JP7116736B2 - 操作されたヘテロ二量体タンパク質 - Google Patents

Description

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出している配列表を含み、この配列表全体が参照より本明細書に組み込まれる。前記ＡＳＣＩＩコピー（２０１８年２月２０日に作成した）は、名称がＰＡＴ０５７５０５－ＷＯ－ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズが２０１，７３７バイトである。

本発明は、正しい重鎖及び軽鎖の対形成を促進する改変を含むヘテロ二量体抗体及びその断片、ならびにこれらの調製方法に関する。

ヒト疾患の治療薬としてのヘテロ二量体抗体（特に、二重特異性抗体）の投与は、大きな臨床的可能性があるが、ヘテロ二量体抗体の頑強な生成（特に、純粋で開発可能なヘテロ二量体抗体の製造）は依然として困難である。抗体の重鎖は無差別に抗体の軽鎖に結合し、その結果、所与の重鎖が、ラムダ軽鎖クラスとカッパ軽鎖クラスとの両方の多くの軽鎖配列と対形成する可能性がある（Ｅｄｗａｒｄｓ ＢＭ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３４：１０３－１８）。これまでの研究では、重鎖と軽鎖との対形成が無作為に生じることが示されている（Ｂｒｅｚｉｎｓｃｈｅｋ ＨＰ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：４７６２－７）。この結合の結果として、２本の抗体重鎖と２本の抗体軽鎖の同時発現により、重鎖－軽鎖の対形成の混乱が自然と生じるが、製造可能性及び生物学的有効性にとっては、均一な対形成が必須の要件である。ヘテロ二量体抗体形式（例えば、ＤＶＤ－Ｉｇ（Ｗｕ Ｃ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１１）：１２９０－７），ＣｒｏｓｓＭａｂ（Ｓｃｈａｅｆｅｒ Ｗ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）ＰＮＡＳ １０８（２７）：１１１８７－９２），又は「２イン１」抗体（‘ｔｗｏ－ｉｎ－ｏｎｅ’ ａｎｔｉｂｏｄｙ）（Ｂｏｓｔｒｏｍ Ｊ ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２３（５９２１）：１６１０－４））は、二重特異性抗体の製造を可能にするが、ライアビリティ（ｌｉａｂｉｌｉｔｙ）が異なる。

これらの近年の開発もかかわらず、当分野では、重鎖及び軽鎖が正しく対形成している、改善されたヘテロ二量体抗体形式と、この均一な対形成を達成して、誤対形成された夾雑物の生成を回避する方法との必要性が依然として存在する。

本発明では、ヘテロ二量体抗体の重鎖及び軽鎖の対形成を改善するために、静電気的操縦機構（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｓｔｅｅｒｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）を適用して、抗体及び抗体断片のサブセットの重鎖及び軽鎖を操作した。界面残基を、２種の異なる重鎖と２種の異なる軽鎖とを同一の細胞中で共トランスフェクトさせて共発現させ、機能するヘテロ二量体の二重特異性抗体を構築した場合に、各軽鎖がその同種の重鎖を強く支持するように変異させた。

重鎖－軽鎖の対形成の操作の設計戦略には、代表的なＦａｂを特定することを含めた。代表的なＦａｂの基準は、一般に使用される重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）のサブグループのメンバー（例えば、ＶＨ３、及びＶκ１又はＶλ１）であることであった。電荷操作では、いくつかの基準を考慮した。ＣＤＲへの相互作用接触は最終的には結合の喪失につながる可能性があり、従って回避すべきであることから、選択されたアミノ酸は、立体構造において可変ドメインＣＤＲと接触してはならない。任意の所与のサブファミリのヘテロ二量体を生成し得るためには、最も一般的な抗体ファミリ内で、選択された位置が高度の保存されていなければならない。加えて、ＶＨとＶＬとの界面の中心の位置、及び重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）と軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）との界面の中心の位置を回避して、この界面の縁の位置を選択することにより、これらのドメインの末端で塩架橋を形成し、それにより正しい重鎖－軽鎖形成を閉じる「クリップ効果」を生じさせることにより、ヘテロ二量体形成を強く支持する効果を達成し得た。この「クリップ効果」は、タンパク質を安定化させ、定常ドメインＣＨ１及びＣＬの界面の不安定化を低減するのに役立った。従って、ＶＨドメイン及びＶＬドメインの終わり、ならびにＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインの始まり及び終わりに、荷電残基を導入した。側鎖相互作用に基づく修飾のために残基を選択することとは対照的に、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインの末端での電荷操作のための残基の選択は、それぞれの主鎖間で観察した最大１２Åの距離に基づいた。

一態様では、本発明は、多くのある特定の位置での置換を含む操作されたＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインならびに操作されたＶＬ及びＣＬドメインを含むヘテロ二量体抗体又はその断片を提供する。全ての置換位置のナンバリングは、ＥＵナンバリングに従う。

一実施形態では、本発明は、操作されたＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインであり、３９位、１４７位、及び１６５位で荷電アミノ酸又は中性アミノ酸を含む操作されたＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインと、操作されたＶＬドメイン及びＣＬドメインであり、３８位、１２４位、及び１６９／１７０位（ＥＵナンバリング）で荷電アミノ酸又は中性アミノ酸を含む操作されたＶＬドメイン及びＣＬドメインとを含むヘテロ二量体抗体又はその断片であって、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメイン中の前記アミノ酸と、ＶＬドメイン及びＣＬドメイン中の界面の対応するアミノ酸とは一対で、電荷が相反しているか、又は荷電しており／中性であり、且つヘテロ二量体化に静電気的に有利な界面を形成する、ヘテロ二量体又はその断片を提供する。指定の位置のアミノ酸が適切な電荷（負、正、又は中性／非荷電）であることを確実にするためには、野生型配列中の特定の位置のアミノ酸を、電荷が異なるアミノ酸に置換する必要があるだろう。例えば、野生型配列中のアミノ酸は、中性、塩基性、又は酸性の場合があり、置換により電荷が変化する。より具体的には、中性アミノ酸を塩基性又は酸性のアミノ酸に置換し得、塩基性アミノ酸を中性又は酸性のアミノ酸に置換し得、又は酸性アミノ酸を中性又は塩基性のアミノ酸に置換し得る。

一実施形態では、本ＶＨドメイン中において、３９位の中性アミノ酸グルタミン（Ｑ）を、塩基性又は酸性のアミノ酸に置換し得る。塩基性アミノ酸（正の電荷）の例として、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、又はヒスチジン（Ｈ）が挙げられ、酸性アミノ酸（負の電荷）の例として、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）が挙げられる。具体的には、これは、ＱからＲ、Ｋ、又はＤへの置換である。本ＣＨ１ドメイン中において、１４７位の塩基性アミノ酸Ｋは、変化しないままであってもよいし（即ち、正の電荷を有する）、中性又は酸性のアミノ酸に置換されていてもよい。具体的には、この置換は酸性アミノ酸に対するものであり、ＫからＤへの置換である。加えて、１６５位の中性アミノ酸セリン（Ｓ）は、変化しないままであってもよいし（即ち、中性である）、塩基性又は酸性のアミノ酸に置換されていてもよい。具体的には、これはＳからＲ又はＤへの置換である。一実施形態では、本ＶＨドメインは、ＶＨ１サブファミリ、ＶＨ２サブファミリ、ＶＨ３サブファミリ、ＶＨ５サブファミリ、又はＶＨ６サブファミリに由来する。特定の実施形態では、本ＶＨドメインはＶＨ３サブファミリに由来する。

軽鎖がカッパ（κ）サブタイプ由来である一実施形態では、本ＶＬドメイン中において、３８位の中性アミノ酸Ｑは、塩基性又は酸性のアミノ酸に置換され得る。塩基性アミノ酸の例として、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、又はヒスチジン（Ｈ）が挙げられ、酸性アミノ酸の例として、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）が挙げられる。具体的には、これは、ＱからＲ、Ｋ、又はＤへの置換である。本ＣＬドメイン中において、１２４位の中性アミノ酸Ｑは、変化しないままであってもよいし（即ち、中性である）、塩基性又は酸性のアミノ酸に置換されていてもよい。具体的には、これはＱからＫ又はＤへの置換である。加えて、１６９位での塩基性アミノ酸Ｋは、変化しないままであってもよいし（即ち、正の電荷を有する）、中性又は酸性のアミノ酸に置換されていてもよく、具体的には、この置換は酸性アミノ酸に対してであり、ＫからＤへの置換である。一実施形態では、このカッパ軽鎖は、Ｖκ１サブファミリ又はＶκ３サブファミリに由来する。

軽鎖がラムダ（λ）サブタイプ由来である一実施形態では、本ＶＬドメイン中において、３８位の中性アミノ酸Ｑは、塩基性又は酸性のアミノ酸に置換され得る。塩基性アミノ酸の例として、アルギニン（Ｒ）、ロイシン（Ｋ）、又はヒスチジン（Ｈ）が挙げられ、酸性アミノ酸の例として、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）が挙げられる。具体的には、この置換は塩基性アミノ酸に対してであり、ＱからＫへの置換である。本ＣＬドメイン中において、１２４位の酸性アミノ酸Ｅは、中性、塩基性、又は別の酸性アミノ酸に置換され得る。具体的には、この置換は別の酸性アミノ酸に対してであり、ＥからＤへの置換である。加えて、１７０位の中性アミノ酸Ｎは、変化しないままであってもよいし（即ち、中性である）、塩基性又は酸性のアミノ酸に置換されていてもよい。具体的には、この置換は塩基性アミノ酸に対してであり、ＮからＫへ、又はＮからＲへの置換である。一実施形態では、このラムダ軽鎖は、Ｖλ１サブファミリ、Ｖλ２サブファミリ、又はＶλ３サブファミリに由来する。

一実施形態では、本操作されたＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインは、３９位、１４７位、及び１６５位で荷電アミノ酸又は中性アミノ酸を含み得、本操作されたＶＬドメイン及びＣＬドメインは、界面の対応する３８位、１２４位、及び１６９／１７０位（ＥＵナンバリング）で荷電アミノ酸又は中性アミノ酸を含み得る。従って、本発明は、操作されたＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインと、操作されたＶＬドメイン及びＣＬドメインとを有するヘテロ二量体抗体又はその断片であって、
（ｉ）操作されたＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインは、３９位で酸性アミノ酸を含み、１４７位で酸性アミノ酸を含み、且つ１６５位で酸性アミノ酸を含み、操作されたＶＬドメイン及びＣＬドメインは、３８位で塩基性アミノ酸を含み、１２４位で塩基性アミノ酸を含み、且つ１６９／１７０位で塩基性アミノ酸を含む；
（ｉｉ）操作されたＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインは、３９位で塩基性アミノ酸を含み、１４７位で塩基性アミノ酸を含み、且つ１６５位で塩基性アミノ酸を含み、操作されたＶＬドメイン及びＣＬドメインは、３８位で酸性アミノ酸を含み、１２４位で酸性アミノ酸を含み、且つ１６９／１７０位で酸性アミノ酸を含む；
（ｉｉｉ）操作されたＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインは、３９位でアミノ酸を含み得、１４７位で酸性アミノ酸を含み得、且つ１６５位で塩基性アミノ酸を含み得、操作されたＶＬドメイン及びＣＬドメインは、３８位で塩基性アミノ酸を含み得、１２４位で塩基性アミノ酸を含み得、且つ１６９／１７０位で酸性アミノ酸を含み得る；
（ｉｖ）操作されたＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインは、３９位で塩基性アミノ酸を含み得、１４７位で塩基性アミノ酸を含み得、且つ１６５位で酸性アミノ酸を含み得、操作されたＶＬドメイン及びＣＬドメインは、３８位で酸性アミノ酸を含み得、１２４位で酸性アミノ酸を含み得、且つ１６９／１７０位で塩基性アミノ酸を含み得る；
（ｖ）操作されたＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインは、３９位で酸性アミノ酸を含み得、１４７位で塩基性アミノ酸を含み得、且つ１６５位で酸性アミノ酸を含み得、操作されたＶＬドメイン及びＣＬドメインは、３８位で塩基性アミノ酸を含み得、１２４位で酸性アミノ酸を含み得、且つ１６９／１７０位で塩基性アミノ酸を含み得る；
（ｖｉ）操作されたＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインは、３９位で塩基性アミノ酸を含み得、１４７位で酸性アミノ酸を含み得、且つ１６５位で塩基性アミノ酸を含み得、操作されたＶＬドメイン及びＣＬドメインは、３８位で酸性アミノ酸を含み得、１２４位で塩基性アミノ酸を含み得、且つ１６９／１７０位で酸性アミノ酸を含み得る；
（ｖｉｉ）操作されたＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインは、３９位で酸性アミノ酸を含み得、１４７位で塩基性アミノ酸を含み得、且つ１６５位で酸性アミノ酸を含み得、操作されたＶＬドメイン及びＣＬドメインは、３８位で塩基性アミノ酸を含み得、１２４位で酸性アミノ酸を含み得、且つ１６９／１７０位で中性アミノ酸を含み得る；
（ｖｉｉｉ）操作されたＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインは、３９位で塩基性アミノ酸を含み得、１４７位で酸性アミノ酸を含み得、且つ１６５位で中性アミノ酸を含み得、操作されたＶＬドメイン及びＣＬドメインは、３８位で酸性アミノ酸を含み得、１２４位で塩基性アミノ酸を含み得、且つ１６９／１７０位で塩基性アミノ酸を含み得る；
又は
（ｉｘ）操作されたＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインは、３９位で酸性アミノ酸を含み得、１４７位で塩基性アミノ酸を含み得、且つ１６５位で中性アミノ酸を含み得、操作されたＶＬドメイン及びＣＬドメインは、３８位で塩基性アミノ酸を含み得、１２４位で中性アミノ酸を含み得、且つ１６９／１７０位で塩基性アミノ酸を含み得る、
ヘテロ二量体抗体又はその断片を提供する。

一実施形態では、本操作されたＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインは、３９位で塩基性アミノ酸を含み得、１４７位で酸性アミノ酸を含み得、且つ１６５位で中性アミノ酸を含み得、本操作されたＶＬドメイン及びＣＬドメインは、３８位で酸性アミノ酸を含み得、１２４位で塩基性アミノ酸を含み得、且つ１６９位（ＥＵナンバリング）の塩基性アミノ酸を含み得る。あるいは、本操作されたＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインは、３９位で酸性アミノ酸を含み得、１４７位で塩基性アミノ酸を含み得、且つ１６５位で中性アミノ酸を含み得、本操作されたＶＬドメイン及びＣＬドメインは、３８位で塩基性アミノ酸を含み得、１２４位で中性アミノ酸を含み得、且つ１６９位（ＥＵナンバリング）で塩基性アミノ酸を含み得る。あるいは、本操作されたＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインは、３９位で酸性アミノ酸を含み得、１４７位で塩基性アミノ酸を含み得、且つ１６５位で酸性アミノ酸含み得、本操作されたＶＬドメイン及びＣＬドメインは、３８位で塩基性アミノ酸を含み得、１２４位で酸性アミノ酸を含み得、且つ１７０９位（ＥＵナンバリング）で中性アミノ酸を含み得る。

具体的な実施形態では、本発明は、操作されたＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを有するヘテロ二量体抗体又はその断片であって、この操作されたＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインは、３９位、１４７位、及び１６５位（ＥＵナンバリング）で、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、及び酸性アミノ酸をそれぞれ含み、従って、これらの位置でそれぞれ負の電荷、正の電荷、及び負の電荷が生じ、又はその逆も同様である、ヘテロ二量体抗体又はその断片を提供する。対応する操作されたＶＬドメイン及びＣＬドメインは、３８位、１２４位、及び１６９／１７０位（ＥＵナンバリング）で、対応する重鎖の界面のアミノ酸の電荷と反対の電荷を有するアミノ酸を含む。例えば、この操作された重鎖が、３９位で酸性アミノ酸を含み、１４７位で塩基性アミノ酸を含み、且つ１６５位で酸性アミノ酸を含む場合には、対応する軽鎖は、３８位で塩基性アミノ酸を含み、１２４位で酸性アミノ酸を含み、且つ１６９／１７０位（ＥＵナンバリング）で塩基性アミノ酸を含むだろう。あるいは、この操作された重鎖が、３９位で塩基性アミノ酸を含み、１４７位で酸性アミノ酸を含み、且つ位で塩基性アミノ酸を含む場合には、対応する軽鎖は、３８位で酸性アミノ酸を含み、１２４位で塩基性アミノ酸を含み、且つ１６９／１７０（ＥＵナンバリング）で酸性アミノ酸を含むだろう。

一実施形態では、本発明は、ヘテロ二量体抗体又はその断片であって、
ｉ．ＶＨ及びＣＨ１中におけるＱ３９Ｄ、Ｓ１６５Ｄ、ならびにＶＬ中におけるＱ３８Ｋ、
ｉｉ．ＶＨ及びＣＨ１中におけるＱ３９Ｋ、Ｋ１４７Ｄ、ならびにカッパＶＬ及びカッパＣＬ中におけるＱ３８Ｄ、Ｑ１２４Ｋ、
ｉｉｉ．ＶＨ及びＣＨ１中におけるＱ３９Ｄ、Ｓ１６５Ｄ、ならびにカッパＶＬ及びカッパＣＬ中におけるＱ３８Ｋ、Ｑ１２４Ｄ、
ｉｖ．ＶＨ及びＣＨ１中におけるＱ３９Ｋ、Ｋ１４７Ｄ、Ｓ１６５Ｒ、ならびにカッパＶＬ及びカッパＣＬ中におけるＱ３８Ｄ、Ｑ１２４Ｋ、Ｋ１６９Ｄ、
ｖ．ＶＨ及びＣＨ１中におけるＱ３９Ｄ、Ｓ１６５Ｄ、ならびにラムダＶＬ及びラムダＣＬ中におけるＱ３８Ｋ、Ｅ１２４Ｄ、Ｎ１７０Ｋ、
ｖｉ．ＶＨ及びＣＨ１中におけるＱ３９Ｄ、Ｓ１６５Ｄ、ならびにラムダＶＬ及びラムダＣＬ中におけるＱ３８Ｋ、Ｎ１７０Ｒ
からなる群から選択される置換を含むヘテロ二量体抗体又はその断片を提供する。

一実施形態では、本発明は、少なくとも２個のＦａｂを含むヘテロ二量体抗体又はその断片であって、各Ｆａｂは抗原上の異なるエピトープに結合する、ヘテロ二量体抗体又はその断片を提供する。これらのエピトープは同一の抗原上にあってもよいし、あるいはこれらのエピトープは異なる抗原上にあってもよい。一実施形態では、このヘテロ二量体抗体又はその断片は、二重特異性又は三重特異性等の多重特異性であり得る。そのような多重特異性抗体では、ＶＨ及びＣＨ１と、対応するＶＬ及びＣＬとの界面のアミノ酸は、ヘテロ二量体化に静電気的に有利な界面が確実に形成されるように、電荷が相反しているか、又は電荷／中性である必要がある。例えば、二重特異性抗体又はその断片では、第１のエピトープに結合するＦａｂは、操作されたＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインであって、３９位、１４７位、及び１６５位（ＥＵナンバリング）で、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、及び酸性アミノ酸をそれぞれ含む操作されたＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを有し得、対応する操作されたＶＬドメイン及びＣＬドメインは、３８位、１２４位、及び１６９／１７０位（ＥＵナンバリング）で、対応する重鎖の界面のアミノ酸の電荷と相反する電荷を有するアミノ酸を含む。従って、第２のエピトープに結合するＦａｂは、操作されたＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインであって、３９位、１４７位、及び１６５位（ＥＵナンバリング）で、塩基性アミノ酸、酸性アミノ酸、及び塩基性アミノ酸をそれぞれ含む操作されたＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを有し得、対応する操作されたＶＬドメイン及びＣＬドメインは、３８位、１２４位、及び１６９／１７０位（ＥＵナンバリング）で、対応する重鎖の界面のアミノ酸の電荷と相反する電荷を有するアミノ酸を含む。従って、操作された軽鎖は、電荷が対応する、その同種の重鎖とのみ会合して、正しい重鎖－軽鎖の対形成を保証するだろう。

具体的な実施形態では、本発明は、二重特異性抗体又はその断片であって、第１のＦａｂであり、置換Ｑ３９Ｋ、Ｋ１４７Ｄ、及びＳ１６５Ｒを含む操作されたＶＨドメイン及びＣＨ１ドメイン、ならびに置換Ｑ３８Ｄ、Ｑ１２４Ｋ、及びＫ１６９Ｄを含む操作されたＶＬドメイン及びＣＬドメインを含む第１のＦａｂと、第２のＦａｂであり、置換Ｑ３９Ｄ及びＳ１６５Ｄを含む操作されたＶＨドメイン及びＣＨ１ドメイン、ならびに置換Ｑ３８Ｋ及びＱ１２４Ｄを含む操作されたカッパＶＬドメイン及びカッパＣＬドメイン、又は置換Ｑ３８Ｋ、Ｑ３８Ｋ、及びＮ１７０Ｒ、もしくはＱ３８Ｋ、Ｅ１２４Ｄ、及びＮ１７０Ｋを含む操作されたラムダＶＬドメイン及びラムダＣＬドメインを含む第２のＦａｂとを含む二重特異性抗体又はその断片を提供する。

さらなる態様では、本発明は、Ｆｃ領域を含むヘテロ二量体抗体又はその断片を提供する。一実施形態では、このＦｃ領域は、例えばＲｉｄｇｗａｙ ＪＢＢ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９（７）：６１７－２１及び米国特許第５，７３１，１６８号明細書で説明されている「ノブ・イントゥ・ホール」アプローチに従う改変を含む操作されたＣＨ３ドメインを含む。このアプローチは、重鎖のヘテロ二量体の形成を促進し、対応する重鎖ホモ二量体の構築を妨げることが分かっている。このアプローチでは、ＣＨ３ドメイン間の界面の小さいアミノ側鎖をより大きいアミノ側鎖に置き換えることによりノブが作成され、大きい側鎖をより小さい側鎖に置き換えることによりホールが構築される。一実施形態では、「ノブ」変異はＴ３６６Ｗを含み、「ホール」変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含む（Ａｔｗｅｌｌ Ｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０：２６－３５）。具体的な実施形態では、「ノブ」変異はＴ３６６Ｗ、Ｓ３５４Ｃを含み、「ホール」変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＹ３４９Ｃを含み、その結果、対応するシステイン残基Ｓ３５４Ｃ及びＹ３４９Ｃの間にジスルフィド結合が形成され、ヘテロ二量体の形成がさらに促進される。

本発明の別の態様は、操作されたＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインと、操作されたＶＬドメイン及びＣＬドメインとを含むヘテロ二量体抗体又はその断片を調製する方法であって、このＶＨドメイン及びＣＨ１ドメイン中の少なくとも２個のアミノ酸を置換し、その結果、操作されたドメインは、３９位、１４７位、及び１６５位（ＥＵナンバリング）で荷電アミノ酸又は中性アミノ酸を含む、置換すること、ならびにこのＶＬドメイン及びＣＬドメイン中のアミノ酸を置換し、その結果、操作されたドメインは、３８位、１２４位、及び１６９／１７０位（ＥＵナンバリング）で荷電アミノ酸又は中性アミノ酸を含む、置換することを含み、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメイン中の前記アミノ酸と、ＶＬドメイン及びＣＬドメイン中の界面の対応するアミノ酸とは一対で、電荷が相反しているか、又は荷電しており／中性であり、且つヘテロ二量体化に静電気的に有利な界面を形成する、方法を提供する。

本発明の更に別の態様では、ヘテロ二量体抗体又はその断片のための正しい重鎖及び軽鎖の対形成を促進する、本明細書で説明された静電気的操縦機構を、ヘテロ二量体抗体のＶＨ－ＶＬ界面及びＣＨ１－ＣＬ界面への改変と組み合わせて、鎖間ジスルフィド結合を操作した。この鎖間ジスルフィド結合は、同種の重鎖及び軽鎖の対形成をさらに促進する。加えて、操作されたジスルフィド結合により、簡単な電気泳動ベースの手順による、誤って構築された分子の容易な同定及び定量を可能にする、ヘテロ二量体抗体のプロファイリングのための分析手順が容易になる。これにより、重鎖－軽鎖の対形成が正しいヘテロ二量体抗体及びその断片のスクリーニング用の頑強でハイスループットのプラットフォームが得られる。

精製済の二重特異性抗体がロードされている、非還元条件下で電気泳動にかけられたＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルを示す図である。対応する二重特異性抗体のアームが改変されているウェルの詳細を表９に示す。ウェル２～５では、二重特異性抗体のノブアームは、電荷操作に関連する改変を含み、ホールアームは、電荷操作及びジスルフィド結合操作に関連する改変を含んだ。ウェル７～１０では、ノブアーム及びホールアームは、電荷操作に関連する改変を含まないが、ホールアームは、ジスルフィド結合操作に関連する改変を含む。ウェル２～５と比較してウェル７～１０で観察され得るように、ジスルフィド結合操作のみでは、正しい重鎖－軽鎖の対形成を達成するには不十分であった。列１、６及び１１は分子量マーカーを示す。

本明細書で開示されているのは、高度なヘテロ二量体化を有する変異した重鎖及び軽鎖を含むヘテロ二量体抗体又はその断片である。同様に本明細書で開示されているのは、静電気的操縦を利用して、変異した場合に軽鎖とその同種の重鎖との正しい対形成が増加する界面残基を選択する方法である。同一の細胞中での変異した重鎖及び軽鎖の共トランスフェクション及び共発現により、機能するヘテロ二重性抗体又は抗体断片の構築が生じる。

定義
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、少なくとも１個の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質（例えば、免疫グロブリン鎖又はその断片）を指す。用語「抗体」は、例えば、モノクローナル抗体（例えば、免疫グロブリンＦｃ領域を有する完全長抗体）を含む。ある実施形態では、抗体は、完全長抗体又は完全長免疫グロブリン鎖を含む。ある実施形態では、抗体は、完全長抗体又は完全長免疫グロブリン鎖の抗原結合断片又は機能的断片を含む。

ある実施形態では、抗体は、重（Ｈ）鎖可変ドメイン配列（本明細書ではＶＨと略す）と、軽（Ｌ）鎖可変ドメイン配列（本明細書ではＶＬと略す）とを含み得る。ある実施形態では、抗体は、１本の重鎖と、１本の軽鎖とを含むか、又はこれらからなる（本明細書では半抗体を称する）。別の例では、抗体は、２個のＶＨ配列と２個のＶＬ配列とを含み、これらにより２個の抗原結合部位が形成され、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆｄ’、Ｆｖ、一本鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）、単一可変ドメイン抗体、ダイアボディ（Ｄａｂ）（二価及び二重特異性）、ならびにキメラ（例えばヒト化）抗体が形成され、これらは、抗体全体の改変又は組換えＤＮＡ技術を使用して新たに合成されたものの改変により生成され得る。これらの機能的抗体断片は、それぞれの抗原又はレセプターと選択的に結合する能力を保持する。抗体及び抗体断片は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥが挙げられるがこれらに限定されない抗体の任意のクラス、及び抗体の任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）に由来し得る。抗体の調製は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり得る。抗体は又、ヒト抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲ移植抗体、又はインビトロで生成された抗体でもあり得る。抗体は、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４から選択される重鎖定常領域を有し得る。抗体は、例えばカッパ又はラムダから選択される軽鎖も有し得る。用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、本明細書では用語「抗体」と互換的に使用される。

ある実施形態では、抗体は、抗体の抗原結合断片を含む。そのような断片の例として、下記が挙げられる：（ｉ）Ｆａｂ断片、即ち、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、及びＣＨ１ドメインからなる一価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、即ち、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２個のＦａｂ断片を含む二価の断片；（ｉｉｉ）ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬドメイン及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインからなるダイアボディ（ｄＡｂ）断片；（ｖｉ）ラクダ可変ドメイン又はラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）可変ドメイン；（ｖｉｉ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３を参照されたい；（ｖｉｉｉ）単一ドメイン抗体。これらの抗体断片は、当業者に既知の従来の技術を使用して得られ、これらの断片は、無傷の抗体と同一の方法で有用性に関してスクリーニングされる。

Ｆａｂは、本明細書で使用される場合、ＶＨ免疫グロブリンドメイン、ＣＨ１免疫グロブリンドメイン、ＶＬ免疫グロブリンドメイン、及びＣＬ免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドを指す。Ｆａｂは、独立して、又は完全長抗体もしくは抗体断片の文脈におけるポリペプチドとして、このポリペプチド領域を指す場合がある。

本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン可変ドメイン配列」は、免疫グロブリン可変ドメインの構造を形成し得るアミノ酸配列を指す。例えば、この配列は、天然に存在する可変ドメインのアミノ酸配列の全て又は一部を含み得る。例えば、この配列は、１個、２個もしくはより多くのＮ末端アミノ酸もしくはＣ末端アミノ酸を含んでもよいし、含まなくてもよく、又はタンパク質構造の形成に適合する他の変更を含んでもよい。

用語「抗原結合部位」は、抗体の一部であって、抗原又はそのエピトープに結合する界面を形成する決定基を含む一部を指す。タンパク質（又はタンパク質模倣物）に関して、抗原結合部位は概して、抗原ポリペプチドに結合する界面を形成する１個又は複数個のループ（少なくとも４個のアミノ酸又はアミノ酸模倣物からなる）を含む。典型的には、抗体分子の抗原結合部位は、少なくとも１個もしくは２個のＣＤＲ及び／もしくは超可変ループを含むか、又はより典型的には、少なくとも３個、４個、５個もしくは６個のＣＤＲ及び／もしくは超可変ループを含む。

一実施形態では、本抗体を組換えにより製造し得、例えば、ファージディスプレイにより又はコンビナトリアル法により製造し得る。抗体を生成するためのファージディスプレイ及びコンビナトリアル法は、当分野で既知である（例えば、Ｌａｄｎｅｒ他、米国特許第５，２２３，４０９号明細書；Ｋａｎｇ他、国際公開第９２／１８６１９号パンフレット；Ｄｏｗｅｒ他、同第９１／１７２７１号パンフレット；Ｗｉｎｔｅｒ他、同第９２／２０７９１号パンフレット；Ｍａｒｋｌａｎｄ他、同第９２／１５６７９号パンフレット；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ他、同第９３／０１２８８号パンフレット；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ他、同第９２／０１０４７号パンフレット；Ｇａｒｒａｒｄ他、同第９２／０９６９０号パンフレット；Ｌａｄｎｅｒ他、同第９０／０２８０９号パンフレット；Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０－１３７２；Ｈａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１－８５；Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５－１２８１；Ｇｒｉｆｆｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ １２：７２５－７３４；Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２６：８８９－８９６；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８；Ｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）ＰＮＡＳ ８９：３５７６－３５８０；Ｇａｒｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７３－１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １９：４１３３－４１３７；及びＢａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）ＰＮＡＳ ８８：７９７８－７９８２で説明されており、これら全ての内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。

一実施形態では、本抗体は、完全ヒト抗体（例えば、ヒト免疫グロブリン配列から抗体を産生するように遺伝子操作されているマウス中で作られた抗体、もしくはヒトから単離された抗体）、又は非ヒト抗体（例えば、齧歯類（マウスもしくはラット）抗体、ヤギ抗体、霊長類（例えばサル）抗体、ラクダ抗体）である。ヒトモノクローナル抗体は、マウス系よりはむしろ、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスを使用して生成され得る。目的の抗原により免疫付与されたこのトランスジェニックマウス由来の脾細胞を使用して、ヒトタンパク質由来のエピトープに特異的な親和性を有するヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを生成する（例えば、Ｗｏｏｄ他、国際公開第９１／００９０６号パンフレット、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ他、同第９１／１０７４１号パンフレット；Ｌｏｎｂｅｒｇ他、同第９２／０３９１８号パンフレット；Ｋａｙ他、同第９２／０３９１７号パンフレット；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６－８５９；Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．７：１３－２１；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，（１９９４）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８１：６８５１－６８５５；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｙｅａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７：３３－４０；Ｔｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）ＰＮＡＳ ９０：３７２０－３７２４；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２１：１３２３－１３２６を参照されたい）。

抗体は、可変領域又はその一部（例えばＣＤＲ）が、非ヒト生物（例えばラット又はマウス）中で生成されているものであり得る。キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、及びヒト化抗体は、本発明の範囲内である。非ヒト生物（例えばラット又はマウス）中で生成され、次いで、例えば可変フレームワーク又は定常領域で改変されてヒトでの抗原性が低下している抗体は、本発明の範囲内である。キメラ抗体は、当分野で既知の組換えＤＮＡ技術により製造され得る（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ他、国際公開第８７／００２６７１号パンフレット；Ａｋｉｒａ他、欧州特許出願公開第１８４１８７Ａ１号明細書；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．、同第１７１４９６Ａ１号明細書；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ他、同第１７３４９４Ａ１号明細書；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ他、国際公開第８６／０１５３３号パンフレット；Ｃａｂｉｌｌｙ他、米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｃａｂｉｌｌｙ他、欧州特許出願公開第１２５０２３Ａ１号明細書；Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１－１０４３；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）ＰＮＡＳ ８４：３４３９－３４４３；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，（１９８７），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１－３５２６；Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）ＰＮＡＳ ８４：２１４－２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９８７），Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９－１００５；Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６－４４９；及びＳｈａｗ ｅｔ ａｌ．，（１９８８），Ｊ．Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５３－１５５９を参照されたい）。

ヒト化抗体又はＣＤＲ移植抗体は、（重免疫グロブリン鎖及び又は軽免疫グロブリン鎖の）少なくとも１個又は２個であるが一般的には３個全てのレシピエントＣＤＲがドナーＣＤＲに置き換えられているだろう。この抗体は、非ヒトＣＤＲの少なくとも一部に置き換えられていてもよいし、ＣＤＲの一部のみが非ヒトＣＤＲに置き換えられていてもよい。標的抗原へのヒト化抗体の結合に必要なＣＤＲの数を変えることが必要とされているだけである。好ましくは、ドナーは、齧歯類抗体（例えば、ラット抗体又はマウス抗体）であり、レシピエントは、ヒトフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークであるだろう。典型的には、ＣＤＲを提供する免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供する免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる。一実施形態では、ドナー免疫グロブリンは非ヒト（例えば齧歯類）である。アクセプターフレームワークは、天然に存在する（例えばヒト）フレームワークもしくはコンセンサスフレームワークであるか、又はこれらと約８５％以上（好ましくは９０％、９５％、９９％もしくはより高く）同一の配列である。

本明細書で使用される場合、用語「コンセンサス配列」は、関連する配列のファミリで最も頻繁に生じるアミノ酸（又はヌクレオチド）から形成された配列を指す（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ １９８７）を参照されたい）。タンパク質のファミリでは、コンセンサス配列中の各位置は、このファミリ中のその位置で最も頻繁に生じるアミノ酸により占められている。２種のアミノ酸が同一の頻度で生じる場合、いずれかがコンセンサス配列に含まれ得る。「コンセンサスフレームワーク」は、コンセンサス免疫グロブリン配列中のフレームワーク領域を指す。

抗体を、当分野で既知の方法によりヒト化し得る（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，（１９８５），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２－１２０７；Ｏｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８６），ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４、ならびにＱｕｅｅｎ他、米国特許第５，５８５，０８９号明細書、同第５，６９３，７６１号明細書、及び同第５，６９３，７６２号明細書を参照されたい。これら全ての内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。ヒト化抗体又はＣＤＲ移植抗体を、ＣＤＲ移植又はＣＤＲ置換により製造し得、免疫グロブリン鎖の１個の、２個又は全てのＣＤＲが置き換えられ得る。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号明細書；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２－５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４；Ｂｅｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３－４０６０、及びＷｉｎｔｅｒ 米国特許第５，２２５，５３９号明細書を参照されたい。これら全ての内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。同様に本発明の範囲内なのは、特定のアミノ酸が置換されているか、欠失しているか、又は付加されているヒト化抗体である。ドナーからアミノ酸を選択する基準は、米国特許第５，５８５，０８９号明細書（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号明細書の第１２～１６欄）で説明されており、この内容は参照により本明細書に組み込まれる。抗体をヒト化するための他の技術は、Ｐａｄｌａｎ他、欧州特許出願公開第５１９５９６Ａ１号明細書で説明されている。

さらに他の実施形態では、本抗体は、重鎖定常領域であって、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、及びＩｇＥの重鎖定常領域から選択される重鎖定常領域を有し、特に、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４の（例えばヒト）重鎖定常領域から選択される重鎖定常領域を有する。別の実施形態では、本抗体分子は、軽鎖定常領域であって、例えば、カッパ又はラムダの（例えばヒト）軽鎖定常領域から選択される軽鎖定常領域を有する。この定常領域を変更して（例えば変異させて）、本抗体の特性を改変させ得る（例えば、下記のうちの１つ又は複数を増加させ得るか、又は低下させ得る：Ｆｃレセプターの結合、抗体のグリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞機能、及び／又は補体機能）。一実施形態では、本抗体はエフェクター機能を有し、補体を固定し得る。他の実施形態では、本抗体はエフェクター細胞を動員しないか、又は補体を固定しない。別の実施形態では、本抗体は、Ｆｃレセプターに結合する能力が低下しているか、又はこの能力を欠いている。例えば、本抗体は、Ｆｃレセプターへの結合を支持しないサブタイプ、アイソタイプ、断片又は他の変異体であり、例えば、本抗体は、Ｆｃレセプター結合領域が変異誘発されているか、又は欠失している。

抗体の定常領域を変更する方法は当分野で既知である。機能が変更されている抗体（例えば、エフェクターリガンド（例えば、細胞上のＦｃＲ）又は補体のＣ１成分に対する親和性が変更されている抗体）を、この抗体の定常部分中の少なくとも１個のアミノ酸残基を異なる残基に置き換えることにより製造し得る（例えば、欧州特許出願公開第３８８１５１Ａ１号明細書、米国特許第５，６２４，８２１号明細書、及び同第５，６４８，２６０号明細書を参照されたい。これら全ての内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。マウス又は他の種の免疫グロブリンに適用した場合には、これらの機能を低下させるか、又は排除するであろう同様のタイプの変更を説明する可能性がある。

「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられている置換のことである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリは、当分野で定義されている。このファミリとして下記が挙げられる：塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ））、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ））、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン（Ｇ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、システイン（Ｃ））、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、メチオニン（Ｍ）、トリプロファン（Ｗ））、ベータ－分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ））、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプロファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ））。

ヘテロ二量体抗体
ある実施形態では、抗体はヘテロ二量体抗体であり、例えば、この抗体は、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、この複数のうちの第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第１のエピトープに対する結合特異性を有し、この複数のうちの第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第２のエピトープに対する結合特異性を有する。ある実施形態では、第１のエピトープ及び第２のエピトープは同一の抗原上にあり、例えば、同一のタンパク質（又は多量体タンパク質のサブユニット）である。別の実施形態では、第１のエピトープ及び第２のエピトープは異なる抗原上にあり、例えば異なるタンパク質（又は多量体タンパク質の異なるサブユニット）である。ある実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、第３、第４、又は第５の免疫グロブリン可変ドメインを含む。ある実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、二重特異性抗体、三重特異性抗体、又は四重特異性抗体である。

具体的な実施形態では、本ヘテロ二量体抗体は、二重特異性抗体又はその断片である。二重特異性抗体は、二種以下のエピトープに対する特異性を有する。二重特異性抗体は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列と、第２のエピトープに対する結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列とを特徴とする。ある実施形態では、第１のエピトープ及び第２のエピトープは同一の抗原上にあり、例えば、同一のタンパク質（又は多量体タンパク質のサブユニット）である。ある実施形態では、第１のエピトープ及び第２のエピトープは重複する。ある実施形態では、第１のエピトープ及び第２エピトープは重複しない。ある実施形態では、第１のエピトープ及び第２のエピトープは異なる抗原上にあり、例えば、異なるタンパク質（又は多量体タンパク質の異なるサブユニット）である。ある実施形態では、二重特異性抗体は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列と、第２のエピトープに対する結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列とを含む。ある実施形態では、二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体と、第２のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体とを含む。ある実施形態では、二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体又はその断片と、第２のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体又はその断片とを含む。ある実施形態では、二重特異性抗体又はその断片は、第１のエピトープに対する結合特異性を有するＦａｂと、第２のエピトープに対する結合特異性を有するＦａｂとを含む。

ヘテロ二量体抗体（特に二重特異性抗体）の製造に最も一般的に使用される方法は、異なる宿主細胞中で抗体の成分を別々に発現させ、その後に続いて精製し、機能するＩｇＧへと構築することによる。しかしながら、そのような方法はコストが嵩み、且つ複雑な製造プロセスを伴う。従って、単一の宿主細胞の発現系が好ましいが、重鎖及び軽鎖の対形成の問題という課題を伴っている。

この重鎖の対形成の問題は、単一の宿主細胞中で発現させた場合にホモ二量体及びヘテロ二量体を形成する、重鎖の能力を反映する。ＩｇＧ中における２本の重鎖のホモ二量体化は、ＣＨ３ドメイン間の相互作用に媒介される。この重鎖のヘテロ二量体化を改善するために作られた最初の方法のうちの１つは、「ノブ・イントゥ・ホール」戦略を利用する（Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）上記参照）。重鎖ヘテロ二量体化を改善するさらなる方法として、特に下記が挙げられる：静電気的操縦変異の合理的な設計（Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）ＪＢＣ，２８５：１９６３７－４６；Ｓｔｒｏｐ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２０：２０４－１９）、コンピュータによる設計の使用（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）ｍＡｂｓ，３：５４６－５５７；Ｖｏｎ Ｋｒｅｕｄｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）ｍＡｂｓ ５：６４６－５４）、配列の相違の利用であるが、ＩｇＧ及びＩｇＡのＣＨ３ドメインの構造類似性の利用（鎖交換操作ドメイン（Ｓｔｒａｎｄ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｄｏｍａｉｎｓ）（ＳＥＥＤ）プラットフォーム；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．，２３：１９５－２０２）、ならびに共通の重鎖の使用（Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．６：６１１３）。国際公開第１６／１１８７４２号パンフレット（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ）で説明されている最近の研究は、重鎖のヘテロ二量体化を達成するために両方のＣＨ３ドメイン中に置換を含む二重特異性抗体に関する。この置換を、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３２：１９１－８及び国際公開第１４／１５０９７３号パンフレット（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ＆ Ｃｏ；下記で論じる）で説明されているように、ＶＨドメイン及びＶＬドメインならびにＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインへの置換とも組み合わせた。

軽鎖－重鎖の誤対形成問題に対処するために、これまでの方法は、単一の軽鎖を使用する二重特異性抗体の生成を含んでいる。これには、多様性を制限する単一の軽鎖を利用する重－軽鎖操作又は新規の抗体ライブラリが必要である（Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６（７）：６７７－８１）。加えて、共通の軽鎖を有する抗体が、単一の軽鎖を有するトランスジェニックマウスから同定されている（国際公開第１１／０９７６０３号パンフレット Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ；Ｄｈｉｍｏｌｅａ ＆ Ｒｅｉｃｈｅｒｔ（２０１２）ｍＡｂｓ，４：４－１３）。別のアプローチは、１つの重鎖のＣＨ１ドメインを、その同種の軽鎖のＣＬドメインと交換することであり（Ｃｒｏｓｓｍａｂ技術、Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）上記参照）、これは、「ノブ・イントゥ・ホール」法も含んで重鎖を確実にヘテロ二量体化し得る（Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）上記参照）。直交ＣＨ１－ＣＬ界面の設計（Ｌｅｗｉｓ ＳＭ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）上記参照）、又は抗体の軽鎖－重鎖界面残基を操作するための静電気的操作機構（Ｌｉｕ Ｚ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）ＪＢＣ，２９０：７５３５－６２）の使用も可能である。Ｆａｂ界面の分析により、軽鎖と重鎖との間では、水素結合及びファンデルワールス相互作用が支配的であり、静電気的相互作用はまれであることが明らかとなった。

ヘテロ二量体抗体を製造するさらなるプロトコルとして、例えば下記が挙げられるがこれらに限定されない：例えば国際公開第０９／０８９００４号パンフレット、同第０６／１０６９０５号パンフレット、及び同第１０／１２９３０４号パンフレットで説明されているような静電気的に操作するＦｃ対形成；例えば国際公開第０８／１１９３５３号パンフレット、同第１１／１３１７４６号パンフレット、及び同第１３／０６０８６７号パンフレットで説明されているようなＦａｂアーム交換；例えば米国特許第４，４３３，０５９号明細書で説明されているような、例えば、アミン反応基及びスルフヒドリル反応基を有するヘテロ二官能性試薬を使用して二重特異性構造を生成するための抗体架橋による、二重抗体コンジュゲート；例えば米国特許第４，４４４，８７８号明細書で説明されているような、２本の重鎖の間のジスルフィド結合の還元及び酸化のサイクルを介して、異なる抗体からの半抗体（重鎖－軽鎖の対又はＦａｂ）を再結合させることにより生成された二重特異性抗体決定基；例えば米国特許第５，２７３，７４３号明細書で説明されているような三官能性抗体、例えば、スルフヒドリル反応基を介して架橋した３個のＦａｂ’断片；例えば米国特許第５，５３４，２５４号明細書で説明されているような生合成結合タンパク質、例えば、Ｃ末端テイルを介して（好ましくは、ジスルフィド反応性化学架橋又はアミン反応性化学架橋を介して）架橋したｓｃＦｖの対；例えば米国特許第５，５８２，９９６号明細書で説明されているような二官能性抗体、例えば、定常ドメインが置き換えられているロイシンジッパー（例えば、ｃ－ｆｏｓ及びｃ－ｊｕｎ）を介して二量体化した、結合特異性が異なるＦａｂ断片；例えば米国特許第５，５９１，８２８号明細書で説明されているような二重特異性及びオリゴ特異性の一価及びオリゴ価のレセプター、例えば、一方の抗体のＣＨ１領域と、典型的には関連する軽鎖を有する他方の抗体のＶＨ領域との間のポリペプチドスペーサーを介して連結された２種の抗体（２種のＦａｂ断片）のＶＨ－ＣＨ１領域；例えば米国特許第５，６３５，６０２号明細書で説明されているような二重特異性ＤＮＡ－抗体コンジュゲート、例えば、ＤＮＡの二本鎖部分を介した抗体又はＦａｂ断片の架橋；例えば米国特許第５，６３７，４８１号明細書で説明されているような二重特異性融合タンパク質、例えば、完全定常領域との間に親水性らせんペプチドリンカーを有する２個のｓｃＦｖを含む発現構築物；例えば米国特許第５，８３７，２４２明細書で説明されているような多価及び多重特異性の結合タンパク質、例えば、一般にダイアボディと呼ばれる、Ｉｇ重鎖可変領域の結合領域を有する第１のドメインと、Ｉｇ軽鎖可変領域の結合領域を有する第２のドメインを有するポリペプチドの二量体（二重特異性、三重特異性又は四重特異性の分子を作る高次構造も開示されている）；例えば米国特許第５，８３７，８２１号明細書で説明されているような、連結されたＶＬ鎖及びＶＨ鎖が、ペプチドスペーサーにより、抗体ヒンジ領域及びＣＨ３領域にさらに接続されているミニボディ構築物（二量体化して二重特異性／多価分子を形成し得る）；短いペプチドリンカー（例えば、５～１０個のアミノ酸）で連結された、又はいずれの方向にも全くリンカーなしで連結されたＶＨドメイン及びＶＬドメイン（二量体を形成して二重特異性ダイアボディを形成し得る）；例えば米国特許第５，８４４，０９４号明細書で説明されているような三量体及び四量体；例えば米国特許第５，８６４，０１９号明細書で説明されているような、一連のＦＶ（又はｓｃＦｖ）を形成するためにＶＬドメインにさらに会合したＣ末端で架橋可能な基とペプチド結合により接続されたＶＨドメイン（又はファミリメンバー中のＶＬドメイン）のストリング；ならびに例えば米国特許第５，８６９，６２０号明細書で説明されているように、ペプチドリンカーを介してＶＨドメイン及びＶＬドメインの両方が連結されている一本鎖結合ポリペプチドは、非共有結合を介して又は化学架橋を介して多価構造体へと結合し、ｓｃＦｖ型形式又はダイアボディ型形式の両方を使用して、例えば、ホモ二価、ヘテロ二価、三価、及び四価の構造体を形成する。

電荷操作
二重特異性抗体分子を生成するための電荷操作の使用の具体例として、例えば国際公開第０７／１１０２０５号パンフレット（Ｍｅｒｃｋ）で説明されているＳＥＥＤヘテロ二量体形成、ならびに国際公開第０９／０８９００４号パンフレット（Ａｍｇｅｎ）、欧州特許第１８７０４５９Ｂ１号明細書（Ｃｈｕｇａｉ）、国際公開第１０／１２９３０４号パンフレット（Ｏｎｃｏｍｅｄ）、同第１４／１５０９７３号パンフレット（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ＆ Ｃｏ及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ）、ならびに同第１６／１１８７４２号パンフレット（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ ＆ Ｃｏ）で説明されている技術が挙げられる。

国際公開第０７／１１０２０５号パンフレット（Ｍｅｒｃｋ）で説明されているＳＥＥＤヘテロ二量体は、ＩｇＡ及びＩｇＧの操作されたＣＨ３ドメインを含み、第１及び第２の操作されたドメインは、ホモ二量体の形成よりも優先的に互いにヘテロ二量体を形成する。加えて、Ｆｃ領域に差次的にタグを付けて、ヒトＩｇＧ３アイソタイプがプロテインＡに結合できないことを利用し得ることにより、ヘテロ二量体の効率的な精製が可能になる（米国特許第８，５８６，７１３号明細書）。

国際公開第０９／０８９００４号パンフレット（Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．）では、ホモ二量体の形成よりも重鎖ヘテロ二量体の形成を静電気的に支持するために、ＣＨ３ドメイン中で電荷操作を使用して二重特異性抗体分子を作製する方法が説明されており、且つ例示されている。この適用はさらに、適切な重鎖に結合するために各軽鎖の忠実度を高めて、重鎖のＣＨ１ドメイン及び軽鎖の定常領域を操作して二量体化を支持し得ることも示唆する。軽鎖－重鎖相互作用のこの分析から、特定の軽鎖及び重鎖の対の結合を増強するために電荷対を配列に導入し得る位置が明らかとなった。この位置は、ラムダ軽鎖のＴ１１２及び重鎖のＡ１４１、ラムダ軽鎖のＥ１５６及び重鎖のＳ１７６、ならびにラムダ軽鎖のＳ１７１及び重鎖のＳ１８３を含んだ。さらなる位置が、国際公開第０９／０８９００４号パンフレットの表４及び表５に太字で示された。

欧州特許第１８７０４５９Ｂ１号明細書（Ｃｈｕｇａｉ）では、ＶＨとＶＬとの間の会合を、ＶＨ－ＶＬ界面で存在するアミノ酸を荷電アミノ酸に置換することにより調節し得ることが報告されており、このことは、「ノブ・イントゥ・ホール」技術と比べて異種分子の形成で有効である。彼らは、このことが、ＶＨとＶＬとの間の会合の調節に適用され得るだけでなく、任意のポリペプチドの間での会合の調節にも適用され得ることを示唆する。示唆された改変は、ｓｃ（Ｆｖ）２のＶＨ／ＶＬ界面中に存在する。ＶＨ／ＶＬの界面が改変されたｓｃ（Ｆｖ）２の調製物は、ＶＨのＱ３９及びＶＬのＱ３８、ならびにＶＬのＰ４４での改変を含んだ。

国際公開第１０／１２９３０４号パンフレット（Ｏｎｃｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．Ｉｎｃ．）では、ヘテロ二量体分子中のポリペプチド間の静電気的な及び／又は疎水性／親水性の相互作用の変更が、ホモ多量体よりも重鎖ヘテロ多量体の形成を支持する方法が説明されている。２個のポリペプチドの間の界面で相互作用するアミノ酸が、改変のために選択された。親水性相互作用に関与するアミノ酸残基は、より疎水性のアミノ酸残基及び／又は別のアミノ酸との電荷相互作用に関与するアミノ酸に置き換えられた。ヒトＩｇＧ２のＣＨ３ドメイン中の２３６位、２４５位、２４９位、２７８位、２８６位、及び２８８位が、置換のために選択された。

国際公開第１４／１５０９７３号パンフレット（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ＆ Ｃｏ及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ）で説明されている研究は、ＶＨドメイン及びＶＬドメインならびにＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインの界面中に設計された残基を有するＦａｂ及び二重特異性抗体に関する。置換は、ＶＨ中の６２位及びＶＬ中の１位、ならびに／又はＶＨ中の３９位及びＶＬ中の３８位（Ｋａｂａｔナンバリング）で行なわれた。さらなる置換が、ＣＨ１中の１７２位及び／又は１７４位、ならびにＣＬ中の１３５位及び／又は１７６位で行なわれた。正しい重鎖－軽鎖の対形成を試みて改善するために、重鎖中のＫ２２８Ｄ及び軽鎖中のＤ１２２ｋのさらなる「電荷交換」置換も行なわれた。これらの置換の様々な組み合わせによっても、達成され得る正しい重鎖－軽鎖の対形成の割合は依然として９０％未満であった。

国際公開第１６／１１８７４２号パンフレット（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ＆ Ｃｏ）で説明されているより最近の研究は、特に、４０７位、及び３６６位、４０９位；４０７位、３９９位、及び３６６位、４０９位；３６０位、３９９位、４０７位、及び３４５位、３４７位、３６６位、４０９位；３４９位、３７０位、及び３５７位、３６４位；ならびに３４９位、３６６位、３７０位、４０９位、及び３５７位、３６４位、４０７位で、重鎖ヘテロ二量体化を改善するために、コンピュータによる合理的な設計に基づいて両方のＣＨ３ドメイン中に置換を含む二重特異性抗体に関する。加えて、上記で詳細に説明したように、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）上記参照及び国際公開第１４／１５０９７３号パンフレットで説明されているように、ＶＨドメイン及びＶＬドメインに対して変異が行なわれた。これらの追加のＣＨ３変異によってのみ、国際公開第１４／５０９７３号パンフレットで観察されたものよりも重鎖－軽鎖結合の改善を達成し得た。

本発明では静電気的操作の概念も使用されているが、本発明者らは、電荷改変のための位置の選択に独特の基準を適用している。相互作用の中心ではなく重鎖－軽鎖の対形成の界面の縁の位置を選択すると、強い塩橋を介して正しい重鎖－軽鎖の形成を調節することにより、正しい重鎖－軽鎖の対形成を支持する「クリップ効果」が得られる。可変ドメインの終わりで、ならびにＣＨ１ドメイン及びＣＬ領域の始まり及び終わりで荷電残基（必要に応じて酸性又は塩基性）を置換することにより、ＣＨ１及びＣＬの界面の不安定化も減少する。そのような改変により、重鎖と、その最大１００％同種の軽鎖との正しい対形成、及び相互作用ドメインの最小限の不安定化のみが達成されている。

ジスルフィド結合操作
これまでの研究は、１個のＣＨ１－ＣＬ界面内の天然の鎖間ジスルフィド結合の、操作された鎖間ジスルフィド結合への置き換えにより、同種のＬＣ及びＨＣの対形成の増強が達成され得ることを説明している（米国特許出願公開第２０１４０３４８８３９号明細書（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ））。本発明のある実施形態では、電荷操作と、ジスルフィド結合操作との組み合わせが適用されている。天然の鎖間ジスルフィド結合は、文献で広く説明されているＶＨ４４－ＶＬ１００ジスルフィド結合を安定化するＦｖに基づく設計を使用して、ＶＨ－ＶＬ界面内の結合に置き換えられた（Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１２３９－４５；Ｗｅａｔｈｅｒｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２５（７）：３２１－９）。そのような改変は、所望の独特のＨＣ／ＬＣ対形成を供給結合的にロックすることを意図しており、加えて、二重特異性抗体の調製物をプロファイリングするのに必要な分析手順を容易にする。本明細書で説明された静電気的操作方法の厳密さにさらに追加する簡単な電気泳動ベースの手順を使用して、誤って構築された分子を容易に特定して定量し、正しく対形成した二重特異性抗体を達成し得る。静電気的操作により既に改変されているが、１００％正しい同種の対形成を示さなかった重鎖及び軽鎖の対へのジスルフィド結合操作の追加により、誤って構築された分子を排除し得、重鎖とその同種の軽鎖との最大１００％の正しい対形成を有する二重特異性抗体が得られる。

核酸及び発現系
本発明は又、本明細書で説明された重鎖及び／又は軽鎖の定常ドメイン及び／又は可変ドメインをコードする核酸も包含する。本発明の核酸分子は、一本鎖の形態及び二本鎖の形態の両方のＤＮＡ及びＲＮＡ、ならびに対応する相補配列を含む。本発明の核酸分子は、完全長の遺伝子又はｃＤＮＡ分子、及びこれらの断片の組み合わせを含む。本発明の核酸はヒト供給源に由来するが、本発明は、非ヒト種に由来するものを含む。

「単離核酸」とは、天然に存在する供給源から単離された核酸の場合には、核酸が単離された生物のゲノム中に存在する隣接遺伝子配列から分離されている核酸のことである。テンプレートから酵素的に合成されたか、又は化学的に合成された核酸（例えば、ＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ分子、又はオリゴヌクレオチド）の場合には、そのようなプロセスから得られる核酸は単離核酸であることが理解される。単離核酸分子は、別個の断片の形態の核酸分子、又はより大きい核酸構築物の構成成分としての核酸分子を指す。好ましい一実施形態では、核酸は、内在性夾雑物質を実質的に含まない。核酸分子は好ましくは、実質的に純粋な形態で、且つ標準的な生化学的方法によるこの核酸分子の構成成分のヌクレオチド配列の同定、操作、及び回収を可能にする量又は濃度で、少なくとも１回は単離されているＤＮＡ又はＲＮＡから由来している（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）で概説されているもの）。そのような配列は好ましくは、典型的には真核生物遺伝子中に存在する内部非翻訳配列（即ちイントロン）で中断されていないオープンリーディングフレームの形態で提供される、及び／又は構築される。非翻訳ＤＮＡの配列はオープンリーディングフレームから５’又は３’に存在し得、この配列は、コード領域の操作又は発現を妨げない。

バリアント配列を、本明細書で概説するように、カセット変異誘発もしくはＰＣＲ変異誘発又は当分野で公知の他の技術を使用する、ポリペプチドをコードするＤＮＡ中のヌクレオチドの部位特異的変異誘発により、このバリアントをコードするＤＮＡを生成し、その後に細胞培養物中で組換えＤＮＡ発現をさせることにより、調製し得る。

本発明は又、上記の少なくとも１種のポリペプチドを含むプラスミド、発現ベクター、転写カセット又は発現カセットの形態の発現系及び発現構築物も提供する。加えて、本発明は、そのような発現系又は発現構築物を含む宿主細胞を提供する。

一実施形態では、本発明は、操作されたＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインと、操作されたＶＬドメイン及びＣＬドメインとを含むヘテロ二量体抗体又はその断片を調製する方法であって、このＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインは、３９位、１４７位、及び１６５位（ＥＵナンバリング）で荷電アミノ酸を含み、このＶＬドメイン及びＣＬドメインは、３８位、１２４位、及び１６９／１７０位（ＥＵナンバリング）で荷電アミノ酸を含み、この方法は、（ａ）この操作されたＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインのポリペプチドをコードする核酸と、この操作されたＶＬドメイン及びＣＬドメインのポリペプチドを含む核酸とを含む宿主細胞を培養する工程であり、培養された宿主細胞は、これらの操作されたポリペプチドを発現する、培養する工程、ならびに（ｂ）この宿主細胞の培養物からヘテロ二量体抗体を回収する工程を含む、方法を提供する。

本発明で有用な発現ベクターを、出発ベクター（例えば市販のベクター）から構築し得る。このベクターを構築し、軽鎖、重鎖、又は軽鎖及び重鎖の配列をコードする核酸分子を、このベクターの適切な部位に挿入した後、完成したベクターを、増幅及び／又はポリペプチド発現に適した宿主細胞に挿入し得る。選択した宿主細胞の発現ベクターによる形質転換を、公知の方法（例えば、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介型トランスフェクション、又は他の既知の技術）により達成し得る。選択される方法は部分的に、使用される宿主細胞の種類と相関関係があるだろう。これらの方法及び他の適切な方法は当業者に公知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１，上記参照に記載されている。

典型的には、この宿主細胞で使用される発現ベクターは、プラスミドの維持のための配列、ならびに外在性ヌクレオチド配列のクローニン及び発現のための配列を含むだろう。そのような配列（「隣接配列」と総称される）は、ある特定の実施形態では、典型的には下記のヌクレオチド配列のうちの１つ又は複数を含む：プロモーター、１個又は複数個のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナー及びアクセプタースプライス部位を含む完全なイントロン配列、ポリペプチド分泌のリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現させるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択可能なマーカー要素。

適切な条件下で培養される場合には、宿主細胞を使用して二重特異性抗体を発現させ得、その後、この二重特異性抗体を、（この宿主細胞が培地中にこの二重特異性抗体を分泌する場合には）培養培地から回収し得るか、又は（この二重特異性抗体が分泌されない場合には）この二重特異性抗体を産生する宿主細胞から直接回収し得る。適切な宿主細胞の選択は、様々な要因（例えば、所望の発現レベル、活性に望ましい又は必須のポリペプチド改変（例えば、グリコシル化又はリン酸化）、及び生物学的に活性な分子へのフォールディングの容易さ）に依存するだろう。宿主細胞は、真核生物であってもよいし、原核生物であってもよい。

発現用の宿主として利用可能な哺乳類細胞株は、当分野で公知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株が挙げられるがこれに限定されず、当分野で既知の発現系で使用される任意の細胞株を使用して、本発明の組換えポリペプチドを作製し得る。一般に、宿主細胞を、所望の二重特異性抗体をコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクターで形質転換させる。利用され得る宿主細胞の中でも特に、原核生物、酵母、又は高等真核細胞である。原核生物として、グラム陰性又はグラム陽性の生物（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又は桿菌）が挙げられる。高等真核細胞として、昆虫細胞、及び哺乳類起源の確立された細胞株が挙げられる。適切な哺乳類宿主細胞の例として、下記が挙げられる：ＣＯＳ－７細胞、Ｌ細胞、Ｃｌ２７細胞、３Ｔ３細胞、血清フリー培地中で増殖するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株又はその誘導対もしくは関連細胞株、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞株、ＣＶＩＩＥＢＮＡ細胞株、ヒト胎児由来腎臓細胞、例えば、２９３、２９３ ＥＢＮＡ又はＭＳＲ ２９３、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換された霊長類細胞株、正常な二倍体細胞、初代組織のインビトロ培養物由来の細胞株、初代移植片、ＨＬ－６０、Ｕ９３７、ＨａＫ又はＪｕｒｋａｔ細胞。任意選択で、様々なシグナル変換アッセイ又はレポーターアッセイでポリペプチドを使用することが望ましい場合には、このポリペプチドの発現に哺乳類細胞株（例えば、ＨｅｐＧ２／３Ｂ、ＫＢ、ＮＩＨ ３Ｔ３又はＳ４９）を使用し得る。あるいは、下等真核生物（例えば酵母）中で又は原核生物（例えば細菌）中でポリペプチドを産生させることが可能である。適切な酵母として、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）株、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、又は異種ポリペプチドを発現し得るあらゆる酵母株が挙げられる。適切な細菌株として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｓ．チフィリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、又は異種ポリペプチドを発現し得るあらゆる細菌株が挙げられる。本二重特異性抗体が酵母又は細菌中で作製される場合、機能する産物を得るために、例えば適切な部位のリン酸化又はグリコシル化により、この酵母又は細菌中で産生される産物を改変することが望ましい場合がある。そのような共有結合性の付着を、既知の化学的な又は酵素的な方法を使用して達成し得る。

実施例１：合理的な設計
合理的な設計戦略を使用して一連のタンパク質を生成し、正しい重鎖－軽鎖の対形成等の望ましい特性を示す変異を特定した。重鎖－軽鎖の対形成の操作のための設計戦略には、代表的なＦａｂを特定することが含まれた。代表的なＦａｂの基準は、一般に使用されるＶＨ及びＶＬのサブグループのメンバー（例えば、ＶＨ３及びＶＫ１）であるか、又はラムダ軽鎖のメンバーであるということであった。Ｆａｂ（抗ｃ－Ｋｉｔ重鎖、配列番号７、及び軽鎖、配列番号２１）の選択後、Ｆａｂ界面のインシリコでの分析を実行して、重鎖と軽鎖との間の可能な相互作用に重要な残基を特定した。

可変ドメインＶＨ及びＶＫならびに定常ドメインＣＨ１及びＣＫ中で一連の変異を導入した後、ＡＭＢＥＲ９９力場を使用して、モデリングソフトウェアＭＯＥ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ Ｉｎｃ．）でモデルを作成した。Ｂｌａｓｔｐ ２．２．３０＋プログラムを使用して、ＰＤＢデータベースに対して変異ドメインを実行した。同一性が最高であるｐｄｂＸ線構造を選択して、最良のバリアント（ｐｄｂ ３ＫＤＭ）をモデル化した。

１．１ 残基位置の選択
軽鎖と、この軽鎖の同種の重鎖の正しい対形成を確実にするために、重鎖－軽鎖の構築を制御する方法を調べた。好ましいアプローチは、ＶＨ－ＶＬドメイン及びＣＨ１－ＣＬドメインの電荷操作により、この構築を制御することであった。この実施例では、電荷操作の適切な位置を、人により誘導される設計により選択し、いくつかの基準を適用した。この選択したアミノ酸は、ＣＤＲと接触しないようにすべきであり、可能であれば、最も一般的な抗体ファミリ内で高度に保存されなければならない。界面の中心での位置は避けるべきであり、「クリップ効果」を達成するためにはむしろ、この位置は界面の縁であるべきである。一方のアームは荷電残基のセットを有すべきであり、他方のアームは、対応する３Ｄ位置でカウンター電荷又は中性電荷を有すべきである。操作の基準を満たした残基を下記の表１に列挙し、これらのうちのいくつかを、ヘテロ二量体抗体を作製するために調べた。エネルギーの最小化後、選択した側鎖の距離を確認するために、相同性モデリングを適用した。ＡＭＢＥＲ９９力場を使用して、モデリングソフトウェアＭＯＥ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ Ｉｎｃ．）によりモデルを作成した。さらなる実験のために、１０Å未満の側鎖距離のみを考慮した。例えば、Ｋ１４７ＤからＴ１２９Ｒまでの距離は１０．１Åであり、この対形成をさらには追求しなかった。

実施例２：操作されたＦａｂの発現及び精製
重鎖及び軽鎖のＤＮＡをＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で合成し、制限酵素ライゲーションをベースとするクローニング技術を使用して哺乳動物発現ベクターにクローニングした。得られたプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトした。Ｆａｂの一時的な発現のために、各操作された鎖に関して等量のベクターを、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；カタログ番号 Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、懸濁液適応（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ－ａｄａｐｔｅｄ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共トランスフェクトした。典型的には、１ｍｌ当たり１００～２００万個の細胞の密度での懸濁液中の細胞１００ｍｌを、操作された重鎖をコードする発現ベクター５０μｇと、操作された軽鎖をコードする発現ベクター５０μｇとを含むＤＮＡでトランスフェクトした。次いで、組換え発現ベクターを宿主細胞に導入し、７日の期間にわたり細胞をさらに培養して、０．１％のプルロン酸（ｐｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、４ｍＭのグルタミン、及び０．２５μｇ／ｍｌの抗生物質を補充した培養培地（ＨＥＫ、血清フリー培地）に分泌させることにより、構築物を産生させた。次いで、産生された構築物を、免疫親和性クロマトグラフィーを使用して、細胞フリー上清から精製した。ろ過した馴化培地をプロテインＡ樹脂（ＣａｐｔｉｖＡ ＰｒｉＭａｂ（商標），Ｒｅｐｌｉｇｅｎ）３００μｌと混合し、ＰＢＳバッファーｐＨ７．４で平衡化した。この樹脂を１５カラム容量のＰＢＳ ｐＨ７．４で３回洗浄した後、１０カラム容量のプロテインＡ溶出バッファー（５０ｍＭのクエン酸塩、９０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ２．５）でＦａｂを溶出させた。

概念実証研究のために、インハウスで生成した抗ｃ－Ｋｉｔ抗体のＦａｂを選択した。２種の操作された軽鎖が、２種の異なる操作された重鎖に結合するという選択肢を有する競合研究を実施した。検証を容易にするために、ある特定の軽鎖又は重鎖のＣ末端には２個の追加のアラニン残基を融合させたが、他の軽鎖及び重鎖を、電荷が操作された実体のみとして保持した。表２に示すように、２個のアラニン残基を含むか、又は含まない、これらの異なる電荷操作鎖は、質量が異なった。

実施例３：操作されたＦａｂの質量分析
Ｆａｂバリアントの正しい重鎖－軽鎖の対形成の評価を、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＵＶ－ＥＳＩ－ＭＳ）により行なった。簡潔に言うと、精製済タンパク質を、スピン濃縮器（３０００ ＭＷＣＯ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して１００μＬまで濃縮し、１００％の水、０．０５％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、及び１００％のアセトニトリル、０．０４％のＴＦＡを含むＵＰＬＣ（Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｉ－Ｃｌａｓｓ，Ｗａｔｅｒｓ）による逆相クロマトグラフィー（カラムＢＥＨ Ｃ４ １．７μｍ ２．１^＊５０ｍｍ，Ｗａｔｅｒｓ）で分析した。５％～１０％のアセトニトリル（０．２分で０．０４％）の第１の勾配を適用し、次いで１０％～４５％のアセトニトリル（４分で０．０４％）の第２の勾配を適用することにより、Ｆａｂバリアントを８０℃で分離した。溶出したＦａｂバリアントをＵＶ（２１０～４５０ｎｍ）で検出し、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）によりイオン化させた後、ＱＴＯＦ（Ｘｅｖｏ Ｇ２－Ｓ ＱＴｏｆ，Ｗａｔｅｒｓ）により質量を分析した。最後に、注入したＦａｂ混合物の相対組成を、ＵＶシグナルと質量強度との二重積分により決定した。

様々なＨＣ－ＬＣの組み合わせの対形成の結果を表３に示す。右側の欄は、正しいＨＣ－ＬＣの対形成の割合を示す。１００％の値は、誤対形成がなく、軽鎖の１００％がその同種の重鎖に結合したことを示す。例えば、９５％の値は、軽鎖の９５％がその同種の重鎖に結合したが、軽鎖がその同種の重鎖に結合しなかった５％の誤対形成が存在したことを示す。

実施例４：２本のカッパ軽鎖（ＶＨ３－ＶＫ＿ＶＨ３－ＶＫ）を有するＩｇＧへの翻訳
いくつかの好ましい変異セットを、多くのＩｇＧ１の可変領域及び定常領域に導入した。抗Ｃ－Ｋｉｔ抗体（配列番号２９及び３０）に加えて、抗ＨＥＲ３抗体（配列番号３１及び３２）ならびに抗ＩＬ－１７抗体（配列番号３３及び３４）を使用して、ＩｇＧ１設定でＨＣ－ＬＣの対形成を評価した。３種全ての抗体は、サブグループＶＨ３／ＶＫ１のメンバーである。重鎖を正しく構築するために、抗体のＣＨ３ドメインに導入された変異と共に、「ノブ・イントゥ・ホール」技術（Ｒｉｄｗａｙ ｅｔ ａｌ．，上記参照）を使用した。下記の表４に従って、抗体の可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメイン中に、さらなる変異を導入した。

同一細胞中において標準的な一過性ＨＥＫ発現を使用して、変異セットを含むヘテロ二量体抗体を生成し、正しい構築ならびに生化学的特性及び生物物理学的特性に関して評価した。さらに、操作されたヘテロ二量体抗体を、抗原の同時結合に関して評価した。親（非変異）ＩｇＧ１との比較を表５に示す。Ｆａｂヘテロ二量体化の割合を、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＵＶ－ＥＳＩ－ＭＳ；実施例３で説明されている）により決定した。例えば、ＩＬ－１７／ＨＥＲ３ヘテロ二量体抗体で観察した７２％の値は、ＩＬ－１７軽鎖及びＨＥＲ３軽鎖の７２％がそれらの同種の重鎖に結合したが、ＩＬ－１７軽鎖がＨＥＲ３重鎖に結合し且つＨＥＲ３軽鎖がＩＬ－１７重鎖に結合する２８％の誤対形成が存在したことを示す。変異ＩＬ－１７／変異ＨＥＲ３ヘテロ二量体抗体、及び変異ＩＬ－１７／変異ｃ－Ｋｉｔヘテロ二量体抗体、及び変異ｃ－Ｋｉｔ／変異ＨＥＲ３ヘテロ二量体抗体で観察したように、１００％の値は、誤対形成が存在せず、軽鎖の１００％がその同種の重鎖に結合したことを示す。

実施例５：１本のカッパ軽鎖及び１本のラムダ軽鎖（ＶＨ３－ＶＫ＿ＶＨ３－ＶＬ）を有するＩｇＧへの翻訳
抗体のＦａｂ部分に電荷を導入する効果を評価するために、カッパ軽鎖を有する抗体を、ラムダ軽鎖を含む抗体と混合した。好ましい変異セットをＩｇＧ１に導入した。抗ｃ－Ｋｉｔ抗体（配列番号２９及び３０）に加えて、抗ＨＥＲ３抗体（配列番号３１及び３２）、抗ＩＬ－１７抗体（配列番号３３及び３４）、抗ＩＬ－１８抗体（配列番号３５及び３６）を使用して、ＩｇＧ１設定で重鎖－軽鎖の対形成を評価した。ｃ－Ｋｉｔ抗体、ＨＥＲ３抗体及びＩＬ－１７抗体はサブグループＶＨ３－ＶＫ１のメンバーであり、ＩＬ－１８抗体は、サブルグープＶＬ１のメンバーである軽鎖を含む。重鎖の正しい構築を確実にするために、抗体のＣＨ３ドメイン中に導入した変異と共に、「ノブ・イントゥ・ホール技術」（上記参照）を使用した。下記の表６に従って、抗体の可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン、及びＣＬドメイン中に、さらなる変異を導入した。

変異セットを含むヘテロ二量体抗体を生成し、正しい構築に関して評価した。親（非変異）ＩｇＧ１との比較を表７に示す。右側の欄は、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＵＶ－ＥＳＩ－ＭＳ；実施例３で説明されている）を使用して決定した場合のＦａｂヘテロ二量体化の割合を示す。ＩＬ－１７／ＩＬ－１８ヘテロ二量体抗体で観察した７１％の値は、ＩＬ－１７軽鎖及びＩＬ－１８軽鎖の７１％がそれらの同種の重鎖に結合したが、ＩＬ－１７軽鎖がＩＬ－１８重鎖に結合し且つＩＬ－１８軽鎖がＩＬ－１７重鎖に結合する２９％の誤対形成が存在したことを示す。変異ＩＬ－１７／変異ＩＬ－１８ヘテロ二量体抗体、及び変異ｃ－Ｋｉｔ／変異ＩＬ－１８ヘテロ二量体抗体で観察したように、１００％の値は、誤対形成が存在せず、軽鎖の１００％がその同種の重鎖に結合したことを示す。

実施例６：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合分析
操作された抗体のそれらの抗原に対する結合の特徴を明らかにするために、直接結合アッセイを実施した。速度論的結合親和性定数（Ｋｉｎｅｔｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｏｎｓｔａｎｔ）（ＫＤ）を、分析物として組換えヒト抗原を使用して、プロテインＡ補足タンパク質で測定した。測定を、室温でＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により行なった。親和性測定のために、タンパク質を、１０ｍＭのＮａＰ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０，ｐＨ５．８で希釈し、製造業者の推奨（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に従って標準的なアミンカップリング手順を使用して、ＣＭ５研究グレードセンサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ｒｅｆ ＢＲ－１０００－１４）のフローセルに固定した。参照として機能するために、１個のフローセルをブランク固定した。その後に、参照フローセル及び測定フローセルに一連の分析物希釈液を注入することにより、結合データを取得した。データ評価の最中に二重参照を可能にするために、ゼロ濃度の試料（ランニングバッファーのみ）を含めた。データ評価のために、２倍の参照センサグラム（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｄ ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）を使用し、定常状態分析により分析して平衡解離定数（ＫＤ）を作成した。結果を表５にまとめている（欄ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）－ＫＤ（ｎＭ）。

実施例７：示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
表５（欄ＤＳＣ－Ｔｍ（℃））に示すように、熱力測定を使用して、操作されたヘテロ二量体抗体、及びその親抗体の熱安定性を比較した。示差走査マイクロ熱量計（Ｎａｎｏ ＤＳＣ，ＴＡ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で熱量測定を実行した。セル容積は０．５ｍｌであり、加熱速度は１℃／分であった。全てのタンパク質を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１ｍｇ／ｍｌの濃度で使用した。各タンパク質のモル熱容量を、タンパク質を含まない同一のバッファーを含む二重試料との比較により推定した。標準的な手順を使用して、部分モル熱容量及び融解曲線を分析した。サーモグラムをベースライン補正し、濃度を正規化した。

実施例８：フレームワークが異なるＩｇＧへの電荷操作の翻訳
フレームワークが異なる抗体のＦａｂに電荷を導入する効果を評価するために、軽鎖フレームワークＶＫ１、ＶＫ３、ＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３と、重鎖フレームワークＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ５、及びＶＨ６を有する抗体を、カッパ軽鎖ＶＫ１及び重鎖ＶＨ３を含む抗体と混合する。ヒト起源のフレームワーク領域の配列を、Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ，ｂｙ Ｍａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｇｅｒａｒｄ Ｌｅｆｒａｎｃ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ２００１，ＩＳＢＮ ０１２４４１３５１から入手し得る。好ましい変異セットをＩｇＧ１に導入し、対応する、操作されていない親抗体と比較した。ＨＥＲ２及び５種の他の抗原Ａ～Ｅに対する抗体を、抗ＩＬ－１７抗体と組み合わせて使用して、ＩｇＧ１設定で重鎖－軽鎖の誤対形成を評価した。重鎖の正しい構築を確実にするために、「ノブ・イントゥ・ホール」技術（上記参照）を使用した。

抗原ＨＥＲ２又は抗原Ａ～Ｅとして本明細書で列挙された多くの他の抗原を標的とする第１の結合アームと、ＩＬ－１７を標的とする第２の結合アームとを有する二重特異性抗体を生成した。ＨＥＲ２に対する操作された抗体は、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメイン中に置換Ｑ３９Ｄ及びＳ１６５Ｄを含み、カッパＶＬドメイン及びカッパＣＬドメイン中にＱ３８Ｋ及びＱ１２４Ｄを含むか、又はラムダＶＬドメイン及びラムダＣＬドメイン中にＱ３８Ｋ及びＮ１７０Ｒを含んだ。抗原Ａに対する操作された抗体は、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメイン中に置換Ｑ３９Ｄ及びＳ１６５Ｄを含み、ラムダＶＬドメイン及びラムダＣＬドメイン中にＱ３８Ｋ又はＱ３８Ｋ及びＮ１７０Ｒを含んだ。抗原Ｂ、Ｄ、及びＥに対する操作された抗体は、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメイン中に置換Ｑ３９Ｄ及びＳ１６５Ｄを含み、ラムダＶＬドメイン及びラムダＣＬドメイン中にＱ３８Ｋ及びＮ１７０Ｒを含んだ。抗原Ｃに対する操作された抗体は、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメイン中に置換Ｑ３９Ｄ及びＳ１６５Ｄを含み、ラムダＶＬドメイン中にＱ３８Ｋを含んだ。ＩＬ－１７に対する操作された抗体は、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメイン中に置換Ｑ３９Ｋ、Ｋ１４７Ｄ、及びＳ１６５Ｒを含み、カッパＶＬドメイン及びカッパＣＬドメイン中にＱ３８Ｄ、Ｑ１２４Ｋ、及びＫ１６９Ｄを含んだ。操作された二重特異性抗体の重鎖－軽鎖の対形成と、親二重特異性抗体との比較を、下記の表８に示す。生成された、操作された二重特異性抗体のほとんどに関して、液体クロマトグラフィー質量分析によるＦａｂヘテロ二量体化の割合として測定した誤対形成は完全に排除された。それぞれの親二重特異性抗体と比較して、３種の操作された二重特異性抗体の場合には、誤対形成を最大５％観測したのみであった。この実施例は、二重特異性ヘテロ二量体抗体の重鎖－軽鎖の誤対形成の発生が、本明細書で開示された特定の静電気的操作変異を使用することによりほぼ排除され得、特定のフレームワーク領域を含む二重特異性ヘテロ二量体抗体に限定されないことを明確に示す。

実施例９：フレームワークが異なるＩｇＧへの電荷操作及びジスルフィド結合操作の翻訳
二重特異性抗体のＦａｂへの電荷の導入に加えて、天然のＬＣ－ＨＣ鎖間ジスルフィド結合を二重特異性抗体の１個のＦａｂ中の操作されたＶＨ－ＶＬジスルフィド結合に置き換える効果を評価した。軽鎖フレームワークＶＬ２又はＶＬ３と、重鎖フレームワークＶＨ１、ＶＨ２、及びＶＨ５とを有する抗体を、カッパ軽鎖ＶＫ１及び重鎖ＶＨ３を含む抗体と混合した。ヒト起源のフレームワーク領域の配列は、Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ（上記参照）から得られる。好ましい静電気的変異セットを、１個のＦａｂへの操作されたＶＨ－ＶＬジスルフィド結合の付加と共にＩｇＧ１に導入した。１個のＦａｂ中に荷電残基及び非天然のジスルフィド結合を有する、これらの操作された抗体を、１個のアームのみ中に非天然のジスルフィド結合で操作された、対応する親抗体と比較した。４種の抗原（抗原Ｆ、Ｇ、Ｈ、及びＩ）に対する抗体を、抗ＩＬ－１７抗体と組み合わせて使用し、ＩｇＧ１設定で重鎖－軽鎖の誤対形成を評価した。重鎖の正しい構築を確実にするために、「ノブ・イントゥ・ホール」技術（上記参照）を使用した。

抗原Ｆ～Ｉとして本明細書で列挙された抗原を標的とする第１の結合アームと、ＩＬ－１７を標的とする第２の結合アームとを有する二重特異性抗体を生成した。抗原Ｆ～Ｉに対する操作された抗体は、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメイン中に置換Ｑ３９Ｄ及びＳ１６５Ｄを含み、ラムダＶＬドメイン及びラムダＣＬドメイン中にＱ３８Ｋ及びＮ１７０Ｒを含んだ。ＩＬ－１７に対する操作された抗体（配列番号７３及び７４）は、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメイン中に置換Ｑ３９Ｋ、Ｇ４４Ｃ、Ｋ１４７Ｄ、Ｓ１６５Ｒ、及びＣ２２０Ａを含み、カッパＶＬドメイン及びカッパＣＬドメイン中にＱ３８Ｄ、Ｑ１００Ｃ、Ｑ１２４Ｋ、Ｋ１６９Ｄ、及びＣ２１４Ａを含んだ。比較のために、ジスルフィド結合操作のみを有する抗ＩＬ－１７抗体は、それぞれＶＨ－ＣＨ１ドメイン中に置換Ｇ４４Ｃ及びＣ２２０Ａを含み且つＬＣ中にＱ１００Ｃ、Ｃ１２４Ａを含んだ（配列番号７５及び７６）。比較の結果を図１に示し、ウェルの内容物の詳細及び操作された位置を下記の表９に示す。

この方法を使用して、正しく対形成された二重特異性抗体対誤対形成された二重特異性抗体を検出して定量する分析手順を大幅に簡素化し、なぜならば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ又は任意の類似の電気泳動ベースのシステムにより、正しく構築された二重特異性抗体のみが完全長抗体（１５０ｋＤａ）として移動し得たからである。軽鎖と重鎖とが共有結合的に連結されていない誤対形成の場合では、不完全な分子と遊離軽鎖とがゲル上に現れた。電荷操作なしで生成された二重特異性抗体の場合に誤対形成を観察し、遊離した、対形成していない軽鎖（２５ｋＤａのバンド）及び不完全な分子（１２５ｋＤａのバンド）をゲル上で検出した（図１；ウェル７～１０）。逆に、ジスルフィド結合と荷電操作とを組み合わせる二重特異性抗体は、これらのバンドの痕跡のみを示した（図１；ウェル２～５）。この実施例は、二重特異性抗体の１個のＦａｂ中におけるＬＣ－ＨＣ鎖間ジスルフィド結合操作と組み合わせて、本明細書で開示された特定の静電気的操作変異を使用することにより、二重特異性ヘテロ二量体抗体の場合の重鎖－軽鎖の誤対形成の発生を排除し得ることを明確に示す。ジスルフィド結合操作自体は、正しいＬＣ－ＨＣの対形成を駆動するには不十分であると思われた。加えて、重鎖及び軽鎖の誤対形成を電気泳動により測定し得ることから、分析手順が簡素化され、これにより、同種の重鎖及び軽鎖の正しい構築による二重特異性候補のハイスルースクリーニングが可能になる。

本発明は、以下の態様を含む。
［１］
少なくとも２個のＦａｂを含むヘテロ二量体抗体又はその断片であって、少なくとも１個のＦａｂは、
（ａ）操作された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）であり、３９位、１４７位で荷電アミノ酸を含み、且つ１６５位（ＥＵナンバリング）で荷電アミノ酸又は中性アミノ酸を含む操作された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）と、
（ｂ）操作された軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）であり、３８位で荷電アミノ酸を含み、１２４位及び１６９／１７０位（ＥＵナンバリング）で荷電アミノ酸又は中性アミノ酸を含む操作された軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）と
を含み、
前記ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメイン中の前記アミノ酸と、前記ＶＬドメイン及びＣＬドメイン中の前記アミノ酸とは一対で、電荷が相反しているか、又は荷電しており／中性であり、且つヘテロ二量体化に静電気的に有利な界面を形成するように対応している、
ヘテロ二量体抗体又はその断片。
［２］
液体クロマトグラフィー質量分析により決定した場合に、少なくとも９５％のヘテロ二量体化が達成されている、［１］に記載のヘテロ二量体抗体又はその断片。
［３］
前記操作されたＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインは、３９位で酸性アミノ酸を含み、１４７位で塩基性アミノ酸を含み、且つ１６５位で酸性アミノ酸を含み、対応する前記操作されたＶＬドメイン及びＣＬドメインは、３８位で塩基性アミノ酸を含み、１２４位で酸性アミノ酸を含み、且つ１６９／１７０位で塩基性アミノ酸を含む、［１］又は［２］に記載のヘテロ二量体抗体又はその断片。
［４］
前記操作されたＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインは、３９位で塩基性アミノ酸を含み、１４７位で酸性アミノ酸を含み、且つ１６５位で塩基性アミノ酸を含み、対応する前記操作されたＶＬドメイン及びＣＬドメインは、３８位で酸性アミノ酸を含み、１２４位で塩基性アミノ酸を含み、且つ１６９／１７０位で酸性アミノ酸を含む、［１］又は［２］に記載のヘテロ二量体抗体又はその断片。
［５］
前記操作された重鎖可変ドメインは、ＶＨ１サブタイプ、ＶＨ２サブタイプ、ＶＨ３サブタイプ、ＶＨ５サブタイプ、又はＶＨ６サブタイプに由来する、［１］～［４］のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体又はその断片。
［６］
前記操作された軽鎖可変ドメインは、Ｖκ１サブファミリ又はＶκ３サブファミリに由来し、且つ３８位、１２４位及び１６９位で荷電アミノ酸を含む、［１］～［５］のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体又はその断片。
［７］
前記操作された軽鎖可変ドメインは、Ｖλ１サブファミリ、Ｖλ２サブファミリ、又はＶλ３サブファミリに由来し、且つ３８位、１２４位及び１７０位で荷電アミノ酸を含む、［１］～［５］のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体又はその断片。
［８］
Ｖκ１サブファミリ又はＶκ３サブファミリの操作された軽鎖可変ドメインと、Ｖλ１サブファミリ、Ｖλ２サブファミリ、又はＶλ３サブファミリの操作された軽鎖可変ドメインとを含む［１］～［７］のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体又はその断片。
［９］
ＩｇＧ Ｆｃ領域を含む［１］～［８］のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体又はその断片。
［１０］
前記ＩｇＧ Ｆｃ領域は、３３６位で置換を有する第１のＣＨ３領域と、３３６位、３６８位、及び４０７位で置換を有する第２のＣＨ３領域とを含む、［９］に記載のヘテロ二量体抗体又はその断片。
［１１］
前記ＩｇＧ Ｆｃ領域は、３３６位及び３５４位で置換を有する第１のＣＨ３領域と、３３６位、３６８位、４０７位、及び３４９位で置換を有する第２のＣＨ３領域とを含む、［９］に記載のヘテロ二量体抗体又はその断片。
［１２］
前記第１のＣＨ３領域は、置換Ｔ３３６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、前記第２のＣＨ３領域は、置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ａ、及びＹ３４９Ｃを含む、［１１］に記載のヘテロ二量体抗体又はその断片。
［１３］
ｉ．前記ＶＨ及びＣＨ１中のＱ３９Ｄ及びＳ１６５Ｄ、ならびに前記ＶＬ中のＱ３８Ｋ；
ｉｉ．前記ＶＨ及びＣＨ１中のＱ３９Ｋ及びＫ１４７Ｄ、ならびに前記カッパＶＬ及びカッパＣＬ中のＱ３８Ｄ及びＱ１２４Ｋ；
ｉｉｉ．前記ＶＨ及びＣＨ１中のＱ３９Ｄ及びＳ１６５Ｄ、ならびに前記カッパＶＬ及びカッパＣＬ中のＱ３８Ｋ及びＱ１２４Ｄ；
ｉｖ．前記ＶＨ及びＣＨ１中のＱ３９Ｋ、Ｋ１４７Ｄ、及びＳ１６５Ｒ、ならびに前記カッパＶＬ及びカッパＣＬ中のＱ３８Ｄ、Ｑ１２４Ｋ、及びＫ１６９Ｄ；
ｖ．前記ＶＨ及びＣＨ１中のＱ３９Ｄ及びＳ１６５Ｄ、ならびに前記ラムダＶＬ及びラムダＣＬ中のＱ３８Ｋ、Ｅ１２４Ｄ、及びＮ１７０Ｋ；
ならびに
ｖｉ．前記ＶＨ及びＣＨ１中のＱ３９Ｄ及びＳ１６５Ｄ、ならびに前記ラムダＶＬ及びラムダＣＬ中のＱ３８Ｋ及びＮ１７０Ｒ
からなる群から選択される置換を含む［１］～［１２］のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体又はその断片。
［１４］
液体クロマトグラフィー質量分析により決定した場合に、最大１００％のヘテロ二量体化が達成されている、［１］～［１３］のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体又はその断片。
［１５］
追加のＦａｂは、
操作された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）であって、３９位、１４７位で荷電アミノ酸を含み、且つ１６５位（ＥＵナンバリング）で荷電アミノ酸又は中性アミノ酸を含む操作された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）と、
操作された軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）であって、３８位で荷電アミノ酸を含み、且つ１２４位及び１６９／１７０位（ＥＵナンバリング）で荷電アミノ酸又は中性アミノ酸を含む、操作された軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）と
を含み、
前記ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメイン中の前記アミノ酸と、前記ＶＬドメイン及びＣＬドメイン中の前記アミノ酸とは一対で、電荷が相反しているか、又は荷電しており／中性であり、且つヘテロ二量体化に静電気的に有利な界面を形成するように対応し、
１個のＦａｂの前記操作されたＶＨ中の３９位、１４７位、及び１６５位のそれぞれでの電荷は、前記追加のＦａｂの前記操作されたＶＨ中の３９位、１４７位、及び１６５位のそれぞれでの電荷と異なる、
［１］～［１４］のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体又はその断片。
［１６］
１個のＦａｂは、前記ＶＨ及びＣＨ１中に置換Ｑ３９Ｋ、Ｋ１４７Ｄ、及びＳ１６５Ｒを含み、且つ前記ＶＬ及びＣＬ中に置換Ｑ３８Ｄ、Ｑ１２４Ｋ、及びＫ１６９Ｄを含み、前記追加のＦａｂは、前記ＶＨ及びＣＨ１中に置換Ｑ３９Ｄ及びＳ１６５Ｄを含み、且つ前記ＶＨ及びＣＬ中に、（ｉ）前記カッパＶＬ及びカッパＣＬ中のＱ３８Ｋ及びＱ１２４Ｄ；（ｉｉ）前記ラムダＶＬ中のＱ３８Ｋ；（ｉｉｉ）前記ラムダＶＬ及びラムダＣＬ中のＱ３８Ｋ及びＮ１７０Ｒ、又は（ｉｖ）前記ラムダＶＬ及びラムダＣＬ中のＱ３８Ｋ、Ｅ１２４Ｄ、及びＮ１７０Ｋから選択される置換を含む、［１５］に記載のヘテロ二量体抗体又はその断片。
［１７］
前記追加のＦａｂ中の鎖間ジスルフィド結合は、操作されたＶＨ－ＶＬ鎖間ジスルフィド結合に置き換えられている、［１５］又は［１６］に記載のヘテロ二量体抗体又はその断片。
［１８］
１個のＦａｂは、前記ＶＨ及びＣＨ１中に置換Ｑ３９Ｋ、Ｋ１４７Ｄ、及びＳ１６５Ｒを含み、且つ前記ＶＬ及びＣＬ中に置換Ｑ３８Ｄ、Ｑ１２４Ｋ、及びＫ１６９Ｄを含み、前記追加のＦａｂは、前記ＶＨ及びＣＨ１中に置換Ｑ３９Ｄ、Ｇ４４Ｃ、Ｓ１６５Ｄ、及びＣ２２０Ａを含み、且つ前記ＶＬ及びＣＬ中に、（ｉ）前記カッパＶＬ及びカッパＣＬ中のＱ３８Ｋ、Ｑ１００Ｃ、Ｑ１２４Ｄ、及びＣ２１４Ａ；（ｉｉ）前記ラムダＶＬ中のＱ３８Ｋ、Ｇ１００Ｃ、及びＣ２１４Ａ；（ｉｉｉ）前記ラムダＶＬ及びラムダＣＬ中のＱ３８Ｋ、Ｇ１００Ｃ Ｎ１７０Ｒ、及びＣ２１４Ａ；又は（ｉｖ）前記ラムダＶＬ及びラムダＣＬ中のＱ３８Ｋ、Ｇ１００Ｃ、Ｅ１２４Ｄ、Ｎ１７０Ｋ、及びＣ２１４Ａから選択される置換を含む、［１７］に記載のヘテロ二量体抗体又はその断片。
［１９］
界面を形成するように対応している、操作されたＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインならびに操作されたＶＬドメイン及びＣＬドメインを含むヘテロ二量体抗体又はその断片を調製する方法であって、前記ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメイン中の少なくとも２個のアミノ酸を置換し、その結果、前記操作されたドメインは、３９位、１４７位及び１６５位（ＥＵナンバリング）で荷電アミノ酸又は中性アミノ酸を含む、置換すること、ならびに前記ＶＬドメイン及びＣＬドメイン中のアミノ酸を置換し、その結果、前記操作されたドメインは、３８位、１２４位、及び１６９／１７０位（ＥＵナンバリング）で荷電アミノ酸又は中性アミノ酸を含む、置換することを含み、前記ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメイン中の前記荷電アミノ酸と、前記ＶＬドメイン及びＣＬドメイン中の前記界面の対応するアミノ酸とは一対で、電荷が相反しているか、又は荷電しており／中性であり、且つヘテロ二量体化に静電気的に有利な界面を形成している、方法。
［２０］
液体クロマトグラフィー質量分析により決定した場合に、少なくとも９５％のヘテロ二量体化が達成されている、［１９］に記載の方法。
［２１］
前記操作されたＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインは、３９位で酸性アミノ酸を含み、１４７位で塩基性アミノ酸を含み、且つ１６５位で酸性アミノ酸を含み、前記操作されたＶＬドメイン及びＣＬドメインは、３８位で塩基性アミノ酸を含み、１２４位で酸性アミノ酸を含み、且つ１６９／１７０位で塩基性アミノ酸を含む、［１９］又は［２０］に記載の方法。
［２２］
前記操作されたＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインは、３９位で塩基性アミノ酸を含み、１４７位で酸性アミノ酸を含み、且つ１６５位で塩基性アミノ酸を含み、前記操作されたＶＬドメイン及びＣＬドメインは、３８位で酸性アミノ酸を含み、１２４位で塩基性アミノ酸を含み、且つ１６９／１７０位で酸性アミノ酸を含む、［１９］又は［２０］に記載の方法。
［２３］
前記操作された重鎖可変ドメインは、ＶＨ１サブタイプ、ＶＨ２サブタイプ、ＶＨ３サブタイプ、ＶＨ５サブタイプ、又はＶＨ６サブタイプに由来する、［１９］～［２２］のいずれか一項に記載の方法。
［２４］
前記操作された軽鎖可変ドメインは、Ｖκ１サブファミリ又はＶκ３サブファミリに由来し、且つ３８位、１２４位及び１６９位で荷電アミノ酸を含む、［１９］～［２３］のいずれか一項に記載の方法。
［２５］
前記操作された軽鎖可変ドメインは、Ｖλ１サブファミリ、Ｖλ２サブファミリ、又はＶλ３サブファミリに由来し、且つ３８位、１２４位及び１７０位で荷電アミノ酸を含む、［１９］～［２３］のいずれか一項に記載の方法。
［２６］
前記ヘテロ二量体抗体又はその断片は、Ｖκ１サブファミリ又はＶκ３サブファミリの操作された軽鎖可変ドメインと、Ｖλ１サブファミリ、Ｖλ２サブファミリ、又はＶλ３サブファミリの操作された軽鎖可変ドメインとを含む、［１９］～［２５］のいずれか一項に記載の方法。
［２７］
前記ヘテロ二量体抗体又はその断片はＩｇＧ Ｆｃ領域を含む、［１９］～［２６］のいずれか一項に記載の方法。
［２８］
前記ＩｇＧ Ｆｃ領域は、３３６位で置換を有する第１のＣＨ３領域と、３３６位、３６８位、及び４０７位で置換を有する第２のＣＨ３領域とを含む、［２７］に記載の方法。
［２９］
前記ＩｇＧ Ｆｃ領域は、３３６位及び３５４位で置換を有する第１のＣＨ３領域と、３３６位、３６８位、４０７位、及び３４９位で置換を有する第２のＣＨ３領域とを含む、［２７］に記載の方法。
［３０］
前記第１のＣＨ３領域は、置換Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、且つ前記第２のＣＨ３領域は、置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ａ、及びＹ３４９Ｃを含む、［２９］に記載の方法。
［３１］
前記ヘテロ二量体抗体又はその断片は、
ｉ．前記ＶＨ及びＣＨ１中のＱ３９Ｄ及びＳ１６５Ｄ、ならびに前記ＶＬ及びＣＬ中のＱ３８Ｋ；
ｉｉ．前記ＶＨ及びＣＨ１中のＱ３９Ｋ及びＫ１４７Ｄ、ならびに前記カッパＶＬ及びカッパＣＬ中のＱ３８Ｄ及びＱ１２４Ｋ；
ｉｉｉ．前記ＶＨ及びＣＨ１中のＱ３９Ｄ及びＳ１６５Ｄ、ならびに前記カッパＶＬ及びカッパＣＬ中のＱ３８Ｋ及びＱ１２４Ｄ；
ｉｖ．前記ＶＨ及びＣＨ１中のＱ３９Ｋ、Ｋ１４７Ｄ、及びＳ１６５Ｒ、ならびに前記カッパＶＬ及びカッパＣＬ中のＱ３８Ｄ、Ｑ１２４Ｋ、及びＫ１６９Ｄ；
ｖ．前記ＶＨ及びＣＨ１中のＱ３９Ｄ及びＳ１６５Ｄ、ならびに前記ラムダＶＬ及びラムダＣＬ中のＱ３８Ｋ、Ｅ１２４Ｄ、及びＮ１７０Ｋ；
ならびに
ｖｉ．前記ＶＨ及びＣＨ１中のＱ３９Ｄ及びＳ１６５Ｄ、ならびに前記ラムダＶＬ及びラムダＣＬ中のＱ３８Ｋ及びＮ１７０Ｒ
からなる群から選択される置換を含む、［１９］～［３０］のいずれか一項に記載の方法。
［３２］
液体クロマトグラフィー質量分析により決定した場合に、最大１００％のヘテロ二量体化が達成されている、［１９］～［３１］のいずれか一項に記載の方法。
［３３］
前記ヘテロ二量体抗体又はその断片は追加のＦａｂを含み、前記追加のＦａｂは、
操作された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）であって、３９位、１４７位で荷電アミノ酸を含み、且つ１６５位（ＥＵナンバリング）で荷電アミノ酸又は中性アミノ酸を含む操作された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）と、
操作された軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）であって、３８位で荷電アミノ酸を含み、且つ１２４位及び１６９／１７０位（ＥＵナンバリング）で荷電アミノ酸又は中性アミノ酸を含む操作された軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）と
を含み、
前記ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメイン中の前記アミノ酸と、前記ＶＬドメイン及びＣＬドメイン中の前記アミノ酸とは一対で、電荷が相反しているか、又は荷電しており／中性であり、且つヘテロ二量体化に静電気的に有利な界面を形成するように対応し、
１個のＦａｂの前記操作されたＶＨ中の３９位、１４７位及び１６５位のそれぞれでの電荷は、前記追加のＦａｂの前記操作されたＶＨ中の３９位、１４７位及び１６５位のそれぞれでの電荷と異なる、
［１９］～［３２］のいずれか一項に記載の方法。
［３４］
１個のＦａｂは、前記ＶＨ及びＣＨ１中に置換Ｑ３９Ｋ、Ｋ１４７Ｄ、及びＳ１６５Ｒを含み、且つ前記ＶＬ及びＣＬ中に置換Ｑ３８Ｄ、Ｑ１２４Ｋ、及びＫ１６９Ｄを含み、前記追加のＦａｂは、前記ＶＨ及びＣＨ１中に置換Ｑ３９Ｄ及びＳ１６５Ｄを含み、且つ前記ＶＨ及びＣＬ中に、（ｉ）前記カッパＶＬ及びカッパＣＬ中のＱ３８Ｋ及びＱ１２４Ｄ；（ｉｉ）前記ラムダＶＬ中のＱ３８Ｋ；（ｉｉｉ）前記ラムダＶＬ及びラムダＣＬ中のＱ３８Ｋ及びＮ１７０Ｒ、又は（ｉｖ）前記ラムダＶＬ及びラムダＣＬ中のＱ３８Ｋ、Ｅ１２４Ｄ及びＮ１７０Ｋから選択される置換を含む、［３３］に記載の方法。
［３５］
前記追加のＦａｂの天然のＬＣ－ＨＣ鎖間ジスルフィド結合は、操作されたＶＨ－ＶＬ鎖間ジスルフィド結合に置き換えられている、［３３］又は［３４］に記載の方法。
［３６］
１個のＦａｂは、前記ＶＨ及びＣＨ１中に置換Ｑ３９Ｋ、Ｋ１４７Ｄ、及びＳ１６５Ｒを含み、且つ前記ＶＬ及びＣＬ中に置換Ｑ３８Ｄ、Ｑ１２４Ｋ、及びＫ１６９Ｄを含み、前記追加のＦａｂは、前記ＶＨ及びＣＨ１中に置換Ｑ３９Ｄ、Ｇ４４Ｃ、Ｓ１６５Ｄ、及びＣ２２０Ａを含み、且つ前記ＶＨ及びＣＬ中に、（ｉ）前記カッパＶＬ及びカッパＣＬ中のＱ３８Ｋ、Ｑ１００Ｃ、Ｑ１２４Ｄ、及びＣ２１４Ａ；（ｉｉ）前記ラムダＶＬ中のＱ３８Ｋ、Ｇ１００Ｃ、及びＣ２１４Ａ；（ｉｉｉ）前記ラムダＶＬ及びラムダＣＬ中のＱ３８Ｋ、Ｇ１００Ｃ Ｎ１７０Ｒ、及びＣ２１４Ａ、又は（ｉｖ）前記ラムダＶＬ及びラムダＣＬ中のＱ３８Ｋ、Ｇ１００Ｃ、Ｅ１２４Ｄ、Ｎ１７０Ｋ、及びＣ２１４Ａから選択される置換を含む、［３５］に記載の方法。
［３７］
［１］～［１６］のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体又はその断片を調製する方法であって、
（ａ）前記操作されたＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインのポリペプチドをコードする核酸と、前記操作されたＶＬドメイン及びＣＬドメインのポリペプチドを含む核酸とを含む宿主細胞を培養する工程であり、前記培養された宿主細胞は、前記操作されたポリペプチドを発現する、培養する工程、
ならびに
（ｂ）前記宿主細胞の培養物から前記ヘテロ二量体抗体又はその断片を回収する工程
を含む方法。
［３８］
［１７］又は［１８］に記載のヘテロ二量体抗体又はその断片を調製する方法であって、
（ａ）前記操作されたＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインのポリペプチドをコードする核酸と、前記操作されたＶＬドメイン及びＣＬドメインのポリペプチドを含む核酸とを含む宿主細胞を培養する工程であり、前記培養された宿主細胞は、前記操作されたポリペプチドを発現する、培養する工程、
（ｂ）前記宿主細胞の培養物から前記ヘテロ二量体抗体又はその断片を回収する工程、
ならびに
（ｃ）電気泳動システムを使用して、正しい重鎖－軽鎖の対形成を決定する工程
を含む方法。

Claims (34)

1. 少なくとも２個のＦａｂを含むヘテロ二量体抗体またはその抗原結合断片であって、少なくとも１個のＦａｂは、
   （ａ）静電気的操作によって改変された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）であり、３９位で酸性アミノ酸を含み、１４７位で塩基性アミノ酸を含み、且つ１６５位（ＥＵナンバリング）で酸性アミノ酸を含む静電気的操作によって改変された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）と、静電気的操作によって改変された軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）であり、３８位で塩基性アミノ酸を含み、１２４位で酸性アミノ酸を含み、且つ１６９位または１７０位（ＥＵナンバリング）で塩基性アミノ酸を含む静電気的操作によって改変された軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）と
   を含むか、または
   （ｂ）静電気的操作によって改変されたＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインであり、３９位で塩基性アミノ酸を含み、１４７位で酸性アミノ酸を含み、且つ１６５位（ＥＵナンバリング）で塩基性アミノ酸を含む静電気的操作によって改変されたＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインと、静電気的操作によって改変されたＶＬドメインおよびＣＬドメインであり、３８位で酸性アミノ酸を含み、１２４位で塩基性アミノ酸を含み、且つ１６９位または１７０位（ＥＵナンバリング）で酸性アミノ酸を含む静電気的操作によって改変されたＶＬドメインおよびＣＬドメインと
   を含み、
   前記ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメイン中の複数の前記アミノ酸と、前記ＶＬドメインおよびＣＬドメイン中の複数の前記アミノ酸とは一対で電荷が相反しており、且つヘテロ二量体化に静電気的に有利な界面を形成するように対応している、
   ヘテロ二量体抗体またはその抗原結合断片。
2. 液体クロマトグラフィー質量分析により決定した場合に、少なくとも９５％のヘテロ二量体化が達成されている、請求項１に記載のヘテロ二量体抗体またはその抗原結合断片。
3. 前記静電気的操作によって改変された重鎖可変ドメインは、ＶＨ１サブタイプ、ＶＨ２サブタイプ、ＶＨ３サブタイプ、ＶＨ５サブタイプ、またはＶＨ６サブタイプに由来する、請求項１または２に記載のヘテロ二量体抗体またはその抗原結合断片。
4. 前記静電気的操作によって改変された軽鎖可変ドメインは、Ｖκ１サブファミリ又はＶκ３サブファミリに由来し、且つ３８位、１２４位及び１６９位（ＥＵナンバリング）で荷電アミノ酸を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体又はその抗原結合断片。
5. 前記静電気的操作によって改変された軽鎖可変ドメインは、Ｖλ１サブファミリ、Ｖλ２サブファミリ、又はＶλ３サブファミリに由来し、且つ３８位、１２４位及び１７０位（ＥＵナンバリング）で荷電アミノ酸を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体又はその抗原結合断片。
6. Ｖκ１サブファミリ又はＶκ３サブファミリの静電気的操作によって改変された軽鎖可変ドメインと、Ｖλ１サブファミリ、Ｖλ２サブファミリ、又はＶλ３サブファミリの静電気的操作によって改変された軽鎖可変ドメインとを含む請求項１～５のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体又はその抗原結合断片。
7. ＩｇＧ Ｆｃ領域を含む請求項１～６のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体又はその抗原結合断片。
8. 前記ＩｇＧ Ｆｃ領域は、３６６位で置換を有する第１のＣＨ３領域と、３６６位、３６８位、及び４０７位（ＥＵナンバリング）で置換を有する第２のＣＨ３領域とを含む、請求項７に記載のヘテロ二量体抗体又はその抗原結合断片。
9. 前記ＩｇＧ Ｆｃ領域は、３６６位及び３５４位で置換を有する第１のＣＨ３領域と、３６６位、３６８位、４０７位、及び３４９位（ＥＵナンバリング）で置換を有する第２のＣＨ３領域とを含む、請求項７に記載のヘテロ二量体抗体又はその抗原結合断片。
10. 前記第１のＣＨ３領域は、置換Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、前記第２のＣＨ３領域は、置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ａ、及びＹ３４９Ｃ（ＥＵナンバリング）を含む、請求項９に記載のヘテロ二量体抗体又はその抗原結合断片。
11. ｉ．前記ＶＨ及びＣＨ１中のＱ３９Ｄ及びＳ１６５Ｄ、ならびに前記ＶＬ中のＱ３８Ｋ；
    ｉｉ．前記ＶＨ及びＣＨ１中のＱ３９Ｋ及びＫ１４７Ｄ、ならびにカッパＶＬ及びカッパＣＬ中のＱ３８Ｄ及びＱ１２４Ｋ；
    ｉｉｉ．前記ＶＨ及びＣＨ１中のＱ３９Ｄ及びＳ１６５Ｄ、ならびにカッパＶＬ及びカッパＣＬ中のＱ３８Ｋ及びＱ１２４Ｄ；
    ｉｖ．前記ＶＨ及びＣＨ１中のＱ３９Ｋ、Ｋ１４７Ｄ、及びＳ１６５Ｒ、ならびにカッパＶＬ及びカッパＣＬ中のＱ３８Ｄ、Ｑ１２４Ｋ、及びＫ１６９Ｄ；
    ｖ．前記ＶＨ及びＣＨ１中のＱ３９Ｄ及びＳ１６５Ｄ、ならびにラムダＶＬ及びラムダＣＬ中のＱ３８Ｋ、Ｅ１２４Ｄ、及びＮ１７０Ｋ；
    ならびに
    ｖｉ．前記ＶＨ及びＣＨ１中のＱ３９Ｄ及びＳ１６５Ｄ、ならびにラムダＶＬ及びラムダＣＬ中のＱ３８Ｋ及びＮ１７０Ｒ
    からなる群から選択される置換（ＥＵナンバリング）を含む請求項１～１０のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体又はその抗原結合断片。
12. 液体クロマトグラフィー質量分析により決定した場合に、９５から１００％の間のヘテロ二量体化が達成されている、請求項１～１１のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体又はその抗原結合断片。
13. 追加のＦａｂは、
    静電気的操作によって改変された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）であって、３９位、１４７位で荷電アミノ酸を含み、且つ１６５位（ＥＵナンバリング）で荷電アミノ酸又は中性アミノ酸を含む静電気的操作によって改変された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）と、
    静電気的操作によって改変された軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）であって、３８位で荷電アミノ酸を含み、且つ１２４位及び１６９位または１７０位（ＥＵナンバリング）で荷電アミノ酸又は中性アミノ酸を含む、静電気的操作によって改変された軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）と
    を含み、
    前記ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメイン中の複数の前記アミノ酸と、前記ＶＬドメイン及びＣＬドメイン中の複数の前記アミノ酸とは一対で、電荷が相反しているか、又は荷電しており／中性であり、且つヘテロ二量体化に静電気的に有利な界面を形成するように対応し、
    １個のＦａｂの前記静電気的操作によって改変されたＶＨ中の３９位、１４７位、及び１６５位（ＥＵナンバリング）のそれぞれでの電荷は、前記追加のＦａｂの前記静電気的操作によって改変されたＶＨ中の３９位、１４７位、及び１６５位（ＥＵナンバリング）のそれぞれでの電荷と異なる、
    請求項１～１２のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体又はその抗原結合断片。
14. １個のＦａｂは、前記ＶＨ及びＣＨ１中に置換Ｑ３９Ｋ、Ｋ１４７Ｄ、及びＳ１６５Ｒを含み、且つ前記ＶＬ及びＣＬ中に置換Ｑ３８Ｄ、Ｑ１２４Ｋ、及びＫ１６９Ｄ（ＥＵナンバリング）を含み、前記追加のＦａｂは、前記ＶＨ及びＣＨ１中に置換Ｑ３９Ｄ及びＳ１６５Ｄを含み、且つ前記ＶＨ及びＣＬ中に、（ｉ）カッパＶＬ及びカッパＣＬ中のＱ３８Ｋ及びＱ１２４Ｄ；（ｉｉ）ラムダＶＬ中のＱ３８Ｋ；（ｉｉｉ）ラムダＶＬ及びラムダＣＬ中のＱ３８Ｋ及びＮ１７０Ｒ、又は（ｉｖ）ラムダＶＬ及びラムダＣＬ中のＱ３８Ｋ、Ｅ１２４Ｄ、及びＮ１７０Ｋから選択される置換（ＥＵナンバリング）を含む、請求項１３に記載のヘテロ二量体抗体又はその抗原結合断片。
15. 前記追加のＦａｂ中の鎖間ジスルフィド結合は、前記ＶＨ及びＣＨ１ドメインに置換Ｇ４４ＣおよびＣ２２０Ａ（ＥＵナンバリング）を、前記ＶＬ及びＣＬドメインに置換Ｑ１００ＣおよびＣ１２４Ａ（ＥＵナンバリング）をそれぞれ含む、改変されたＶＨ－ＶＬ鎖間ジスルフィド結合に置き換えられている、請求項１３又は１４に記載のヘテロ二量体抗体又はその抗原結合断片。
16. １個のＦａｂは、前記ＶＨ及びＣＨ１中に置換Ｑ３９Ｋ、Ｋ１４７Ｄ、及びＳ１６５Ｒ（ＥＵナンバリング）を含み、且つ前記ＶＬ及びＣＬ中に置換Ｑ３８Ｄ、Ｑ１２４Ｋ、及びＫ１６９Ｄ（ＥＵナンバリング）を含み、前記追加のＦａｂは、前記ＶＨ及びＣＨ１中に置換Ｑ３９Ｄ、Ｇ４４Ｃ、Ｓ１６５Ｄ、及びＣ２２０Ａ（ＥＵナンバリング）を含み、且つ前記ＶＬ及びＣＬ中に、（ｉ）カッパＶＬ及びカッパＣＬ中のＱ３８Ｋ、Ｑ１００Ｃ、Ｑ１２４Ｄ、及びＣ２１４Ａ；（ｉｉ）ラムダＶＬ中のＱ３８Ｋ、Ｇ１００Ｃ、及びＣ２１４Ａ；（ｉｉｉ）ラムダＶＬ及びラムダＣＬ中のＱ３８Ｋ、Ｇ１００Ｃ、Ｎ１７０Ｒ、及びＣ２１４Ａ；又は（ｉｖ）ラムダＶＬ及びラムダＣＬ中のＱ３８Ｋ、Ｇ１００Ｃ、Ｅ１２４Ｄ、Ｎ１７０Ｋ、及びＣ２１４Ａから選択される置換（ＥＵナンバリング）を含む、請求項１５に記載のヘテロ二量体抗体又はその抗原結合断片。
17. 界面を形成するように対応している、静電気的操作によって改変されたＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインならびに静電気的操作によって改変されたＶＬドメインおよびＣＬドメインを含むヘテロ二量体抗体またはその抗原結合断片を調製する方法であって、前記ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメイン中の少なくとも２個のアミノ酸を置換し、その結果、前記静電気的操作によって改変されたドメインは、３９位で酸性アミノ酸を含み、１４７位で塩基性アミノ酸を含み、且つ１６５位（ＥＵナンバリング）で酸性アミノ酸を含む、置換すること、ならびに前記ＶＬドメインおよびＣＬドメイン中のアミノ酸を置換し、その結果、前記静電気的操作によって改変されたドメインは、３８位で塩基性アミノ酸を含み、１２４位で酸性アミノ酸を含み、且つ１６９位または１７０位（ＥＵナンバリング）で塩基性アミノ酸を含む、置換することを含み、前記ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメイン中の複数の前記アミノ酸と、前記ＶＬドメインおよびＣＬドメイン中の前記界面の対応する複数のアミノ酸とは一対で電荷が相反しており、且つヘテロ二量体化に静電気的に有利な界面を形成している、方法。
18. 液体クロマトグラフィー質量分析により決定した場合に、少なくとも９５％のヘテロ二量体化が達成されている、請求項１７に記載の方法。
19. 前記静電気的操作によって改変された重鎖可変ドメインは、ＶＨ１サブタイプ、ＶＨ２サブタイプ、ＶＨ３サブタイプ、ＶＨ５サブタイプ、又はＶＨ６サブタイプに由来する、請求項１７又は１８に記載の方法。
20. 前記静電気的操作によって改変された軽鎖可変ドメインは、Ｖκ１サブファミリ又はＶκ３サブファミリに由来し、且つ３８位、１２４位及び１６９位で荷電アミノ酸を含む、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記静電気的操作によって改変された軽鎖可変ドメインは、Ｖλ１サブファミリ、Ｖλ２サブファミリ、又はＶλ３サブファミリに由来し、且つ３８位、１２４位及び１７０位で荷電アミノ酸を含む、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記ヘテロ二量体抗体又はその抗原結合断片は、Ｖκ１サブファミリ又はＶκ３サブファミリの静電気的操作によって改変された軽鎖可変ドメインと、Ｖλ１サブファミリ、Ｖλ２サブファミリ、又はＶλ３サブファミリの静電気的操作によって改変された軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１７～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記ヘテロ二量体抗体又はその抗原結合断片はＩｇＧ Ｆｃ領域を含む、請求項１７～２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記ＩｇＧ Ｆｃ領域は、３６６位で置換を有する第１のＣＨ３領域と、３６６位、３６８位、及び４０７位（ＥＵナンバリング）で置換を有する第２のＣＨ３領域とを含む、請求項２３に記載の方法。
25. 前記ＩｇＧ Ｆｃ領域は、３６６位及び３５４位で置換を有する第１のＣＨ３領域と、３６６位、３６８位、４０７位、及び３４９位（ＥＵナンバリング）で置換を有する第２のＣＨ３領域とを含む、請求項２３に記載の方法。
26. 前記第１のＣＨ３領域は、置換Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを含み、且つ前記第２のＣＨ３領域は、置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ａ、及びＹ３４９Ｃを含む、請求項２５に記載の方法。
27. 前記ヘテロ二量体抗体又はその抗原結合断片は、
    ｉ．前記ＶＨ及びＣＨ１中のＱ３９Ｄ及びＳ１６５Ｄ、ならびに前記ＶＬ中のＱ３８Ｋ；
    ｉｉ．前記ＶＨ及びＣＨ１中のＱ３９Ｋ及びＫ１４７Ｄ、ならびにカッパＶＬ及びカッパＣＬ中のＱ３８Ｄ及びＱ１２４Ｋ；
    ｉｉｉ．前記ＶＨ及びＣＨ１中のＱ３９Ｄ及びＳ１６５Ｄ、ならびにカッパＶＬ及びカッパＣＬ中のＱ３８Ｋ及びＱ１２４Ｄ；
    ｉｖ．前記ＶＨ及びＣＨ１中のＱ３９Ｋ、Ｋ１４７Ｄ、及びＳ１６５Ｒ、ならびにカッパＶＬ及びカッパＣＬ中のＱ３８Ｄ、Ｑ１２４Ｋ、及びＫ１６９Ｄ；
    ｖ．前記ＶＨ及びＣＨ１中のＱ３９Ｄ及びＳ１６５Ｄ、ならびにラムダＶＬ及びラムダＣＬ中のＱ３８Ｋ、Ｅ１２４Ｄ、及びＮ１７０Ｋ；
    ならびに
    ｖｉ．前記ＶＨ及びＣＨ１中のＱ３９Ｄ及びＳ１６５Ｄ、ならびにラムダＶＬ及びラムダＣＬ中のＱ３８Ｋ及びＮ１７０Ｒ
    からなる群から選択される置換を含む、請求項１７～２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 液体クロマトグラフィー質量分析により決定した場合に、９５から１００％の間のヘテロ二量体化が達成されている、請求項１７～２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記ヘテロ二量体抗体又はその抗原結合断片は追加のＦａｂを含み、前記追加のＦａｂは、
    静電気的操作によって改変された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）であって、３９位、１４７位で荷電アミノ酸を含み、且つ１６５位（ＥＵナンバリング）で荷電アミノ酸又は中性アミノ酸を含む静電気的操作によって改変された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）と、
    静電気的操作によって改変された軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）であって、３８位で荷電アミノ酸を含み、且つ１２４位及び１６９位または１７０位（ＥＵナンバリング）で荷電アミノ酸又は中性アミノ酸を含む静電気的操作によって改変された軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）と
    を含み、
    前記ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメイン中の前記アミノ酸と、前記ＶＬドメイン及びＣＬドメイン中の前記アミノ酸とは一対で、電荷が相反しているか、又は荷電しており／中性であり、且つヘテロ二量体化に静電気的に有利な界面を形成するように対応し、
    １個のＦａｂの前記静電気的操作によって改変されたＶＨ中の３９位、１４７位及び１６５位のそれぞれでの電荷は、前記追加のＦａｂの前記静電気的操作によって改変されたＶＨ中の３９位、１４７位及び１６５位のそれぞれでの電荷と異なる、
    請求項１７～２８のいずれか一項に記載の方法。
30. １個のＦａｂは、前記ＶＨ及びＣＨ１中に置換Ｑ３９Ｋ、Ｋ１４７Ｄ、及びＳ１６５Ｒを含み、且つ前記ＶＬ及びＣＬ中に置換Ｑ３８Ｄ、Ｑ１２４Ｋ、及びＫ１６９Ｄを含み、前記追加のＦａｂは、前記ＶＨ及びＣＨ１中に置換Ｑ３９Ｄ及びＳ１６５Ｄを含み、且つ前記ＶＨ及びＣＬ中に、（ｉ）カッパＶＬ及びカッパＣＬ中のＱ３８Ｋ及びＱ１２４Ｄ；（ｉｉ）ラムダＶＬ中のＱ３８Ｋ；（ｉｉｉ）ラムダＶＬ及びラムダＣＬ中のＱ３８Ｋ及びＮ１７０Ｒ、又は（ｉｖ）ラムダＶＬ及びラムダＣＬ中のＱ３８Ｋ、Ｅ１２４Ｄ及びＮ１７０Ｋから選択される置換を含む、請求項２９に記載の方法。
31. 前記追加のＦａｂの天然のＬＣ－ＨＣ鎖間ジスルフィド結合は、前記ＶＨ及びＣＨ１ドメインに置換Ｇ４４ＣおよびＣ２２０Ａ（ＥＵナンバリング）を、前記ＶＬ及びＣＬドメインに置換Ｑ１００ＣおよびＣ１２４Ａ（ＥＵナンバリング）をそれぞれ含む、改変されたＶＨ－ＶＬ鎖間ジスルフィド結合に置き換えられている、請求項２９又は３０に記載の方法。
32. １個のＦａｂは、前記ＶＨ及びＣＨ１中に置換Ｑ３９Ｋ、Ｋ１４７Ｄ、及びＳ１６５Ｒを含み、且つ前記ＶＬ及びＣＬ中に置換Ｑ３８Ｄ、Ｑ１２４Ｋ、及びＫ１６９Ｄを含み、前記追加のＦａｂは、前記ＶＨ及びＣＨ１中に置換Ｑ３９Ｄ、Ｇ４４Ｃ、Ｓ１６５Ｄ、及びＣ２２０Ａを含み、且つ前記ＶＨ及びＣＬ中に、（ｉ）カッパＶＬ及びカッパＣＬ中のＱ３８Ｋ、Ｑ１００Ｃ、Ｑ１２４Ｄ、及びＣ２１４Ａ；（ｉｉ）ラムダＶＬ中のＱ３８Ｋ、Ｇ１００Ｃ、及びＣ２１４Ａ；（ｉｉｉ）ラムダＶＬ及びラムダＣＬ中のＱ３８Ｋ、Ｇ１００Ｃ Ｎ１７０Ｒ、及びＣ２１４Ａ、又は（ｉｖ）ラムダＶＬ及びラムダＣＬ中のＱ３８Ｋ、Ｇ１００Ｃ、Ｅ１２４Ｄ、Ｎ１７０Ｋ、及びＣ２１４Ａから選択される置換を含む、請求項３１に記載の方法。
33. 請求項１～１４のいずれか一項に記載のヘテロ二量体抗体又はその抗原結合断片を調製する方法であって、
    （ａ）前記静電気的操作によって改変されたＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインのポリペプチドをコードする核酸と、前記静電気的操作によって改変されたＶＬドメイン及びＣＬドメインのポリペプチドを含む核酸とを含む宿主細胞を培養する工程であり、前記培養された宿主細胞は、前記静電気的操作によって改変されたポリペプチドを発現する、培養する工程、
    ならびに
    （ｂ）前記宿主細胞の培養物から前記ヘテロ二量体抗体又はその抗原結合断片を回収する工程を含む方法。
34. 請求項１５又は１６に記載のヘテロ二量体抗体又はその抗原結合断片を調製する方法であって、
    （ａ）前記静電気的操作によって改変されたＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインのポリペプチドをコードする核酸と、前記静電気的操作によって改変されたＶＬドメイン及びＣＬドメインのポリペプチドを含む核酸とを含む宿主細胞を培養する工程であり、前記培養された宿主細胞は、前記静電気的操作によって改変されたポリペプチドを発現する、培養する工程、
    （ｂ）前記宿主細胞の培養物から前記ヘテロ二量体抗体又はその抗原結合断片を回収する工程、ならびに
    （ｃ）電気泳動システムを使用して、正しい重鎖－軽鎖の対形成を決定する工程
    を含む方法。
    

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