DE69201786T2 - Wasserlösliche Methylenbis(dialkylanilin)-Derivate und ihre Verwendung. - Google Patents

Wasserlösliche Methylenbis(dialkylanilin)-Derivate und ihre Verwendung.

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Description

    Detaillierte Beschreibung der Erfindung:
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf wasserlösliche Methylenbis(dialkylanilin)-Derivate, wie sie durch die allgemeine, im Patentanspruch 1 angegebene Formel (I) repräsentiert werden, sowie auf deren Salze (hiernach als "die Verbindung nach der vorliegenden Erfindung" bezeichnet), und sie bezieht sich auch auf eine Zusammensetzung zum quantitativen Bestimmen von Superoxyden, welche die Verbindung nach der vorliegenden Erfindung als farbbildende Substanz enthält.
  • Alle Verbindungen nach der vorliegenden Erfindung sind neu, wurden in der Literatur nach dem Stande der Technik noch nicht geoffenbart und sind als farbbildende Substanz bei der quantitativen Bestimmung von Superoxyden in gleichzeitiger Gegenwart von Peroxydase oder einer Substanz mit derselben katalytischen Wirkung brauchbar.
  • Wegen des spezifischen Ansprechens von Enzymen auf Substrate ist ein klinisches Testverfahren, welches ein Enzym als Reagens benützt, eine sehr selektive Analysemethode. Da das Verfahren zur Durchführung einer quantitativen Bestimmung verschiedener Komponenten in einem biologischen System leicht und ohne Störung durch eine komplizierte Biomatrix imstande ist, ist sie nun ein wichtiges analytisches Mittel, das für klinisch-chemische Analysen mit dem Spektrum an automatisierten Analysegeräten unentbehrlich ist. Bei der Analyse von Komponenten in einem biologischen System unter Verwendung eines enzymatischen Analyseverfahrens gibt es ein besonders bemerkenswertes System, bei dem Wasserstoffsuperoxyd durch eine enzymatische Reaktion gebildet wird. Daher wurden verschiedene Oxydasen, welche als Ergebnis einer selektiven Wirkung auf Komponenten in einem biologischen System Wasserstoffsuperoxyd erzeugen, in weitem Ausmaße angewendet, und zur Zeit sind Oxydasen bekannt, die fast allen Komponenten in einem biologischen System entsprechen. Demgemäß ist es nun möglich, eine quantitative Bestimmung gewünschter Komponenten in einem biologischen System durch die quantitative Bestimmung des sich ergebenden Wasserstoffsuperoxydes durchzuführen, vorausgesetzt, daß eine passende Oxydase verfügbar ist.
  • Das üblichste Mittel für die quantitative Bestimmung von durch einen solchen Mechanismus erzeugtem Wasserstoffsuperoxyd, liegt darin, daß ein Wasserstoffspender mit einem Koppler (wie 4-Aminoantipyrin; hiernach als 4-AA bezeichnet) durch Oxydation unter Verwendung von Wasserstoffsuperoxyd in Gegenwart von Peroxydase (hiernach als POD bezeichnet) kondensiert wird, und die Färbung des Kondensates wird durch Absorptiometrie gemessen. Beispiele für die angegebenen Verfahren werden in Tabelle 1 angeführt. Tabelle 1 Quantitative Bestimmung von Wasserstoffsuperoxyd unter Verwendung von POD Koppler Wasserstoffspender gebildetes Chromogen (lambdamax, nm) Phenol N,N-Dimethylanilin 4-Chlorophenol 2,4,6-Tribromphenol N-Äthyl-N-Sulfopropylanilin N-Äthyl-N-(2-Hydroxy-3-Sulfopropyl)-m-Toluidin
  • Es ist eine wesentliche Anforderung bei klinisch-chemischen Tests, die Erfassungsempfindlichkeit wegen der Verwendung von Blut höher zu machen, das ein wertvolles Probenmaterial darstellt, und auch wegen der Messung der Komponenten in sehr geringer Menge. Im Hinblick darauf bestand ein Bedarf an Reagenzien, die eine höhere Empfindlichkeit aufweisen als jene der in der obigen Tabelle 1 angegebenen Wasserstoffspender. Ferner absorbieren die meisten jener bekannten farbbildenden Substanzen bei Wellenlängen von 500-600 nm, wogegen die durch eine Homolyse und durch in der Körperflüssigkeit enthaltenes Bilirubin verursachte Absorption innerhalb eines weiten Bereiches vom Ultraviolettgebiet bis rund um 530 nm liegt, wodurch die Möglichkeit besteht, bei der Messung zu einem positiven Irrtum zu kommen, und daher bestand ein Bedarf an Wasserstoffspendern, die in einem höheren Wellenlängenbereich gefärbt sind.
  • Die Literaturstelle "Analytica Chimica Acta, 153, (1983), 191-197" offenbart wasserlösliche Derivate auf Basis von Diphenylmethan, und insbesondere ein Methylenbis(Methylanilin)-Derivat, das in Kombination mit einem Koppler für die quantitative enzymatische Bestimmung von Wasserstoffsuperoxyd brauchbar ist. Diese Verbindungen ergeben jedoch stabile Farben nur in Gegenwart eines Kopplers und besitzen Absorptionsmaxima bei Wellenlängen von 561 bis 601 nm.
  • Der vorliegende Erfinder hat ausgedehnte Studien unternommen, um farbbildende Substanzen zu finden, die Farben mit Wellenlängen von 600 nm oder länger erzeugen, und insbesondere mit hoher Löslichkeit in Wasser, und fand dabei die Verbindung nach der vorliegenden Erfindung, wie sie durch die bereits angegebene allgemeine Formel (I) repräsentiert wird. Es wurde auch gefunden, daß die Verbindung nach der vorliegenden Erfindung, unähnlich den herkömmlichen Verfahren (siehe japanische Offenlegungsschriften 56/99454 und 57/64660), keine Koppler benötigt, sondern nur durch das Enzym und Wasserstoffsuperoxyd gefärbt wird. Wenn die Verbindung nach der vorliegenden Erfindung beispielsweise mit Peroxydase und Wasserstoffsuperoxyd oxydiert wird, wird eine blaue Farbe nach der folgenden allgemeinen Formel (II) quantitativ erzeugt, wobei eine zufriedenstellende Farbstabilität aufrechterhalten werden kann. So wurde die vorliegende Erfindung erreicht. Peroxidase
  • Das wesentliche Merkmal der vorliegenden Erfindung, daß nämlich Koppler nicht benötigt werden, ist ein sehr nützlicher Vorteil im Hinblick auf die Vereinfachung der Meßvorgänge durch automatische Analysegeräte, die sich nun in einem Stadium ständigen Fortschrittes befinden. Wenn die Verbindung nach der vorliegenden Erfindung in einer Pufferlösung mit einem pH-Wert von 5,5, gefolgt von der Zugabe von Peroxydase und Wasserstoffsuperoxyd, aufgelöst wird, wird überdies ein Farbstoff mit einem molaren Extinktionskoëffizienten von 4,0 x 10&sup4; bis 5,0 x 10&sup4; (1.mol&supmin;¹.cm&supmin;¹) an der Wellenlänge mit maximaler Absorption erzeugt, wogegen bei Durchführung der Messung unter gleichen Bedingungen unter Verwendung von Phenol und 4-Aminoantipyrin der molare Extinktionskoëffizient an der Wellenlänge mit maximaler Absorption nur etwa 5,0 x 10³ beträgt. Daher erfolgt das quantitative Bestimmungsverfahren von Wasserstoffsuperoxyd unter Verwendung der Verbindung nach der vorliegenden Erfindung mit sehr hoher Empfindlichkeit.
  • Die Verbindung der allgemeinen Formel (I) kann durch die Reaktion der Verbindung mit der folgenden allgemeinen Formel (III)
  • [worin R¹, R² und R³ dasselbe sind, wie bereits für (I) definiert wurde] mit Formalin synthetisiert werden. Spezifische Beispiele für die Verbindung der allgemeinen Formel (I) nach der vorliegenden Erfindung, die so hergestellt wurde, wie in Tabelle 2 angegeben ist, sowie die Schmelzpunkte und Elementenanalysen der Verbindung, wie auch die durch Behandlung mit Wasserstoffsuperoxyd bei einem pH-Wert von 5,5 erhaltenen Wellenlänge mit maximaler Absorption der oxydierten Farbstoffe sind in Tabelle 3 angeführt. Tabelle 2 Verbindung Tabelle 3 Elementenanalyse(%) Verbindung Schmelzpunkt (ºC) Molekularformel Absorptionswellenlänge λmax (nm) (theoret. Wert) (errechn. Wert) (Zersetz) (Zersetz)
  • Durch die folgenden Beispiele wird das Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach der vorliegenden Erfindung (Beispiele 1-3) und das Verfahren zur quantitativen Bestimmung unter Verwendung solcher Verbindungen (Beispiel 4) im besonderen veranschaulicht, obwohl die vorliegende Erfindung auf jene Beispiele nicht beschränkt ist, soweit man sich im Bereiche der kennzeichnenden Merkmale der vorliegenden Erfindung befindet.
    • Beispiel 1. Herstellung der Verbindung (F).
  • Das Natriumsalz von N-Äthyl-N-Sulfopropyl-3,5-Dimethylanilin (2,0 g) wurde in 12 ml Wasser aufgelöst, es wurden 0,31 ml 37%-igen Formalins und 0,03 ml 90%-iger Ameisensäure hinzugefügt, und die Reaktion wurde durch Zugabe einer katalytischen Menge an N-Methylanilin durchgeführt, wobei das Gemisch auf 35ºC gehalten wurde. Nach Durchführung der Reaktion während 4 Stunden wurde die Reaktionslösung über 500 ml Azeton gegossen, so daß die Kristalle isoliert wurden. Die resultierenden Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt und aus Methanol umkristallisiert, um 1,52 g von weißem Methylenbis(N-Äthyl-N- Sulfopropyl-3,5-Dimethylanilin-Natriumsalz) zu ergeben. Die Ausbeute betrug 74,5%.
  • TLC (Silikagel, mit 0,2N wäßrigem Ammoniak gesättigtes n-Butanol): Rf = 0,28
  • ¹H-NMR (D&sub2;O) δppM (TMC): 1,11 (t, J = 7,1 Hz, 6H), 1,62-1,91 (m, 4H), 2,16 (s, 12H), 2,65 (t, 7,27, 4H), 3,48-3,74 (m, 8H), 4,22 (s, 2H), 7,17 (s, 4H)
  • IR (cm&supmin;¹): 3480, 1610, 1266, 1175
    • Beispiel 2. Herstellung der Verbindung (L).
  • Das Natriumsalz von N-Äthyl-N-(2-Hydroxy-3-Sulfopropyl)-3,5-Dimethylanilin (2,0 g) wurde in 10 ml Wasser aufgelöst, es wurden 0,30 ml 37%-igen Formalins und 0,03 ml 90%-iger Ameisensäure hinzugefügt, und es wurde bei auf 35-40ºC gehaltener Mischung eine katalytische Menge an N-Methylanilin hinzugegeben, um die Reaktion durchzuführen. Nach Durchführung der Reaktion während 4 Stunden wurde die Reaktionslösung über 500 ml Azeton gegossen, um die Kristalle zu isolieren. Die resultierenden Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt und aus Methanol umkristallisiert, um 1,52 g von weißem Methylenbis[N- Äthyl-N-(2-Hydroxy-3-Sulfopropyl)-3,5-Dimethylanilin-Natriumsalz] zu ergeben. Die Ausbeute betrug 77,0%.
  • TLC (Silikagel, mit 0,2N wäßrigem Ammoniak gesättigtes n-Butanol): Rf = 0,25
  • ¹H-NMR (D&sub2;O) δppM (TMS): 1,01 (t, J = 6,6 Hz, 6H), 2,01 (s, 12H), 2,09-2,20 (m, 2H), 2,50 (d, J = 2,1 Hz, 4H), 3,13-3,42 (m, 8H), 3,74 (s, 2H), 6,32 (s, 4H).
  • IR (cm&supmin;¹): 3500, 1603, 1220, 1160
    • Beispiel 3. Herstellung der Verbindung (O).
  • Das Natriumsalz von N-Butyl-N-Sulfopropyl-3,5-Diäthylanilin (2,14 g) wurde in 20 ml Wasser aufgelöst, es wurden 0,31 ml 37%-igen Formalins und 0,01 ml 90%-iger Ameisensäure hinzugefügt, und es wurde bei auf 35-40ºC gehaltener Mischung eine katalytische Menge an N-Methylanilin hinzugegeben, um die Reaktion durchzuführen. Nach Durchführung der Reaktion während 4 Stunden wurde die Reaktionslösung über 500 ml Azeton gegossen, um die Kristalle zu isolieren. Die resultierenden Kristalle wurden durch Filtrieren gesammelt und aus Methanol umkristallisiert, um 1,46 g von weißem Methylenbis(N-Butyl-N-Sulfopropyl-3,5-Diäthylanilin-Natriumsalz) zu ergeben. Die Ausbeute betrug 67,1%.
  • TLC (Silikagel, mit 0,2N wäßrigem Ammoniak gesättigtes n-Butanol): Rf = 0,34
  • ¹H-NMR (D&sub2;O) δppM (TMS): 0,97 (t, J = 7,7 Hz, 6H), 1,20 (t, J = 7,4 Hz, 12H), 1,39-1,68 (m, 8H), 1,55-1,76 (m, 4H), 2,66 (t, 7,6, 4H), 3,17-3,44 (m, 8H), 3,96 (s, 2H), 6,49 (s, 4H)
  • IR (cm&supmin;¹): 3380, 1600, 1239, 1212, 119, 1050
    • Beispiel 4. Erstellung einer Arbeitskurve unter Benützung einer Standardlösung von Wasserstoffsuperoxyd.
  • Peroxydase (500 Einheiten) wurde in 100 ml von 50 mM MES [2-(N-Morpholino)Äthansulfonsäure-Monohydrat] als Puffer (pH-Wert 5,5) aufgelöst. Es wurden vier Lösungen hergestellt, und jeweils wurden 5,43 mg Methylenbis(N-Sulfopropyl-3,5-Dimethylanilin-Dinatriumsalz) (Verbindung B), 5,98 mg Methylenbis(N-Äthyl-N-Sulfopropyl-3,5-Dimethylanilin-Dinatriumsalz) (Verbindung F), 6,83 mg Methylenbis(N-Propyl-N-Sulfopropyl-3,5- Diäthylanilin-Dinatriumsalz) (Verbindung I) und 6,31 mg Methylenbis[N-Äthyl-N-(2-Hydroxy-3-Sulfopropyl)-3,5-Dimethylanilin- Dinatriumsalz] (Verbindung L) in der Lösung aufgelöst, um vier Färbereagenzien herzustellen.
  • Jedem Färbereagens wurden jeweils Teströhrchen a-f zugeordnet, und jedes Teströhrchen wurde mit dem Färbereagens und einer Standardlösung von Wasserstoffsuperoxyd, wie folgt, gefüllt. Standardlösung von H&sub2;O&sub2; Färbereagens
  • Jedes Teströhrchen wurde 10 Minuten lang in thermostatische 37ºC getaucht, und es wurde unter Benützung eines Blindreagens als Kontrolle für jedes die Auslöschung an der Wellenlänge mit maximaler Absorption gemessen. Die aus dem gemessenen Resultat erstellte Arbeitskurve ist in Fig. 1 wiedergegeben. Aus Fig. 1 ist klar, daß die Arbeitskurven für alle Färbereagenzien innerhalb eines Konzentrationsbereiches von 1- 100 uM eine Linearität zeigen. Aus dem obigen Ergebnis wird deutlich, daß alle Verbindungen nach der vorliegenden Erfindung als Reagenzien für die quantitative Bestimmung von Superoxyden wirksam sind. Spezifische Beispiele für die quantitative Bestimmung werden unten für die Verbindung F angegeben, die bei den obigen Messungen die höchste Empfindlichkeit zeigte. Es versteht sich jedoch, daß es sich um eine bloße Exemplifizierung handelt, und daß die vorliegende Erfindung darauf nicht beschränkt ist.
    • Beispiel 5. Quantitative Bestimmung von Glukose im Serum unter Verwendung der Verbindung F
  • Glukoseoxydase (500 Einheiten), 500 Einheiten Peroxydase und 5,98 mg Methylenbis(N-Äthyl-N-Sulfopropyl-3,5-Dimethylanilin-Dinatriumsalz) (Verbindung F) wurden in 100 ml von 50 mM MES als Puffer (pH-Wert 5,5) aufgelöst, um ein Färbereagens herzustellen.
    • i) Erstellung der Arbeitskurve unter Benützung einer Standardlösung von Glukose.
  • Glukose (200 mg) wurde in 100 ml Wasser aufgelöst, um eine Standardlösung von Glukose herzustellen. Diese wurde im gewünschten Ausmaße verdünnt und für die Versuche verwendet.
  • Das Reagens wurde in die Teströhrchen a-d wie folgt eingefüllt: Standardlösung von Glukose Färbereagens auf verdünnt nicht verdünnt
  • Jedes der Teströhrchen wurde 10 Minuten lang in thermostatische 37ºC getaucht, und es wurde unter Benützung des Blindreagens als Kontrolle die Auslöschung bei 648 nm gemessen. Die aus den gemessenen Werten erstellte Arbeitskurve ist in Fig. 2 wiedergegeben. Das Ergebnis zeigt, daß innerhalb eines Konzentrationsbereiches von Glukose von 0-200 mg/dl eine gute Linearität verfügbar ist.
    • ii) Quantitative Bestimmung von Glukose im Serum
  • Entproteinisiertes Serum (20 ml) wurde in ein Teströhrchen eingefüllt, es wurde 1,0 ml des obigen Färbereagens hinzugefügt, die Mischung wurde 10 Minuten lang in thermostatische 37ºC getaucht, die Auslöschung bei 648 nm wurde unter Benützung des Blindreagens als Kontrolle gemessen, und es wurde die Glukosekonzentration im Serum durch Vergleich mit der Arbeitskurve bestimmt.
    • Probe I (männlich; Alter: 32)
  • Auslöschung: 0,293
  • Glukosekonzentration: 91,69 mg/dl
    • Probe II (männlich; Alter: 28)
  • Auslöschung: 0,333
  • Glukosekonzentration: 105,24 mg/dl
    • Probe III (männlich; Alter: 36)
  • Auslöschung: 0,361
  • Glukosekonzentration: 112,98 mg/dl
    • Kurze Erläuterung der Zeichnungen:
  • Fig. 1 zeigt die Arbeitskurven für die Reagenzien B, F, I und L gegenüber der Konzentration an Wasserstoffsuperoxyd, wobei die Ordinate die Auslöschung bei der Wellenlänge mit maximaler Absorption zeigt, wogegen die Abszisse die Konzentration an Wasserstoffsuperoxyd angibt, und , o, sowie jeweils den Verbindungen B, F, I und L entsprechen.
  • Die Fig. 2 zeigt die Arbeitskurve für Glukose, wenn das Reagens F benützt wird, wobei die Ordinate die Auslöschung bei 648 nm veranschaulicht, wogegen die Abszisse die Glukosekonzentration zeigt.

Claims (1)

  1. (1) Wasserlösliches Methylenbis(dialkylanilin)-Derivat, das durch die allgemeine Formel
    repräsentiert wird, (worin R&sub1; Wasserstoff oder ein aus der aus einem Alkyl mit C&sub1;-C&sub4; und einem Sulfoalkyl oder einem Hydroxysulfoalkyl mit C&sub2;&submin;&sub3; bestehenden Gruppe ausgewählter Substituent ist; R&sub2; ein Sulfoalkyl oder ein Hydroxysulfoalkyl mit C&sub2;&submin;&sub3; ist; und R&sub3; ein Alkyl mit C&sub1;-C&sub3; ist) oder ein Salz davon.
    (2) Zusammensetzung zum quantitativen Bestimmen von Superoxyden, welche ein wasserlösliches Methylenbis(dialkylanilin)- Derivat als farbbildende Substanz enthält, das durch die allgemeine Formel
    repräsentiert wird, (worin R&sub1; Wasserstoff oder ein aus der aus einem Alkyl mit C&sub1;-C&sub4; und einem Sulfoalkyl oder einem Hydroxysulfoalkyl mit C&sub2;&submin;&sub3; bestehenden Gruppe ausgewählter Substituent ist; R&sub2; ein Sulfoalkyl oder ein Hydroxysulfoalkyl mit C&sub2;&submin;&sub3; ist; und R&sub3; ein Alkyl mit C&sub1;-C&sub3; ist) oder ein Salz davon.
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