CH651318A5

CH651318A5 - Verfahren und reagenz zur bestimmung der peroxidase.

Info

Publication number: CH651318A5
Application number: CH1340/80A
Authority: CH
Inventors: Karl-Dietrich Prof Gundermann; Karl Dr Wulff; Fritz Dr Med Staehler; Hans-Ralf Dr Linke
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1979-02-21
Filing date: 1980-02-19
Publication date: 1985-09-13
Also published as: DE2906732B1; GB2044927B; FR2449882B1; FR2449882A1; CA1134744A; JPS55118398A; DE2906732C2; US4302537A; GB2044927A; IT1129721B; IT8019493A0; JPS5728274B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Peroxidase (POD) und ein hierfür geeignetes Reagenz.

Peroxidase (POD; Donor: H202-0xidoreduktase, EC 1.11.1.7) bezeichnet eine Gruppe von Enzymen, welche die Dehydrogenierung einer grossen Anzahl organischer Verbindungen katalysieren. Bedeutung hat die POD-Bestimmung vor allem in Verbindung mit vorgeschalteten Reaktionen, bei denen H202 gebildet wird, beispielsweise für die Blutzuckerbestimmung, sowie bei enzymimmunologischen Bestimmungsverfahren, die POD als Markierungsenzym verwenden, erlangt. Andere Analysenmethoden, bei denen die POD-Bestimmung von Bedeutung ist, sind beispielsweise die Galactose-, Wasserstoffperoxid*, Katalase- oder Oxidasen-Bestimmung.

Es ist bekannt, POD durch Abnahme des H202 oder des Wasserstoffdonators sowie durch Entstehen der dehydrierten Verbindung zu messen. Besondere Bedeutung hat dabei die letztere Methode gefunden, wobei als der Dehydrierung unterworfene Substrate beispielsweise Di-o-anisidin, Guajakol oder ABTS (2,2'-Azinodi[3-äthyl-benzthiazolin-(6)-sulfonsäure] verwendet werden.

Diese bekannten Methoden haben sich zwar bewährt, es besteht jedoch ein Bedarf an Methoden höherer Empfindlichkeit, welche insbesondere geeignet sind, die POD-Bestimmung im Rahmen von Enzymimmun-Tests erheblich zu verkürzen. Wie bereits erwähnt, spielt POD als Markierungsenzym bei den sogenannten «Enzym-Immuno-Assays» (ELISA-Tests) eine grosse Rolle. Zahlreiche, auf diesem System beruhende Testreagenzien sind handelsüblich. Bei diesen Reagenzien bzw. Verfahren dauert die eigentliche POD-Bestimmung z.B. mit ABTS als Substrat etwa 60 Minuten. Eine wesentliche Verringerung dieses Zeitbedarfs wird daher angestrebt.

Aus der DE-OS 2811228 ist bereits ein Verfahren zur Bestimmung von POD in Gegenwart einer phenolischen Verbindung bekannt, die bei ihrer enzymkatalysierten Oxidation mit H202 und H202 enthaltenden Verbindungen Licht emittiert, und Messung des emittierten Lichts. Als phenolische Verbindung wurde dabei Pyrogallol verwendet. Mit diesem Verfahren war bereits eine Erhöhung der Empfindlichkeit zu erzielen, jedoch Iiess die Quantenausbeute immer noch zu wünschen übrig. Gleiches gilt auch gegenüber dem für denselben Zweck schon vorgeschlagenen Luminol.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Aktivitätsbestimmung von Peroxidasen mit Hilfe einer Chemilumineszenz-Reaktion zu schaffen, welches eine bessere Quantenausbeute liefert als die bisher bekannten Verfahren dieser Art und es ermöglicht, die Empfindlichkeit der POD-Bestimmung und die Zeitdauer der POD-Bestimmung im Rahmen des Enzym-Immuno-Assays wesentlich herabzusetzen.

Gelöst wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zur Bestimmung von Peroxidase in Gegenwart einer Verbindung, die bei ihrer enzymkatalysierten Oxidation mit einer Peroxyverbindung Licht emittiert, und Messung des emittierten Lichts, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man als Licht emittierende Verbindungen 7-Dimethylaminonaphthalin-l ,2-dicarbonsäure-hydrazid verwendet.

Die Erfindung beruht auf der überraschenden Feststellung, dass 7-Dimethylaminonaphthalin-l ,2-dicarbonsäurehydrazid bei seiner mit POD katalysierten Oxidation durch Perverbindungen eine um ein Vielfaches höhere Quantenausbeute liefert, verglichen mit den bisher hierfür verwendeten lumineszierenden Substraten.

Dieses Verfahren kann zur immunologischen Haptenbestimmung angewandt werden. Diese Anwendung ist dadurch gekennzeichnet, dass man eine bekannte Menge eines mit POD markierten Haptens der zu untersuchenden, eine unbekannte Menge des Haptens enthaltenden Probe zusetzt, die Probe dann mit einem an einen festen Träger gebundenen spezifischen Antikörper des Haptens kontaktiert, die feste von der flüssigen Phase trennt und in einer der beiden Phasen die POD-Aktivität misst (ELISA-Tests).

Zur Erläuterung der Erfindung soll im folgenden ein derartiger ELISA-Test am Beispiel eines handelsüblichen Tests zur Bestimmung von Digoxinkonzentrationen im Blutserum erläutert werden. Die innere Oberfläche eines Reagenzgläschens ist mit spezifischen Antikörpern gegen Digoxin beladen, wobei die Antikörper kovalent oder adsorptiv so fest an die Röhrchenwand gebunden sind, dass sie sich nicht auswaschen lassen. Gibt man in ein solches Reaktionsgefäss eine Digoxinlösung, so wird Digoxin von den trägergebundenen Antikörpern gebunden. Handelt es sich um ein mit POD markiertes Digoxin, so kann man nach Herauswaschen des in der Lösung verbliebenen Überschusses an POD-markierten Digoxinmolekülen die Menge der an die Gefässwand über den Antikörper gebundenen POD-markierten Digoxinmoleküle oder die in der Lösung verbliebene Menge duch Messung ihrer POD-Aktivität quantitativ bestimmen.

Will man nun in einer Probe eine unbekannte Konzentration an Digoxin bestimmen, so gibt man ein Aliquot dieser Probe zusammen mit einer bekannten Menge an POD-markiertem

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Digoxin in das Reaktionsgefäss. Die markierten und die unmarkierten Digoxinmolekiile konkurrieren um die Bindungsstellen, wobei sich ein Gleichgewicht einstellt. Je mehr unmarkiertes Digoxin mit der Probe in das Reaktionsgefäss eingebracht wird, desto weniger markiertes Digoxin wird an die Wand gebunden. Mit Hilfe einer Eichkurve lässt sich daher die Menge an Digoxin in der Probelösung durch Bestimmung der POD feststellen.

Beispiele für andere Haptene, die sich nach dieser Methode bestimmen lassen, sind Thyroxin (T4) oder Insulin.

Bei den handelsüblichen ELISA-Tests wird vielfach die Aktivität der POD photometrisch unter Verwendung von ABTS als chromogenes Substrat bestimmt. Die untere Empfindlichkeitsgrenze dieses Verfahrens liegt bei 1 ng/ml Testvolumen. Dieses Verfahren ist daher zwar empfindlicher als die bisher bekannten Methoden unter Anwendung einer Chemilumineszenzreaktion. Jedoch erfordert die photometrische ABTS-Methode eine Inkubationszeit von 60 Minuten zur Farbentwicklung.

Mit dem erfindungsgemässen Verfahren ist es möglich, die Messzeit für die reine Enzymaktivitätsbestimmung bei derartigen ELISA-Tests von 60 Minuten auf 2 bis 3 Minuten herabzusetzen bei gleicher oder noch besserer Empfindlichkeit. Die Messung erfolgt vorzugsweise derart, dass die in einem bestimmten Zeitintervall emittierte Lichtmenge gemessen wird.

Das erfindungsgemässe Verfahren wird zweckmässig bei pH-Werten zwischen 6 und 9, vorzugsweise zwischen pH 7,5 und 8,5, durchgeführt. Als Puffer wird Kaliumphosphatpuffer oder Gly-cin-NaOH-Puffer bevorzugt, obwohl auch andere Puffersubstanzen, wie z. B. Tris-HCl, Tris-Sulfat und Tris-Acetat, gut geeignet sind. Die bevorzugte Pufferkonzentration beträgt dabei 10 bis 1000 mMol/1. Das erfindungsgemäss verwendete chromogene Substrat wird zweckmässig in Mengen zwischen 0,1 |xM und lOOuM verwendet. Die erfindungsgemässe Bestimmung kann bei den für enzymatische Bestimmungen üblichen Temperaturen, die zwischen etwa 20 und 37°C liegen, durchgeführt werden. Besonders bevorzugt wird dabei der Temperaturbereich zwischen 22 und 30°C.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenz zur Bestimmung der POD, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es 7-Dimethylaminonaphthalin-l,2-dicarbonsäurehydrazid, einen H202-Lieferanten und Puffersubstanz, pH 6 bis 9, enthält.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält dieses Reagenz 0,1 bis 100 |xMol/l 7-Dimethylaminonaphthalin-l,2-dicarbonsäurehydrazid, 50 bis 500 mMol/1 Kaliumphosphat- oder Glycin-Puffer, 10 bis 200 (iMol/l H202 und gegebenenfalls 0,01 bis 1 mMol/1 eines Sequestrierungsmittels.

Als gegebenenfalls zu verwendendes Sequestierungsmittel kommen in der Regel die hierfür bekannten Substanzen, wie Äthylendiaminotetraessigsäure (EDTA) und ähnliche, dem Fachmann bekannte Verbindungen in Betracht. Ausserdem kann das Reagenz übliche Stabilisierungsmittel, wie Serumalbumin, Kohlehydrate und dergleichen, enthalten. Als H202-Lieferant kommen im Rahmen der Erfindung beispielsweise H202 selbst sowie die bekannten, H202 freisetzenden Substanzen, wie Harnstoffperhydrat («festes H202») und ähnliche, sowie organische Hydroperoxide, bei denen eines der Wasserstoffatome durch einen organischen Rest ersetzt ist, in Frage. Auch die festen Salze des H202, wie Natriumperoxid, die sich bei Auflösen in Wasser wie eine Mischung aus H202 und der entsprechenden Hydroxylverbindung verhalten, können verwendet werden. Beispielsweise kann eine Kombination aus Glycin und Natriumperoxid verwendet werden, die beim Auflösen in Wasser den Glycin-NaOH-Puffer sowie H202 bildet.

Ausser den oben genannten Bestandteilen enthält das erfindungsgemässe Reagenz vorzugsweise auch mit POD markiertes Hapten sowie einen trägergebundenen spezifischen Antikörper gegen das jeweilige Hapten, wenn das Reagenz im Rahmen des Enzym-Immun-Tests verwendet werden soll. Daneben können die anderen, in derartigen ELISA-Reagenzien üblichen Bestandteile, wie weitere Puffer, Stabilisierungsmittel und dergleichen, enthalten sein.

Die Fig. 1 bis 3 zeigen die Eichkurven eines enzym-immunolo-gischen Tests zur quantitativen Bestimmung eines Haptens 5 (Digoxin, Tyroxin, Insulin) nach dem oben beschriebenen ELISA-Prinzip.

Die Eichkurven zeigen die emittierte Lichtmenge vs. Hapten-menge. Als Licht emittierende Verbindung wird 7-Dimethyl-amino-naphthalin-l,2-dicarbonsäure-hydrazid eingesetzt. Im io Vergleich dazu sind die Eichkurven des entsprechenden herkömmlichen photometrischen Verfahrens unter Verwendung von ABTS als chromogenes Substrat in den Fig. 1 bis 3 eingetragen.

Fig. 1 zeigt die beschriebenen Eichkurven zum in-vitro Test 15 von Digoxin. Die Eichkurven wurden unter Verwendung bekannter Digoxinmengen erhalten.

Fig. 2 zeigt die Eichkurven zur Bestimmung von Thyroxin. Die Eichkurven wurden unter Verwendung von Standardserum mit unterschiedlicher Verdünnung erhalten.

20 Fig. 3 zeigt die Eichkurven zur Bestimmung von Insulin.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel

25 Ein handelsüblicher enzy m-immunologischer in-vitro-Test zur quantitativen Bestimmung von Digoxin nach dem ELIS A-Prin-zip (Enz-Immun-Test Digoxin, Boehringer Mannheim) wurde wie folgt durchgeführt:

In ein Kunststoffreagenzröhrchen, welches auf der Innenseite 30 mit ca. 60 pg Digoxin-Antikörpern beschichtet ist, wurden 1,0ml einer Lösung von POD-markiertem Digoxin (ca. 12 U/1 POD) in Phosphatpuffer40mMol/1, pH6,8, die0,25% Rinderserumalbumin enthält, sowie 0,1 ml Serum als Probe gegeben, gemischt und 1 Stunde bei Raumtemperatur (20 bis 25° C) stehengelassen. 35 Nach Beendigung dieser Inkubationszeit wird der Röhrcheninhalt ausgesogen und verworfen und das Röhrchen einmal mit gekühltem Leitungswasser ausgespült. Dann wurde in das Röhrchen 1 ml einer Lösung von 100 (iMol/1 7-Dimethylaminonaphthalin-l ,2-dicarbonsäurehydrazid in 100 mMol/1 Kaliumphos-40 phatpuffer, pH 8,2, welche 0,1 mMol/1 EDTA enthält, gegeben. Dann wurde die Reaktion durch Zusatz von 120 |iMol/l H202 (Endkonz.) gestartet. In einem Photometer (ATP-Photometer der Firma S AI, San Diego, Kalifornien) wurde zwischen der 2. und 5. Minute nach dem Start das emittierte Licht gemessen. Das 45 auf dem Schreibgerät aufgezeichnete Signal wurde integriert. Aus einer Eichkurve, die in analoger Weise unter Verwendung von bekannten Digoxinmengen gewonnen wurde, wurde die dem gemessenen Lichtsignal entsprechende Digoxinmenge bestimmt.

In der beigefügten Zeichnung zeigt Fig. 1 die erhaltene Eich-50 kurve, dargestellt als Digoxinmenge gegen emittierte Lichtmenge, im Vergleich zum herkömmlichen photometrischen Verfahren unter Verwendung der Farbreaktion mit ABTS, wobei die Kurve das Verhältnis von Digoxinmenge zu Extinktion bei Wellenlänge Hg 405 nm wiedergibt.

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Beispiel 2

Analog Beispiel 1 wurde die enzymimmunologische Bestimmung von Thyroxin (T4) nach dem ELISA-Prinzip unter Verwendung eines handelsüblichen Tests (Boehringer Mannheim 60 GmbH) durchgeführt. Zur Inkubation wurden in diesem Fall 1 ml einer Lösung verwendet, welche POD-markiertes T4 (ca. 12 U/1 POD) in Phosphatpuffer 17,8 mMol/1, pH 8,6, der 120 mMol/1 Barbiturat und 0,20 % Rinderserumalbumin und 0,04 % 8-Anilino-l-naphthalinsulfinsäure enthält, verwendet. 65 Die Serummenge beträgt 0,02 ml.

Nach 2-stündiger Inkubation bei Zimmertemperatur (20 bis 25° C) wird wie in Beispiel 1 beschrieben der Röhrcheninhalt ausgesaugt und das Röhrchen mit Leitungswasser ausgewaschen.

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Dann wurde die gleiche Lösung wie in Beispiel 1 beschrieben dem mit Antikörper gegen Insulin beschichteten Kunststoffrea-zugegeben und in gleicher Weise ausgewertet. Fig. 2 der beige- genzgläschen (Insulin-Bindungskapazität 6 bis 10 uU/ Gläs-fügten Zeichnung zeigt in graphischer Darstellung die in der chen) durchgeführt. 0,2 ml Serum als Probe wurden mit 1,0 ml beschriebenen Weise unter Verwendung von Standardserum mit einer Lösung von POD-markiertem Insulin (ca. 15 U/1 POD) in unterschiedlicher Verdünnung erhaltene Eichkurve im Vergleich 5 Phosphatpuffer, 40 mMol/1, pH 6,8, welche 0,25 % Rinder-zu einer nach dem bekannten Verfahren unter Verwendung von serumalbumin enthält, nach Vorschrift inkubiert, anschliessend ABTS als chromogenem Substrat erhaltenen Kurve. die flüssige Phase verworfen, das Röhrchen mit kaltem Wasser gespült und wie in Beispiel 1 beschrieben unter Verwendung der Beispiel 3 gleichen Reagenzlösung die Bestimmung des an die Gläschen-

Analog zu dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurde 10 wand gebundenen POD durchgeführt. Fig. 3 der beigefügten unter Verwendung eines handelsüblichen enzymimmunologi- Zeichnung zeigt die auf diese Weise erhaltene Eichkurve im sehen Tests nach dem ELISA-Prinzip (Insulin-ELIS A der Firma Vergleich mit einer Eichkurve unter Verwendung von ABTS als Boehringer Mannheim GmbH) die immunologische Reaktion in chromogenes Substrat.

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3 Blatt Zeichnungen

Claims

651 318 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Bestimmung von Peroxidase in Gegenwart einer Verbindung, die bei ihrer enzymkatalysierten Oxidation mit einer Peroxyverbindung Licht emittiert, und Messung des emittierten Lichts, dadurch gekennzeichnet, dass man als Licht emittierende Verbindung 7-Dimethylamino-naphthalin-l ,2-dicarbonsäure-hydrazid verwendet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die in einem bestimmten Zeitintervall emittierte Lichtmenge misst.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man einen pH-Wert zwischen 6,0 und 9,0 einstellt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man den pH-Wert mit einer Puffersubstanz der Konzentration 10 bis 1000 mMol/1 einstellt.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass man Kaliumphosphat- oder Glycin-Puffer verwendet.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man 10 bis 200 [iMoI/1 H202 zusetzt.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man 0,1 bis 100 fiMol/1 7-Dime-thylaminonaphthalin-1,2-dicarbonsäurehydrazid zusetzt.

8. Anwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur immunologischen Haptenbestimmung, dadurch gekennzeichnet, dass man eine bekannte Menge eines mit der Peroxidase markierten Haptens der zu untersuchenden, eine unbekannte Menge des Haptens enthaltenden Probe zusetzt, die Probe dann mit einem an einen festen Träger gebundenen spezifischen Antikörper des Haptens kontaktiert, die feste von der flüssigen Phase trennt und in einer der beiden Phasen die Peroxidaseaktivität misst.

9. Reagenz zur Bestimmung von Peroxidase nach einem der Verfahren der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es 7-Dimethylaminonaphthalin-l,2-dicarbonsäurehydrazid, ein H202 lieferndes System und Puffersubstanz, pH 6 bis 9, enthält.

10. Reagenz nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es 0,1 bis 100 [xMoI/1 7-Dimethylaminonaphtahlin-l,2-dicarbon-säurehydrazid, 50 bis 500 mMol/1 Kaliumphosphat- oder Glycin-Puffer, 10 bis 200 [xMol/1 H202 und gegebenenfalls 0,01 bis 1 mMol/1 eines Sequestrierungsmittels enthält.

11. Reagenz nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich mit Peroxidase markiertes Hapten und trägergebundenen spezifischen Antikörper gegen das Hapten enthält.