JP6449876B2 - ニューレグリンに対して非競合的でアロステリックな抗ヒトｈｅｒ３抗体及びその使用 - Google Patents

Description

発明の分野：
本発明は、ニューレグリン（ＮＲＧ）に非競合的でアロステリックな抗ヒトＨＥＲ３抗体、並びに診断法及び治療法におけるその使用に関する。

発明の背景
受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のヒト上皮増殖因子受容体ＥｒｂＢ／ＨＥＲファミリーは、以下の４つのメンバーを含む：ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１／ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２（ｃ−Ｎｅｕ、ＨＥＲ２）、ＨＥＲ３（ＨＥＲ３）及びＨＥＲ４（ＨＥＲ４）。ＨＥＲ受容体は、１〜４で示される４つの構造ドメインからなる細胞外グリコシル化ドメイン、続いて膜貫通ドメイン、及びシグナル伝達経路への共役のためのキナーゼドメインを含有する細胞内Ｃ末端部分を含む。ＨＥＲ３を除いて、細胞内領域は、チロシンキナーゼ活性を含有する。シグナル伝達は、リガンドにより誘発される受容体の二量体化、続いてリン酸化を通して媒介され、これにより細胞質内シグナル伝達経路が活性化される。ＨＥＲ２は、特異的なリガンドを全く有さない。なぜなら、それは天然で「活性な」コンフォメーション下にあるからである。他のＨＥＲ受容体は不活性な単量体として存在し、分子は、二量体化を妨げるように折り畳まれている。ドメイン１及び３に結合するリガンドは、大きなコンフォメーション変化を誘導し、最終的には受容体のドメイン２の二量体化ループを露出させる。この二量体化ループの露出は、受容体の二量体化を可能とする。

１９９０年に初めて記載されたＨＥＲ３受容体は、内在的なキナーゼ活性を欠失した唯一のＨＥＲファミリーメンバーの受容体であり、下流のシグナル伝達はヘテロ二量体化を通して成し遂げられる。したがって、単量体としてのＨＥＲ３受容体は「非自己」と呼ばれ、ホモ二量体を形成することができない。ＨＥＲ３受容体にリガンドのニューレグリン（ＮＲＧ）が結合すると、ＨＥＲ３と他のＨＥＲファミリー受容体（優先的にはＨＥＲ２）のヘテロ二量体化がトリガーされる。ヘテロ二量体内で、ＨＥＲ３キナーゼドメインは、そのＨＥＲファミリー対のアロステリックなアクチベーターとして作用する。

ＨＥＲ３は、乳癌及び卵巣癌をはじめとする様々な癌の腫瘍発生に関与する（Lee-Hoeflich ST, Cancer Res. 2008; McIntyre E, Breast Cancer Res Treat. 2010; Tanner B, J Clin Oncol. 2006）。ＨＥＲ３の発現は、悪性黒色腫及び転移における腫瘍の進行及び患者の低下した生存率に相関し、卵巣癌における低下した生存率に関連する。重要なことには、乳癌においては、ハーセプチンによる処置に適格ではないＨＥＲ２の発現が低い腫瘍は、ＨＥＲ３を強く発現するように「プログラム化」されていることが多く（Smith et al. Br. J. Cancer 2004）、長期間の処置後にハーセプチンに対して抵抗性となったＨＥＲ２＋＋＋腫瘍は、ＨＥＲ３を強く発現するように「再プログラム化」される（Narayan, Cancer Res. 2009）。肺癌（Wheeler, Oncogene 2008）及び結腸直腸癌（Lu Cancer Res 2007）におけるセツキシマブに対する抵抗性もまた、ＥＧＦＲの内部移行／分解の調節不全と共に、ＨＥＲ３の過剰発現にも関連していた。近年、ＨＥＲ３の過剰発現は、結腸直腸癌の転移を有さない生存期間の悪化に有意に関連していた（Ho-Pun-Cheung, Int J Cancer 2010）。したがって、ＨＥＲ３の過剰発現、及びＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路の活性化を通した代償的なシグナル伝達が、ＨＥＲ標的化療法（抗体及びＴＫＩ）による処置に対する抵抗性の発達だけでなく（Wheeeler 2008, Lu 2007, Narayan, 2009, Sergina, 2007）、ＩＧＦＲ標的化療法（Desbois-Mouthon, Clin Cancer Res 2009）及び化学療法剤（Kruser, Exp Cell Res 2010）による処置に対する抵抗性の発達にも関与している。

これら全ての所見は、ＨＥＲ３を標的とする薬剤、特に抗体が、癌におけるＨＥＲ３シグナル伝達の役割をさらに理解するのを助け、特に効果的な免疫療法剤として使用され得ることを示唆する。

現在、治療用の抗ＨＥＲ３抗体は市販されていないが、科学文献は、腫瘍治療においてＨＥＲ３を標的化する利点を強く強調する。２つのヒト抗体が、現在、メリマックファーマシューティカルズ社／サノフィアベンティス社（ＭＭ−１２１抗体；ＰＣＴ国際公開公報第２００８／１００６２４号）及びＵ３ファーマＡＧ社／第一三共社／アムジェン社（Ｕ３−１２８７又はＡＭＧ−８８８；ＰＣＴ国際公開公報第２００７／０７７０２８号）によって開発中である。ＭＭ−１２１抗体は、非小細胞肺癌の第Ｉ相臨床試験、及びＥＲ＋ＰＲ＋ＨＥＲ２−乳癌の第Ｉ／ＩＩ相試験に関わっている。Ｕ３−１２８７抗体は、エルロチニブとともに非小細胞肺癌の第Ｉ相にある。ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３二重特異的抗体のＭＥＨＤ７９４５Ａ（ジェネンテック社；ＰＣＴ国際公開公報第２０１０／１０８２１７号）は依然として研究開発中である。ＨＥＲ２／ＨＥＲ３二重特異的抗体のＭＭ−１１１（メリマックファーマシューティカルズ；ＰＣＴ国際公開公報第２００５／１１７９７３号、国際公開公報第２００６／０９１２０９号）は、ＨＥＲ２の増幅された乳癌において、単独で、又はトラスツズマブ若しくはラパチニブと組み合わせて第Ｉ／ＩＩ相臨床試験に関わっている。

上記の抗体は全て、ＨＥＲ３受容体のヘレグリン結合部位を遮断するので、リガンド依存性腫瘍へのこれらの抗体による治療は低減する。ＨＥＲ３のヘレグリン結合部位に指向されない抗体を用いてのＨＥＲ３の標的化は、ＨＥＲ２の増幅した抵抗性の乳癌における標的化療法若しくは化学療法に対する抵抗性を迂回させることを可能とするか、このような処置には現在適格ではないＨＥＲ２の低い乳癌に対する標的化療法の適用分野を広げることを可能とするか、又は、ＨＥＲ３を発現しかつ標的化療法が依然として得られていない三種陰性乳癌を処置することを可能とするだろう。

発明の概要：
本発明は、ニューレグリン（ＮＲＧ）に対して非競合的でアロステリックな抗ヒトＨＥＲ３抗体、並びに診断法及び治療法におけるその使用に関する。

発明の詳細な説明：
本発明者らは、リガンドのニューレグリンの存在下でＨＥＲ３陽性細胞に対する独特な特異性を有する、９Ｆ７−Ｆ１１と命名されたマウス抗ヒトＨＥＲ３抗体を特徴付けた。特に、９Ｆ７−Ｆ１１／ＨＥＲ３の親和性はニューレグリンが存在する場合にも阻害されず（９Ｆ７−Ｆ１１抗体は、ニューレグリンに対して非競合的である）、さらに、９Ｆ７−Ｆ１１／ＨＥＲ３の親和性は、ニューレグリンがＨＥＲ３陽性細胞の環境内に存在する場合にアロステリック的に高まる（９Ｆ７−Ｆ１１はアロステリックな抗ＨＥＲ３抗体である）ことを本発明者らは示した。ＮＲＧに非競合的でアロステリックな９Ｆ７−Ｆ１１抗体はＭＡＰＫ、ＡＫＴ及びｐ５３経路を阻害し、細胞周期のＧ１期を遮断し、細胞増殖を阻害し、腫瘍細胞のアポトーシスを回復させる。この独特な９Ｆ７−Ｆ１１抗体は、ＮＲＧ依存性の膵臓癌、及びＨＥＲ２の増幅した乳癌又は三種陰性の乳癌の腫瘍増殖を低減させ、かつ、トラスツズマブ／ペルツズマブというＨＥＲ２抗体の組合せ又は単独で使用されたＨＥＲ２抗体よりも、ＨＥＲ２特異的抗体のペルツズマブと組み合わせた方がより効果的である。

治療用９Ｆ７−Ｆ１１抗体は、より限定されたＨＥＲ３活性化機序に標的化する、リガンドに対して競合的な抗体又はアロステリック作用のないリガンドに対して非競合的な抗体よりも、幅広い範囲の腫瘍において臨床上の有用性を有するだろう。そのアロステリック効果により、ＮＲＧに対して非競合的な９Ｆ７−Ｆ１１抗体は、ニューレグリンが腫瘍によって分泌されている場合（自己分泌）又は微小環境によって分泌されている場合（パラ分泌）、他の抗体よりも、リガンド依存性腫瘍に対してより効果的であろう。そのアロステリック効果により、９Ｆ７−Ｆ１１抗体は、ニューレグリンのアップレギュレーションによって媒介される抵抗性（すなわち、結腸直腸癌におけるセツキシマブに対する抵抗性）が起こった場合により効果的であろう。そのアロステリック効果により、９Ｆ７−Ｆ１１の結合は、リガンドによる活性化後に受容体がヘテロ二量体化した場合に、向上し得る。要するに、ＮＲＧに対して非競合的でアロステリックな抗ヒトＨＥＲ３抗体の９Ｆ７−Ｆ１１は、既存の治療用抗体が臨床的に無効である容態を処置するのに使用され得る。

結論すると、本発明の抗体は、先行技術に記載された抗ＨＥＲ３抗体を上回る以下の利点を提供する：
−それらはアロステリックな抗体である、
−それらはニューレグリンに対して非競合的である、
−それらは、より広範囲の作用を与える（リガンド非依存性癌及びリガンド依存性癌の両方に）、
−それらは、自己分泌又はパラ分泌リガンド依存性腫瘍に対してより効果的である（そのアロステリック効果による）、
−それらは、ＨＥＲ３リガンドのアップレギュレーションによって媒介される抵抗性（例えば、抗体又はＴＫＩ、又は化学療法、又は抗ホルモン剤に対する抵抗性）が起こった場合に、より効果的である、
−それらは、既存の治療用抗体が臨床的に無効である容態、例えば、三種陰性の乳癌、膵臓癌、他のニッチ（例えば腎細胞癌）を処置するのに使用され得る。

定義：
「ニューレグリン」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、「ヘレグリン」という用語と同義語として使用されることが多い。ヘレグリンファミリーは、α、β及びγヘレグリン（Holmes et al., Science, 256: 1205-1210 (1992); 米国特許第５，６４１，８６９号；及びSchaefer et al. Oncogene 15: 1385-1394 (1997)）；ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）、グリア細胞増殖因子（ＧＧＦ）；アセチルコリン受容体誘導活性（ＡＲＩＡ）；及び感覚及び運動ニューロン由来因子（ＳＭＤＦ）を含む。概説については、Groenen et al. Growth Factors 11:235-257 (1994); Lemke, G. Molec. & Cell. Neurosci. 7:247-262（1996）及びLee etal. Pharm. Rev. 47:51-85 (1995); Falls and D. (2003). "Neuregulins: functions, forms, and signaling strategies." Experimental Cell Research 284(1): 14-30を参照されたい。

「ＨＥＲ３」という用語は、Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4905-4909（1990）に記載のようなヒトＨＥＲ３受容体を指す；Kani et al., Biochemistry 44: 15842-857 (2005), Cho and Leahy, Science 297: 1330- 1333（2002）も参照されたい。ＨＥＲ３は「ＨＥＲ３」としても知られる。

「抗ヒトＨＥＲ３抗体」という用語は、ヒトＨＥＲ３に対して指向される抗体を指す。

本発明によると、「抗体」又は「免疫グロブリン」は同じ意味を有し、本発明において等価に使用される。本明細書において使用される「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子、及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原と免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を指す。したがって、抗体という用語は、完全な抗体分子だけでなく、抗体断片、並びに、抗体及び抗体断片の変異体（誘導体も含む）も包含する。天然の抗体では、２本の重鎖が互いにジスルフィド結合によって連結され、各々の重鎖は軽鎖にジスルフィド結合によって連結されている。ラムダ（ｌ）及びカッパ（ｋ）という２種類の軽鎖がある。抗体分子の機能的活性を決定する５つの主な重鎖のクラス（又はアイソタイプ）が存在する：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ。各々の鎖は明確に異なる配列ドメインを含有する。軽鎖は、２つのドメイン、すなわち可変ドメイン（ＶＬ）及び定常ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は４つのドメイン、すなわち可変ドメイン（ＶＨ）及び３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３、まとめてＣＨと称される）を含む。軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）の両方の可変領域が、抗原に対する結合認識及び抗原に対する特異性を決定する。軽鎖（ＣＬ）及び重鎖（ＣＨ）の定常領域ドメインは、抗体鎖の会合、分泌、経胎盤移動、補体との結合、及びＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合などの重要な生物学的特性を付与する。Ｆｖ断片は、免疫ブログリンのＦａｂ断片のＮ末端部分であり、１本の軽鎖と１本の重鎖の可変部分からなる。抗体の特異性は、抗体の結合部位と抗原決定基との間の構造的相補性に存する。抗体の結合部位は、主に超可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基から作られる。時折、非超可変領域又はフレームワーク領域（ＦＲ）に由来する残基が全体的なドメイン構造に影響を及ぼし、したがって結合部位に影響を及ぼす。相補性決定領域すなわちＣＤＲは、天然免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性及び特異性を共に規定するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖は各々、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３、及びＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３とそれぞれ称される３つのＣＤＲを有する。それ故、抗原結合部位は、重鎖及び軽鎖の各々のＶ領域に由来するＣＤＲセットを含む、６つのＣＤＲを含む。フレームワーク領域（ＦＲ）はＣＤＲの間に挿入されたアミノ酸配列を指す。

「キメラ抗体」という用語は、９Ｆ７−Ｆ１１抗体に由来する抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインと、ヒト抗体のＣＨドメイン及びＣＬドメインとを含む、抗体を指す。

本発明によると、「ヒト化抗体」という用語は、ヒト抗体の可変領域のフレームワーク領域及び定常領域を有しているが、９Ｆ７−Ｆ１１抗体のＣＤＲを保持している、抗体を指す。

「Ｆａｂ」という用語は、約５０，０００の分子量及び抗原結合活性を有し、プロテアーゼのパパインでＩｇＧを処理することによって得られた断片の中で、Ｈ鎖のＮ末端側の約半分及び完全なＬ鎖が、ジスルフィド結合を通して互いに結合している、抗体断片を示す。

「Ｆ（ａｂ’）２」という用語は、約１００，０００の分子量及び抗原結合活性を有し、プロテアーゼのペプシンでＩｇＧを処理することによって得られた断片の中で、ヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合したＦａｂよりも僅かに大きい、抗体断片を指す。

「Ｆａｂ’」という用語は、約５０，０００の分子量及び抗原結合活性を有し、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られる、抗体断片を指す。

一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、ペプチドをコードするリンカーによって連結されたＶＨコード遺伝子とＶＬコード遺伝子を含む遺伝子融合体から通常発現される、共有結合で連結されたＶＨ：ＶＬヘテロ二量体である。「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド結合によって安定化されたＶＨ：ＶＬヘテロ二量体である。二価及び多価抗体断片は、一価ｓｃＦｖの会合によって自然発生的に形成され得るか、又は、二価ｓｃ（Ｆｖ）２のようにペプチドリンカーによって一価ｓｃＦｖを結合させることによって作製され得る。

「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、該断片は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間で対を形成するには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対を形成させ、２つの抗原結合部位を作る。

「精製された」及び「単離された」によって、本発明に記載の抗体又はヌクレオチド配列に言及されている場合、示された分子は、同種の他の生物学的な巨大分子の実質的な非存在下で存在することを意味する。本明細書において使用される「精製された」という用語は、同種の生物学的巨大分子が好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、さらにより好ましくは少なくとも９５重量％、最も好ましくは少なくとも９８重量％存在することを意味する。特定のポリペプチドをコードする「単離された」核酸分子は、該ポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子を指すが；該分子は、該組成物の基本的な特徴に有害な影響を及ぼさないいくつかの追加の塩基又は部分を含んでいてもよい。

本発明の抗体：
本発明は、単離されたニューレグリン（ＮＲＧ）に対して非競合的でアロステリックな抗ＨＥＲ３抗体又はその断片を提供する。特に、本発明者らは、マウス抗ＨＥＲ３抗体（９Ｆ７−Ｆ１１）を産生するハイブリドーマを生成した。本発明者らは、該９Ｆ７−Ｆ１１モノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖の可変ドメインをクローニングし特徴付け、したがって、表１に記載のような該抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）ドメインを決定した。

それ故、本発明は、重鎖（可変ドメインが、Ｈ−ＣＤＲ１については配列番号２、Ｈ−ＣＤＲ２については配列番号３、及びＨ−ＣＤＲ３については配列番号４からなる群より選択された配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む）を含む、ＨＥＲ３に対して特異性を有するモノクローナル抗体に関する。

本発明はまた、軽鎖（可変ドメインが、Ｌ−ＣＤＲ１については配列番号６、Ｌ−ＣＤＲ２については配列番号７、及びＬ−ＣＤＲ３については配列番号８からなる群より選択された配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む）を含む、ＨＥＲ３に対して特異性を有するモノクローナル抗体に関する。

本発明のモノクローナル抗体は、重鎖（可変ドメインが、Ｈ−ＣＤＲ１については配列番号２、Ｈ−ＣＤＲ２については配列番号３、及びＨ−ＣＤＲ３については配列番号４からなる群より選択された配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む）及び軽鎖（可変ドメインが、Ｌ−ＣＤＲ１については配列番号６、Ｌ−ＣＤＲ２については配列番号７、及びＬ−ＣＤＲ３については配列番号８からなる群より選択された配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む）を含み得る。

特に、本発明は、Ｈ−ＣＤＲ１領域に配列番号２、Ｈ−ＣＤＲ２領域に配列番号３、及びＨ−ＣＤＲ３領域に配列番号４を含む重鎖可変領域；並びに、Ｌ−ＣＤＲ１領域に配列番号６、Ｌ−ＣＤＲ２領域に配列番号７、及びＬ−ＣＤＲ３領域に配列番号８を含む軽鎖可変領域を含む、抗ＨＥＲ３モノクローナル抗体を提供する。

１つの特定の実施態様では、該抗体の重鎖可変領域は、配列番号１として示されるアミノ酸配列を有し、及び／又は、軽鎖可変領域は、配列番号５として示されるアミノ酸配列を有する。

別の実施態様では、本発明のモノクローナル抗体は、キメラ抗体、好ましくはキメラマウス／ヒト抗体である。特に、該マウス／ヒトキメラ抗体は、上記に定義されているような９Ｆ７−Ｆ１１抗体の可変ドメインを含み得る。

別の実施態様では、本発明のモノクローナル抗体は、ヒト化抗体である。特に、該ヒト化抗体では、可変ドメインは、ヒトアクセプターフレームワーク領域、及び場合により存在する場合にはヒト定常ドメイン、及び非ヒトドナーＣＤＲ、例えば上記に定義されているようなマウスＣＤＲを含む。

本発明はさらに、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２及びダイアボディを含むがこれらに限定されない、ＨＥＲ３に対して指向される該抗体の抗ＨＥＲ３断片を提供する。

別の態様では、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択された配列を有する、ポリペプチドに関する。

本発明の抗体を作製する方法
本発明の抗ヒトＨＥＲ３抗体は、任意の化学的技術、生物学的技術、遺伝子的技術、又は酵素的技術を単独で又は組み合わせたものを含むがこれらに限定されない、当技術分野において公知の任意の技術によって作製され得る。

所望の配列のアミノ酸配列が分かれば、当業者は、標準的なポリペプチド作製技術によって、該抗体を容易に作製することができる。例えば、それらは、周知の固相法を使用して、好ましくは市販のペプチド合成装置（例えば、Applied Biosystems、フォスターシティ、カリフォルニアによって製造された装置）を使用して、製造業者の説明書に従って合成され得る。あるいは、本発明の抗体は、当技術分野において周知の組換えＤＮＡ技術によって合成され得る。例えば、抗体は、抗体をコードするＤＮＡ配列を発現ベクターに組み込み、このようなベクターを、所望の抗体を発現するであろう適切な真核細胞宿主又は原核細胞宿主に導入した後にＤＮＡ発現産物として得ることができ、それから後で周知の技術を使用して単離することができる。

したがって、本発明のさらなる目的は、本発明に記載の抗体をコードする核酸配列に関する。

１つの特定の実施態様では、本発明は、ハイブリドーマ９Ｆ７−Ｆ１１から得ることのできる抗体のＶＨドメイン、又はハイブリドーマ９Ｆ７−Ｆ１１から得ることのできる抗体のＶＬドメインをコードする核酸配列に関する。

１つの特定の実施態様では、本発明は、配列番号９の配列を含む核酸配列に関する。

１つの特定の実施態様では、本発明は、配列番号１０の配列を含む核酸配列に関する。

典型的には、該核酸はＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子であり、これを任意の適切なベクター、例えばプラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージ、又はウイルスベクターに含め得る。

「ベクター」、「クローニングベクター」及び「発現ベクター」という用語はビヒクルを意味し、これによってＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列（例えば外来遺伝子）を宿主細胞に導入することができ、これにより宿主を形質転換させ、導入された配列の発現（例えば転写及び翻訳）を促進することができる。

よって、本発明のさらなる目的は、本発明の核酸を含むベクターに関する。

このようなベクターは、被験者への投与時に該抗体の発現を引き起こすか又は指令するための、調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、終結因子などを含み得る。動物細胞用の発現ベクターに使用されるプロモーター及びエンハンサーの例としては、ＳＶ４０の初期プロモーター及びエンハンサー（Mizukami T. et al. 1987）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーター及びエンハンサー（Kuwana Y et al. 1987）、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター（Mason JO et al. 1985）及びエンハンサー（Gillies SD et al. 1983）などが挙げられる。

ヒト抗体Ｃ領域をコードする遺伝子を挿入し発現させることができる限りにおいて、動物細胞用のあらゆる発現ベクターを使用することができる。適切なベクターの例としては、ｐＡＧＥ１０７（Miyaji H et al. 1990）、ｐＡＧＥ１０３（Mizukami T et al. 1987）、ｐＨＳＧ２７４（Brady G et al. 1984）、ｐＫＣＲ（O'Hare K et al. 1981）、ｐＳＧ１βｄ２−４―（Miyaji H et al. 1990）などが挙げられる。プラスミドの他の例としては、複製起点を含む複製プラスミド、又は、組込み用プラスミド、例えばｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどが挙げられる。ウイルスベクターの他の例としては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、及びＡＡＶベクターが挙げられる。このような組換えウイルスは、当技術分野において公知の技術によって、例えばパッケージング細胞のトランスフェクションによって、又は、ヘルパープラスミド若しくはウイルスを用いての一過性トランスフェクションによって産生され得る。ウイルスパッケージング細胞の典型例としては、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などが挙げられる。このような複製欠陥組換えウイルスを産生するための詳細なプロトコールは例えば、国際公開公報第９５／１４７８５号、国際公開公報第９６／２２３７８号、米国特許第５，８８２，８７７号、米国特許第６，０１３，５１６号、米国特許第４，８６１，７１９号、米国特許第５，２７８，０５６号、及び国際公開公報第９４／１９４７８号に見られ得る。

本発明のさらなる目的は、本発明に記載の核酸及び／又はベクターによってトランスフェクト、感染、又は形質転換された宿主細胞に関する。

「形質転換」という用語は、「外来」（すなわち外因性又は細胞外）遺伝子のＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列を宿主細胞に導入することを意味し、これによって宿主細胞は導入された遺伝子又は配列を発現して、所望の物質、典型的には導入された遺伝子又は配列によってコードされるタンパク質又は酵素を産生する。導入されたＤＮＡ又はＲＮＡを受け取り発現する宿主細胞は「形質転換」されている。

本発明の核酸を使用して、適切な発現系において本発明の抗体を産生し得る。「発現系」という用語は、例えばベクターによって保有され宿主細胞に導入された外来ＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現のために適した条件下での宿主細胞と適合性ベクターを意味する。

一般的な発現系としては、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞とプラスミドベクター、昆虫宿主細胞とバキュロウイルスベクター、及び哺乳動物宿主細胞とベクターが挙げられる。宿主細胞の他の例としては、以下に限定されないが、原核細胞（例えば細菌）及び真核細胞（例えば酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など）が挙げられる。具体例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、クリベロマイセス又はサッカロマイセス酵母、哺乳動物細胞株（例えばＶｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞など）、並びに、初代又は樹立された哺乳動物細胞培養液（例えば、リンパ芽球、線維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞などから産生される）が挙げられる。例としてはまた、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（本明細書において以後、「ＤＨＦＲ遺伝子」と称される）が欠損しているＣＨＯ細胞（Urlaub G et al; 1980）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２、本明細書において以後、「ＹＢ２／０細胞」と称される）なども挙げられる。

本発明はまた、本発明に記載の抗体を発現している組換え宿主細胞を産生する方法に関し、該方法は、（ｉ）上記のような組換え核酸又はベクターをインビトロ又はエクスビボでコンピテントな宿主細胞に導入する工程、（ｉｉ）得られた組換え宿主細胞をインビトロ又はエクスビボで培養する工程、及び（ｉｉｉ）場合により、該抗体を発現及び／又は分泌する細胞を選択する工程を含む。このような組換え宿主細胞は、本発明の抗体の産生に使用することができる。

別の特定の実施態様では、該方法は、
（ｉ）ハイブリドーマ９Ｆ７−Ｆ１１を、１６Ｄ３−Ｃ１抗体の発現を可能とするに適した条件下で培養する工程；及び
（ｉｉ）発現された抗体を回収する工程
を含む。

本発明の抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティクロマトグラフィーなどの、従来の免疫グロブリン精製手順によって培養培地から適切に分離される。

１つの特定の実施態様では、本発明のヒトキメラ抗体は、以前に記載されているようにＶＬドメイン及びＶＨドメインをコードする核酸配列を得、それらを、ヒト抗体ＣＨ及びヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用の発現ベクターに挿入することによってヒトキメラ抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを動物細胞に導入することによってコード配列を発現させることによって産生され得る。

ヒトキメラ抗体のＣＨドメインとしては、それはヒト免疫グロブリンに属する任意の領域であり得るが、ＩｇＧクラスのものが適し、ＩｇＧクラスに属しているサブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のいずれか１つを使用することができる。また、ヒトキメラ抗体のＣＬとしては、それはＩｇに属する任意の領域であり得、κクラス又はλクラスのものを使用することができる。

キメラ抗体の産生法は、当技術分野において周知である従来の組換えＤＮＡ技術及び遺伝子トランスフェクション技術を含む（Morrison SL. et al.（1984）及び特許文書の米国特許第５，２０２，２３８号；及び米国特許第５，２０４，２４４号を参照されたい）。

本発明のヒト化抗体は、以前に記載されているようにＣＤＲドメインをコードする核酸配列を得、それらを（ｉ）ヒト抗体と同一な重鎖定常領域及び（ｉｉ）ヒト抗体と同一な軽鎖定常領域をコードする遺伝子を有する動物細胞用の発現ベクターに挿入することによってヒト化抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを動物細胞に導入することによって遺伝子を発現させることによって産生され得る。

ヒト化抗体発現ベクターは、抗体重鎖をコードする遺伝子と抗体軽鎖をコードする遺伝子が別々のベクター上に存在するタイプか、又は、両方の遺伝子が同じベクターに存在するタイプ（タンデム型）のいずれかであってもよい。ヒト化抗体発現ベクターの構築のし易さ、動物細胞への導入のし易さ、動物細胞内での抗体のＨ鎖とＬ鎖の発現レベルのバランスの観点では、タンデム型のヒト化抗体発現ベクターが好ましい（Shitara K et al. 1994）。タンデム型のヒト化抗体発現ベクターの例としては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開公報第９７／１０３５４号）、ｐＥＥ１８などが挙げられる。

従来の組換えＤＮＡ技術及び遺伝子トランスフェクション技術に基づいたヒト化抗体の作製法は、当技術分野において周知である（例えば、Riechmann L. et al. 1988; Neuberger MS. et al. 1985を参照）。抗体は、例えば、ＣＤＲ移植法（欧州特許第２３９，４００号；ＰＣＴ公開公報の国際公開公報第９１／０９９６７号；米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号；及び第５，５８５，０８９号）、化粧張り（veneering）法又は表面再構成（resurfacing）法（欧州特許第５９２，１０６号；欧州特許第５１９，５９６号；Padlan EA (1991)；Studnicka GM et al. (1994)；Roguska MA. et al.（1994））、及びチェーンシャッフリング法（米国特許第５，５６５，３３２号）などをはじめとする当技術分野において公知の様々な技術を使用してヒト化され得る。このような抗体の調製のための一般的な組換えＤＮＡ技術も公知である（欧州特許出願の欧州特許第１２５０２３号及び国際特許出願の国際公開公報第９６／０２５７６号を参照）。

本発明のＦａｂは、ヒトＨＥＲ３と特異的に反応する抗体をプロテアーゼのパパインで処理することによって得ることができる。また、Ｆａｂは、抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを、原核細胞発現系又は真核細胞発現系のためのベクターに挿入し、該ベクターを原核細胞又は真核細胞（適宜）に導入してＦａｂを発現させることによっても産生され得る。

本発明のＦ（ａｂ’）２は、ヒトＨＥＲ３と特異的に反応する抗体をプロテアーゼのペプシンで処理することによって得ることができる。また、Ｆ（ａｂ’）２は、チオエーテル結合又はジスルフィド結合を介して下記のＦａｂ’を結合させることによっても作製され得る。

本発明のＦａｂ’は、ヒトＨＥＲ３と特異的に反応するＦ（ａｂ’）２を、還元剤のジチオトレイトールで処理することによって得ることができる。また、Ｆａｂ’は、抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを、原核細胞用の発現ベクター又は真核細胞用の発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核細胞又は真核細胞（適宜）に導入してその発現を行なうことによっても産生され得る。

本発明のｓｃＦｖは、以前に記載されているようにＶＨドメイン及びＶＬドメインをコードするｃＤＮＡを得、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核細胞用の発現ベクター又は真核細胞用の発現ベクターに挿入し、その後、該発現ベクターを原核細胞又は真核細胞（適宜）に導入してｓｃＦｖを発現させることによって産生され得る。ヒト化ｓｃＦｖ断片を作製するために、ＣＤＲ移植法と呼ばれる周知の技術が使用され得、これは、ドナーｓｃＦｖ断片から相補性決定領域（ＣＤＲ）を選択し、それらを３次元構造が公知であるヒトｓｃＦｖ断片フレームワークに移植することを含む（例えば、国際公開公報第９８／４５３２２号；国際公開公報第８７／０２６７１号；米国特許第５，８５９，２０５号；米国特許第５，５８５，０８９号；米国特許第４，８１６，５６７号；欧州特許第０１７３４９４号を参照）。

本明細書に記載の抗体のアミノ酸配列の改変が考えられる。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を向上させることが望ましい場合がある。ヒト化抗体が、非ヒト動物に由来する抗体のＶＨ及びＶＬ中のＣＤＲのみを、ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲに単に移植することによって産生される場合、抗原結合活性は、非ヒト動物に由来する元来の抗体と比較して低下することが知られている。非ヒト抗体のＣＤＲ中だけでなくＦＲ中の、ＶＨ及びＶＬのいくつかのアミノ酸残基も、抗原結合活性に直接的に又は間接的に関連していると考えられる。したがって、これらのアミノ酸残基を、ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲに由来する異なるアミノ酸残基で置換することにより、結合活性は減少するだろう。問題を解決するために、ヒトＣＤＲを移植された抗体において、ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、抗体との結合に直接関連しているか、又はＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用しているか、又は抗体の３次元構造を維持し、かつ抗原との結合に直接関連しているアミノ酸残基を同定するための試みを行なわなければならない。低下した抗原結合活性は、同定されたアミノ酸を、非ヒト動物に由来する元来の抗体のアミノ酸残基で置換することによって上昇させることができた。

本発明の抗体の構造、及びそれらをコードしているＤＮＡ配列に改変及び変化を施し得、所望の特徴を有する抗体をコードする機能的分子が依然として得られるだろう。

アミノ酸配列を変化させる際に、アミノ酸の疎水性指標が考慮され得る。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する際のアミノ酸の疎水性指標の重要性は、一般的に当技術分野において理解されている。アミノ酸の相対的な親水性疎水性特徴は、結果として生じるタンパク質の二次構造に寄与し、次に、該タンパク質と他の分子（例えば酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定することが認められている。各々のアミノ酸は、その疎水性及び荷電の特徴に基づいて疎水性指標を割り当てられている。それらは、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）である。

本発明のさらなる目的はまた、本発明の抗体の機能保存的な変異体も包含する。

「機能保存的変異体」は、タンパク質又は酵素中の所与のアミノ酸残基を、ポリペプチドの全体的なコンフォメーション及び機能を改変させることなく変化させたものであり、これには、アミノ酸を、類似した特性（例えば、極性、水素結合能、酸性、塩基性、疎水性、芳香族性など）を有するアミノ酸で置換することが挙げられるがこれに限定されない。保存されたと示されているもの以外のアミノ酸は、タンパク質内で異なっていてもよく、よって、類似の機能を有するいずれか２つのタンパク質間のタンパク質配列又はアミノ酸配列の類似率は異なり得、例えば、アラインメントスキームに従って、例えばＣｌｕｓｔｅｒ法などによって決定されたところ７０％〜９９％であり得、類似率はＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づく。「機能保存的変異体」はまた、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡアルゴリズムによって決定されるアミノ酸同一率の、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％を有し、それと比較する天然タンパク質又は親タンパク質と同じ又は実質的に類似した特性又は機能を有する、ポリペプチドも含む。

２つのアミノ酸配列は、アミノ酸の８０％超、好ましくは８５％超、好ましくは９０％超が同一であるか、又は、より短い配列の完全長にわたって約９０％超、好ましくは９５％超が類似（機能的に同一）である場合に、「実質的に相同」又は「実質的に類似」している。好ましくは、類似の又は相同な配列は、例えばＧＣＧ（Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin）パイルアッププログラム、又はＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの配列比較アルゴリズムのいずれかを使用したアラインメントによって同定される。

例えば、タンパク質構造内の特定のアミノ酸を、認められ得る活性の低下を伴うことなく、他のアミノ酸で置換してもよい。タンパク質の相互作用能及び性質は、タンパク質の生物学的な機能的活性を規定するので、タンパク質配列内、および勿論そのＤＮＡコード配列内の特定のアミノ酸の置換を行なうことができ、それにも関わらず似たような特性を有するタンパク質が得られる。したがって、認められ得るその生物学的活性の低下を伴うことなく、本発明の抗体配列、又は該抗体をコードする対応するＤＮＡ配列に様々な変化を行ない得ることが考えられる。

特定のアミノ酸を、類似の疎水性指標又はスコアを有する他のアミノ酸で置換し得、それでも依然として類似した生物学的活性を有するタンパク質が得られ、すなわち、依然として生物学的に機能的に等価なタンパク質が得られるであろうことは当技術分野において公知である。

それ故、上記に概略が示されているように、アミノ酸の置換は一般的に、アミノ酸の側鎖の置換基の相対的な類似性、例えばその疎水性、親水性、荷電、サイズなどに基づく。様々な前記の特徴を考慮に入れた例示的な置換は当業者には周知であり、これには、アルギニンとリジン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとトレオニン；グルタミンとアスパラギン；及びバリンとロイシンとイソロイシンが挙げられる。

したがって、本発明はまた、重鎖を含む抗体を提供し、
可変ドメインは、
−配列番号２として示される配列に対して少なくとも９０％又は９５％の同一率を有するＨ−ＣＤＲ１、
−配列番号３として示される配列に対して少なくとも９０％又は９５％の同一率を有するＨ−ＣＤＲ２、
−配列番号４として示される配列に対して少なくとも９０％又は９５％の同一率を有するＨ−ＣＤＲ３、
−配列番号６として示される配列に対して少なくとも９０％又は９５％の同一率を有するＬ−ＣＤＲ１、
−配列番号７として示される配列に対して少なくとも９０％又は９５％の同一率を有するＬ−ＣＤＲ２、
−配列番号８として示される配列に対して少なくとも９０％又は９５％の同一率を有するＬ−ＣＤＲ３
を含み、
−重鎖（可変ドメインが、Ｈ−ＣＤＲ１については配列番号２、Ｈ−ＣＤＲ２については配列番号３、及びＨ−ＣＤＲ３については配列番号４を含む）及び軽鎖（可変ドメインが、Ｌ−ＣＤＲ１については配列番号６、Ｌ−ＣＤＲ２については配列番号７、及びＬ−ＣＤＲ３については配列番号８を含む）を含む抗体と実質的に同じ親和性で、より好ましくはマウス抗ＨＥＲ３抗体９Ｆ７−Ｆ１１と実質的に同じ親和性で、ＨＥＲ３に特異的に結合する。

前記抗体は、当技術分野において公知の任意の方法によって特異的な結合についてアッセイされ得る。多くの異なる競合結合アッセイフォーマット（群）をエピトープビニングのために使用することができる。使用され得るイムノアッセイとしては、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素アッセイ、ゲル拡散沈降素アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ、及び補体結合アッセイなどの技術を使用した競合アッセイシステムが挙げられるがこれらに限定されない。このようなアッセイは、当技術分野において慣用的でありかつ周知である（例えば、Ausubel et al., eds, 1994 Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & sons, Inc., New Yorkを参照）。例えば、ビアコア（登録商標）（GE Healthcare、ピスキャタウェイ、ＮＪ）は、モノクローナル抗体のパネルをエピトープビニングするために慣用的に使用される様々な表面プラズモン共鳴アッセイフォーマットの１つである。さらに、慣用的な交差遮断アッセイ、例えばAntibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane, 1988に記載のアッセイを行なうことができる。

本発明の工学操作された抗体としては、例えば抗体の特性を向上させるために、ＶＨ及び／又はＶＬ内のフレームワーク残基に改変が行なわれている抗体が挙げられる。典型的には、このようなフレームワークの改変は、抗体の免疫原性を減少させるために行なわれる。例えば、１つのアプローチは、１つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖系列上の配列へと「復帰突然変異」させることである。より具体的には、体細胞突然変異を受けた抗体は、該抗体が由来する生殖系列上の配列とは異なるフレームワーク残基を含有している可能性が高い。このような残基は、抗体のフレームワーク配列を、該抗体が由来する生殖系列上の配列と比較することによって同定され得る。フレームワーク領域の配列をその生殖系列上の配置へと戻すために、体細胞突然変異を、例えば部位突然変異誘発又はＰＣＲ媒介突然変異誘発によって生殖系列上の配列へと「復帰突然変異」させることができる。このような「復帰突然変異した」抗体も本発明によって包含されることを意図する。別のタイプのフレームワーク改変は、フレームワーク領域内、又はさらには１つ以上のＣＤＲ領域内の１つ以上の残基を突然変異させて、Ｔ細胞エピトープを除去し、これにより抗体の起こり得る免疫原性を低減させることを含む。このアプローチはまた、「脱免疫化」とも称され、Carr et alによる米国特許公開公報第２００３０１５３０４３号にさらに詳細に記載されている。

フレームワーク又はＣＤＲ領域内に行なわれた改変に加えて又はその代わりに、本発明の抗体を、典型的には、抗体の１つ以上の機能的特性、例えば血清中半減期、補体との結合、Ｆｃ受容体への結合、及び／又は抗原依存性細胞障害などを改変させるために、Ｆｃ領域内に改変を含むように工学操作し得る。さらに、本発明の抗体は、抗体の１つ以上の機能的特性を再度改変させるために、化学的に修飾され得るか（例えば１つ以上の化学的部分を抗体に付着させることができる）、又はそのグリコシル化を改変させるために改変され得る。これらの各々の実施態様は、以下にさらに詳細に記載される。Ｆｃ領域内の残基の番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けである。

１つの実施態様では、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域内のシステイン残基の数が改変されるように、例えば増加又は減少するように改変されている。このアプローチは、Bodmer et alによる米国特許第５，６７７，４２５号にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域内のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖と重鎖の会合を促進するために、又は抗体の安定性を上昇若しくは低下させるために改変されている。

別の実施態様では、抗体のＦｃヒンジ領域は、抗体の生物学的な半減期を減少させるように突然変異されている。より具体的には、抗体の、天然Ｆｃ−ヒンジドメインのブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）への結合と比較して、ＳｐＡへの結合が損なわれるように、１つ以上のアミノ酸の突然変異が、Ｆｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメインの界面領域に導入されている。このアプローチは、Ward et alによる米国特許第６，１６５，７４５号にさらに詳細に記載されている。

別の実施態様では、抗体は、その生物学的半減期を延ばすように改変されている。様々なアプローチが可能である。例えば、Ward et alによる米国特許第６，２７７，３７５号に記載のように、以下の１つ以上の突然変異を導入することができる：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。あるいは、生物学的半減期を延ばすために、抗体を、ＣＨ１又はＣＬ領域内で改変させて、Presta et alによる米国特許第５，８６９，０４６号及び第６，１２１，０２２号に記載のように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから採用されたサルベージ受容体に結合するエピトープを含有させることができる。

さらに他の実施態様では、抗体のエフェクター機能を改変させるために、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換することによってＦｃ領域を改変する。例えば、１つ以上のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基で置換することができ、これにより、抗体は、エフェクターリガンドに対して改変された親和性を有するが、親抗体の抗原結合能は保持している。エフェクターリガンド（これに対する親和性が改変される）は、例えば、Ｆｃ受容体又は補体のＣ１成分である。このアプローチは、どちらもWinter et alによる米国特許第５，６２４，８２１号及び第５，６４８，２６０号にさらに詳細に記載されている。

別の実施態様では、アミノ酸残基から選択された１つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置換することができ、これにより、抗体は、改変されたＣ１ｑへの結合及び／又は低減された若しくは消失した補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を有する。このアプローチは、ldusogie et alによる米国特許第６，１９４，５５１号にさらに詳細に記載されている。

別の実施態様では、１つ以上のアミノ酸残基を改変させて、これにより、抗体の補体への結合能を改変させる。このアプローチは、Bodmer et alによるＰＣＴ公開公報の国際公開公報第９４／２９３５１号にさらに記載されている。

さらに別の実施態様では、Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を高めるために、及び／又はＦｃ受容体に対する抗体の親和性を高めるために、１つ以上のアミノ酸を改変することによって改変されている。このアプローチは、PrestaによるＰＣＴ公開公報の国際公開公報第００／４２０７２号にさらに記載されている。さらに、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位がマッピングされ、改善された結合を有する変異体が記載されている（Shields, R. L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604、国際公開公報第２０１０１０６１８０号を参照）。

さらに別の実施態様では、抗体のグリコシル化が改変されている。例えば、脱グリコシル化抗体を作製することができる（すなわち抗体はグリコシル化を欠失している）。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を高めるために改変され得る。このような糖鎖の改変は、例えば、抗体配列内の１つ以上のグリコシル化部位を改変させることによって成し遂げられ得る。例えば、１つ以上の可変領域のフレームワークのグリコシル化部位を消失させ、これによりその部位におけるグリコシル化を消失させるような、１つ以上のアミノ酸の置換を行なうことができる。このような脱グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を高め得る。このようなアプローチは、Co et alによる米国特許第５，７１４，３５０号及び第６，３５０，８６１号にさらに詳細に記載されている。

追加的又は代替的に、減少した量のフコシル残基を有するか若しくは全くフコシル残基を有さない低フコシル化若しくは非フコシル化抗体、又は、バイセクティングＧｌｃＮａｃ構造が増加している抗体などの、改変されたタイプのグリコシル化を有する抗体を作製することができる。このような改変されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能を高めることが実証されている。このような糖鎖の改変は、例えば、改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞において抗体を発現させることによって成し遂げられ得る。改変されたグリコシル化機構を有する細胞は当技術分野において記載され、これを本発明の組換え抗体を発現するための宿主細胞として使用して、これにより改変されたグリコシル化を有する抗体を産生することができる。例えば、Hang et al.による欧州特許第１，１７６，１９５号は、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が機能的に破壊された細胞株を記載し、よって、このような細胞株において発現された抗体は低フコシル化を示すか、又は、フコシル残基を欠失している。それ故、１つの実施態様では、本発明の抗体は、低フコシル化又は非フコシル化パターンを示す細胞株、例えば、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子の発現が欠損した哺乳動物細胞株における組換え発現によって産生され得る。PrestaによるＰＣＴ公開公報の国際公開公報第０３／０３５８３５号は、フコースをＡｓｎ（２９７）に連結された糖鎖に付着させる能力が低下した、変異ＣＨＯ細胞株であるＬｅｃｌ３細胞を記載し、ここでもまたその結果、その宿主細胞内で発現された抗体の低フコシル化が起こる（Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照）。Umana et al.によるＰＣＴ公開公報の国際公開公報第９９／５４３４２号は、糖タンパク質を改変するグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように工学操作された細胞株を記載し、よって、工学操作された細胞株において発現された抗体は、増加したバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造を示し、その結果、抗体のＡＤＣＣ活性は上昇した（Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180も参照）。Eureka Therapeutics社はさらに、フコシル残基を欠失した改変された哺乳動物のグリコシル化パターンを有する抗体を産生することのできる遺伝子工学操作されたＣＨＯ哺乳動物細胞を記載する（http://www.eurekainc.com/a&boutus/companyoverview.html）。あるいは、哺乳動物に似たグリコシル化パターンについて工学操作されかつグリコシル化パターンとしてフコースを欠失している抗体を産生することができる、酵母又は糸状菌において本発明の抗体を産生することができる（例えば欧州特許第１２９７１７２Ｂ１号を参照）。

本発明によって考えられる本明細書における抗体の別の改変は、ＰＥＧ化である。例えば抗体の生物学的（例えば血清中）半減期を延ばすために、抗体をＰＥＧ化することができる。抗体をＰＥＧ化するために、抗体又はその断片を典型的には、１つ以上のＰＥＧ基が抗体又は抗体断片と付着するようになる条件下で、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えばＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体と反応させる。ＰＥＧ化は、反応性ＰＥＧ分子（又は、類似した反応性の水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応によって行なうことができる。本明細書において使用される「ポリエチレングリコール」という用語は、他のタンパク質を誘導体化するために使用されたあらゆる形態のＰＥＧ、例えばモノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−又はアリールオキシ−ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール−マレイミドを包含することを意図する。特定の実施態様では、ＰＥＧ化しようとする抗体は、脱グリコシル化抗体である。タンパク質をＰＥＧ化するための方法は当技術分野において公知であり、本発明の抗体に適用することができる。例えば、Nishimura et al.による欧州特許第０１５４３１６号及びIshikawa et al.による欧州特許第０４０１３８４号を参照されたい。

本発明によって考えられる抗体の別の改変は、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域と、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン又はその断片との、コンジュゲート又はタンパク質融合であり、これにより結果として生じる分子の半減期は延長される。このようなアプローチは、例えば、Ballance et al. 欧州特許第０３２２０９４号に記載されている。

別の可能性は、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域と、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミンに結合することのできるタンパク質との融合であり、これにより結果として生じる分子の半減期は延長される。このようなアプローチは、Nygren et al.、欧州特許第０４８６５２５号に記載されている。

免疫複合体：
本発明の抗体を、検出可能な標識とコンジュゲートさせて、抗ＨＥＲ３免疫複合体を形成することができる。適切な検出可能な標識としては、例えば、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、生物発光標識、又はコロイド金が挙げられる。このような検出可能なように標識された免疫複合体を作製及び検出する方法は当業者には周知であり、より詳細に以下に記載されている。

検出可能な標識は、オートラジオグラフィーによって検出される放射性同位体であり得る。本発明の目的のために特に有用である同位体は、^３Ｈ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓ及び^１４Ｃである。

抗ＨＥＲ３免疫複合体は、蛍光化合物を用いても標識することができる。蛍光で標識された抗体の存在は、免疫複合体を適切な波長の光に曝し、結果として生じた蛍光を検出することによって決定される。蛍光標識化合物としては、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、及びフルオレサミンが挙げられる。

あるいは、抗ＨＥＲ３免疫複合体は、抗体を化学発光化合物と結合させることによって検出可能なように標識され得る。化学発光でタグ化された免疫複合体の存在は、化学反応の経過中に生じる発光の存在を検出することによって決定される。化学発光標識化合物の例としては、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、及びシュウ酸エステルが挙げられる。

同様に、生物発光化合物を使用して、本発明の抗ＨＥＲ３免疫複合体を標識することができる。生物発光は、生物学的系において見られる化学発光の一種であり、この系において触媒タンパク質は化学発光反応の効率を高める。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって決定される。標識に有用な生物発光化合物としては、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリンが挙げられる。

あるいは、抗ＨＥＲ３免疫複合体は、抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体を酵素に連結させることによって検出可能なように標識され得る。抗ＨＥＲ３抗体−酵素のコンジュゲートを適切な基質の存在下でインキュベートする場合、酵素部分は基質と反応して、化学部分を生成し、これを、例えば分光光度的な方法、蛍光定量的な方法、又は目視による方法によって検出することができる。多重特異的な免疫複合体を検出可能なように標識するために使用され得る酵素の例としては、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、及びアルカリホスファターゼが挙げられる。

当業者は、本発明に従って使用され得る他の適切な標識も知っているだろう。抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体へのマーカー部分の結合は、当技術分野において公知の標準的な技術を使用して成し遂げられ得る。これに関しての典型的な方法は、Kennedy et al., Clin. Chim. Acta 70:1, 1976; Schurs et al., Clin. Chim. Acta 81:1, 1977; Shih et al., Int'l J. Cancer 46:1101, 1990; Stein et al., Cancer Res. 50:1330, 1990；及びColigan、前記によって記載されている。

さらに、免疫化学的な検出の簡便性及び多用途性は、アビジン、ストレプトアビジン、及びビオチンとコンジュゲートさせておいた抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体を使用することによって増強され得る（例えば、Wilchek et al. (eds.), “Avidin-Biotin Technology,” Methods In Enzymology (Vol. 184) (Academic Press 1990); Bayer et al., “Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology,” in Methods In Molecular Biology (Vol. 10) 149-162（Manson, ed., The Humana Press, Inc. 1992）を参照）。

イムノアッセイを実施するための方法は十分に確立されている（例えば、Cook and Self, “Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays,” in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application 180-208 (Ritter and Ladyman, eds., Cambridge University Press 1995); Perry, “The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology,” in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications 107-120 (Birch and Lennox, eds., Wiley-Liss, Inc. 1995); Diamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc. 1996)を参照）。

別の態様では、本発明は、抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体−薬物のコンジュゲートを提供する。本明細書において使用される「抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体−薬物のコンジュゲート」は、治療剤にコンジュゲートされた本発明に記載の抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体を指す。このような抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体−薬物のコンジュゲートは、被験者に、例えばＨＥＲ３を発現している癌を有する被験者に投与された場合、典型的には単独で、しかしまた他の治療剤と組み合わせて投与された場合でも、ＨＥＲ３発現細胞に対して臨床的に有益な効果をもたらす。

典型的な実施態様では、抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体を細胞障害性薬剤にコンジュゲートさせ、よって、結果として生じた抗体−薬物のコンジュゲートは、細胞によって取り込まれるか又は内部移行した場合に、ＨＥＲ３発現細胞（例えばＨＥＲ３発現癌細胞）に対して細胞障害作用又は細胞静止作用を発揮する。抗体へのコンジュゲートのために特に適した部分は、化学療法剤、プロドラッグ変換酵素、放射性同位体若しくは放射性化合物、又は毒素である。例えば、抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体を、化学療法剤又は毒素などの細胞障害性薬剤（例えば細胞静止剤又は細胞致死剤、例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、又はジフテリア毒素など）にコンジュゲートすることができる。

有用なクラスの細胞障害性薬剤としては、例えば、抗チューブリン剤、オーリスタチン、ＤＮＡ小溝結合剤、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤（例えば白金錯体、例えばシスプラチン、単核白金、二核白金、及び三核白金錯体、及びカルボプラチン）、アントラサイクリン、抗生物質、葉酸代謝拮抗剤、代謝拮抗剤、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、ニトロソウレア、プラチノール、孔形成（pre-forming）化合物、プリン代謝拮抗剤、ピューロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイドなどが挙げられる。

個々の細胞障害性薬剤としては、例えば、アンドロゲン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、アスパラギナーゼ、５−アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブスルファン、ブチオニンスルホキシミン、カンプトテシン、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ＣＣ−１０６５（Li et al., Cancer Res. 42:999-1004, 1982）、クロラムブシル、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、シチジンアラビノシド、サイトカラシンＢ、ダカルバジン、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ダウノルビシン、デカルバジン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エストロゲン、５−フルオロデオキシウリジン、リン酸エトポシド（ＶＰ−１６）、５−フルオロウラシル、グラミシジンＤ、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミン、メルファラン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミスラマイシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ニトロイミダゾール、パクリタキセル、プリカマイシン、プロカルバジン、ストレプトゾトシン、テノポシド（ＶＭ−２６）、６−チオグアニン、チオテパ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、及びビノレルビンが挙げられる。

特に適した細胞障害性薬剤としては、例えば、ドラスタチン（例えばオーリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ）、ＤＮＡ小溝結合剤（例えばエンジイン及びレキシトロプシン）、デュオカルマイシン、タキサン（例えばパクリタキセル及びドセタキセル）、ピューロマイシン、ビンカアルカロイド、ＣＣ−１０６５、ＳＮ−３８（７−エチル−１０−ヒドロキシ−カンプトテシン）、トポテカン、モルホリノ−ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、エキノマイシン、コンブレタスタチン、ネトロプシン、エトチロンＡ及びＢ、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、メイタンシノイド、ディスコデルモリド、エリュテロビン、及びミトキサントロンが挙げられる。

特定の実施態様では、細胞障害性薬剤は、従来の化学療法剤、例えば、ドキソルビシン、パクリタキセル、メルファラン、ビンカアルカロイド、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、又はエトポシドである。さらに、ＣＣ−１０６５類似体、カリケアマイシン、メイタンシン、ドラスタチン１０の類似体、リゾキシン、及びパリトキシンなどの強力な薬剤を抗ＨＥＲ３発現抗体に連結させることができる。

具体的な変法では、細胞障害性薬剤又は細胞静止剤は、オーリスタチンＥ（当技術分野においてドラスタチン−１０としても知られる）又はその誘導体である。典型的には、オーリスタチンＥ誘導体は、例えば、オーリスタチンＥとケト酸との間に形成されたエステルである。例えば、オーリスタチンをパラアセチル安息香酸又はベンゾイル吉草酸と反応させて、それぞれＡＥＢ及びＡＥＶＢを生成することができる。他の典型的なオーリスタチン誘導体としては、ＡＦＰ（ジメチルバリン−バリン−ドライソロイニン−ドラプロイン−フェニルアラニン−ｐ−フェニレンジアミン）、ＭＭＡＦ（ドバリン−バリン−ドライソロイニン−ドラプロイン−フェニルアラニン）、及びＭＡＥ（モノメチルオーリスタチンＥ）が挙げられる。オーリスタチンＥ及びその誘導体の合成及び構造は、米国特許出願公開公報第２００３００８３２６３号；国際特許公開公報第２００２／０８８１７２号及び国際公開公報第２００４／０１０９５７号；及び米国特許第６，８８４，８６９号；第６，３２３，３１５号；第６，２３９，１０４号；第６，０３４，０６５号；第５，７８０，５８８号；第５，６６５，８６０号；第５，６６３，１４９号；第５，６３５，４８３号；第５，５９９，９０２号；第５，５５４，７２５号；第５，５３０，０９７号；第５，５２１，２８４号；第５，５０４，１９１号；第５，４１０，０２４号；第５，１３８，０３６号；第５，０７６，９７３号；第４，９８６，９８８号；第４，９７８，７４４号；第４，８７９，２７８号；第４，８１６，４４４号；及び第４，４８６，４１４号に記載されている。

他の変法では、細胞障害性薬剤は、ＤＮＡ小溝結合剤である（例えば米国特許第６，１３０，２３７号を参照）。例えば、特定の実施態様では、小溝結合剤はＣＢＩ化合物である。他の実施態様では、小溝結合剤はエンジイン（例えばカリケアマイシン）である。

特定の実施態様では、抗体−薬物のコンジュゲートは、抗チューブリン剤を含む。抗チューブリン剤の例としては、例えば、タキサン（例えばタキソール（登録商標）（パクリタキセル）、タキソテア（登録商標）（ドセタキセル））、Ｔ６７（Tularik社）、ビンカアルカロイド（例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、及びビノレルビン）、及びドラスタチン（例えばオーリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ）が挙げられる。他の抗チューブリン剤としては、例えば、バッカチン誘導体、タキサン類似体（例えばエポチロンＡ及びＢ）、ノコダゾール、コルヒチン及びコルセミド、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、メイタンシノイド、コンブレタスタチン、ディスコデルモライド、及びエリュテロビンが挙げられる。いくつかの実施態様では、細胞障害性薬剤は、別のグループの抗チューブリン剤であるメイタンシノイドである。例えば、具体的な実施態様では、メイタンシノイドはメイタンシン又はＤＭ−１である（ImmunoGen, Inc.；Chari et al., Cancer Res. 52:127-131, 1992も参照）。

他の実施態様では、細胞障害性薬剤は代謝拮抗剤である。代謝拮抗剤は、例えば、プリン拮抗剤（例えばアザチオプリン又はミコフェノール酸モフェチル）、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤（例えばメトトレキサート）、アシクロビル、ガンシクロビル、ジドブジン、ビダラビン、リババリン、アジドチミジン、シチジンアラビノシド、アマンタジン、ジデオキシウリジン、ヨードデオキシウリジン、ホスカルネット又はトリフリジンであり得る。

他の実施態様では、抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体を、プロドラッグ変換酵素にコンジュゲートさせる。プロドラッグ変換酵素は、公知の方法を使用して抗体に組換え融合されていても又は化学的にコンジュゲートされていてもよい。例示的なプロドラッグ変換酵素はカルボキシペプチダーゼＧ２、β−グルクロニダーゼ、ペニシリン−Ｖ−アミダーゼ、ペニシリン−Ｇ−アミダーゼ、β−ラクタマーゼ、β−グルコシダーゼ、ニトロレダクターゼ、及びカルボキシペプチダーゼＡである。

治療剤をタンパク質に、特に抗体にコンジュゲートさせるための技術は周知である（例えば、Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy (Reisfeld et al. eds., Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery,” in Controlled Drug Delivery (Robinson et al. eds., Marcel Deiker, Inc., 2nd ed. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,” in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (Pinchera et al. eds., 1985); “Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy (Baldwin et al. eds., Academic Press, 1985)；及びThorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58を参照。例えばＰＣＴ公開公報の国際公開公報第８９／１２６２４号も参照されたい）。

診断用途：
本発明のさらなる目的は、ＨＥＲ３の発現に関連した癌疾患を診断及び／又はモニタリングするための本発明の抗ヒトＨＥＲ３抗体に関する。ＨＥＲ３の発現に関連した癌疾患としては、典型的には、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、膵臓癌、グリア細胞腫瘍、例えば神経膠芽腫及び神経線維腫症、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、大腸癌、黒色腫、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓（kidney）癌、腎臓（renal）癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝細胞癌、及び様々な種類の頭頸部癌が挙げられるがこれらに限定されない。１つの特定の実施態様では、本発明の方法を使用して診断された癌は、乳癌又は卵巣癌である。１つの特定の実施態様では、本発明の抗体は、乳癌及び卵巣癌を診断するのに有用である。

１つの特定の実施態様では、本発明の抗体を、検出可能な分子又は物質、例えば蛍光分子、放射性分子、又は上記されているような当技術分野において公知の任意の他の標識で標識し得る。例えば、本発明の抗体を、当技術分野において公知の任意の方法によって放射性分子で標識し得る。例えば、放射性分子としては、シンチグラフィー研究のための放射性原子、例えばＩｌ２３、Ｉｌ２４、Ｉｎ１１１、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の抗体はまた、核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（磁気共鳴画像法、ｍｉｒとしても知られている）のためのスピンラベル、例えばヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン、又は鉄で標識されていてもよい。抗体の投与後、患者内の抗体の分布を検出する。任意の特定の標識の分布を検出するための方法は当業者には公知であり、任意の適切な方法を使用することができる。いくつかの非限定的な例としては、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、ポジトロン断層撮影（ＰＥＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、蛍光、化学発光、及び超音波検査が挙げられる。

本発明の抗体は、ＨＥＲ３の発現に関連した癌疾患のステージ分類をするのに有用であり得る（例えば放射性物質を用いた画像撮影法において）。例えば、本発明の抗体は、乳癌又は卵巣癌のステージ分類をするのに有用であり得る。それらは単独で又は他の乳癌若しくは卵巣癌マーカー（ＨＥＲ２、ＣＡ１２５、ＨＥ４及びメソテリンなどを含むがこれらに限定されない）と組み合わせて使用され得る。

典型的には、該診断法は、患者から得られた生物学的試料の使用を含む。本明細書において使用される「生物学的試料」という用語は被験者から得られた様々な試料の種類を包含し、これを診断アッセイ又はモニタリングアッセイに使用することができる。生物学的試料としては、血液、及び生物学的起源の他の液体試料、固体組織試料、例えば生検標本、又は組織培養液若しくはそれから得られた細胞、及びその後代が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、生物学的試料は、１つの特定の実施態様では***又は卵巣からのＨＥＲ３発現に関連した癌疾患を有すると疑われる個体から回収された組織試料から得られた細胞を含む。それ故、生物学的試料は、臨床試料、培養液中の細胞、細胞上清、細胞溶解液、血清、血漿、生物学的液体、及び組織試料を包含する。

１つの特定の実施態様では、本発明は、本発明の抗体を使用して被験者由来の細胞上でＨＥＲ３を検出することによって、被験者におけるＨＥＲ３の発現に関連した癌疾患を診断する方法である。特に、該診断法は、
（ａ）ＨＥＲ３の発現に関連した癌疾患を患っている可能性が高い被験者の生物学的試料を、本発明に記載の抗体と、ＨＥＲ３を発現する生物学的試料の細胞と該抗体が複合体を形成するに十分な条件で接触させ；
（ｂ）該複合体を検出及び／又は定量し、これにより、該複合体の検出は、ＨＥＲ３の発現に関連した癌疾患を示す
ことからなる工程を含み得る。

癌疾患をモニタリングするために、本発明に記載の診断法を、試料への抗体の結合が増加又は減少したかを決定するために、様々な時間間隔で繰り返し得、これにより癌疾患が進行したか又は後退したかが決定される。

治療用途：
本発明の抗体、断片、又は免疫複合体は、あらゆるＨＥＲ３を発現している癌の処置に有用であり得る。本発明の抗体は、単独で又は任意の適切な薬剤と組み合わせて使用され得る。

ＨＥＲ３を発現している癌の例としては、細胞癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が挙げられるがこれらに限定されない。このような癌のより特定の例としては、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、膵臓癌、グリア細胞腫瘍、例えば神経膠芽腫及び神経線維腫症、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、大腸癌、黒色腫、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓（kidney）癌、腎臓（renal）癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝細胞癌、及び様々な種類の頭頸部癌が挙げられる。１つの特定の実施態様では、本発明の方法を使用して処置される癌は、乳癌又は卵巣癌である。

したがって、本発明の目的は、治療有効量の本発明の抗体、断片又は免疫複合体をそれを必要とする被験者に投与することを含む、ＨＥＲ３の発現に関連した癌を処置する方法に関する。

いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、リガンド（すなわちＮＲＧ）非依存性癌及びリガンド依存性癌の処置に特に適している。

いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、（そのアロステリック効果により）自己分泌又はパラ分泌リガンド依存性腫瘍の処置に特に適している。

いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、抗体、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、化学療法剤、又は抗ホルモン剤による処置に対して抵抗性である癌の処置に特に適している。

いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、三種陰性乳癌、膵臓癌及び腎細胞癌からなる群より選択された癌の処置に特に適している。

本発明の文脈において、本明細書において使用される「処置する」又は「処置」という用語は、このような用語が適用される疾患若しくは容態、又はこのような疾患若しくは容態の１つ以上の症状を元に戻す、寛解する、その進行を阻止する、又は予防することを意味する。

本発明によると、「患者」又は「それを必要とする患者」という用語は、ヒトＨＥＲ３の発現を伴うヒトＨＥＲ３癌の発現を伴う癌に罹患した又は罹患する可能性が高いヒト又は非ヒト哺乳動物を意味する。

本発明の抗体の「治療有効量」によって、任意の医学的処置に適用可能な妥当なベネフィット／リスク比で、前記の癌を処置するのに十分な量の抗体を意味する。しかし、本発明の抗体及び組成物の１日総使用量は、妥当な医学的判断の範囲内で担当の医師によって決定されることが理解されるだろう。任意の特定の患者についての具体的な治療有効投与量レベルは、処置される疾患及び疾患の重度；使用される具体的な抗体の活性；使用される具体的な組成、患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別及び食事；使用される具体的な抗体の投与時刻、投与経路、及び***速度；処置期間；使用される具体的な抗体と組み合わせて又は同時に使用される薬物；並びに、医学分野において周知である同様な因子をはじめとする、様々な因子に依存するだろう。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要とされるよりも低いレベルで化合物の投与量を開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を次第に増加させることは当技術分野の技能範囲内で周知である。

特定の実施態様では、抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体又は抗体−薬物のコンジュゲートは、疾病又は疾患の処置のための第二の薬剤と組み合わせて使用される。癌の処置に使用される場合、本発明の抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体又は抗体−薬物のコンジュゲートは、従来の癌療法、例えば手術、放射線療法、化学療法、又はその組合せなどと組み合わせて使用され得る。特定の態様では、本発明に記載の抗ＨＥＲ３抗体又は抗体−薬物のコンジュゲートとの併用癌療法に有用である他の治療剤としては、血管新生抑制剤が挙げられる。いくつかの態様では、本発明に記載の抗体又は抗体−薬物のコンジュゲートは、サイトカイン（例えば、腫瘍に対する免疫応答を刺激するサイトカイン）と共投与される。

いくつかの他の態様では、併用療法に有用な他の治療剤としては、腫瘍増殖に関与する特定の因子（例えばＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、又はＨＥＲ４）の拮抗剤が挙げられる。

１つの特定の実施態様では、本発明の抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体又は抗体−薬物のコンジュゲートは、抗ヒトＨＥＲ２モノクローナル抗体、例えばトラスツズマブ又はペルツズマブなどと組み合わせて使用される。

いくつかの実施態様では、本明細書に記載されている抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体又は抗体−薬物のコンジュゲートは、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）と組み合わせて使用される。ＢＡＹ４３−９００６（ソラフェニブ、ネクサバール（登録商標））及びＳＵ１１２４８（スニチニブ、スーテント（登録商標））は、認可されている２つのこのようなＴＫＩである。他のＴＫＩとしては、メシル酸イマチニブ（グリベック（登録商標）、ノバルティス社）；ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標）、アストラゼネカ社）；エルロチニブ塩酸塩（タルセバ（登録商標）、ジェネンテック社）；バンデタニブ（ザクティマ（登録商標）、アストラゼネカ社）、チピファルニブ（ザーネストラ（登録商標）、ヤンセン・シラグ社）；ダサチニブ（スプリセル（登録商標）、ブリストールマイヤーズスクイブ社）；ロナファーニブ（Sarasar（登録商標）、シェリングプラウ社）；コハク酸バタラニブ（ノバルティス社、シエーリングＡＧ社）；ラパチニブ（タイケルブ（登録商標）、グラクソスミスクライン社）；ニロチニブ（ノバルティス社）；レスタウルチニブ（セファロン社）；パゾパニブ塩酸塩（グラクソスミスクライン社）；アキシチニブ（ファイザー社）；カネルチニブ二塩酸塩（ファイザー社）；ペリチニブ（米国国立癌研究所、ワイス社）；タンデュチニブ（ミレニアム社）；ボスチニブ（ワイス社）；セマキサニブ（Sugen社、大鵬薬品）；ＡＺＤ−２１７１（アストラゼネカ社）；ＶＸ−６８０（メルク社、ベルテックス社）；ＥＸＥＬ−０９９９（エグゼリクシス社）；ＡＲＲＹ−１４２８８６（アレイ・バイオファーマ社、アストラゼネカ社）；ＰＤ−０３２５９０１（ファイザー社）；ＡＭＧ−７０６（アムジェン社）；ＢＩＢＦ−１１２０（ベーリンガーインゲルハイム社）；ＳＵ−６６６８（大鵬薬品）；ＣＰ−５４７６３２（ＯＳＩ社）；ＡＥＥ−７８８（ノバルティス社）；ＢＭＳ−５８２６６４（ブリストールマイヤーズスクイブ社）；ＪＮＫ−４０１（セルジーン社）；Ｒ−７８８（ライジェル社）；ＡＺＤ−１１５２ ＨＱＰＡ（アストラゼネカ社）；ＮＭ−３（ジェンザイム・オンコロジー社）；ＣＰ−８６８５９６（ファイザー社）；ＢＭＳ−５９９６２６（ブリストールマイヤーズスクイブ社）；ＰＴＣ−２９９（ＰＴＣセラピューティクス社）；ＡＢＴ−８６９（アボット社）；ＥＸＥＬ−２８８０（エグゼリクシス社）；ＡＧ−０２４３２２（ファイザー社）；ＸＬ−８２０（エグゼリクシス社）；ＯＳＩ−９３０（ＯＳＩ社）；ＸＬ−１８４（エグゼリクシス社）；ＫＲＮ−９５１（キリンビール社）；ＣＰ−７２４７１４（ＯＳＩ社）；Ｅ−７０８０（エーザイ社）；ＨＫＩ−２７２（ワイス社）；ＣＨＩＲ−２５８（カイロン社）；ＺＫ−３０４７０９（シエーリングＡＧ社）；ＥＸＥＬ−７６４７（エグゼリクシス社）；ＢＡＹ−５７−９３５２（バイエル社）；ＢＩＢＷ−２９９２（ベーリンガーインゲルハイム社）；ＡＶ−４１２（ＡＶＥＯ社）；ＹＮ−９６８Ｄ１（Advenchen Laboratories社）；ミドスタウリン（ノバルティス社）；ペリフォシン（エテルナ・ゼンタリス社、ケリックス社、米国国立癌研究所）；ＡＧ−０２４３２２（ファイザー社）；ＡＺＤ−１１５２（アストラゼネカ社）；ＯＮ−０１９１０Ｎａ（オンコノバ社）；及びＡＺＤ−０５３０（アストラゼネカ社）などが挙げられるがこれらに限定されない。

医薬組成物：
投与のために、抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体又は抗体−薬物のコンジュゲートを、医薬組成物として製剤化する。抗ヒトＨＥＲ３モノクローナル抗体又は抗体−薬物のコンジュゲートを含む医薬組成物を、薬学的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従って製剤化することができ、この方法では、治療用分子を、薬学的に許容される担体と混合物中で合わせる。組成物は、その投与がレシピエント患者によって耐容され得るならば「薬学的に許容される担体」であると言われる。無菌リン酸緩衝食塩水は、薬学的に許容される担体の一例である。他の適切な担体は当業者には周知である。（例えば、Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences（Mack Publishing Company, 19th ed. 1995）を参照されたい）。製剤はさらに、１つ以上の賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝化剤、バイアル表面上でのタンパク質の損失を防ぐためのアルブミンなどを含み得る。

医薬組成物の剤形、投与経路、投与量、及び処方計画は必然的に、処置しようとする容態、病気の重度、患者の年齢、体重、及び性別などに依存する。

本発明の医薬組成物は、局所投与、経口投与、非経口投与、鼻腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、又は眼内投与などのために製剤化され得る。

好ましくは、医薬組成物は、注射することのできる製剤にとって薬学的に許容されるビヒクルを含有する。これらは、特に、等張で無菌の食塩水溶液（リン酸一ナトリウム又はリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム又は塩化マグネシウムなど、あるいはこのような塩の混合物）、又は、場合に応じて滅菌水若しくは生理食塩水の添加により注射液の復元が可能となる乾燥させた、特に凍結乾燥させた組成物であり得る。

投与に使用される用量は、様々なパラメーターの関数として、特に使用される投与形態、関連した病態、又は代替的には所望の処置期間の関数として適応させ得る。

医薬組成物を調製するために、有効量の抗体を薬学的に許容される担体又は水性媒体に溶解又は分散させ得る。

注射用途に適した剤形としては、無菌水溶液又は分散液；ゴマ油、ピーナッツ油、又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び、無菌注射溶液又は分散液の即時調製のための無菌粉末が挙げられる。全ての場合において、剤形は無菌でなければならず、シリンジが容易に扱える程度まで流動性でなければならない。それは、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から防腐されていなければならない。

遊離塩基又は薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製され得る。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びその混合物中、及び油中において調製されてもよい。通常の保存及び使用の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための保存剤を含有する。

本発明の抗体は、中性又は塩の形の組成物へと製剤化され得る。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と共に形成される）が挙げられ、これらは、例えば、塩酸若しくはリン酸などの無機酸、又は、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのこのような有機酸を用いて形成される。遊離カルボキシル基を用いて形成された塩はまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化鉄などの無機塩基、及び、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのこのような有機塩基から誘導され得る。

担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、及び植物油を含有する、溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防御は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張化剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましいだろう。注射用組成物の吸収延長は、組成物中に、吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどを使用することによってもたらされ得る。

無菌注射溶液は、必要量の活性化合物を、適切な溶媒中に、必要であれば上記に列挙された他の様々な成分と共に取り込み、その後、滅菌濾過することによって調製される。一般的には、分散液は、様々な滅菌された活性成分を、基本的な分散媒体及び上記に列挙された成分の中からの必要とされるその他の成分とを含有する無菌ビヒクルに取り込むことによって調製される。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製法は真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、これにより、以前に滅菌濾過されたその溶液から活性成分と任意の追加の所望の成分の粉末が得られる。

直接的な注射のためのより濃縮された又は非常に濃縮された溶液（溶媒としてＤＭＳＯの使用が想定される）の調製が企画され、これにより極めて急速な浸透がもたらされ、高濃度の活性薬剤が小さな腫瘍領域へと送達される。

製剤化時に、溶液は、投与製剤に適合した様式で、治療的に効果のあるような量で投与されるだろう。製剤は、様々な剤形で、例えば上記の注射溶液のタイプで容易に投与されるが、薬物放出カプセルなどを使用してもよい。

水溶液での非経口投与のために、例えば、溶液は、必要であれば適切に緩衝化されるべきであり、液体希釈剤をまず、十分な食塩水又はブドウ糖で等張とすべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、及び腹腔内投与に特に適している。これに関連して、使用され得る無菌水性媒体は、本開示を鑑みて当業者には公知であろう。例えば、１用量を等張ＮａＣｌ溶液１mlに溶かし、皮下点滴療法液１０００mlに加えるか又は提案された注入部位に注射し得る（例えば、"Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580を参照）。投与量の幾分かの変更が、処置される被験者の容態に依存して必然的になされるだろう。投与責任者は、いずれの事象においても、個々の被験者にとって適切な用量を決定するだろう。

本発明の抗体は、治療混合物内で、１用量あたり約０．０００１〜１．０mg、又は約０．００１〜０．１mg、又は約０．１〜１．０mg、又はさらには約１０mgなどを含むように製剤化され得る。複数回の用量を投与してもよい。

静脈内又は筋肉内注射などの非経口投与のために製剤化された化合物の他に、他の薬学的に許容される剤形としては、例えば、経口投与用の錠剤又は他の固形剤；徐放性カプセル剤；及び現在使用されている任意の他の剤形が挙げられる。

特定の実施態様では、リポソーム及び／又はナノ粒子の使用が、抗体の宿主細胞への導入のために考えられる。リポソーム及び／又はナノ粒子の形成及び使用は当業者には公知である。

ナノカプセルは、一般的に、安定かつ再現性のある方法で化合物を封入することができる。細胞内へのポリマーの過剰負荷に起因する副作用を避けるために、このような超微細粒子（サイズは約０．１μm）は一般的に、インビボで分解されることのできるポリマーを使用して設計される。これらの必要条件を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリル酸ナノ粒子が、本発明における使用に考えられ、このような粒子は容易に作製され得る。

リポソームは、水性媒体に分散して自発的に多重ラメラ同心状二層小胞（多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）とも称される）を形成する、リン脂質から形成される。ＭＬＶは一般的に、２５nm〜４μmの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理により、コアに水溶液を含有する、２００〜５００Åの範囲内の直径を有する小型単ラメラ小胞（ＳＵＶ）が形成される。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度、及び二価陽イオンの存在に依存する。

キット：
最後に、本発明はまた、本発明の少なくとも１つの抗体を含むキットを提供する。本発明の抗体を含有するキットは、ＨＥＲ３発現の検出に、又は治療アッセイ若しくは診断アッセイに用途を見出す。本発明のキットは、固相支持体、例えば組織培養プレート又はビーズ（例えばセファロースビーズ）に結合させた抗体を含有し得る。インビトロで、例えばＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロットにおいてＨＥＲ３を検出及び定量するための抗体を含有するキットが提供され得る。検出に有用なこのような抗体は、蛍光標識又は放射標識などの標識と共に与えられ得る。

本発明は、以下の図面及び実施例によってさらに説明されるだろう。しかし、これらの実施例及び図面は、いずれにしても、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

図１は、細胞上のＨＥＲ３受容体への結合についての、９Ｆ７−Ｆ１１モノクローナル抗体とＮＲＧのアロステリックな相互作用を示す。ＨＥＲ３に結合している９Ｆ７−Ｆ１１は、様々な濃度のＮＲＧを加えると、ＳＫＢＲ３細胞上で増加する。これに対して、抗体ＡはＮＲＧの結合によって影響されず、抗体ＢはＮＲＧの結合によって遮断される（パネルＡ）。逆に、ＨＥＲ３へのＮＲＧの結合は、様々な濃度の９Ｆ７−Ｆ１１モノクローナル抗体を加えると、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３でトランスフェクトされた３Ｔ３線維芽細胞上で増加し、一方、関連性のないＩｇＧはＮＲＧの結合に影響を及ぼさない。これに対して、遊離ＮＲＧは、ＨＥＲ３への結合について標識ＮＲＧを置換する（パネルＢ）。 図２は、ＮＲＧの存在下又は非存在下におけるＨＥＲ３受容体に対する９Ｆ７−Ｆ１１の親和性を定量する。ＮＲＧの非存在下で測定された親和性と比べて（２．３３±０．３０nM）、６倍増加した親和性が、ＮＲＧの存在下で測定された（０．４７±０．０７nM）。 図３は、ＢｘＰＣ３膵臓癌細胞において抗ＨＥＲ３モノクローナル抗体の９Ｆ７−Ｆ１１を使用することによる、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３受容体のリン酸化阻害、及び下流のＰＩ３Ｋ／ＡｋｔとＥＲＫのシグナル伝達阻害を示す。 図４は、ウェスタンブロットによって実証され（Ａ）Image Jによって定量された（Ｂ）、ｐ５３／ＭＤＭ２の発現及びリン酸化に対する９Ｆ７−Ｆ１１モノクローナル抗体の効果を示す。 図５は、定量ＰＣＲによって実証された、ｐ５３誘導性遺伝子ｐ２１、Ｃｙｃｌｉｎ Ａ２、ＰＥＲＰ、Ｐｕｍａ、及びＢｃｌ−２の発現に対する９Ｆ７−Ｆ１１モノクローナル抗体の効果を示す。相対的なｍＲＮＡ発現は、ＧＡＰＤＨ発現に対して標準化された。 図６は、ＢｘＰＣ３膵臓癌細胞の細胞周期停止に対する９Ｆ７−Ｆ１１モノクローナル抗体の効果を示す。 図７は、ＢｘＰＣ３膵臓癌細胞のアポトーシスに対する９Ｆ７−Ｆ１１モノクローナル抗体の効果を示す（Ａ）。ミトコンドリアのアポトーシスを開始するカスパーゼ−９の開裂が、９Ｆ７−Ｆ１１で処置されたＢｘＰＣ３細胞の細胞溶解液のウェスタンブロットによって実証される（Ｂ）。 図８は、トラスツズマブ又はセツキシマブ単独で観察された効果と比較して、単独で又はセツキシマブ若しくはトラスツズマブと組み合わせた、９Ｆ７−Ｆ１１モノクローナル抗体の、ＢｘＰＣ３膵臓癌細胞の増殖に対する効果を示す。 図９は、標的ＭＤＡ−ＭＢ−４５３乳癌細胞に対する９Ｆ７−Ｆ１１モノクローナル抗体対トラスツズマブのＡＤＣＣ作用を示す。 図１０は、ＨＥＲ２の増幅した／ＰＩＫ３ＣＡ−ｍｕｔのＭＤＡ−ＭＢ−３６１乳癌細胞を異種移植されたヌードマウスにおける、９Ｆ７−Ｆ１１モノクローナル抗体による腫瘍進行の阻止を示す。 図１１は、三種陰性ＰＴＥＮ−ｍｕｔ／ｐ５３−ｍｕｔのＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌細胞を異種移植されたヌードマウスにおける、９Ｆ７−Ｆ１１モノクローナル抗体による腫瘍進行の阻止を示す（Ａ）。カプランマイヤー生存曲線を、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８腫瘍が２０００mm³の体積に達した場合に計算した（Ｂ）。 図１２は、ＮＲＧ依存性でｐ５３−ｍｕｔでＨＥＲ２^lowのＢｘＰＣ３膵臓癌細胞を異種移植され、単独で（９Ｆ７）又はペルツズマブと組み合わせて（Ｐ＋９Ｆ７）使用された９Ｆ７−Ｆ１１モノクローナル抗体を用いて処置された、ヌードマウスの腫瘍進行及び生存期間を、ペルツズマブ単独（Ｐ）又はビヒクル（対照）（パネルＡ）及びトラスツズマブとペルツズマブの組合せ（Ｐ＋Ｔ）（パネルＢ）と比較して示す。 図１３は、ｓｈＨＥＲ３−又はｓｈＬｕｃ（対照）−ノックアウトＢｘＰＣ３膵臓癌細胞を異種移植されたヌードマウスにおける９Ｆ７−Ｆ１１モノクローナル抗体による腫瘍進行の阻止を示す（Ａ）。ＨＥＲ３サイレンシングは、処置されたマウスから回収された異種移植片に対するウェスタンブロットによって確認される（Ｂ）。

実施例１：ＨＥＲ３への結合に対する９Ｆ７−Ｆ１１のアロステリック効果
事前にニューレグリンβ１（ＮＲＧ）で刺激してＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体の形成を促進しておいた、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３でトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞株（約２×１０^６個の細胞）を、１匹のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射した。免疫化マウスからの脾臓細胞を、すでに記載されているプロトコールに従って（Salhi et al. Biochem. J. 2004）、骨髄腫ＰＸ６３Ａｇ８．６５３を使用して融合させた。１ウェルあたり１０^５個の融合した細胞を、ハイブリドーマの選択のためのＨＡＴ培地を含むプレート中で培養した。融合から１２日後、ハイブリドーマ上清のスクリーニングを、抗原としてタンパク質ＨＥＲ３−Ｆｃを使用してＥＬＩＳＡによって行なった。対照では、スクリーニングは、識別用の抗原ＨＥＲ２−Ｆｃ及びＦｃ断片のみを用いて同時に行なわれる。

サイトメトリー競合実験を行なって、ＮＲＧが、ＳＫＢＲ３細胞をベースとしたアッセイにおいてＨＥＲ３への抗体の結合を阻害する能力を定量した。この目的を達成するために、１０^５個のＳＫＢＲ３細胞を、様々な濃度の競合ＮＲＧリガンドと共に氷上で１．５時間プレインキュベートした。ＰＢＳ−１％ＢＳＡで１回洗浄した後、最大結合の５０％をもたらす濃度の選択された抗ＨＥＲ３モノクローナル抗体９Ｆ７−Ｆ１１を氷上の各ウェルに１時間加えた。いくつかの実験では、ＮＲＧリガンドと抗ＨＥＲ３抗体の９Ｆ７−Ｆ１１を氷上で２時間かけて共インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、氷上で４５分間かけて１：６０の希釈度の適切なＦＩＴＣにコンジュゲートさせた二次抗体（シグマ社）と共にさらにインキュベートし、その後、Ｑｕａｎｔａ装置（ベックマンコールター社）でのサイトメトリー分析を行なった。ＦＡＣＳによる競合実験は、９Ｆ７−Ｆ１１抗体がＮＲＧと競合しないことを実証し、よって、この抗体はＮＲＧ結合部位に結合しなかったことを示唆する（図１Ａ）。ＮＲＧに非競合的な９Ｆ７−Ｆ１１抗体の結合は、ＮＲＧを添加した場合には１６０％まで増強さえされ、よって、ＨＥＲ３への結合に関する９Ｆ７−Ｆ１１モノクローナル抗体のアロステリック効果が実証された。これに対して、陽性対照の抗体Ａの結合は、ＮＲＧとのインキュベーションによって改変されず、陽性対照の抗体Ｂは、ＮＲＧ依存性の結合を示した（図１Ａ）。

逆に、１０^５個のＨＥＲ３でトランスフェクトされた３Ｔ３線維芽細胞を２日間培養し、その後、飢餓状態とさせ、その後、様々な濃度の９Ｆ７−Ｆ１１モノクローナル抗体と共にＫＲＥＢＳ緩衝液中で＋４℃で４５分間インキュベートした。ｄ２クリプテート色素で標識されたＮＲＧをさらに４５分間加えた。ＫＲＥＢＳによる洗浄後、６２０／６７０nmでの蛍光を、Pherastarマイクロプレートリーダーを使用して測定した。図１Ｂに実証されているように、９Ｆ７−Ｆ１１の結合は、ＨＥＲ３へのＮＲＧの結合の増加を誘導し、一方、関連性のないＩｇＧは誘導しなかった。対照としての、様々な濃度の遊離ＮＲＧは、ＨＥＲ３受容体への標識ＮＲＧの結合を置換し（図１Ｂ）、したがって、ＨＥＲ３への結合について９Ｆ７−Ｆ１１とＮＲＧとの間のアロステリックな相互作用が実証された。

実施例２：ＮＲＧの添加は、ＨＥＲ３受容体に対する９Ｆ７−Ｆ１１の親和性の６倍増加を誘導する
CisBio BioAssay社によって開発されたTag-Lite技術を使用して、１０^４個のＨＥＲ３のＳＮＡＰタグ化されたＨＥＫ細胞を、Ｌｕｍｉ４−テルビウムクリプテートドナーで標識し、その後、ＮＲＧ及び様々な濃度のｄ２アクセプター標識９Ｆ７−Ｆ１１モノクローナル抗体と共インキュベートした。１６時間のインキュベート後、Ｌｕｍｉ４−テルビウム及びｄ２の蛍光を、Pherastar FS機器で３３７nmでの励起時にそれぞれ６２０nm及び６６５nm（６０μ秒間の時間差、４００μ秒間の積分時間）で測定した。図２に実証されているように、ＮＲＧの存在下では、ＨＥＲ３受容体に対する９Ｆ７−Ｆ１１の用量依存的な結合の増加が、ＮＲＧの非存在下で測定された低いＨＥＲ３への結合と比較して観察された。ＨＥＲ３に対する９Ｆ７−Ｆ１１の結合のＫ_ｄ値は、ＮＲＧとの共インキュベート後では０．４７±０．０７nMであると計算され、一方、Ｋ_ｄは、ＮＲＧの非存在下では２．３３±０．３０nmであると測定され、したがって、ＮＲＧの添加は、ＨＥＲ３受容体に対する９Ｆ７−Ｆ１１の親和性の６倍増加をアロステリック的に誘導したことを実証した。

実施例３：ＮＲＧに非競合的でアロステリックな抗ＨＥＲ３抗体の９Ｆ７−Ｆ１１は、ＥＲＫ１／２及びＡＫＴのリン酸化の遮断と共に、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３のリン酸化を阻害する
５００個及び１，０００個のＢｘＰＣ３膵臓腫瘍細胞を６ウェル培養プレートの各ウェルに３７℃で２４時間加えた。１％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ完全培地中で１６時間かけて血清を飢餓状態とし、さらに洗浄した後、細胞を、５０μg/mlの濃度の９Ｆ７−Ｆ１１抗体、又は陰性対照抗体と共に３７℃で１５分間又は１時間プレインキュベートし、その後、洗浄し、続いて、１００ng/mlのＮＲＧ希釈液を用いて刺激したか又は刺激しなかった。その後、細胞を洗浄し、剥がし、２０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０mM ＮａＣｌ、１．５mM ＭｇＣｌ_２、１mM ＥＤＴＡ、１％トリトン、１０％グリセロール、０．１mMフェニルメチルスルホニルクロリド、１００mMフッ化ナトリウム、１mMオルトバナジン酸ナトリウムを含有する緩衝液（シグマ・アルドリッチ社）、及び１つのコンプリートプロテアーゼインヒビター混合物タブレット（ロシュダイアグノスティックス社、インディアナポリス、ＩＮ）を用いて溶解した。３０分間のインキュベート時間後、試料から遠心分離によって不溶性画分を除去し、細胞溶解液中のタンパク質濃度をブラッドフォードアッセイによって決定した。これらのタンパク質溶解液を、Laemmli緩衝液と直接混合し（標的及び細胞株に応じて合計して１〜２０μgのタンパク質）、９５℃で５分間加熱した。還元条件下での７％ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの電気泳動後、タンパク質をポリビニリデンジフルオライド膜（ミリポア社）に転写し、これをその後、５％無脂肪ドライミルクを含有するＴＮＴ緩衝液（トリス２５mM ｐＨ７．４、ＮａＣｌ １５０mM、Ｔｗｅｅｎ０．１％）中で２５℃で１時間かけて飽和させた。キナーゼ受容体又はシグナル伝達キナーゼ、及びそのリン酸化形に指向された一次抗体を、ＴＮＴ−５％ＢＳＡ緩衝液中で４℃で１８時間インキュベートした。ＴＮＴ緩衝液中で５回洗浄した後、ペルオキシダーゼにコンジュゲートさせたウサギ、ヤギ、又はマウスポリクローナル抗体（シグマ−アルドリッチ社）を適宜、５％無脂肪ドライミルクを含有するＴＮＴ緩衝液に２５℃で１時間加えた。ＴＮＴ緩衝液で５回洗浄した後、ブロットを、化学発光基質（Western lightning Plus-ECL、パーキンエルマー社）を使用して可視化した。

顕著なことには、９Ｆ７−Ｆ１１抗体は、Ｙ１２８９−ＨＥＲ３及びＹ１２４２−ＨＥＲ２上でのリガンドにより誘導されるリン酸化を遮断した（図３）。同時に、アロステリックで非競合的な９Ｆ７−Ｆ１１抗体は、Ｓｅｒ４７３上でのＡｋｔリン酸化の阻害、及び、Ｔｈｒ２０２／２０４上でのＥＲＫ１／２リン酸化の阻害を誘導した。

実施例４：ＮＲＧに非競合的でアロステリックな抗ＨＥＲ３抗体の９Ｆ７−Ｆ１１は、ｐ５３経路の調節と一緒に、ＭＤＭ２の発現及びリン酸化を阻害する
上記に記載されているのと同様に、ＢｘＰＣ３腫瘍細胞を、６ウェル培養プレートの各ウェルに３７℃で２４時間加えた。１％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ完全培地中で１６時間かけて血清を飢餓状態とし、さらに洗浄した後、細胞を、５０μg/mlの濃度の９Ｆ７−Ｆ１１抗体、又は陰性対照の抗体と共に３７℃で２４時間又は７２時間プレインキュベートし、その後、洗浄し、続いて１００ng/mlのＮＲＧ希釈液を用いて刺激したか又は刺激しなかった。続いて、細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットのために溶解するか、又は、ＲＮＡの抽出、逆転写、及び適切なプライマーを使用した定量ＰＣＲにかけた。ウェスタンブロットによって図４に実証されているように、９Ｆ７−Ｆ１１による処置は、ＭＤＭ２の発現及びリン酸化を阻害し、ｐ５３の発現を増加させた。これに関連して、９Ｆ７−Ｆ１１による処置は、Ｑ−ＰＣＲ（図５）によって実証されているように、細胞周期及び増殖の遮断に関与するｐ２１などのｐ５３誘導性遺伝子の発現、並びに、アポトーシスをプラスに調節するＰｕｍａ及びＰＥＲＰを増加させた。これに対して、それぞれ増殖を促進し、アポトーシスを阻害する、ＣｙｃｌｉｎＡ２及びＢｃｌ２遺伝子の発現は、ＮＲＧに非競合的でアロステリックな９Ｆ７−Ｆ１１抗体による処置後に減少した（図５）。

実施例５：ＮＲＧに非競合的でアロステリックな抗ＨＥＲ３抗体の９Ｆ７−Ｆ１１は、細胞周期のＧ１期を遮断し、増殖を阻害し、アポトーシスを回復させる
細胞周期に対するＨＥＲ３特異的抗体の９Ｆ７−Ｆ１１の効果を、ヨウ化プロピジウムによる染色を使用して評価した。簡潔には、ウェルあたり３００，０００個のＢｘＰＣ３腫瘍細胞を、６ウェルマイクロタイタープレート中で２４時間培養し、その後、血清を飢餓状態とさせ、ＦＣＳを含まないＲＰＭＩ培地中でさらに２４時間かけて同期化し、その後、１００μg/mlの抗ＨＥＲ３抗体の９Ｆ７−Ｆ１１及び１００ng/mlのＮＲＧと共インキュベートした。透過処理した細胞をヨウ化プロピジウムを用いて２４時間後に染色し、その後、サイトメトリー分析を行なった。増殖及びアポトーシスアッセイのために、５０，０００個のＢｘＰＣ細胞／ウェルを飢餓の１日前に播種した（ＲＰＭＩ−１％ＦＣＳ中）。その後、ＨＥＲ３特異的抗体の９Ｆ７−Ｆ１１及びＮＲＧを１２０時間加えた。細胞増殖を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８にコンジュゲートさせた５−エチニル−２’−デオキシウリジン（ＥｄＵ）（インビトロジェン社）を培養の最後の３０時間の間に取り込むことによって測定した。細胞のアポトーシスを、蛍光にコンジュゲートさせたアネキシンＶ及び７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ；ベックマンコールター社）とのインキュベートによって評価した。全ての実験を三回行なった。カスパーゼ−９の分析のために、ＢｘＰＣ３細胞を上記のように処置し、溶解させた。細胞溶解液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットの後、プロ酵素の開裂を通したカスパーゼ−９の活性化を、適切な抗体を使用して証明した。図６に示されているように、アロステリックな９Ｆ７−Ｆ１１抗体の２４時間の処置により、細胞周期のＧ１期は遮断され、Ｇ１細胞は、未処置の細胞又は対照の抗体で処置された細胞についての３６〜３８％から、９Ｆ７−Ｆ１１で処置されたＢｘＰＣ３細胞についての６２％まで増加した。９Ｆ７−Ｆ１１による処置は同時に、Ｓ期及びＧ２／ｍ期のＢｘＰＣ３細胞の比率を低下させた（図６）。９Ｆ７−Ｆ１１モノクローナル抗体を用いてのＢｘＰＣ３細胞の処置は、未処置の細胞及び対照抗体で処置された細胞と比較して（図７Ａ）、初期（１８％）及び後期（１２％）アポトーシスを増加させ、同時にミトコンドリアのアポトーシスを開始するプロ−カスパーゼ−９を開裂した（図７Ｂ）。最後に、ＢｘＰＣの細胞増殖は、９Ｆ７−Ｆ１１抗体を用いての１２０時間かけての処置後に阻害された。ＨＥＲ２^lowＢｘＰＣ３細胞に対して抗ＨＥＲ２抗体のトラスツズマブを単独で用いても細胞増殖に対する特異的な効果は観察されず、一方、抗ＥＧＦＲ抗体のセツキシマブは、抗ＨＥＲ３抗体の９Ｆ７−Ｆ１１よりも効果が低かった（図８）。これに対して、９Ｆ７−Ｆ１１モノクローナル抗体とトラスツズマブの組合せは、９Ｆ７−Ｆ１１／セツキシマブの組合せよりも細胞増殖を阻害する上でより効果的であり、このことは、ＨＥＲ２^low腫瘍細胞に対してセツキシマブ／９Ｆ７−Ｆ１１の組合せが相加作用であるのに対して、トラスツズマブ／９Ｆ７−Ｆ１１の組合せが相乗作用である可能性を示唆する。要するに、これらの結果は、ＮＲＧに非競合的でアロステリックな抗ＨＥＲ３抗体の９Ｆ７−Ｆ１１は、細胞周期のＧ１期を遮断し、プロ−カスパーゼ−９の開裂を通して初期及び後期のミトコンドリアのアポトーシスを回復させ、腫瘍細胞の増殖を阻害することを実証した。この場合、９Ｆ７−Ｆ１１モノクローナル抗体と抗ＨＥＲ２抗体の組合せは、ＨＥＲ２^low腫瘍において大きな利点があり得る。

実施例６：ＮＲＧに非競合的でアロステリックな抗ＨＥＲ３抗体の９Ｆ７−Ｆ１１は、乳癌細胞の抗体依存性細胞障害を誘導する
basal-like型の三種陰性乳癌から得られた、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３腫瘍標的細胞を、ＡＤＣＣアッセイの１日前に平底９６ウェルマイクロプレートにウェルあたり２０，０００個播種した。ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞株は、約１８０，０００個のＨＥＲ２受容体及び２１，０００個のＨＥＲ３受容体を発現するが、ＥＧＦＲの発現は全く観察されない。培養培地で洗浄した後、１０μg/mlの９Ｆ７−Ｆ１１モノクローナル抗体を３０分間の間に加え、その後、末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）から得られたエフェクター細胞を添加した。ＰＢＭＣを、「フランス血液研究所（Etablissement Francais du Sang）」で入手した健康なドナーの血液試料の密度勾配遠心分離によって調製した。エフェクター細胞／標的細胞（Ｅ／Ｔ）を、加湿細胞インキュベーター中で１５／１のＥ／Ｔ比で２４時間インキュベートした。ＭＤＡ−ＭＢ−４５３標的細胞の殺滅を、細胞障害性検出キット（ＬＤＨ検出キット；プロメガＧ−１７８０）を使用して製造業者の説明書に従って、傷害を受けた細胞からの乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＬ）の放出を測定することによって評価した。簡潔には、細胞上清 ５０μlを、新たな平底９６ウェルマイクロプレートに注意深く移し、キットのＬＤＨ反応混合物（５０μl／ウェル）を各ウェルに加えた。３７℃で３０分間インキュベートした後、停止溶液（キット内にある）５０μlを加え、４９０nmでの吸光度を測定した。各実験において以下の対照を作った：ＰＢＭＣのみ、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３標的細胞のみ（自然発生的なＬＤＨの放出）、ＰＢＭＣと標的細胞（抗体依存的な自然発生的な放出）、溶解緩衝液と標的細胞（最大のＬＤＨの放出）、抗体とＰＢＭＣ、抗体と標的細胞。各試料の特異的溶解率を、以下の式を使用して決定した：特異的溶解率＝（試料の値−自然発生的な放出）／（最大放出−自然発生的な放出）×１００。図９に示されているように、９Ｆ７−Ｆ１１抗体は、健康ドナー１及び２に由来するＰＢＭＣを使用してＭＤＡ−ＭＢ−４５３乳癌細胞の５〜１０％の特異的細胞溶解を誘導した。同じ実験で、陽性対照のトラスツズマブは、ＭＡＤ−ＭＢ−４５３がＨＥＲ３受容体よりも１０倍多くのＨＥＲ２受容体を発現しているという事実に起因して、約４０％の溶解を誘導した。

実施例７：ＨＥＲ２の増幅したＭＤＡ−ＭＢ−３６１乳癌及び三種陰性ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌を異種移植されたマウスにおける、９Ｆ７−Ｆ１１の単独療法
無胸腺の６〜８週令の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Janvier及びチャールズリバーラボラトリーズから購入した。ＨＥＲ２の増幅した／ＰＩＫ３ＣＡ−ｍｕｔの乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ３６１（１０×１０^６個）及びＨＥＲの増幅していない／ＰＴＥＮ−ｍｕｔ／ｐ５３−ｍｕｔ／ＥＲ−／ＰＲ−の三種陰性乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（３．５×１０^６個）を、無胸腺ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの右腹側部に皮下注射した。それらは両方共に低いレベルでＨＥＲ３受容体を発現していた（約１０，０００個の受容体／細胞）。全てのインビボでの実験は、実験動物の研究のためのフランスの指針を遵守して行なわれた（同意番号第Ｂ３４−１７２−２７）。

腫瘍を有するマウスを、腫瘍が約１００mm³の体積に達したときに、異なる処置群に無作為に分類した。マウスを、ＨＥＲ３特異的９Ｆ７−Ｆ１１抗体対ビヒクル（ＰＢＳ）の腹腔内注射によって処置した。注射された抗体の量は、１回の注射につき３００μg（１５mg/kg）を１週間に３回、６週間連続であった（Ｑ２Ｄ−６Ｗ）。腫瘍の寸法を週２回キャリパーを用いて測定し、体積を式Ｄ１×Ｄ２×Ｄ３／２によって計算した。腫瘍の進行を、式［（最終体積）−（最初の体積）］／（最初の体積）を使用して計算した。結果は、腫瘍が２，０００mm³と決定された最終体積に達するのに要する時間を使用して、カプランマイヤー生存曲線によっても表現された。時間差の中央値は、マウスの５０％が決定された体積に達した腫瘍を有する時間として定義された。

図１０に示されているように、本発明者らは、ビヒクルで処置されたマウスにおいて測定された平均腫瘍サイズと比較して、腫瘍の移植から５５日後（抗体による処置の終了日に相当する；４０日後）に９Ｆ７−Ｆ１１で処置されたマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−３６１腫瘍増殖の有意な４７±５％の減少を観察した（ｐ＜０．００１）。実験終了時（９７日後）、より少ないが有意な２１±２％の腫瘍サイズの減少が９Ｆ７−Ｆ１１処置群において観察され、これはおそらく９Ｆ７−１１による処置が５７日後以降中止されたためであった。

図１１Ａに示されているように、平均腫瘍体積は、対照（ビヒクル）よりも、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を異種移植された９Ｆ７−Ｆ１１で処置されたマウスにおいて有意に低かった（９Ｆ７−Ｆ１１による処置後、異種移植から１０５日後に３５％の体積の減少）。９Ｆ７−Ｆ１１抗体による処置は、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を異種移植された動物において、５０％生存期間中央値を２０日間遅延させた（実験終了時にすなわち１９０日後に９Ｆ７−Ｆ１１処置群の一匹のマウスが安定化された；ｐ＜０．０５）。要するに、これらの結果は、ＮＲＧに非競合的でアロステリックな抗ＨＥＲ３抗体の９Ｆ７−Ｆ１１は、ＨＥＲ２の増幅した乳癌細胞株又は三種陰性の乳癌細胞株のいずれかを異種移植されたマウスにおける腫瘍増殖を遅延させた。

実施例８：ＮＲＧ依存性のＢｘＰＣ３膵臓癌を異種移植されたマウスにおける、ペルツズマブと９Ｆ７−Ｆ１１の併用療法
本発明者らは以前に、治療用抗体のトラスツズマブと他の標的化療法との組合せが、ＨＥＲ２発現の低い膵臓癌に対して相乗作用を示したことを実証した（Larbouret, 2007, 2010）。本発明者らは今回、ＨＥＲ２^low膵臓癌においてアロステリックな抗ＨＥＲ３抗体の９Ｆ７−Ｆ１１と抗ＨＥＲ２抗体のペルツズマブの併用療法を評価した。６週令の雌の無胸腺マウスの右腹側部に、ニューレグリンを分泌するＨＥＲ２^lowＢｘＰＣ−３膵臓細胞（４．５×１０^６個）（ＮＲＧ依存性）を皮下注射した。腫瘍を有するマウスを、腫瘍が１００mm³の体積に達した場合に異なる処置群に無作為に分類し（少なくとも６匹の動物／群）、その後、２又は１０mg/kgのペルツズマブ、１０mg/kgの９Ｆ７−Ｆ１１、又はペルツズマブと９Ｆ７−Ｆ１１の組合せ（１０mg/kgの各々のモノクローナル抗体）で処置した。抗体を週２回４週間かけて（Ｑ３Ｄ−４Ｗ）腹腔内（i.p.）に投与した。腫瘍の体積を式：Ｄ_１×Ｄ_２×Ｄ_３／２によって計算した。生存期間の比較のために、腫瘍が１０００mm³の体積に達した場合に屠殺した。

どちらの抗体も単独で、非処置群と比較して腫瘍増殖を顕著に緩徐化させ（ｐ＜０．００１）、抗ＨＥＲ３抗体の９Ｆ７−Ｆ１１とペルツズマブとの間に有意差は観察されなかった（ｐ＝０．６４８８）（図１２Ａ）。５０％生存期間中央値は、対照と比較して、９Ｆ７−Ｆ１１で処置されたマウスにおいては１７日間、及び、ペルツズマブで処置されたマウスにおいては２３日間、有意に遅延された（図１２Ａ）。さらに、９Ｆ７−Ｆ１１とペルツズマブを用いた共処置は、それぞれの単独の抗体よりも腫瘍増殖をはるかに阻害した（ペルツズマブ対９Ｆ７−Ｆ１１／ペルツズマブ；ｐ＝０．００４）。４週間の処置終了時に、腫瘍体積は、９Ｆ７−Ｆ１１又はペルツズマブを単独で処置されたマウスにおいては増加し続けたが、９Ｆ７−Ｆ１１／ペルツズマブの組合せを受けた動物では依然として極めて安定であった（図１２Ａ）。生存期間中央値は、対照動物（４２日後のを得る；ｐ＝０．０００１）又は単一の抗体を受けたマウスよりも、２つの抗体の組合せで処置された動物の方が長かった（９Ｆ７−Ｆ１１／ペルツズマブ対９Ｆ７−Ｆ１１ ｐ＝０．００１３；９Ｆ７−Ｆ１１／ペルツズマブ対ペルツズマブ ｐ＝０．０３５５）（図１２Ａ）。最後に、抗ＨＥＲ３抗体の９Ｆ７−Ｆ１１とペルツズマブの組合せは、ペルツズマブ／トラスツズマブの組合せよりも顕著により効果的であり、平均生存期間は、ペルツズマブ／トラスツズマブで処置された動物（１３日間）よりも、９Ｆ７−Ｆ１１／ペルツズマブで処置された動物（４２日間）の方が長かった（図１２Ｂ）。要するに、これらの結果は、ＮＲＧに非競合的でアロステリックな抗ＨＥＲ３抗体の９Ｆ７−Ｆ１１と抗ＨＥＲ２抗体のペルツズマブを使用した併用療法は、２つのＨＥＲ２特異的抗体を使用した併用療法よりも、ＨＥＲ２^low腫瘍に対してより効果的であることを実証した。

実施例９：ＨＥＲ３のノックアウトは、ＮＲＧ依存性のＢｘＰＣ３膵臓癌を異種移植されたマウスにおいて、９Ｆ７−Ｆ１１のインビボでの効力を消失させる
Lee-Hoeflich et al.（2008）の研究に基づいて、２つの短いヘアピンオリゴヌクレオチドを、サポートする材料及び方法に記載のとおり、ＨＥＲ３のｍＲＮＡレベルをノックダウンさせるために選択した。対照ベクター（ｓｈＣＴＲＬ）ｐＳＩＲＥＮ−ｓｈＬｕｃはL. Le Camによって親切にも提供され、これは以前に記載されていた（Le Cam et al., 2006）。次いで、ピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ耐性遺伝子を含有する、ｐＳＩＲＥＮ−ｓｈＨＥＲ３及びｐＳＩＲＥＮ−ｓｈＬｕｃを、両種指向性パッケージング細胞株ＡｍｐｈｏＰａｃｋ−２９３（クロンテック社）にトランスフェクトした。２日後、複製欠損ウイルス粒子を含有する上清を回収し、これを使用してＢｘＰＣ３細胞に感染させた。抗生物質による選択（１０μg/mlのピューロマイシン）を２日後に開始した。選択から７日後に、細胞をサブクローニングし、内因性ＨＥＲ３タンパク質発現の欠落に基づいて選択した。Harlan（Le Malcourlet、フランス）から購入した６週令の雌の無胸腺マウスの右腹側部に、上記のような親ｓｈＨＥＲ３ ＢｘＰＣ−３細胞（３．５×１０^６個）又は対照ｓｈＬｕｃ ＢｘＰＣ−３細胞（４．５×１０^６個）を皮下注射した。腫瘍を有するマウスを、腫瘍が１００mm³の体積に達した場合に異なる処置群に無作為に分類し（少なくとも６匹の動物／群）、その後、１０mg/kgの９Ｆ７−Ｆ１１を用いて週２回４週間かけて（Ｑ３Ｄ−４Ｗ）腹腔内に処置した。

ＨＥＲ３の発現と９Ｆ７−Ｆ１１の治療効力との間の関係をインビボで確認するために、マウスに、ｓｈＨＥＲ３ ＢｘＰＣ−３細胞又はｓｈＣＴＲＬ ＢｘＰＣ−３細胞を異種移植した（図１３Ａ）。本発明者らのインビトロでのデータと一致して、ＮＲＧに非競合的でアロステリックな抗ＨＥＲ３抗体の９Ｆ７−Ｆ１１は、未処置の対照と比較して、ｓｈＣＴＲＬ ＢｘＰＣ−３腫瘍異種移植片の増殖を有意に阻害した（ｐ＜０．０００１及びｐ＝０．００１５）（図１３Ａ）。これに対して、未処置の対照と比較して、ｓｈＨＥＲ３ ＢｘＰＣ−３癌細胞を異種移植され、９Ｆ７−Ｆ１１抗体で処置されたマウスにおいては、有意な腫瘍増殖の退縮は全く観察されなかった（図１３Ａ）。実験終了時に、ＨＥＲ３の発現は依然として、処置されたマウスから単離されたｓｈＨＥＲ３ ＢｘＰＣ−３腫瘍異種移植片においてサイレンス状態であった（図１３Ｂ）。これらの結果は、インビボでのＨＥＲ３のノックダウンが、ＮＲＧに非競合的でアロステリックな抗ＨＥＲ３抗体の９Ｆ７−Ｆ１１の治療効力を消失させることを示す。

参考文献：
本出願全体を通して、様々な参考文献が、本発明が属する技術分野の最新技術を記載している。これらの参考文献の開示は、本開示への参照により本明細書に組み入れられる。

Claims (10)

1. −配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び
   −配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
   を含む、ニューレグリンに対して非競合的でアロステリックな抗ヒトＨＥＲ３抗体。
2. キメラ抗体である、請求項１記載の抗体。
3. ヒト化抗体である、請求項１記載の抗体。
4. Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’） ^２ 、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、及びダイアボディからなる群より選択される、請求項１記載の抗体の断片。
5. 請求項１記載の抗体又は請求項４記載の断片をコードする核酸。
6. 請求項５記載の核酸を含むベクター。
7. 請求項５記載の核酸又は請求項６記載のベクターを含む宿主細胞。
8. 請求項１記載の抗体又は請求項４記載のその断片を含む医薬組成物。
9. 癌の処置に用いるための請求項８記載の医薬組成物。
10. 癌の診断に用いるための請求項８記載の医薬組成物。