DE2833612B2 - Mittel und Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxyd - Google Patents

Mittel und Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxyd

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Description

dadurch gekennzeichnet, daß das Chromogen ein N-substituiertes 3-Alkylanilin der allgemeinen Formel I ist:
(D
worin R< und R2 unabhängig voneinander eine Niedrigalkylgruppe oder eine Hydroxyniedrigalkyl gruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen bedeuten und to R3 für eine Niedrigalkylgruppe steht.
2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in der allgemeinen Formel (I) R' für eine Niedrigalkylgruppe mit 1 bis 5 C-Atomen steht, R2 eine Hydroxyalkylgruppe mit 1 bis 5 C-Atomen r> bedeutet und R3 für Methyl, Äthyl oder Propyl steht.
3. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in der allgemeinen Formel (I) R' und R2 gleiche oder verschiedene Alkylgruppen mit 1 bis 5 C-Atomen bedeuten und R3 für Methyl, Äthyl oder -411 Propyl steht.
4. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in der allgemeinen Formel (I) R' und R2 gleiche oder verschiedene Hydroxyalkylgruppen mit
1 bis 5 C-Atomen bedeuten und R3 für Methyl, Äthyl -r. oder Propyl steht.
5. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das N-substituierte 3-Alkylanilin N-Äthyl-N- hydroxyäthyl-3-methylanilin ist.
6. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich- "> <> net, daß das N-substituierte 3-Alkylanilin N1N-Dimethyl-3-methylanilin ist.
7. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das N-substituierte 3-Alkylanilin N,N-bis(|S Hydroxyäthyl)-3-äthylanilin ist. ">">
8. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Wasserstoffperoxid aktivierende Mittel Peroxidase ist.
9. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Wasserstoffperoxid aktivierende Mittel w> aus einer Mischung aus Iod und einer Verbindung ausgewählt unter Wolframsäure und deren Salzen oder Molybdänsäure und deren Salzen besteht.
10. Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxyd, bei dem man 4-Aminoantipyrin in Kombi- ιτϊ nation mit einem Chromogen in Gegenwart eines Wasserstoffperoxyd aktivierenden Mittels zur Bildung eines färbenden materials umsetzi, uauure.ii gekennzeichnet, daß das Chromogen ein N-substituiertes 3-Alkylanilin der allgemeinen Formel (I) ist:
worin R1 und R2 unabhängig voneinander eine Niedrigalkylgruppe oder eine Hydroxyalkylgruppe mit 1 bis 5 C-Atomen bedeuten und R3 für eine Niedrigalkylgruppe steht.
21) Die Erfindung bezieht sich auf ein Mittel gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 und ein Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 10.
In letzter Zeit wurden bei klinischen Untersuchungen aufgrund der höchst geschätzten Spezifizität enzymatische Analysen in immer größerem Ausmaß angewandt.
Bei Verfahren zur Bestimmung von Glucose, Harnsäure, Cholesterin, Cholesterinase, Pliospholipid, Kreatin oder Kreatinin in Körperfluiden, verwendet man erfolgreich Verfahren zur Bestimmung der gewünschten Substanz, indem man das Wasserstoffperoxyd bestimmt, das beispielsweise erhalten wird, indem man deren Oxydationsenzym oder ein Oxydationsenzym auf das im Verlaufe der Enzymreaktion erhaltene Produkt einwirken läßt
Diese Vei fahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxyd können grob in die folgenden Verfahren eingeteilt werden:
(Ia) ein Verfahren, bei dem man ein Chromogen durch enzymatische Einwirkung von Peroxidase in ein durch Oxydation farbentwickeltes Material überführt und die optische Absorption des farbentwikkelten Materials mißt,
(Ib) ein Verfahren, bei dem man ein oder zwei Chromogene durch enzymatische Einwirkung von Peroxidase oxydativ kondensiert, wobei man ein farbentwickeltes Material erhält, und die optische Absorption des farbentwickelten Materials mißt,
(II) ein Verfahren, bei dem man entweder Catalase in Gegenwart eines Alkohols umsetzt und den erhaltenen Aldehyd in ein Farbentwicklungssystem einführt, oder Aldehyddehydrogenase in Gegenwart von NAD umsetzt und die Menge an erhaltenem NADH mißt.
Beim Verfahren la wurden als Chromogene ortho- und mela-Toluidin, 2,7-Diaminofluoren, N,N-Dimethyl- p-phenylendiamin, o-Dianisidin, o-Aminophenol und dergleichen verwendet.
Beim Verfahren Ib wurden als Chromogene eine Kombination von 4-Aminoantipyrin mit Phenyl oder Ν,Ν-Dimethylanilin oder Ν,Ν-Diäthylanilin, eine Kombination von 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon mit o-Toluidin oder Ν,Ν-Dimethylanilin oder Ν,Ν-Diäthylanilin, oder 4-Methoxy-1-naphthol oder dessen Derivaten, wciChc cifi DirncTcS bilucH konnCn, VCrWCn-
det Diese Chromogene werden allein oder in Kombination zur Herstellung von Farbbildungsreagentien zur Bestimmung von Wasserstoffperoxyd verwendet
Andererseits variiert der optimale Aktivienings-pH des Oxydationssystems, welches die gewünschte Substanz oxydativ zersetzt, über einen weiten Bereich, im allgemeine von etwa pH 5 bis 9. Wenn der optimale Aktivierungs-pH-Wert mit dem optimalen pH-Wert für die Farbbildungsreaktion nicht identisch oder diesem nicht sehr nahe ist, sind jedoch die Genauigkeit der Messung, die einfache und rasche Durchführung und die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens nicht mehr gewährleistet
Beispielsweise ist der optimale Aküvierungs pH-Wert von Uricase, welche von Hefe abgeleitet und ein Oxydationserrzym für Harnsäure ist, ein pH-Wert von 7,5 bis 8,5, aber es gibt kein geeignetes Farbbildungsreagenz, welches bei diesem pH-Wert die nötige Empfindlichkeit hat und die Farbstabilität aufrechterhalten kann. Deshalb wird die Messung der Harnsäure so vorgenommen, daß man entweder die Uricase-Reaktion und die Oxydationsreaktion oder die oxydative Kondensationsreaktion getrennt bei verschiedenen pH-Werten durchführt oder indem man eine große Menge Uricase zur Messung bei einem niedrigen pH-Wert oder eine große Menge der Probe und eines farbbildenden Reagenzes mit geringer Empfindlichkeit und optimaler Farbentwicklung bei pH 7 bis 8 verwendet und mißt. Diese Verfahren sind jedoch nicht so genau und wirtschaftlich.
In der DE-OS 25 18 586 ist ein Mittel nach dem Oberbegriff des Anspruches 1 beschrieben. Soweit in dem bekannten Mittel 4-Aminoantipyrin enthalten ist, liegt es in Kombination mit 1,7-Dihydroxynaphthalin vor. Als Chromogene werden zahlreiche Verbindungen vorgeschlagen, unter anderem auch das ortho- und para-Toluidin. Nicht genannt wird cias meta-Toluidin oder dessen Derivate.
In der US-PS 34 11 887 ist ein diagnostisches Mittel offenbart, das ein enzymatisches Bestimmungssystem, ein Chromogen, beispielsweise meta-Toluidin, einen Peroxidasekatalysator und ein Maskierungssystem umfaßt. Die erfindungsgemäße Kombination ist in der Druckschrift nicht beschrieben.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Mittel der eingangs genannten Art so auszugestalten, daß man über einen weiten pH-Bereich eine ausgezeichnete Empfindlichkeit und Farbstabilität erhält Es soll auch ein Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid geschaffen werden, das diese vorteilhaften Ergebnisse zu erzielen erlaubt.
Diese Aufgabe wird bei einem Mittel gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 durch das Kennzeichen des Anspruchs 1 und bei einem Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 10 durch das Kennzeichen des Anspruchs 10 gelöst.
Vorteilhafte Ausgestaltungen des Mittels sind in den Ansprüchen 2 bis 9 beschrieben.
Bei den N-substituierten 3-AlkylanUinen der allgemeinen Formel I umfaßt die Niedrigalkylgruppe eine Alkylgruppe mit vorzugsweise 1 bis 5 C-Atomen, wie Methyl, Äthyl, Propyl, Isopropyl, etc.
Beispiele für die Hydroxyaikylgruppe mit 1 bis 5 C-Atomen sind Hydroxymethyl, Hydroxyäthyl, Hydroxypropyl und dergleichen.
ίο Beispiele für N-substituierte 3-Alkylaniline der allgemeinen Formel I sind
N-Methyl-N-hydroxymethyl-3-methylanilin, N-Äthyl-N-hydroxyäthyl-3-methylanilin, N-Äthyl-N-hydroxyäthyl-3-äthylanilin, N-Methyl-N-hydroxyäthyl-3-methylanilin, N-Methyl-N-hydroxypropyl-3-methylanilin, N-ÄthyI-N-hydroxy-propyl-3-methylanilin, N-Methyl-N-hydroxyäthyl-3-äthylanilin, N-Propyl-N-hydroxyäthyl-3-methylanilin, N-Methyl-N-hydroxyäthyl-3-propylanilin, N,N-bis(/J-Hydroxyäthyl)-3-methyl-anilin, N,N-bis(/?-Hydroxypropyl)-3-methylaniIin, N,N-Dimethyl-3-methylanilin, N,N-Dimethyl-3-äthylanilin, N.N-Dimethyl-S-propyl-anilin, N,N-Diäthyl-3-methylanilin, N,N-Diäthyl-3-äthylanilin, N,N-Dipropyl-3-methylaniIin und dergleichen.
J» Alle der wie oben definierten N-substituierten 3-Alkylaniline der allgemeinen Formel I ergeben eine ausgezeichnete Empfindlichkeit und Farbstabilität. Insbesondere N-Äthyl-N-hydroxyäthyl-3-methylanilin ergibt die beste Empfindlichkeit.
r> Ist jedoch die 2-Stellung (ortho-Stellung) oder 4-Stellung (para-Stellung) von N-substituierten Anilinen mit einer Niedrigalkylgruppe substituiert, so können hinsichtlich Empfindlichkeit und Farbstabilität keine zufriedenstellenden Ergebnisse erzielt werden. ■ίο Die N-substituierten 3-Alkylaniline der allgemeinen Formel I werden im allgemeinen in einer Menge von etwa 1 bis 20 Mol pro Mol 4-Aminoantipyrin eingesetzt Zu den erfindungsgemäß verwendeten Wasserstoffperoxydaktivierungsmitteln gehört nicht nur Peroxidase •r> sondern auch Wolframsäure und deren Salze, Molybdänsäure und deren Salze, Mischungen eines Jodids und einer dieser anorganischen Verbindungen, Eisen-, Kupfer-, Cer-Ionen und Vanadinsäure und dergleichen. Üblicherweise verwendet man eine katalytische Menge W des Wasserstoffperoxyd-Aktivierungsmittels.
Das N-substituierte 3-Alkylanilin der allgemeinen Formel I1 welches erfindungsgemäß ein Farbbildungsmittel darstellt, wird in Kontakt mit H2O2 oxydativ mit 4-Aminoantipyrin kondensiert, wobei sich ein lndopheir> nol-Farbstoff der allgemeinen Formel II, wie untenstehend gezeigt, ergibt, welcher eine maximale Absorption nahe λ = 545 nm hat.
QH5 I, C N O
■ \/ v
R1 R2
,C), -4
11,r
NH,
Wasserstoffperoxydaktivierungsmittel
QH5 H3C N
H3C
(H)
Verwendet roan das erfindungsgemäße Mittel, so erreicht man bei Kontakt mit Wasserstoffperoxyd eine bemerkenswert gute Empfindlichkeit und Farbstabilität über einen weiten pH-Bereich, wie nachstehend in Tabelle I gezeigt, im Gegensatz zu der bekannten Anwendung von 4-Aminoantipyrin zusammen mit
Tabelle I
Phenol, wo die Farbentwicklung und die Farbstabilität auf den pH-Bereich von 7 bis 9 begrenzt sind und die bekannte gemeinsame Anwendung von 4-Aminoantipyrin und Dimethylanilin oder Diäthylanilin, wo die Farbentwicklung und Farbstabilität auf den pH-Bereich von pH 4 bis 6 begrenzt sind.
Farbbildungsmittel (X11111x)
pH 3
Erfindungsgemäße N-Äthyl-N-hydroxy- Empfindlichkeit Farbbildungsmittel äthyl-3-methylaniIir Farbstabilität (545 nm)
Empfindlichkeit Farbstabilität
N,N-Dimethyl-3-methylanilin (545 nm)
N,N-bis-(/?-Hy- Empfindlichkeit
droxyäthyl)-3-äthyl- Farbstabilität anilin
(545 nm)
96 98
93 92
29 82
Herkömmliche Phenol Empfindlichkeit
Farbbildungsmittel (505 nm) Farbstabilität
N,N-Dimethylanilin Empfindlichkeit
(545 nm) Farbstabilität
98
99
95
99
39
95
100
99
96
100
39
99
22 31
37 63
85 85
100 100
100
99
96
100
41
1OO
40
82
84
98
100 98
95 98
41 100
42 98 80 82
99
97
90 92
41 97
42 98 71 63
97 81
87 78
36
82
41 96 56 45
In Tabelle I stehen die in den Zeilen für Farbstabilität angegebenen Werte für das Absorptionsverhältnis in Prozent nach 90 Minuten, bezogen auf die Absorption bei völliger Farbentwicklung (100%) und die in den Zeilen für die Empfindlichkeit angegebenen Werte bedeuten das Absorptionsverhältnis in Prozent, bezogen auf die Absorption von N-Äthyl-N-hydroxyäthyl-3-methyl-anilin bei dem ph-Wert, bei dem sich die maximale Empfindlichkeit erreichen läßt (100%).
In Tabelle I sind typische Beispiele für erfindungsgemäß verwendete Farbbildungsmittel aufgeführt, es ist jedoch selbstverständlich, daß die gleichen ausgezeichneten Ergebnisse auch mit den anderen N-substituierten 3-Alkylanilinen der allgemeinen Formel I nach Anspruch 1 erzielt werden können.
Unter Verwendung der nachstehend aufgeführten Proben und Farbbildungsreagenzlösungen wird die Absorption wie folgt gemessen, wobei man dann zu den Werten der Tabelle I kommt:
Tabelle II
Meßverfahren
Eine Mischung, welche 50 μΐ einer Probe und 5 ml einer Farbbildungsreagenzlösung enthält, läßt man bei Raumtemperatur 5 Minuten stehen und mißt dann die Absorption bei jeder maximalen Absorptionswellenlänge (Λ max).
Probe
Wasserstoffperoxydlösung: H2O2 5 mg/dl.
„ Farbbildungsreagenzlösung:
Zu einer Pufferlösung, welche erhalten wurde, indem man wie in Tabelle II gezeigt, für jeden pH-Wert einen Puffer verwendete, gibt man 2000 Einheiten Peroxidase, 0,5 mMol 4-Aminoantipyrin und 5 mMol eines Farbbildungsmittels wie in Tabelle I aufgeführt und stellt das Gesamtvolumen auf 1 1 ein.
pH
Puffer
Acetat (0.1 m) Phosphat (0,1 m) Borat (0,1 m)
Wie oben bereits angegeben, ist der optimale pH-Bereich für die Farbentwicklung des Mittels, d. h. der zu dem erfindungsgemäßen Mittel kombinierten Farbbildungsreagentien, so breit, daß der pH-Bereich nur nach dem anderen Faktor, beispielsweise dem ■> optimalen Aktivierungs-pH eines zu verwendenden Oxydationsenzyms gewählt werden kann. Dies bedeutet beispielsweise, daß man bei Bestimmung von Glucose im Serum, wobei man Glucoseoxydase verwendet, welche einen optimalen Aktivierungs-pH-Wert bei ι ο pH 5 hat, einen pH-Wert von 5 verwenden kann; bestimmt man Cholesterin im Serum unter Verwendung von Cholesterinoxydase mit einem optimalen Aktivierungs-pH-Wert von etwa 5,8, so kann man etwa pH 6 verwenden und im Fall der Bestimmung von Harnsäure im Serum durch Uricase mit einem optimalen Aktivierungs-pH-Wert bei pH 7,5 bis 8,5, kann man etwa pH 8 verwenden. Die bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung von Wasserstoffperoxyd erhaltenen Ergebnisse sind exakter, rascher und wirtschaftlicher.
Das Farbentwicklungsmittel mit der höchsten Empfindlichkeit ist N-Äthyl-N-hydroxyäthyl-3-rnethylanilin. Die Anwendung einer Kombination von N-Äthyl-N-hydroxyäthyl-3-methylanilin und 4-Aminoantipyrin ergibt eine etwa 2,5 mal höhere Empfindlichkeit als die Anwendung einer Kombination von Phenol und 4-Aminoantipyrin, wie dies auch in Tabelle I gezeigt ist.
Derartig hochempfindliche Farbbildungsmittel, wie N-Äthyl-N-hydroxyäthyi-3-methylaniIin und N1N-Di- jii methyl-3-methylanilin werden vorzugsweise zur Bestimmung von Harnsäure, Kreatinin, freiem Cholesterin und dergleichen angewandt, welche im Serum nur in sehr geringen Mengen anwesend sind.
Diejenigen N-substituierten 3-Alkylaniline der allgemeinen Formel I, welche eine relativ geringe Empfindlichkeit aufweisen, wie N,N-Dihydroxyäthy!-3-methylanilin, werden vorzugsweise zur Bestimmung von Glucose, Gesamtcholesterin, Cholesterase, Phospholipiden und dergleichen angewandt, welche in großen Mengen im Serum enthalten sind.
Die N-substituierten 3-Alkylaniline der allgemeinen Formel I sind in Form einer Lösung bei einem pH von ~6 oder darunter sehr stabil, sie können jedoch, falls erforderlich auch in Form eines Salzes, beispielsweise eines Mineralsalzes, wie Hydrochlorid, Sulfat, etc. oder eines organischen Säuresalzes eingesetzt werden, nötigenfalls können sie auch als Pulver, oder in Form eines zu Tabletten bearbeiteten Feststoffs, als gefriergetrocknete Produkte und dergleichen, oder zusammen mit anderen Bestandteilen, falls nötig, verwendet werden.
Werden die erfindungsgemäßen Mittel zur Bestimmung von Wasserstoffperoxyd verwendet, so kann das Verfahren in einem pH-Bereich von pH 3 bis 9 durchgeführt werden. Darüberhinaus können die erfindungsgemäßen Mittel nicht nur für klinische Untersuchungen, sondern auch für Analysen auf Nahrungsmittelzusätze und für Analysen im allgemeinen verwendet werden.
Die nachstehenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.
Beispiel 1
Bestimmung von Harnsäure
In 100 ml 0,1 m Phosphatpufferlösung (pH 8,0) löst man 10 Einheiten Uricase, 100 Einheiten Peroxydase,
65 30 mg 4-Aminoantipyrin und 100 mg N-Äthyl-N-hydroxyäthyI-3-methylanilin, wobei man eine Farbbildungsreagenzlösung erhält.
In ein Teströhrchen gibt man 100 μΐ Serum und 3 ml der Farbbildungsreagenzlösung und läßt bei 37° C 10 Minuten stehen. Danach werden die Absorption bei 546 nm und 600 nm sowohl bei der Probe als auch einem Reagens allein gemessen, so daß man die Differenz der Absorptionen erhält. Die Harnsäurekonzentration im Serum wird mit Hilfe einer Kalibrierungskurve berechnet, welche zuvor nach dem herkömmlichen Verfahren aufgestellt wurde.
Beispiel 2
Bestimmung von Glucose
In 100 ml einer 0,1 m Acetatpufferlösung (pH 5,0) löst man 400 Einheiten Glucoseoxydase, 200 Einheiten Peroxydase, 30 mg 4-Aminoantipyrin und 100 mg N,N-bis(j3-Hydroxyäthyl)-3-methylanilin, wobei man eine Farbbildungsreagenzlösung erhält.
In ein Teströhrchen gibt man 20 μΐ Serum und 3 ml der Farbbildungsreagenzlösung und läßt 10 Minuten bei 37°C stehen. Danach wird die Absorption bei 545 nm sowohl bei der Probe als auch bei der Reagenzlösung allein gemessen, um die Absorptionsdifferenz zu erhalten. Eine Glucosekonzentration im Serum wird mit Hilfe einer Kalibrierungskurve berechnet, welche zuvor nach herkömmlichen Verfahren aufgestellt wurde.
Beispiel 3
Bestimmung von Gesamtcholesterin
In 100 ml 0,2 m Phosphatpufferlösung (pH 5,8), löst man 15 Einheiten Cholesterinoxydase, 20 Einheiten Cholesterinesterhydrase, 150 Einheiten Peroxydase, 10 mg 4-Aminoantipyrin, 100 mg N,N-Dimethyl-3-methylanilin und 150 mg Triton X-100 (Handelsbezeichnung von Röhm & Haas Co.), wobei man eine Farbbildungsreagenzlösung erhält.
In ein Teströhrchen gibt man 10 μΐ Serum und 3 ml der Farbbildungsreagenzlösung und läßt 10 Minuten bei 37°C stehen. Anschließend wird die Absorption bei 545 nm sowohl bei der Probe als auch der Reaktionslösung allein gemessen und die Absorptionsdifferenz erhalten. Die Gesamtcholesterinkonzentration im Serum wird mit Hilfe einer Kalibrierungskurve berechnet, welche zuvor auf herkömmliche Weise erhalten wurde.
Beispiel 4
Bestimmung von Gesamtcholesterin
In 100 ml 0,2 m Phosphatpufferlösung (pH 5,8) löst man 15 Einheiten Cholesterinoxydase, 20 Einheiten Cholesterinesterhydrase, 0,5 g Natriumwolframat, 1,0 g Natriumiodid, 10 mg 4-Aminoantipyrin, 100 mg N1N-Dimethyl-3-methylanilin und 150 mg Triton X-100, wobei man eine Farbbildungsreagenzlösung erhält
In ein Teströhrchen gibt man 10 μΐ Serum und 3 ml der Farbbildungsreagenzlösung und läßt 10 Minuten bei 37°C stehen. Danach wird die Absorption bei 545 nm sowohl bei der Probe als auch bei der Reagenzlösung allein gemessen und die Absorptionsdifferenz erhalten. Die Gesamtcholesterinkonzentration im Serum wird mit Hilfe einer Kalibrierungskurve berechnet, welche auf herkömmliche Weise erstellt wurde.
Die Empfindlichkeit und Farbstabilität bei den Beispielen 1 bis 4 sind wie in Tabelle III aufgezeigt
ίο
Tabelle III
Beispiel Nr. Untersuchte Substanz (pH)
Empfindlichkeit der Standardlösung
Farbstabilität
1 Harnsäure (8,0) Standardlösung: Harnsäure 10 mg/dl 98% (90 Min/ίΟ Min)
Empfindlichkeit: 0,135 (A 546 nm/600 nm)
2 Glucose (5,0) Standardlösung: Glucose 200 mg/dl 100% (90 Min/10 Min)
Empfindlichkeit: 0,403 (A 545 nm)
3 Gesamtcholesterin (5,8) Standardlösung: Cholesterin 200 mg/dl 100% (90 min/10 Min)
Empfindlichkeit: 0,227 (A 545 nm)
4 üesamtcholesterin (5,8) Standardlösung: Cholesterin 200 mg/dl 100% (90 Min/10 Min)
Empfindlichkeit: 0,227 (A 545 nm)
Anmerkung:
Die Absorptionen wurden mit Hilfe eines Hitachi Typ 101 Spektropholometers gemessen.

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Mittel zur Herstellung von Farbbildungsreagentien zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid, enthaltend
(a) 4-Aminoantipyridin,
(b) ein Cliromogen und
(c) ein Wasserstoffperoxid-Aktivierungsmittel
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