２のアミノ酸配列をさらに含む、請求項９のヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片。
  11. ヒト化免疫グロブリンが２つの重鎖および２つの軽鎖を含む、請求項１０のヒト化免疫グロブリンまたはその抗原結合性断片。
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