ES2543201T3 - Métodos y agentes que mejoran la dirección a las células tumorales que expresan CD138 - Google Patents

Métodos y agentes que mejoran la dirección a las células tumorales que expresan CD138 Download PDF

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Abstract

Un inmunoconjugado dirigido a las células tumorales que expresan CD138 de un sujeto disminuyendo la adhesión de las células del estroma a las células tumorales que expresan CD138, en el que el inmunoconjugado comprende una molécula efectora y un anticuerpo dirigido modificado, en el que la molécula efectora y el anticuerpo dirigido modificado están unidos entre sí mediante un enlazador escindible, en el que la molécula efectora es un inhibidor de la polimerización de tubulina, en el que el anticuerpo dirigido modificado comprende una región variable de la cadena pesada que comprende los restos de aminoácidos 31 a 35 (CDR1), 51 a 68 (CDR2) y 99 a 111 (CDR3) de la SEC ID Nº 1, y una región variable de la cadena ligera que comprende los restos de aminoácido 24 a 34 (CDR1), 50 a 56 (CDR2) y 89 a 97 (CDR3) de la SEC ID Nº 2, y en el que el inmunoconjugado es para su uso con un agente citotóxico adicional, en el que el inmunoconjugado y el agente citotóxico adicional son para administrarse consecutivamente y en el que la administración del agente citotóxico adicional se realiza después de la administración del inmunoconjugado.

Description

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en el que dicho inmunoconjugado se une homogéneamente a CD138, y en el que el medicamento se administra a un paciente tratado con radiación para reducir la carga tumoral.
5 Aún más, la presente descripción proporciona el uso de un inmunoconjugado para la fabricación de un medicamento para tratar las células tumorales de un paciente que comprende células que expresan CD138, en el que el inmunoconjugado comprende:
un agente dirigido que se dirige contra CD138 que comprende un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de una cadena pesada de inmunoglobulina
o parte de la misma, en el que dicha cadena pesada de inmunoglobulina o parte de la misma tiene una identidad de secuencia de al menos el 70% de la SEC ID Nº 1, y en el que el medicamento se va a administrar a un paciente tratado con radiación para reducir la carga tumoral.
15 En los párrafos anteriores, el medicamento es capaz de inhibir, retrasar y/o prevenir el crecimiento de un tumor y/o la diseminación de las células tumorales malignas en un paciente.
Además la presente descripción proporciona un inmunoconjugado para la supresión de la supervivencia de las células de mieloma en un individuo, en el que el inmunoconjugado comprende:
(a) un anticuerpo dirigido modificado
(i) que consiste esencialmente en una región de unión al antígeno contra CD138 de un anticuerpo no humano, o
25 (ii) que comprende una región de unión al antígeno contra CD138, en el que dicha región de unión al antígeno es de un anticuerpo no humano, una región de anticuerpo adicional, en el que al menos parte de dicha región de anticuerpo adicional es de anticuerpo humano, y
(b) una molécula efectora,
en el que dicho inmunoconjugado se une homogéneamente a CD138.
Aún más, la presente descripción proporciona un inmunoconjugado para la supresión de la supervivencia de las 35 células de mieloma en un individuo, en el que el inmunoconjugado comprende:
un agente dirigido que se dirige contra CD138 que comprende un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de una cadena pesada de inmunoglobulina
o parte de la misma, en el que dicha cadena pesada de inmunoglobulina o parte de la misma tiene una identidad de secuencia de al menos el 70% de la SEC ID Nº 1,
En los dos párrafos anteriores el inmunoconjugado es, en particular, capaz de disminuir selectivamente la supervivencia o crecimiento de dichas células de mieloma en el individuo.
45 Además, la presente descripción proporciona un inmunoconjugado para su uso en la inhibición, retraso y/o prevención del crecimiento de un tumor que comprende células tumorales CD138 y/o la diseminación de células tumorales de tal tumor en un sujeto, en el que el inmunoconjugado comprende un anticuerpo dirigido modificado contra CD138 unido a una molécula efectora por medio de un enlazador escindible, en el que dicha molécula efectora está impedida estéricamente.
En el párrafo anterior, el inmunoconjugado es, en particular, capaz de proporcionar una inhibición de la actividad tumoral que excede la de su equivalente sin impedimento aproximadamente un 10%, aproximadamente un 20%, aproximadamente un 30%, aproximadamente un 40% o más.
55 La presente descripción proporciona además un agente de dirección a CD138 para su uso en un método para la disminución de la adhesión de las células del estroma a las células tumorales que expresan CD138 en las células tumorales de un sujeto.
La presente descripción proporciona además un medicamento que comprende un agente de dirección a CD138 y un agente adicional, tal como un inmunoconjugado dirigido o un agente citostático, como una preparación combinada para su uso simultáneo (co-administración), por separado, o secuencial en un método para disminuir la adhesión de las células del estroma a las células tumorales que expresan CD138 en las células tumorales de un sujeto.
En el párrafo anterior, la preparación combinada es, en particular, capaz de inhibir, retrasar y/o prevenir el 65 crecimiento de las células tumorales en un sujeto.
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al uso de la capacidad de estos inmunoconjugados para superar o disminuir los mecanismos protectores que se encuentran en el microambiente de la médula ósea.
Los inmunoconjugados de acuerdo con la presente invención se pueden administrar a un sujeto que necesita del
5 tratamiento terapéutico o a las células aisladas de tal sujeto que necesita el tratamiento terapéutico. La molécula o moléculas efectoras se pueden liberar del inmunoconjugado por escisión/disociación en, o cerca de la célula, tejido u órgano diana.
En un ejemplo de la descripción, el inmunoconjugado comprende el anticuerpo nBT062, que se dirige a las células que expresan CD138, y al menos un fármaco altamente citotóxico o toxina como molécula efectora, se administra a un paciente con cáncer. Es este ejemplo, se administra por vía intravenosa a una cantidad terapéuticamente eficaz del inmunoconjugado a un paciente de forma que se concentra en las células del cáncer. La molécula o moléculas efectoras se liberan entonces del anticuerpo por medios naturales. Después o durante la escisión, la molécula efectora se puede estabilizar por alquilación y puede difundirse rodeando las células auxiliares tales como las
15 células del estroma que no expresan CD138.
En un ejemplo de la invención, el inmunoconjugado comprende el anticuerpo nBT062, que se dirige a las células que expresan CD138, y al menos un fármaco altamente citotóxico o toxina como molécula efectora, y un agente citotóxico adicional, se administra a un paciente con cáncer. En este ejemplo, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz del inmunoconjugado y el agente citotóxico consecutivamente. Primero se administra el inmunoconjugado por vía intravenosa a un paciente de forma que se concentra en las células cancerosas del microambiente de la médula ósea. El inmunoconjugado supera sustancialmente la resistencia a los fármacos mediada por la adhesión celular (CAM-DR) y destruye una parte sustancial de las células tumorales que expresan CD138 en el microambiente de la médula ósea. En particular, la molécula(s) efectora(s) se libera del anticuerpo or
25 medios naturales y destruye las células tumorales. El inmunoconjugado al menos en parte evita la adhesión de las células tumorales a las células del estroma, algunas de las cuales se pueden destruir por la difusión de la molécula efectora. Tras un intervalo de tiempo de 12 horas, se administra el agente citotóxico. El agente citotóxico, cuya actividad al menos se reduce normalmente por la CAM-DR puede actuar sobre las células tumorales que no están asociadas con las células del estroma y destruir las células tumorales que expresan CD138, que escaparon a la acción del inmunoconjugado.
CD138 o Sindecan-1 (también descrito como SYND1; SYNDECAN; SDC; SCD1; ANTIGENO CD138, número de registro SwissProt: P18827 humano) es una glucoproteína de membrana que se describió originalmente por estar presente en las células de origen epitelial, y posteriormente se encontró en células hematopoyéticas (Sanderson,
35 1989). El CD138 tiene un largo dominio extracelular que se une a moléculas solubles (por ejemplo, los factores de crecimiento EGF, FGF, HGF) y a moléculas insolubles (por ejemplo, a los componentes de la matriz extracelular, colágeno y fibronectina) por medio de cadenas de sulfato de heparano (Langford, 1998; Yang, 2007) y actúa como un receptor para la matriz extracelular. El CD138 también media en la adhesión célula a célula por medio de las moléculas de unión a heparina expresadas por las células adherentes. Se ha demostrado que el CD138 tiene un papel como co-receptor para los factores de crecimiento de las células de mieloma (Bisping, 2006). Los estudios en diferenciación de células plasmáticas demostraron que el CD138 también se debe considerar como un antígeno de diferenciación (Bataille, 2006).
En la hematopoyesis maligna, el CD138 se expresa altamente en la mayoría de las células del MM, carcinoma
45 ovárico, carcinoma de riñón, carcinoma de vesícula, carcinoma de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, células de carcinoma de colon y células de linfomas de Hodgkin y no Hodgkin, leucemia linfocítica crónica (CLL) (Horvathova, 1995), leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloblástica aguda (AML) (Seftalioglu, 2003 (a); Seftalioglu, 2003 (b)), sarcomas de tejidos sólidos, carcinomas de colon así como otras enfermedades malignas hematológicas y tumores sólidos que expresan CD138 (Carbone et al., 1999; Sebestyen et al., 1999; Han et al., 2004; Charnaux et al., 2004; O’Connell et al.,2004; Orosz y Kopper, 2001).
Otros cánceres en los que se ha demostrado que son positivos a la expresión de CD138 son muchos adenocarcinomas ováricos, carcinomas de células transicionales de vejiga, carcinoma de células claras de riñón, carcinoma de pulmón de células escamosas; carcinomas de mama y cánceres uterinos (véase, por ejemplo, Davies
55 et al., 2004; Barbareschi et al., 2003; Mennerich et al., 2004; Anttonen et al., 2001; Wijdenes, 2002).
En el compartimento hematopoyético normal humano, la expresión de CD138 se restringe a las células plasmáticas ((Wijdenes, 1996; Chilosi, 1999) y el CD138 no se expresa en linfocitos, monocitos y granulocitos de sangre periférica, y glóbulos rojos. En particular, las células madre CD34+ y progenitoras no expresan CD138 y los mAb anti-CD138 no afecta el número de unidades formadoras de colonias en los cultivos de células madre hematopoyéticas (Wijdenes, 1996). En los compartimentos no hematopoyéticos, el CD138 se expresa principalmente en el epitelio simple y estratificado del pulmón, hígado, piel, riñón e intestino. Solo se vio una débil tinción en las células endoteliales (Bernfield, 1992; Vooijs, 1996). Se ha informado de que existe CD138 en formas polimórficas en las células de linfoma humano (Gattei, 1999).
65 Se ha informado que los anticuerpos monoclonales BC/B-B4, B-B2, DL-101, 1 D4, MI15, 1.BB.210, 2Q1484, 5F7,
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104-9, 281-2 en particular B-B4 son específicos para el CD138 y se demostró que reconocían el mismo o epítopos estrechamente relacionados (Gattei, 1999). Estudios previos comunicaron que B-B4 no reconocía CD138 soluble, sino solamente el CD138 de la membrana en forma unida (Wijdenes, 2002).
5 El B-B4 es un mAb IgG1 murino, que se une a un epítopo lineal entre los restos 90-95 de la proteína central del sindecan-1 humano (CD138) (Wijdenes, 1996; Dore, 1998). En consonancia con el patrón de expresión de CD138, se demostró que el B-B4 reaccionaba fuertemente con la línea celular plasmática RPMI8226, pero no reaccionaba con células endoteliales. También en consonancia con el patrón de expresión de CD138, el B-B4 reacciona también con líneas de células epiteliales A431 (derivado de queratinocitos) y HepG2 (derivado de hepatocitos). Una inmunotoxina B-B4-saponina también era altamente tóxica para la línea celular plasmática RPMI8226, de hecho considerablemente más tóxica que la saponina libre. Sin embargo, en las dos líneas celulares epiteliales, la B-B4saponina solo mostraba toxicidad para la línea celular A431, aunque en un ensayo clonogénico la BB4-saponina no mostraba un efecto inhibidor en el crecimiento de células A431 (Vooijs, 1996). Otros investigadores comunicaron falta de especificidad de los antígenos asociados a MM contra los tumores (Couturier, 1999).
15 Un anticuerpo/inmunoconjugado “consiste esencialmente en” ciertos componentes, significa en el contexto de la presente invención que el anticuerpo/inmunoconjugado consiste en los componentes especificados y cualquiera de los materiales adicionales o componentes que no afectan materialmente las características básicas del anticuerpo.
La presente invención utiliza la expresión “célula tumoral” para incluir las células del cáncer así como las células precancerosas que pueden formar parte o no de un tumor sólido.
Un “agente dirigido” de acuerdo con la presente descripción es capaz de asociarse con una molécula expresada por una célula diana e incluye péptidos y no péptidos. En particular, los agentes dirigidos de acuerdo con la presente
25 invención incluye anticuerpos dirigidos y moléculas dirigidas no inmunoglobulinas, que se pueden basar en proteínas no inmunoglobulinas, que incluyen pero no limitan a moléculas AFFILIN®, ANTICALINS® y AFFIBODIES®. Las moléculas dirigidas no inmunoglobulinas también incluyen moléculas dirigidas no peptídicas tales como oligonucleótidos ADN y ARN dirigidas (aptámeros), pero también ligandos fisiológicos, en particular, ligandos del antígeno en cuestión, tal como el CD138.
Un “anticuerpo dirigido” de acuerdo con la presente invención es o se basa en un anticuerpo natural o se produce sintéticamente o por modificación genética y se une a un antígeno en una célula o células (célula(s) diana) de interés. Un anticuerpo dirigido de acuerdo con la presente invención incluye un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo multiespecífico (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico), o un fragmento de anticuerpo. El 35 anticuerpo dirigido puede estar modificado, por ejemplo, para mejorar su afinidad contra las células diana (Ross, 2003) o disminuir su inmunogenicidad. El anticuerpo dirigido se puede unir a una formulación de liposomas que incluyen las moléculas efectoras (Carter, 2003). Un fragmento de anticuerpo comprende una parte de un anticuerpo intacto, preferentemente la región de unión al antígeno o la región variable del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo de acuerdo con la presente invención incluyen los fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2, y Fv, pero también los diacuerpos; dominios de anticuerpo (dAb) (Ward, 1989; Patente de Estados Unidos 6.005.079); anticuerpos lineales; moléculas anticuerpo de cadena sencilla; y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo. En un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla variable (scFv) las cadenas pesada y ligera (VH y VL) se pueden unir por un enlazador de aminoácidos corto que tiene, por ejemplo, la secuencia (glicina4 serina)n, que tiene la suficiente flexibilidad para permitir que los dos dominios se unan a un bolsillo de unión al 45 antígeno funcional. La adición de varias secuencias de señal puede permitir una dirección más precisa del anticuerpo dirigido. La adición de la región constante de la cadena ligera (CL) puede permitir la dimerización por medio de enlaces disulfuro, lo que aumenta la estabilidad y la avidez. Las regiones variables para la construcción del scFv pueden, si está disponible un mAb contra una diana de interés, obtenerse por RT-PCR que clona las regiones variables a partir del ARNm extraído del hibridoma parental. De manera alternativa, el scFv se pueden generar de novo por tecnología de fago de presentación (Smith, 2001). Como se utiliza en el presente documento, el término “fragmento funcional”, cuando se utilizan en referencia a un anticuerpo dirigido, se pretende que se refiere a una parte del anticuerpo dirigido que es capaz de unirse específicamente a un antígeno que está unido específicamente por el anticuerpo al que se hace referencia. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la presente invención puede, por ejemplo, tener al menos un brazo que es reactivo contra un tejido diana y un brazo que es reactivo contra un
55 resto enlazador (Publicación de Patente de Estados Unidos 20020006379). Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la presente invención puede unirse también a más de un antígeno en una célula diana (Carter, 2003). Un anticuerpo de acuerdo con la presente invención se puede modificar por ejemplo, introduciendo restos de cisteína para introducir grupos tiol (Olafsen, 2004).
De acuerdo con la presente invención, el anticuerpo dirigido se puede derivar de cualquier fuente y puede ser, pero no se limita a, un anticuerpo de camélido, un anticuerpo murino, un anticuerpo quimérico de ser humano/ratón o un anticuerpo quimérico de ser humano/mono, en particular, un anticuerpo quimérico de ser humano/ratón tal como nBT062.
65 Los anticuerpos humanizados son anticuerpos que contienen secuencias derivadas de un anticuerpo humano y un anticuerpo no humano y también están en el ámbito de la presente invención. Los métodos adecuados para
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humanizar anticuerpos incluyen el injerto-CDR (injerto de la región determinante de complementariedad) (EP 0 239 400; WO 91/09967; Patentes de Estado Unidos 5.530.101; y 5.585.089), revestimiento o recubrimiento (P 0 592 106; EP 0 519 596; Padlan, 199; Studnicka et al., 1994; Roguska et al., 1994), entremezclado de cadenas (Patente de Estados Unidos 5.565.332) y DeInmunosación™ (Biovation, LTD). En el injerto-CDR, las regiones determinantes de
5 complementariedad de ratón (CDR) de por ejemplo, el mAb B-B4 se injertan en los armazones variables humanos, que se unen entonces a las regiones constantes humanas, para crear un anticuerpo B-B4 (gB-B4). Varios anticuerpos humanizados por injerto-CDR están actualmente en uso clínico, que incluyen el MYLOTARG (Sievers et al., 2001) y HECEPTIN (Pegram et al, 1998).
La tecnología de recubrimiento utiliza una combinación de modelado molecular, análisis estadístico y mutagénesis para alterar las superficies no CDR de las regiones variables del anticuerpo para que se parezcan a superficies de anticuerpos conocidos del huésped diana. Las estrategias y métodos para el recubrimiento de anticuerpos, otros métodos para reducir la inmunogenicidad de los anticuerpo en diferentes huéspedes, se desvelan, por ejemplo en la Patente de Estados Unidos 5.639.641. Los anticuerpos humanos se pueden fabricar por una variedad de métodos
15 conocidos en la técnica que incluyen métodos de fago de presentación. Véase también las Patentes de Estados Unidos 4.444.887, 4.716.111, 5.545.806, y 5.814.318; y las publicaciones de solicitudes de patente internacionales WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, y WO 91/10741.
Los anticuerpos dirigidos que se han sometido a una modificación no natural tal como los anticuerpos quiméricos humano/ratón o quimérico humano/mono, anticuerpos humanizados o anticuerpos que se modificaron para, por ejemplo, mejorar su afinidad para las células diana o para disminuir su inmunogenicidad pero también los fragmentos de anticuerpo, en particular los fragmentos funcionales de tales anticuerpos dirigidos que se han sometido a cualquier modificación no natural, diacuerpos; dominios de anticuerpo; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena sencilla; y anticuerpos multiespecíficos se denominan en el presente documento
25 anticuerpos dirigidos modificados.
Los anticuerpos quimerizados, mantienen la región del anticuerpo de unión (región ABR o Fab) del anticuerpo no humano, por ejemplo, el anticuerpo murino en el que se basan, mientras que las regiones constantes se pueden proporcionar, por ejemplo, por un anticuerpo humano. En general, la quimerización y/o el intercambio de regiones constantes de un anticuerpo no afectará la afinidad de un anticuerpo debido a las regiones del anticuerpo que contribuyen a la unión con el antígeno no se afectan por este intercambio. En una realización preferida de la presente invención, el anticuerpo modificado, en particular quimerizado, de la presente invención, puede tener una afinidad de unión más alta (como se expresa por los valores de KD) que el anticuerpo no humano respectivo en el que se basa. En particular el anticuerpo nBT062 y los anticuerpos que se basan en el mismo pueden tener una 35 afinidad pode anticuerpo más alta que el B-B4 murino. En otra realización preferida de la presente invención, los inmunoconjugados que comprenden estos anticuerpos modificados/quimerizados también muestran esta alta afinidad de anticuerpo. Estos inmunoconjugados pueden presentar también en ciertas realizaciones otras propiedades ventajosas, tales como la alta reducción de la carga tumoral que sus equivalentes que contienen B-B4. En una realización preferida, los anticuerpos dirigidos modificados, en particular los anticuerpos dirigidos quimerizados presentan afinidades de unión que se caracterizan por constantes de disociación KD (nM) de menos de 1,6, menos de 1,5 o aproximadamente o menos de 1,4, mientras que sus equivalentes murinos se caracterizan por constantes de disociación KD (nM) de aproximadamente o más de 1,6. Se prefieren los inmunoconjugados que comprenden agentes dirigidos tales como los anticuerpos dirigidos que se pueden caracterizar por constantes de disociación de KD (nM) de menos de 2,6, menos de 2,5, menos de 2,4, menos de 2,3, menos de 2,2, menos de 2,1,
45 menos de 2,0, menos de o aproximadamente 1,9, mientras que los inmunoconjugados que comprenden anticuerpos del equivalente murino se pueden caracterizar por constantes de disociación KD (nM) de aproximadamente o más de 2,6 (compárese la Tabla 3, Materiales y Métodos).
Los anticuerpos totalmente humanos también se pueden utilizar. Estos anticuerpos se pueden seleccionar por la estrategia de fago de presentación, en el que CD138 o el determinante antigénico del mismo se utiliza para unirse selectivamente al fago que expresa, por ejemplo, las regiones variables de B-B4 (véase, Krebs, 2001). Esta estrategia se acopla ventajosamente con la técnica de maduración de afinidad para mejorar la afinidad del anticuerpo. Todos los anticuerpos a los que se refiere el presente documento son anticuerpos aislados.
55 En una realización, el anticuerpo dirigido está, en su forma sin conjugar, moderada o pobremente internalizado. Una internalización moderada constituye aproximadamente del 30% al 70% de internalización del anticuerpo, la internalización pobre constituye aproximadamente del 0,01% hasta aproximadamente el 30% de internalización tras 3 horas de incubación a 37 ºC. En otra realización preferida el anticuerpo dirigido se une al CD138, por ejemplo, los anticuerpos BC/B-B4, B-B2, DL-101, 1 D4, MI15, 1.BB.210, 2Q1484, 5F7, 104-9, 281-2 en particular el B-B4. Las células de hibridoma, que se generaban por hibridación de células de mieloma SP02/0 con células esplénicas de ratones Balb/c se han depositado en el DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1, D-38124 Braunschweig el 11 de diciembre de 2007. El número de identificación de estas células de hibridoma que expresan B-B4 es DSM ACC2874. En otra realización, el anticuerpo dirigido no se une sustancialmente al CD138 que se expresa en la superficie. Cuando, en el contexto de la presente invención, el
65 nombre de un anticuerpo específico está combinado con el término “anticuerpo dirigido” tal como “anticuerpo dirigido nBT062”, significa que este anticuerpo dirigido tiene la especificidad de unión del anticuerpo nBT062. Si se dice que
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un anticuerpo dirigido está “basado en” un anticuerpo especificado, esto significa que este anticuerpo dirigido tiene la especificidad de unión de este anticuerpo, pero puede tomar cualquier forma que consistente con la descripción anterior de un anticuerpo dirigido. Cuando, en el contexto de la presente invención, el nombre de un antígeno específico se combina con la expresión “anticuerpo dirigido” tal como “anticuerpo dirigido CD138”, esto significa que
5 este anticuerpo dirigido tiene la especificidad de unión por el CD138. Si, en el contexto de la presente invención, se dice , por ejemplo, que un anticuerpo dirigido hace algo “selectivamente” tal como “dirigido selectivamente contra el CD138 que se expresa en la superficie celular” o que es “selectivo” para algo, esto significa que hay una selectividad significativa (es decir, una afinidad más alta hacia las células positivas a CD138 en comparación con células negativas a CD138) para, en el caso del ejemplo que se proporciona, el CD138 que se expresa en la superficie celular, en comparación con cualquiera de otros antígenos. Los efectos secundarios adversos en un determinado ambiente se reducen sustancialmente o incluso se evitan debido a esta selectividad.
“Moléculas dirigidas no inmunoglobulinas” de acuerdo con la presente descripción incluye las moléculas dirigidas derivadas de proteínas no inmunoglobulinas así como de moléculas dirigidas no peptídicas. Las pequeñas proteínas 15 no inmunoglobulinas que están incluidas en esta definición se diseñan para que tengan afinidades específicas hacia CD138 que se expresan en particular en la superficie. Estas pequeñas proteínas no inmunoglobulinas incluyen las moléculas modificadas basadas en armazones tales como moléculas Affilin® que tienen un peso molecular relativamente bajo tal como entre 10 kDa y 20 kDa. Los armazones apropiados incluyen, por ejemplo, cristalina gama. Estas moléculas tienen, en su estado natural, actividad de unión no específica hacia las moléculas diana. Modificando las superficies de las proteínas mediante aleatorización definida localmente de aminoácidos expuestos a disolventes, se crean sitios de unión completamente nuevos. Las primeras proteínas no unidas se transforman de esta manera en proteínas de unión específica. Tales moléculas se pueden diseñar específicamente para unirse a una diana, tal como el CD138, y permite el suministro específico de una o más moléculas efectoras (véase, scil Proteins GmbH at www.scilproteins.com, 2004). Otro tipo de moléculas dirigidas no inmunoglobulina se derivan de 25 lipocalinas, e incluyen, por ejemplo ANTICALINS®, que se parecen en la estructura de alguna manera a las inmunoglobulinas. Sin embargo, las lipocalinas se componen por una única cadena polipeptídica con 160 a 180 restos de aminoácidos. Los bolsillos de unión de las lipocalinas están reformadas para reconocer una molécula de interés con alta afinidad y especificidad (véase, por ejemplo, Beste et al., 1999). Los receptores bacterianos artificiales tales como los que se comercializan bajo la marca Affibody® (Affibody AB) también están en el ámbito de la presente invención. Estas moléculas de receptor bacteriano artificial son proteínas pequeñas, simples que pueden estar compuestas por un manojo triple helicoidal basado en el armazón de uno de los dominios de unión IgG de la Proteína A (Staphylococcus aureus). Estas moléculas tienen propiedades de unión similares a muchas inmunoglobulinas, pero son sustancialmente más pequeñas, que tienen un peso molecular que no excede a menudo los 10 kDa y que son también comparativamente estables. Las moléculas de receptor bacteriano artificial adecuadas
35 están, por ejemplo, descritas en las Patentes de Estados Unidos 5.831.012; 6.534.628 y 6.740.734.
Otras “moléculas dirigidas no inmunoglobulinas” son ligandos fisiológicos del antígeno en cuestión. Los ligandos fisiológicos del CD138 incluyen por ejemplo, pero no se limitan a, ADAMTS4 (agrecanasa-1), antitrombina-3, bFGF, catepsina G, CCL5 (RANTES), CCL7, CCL11, CCL17, CD44, colágenos (colágeno tipo 1, colágeno tipo 2, colágeno tipo 3, colágeno tipo 4, colágeno tipo 5, colágeno tipo 6), CXCL1, elastasa, gp120 , HGF [factor de crecimiento del hepatocito], laminina-1, laminina-2, laminina-5, midquina, MMP-7, neutrófilo elastasa, y pleiotrofina (HBNF, HBGF-8). Las moléculas dirigidas no peptídicas incluyen, pero no se limitan a, oligonucleótidos ADN y ARN que se unen a CD138 (aptámeros).
45 Una “molécula efectora” de acuerdo con la presente invención es una molécula o un derivado, o un análogo de la misma que se une a un agente de dirección, en particular un anticuerpo dirigido y/o un anticuerpo dirigido modificado, y que ejerce el efecto deseado, por ejemplo apoptosis, u otro tipo de muerte celular, o una detención del ciclo celular continuo en la célula o células diana. Las moléculas efectoras de acuerdo con la presente invención incluyen moléculas que pueden ejercer efectos deseados en una diana celular e incluyen, pero no se limitan a, toxinas, fármacos, en particular fármacos citotóxicos de bajo peso molecular, radionúclidos, modificadores de la respuesta biológica, agentes formadores de poros, ribonucleasas, proteínas de las cascadas de señalización apoptótica con actividades inductoras de apoptosis, enzimas citotóxicas, enzimas activadoras de profármacos, oligonucleótidos antisentido, anticuerpos o citocinas, así como derivados funcionales o análogos/fragmentos de los mismos. Las toxinas pueden incluir toxinas bacterianas, tales como, pero sin limitarse a, toxina diftérica o Exotoxina
55 A, toxinas vegetales, tales pero sin limitarse a, ricino. Proteínas de cascadas de señalización apoptóticas con actividades de inducción de apoptosis, que incluyen, pero no se limitan a, Granzima B, Granzima A, Caspasa-3, Caspasa-7, Caspasa-8, Caspasa-9, Bid truncado (tBid), Bax y Bak.
En una realización preferida, el efector aumenta el suministro interno del efector del inmunoconjugado, en particular cuando la forma natural del anticuerpo en el que está basado el anticuerpo dirigido del inmunoconjugado es pobremente internalizable. En otra realización preferida el efector es, en su forma nativa, no selectivo. En ciertas realizaciones, el efector tiene una alta toxicidad no selectiva, que incluye toxicidad sistémica, cuando está en su forma nativa. La “forma nativa” de una molécula efectora de la presente invención es una molécula efectora antes de unirse al agentes de dirección para formar un inmunoconjugado. En otra realización preferida, la molécula efectora 65 produce, cuando alcanza la célula diana, la muerte o la detención del ciclo celular continuo en la célula diana. Una molécula efectora fármaco de acuerdo con la presente invención incluye, pero no se limita a, un fármaco que
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embargo, como apreciará el experto en la técnica, son parte de la invención otras moléculas efectoras que comprenden sustituyentes tales como grupos alquilo en posiciones que dan como resultado un impedimento estérico cuando el efector se une a un agente de dirección por medio de un enlazador (Publicación de Patente de EE. UU. 2004/0235840). Preferentemente, este impedimento induce una modificación química tal como la alquilación del
5 fármaco libre para aumentar su estabilidad total, lo que permite al fármaco no solo inducir muerte celular o detención del ciclo celular continuo en células tumorales que expresan CD138, sino, opcionalmente, también afectar a las células auxiliares que, por ejemplo, soportan o protegen el tumor de los fármacos, en particular las células del estroma tumoral y el sistema vascular tumoral y que generalmente no expresan para que disminuyan o pierdan su función de soporte o protectora.
10 Los agentes alquilantes ADN también son particularmente preferidos como moléculas efectoras e incluyen, pero no se limitan a, análogos o derivados CC-1065. El CC-1065 es un potente antibiótico antitumoral aislado de cultivos de Streptomyces zelensis y se ha demostrado que es un citotóxico excelente in vitro (Patente de Estados Unidos 4.169.888). En el ámbito de la presente invención están, por ejemplo, los análogos o derivados del CC-1065
15 descritos en las Patentes de Estados Unidos 5.475.092. 5.585.499 y 5.739.350. Como apreciará fácilmente el experto en la técnica, los análogos o derivados de CC-1065 modificados como se describe en la Patente de Estados Unidos 5.846.545 y los profármacos de análogos o derivados de CC-1065 como se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos 6.756.397 también están en el ámbito de la presente invención. En ciertas realizaciones de la invención, los análogos o derivados de CC-1065 pueden, por ejemplo, sintetizarse como se describe en la
20 Patente de Estados Unidos 6.534.660.
Otro grupo de compuestos que sirven de moléculas efectoras preferidas son los taxanos, especialmente los altamente potentes y los que contienen tiol o grupos disulfuro. Los taxanos son venenos del huso mitótico que inhiben la despolimerización de tubulina, dando como resultado un aumento del ensamblaje de microtúbulos y 25 muerte celular. Los taxanos que están en el ámbito de la presente invención son por ejemplo, los que se desvelan en las Patentes de Estados Unidos 6.436.931; 6.340.701; 6.706.708 y Publicaciones de Patente de Estados Unidos 20040087649; 20040024049 y 20030004210. Otros taxanos se desvelan, por ejemplo, en Patente de Estados Unidos 6.002.023, Patente de Estados Unidos 5.998.656, Patente de Estados Unidos 5.892.063, Patente de Estados Unidos 5.763.477, Patente de Estados Unidos 5.705.508, Patente de Estados Unidos 5.703.247 y Patente de
30 Estados Unidos 5.367.086. Como un experto en la técnica apreciará, los taxanos PEGilados tales como los descritos en la Patente de Estados Unidos 6.596.757 también están en el ámbito de la presente invención.
Las moléculas efectoras de calicamicina de acuerdo con la presente invención incluyen 1I, N-acetil calicheamicina y otros derivados de la calicheamicina. La calicheamicina se une al grupo menor de ADN de manera específica de la
35 secuencia, se somete re-ordena y expone radicales libres, lo que lleva a la rotura del ADN bicatenario, dando como resultado la apoptosis y muerte de la célula. Un ejemplo de molécula efectora calicheamicina que se puede utilizar en el contexto de la presente invención se describe en la Patente de Estados Unidos 5.053.394.
Un inmunoconjugado de acuerdo con la presente descripción comprende al menos un agente de dirección, en
40 particular un anticuerpo dirigido y una molécula efectora. El inmunoconjugado puede comprender más moléculas, por ejemplo para la estabilización. Para los inmunoconjugados, el término “conjugado” se utiliza en general para definir la asociación operativa del agente de dirección con una o más moléculas efectoras y no se pretende que se refiera solo a cualquier tipo de asociación operativa, y particularmente no se limita a “conjugación” química. Siempre que el agente de dirección sea capaz de unirse al sitio diana y el efector unido funcione suficientemente como se
45 pretendía, particularmente cuando se suministra en el sitio diana, cualquier modo de unión será adecuado. Los métodos de conjugación de acuerdo con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, unión directa de la molécula efectora al anticuerpo dirigido, con o sin una modificación previa de la molécula efectora y/o el anticuerpo dirigido o unido mediante enlazadores. Os enlazadores se pueden categorizar funcionalmente en, por ejemplo, lábil a ácidos, enlazadores fotolábiles, enlazadores escindible por enzimas, tales como los enlazadores que se pueden
50 escindir por peptidasas. En la presente invención el anticuerpo dirigido modificado y la molécula efectoras están unidos entre ellos por medio de un enlazador escindible. Tales enlazadores escindibles se pueden escindir bajo las condiciones presentes en el entorno celular, en particular, un entorno intracelular y que no tiene un efecto perjudicial sobre el fármaco liberado con la escisión. Los pH bajos tales como un pH de 4 o 5 como se encuentra en ciertos departamentos intracelulares escindirá los enlazadores lábiles a ácidos, mientras que los enlazadores fotolábiles se
55 pueden escindir, por ejemplo, con rayos infrarrojos. Sin embargo, se prefieren los enlazadores que se escinden por/bajo condiciones fisiológicas que están presentes en la mayoría de las células en muchas realizaciones de la invención. Estos enlazadores son escindibles por medio de un intercambio disulfuro, que pueden existir bajo condiciones fisiológicas. Los enlazadores disulfuro heterobifuncionales preferidos incluyen, pero no se limitan a, Nsuccinimidil 3-(2-piridilditio) propionato (SPDP) (véase, por ejemplo, Carlsson et al.(1978)), N-succinimidil 4-(2
60 pyridyidithio) butanoato (SPDB) (véase, por ejemplo, Patente de EE. UU. Nº 4.563.304), N-succinimidil 4-(2pyridyldithio) pentanoato (SPP) (véase, por ejemplo, número de Registro CAS 341498-08-6), N-succinimidil 4-(Nmaleimidometil) cyclohexano-1-carboxylato (SMCC) (véase, por ejemplo, Yoshitake et al., (1979)), y N-succinimidil 4metil-4-[2-(5-nitro-piridil)-ditio] pentanoato (SMNP) (véase, por ejemplo, Patente de EE. UU. Nº 4.563.304). Las moléculas enlazadoras más preferidas para su uso en la composición inventiva son SPP y SPDB.
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empíricamente, o por la consideración de las farmacocinéticas y modos de acción de los agentes, la dosis o las dosis adecuadas de cada agente terapéutico, así como los tiempos y métodos adecuados de administración. Como se utiliza en el contexto de la presente descripción “co-administración” se refiere a la administración al mismo tiempo que el inmunoconjugado, a menudo en una forma de dosificación combinada.
5 La expresión “identidad de secuencia” se refiere a una medida de la identidad de secuencias de nucleótidos o secuencias de aminoácidos. En general, las secuencias se alinean de forma que se obtenga el orden de mayor coincidencia. “Identidad”, per se, tiene un significado reconocido en la técnica y se puede calcular utilizando técnicas publicadas (véase, por ejemplo, Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991). Como existen varios métodos para medir la identidad entre dos secuencias de polinucleótidos o polipéptidos, el término “identidad” se conocen bien entre los
15 expertos (Carillo, H. & Lipton, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988)).
Si cualquier molécula de ácido nucleico particular es idéntica en al menos el 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%. 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a, por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico de nBT062, o una parte de la misma, se puede determinar convencionalmente utilizando programas informáticos conocidos tales como el software DNAsis (Hitachi Software, San Bruno, Calif.) para el alineamiento de secuencia inicial seguido por el software de secuencias de proteínas/ADN ESEE versión 3.0 ([email protected]) para alineamientos de secuencias múltiples.
Si la secuencia de aminoácidos es idéntica en al menos un 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%. 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a la, por ejemplo, SEC ID Nº 1 o a la SEC ID Nº 2, o a una parte de la misma, se puede determinar
25 convencionalmente utilizando programas informáticos conocidos tales como el programa BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711). El BESTFIT utiliza un algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981), para encontrar el mejor segmento de homología entre dos secuencias.
Cuando se utilizan los programas DNAsis, ESEE, BESTFIT o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia en particular es, por ejemplo, idéntica al 95% con respecto a una secuencia de referencia de acuerdo con la presente invención, los parámetros se fijan de tal manera que se calcula el porcentaje de identidad sobre el ácido nucleico de referencia de longitud completa o la secuencia de aminoácidos
35 y que se permiten huecos de homología de hasta el 5% del número total de nucleótidos de la secuencia de referencia.
Si, en el contexto de la presente invención, se hace referencia a una cierta identidad de secuencia con una combinación de restos de una secuencia particular, esta identidad de secuencia se refiere a la suma de todos los restos especificados.
La moléculas básica de anticuerpo es una estructura bifuncional en la que las regiones variables se unen al antígeno mientras que las regiones constantes restantes pueden provocar respuestas independientes del antígeno. Las clases principales de anticuerpo, IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, se determinan por las regiones constantes. Estas clases
45 se pueden dividir adicionalmente en subclases (isotipos). Por ejemplo, la clase IgG tiene cuatro isotipos, a saber, IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4 que se determinan pro las regiones constantes. De las distintas clases de anticuerpos humanos, solo de las IgG1, IgG2, IgG3 e IgM humanas se sabe que activan eficazmente el sistema de complemento. Aunque las regiones constantes no forman sitios de unión al antígeno, la disposición de las regiones constantes y las regiones de bisagra pueden conferir la flexibilidad segmentaria en la molécula que le permita unirse con el antígeno.
Los diferentes isotipos de IgG se pueden unir a receptores Fc de células tales como monocitos, células B, y células NK, activando de esta manera las células que liberan citocinas. Varios isotipos pueden también activar el complemento, dando como resultado una inflamación local o sistémica. En particular, los diferentes isotipos IgG 55 pueden unirse a FcR en diferentes grados. Los FcR son un grupo de glucoproteínas de superficie que pertenecen a la superfamilia Ig y se expresan principalmente en los leucocitos. Las glucoproteínas FcR se dividen en tres clases denominadas FcRI (CD64), FcRII (CD32) y FcRIII (CD16). Mientras que la IgG1, IgG2 e IgG3 se une fuertemente a una variedad de estas clases de glucoproteínas FcR, la IgG4 muestra una unión más débil. En particular, la IgG4 es un ligante intermedio de FcRI, lo que da como resultado una ADCC (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo) relativamente baja o incluso ninguna, y no se une a FcRIIIA o FcRIIA. La IgG4 también es un ligante débil de FcRIIB que es un receptor inhibidor. Además la IgG4 media una fijación de complemento débil o ninguna y una citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) débil o ninguna. En el contexto de la presente invención, la IgG4 se puede emplear específicamente para prevenir la dirección mediada por Fc de FcR hepático ya que no muestra interacción con FcRII en las LSEC (células endoteliales sinusoidales hepáticas), 65 ninguna o débil interacción con FcRI-III en células de Kupffer (macrófagos) y ninguna interacción con FcRIII en
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células NK hepáticas. Ciertas mutaciones que reducen más cualquier CDC también son parte de la presente invención, Por ejemplo los restos IgG4 en las posiciones 327, 330 y 331 demostraron que reducían la ADCC (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo) y CDC (Amour, 1999; Shields, 2001). Una o más mutaciones que estabilicen el anticuerpo también son parte de la presente invención (también denominadas en el presente 5 documento como “mutaciones estabilizantes”). Estas mutaciones incluyen en particular, mutaciones de leucina en ácido glutámico en la región CH2 de IgG4 e intercambios serina por prolina en la región centro de la bisagra de IgG44. Estas mutaciones disminuyen, en ciertas realizaciones dela invención, la cantidad de semi-moléculas a menos del 10%, menos del 5% y preferentemente menos del 2% o 1%. Además, la semivida in vivo de los anticuerpos estabilizados de esta manera pueden aumentarse varios días, incluyendo, 1, 2, 3, 4, o más de 5 días
10 (Schuurman, 1999).
Los agentes de dirección, incluyendo los anticuerpos dirigidos desvelados en el presente documento pueden describir también o especificarse en términos de su afinidad de unión con el antígeno, en particular para el CD138. Las afinidades de unión preferidas de los agentes de dirección tales como los anticuerpos dirigidos se caracterizan
15 por las constantes de disociación KD (nM) de menos de 1,6, menos de 1,5 o aproximadamente menos de 1,4. Para los inmunoconjugados que comprenden dichos agentes de dirección tales como los anticuerpos dirigidos se prefieren constantes de disociación KD (nM) de menos de 1,6, menos de 1,5, o menos de 2,5, menos de 2,4, menos de 2,3, menos de 2,2, menos de 2,1, menos de 2,0, menos de o aproximadamente 1,9.
20 Una región de unión al antígeno (ABR) de acuerdo con la presente descripción variará basándose en el tipo de anticuerpo dirigido o el anticuerpos dirigido modificado que se emplee. En un anticuerpo de origen natural y el mayoría de los anticuerpos quiméricos y humanizados, la región de unión al antígeno se compone de una cadena ligera y de los primeros dos dominios de una cadena pesada y así comprende un ABR con un solo sitio de combinación con el antígeno. Por otro lado, los diacuerpos son pequeños fragmentos de anticuerpo con dos
25 regiones de unión al antígeno. En el contexto de la presente invención, sin embargo, una región de unión al antígeno de un anticuerpo dirigido o anticuerpo dirigido modificado es cualquier región que determina primariamente la especificidad de unión del anticuerpo dirigido o anticuerpo dirigido modificado.
Si una ABR u otra región del anticuerpo dirigido se dice ser “de un cierto anticuerpo”, por ejemplo, un anticuerpo
30 humano o no humano, significa en el contexto de la presente descripción que la ABR es o idéntica a una ABR de origen natural correspondiente o está basada en la misma. Una ABR se basa en una ABR de origen natural si tiene la especificidad de unión de la ABR de origen natural. Sin embargo, tal ABR puede comprender, por ejemplo, mutaciones puntuales, adiciones, eliminaciones o modificaciones post-traduccionales tales como glucosilación. Tal ABR puede en particular tener una identidad de secuencia de más del 70%, más del 80%, más del 90%,
35 preferentemente más del 95%, más del 98%, o más del 99% con la secuencia de la ABR de origen natural.
Dirección homogénea de un agente de dirección tal como un anticuerpo dirigido, pero en particular, un inmunoconjugado que comprende el mismo, en el contexto de la presente invención, es una medida de la variación que se asocia con la obtención del resultado deseado de dicha dirección con el agente de dirección. En ciertas 40 realizaciones de la invención, el resultado deseado se obtiene por unión simple a la diana. Este es, por ejemplo, el caso de realizaciones en las que un cierto agente de dirección proporciona un escudo contra la unión posterior. Sin embargo, la homogeneidad de un agente dirigido se puede evaluar fácilmente, por ejemplo, por medio de la eficacia de un inmunoconjugado que comprende dicho agente de dirección. Por ejemplo, la eficacia de dicho inmunoconjugado contra un antígeno tumoral tal como el CD138 que comprende un efector que ayuda a la 45 destrucción de las células tumorales y/o la detención del crecimiento de un tumor se puede determinar por el grado de supresión del crecimiento de un tumor que comprende células que expresan el antígeno CD138. Tal inmunoconjugado puede presentar una gran variación en su eficacia. Esto puede, por ejemplo, detener el crecimiento tumoral a veces con alta eficacia, pero otras veces con una eficacia que apenas excede la eficacia del control. Una baja variación de la eficacia de un inmunoconjugado, por otra parte, muestra que el inmunoconjugado 50 y/o el agente dirigido, respectivamente, proporciona el resultado deseado constantemente. Una forma de cuantificar la homogeneidad de la dirección es calcular la variación de dirección. En el contexto de la detención del crecimiento tumoral por un inmunoconjugado que comprende un cierto agente de dirección, la variación de dirección se puede calcular primero determinando el tiempo para que un tumor alcance un volumen predeterminado, por ejemplo, 300 mm3. Preferentemente, el volumen predeterminado se escoge de forma que el crecimiento de cualquier tumor antes 55 y después de haber alcanzado dicho volumen predeterminado aumenta establemente a aproximadamente la misma tasa. Tras determinar tal tiempo para un grupo de sujetos, se calcula la media de estos tiempos (Tm) en el grupo de sujetos (por ejemplo, ratones SCID u otro modelo adecuado que muestre un crecimiento tumoral homogéneo). El Tm se correlaciona entonces con las observaciones que se hacen en el sujeto del grupo que muestra la eficacia mínima en la dirección y de esta manera se asocia con tumores que necesitan el tiempo mínimo (Tf) para alcanzar dicho
60 volumen predeterminado, y por otra parte, el sujeto del grupo que muestra la eficacia máxima en la dirección y que se asocia con tumores que necesitan el mayor tiempo (Ts) para alcanzar dicho volumen predeterminado calculando la variación de dirección para el volumen predeterminado de acuerdo con la siguiente fórmula:
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VARIACIÓN DE DIRECCIÓN [%] =Ts -Tf/Tm x 100
5 En una realización preferida, la variación de dirección del inmunoconjugado que comprende el anticuerpo dirigido modificado de la presente descripción es menor del 150%, menor del 140%, menor del 130%, menor del 120%, menor del 110%, menor del 100%, menor del 90%, menor del 80%, menor del 70%, menor del 60%, o menor del 50%, y en ciertas realizaciones incluso menor del 45%. Preferentemente, la variación de dirección es entre aproximadamente el 10% y aproximadamente el 150%, preferentemente entre aproximadamente el 10% y
10 aproximadamente el 100%, aproximadamente el 10% y aproximadamente el 80%, aproximadamente el 10% y aproximadamente el 70%, aproximadamente el 10% y aproximadamente el 60%, aproximadamente el 10% y aproximadamente el 50%.
La homogeneidad de dirección también se puede cuantificar por otros medios tales como la determinación del
15 retraso del crecimiento tumoral. También, como entenderá fácilmente un experto en la técnica el volumen tumoral de un cierto tamaño es solo un parámetro con el que se puede determinar la base de la variación de dirección. Dependiendo del resultado deseado, se pueden emplear otros parámetros que incluyen el tiempo (por ejemplo, por medición del retraso del crecimiento tumoral) o el % de unión. El experto en la técnica puede fácilmente determinar tales otros parámetros.
20 La FIG. 9 muestra en (C ) y (D) las diferencias de homogeneidad de dirección/unión entre inmunoconjugados que comprenden el anticuerpo murino BB4 (BB4-SPP-DM1; FIG. 9C) y el anticuerpo dirigido modificado nBT062 (nBT062-SPP-DM1; FIG. 9D) que se basa en el mismo. Como se puede apreciar en estos gráficos, los resultados obtenidos con el inmunoconjugado que comprende el anticuerpo dirigido modificado son sustancialmente más
25 homogéneos que los que se obtienen con los inmunoconjugados que comprenden el anticuerpo murino. Esto es particularmente notable ya que la región de unión de anticuerpo del BB4 no se modificó en nBT062. Por lo tanto, el inmunoconjugado que comprende la región de unión de anticuerpo del anticuerpo murino, pero no otras partes del anticuerpo murino, mostraba propiedades que excedieran los resultados que esperaba el experto en la técnica.
30 El nBT062 (véase también la FIG. 1) es un mAb IgG4 versión quimérica humana murina de B-B4. Esta versión quimérica de B-B4 se creó para reducir la respuesta HAMA (Anticuerpo humano anti-ratón), a la vez que mantiene la funcionalidad de la región de unión de anticuerpo del B-B4 para el CD138. Sorprendentemente, los resultados obtenidos con el uso de un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo dirigido modificado eran mucho más homogéneos (la variación en los resultados estaba reducida). El protocolo para la producción de nBT062 se
35 especifica por debajo. Las células ováricas de hámster chino que expresan nBT062 se han depositado en la DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1, D-38124 Braunschweig el 11 de diciembre de 2007. El número de identificación es DSM ACC2875. El anticuerpo quimérico específico CD138 basado en B-B4 se denomina genéricamente c-B-B4.
40 La secuencia de aminoácidos de ambos, las cadenas pesada y ligera se han predicho de la traducción de la secuencia de nucleótidos para nBT062. Las secuencias de aminoácidos previstas para la cadena pesada y la cadena ligera se presentan en la Tabla 1. Las regiones variables previstas están en negrita, las CDR previstas están subrayadas.
45 Tabla 1. Secuencia de aminoácidos prevista para nBT062
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La lisina del extremo C es susceptible de cortarse y puede estar presente debido a un corte incompleto en cierta medida. La (K) entre paréntesis no es parte de la SEC ID Nº 1
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inhibir la adhesión celular de mieloma múltiple a las BMSC (células del estroma de médula ósea) en muestras en las que solo se trataban las células del estroma (así como en muestras en los que las células del estroma no se trataban), mientras que el equivalente UINCL no tenía esta efecto. Estos resultados sugieren el que el efecto de disminución del efecto depende de la naturaleza del enlazador del inmunoconjugado, con un enlazador escindible se
5 permite disociarse a la molécula efectora más fácilmente, siendo preferidos. El hecho de que las células de mieloma múltiple se salvaguardan por la adherencia a las BMSC también las hace más fácilmente accesibles a otros agentes citotóxicos, que incluyen los que habitualmente tienen una acción inhibida, al menos con total eficacia, sobre las células de mieloma múltiple como resultado de la CAM-DR. Por lo tanto, la administración del inmunoconjugado se combina preferentemente con una administración simultánea o posterior de agente citotóxico. Los intervalos de tiempo entre la administración del inmunoconjugado y el agente citotóxico puede comprender de 12 horas a 6 días, incluyendo 12 horas, 24 horas, 2, 3, 4 o 5 días.
Los inmunoconjugados desvelados en el presente documento se pueden administrar por cualquier vía, incluyendo la vía intravenosa, parenteral, oral, intramuscular, intratecal o como un aerosol. El modo de administración dependerá
15 del efecto deseado. Un experto en la técnica conocerá fácilmente la mejor vía de administración para un tratamiento particular de acuerdo con la presente invención. La dosificación apropiada dependerá de la vía de administración y del tratamiento indicado, y puede determinarlo fácilmente un experto en la técnica en vista de los protocolos de tratamiento actuales.
Las composiciones farmacéuticas que contienen el inmunoconjugado de la presente descripción y/o cualquier agente citotóxico como ingredientes activos pueden prepararse de acuerdo con las técnicas de composición farmacéuticas convencionales. Véase, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17ª Ed. (1985, Mack Publishing Co., Easton, Pa.). Típicamente, las cantidades eficaces de los ingredientes activos se mezclarán con un vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo puede tener una amplia variedad de formas dependiendo de la
25 forma de preparación deseada para la administración, por ejemplo, intravenosa, oral, parenteral, intratecal, transdérmica, o por aerosol.
Para la administración oral, el inmunoconjugado y/o el agente citotóxico se puede formular en preparaciones sólidas o líquidas tales como cápsulas, píldoras, comprimidos, pastillas para chupar, fusiones, polvos, suspensiones o emulsiones. En la preparación de las composiciones en forma de dosificación oral, se puede emplear cualquiera de los medios farmacéuticos, tales como, por ejemplo, agua, glicoles, aceites, alcoholes, agentes saborizantes, conservantes, agentes colorantes, agentes suspensores, y similares en el caso de preparaciones líquidas orales (tales como, por ejemplo, suspensiones, elixires y soluciones); o vehículos tales como almidones, azúcares, diluyentes, agentes granulantes, lubricantes, aglutinantes, agentes disgregantes y similares en el caso de
35 preparaciones orales sólidas (tales como, por ejemplo, polvos, cápsulas o comprimidos). Debido a su facilidad de administración, los comprimidos y cápsulas representan las formas de dosificación unitaria orales más ventajosas, en cuyo caso obviamente se emplean vehículos farmacéuticos sólidos. Si se desea, los comprimidos pueden estar cubiertos con azúcar o con recubrimiento entérico por técnicas de referencia. El agente activo debe ser estable para el paso a través del tracto gastrointestinal. Si fuera necesario, se pueden utilizar agentes adecuados para el paso estable, y pueden incluir fosfolípidos o derivados de lecitina descritos en la bibliografía, así como liposomas, micropartículas (incluyendo microsferas y macrosferas).
Para la administración parenteral, el inmunoconjugado y/o agente citotóxico se puede disolver en un vehículo farmacéutico y se administra como una solución o una suspensión. Son ilustrativos de vehículos adecuados el agua,
45 solución salina, solución de fosfato tampón (PBS), soluciones de dextrosa, soluciones de fructosa, etanol. O aceites de origen animal, vegetal o sintético. El vehículo también puede contener otros ingredientes, por ejemplo, conservantes, agentes de suspensión, agentes solubilizantes, tampones y similares. Cuando el agente no conjugado y/o inmunoconjugado y/o agente citotóxico se van a administrar por vía intracerebroventricular o intratecal, también se pueden disolver en líquido cefalorraquídeo.
Las dosificaciones que se administran a un sujeto se pueden especificar como la cantidad, por área de superficie del sujeto (que incluye seres humano así como animales no humanos). La dosis se puede administrar a tal sujeto en cantidades, preferentemente, pero no exclusivamente desde aproximadamente 5 mg/m2 a aproximadamente 300 mg/m2, incluyendo aproximadamente 20 mg/m2, aproximadamente 50 mg/m2, aproximadamente 100 mg/m2, 55 aproximadamente 150 mg/m2, aproximadamente 200 mg/m2 y aproximadamente 250 mg/m2. En ciertas realizaciones, en las que el inmunoconjugado se administra en combinación con un agente citotóxico, la dosis de inmunoconjugado puede ser menor. Los inmunoconjugados se administran adecuadamente de una vez o sobre una serie de tratamientos. En un régimen de múltiples dosis, estas cantidades se pueden administrar una vez al día, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez cada cinco semanas o una vez cada seis semanas. Las dosis de carga con una sola dosis alta o, de manera alternativa, las dosis más bajas que se administran enseguida una tras la otra, seguidas por dosificaciones separadas por intervalos largos constituyen una realización preferida de la presente invención. En una realización preferida, la planificación de las dosificaciones se ajustan para un sujeto de forma que pase el tiempo suficiente antes de un segundo y/o cualquier tratamiento posterior de forma que se haya metabolizado la dosis inicial 65 sustancialmente, pero la cantidad de inmunoconjugado presente en el sistema del paciente aún inhibe, retrasa y/o previene el crecimiento de un tumor. Un regimen ejemplar de “dosis única repetida” comprende la administración de
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una dosis inicial de inmunoconjugado de aproximadamente 200 mg/m2 una vez cada tres semanas. Alternativamente, una dosis inicial alta puede estar seguida por una dosis de mantenimiento bisemanal de aproximadamente 150 g/m2. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación. El progreso de esta terapia se controla fácilmente por técnicas y ensayos conocidos. La dosificación puede variar dependiendo de si se
5 administran con fines terapéuticos o preventivos, el curso de cualquier terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta al agente de dirección/inmunoconjugado, y a discreción del facultativo.
En una realización, el inmunoconjugado se administra con uno o más agentes citotóxicos adicionales, que es eficaz para tratar la misma enfermedad pero que está, cuando se administra sin el inmunoconjugado, limitado a menudo en su eficacia debido a CAM-DR; por ejemplo, se puede administrar un inmunoconjugado específico CD138 en combinación con dexametasona. En particular, la dexametasona se administra a un paciente que necesita la misma en una cantidad eficaz dos horas antes de administrarse el inmunoconjugado.
Por lo tanto, el inmunoconjugado de la presente descripción también puede administrarse particularmente en
15 regímenes de tratamiento con quimioterapia de alta dosis (preferentemente , melfalán, melfalán/prednisona (MP), vincristina/doxorrubicina/dexametasona (VAD), doxorrubicina/vincristina, dexametasona liposómicas (DVd), ciclofosfamida, etopósido/dexametasona /citarabina, cisplatino (EDAP)), trasplantes de células madre (por ejemplo trasplantes autólogos de células madre, y/o trasplante de células madre mini-alogénico (no-mieloablativo)), esteroides (por ejemplo, corticosteroides, dexametasona, talidomida/dexametasona, prednisona, melfalán/prednisona), terapia de soporte (por ejemplo, bifosfonatos, factores de crecimiento, antibióticos, inmunoglobulina intravenosa, radioterapia de dosis baja, y/o intervenciones ortopédicas), THALOMID (talidomida, Celgene), VELCADE (bortezomib, Millennium), y/o REVLIMID (lenalidomida) (Chelgene Corporation) y/o otros tratamientos del mieloma múltiple incluyendo la radioterapia.
25 Si un inmunoconjugado de la presente descripción se administra en combinación con agentes citotóxicos, las dosis y regímenes anteriores a menudo se mantienen. Sin embargo, si el inmunoconjugado y el agente citotóxico se coadministran, se prefieren, en ciertas realizaciones, dosis menores de cada uno de estos componentes terapéuticos. En tal situación el inmunoconjugado se puede administrar a dosis desde aproximadamente 5 mg/m2 a aproximadamente 100 mg/m2, incluyendo aproximadamente 20 mg/m2, aproximadamente 50 mg/m2, mientras que el agente citotóxico se administra a dosis como las que se recomiendan cuando se administran solos.
Los datos experimentales que se obtienen basándose en el cultivo celular (Fig. 7) y los experimentos con ratones (Fig. 8 a 11), se confirmó más con experimentos que además apoyaban estos hallazgos.
35 La patogénesis del mieloma múltiple implica la unión de las células de mieloma, por medio de las moléculas de adhesión de superficie celular, no solo a las células del estroma de la médula ósea (BMSC) sino también a la matriz extracelular (ECM). Esta unión desencadena, y por tanto puede ser el responsable en último término, del crecimiento celular del mieloma múltiple, la resistencia a los fármacos y la migración de las células del MM en el medio de la médula ósea (Munshi et al. 2008). En particular, la adhesión de células de mieloma múltiple a la ECM por medio de sindecan-1 (CD138) al colágeno tipo I, induce la expresión de la metaloproteinasa de la matriz 1, promoviendo de esta forma la resorción ósea y la invasión tumoral (Hideshima et al. 2007). Las interacciones entre las células de mieloma múltiple y el microambiente de la médula ósea producen la activación de una cascada proliferativa pleiotrópica y anti-apoptótica.
45 Después del asentamiento de las células de mieloma múltiple en el compartimento del estroma de la médula ósea, la adhesión entre las células del mieloma múltiple y las BMSC regula positivamente muchas citocinas tales como la interleucina-6 (IL-6) y factor de crecimiento tipo insulina 1 (IGF-1) que tienen actividades angiogénicas y de crecimiento tumoral (Hideshima et al. 2007). Las cascadas de señalización iniciadas por estas citocinas eventualmente da como resultado la resistencia de las células del MM a los agentes terapéuticos convencionales (Anderson et al. 2000; Hideshima et al. 2006).
La eficacia in vivo de nBT062-SPDB-DM4 y nBT062-SPP-DM1 contra las células tumorales positivas a CD138 en presencia de médula ósea humana se analizó en un modelo de ratón y los resultados de este análisis se muestran en la Fig. 13. Las figuras muestra que ambos, HICL y UICL funcionan bien en este ambiente. El aumento en el nivel
55 de ShuIL-6R que se pueden utilizar, en este modelo, como un parámetro de crecimiento celular de MM, ambos se suprimieron con estos inmunoconjugados.
De acuerdo con la presente descripción, el MM se trata de la siguiente manera, con el uso de BT062 como ejemplo. Este ejemplo no pretende limitar la presente descripción de ninguna manera, y un experto en la técnica podría determinar fácilmente otro inmunoconjugado o sistemas basados en nBT062 que estén dentro del ámbito de la presente descripción y otros regímenes de tratamiento que se podrían utilizar para el tratamiento de enfermedades tales como la MM.
Debido a la expresión selectiva de CD138 en las células MM del paciente por medio de las células accesibles de la
65 corriente sanguínea, la especificidad de nBT062 y la estabilidad de BT062 en la corriente sanguínea, el BT062 elimina la toxicidad sistémica del DM4 y proporciona una oportunidad de dirigir el suministro de la molécula efectora
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secuenciaron de cada producto de 1ª cadena. Se secuenciaron cinco clones de cada 1ª cadena.
Construcción de vectores de expresión cB-B4 quiméricos
5 La construcción de los vectores de expresión quiméricos supone añadir una secuencia directora adecuada a VH y V, precedido por un sitio de restricción BamHI y una secuencia Kozak. La secuencia de consenso Kozak es crucial para la traducción eficaz de una secuencia de región variable. Define el codón AUG correcto a partir del que el ribosoma puede comenzar la traducción, y la única base más crítica es la adenina (o menos preferible, una guanina) en la posición -3, corriente arriba del inicio AUG. La secuencia directora se selecciona como la secuencia más similar en la base de datos Kabat (Kabat et al., NIH National Technical Information Service, 1991). Estas adiciones se codifican con los cebadores directos (Dir) (que tienen ambos la secuencia 5’-AGAGAAGCTTGCCGCCACCATGATT-GCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCC-3’ [SEC ID NO: 9]; el sitio de restricción está subrayado, la secuencia Kozak está en negrita). Además, la construcción de los vectores de expresión quimérica suponen la introducción de un fragmento 5’ de la región constante humana gamma 1, hasta un
15 sitio de restricción ApaI natural, contiguo al extremo 3’ de la región J de B-B4 y, para la cadena ligera, la adición de un sitio donante de corte empalme y un sitio HindIII. La secuencia donante de corte empalme es importante para el acoplamiento correcto en fase de la región variable a su región constante correcta, así el corte empalme fuera del intrón V:C. El intrón kappa + CK se codifican en la construcción de expresión corriente abajo de la secuencia B-B4 V. De manera similar la CH4 gamma se codifica en la construcción de expresión corriente abajo de la secuencia VH B-B4.
Los genes VH y V B-B4 primero se analizaron cuidadosamente para identificar cualquier sitio donante de corte empalme, sitios aceptores de corte empalme, secuencias Kozak y la presencia de cualquier sitio de restricción de sub-clonaje extra que pudiera más tarde interferir con la subclonación y/o expresión del anticuerpo completo
25 funcional. Un sitio HindIII no deseado se encontraba en la secuencia V que era eliminado necesariamente por mutagénesis dirigida al sitio por medio de PCR sin cambiar la secuencia de aminoácidos. Para estas reacciones se utilizaron los cebadores oligonucleotídicos BT03 (5’-CAACAGTATAGTAAGCTCCCTCGGACGTTCGGTGG-3’) [SEC ID NO:10] y BT04 (5’-CCACCGAACGTCCGAGGGAGCTTACTATACTGTTG-3’) [SEC ID NO:11] y se llevó a cabo la mutagénesis de acuerdo con el protocolo del kit de mutagénesis Quickchange de Stratagene (La Jolla, CA).
Cebadores de quimerización de cadena Kappa
La secuencia directora B-B4 V no ambigua, independiente de la secuencia de cebador PCR, se alinearon con las secuencias directoras murinas de la base de datos Kabat. La coincidencia más cercana para la directora VH B-B4
35 era VK-10 ARS-A (Sanz et al., PNAS, 84 (1987), 1085). Se preveía que esta secuencia directora se cortaba correctamente por el algoritmo SignaIP (Nielsen et al., Protein Eng, 10 (1997); 1). Los cebadores CBB4Kdir (véase anteriormente) y g2258 (5’-CGCGGGATCCACTCACGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCTCC-3’ [SEC ID NO:12]; El sitio de restricción está subrayado) se diseñaron para generar un producto PCR que contenía esta región directora B-B4 V completa, y los sitios de restricción terminales HindIII y BamHI, para la clonación en el vector de expresión pKN100. El cebador directo CBB4K, introduce un sitio de restricción HindIII, un sitio de inicio de la traducción Kozak y la secuencia directora VK-19 ARS-A. El cebador inverso g2258 introduce un sitio de corte empalme y un sitio de restricción BamHI. El fragmento resultante se clonó en los sitios de restricción HindIII/BamHI de pKN100.
Cebadores de quimerización de cadena pesada
45 La secuencia directora B-B4 VH no ambigua, independiente de la secuencia de cebador PCR, se alineó con las secuencias directoras murinas de la base de datos Kabat. La coincidencia más cercana para la directora B-B4 VK era VH17-1A (Sun et al., PNAS, 84 (1987), 214). Se preveía que esta secuencia directora se cortaría correctamente por el algoritmo SinaIP. Los cebadores cBB4Hdir (véase anteriormente) y g22949 (5’-CGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGA-GACGGTGACTGAGGTTCC-3’ [SEC ID NO:13]; el sitio de restricción está subrayado) se diseñaron para generar un producto PCR que contenía la directora VH17-1A, la región B-B4 VH, y los sitios de restricción terminales HindIII y ApaI, para la clonación en el vector de expresión pG4D200. El cebador directo cBBHDir introduce un sitio de restricción HindIII, un sitio de inicio de la traducción Kozak y la secuencia directora VH17-1A. El cebador inverso g22949 introduce el extremo 5’ de la región 4 C gamma y un sitio de
55 restricción ApaI natural. El fragmento resultante se clonó en los sitios de restricción HindIII/ApaI de pG4D200, dando como resultado el vector pG4D200cBB4.
Producción de anticuerpo cBB4
Un vial de células COS 7 se descongeló y se cultivó en DMEM suplementado con un 10% de suero fetal clon I con antibióticos. Una semana más tarde, las células (0,7 ml a 107 células/ml) se electroporaron con pG4D200cBB4 más pKN100cBB4 (10 g de ADN cada uno) o sin ADN. Las células se colocaron en placas con 8 ml de medio de cultivo durante 4 días. Se repitió la electroporación siete veces.
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Detección de anticuerpo quimérico
Para medir las concentraciones de anticuerpo en los sobrenadantes de células COS 7 se utilizó un ELISA de tipo sándwich. Las células COS 7 que se transformaron transitoriamente segregaban aproximadamente 6956 ng/ml de 5 anticuerpo (datos no mostrados).
Actividad de unión de cB-B4
Para ensayar la actividad de unión de cB-B4 en los sobrenadantes del cultivo de COS 7, se utilizó el kit sCD138 Diaclone, un ELISA de tipo sándwich de fase sólida. Se habían revestido pocillos de las tiras de microtitulación proporcionadas, con un anticuerpo monoclonal específico para sCD138. Durante la primera incubación, se incubaron juntos simultáneamente sCD138 y el anticuerpo B-B4 biotinilado (bio-B-B4) con una serie de diluciones de anticuerpo de ensayo sin marcar (B-B4 o cB-B4).
15 Las concentraciones de bio-B-B4 en este ensayo se redujeron con el fin de obtener la competición con bajas concentraciones o anticuerpo sin marcar (la concentración de cB-B4 en sobrenadantes de cultivo celular eran de otra manera demasiado bajas para obtener la suficiente competición). Los resultados de este ensayo revelan que ambos anticuerpos tiene la misma especificidad para CD138 (datos no mostrados).
Purificación de cB-B4
El B-B4 quimérico se purificó de los sobrenadantes COS 7 utilizando el kit Protein A ImmunoPure Plus (Pierce), según las recomendaciones del fabricante (datos no mostrados).
25 Determinación de KD: Comparación nBT062 / BB4
Purificación de CD 138 soluble
El antígeno soluble CD138 de sobrenadante del cultivo celular U-266 se purificó por FPLC utilizando la columna “HP activada-NHS HiTrap” de 1 ml acoplada con B-B4. Es sobrenadante del cultivo celular se cargó en tampón PBS pH 7,4 en la columna y después en antígeno CD138 se eluyó con tri-etilamina 50 mM pH 11 en fracciones de 2 ml. El CD138 eluído se neutralizó inmediatamente con 375 l de Tris-HCl 1 M para evitar daños estructurales y/o funcionales.
35 Biotinilación de CD138
Se utilizó Sulfo-NHS-LC (Pierce) para marcar el CD138. Las biotinas activadas-NHS reaccionan eficazmente con grupos amino primarios tipo restos de lisina en tampones a pH 7-9 para formar enlaces amida estables.
Para la biotinilación de CD138, se desalaron 50 l de CD138 utilizando columnas centrífugas desaladoras de proteínas (Pierce). El reactivo de biotinilación (EZ-Link Sulfo NHS-LC-Biotin, Pierce) se disolvió en H2O desionizada enfriada en hielo a una concentración final de 0,5 mg/ml. El reactivo de biotinilaicón y la solución del reactivo de captura se mezclaron teniendo un exceso molar de 12 veces de reactivo de biotinilación en comparación con el reactivo de captura (60 pmol de CD138 a 600 pmol de reactivo de biotinilación) y se incubaron 1 h a temperatura
45 ambiente mientras se agitaba el vial cuidadosamente. El reactivo de biotinilación no unido se retiró utilizando las columnas de desalado de proteínas.
Inmovilización de bCD138
La microplaca detectora (SENSOR CHIP SA, BIACORE AB) que se utilizó en el ensayo BIACORE se diseñó para unirse a moléculas biotiniladas para los análisis de interacción en sistemas BIACORE. La superficie consiste en una matriz de dextrano carboximetilada pre-inmovilizada con estreptavidina y lista para la captura de alta afinidad de ligando biotinilados. La inmovilización de bCD138 se llevó a cabo en la microplaca detectora SENSOR CHIP SA utilizando una tasa de flujo de 10 l/min por inyección manual. La superficie de la microplaca se acondicionó con tres
55 inyecciones sucesivas de 1 minuto de NaCl 1M en 50 mM de NaOH. Luego se inyectó el CD138 biotinilado durante 1 minuto.
Determinación de KD de diferentes anticuerpos utilizando BIACORE
El software BIACORE C utiliza máscaras pre-definidas, denominadas “Asistentes” para diferentes experimentos en el que solo se pueden cambiar ciertos ajustes. Como el BIACORE C se desarrolló originalmente para medir concentraciones, no hay asistente diseñado para llevar a cabo mediciones de afinidad. Sin embargo, con los ajustes adecuados, el asistente para “unión no específica” se podría utilizar para medir las constantes de la tasa de afinidad y por lo tanto utilizarse para la determinación de KD. Con este asistente, se midieron dos células en flujo y la fase de 65 disociación se fijó a 90 s llevando a cabo la “Regeneración 1” con el tampón de ejecución BIACORE. La “Regeneración 2” que es equivalente a la regeneración real se llevó a cabo con 10 mM de Glicina-HCl pH 2,5. Tras
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esta etapa, el ligando CD138 estaba en su estado competente de unión de nuevo. Durante todo el procedimiento se utilizó HBS-EP como tampón de ejecución y dilución. Para determinar la unión de los diferentes anticuerpos ( 150 kDa) contra el CD138, se analizaron la asociación y la disociación a diferentes concentraciones (100, 50, 25, 12,5, 6,25 y 3,13 nM). Las constantes del equilibrio de disociación se determinaron calculando las constantes de tasa ka y
5 kd. A continuación, los valores de KD se los analitos se calcularon por el cociente de kd y ka con el softwares BIAevaluation. Los resultados se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4: Análisis comparativo de los valores de KD de nBT062 y B-B4. Se dan los valores de desviación estándar para los valores medios de KD. 10
Afinidad
Anticuerpo
KD(nM)
media KD (nM)
1,4
nBT062
1,4
1,4 +/-0,06
1,5
1,7
B-B4
1,7
1,6 +/-0,06
1,6
1,9
nBT062-SPDB-DM4 1,9 1,9 +/-0,00
1,9
2,6
B-B4-SPP-DM1
2,7
2,6 +/-0,06
2,6
Conclusión
Los valores medios de KD para cada anticuerpo se calcularen en tres experimentos independientes. Los resultados
15 muestran que en todas las mediciones nBT062 muestra valores de KD ligeramente menores en comparación con con el B-B4 (los valores medios de la KD eran 1,4 y 1,6 nM, respectivamente).
Preparación de inmunoconjugados
20 nBT062-DM1 y huC242-DM1
El maitansinoide DM1 que contiene tiol se sintetizó a partir del producto de fermentación ansamitocina P-3, como había descrito anteriormente Chari (Chari, et al., Cancer Res. 1 (1992), 127). La preparación de C242 humanizado (huC242) ((Roguska et al., PNAS, 91 (1994), 969) se había descrito previamente. Los conjugados de fármacos
25 anticuerpos se prepararon como se había descrito previamente (Liu et al., PNAS, 93 (1996), 8618). Una media de 3,5 moléculas de DM1 se unieron por molécula de anticuerpo.
nBT062-DM4
30 El BT062 es un conjugado fármaco-anticuerpo compuesto por el fármaco maitansinoide citotóxico, DM4, unido por puentes disulfuro por medio de un enlazador al anticuerpo monoclonal quimerizado nBT062. Los maitansinoides son anti-mitóticos que inhiben la polimerización de la tubulina y el ensamblaje de microtúbulos (Remillard et al., Science 189 (1977), 1002). Las representaciones química y esquemática de BT062 (nBT062-DM4) se muestran en las FIG. 1 y 2.
35
Síntesis de DM4
El DM4 se prepara a partir del derivado maitansinol bien conocido (Kupchan et al., J. Med. Chem., 21 (1978), 31). El maitansinol se prepara por escisión reductora del resto éster del producto de fermentación microbiana, ansamitocina
40 P-3, con hidruro de litio trimetoxialuminio. (Véase la FIG. 3).
El DM4 se sintetiza por acilación del maitansinol con N-metil-N-(4-metilditiopentanoil)-L-alanina (cadena lateral del DM4) en presencia de ciciclohexilcarbodiimida (DCC) y cloruro de zinc para dar al maitansinoide que contiene disulfuro DM4-SMe. El DM4-SMe se reduce con ditiotreitol (DTT) para dar el maitansinoide DM4 que contiene tiol
45 deseado (véase la FIG. 4 para el diagrama de flujo de proceso del DM4).
Inmunoconjugado BT062
El procedimiento para la preparación de nBT062-DM4 se perfila en la FIG. 5. El anticuerpo nBT062 se modifica con
50 N-succimidil-4-(2-piridiltio) butirato (enlazador SPDB) para introducir grupos ditiopiridilo. El DM4 se mezcla con el anticuerpo modificado a una concentración en exceso de equivalentes de grupos ditiopiridilo. El conjugado BT062 se
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Log10 destrucción celular = (T -C) / Td x 3,32
en el que (T-C) o retraso de crecimiento tumoral, es el tiempo medio en días necesario para que los tumores del grupo de tratamiento (T) y el grupo de control (C), alcanzaran un tamaño predeterminado (600 mm3). Td es el tiempo 5 de doblaje del tumor, y 3,32 es el número de células que se doblan por logaritmo de crecimiento celular.
Resultados
El crecimiento tumoral en ratones individuales se muestra en las FIG. 8 y 9. La media (+/-DE) del crecimiento del 10 tumor para cada grupo se muestra en la FIG. 10.
Cuando se compara con el crecimiento del tumor en los animales tratados con PBS, el tratamiento con el anticuerpo nBT062, el DM4 libre no conjugado o el conjugado no relevante no dirigido huC242-DM4 no produjeron ninguna inhibición significativa del crecimiento tumoral.
15 Los tres conjugados dirigidos contra CD138 , nBT062-SPDB-DM4, B-B4-SPP-DM1 y nBT062-SPP-DM1, a una dosis de 250 g/kg producían un marcado retraso del crecimiento tumoral. Basándose en la media de volúmenes tumorales medidos en los grupos de tratamiento, el conjugado con DM4 nBT062-SPDB-DM4 era el más activo, mientras que el conjugado nBT062-SPP-DM1 mostraba un ligero aumento de actividad al compararlo con su
20 equivalente murino B-B4-SPP-DM1 (FIG. 10). Los resultados obtenidos en ratones individuales muestran además que la actividad anti-tumoral obtenida con B-B4-SPP-DM1 es más heterogénea y por lo tanto menos predecible que con la medida de los ratones tratados con nBT062-SPP-DM1. En términos de homogeneidad de actividad antitumoral, el otro conjugado que utiliza nBT062 como anticuerpo dirigido nBT062-SPDB-DM4 se comportaba de forma similar a nBT062-SPP-DM1.
25 No se observó una reducción de peso en ningún grupo de tratamiento sugiriendo que los tratamientos eran bien tolerados.
Conclusión
30 Los resultados de los tres conjugados dirigidos contra CD138 en los animales de experimentación demuestran la importancia del suministro dirigido para la actividad anti-tumoral. Mientras los conjugados con maitansinoide de los anticuerpos nBT062 quimérico humano y el B-B4 murino muestran una actividad significativa como se mide por el log de destrucción celular, no había un impacto significativo sobre el crecimiento tumoral con el DM4 sin conjugar, el
35 anticuerpo huBT062 nativo sin modificar, o un conjugado no dirigido de control (huC242-DM4).
El inmunoconjugado preparado a partir del anticuerpo quimérico de ser humano, nBT062-SPP-DM1, daba una actividad anti-tumoral ligeramente mayor que el conjugado preparado de su equivalente murino, B-B4-SPP-DM1. Además, el tratamiento con nBT062-SPP-DM1 y nBT062-SPDB-DM4 daban como resultado respuestas más 40 homogéneas en los ratones individuales en comparación con el tratamiento con B-B4-SPP-DM1. La alta variación de unión de B-B4-SPP-DM1 explicaba que la medición del volumen tumoral medio (+/-DE) de los xenoinjertos de mieloma múltiple humano MOLP-8 en ratones SCID CB.17 a lo largo del tiempo (días) tras la inoculación proporciona actualmente resultados relativamente mejores para el B-B4-SPP-DM1 que para el nBT062-SPP-DM1 (datos no mostrados). Esta característica de los inmunoconjugados que utilizan nBT062 como anticuerpo dirigido
45 parece ser beneficiosa especialmente para el uso terapéutico de los conjugados.
Por último, el más potente de los conjugados maitansinoides, después de una única administración i.v. en los modelos de xenoinjerto en ratones SCID, era el nBT062-SPDB-DM4.
50 Destrucción del testigo (ensayo de viabilidad celular)
Las células OPM2 CD138+ y Namalwa CD138-se sembraron en placas de fondo redondo o en pocillos distintos o en co-cultivo. Las células se trataron con nBT062-SPDB-DM4 a concentraciones que variaban desde 1 x 10-8 a 1 x 10-9
M. La fracción de células viables se detectó utilizando el reactivo WST (sal de tetrazolio soluble en agua, ROCHE)
55 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ROCHE). La fracción de células supervivientes se calculó basándose en las densidades ópticas medidas en un lector de microplacas utilizando procedimientos de referencia.
Conclusión
60 La destrucción del testigo de las células no dirigidas en estrecha proximidad (como las presentes en los pocillos de fondo redondo) a las células de mieloma múltiple en el tratamiento con nBT062-SPDB-DM4 se analizó en un estudio in vitro en el que las células OPM2 positivas a CD138 se cultivaron en co-cultivo con células Namawla negativas a CD138 (FIG.13). En general, mientras que las células positivas a CD138 se eliminan eficazmente por nBT062SPDB-DM4, las células negativas a CD138 no se ven afectadas por el conjugado. Sin embargo, en el co-cultivo en
65 pocillos de fondo redondo, el nBT062-SPDB-DM4 también eliminaba las células negativas al antígeno en estrecha
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Eficacia in vivo de nBT062-SPDB-DM4 y nBT062-SPP-DM1 en el ambiente de la médula ósea
Preparación de ratones SCID que tienen implantes de hueso fetal humano
5 Los huesos largos humanos (trozos de hueso fetal humano) se implantaron en la parte superior del cuerpo de ratones SCID CB17 (SCID-hu) como se había descrito previamente (Urashima et al., 1997) y proporcionar así un modelo de ratón para albergar las células de MM humano en células BM humanas.
Regimen de tratamiento (ratones SCID-hu/INA-6)
4 semanas después de la implantación, se inyectaron 2,5 x 106 células INA-6 con un volumen final de 100 l de medio de cultivo celular RPMI-1640 directamente en la cavidad de la médula ósea humana en los ratones SCID-hu descritos anteriormente. Se utilizó como un parámetro del crecimiento celular MM y carga de enfermedad el aumento de los niveles de receptor IL-6 soluble humano (shuIL-6R), que es liberado por las células INA-6.
15 Los ratones desarrollaban shuIL-6R medible en el suero aproximadamente 4 semanas después de la inyección celular de INA-6 y luego recibieron 0,176 mg de conjugado o vehículo de control por medio de inyección en la vena del rabo semanalmente durante 7 semanas. Tras cada tratamiento, se recolectaron las muestras de sangre y se midieron los niveles de shuIL-6R con un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA, R&D Systems, Minneapolis, MN). Los resultados se representan en la Fig. 12.
Conclusión
La interleucina 6 (IL-6) es un factor de crecimiento y supervivencia para las células de mieloma múltiple. INA-6 es
25 una línea celular de mieloma humano dependiente de IL-6, que también necesita células del estroma de médula ósea (BMSC) para proliferar. Las líneas celulares INA-6 producen receptor IL-6 soluble (shuIL-6R). Un aumento en los niveles de shuIL se puede utilizar como un parámetro del crecimiento celular de MM y la carga de enfermedad.
Por lo tanto, los ratones sCID-hu/INA-6 proporcionan un modelo para el crecimiento de células de mieloma múltiple en su ambiente de médula ósea normal. Las células tumorales de este modelo, que interactúan directamente con la médula ósea humana, se parece estrechamente a la situación de los pacientes, en los que el crecimiento celular del tumor también está promovido por la presencia de células del estroma. Como las células INA-6 liberan receptor de interleucina-6 humano soluble (shuIL-6R), las concentraciones en el suero de esta proteína se pueden utilizar como una medida de la carga celular tumoral en estos ratones. La potencia in vivo de nBT062-SPDB-DM4 y nBT062-SPP
35 DM1 se ensayaron en este ambiente.
El tratamiento de los ratones SCIDhu/INA-6 con administraciones i.v. semanales de nBT062-SPDB-DM4 o nBT062-SPP-DM1 durante 7 semanas inducían una regresión tumoral eficaz, como se detecta por un descenso en los niveles de suero shuIL-6R con respecto al control, que indica una buena eficacia de los conjugados incluso en el ambiente de médula ósea humana, lo que refleja la situación relevante en pacientes (Fig. 12).
Análisis de la eficacia sobre nBT062-SMCC-DM1, nBT062-SPDB-DM4 y nBT062-SPP-DM1 in vitro e in vivo en animales de experimentación.
45 Materiales y métodos
Cultivo celular
Las líneas celulares sensibles a Dex (MM.1S) y resistente (MM.1R) fueron proporcionadas amablemente por el Dr. Steven Rosen (Northwestern University, Chicago, IL). Las líneas celulares RPMI8226 y U266 de MM humano se obtuvieron de la Colección de cultivos tipo americana (Manassas, VA). Las células resistentes a Doxorrubicina (Dox) (RPMI-Dox40) y resistentes a Melfalán (LR5) las proporcionó amablemente el Dr. William Dalton (Lee Moffitt Cancer Center, Tampa, FL). Las células de leucemia de células plasmáticas OPM1 y OPM2 las proporcionó amablemente el Dr. Edward Thompson (University of Texas Medical Branch, Galveston).
55 Todas las líneas celulares de MM y de estroma de médula ósea (BM) se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco DMEM (Sigma) que contenía un 10% de suero fetal bovino, 2 mM de L-glutamina (Life Technologies), 100 U/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina (Life Technologies). Las muestras de sangre recolectadas de voluntarios sanos se procesaron por gradientes de Ficoll Paque para obtener las células mononucleares de sangre periféricas (PBMC). Las células MM y BM derivadas de pacientes se obtuvieron de muestras de BM después de obtenerse el consentimiento informado según la Declaración de Helsinki y aprobado por la Oficina de Revisión Institucional del Instituto de Cáncer Dana-Farber (Boston, MA) Las células mononucleares de BM se separaron utilizando la sedimentación por densidad Ficoll-Paque, y las células plasmáticas se purificaron (>95% CD138+) por selección positiva con las microperlas de separación celular activadas magnéticas anti-CD138 (Miltenyi Biotec
65 Auburn, CA). Las células tumorales se purificaron a partir de la BM de los pacientes con MM utilizando el sistema de selección negativa RosetteSep (StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canadá), como se había descrito
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Transferencia de Western
Las células de MM se cultivaron en presencia o ausencia de nBT062-SMCC-DM1, nBT062-SPDB-DM4 o nBT062-SPP-DM1, se recolectaron, se lavaron y se lisaron utilizando un tampón del ensayo de radioinmunoprecipitación
5 (RIPA) que contenía 2 mM de Na3VO4, 5 mM NaF, 1 mM de fenilmetilsulfonil fluoruro, 5 mg/ml de inhibidor de proteasa completo, como se ha descrito anteriormente (Yasui, 2005; Hayashi, 2002). Los lisados celulares completos (20 g por calle) se sometieron a separación por electroforesis en gel de poliacrilamida-sulfato de dodecil sódico (SDS-PAGE), se transfirieron a membranas de nitrocelulosa pura (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) y se inmunotransfirió con anticuerpo contra poli-ADP (adenosina difosfato)-ribosa polimerasa (PARP), caspasa-8, caspasa-3, caspasa-9, AKT, y fosfo(Ser 473) Akt (señalización celular), así como anticuerpos anti-tubulina y anti-CD138 (Santa Cruz Biotechnology).
Ensayo de adhesión celular
15 En una placa de 96 pocillos, se pipetearon 1 x 104 BMSC en cada pocillo y se incubaron durante 12 h en presencia o ausencia de los inmunoconjugados a 37 ºC. En esta incubación, se unieron células de MM en presencia o ausencia de los fármacos a las BMSC. Por lo tanto, las células MM se lavaron 3 veces con PBS y se resuspendieron en medio RPMI libre de suero a densidades de 2 x 105 células en 100 l en presencia o ausencia de los fármacos. Cada grupo de muestra se procesó por triplicado o cuadruplicado. Tras 2 horas en co-cultivo, las células no adherentes, débilmente adheridas y el medio se retiraron volcando la placa. Posteriormente, los pocillos se lavaron tres veces en PBS. Las células adherentes restantes se cultivaron en un medio RPMI con un 10% de FBS en presencia de [3H]-timidina (0,5 Ci/pocillo, Perkin Elmer, Boston, MA, USA) por 8 horas más, para medir la síntesis de ADN.
25 Análisis estadístico
La significación estadística de las diferencias observadas en los cultivos tratados con inmunoconjugado (IC) frente a los cultivos de control se determinaron utilizando ensayos de comparación múltiple de Dunn. El nivel mínimo de significación era un valor de P menor de 0,5. Para los experimentos in vivo, los volúmenes tumorales se compararon utilizando ensayos de comparación múltiple de Dunn de una vía. La supervivencia se evaluó utilizando curvas de Kaplan-Meier y análisis de rango logarítmico.
Resultados
35 Expresión de CD138 en líneas celulares de MM
Se analizaron los niveles de expresión de CD138 líneas celulares de mieloma múltiple por transferencia de Western utilizando los lisados celulares completos de células MM1S, OPM1, OPM2, RPMI8226, DOX40, MM1R, LR5, y U266 (FIG. 14A).
Como se puede apreciar en la FIG. 14A, las células MM1S y LR5 mostraban expresión débil de CD138 y las células Dox40 eran negativas a CD138. Las otras líneas celulares mostraban niveles de alta expresión de CD138. Esto demostraba que el CD138 se expresa en 7 de 8 (87,5%) de las líneas celulares de mieloma.
45 La FIG. 14B muestra un análisis que utiliza la tinción inmunofluorescente utilizando anticuerpos específicos para CD138. Se llevó a cabo el análisis microscópico de células DOX40 (panel superior) y células OPM1 (panel inferior). La expresión de CD138 se muestra a la izquierda y los ácidos nucleicos a la derecha. La FIG. 14B muestra que las células DOX40 casi no presentan expresión detectable de CD138. Por el contrario, las células OPM1 mostraban una inmunorreactividad a CD138.
nBT062-SMCC-DM1, nBT062-SPDB-DM4 y nBT062-SPP-DM1 muestran citotoxicidad selectiva para las líneas celulares positivas a CD138
La eficacia de los conjugados anticuerpos contra CD138 y maitansinoides también se ensayaron en ensayos de
55 viabilidad celular. Los inmunoconjugados nBT062-SMCC-DM1, nBT062-SPDB-DM4 y nBT062-SPP-DM1 se ensayaron en cuanto a su potencia citotóxica contra células positivas a CD138 (OPM1, RPM18226), células que expresaban débilmente CD138 (MM1S) y células negativas a CD138 (DOX40), utilizando el ensayo basado en bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difeniltetrazolio (MTT). La FIG. 16A representa las células OPM1 (■), RPM18226 (), DOX40 (□) y MM1S () al exponerse a nBT062-SMCC-DM1, nBT062-SPDB-DM4 o nBT062-SPP-DM1, respectivamente. Se midió la supervivencia en ensayos MTT. Las viabilidades celulares tras los tiempos de incubación indicados (40, 80, 120 h) se dieron en % de viabilidad de los controles sin tratar. El tratamiento de las células con nBT062-SMCC-DM1, nBT062-SPDB-DM4 y nBT062-SPP-DM1 a concentraciones que varían desde 3 a 354 ng/ml inducían la inhibición del crecimiento en las células positivas a CD138. Este efecto se producía de una manera dependiente del tiempo y la dosis y era más prominente tras las 120 h en las dos líneas celulares que
65 expresaban altos niveles de CD138. Bajo las mismas condiciones, casi no se podía medir citotoxicidad contra las células DOX40 negativas a CD138 (FIG. 15A). De manera importante, los tres inmunoconjugados también eran
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celulares MM analizadas expresan CD138. Sin embargo DOX40, no expresan proteína CD138 y las células MM1S y LR5 mostraban una expresión débil de la proteína. Las restantes cinco mostraban altos niveles de expresión de CD138. Los inmunoconjugados nBT062-SMCC-DM1, nBT062-SPDB-DM4 y nBT062-SPP-DM1 mostraban una citotoxicidad significativa contra las líneas celulares de MM siendo el nBT062-SPDB-DM4 el compuesto más potente 5 de estos tres agentes. Las células OPM1 y RPMI8226 que expresan altos niveles de CD138 eran más sensibles a los inmunoconjugados que las células MM1S que expresaban bajo CD138 o las Dox40 negativas a CD138. De manera importante, estos agentes también eran citotóxicos contra las células aisladas de pacientes que padecen MM. De manera importante, no se observó citotoxicidad contra las células mononucleares de médula ósea o de médula ósea de voluntarios sanos. Estos resultados sugieren el que los inmunoconjugados tienen una actividad
10 selectiva de antígeno contra las células tumorales de MM.
Se podría demostrar que nBT062-SMCC-DM1, nBT062-SPDB-DM4 ynBT062-SPP-DM1 inhiben la proliferación celular de las células MM induciendo la detención del ciclo celular G2/M lo que da lugar a la muerte celular apoptótica. La escisión de la caspasa-3, 8, 9 y la PARP diana de la caspasa-3 corriente abajo se puede detectar en
15 células OPM1 tratadas con inmunoconjugados. Además, las células positivas al antígeno APO2.7 aumentaron tras veinticuatro horas de incubación con estos fármacos.
Se comunicó previamente que la IL-6 desencadena la proliferación de células de mieloma múltiple por medio de la activación de las cascadas de señalización PI3-K/Akt, MEK/ERK y JAK2/STAT3. El IGF-1 se ha descrito que 20 también promueve la proliferación de células de mieloma múltiple y la supervivencia utilizando las mismas rutas, La IL-6 protege contra la apoptosis inducida por la dexametasona por medio de la inducción de la señalización PI3K/Akt. Se examinó si la IL-6 e IGF-1 inhibía la citotoxicidad inducida por los inmunoconjugados. Aunque se notó un aumento de la proliferación en las células tratadas con IL-6 o IGF-1, estas citocinas no podían inhibir la apoptosis inducida por nBT062-SPDB-DM4 en células OPM1, sugiriendo que estos agentes pueden superar los efectos
25 protectores de estas citocinas. De manera importante, los inmunoconjugados inhibían el crecimiento y la adherencia de células MM1S adheridas a las BMSC, confirmando más que pueden superar la resistencia a fármacos mediada por la adhesión celular (CAM-DR). En animales de experimentación, el nBT062-SPDB-DM4 inducía un retraso significativo del crecimiento de xenoinjertos de MM establecidos sin influencia sobre los pesos corporales.
30 Todos los conjugados ensayados mostraban una alta actividad citotóxica contra las líneas celulares de MM y contra las células MM primarias derivadas de pacientes, mientras que las células mononucleares de sangre periférica de voluntarios sanos no mostraban sensibilidad hacia los conjugados.
Los inmunoconjugados específicos de CD138 desencadenaban detención del ciclo celular G2/M e inducían
35 apoptosis en las células diana, asociada con la escisión de la caspasa -8/9 y 3 y la escisión de la diana corriente abajo de la caspasa-3 la PARP. De manera importante, la interleucina-6, el factor de crecimiento tipo insulina 1 o la presencia de células del estroma de médula ósea no protegían las células de MM contra la citotoxicidad mediada por inmunoconjugados
40 El conjugado nBT062-SPDB-DM4 inhibía significativamente el crecimiento tumoral del MM (p<0,01) y prolongaba la supervivencia de los ratones.
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