DE3634525A1 - Testmittel und indikatoren zum nachweis von thiolgruppen und verfahren zu deren herstellung - Google Patents

Testmittel und indikatoren zum nachweis von thiolgruppen und verfahren zu deren herstellung

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DE3634525A1 DE19863634525 DE3634525A DE3634525A1 DE 3634525 A1 DE3634525 A1 DE 3634525A1 DE 19863634525 DE19863634525 DE 19863634525 DE 3634525 A DE3634525 A DE 3634525A DE 3634525 A1 DE3634525 A1 DE 3634525A1
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Description

Die Erfindung betrifft Indikatoren und Mittel zum Nachweis von Thiolgruppen, die in einem System vorhanden sind oder in einem der Nachweisreaktion vorgelagerten Schritt gebildet werden. Verfahren zur Herstellung der Indikatoren werden ebenfalls beschrieben. Die Bildung der Thiolgruppen kann durch chemische Reaktionen, wie z. B. Reduktion von Disulfiden, oder biochemische Reaktionen erfolgen. Die bevorzugten biochemischen Reaktionen, die zur Bildung von Thiolgruppen führen, werden durch das folgende Formelschema verdeutlicht:
Es sind zahlreiche Methoden zum Nachweis von Thiolgruppen enthaltenden Verbindungen bekannt. Eine besonders häufig zitierte Methode ist die von G. H. Ellman in "Arch. Biochem. Biophys. 1959, 82, 70-77" beschriebene, die auf der Bildung des gelben Anions der 3-Mercapto-6- nitro-benzoesäure beruht, das durch Reaktion zwischen einem Thiol und der 3,3′-Dithio-bis-6-nitro-benzoesäure (Ellmans Reagenz) entsteht.
Die Reaktion ist empfindlich und schnell. Allerdings ist das Anion des Ellman Reagenzes sehr oxidationsempfindlich und somit die entstandene Färbung instabil. Außerdem ist das Ellman Reagenz in polaren Lösungsmitteln, wie z. B. Wasser, sehr schwer löslich und somit für manche Thiol-Lösungen, besonders diejenigen, die biochemisch in wäßrigen Systemen dargestellt werden, nur bedingt brauchbar.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I
worin
Xfür Wasserstoff oder -SO₂R¹, Yfür Wasserstoff oder -NO₂,
R² und R³unabhängig voneinander für Wasserstoff, C₁-C₄- Alkyl, das substituiert sein kann durch Halogen, -COOH, Cyano, C₁-C₄-Alkoxy, Hydroxy, -OSO₃H, -SO₃H, Amino, wobei die Aminogruppe ihrerseits durch gegebenenfalls mit Halogen, Hydroxy, Cyano, -OSO₃H, -SO₃H substituiertes C₁-C₄-Alkyl, Phenyl oder Benzylgruppen substituiert sein kann, stehen, oder R² und R³gemeinsam mit dem N-Atom für einen Pyrrolidin-, Pyrazolin-, Piperidin-, Piperazin- oder Morpholinring stehen, der durch C₁ bis C₄-Alkyl oder Phenyl substituiert sein kann,
weisen diese Nachteile nicht auf.
Besonders bevorzugt sind Verbindungen der allgemeinen Formel II
worin X, Y und R¹ die oben angegebene Bedeutung haben.
Von besonderem Interesse sind Verbindungen der allgemeinen Formel III
worin X, Y und R¹ die oben angegebene Bedeutung haben.
Ganz besonders bevorzugt sind Verbindungen der allgemeinen Formel IV
worin R¹ die oben angegebene Bedeutung hat.
Steht R¹ für
worin R² verschieden von Wasserstoff ist, R² und R³ ansonsten aber die gleiche Bedeutung wie oben angeführt haben, so sind die Verbindungen als solche neu.
Von ganz besonderem Interesse sind Verbindungen der allgemeinen Formel V
worin R² und R³ die bei der Formel I angegebene Bedeutung haben.
Ganz besonders bevorzugt sind Verbindungen der allgemeinen Formel VI
worin R² und R³ die bei der Formel I beschriebene Bedeutung haben.
Die Herstellung der Verbindungen I erfolgt nach in den Einzelschritten bekannten Verfahren.
Hergestellt werden die Verbindungen der Formel I, indem man ein Chlor-nitro-benzolsulfochlorid der Formel
mit einem Amin oder Alkoholat der Formel H-R¹
wobei R¹ die obengenannte Bedeutung hat,
in das entsprechende Chlor-nitro-benzolsulfonsäurederivat überführt und anschließend in Anwesenheit von Na₂S einen Chlor-Sulfid-Austausch und darauf eine Oxidation durchführt, wodurch man ein symmetrisches Disulfid erhält. Asymmetrische Disulfide der Formel I werden hergestellt, indem man ein durch Chlor-Sulfid-Austausch erhaltenes Mercapto-nitro-benzol-sulfonsäurederivat der Formel
worin R¹ die obengenannte Bedeutung hat,
mit einem substituierten Phenylsulfensäurechlorid der Formel
worin X und Y die obengenannte Bedeutung haben, umsetzt.
Das folgende Schema zeigt beide Wege der Synthese:
a) Symmetrische Disulfide
b) Asymmetrische Disulfide
Die Verbindungen der allgemeinen Formel I können besonders gut als Indikatoren in Testmitteln für Thiole oder Thiolvorläufer wie z. B. Liponamid, Glutathion oder Coenzym A eingesetzt werden.
Unter Testmittel oder Testsystem im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind z. B. solche zu verstehen, die in einer Küvette vermessen werden können. Die Testmittel enthalten neben den Verbindungen der allgemeinen Formel (I) alle für den der jeweiligen Analysesubstanz notwendigen Reagenzien wie Enzyme, Substrate, Coenzyme, Effektoren, Antigene, Antikörper usw. Weiterhin können diese Testmittel noch nicht reagierende Substanzen wie z. B. Puffer, Netzmittel und Stabilisatoren enthalten. Als Thiolgruppen-bildende Enzyme sind zu nennen Thiolglykosidasen, Thioetherhydrolasen und auch Esterasen wie z. B. die Cholinesterase. Weiterhin zu nennen sind Enzyme, die mit Hilfe von NADH und NADPH als Coenzym Thiolgruppen bilden wie die Liponamiddehydrogenase und die Glutathionreduktase. Die letztgenannten Enzyme können in Testsystemen eingesetzt werden, bei denen NADH oder NADPH gebildet wird. Solche Reaktionen sind die bekannten durch Dehydrogenasen katalysierten Oxidationen von Substraten. Aus den genannten Reagenzien und Substanzen können Reagenzkombinationen hergestellt werden, die als Lösung, als Pulver vermischt, als Tabletten oder als Lyophylisat vorliegen. Die Reagenzkombination (falls sie nicht schon als Lösung vorliegt) wird mit Wasser oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel aufgenommen und zu einer Reagenzlösung bereitet. Besteht die Reagenzkombination aus einzelnen Komponenten so sind diese miteinander zu mischen. Nach Vermischen der Probe (z. B. Substratlösung, Enzymlösung, Blut, Serum, Plasma oder Urin) mit einem aliquoten Teil der Reagenzmischung wird die entstehende Farbe am Photometer vermessen und über den molaren Extinktionskoeffizienten und die zugesetzten Reagenz- bzw. Probevolumina die jeweilige Konzentration bzw. Substratkonzentration berechnet. Es sind sowohl kinetische als auch Endpunktmessungen möglich.
Ebenso können die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) zusammen mit dem/den für den jeweiligen Parameternachweis notwendigen Reagenzien bzw. anderen Enzymen, dem Puffersystem, gegebenenfalls Netzmitteln und Aktivatoren sowie anderen Hilfsstoffen auf saugfähigen Reagenzträgern wie Papieren, Vliesen etc. imprägniert werden. Dazu kann man eine oder mehrere Imprägnierlösungen in Form von wäßrigen oder organischen bzw. gemischten Lösungen herstellen, je nachdem wie sich die Reagenzien oder Hilfsstoffe lösen. Mit diesen Lösungen werden saugfähige oder quellfähige Träger, vorzugsweise Filterpapier oder saugfähige Glas- oder Kunststoffvliese, imprägniert oder besprüht. Anschließend wird getrocknet. Die so hergestellten Reagenzträger können entweder als Schnelldiagnostica zur direkten Bestimmung von Inhaltsstoffen von Flüssigkeiten (z. B. in Körperflüssigkeiten wie Blut, Urin oder Speichel, oder in Lebensmitteln z. B. Fruchtsäften, Milch o. a.) eingesetzt werden. Die Flüssigkeit wird dabei direkt auf den Reagenzträger gebracht und dieser kurz in die Flüssigkeit eingetaucht. Eine semi quantitative Bestimmung ist möglich, indem man die so entstandene Farbe einer Vergleichsfarbe zuordnet. Eine quantitative Auswertung läßt sich remissionsphotometrisch durchführen.
Ebenso ist es möglich die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) in Trägermatrices einzubringen, die aus Gießlösungen hergestellt wurden. Beispielhaft sind hier Cellulose, Cellulosederivate, Gelatine, Gelatinederivate oder auch Kunststoffe wie Polyurethane und Acrylamid zu nennen. Dabei ist es vorteilhaft, wenn die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) und gegebenenfalls die anderen notwendigen Reagenzien der Gießlösung direkt zugesetzt werden, wodurch es möglich wird, die Testvorrichtung, bestehend aus Träger und Reagenzien, in einem Arbeitsgang herzustellen.
Durch Eluieren der vorweggenannten Reagenzien mit Wasser bzw. Puffer oder Serum aus dem saugfähigen Träger läßt sich eine Reagenzlösung herstellen, mit der man wie oben beschrieben Substrate oder Enzyme in der Küvette am Photometer bestimmen kann.
Geeignete Puffer für die genannten Testmittel sind Phosphat-, Citrat-, Borat-, GOOD-Puffer mit Alkali- oder Ammoniumgegenionen. Andere Systeme sind jedoch ebenfalls brauchbar. Als pH-Werte sind 6 bis 10, insbesondere 6,5 bis 7,5 anzustreben.
Netzmittel sind insbesondere anionische und kationische Netzmittel, die mit den erfindungsgemäßen Verbindungen ionische Wechselwirkungen eingehen. Nichtionogene Netzmittel, die die Enzyme aktivieren, sind jedoch ebenfalls brauchbar, Natriumlaurylsulfat, Dioctylnatriumsulfosuccinat und Alkylarylpolyetheralkohole werden bevorzugt.
Als Effektoren sind die für die jeweilige enzymatische Reaktion bekannten einzusetzen.
Als sonstige Hilfsstoffe können übliche Verdicker, Lösungsvermittler, Emulgatoren, optische Aufheller, Kontrastmittel etc. sinnvoll sein, wie sie in entsprechenden Testen mit anderen Chromogenen bekannt sind.
Beispiel 1
Zu einer Lösung von 120 g Natriumsulfid · 9 H₂O in 750 ml Wasser gibt man 130 g des Natriumsalzes der 2-Chlor-5- nitrobenzolsulfonsäure. Man läßt 10 Stunden bei Raumtemperatur rühren und säuert die Lösung an. Mit Hilfe von Stickstoff entfernt man den entstandenen Schwefelwasserstoff. Anschließend stellt man mit Natronlauge einen pH- Wert von 10 ein und führt die Oxidation zum Disulfid mit 125 g Iod durch. Während der Iod-Zugabe muß der pH-Wert ständig mit Natronlauge nachreguliert werden. Nach beendeter Oxidation wird ein pH-Wert von 7,5 eingestellt und die folgende Verbindung mit 20%-Kochsalz ausgesalzen.
Beispiel 2
In einer Lösung aus 500 ml Wasser und 126 g Natriumsulfit werden 101 g 3,4-Dinitro-chlorbenzol 30 Stunden zum Rückfluß erhitzt. Man läßt abkühlen und kristallisiert den ausgefallenen gelben Niederschlag der folgenden Formel aus Wasser um.
25,9 g des oben hergestellten Natriumsalzes der 3-Chlor- 6-nitro-benzolsulfonsäure werden bei Raumtemperatur zu einer Lösung von 25,0 g Natriumsulfid · 9 H₂O in 250 ml Wasser gegeben. Nach 5 Stunden Reaktionszeit (DC-Kontrolle) säuert man die Lösung an, entfernt mit Stickstoff den entstandenen Schwefelwasserstoff und klärt anschließend über Aktivkohle. Das gelbe Filtrat mit der Mercaptoverbindung der folgenden Struktur
wird anschließend mit Natronlauge auf pH 10 gestellt und mit 25 g Iod oxidiert. Der pH-Wert wird während der Oxidation durch Zugabe von Natronlauge gehalten. Das entstandene Disulfid wird mit Kochsalz ausgesalzen und aus Wasser umkristallisiert. Es wird durch das folgende ¹³C- NMR-Spektrum charakterisiert.
¹³C-Shifts in DMSO-D₆
C-Atomeδ [ppm]
C-1/C-1138.300 C-2/C-2126.478 C-3/C-3140.481 C-4/C-4127.248 C-5/C-5123.948 C-6/C-6146.616
Beispiel 3
Man löst 50,0 g N-Methyl-piperazin in 300 ml Chloroform. Nach Zugabe von 69 ml Triethylamin trägt man bei Raumtemperatur 128 g 2-Chlor-5-nitrobenzolsulfonsäurechlorid ein. Nach 5 Stunden gießt man den Ansatz auf Eis und extrahiert das entstandene Sulfonamid der folgenden Formel mit Chloroform.
Zu einer Lösung von 63,9 g der oben hergestellten Nitroverbindung in 300 ml Ethanol tropft man eine frisch bereitete Natriumdisulfid-Lösung, die man aus 48,0 g Natriumsulfid · 9 H₂O in 250 ml Ethanol mit 6,4 g Schwefel erhält. Man kocht 2 Stunden am Rückflußkühler und trägt den Ansatz anschließend in 1 l Eiswasser aus. Das ausgefallene hellgelbe Produkt wird abgesaugt und kristallisiert aus Ethanol mit dem Schmelzpunkt 205°C.
Beispiel 4
Zu einer Mischung aus 50 ml Phosphoroxychlorid und 25 g Phosphorpentachlorid gibt man bei 80°C portionsweise 25,9 g des Natriumsalzes der 3-Chlor-6-nitrobenzolsulfonsäure. Nach 2 Stunden ist die HCl-Entwicklung abgeklungen. Man rotiert die Lösung ein, nimmt den Rückstand in Toluol auf, wäscht die Toluolphase mit Eiswasser, trocknet den Extrakt und rotiert nochmals ein. Das Sulfochlorid der folgenden Formel bleibt als hellkristalline Masse zurück.
25,6 g des 3-Chlor-6-nitrobenzolsulfochlorids in 100 ml Chloroform gelöst tropft man bei Raumtemperatur zu 250 ml Chloroform, in dem sich eine Mischung aus 10,0 g N-Methylpiperazin und 11 ml Triethylamin befinden. Nach dem Reaktionsende trägt man auf Eis aus, extrahiert mit Chloroform und isoliert so das folgende Sulfonamid.
Man gibt anschließend 31,95 g des oben hergestellten Sulfonamids bei Raumtemperatur zu einer Suspension von 25,0 g Natriumsulfid · 9 H₂O in 100 ml DMF. Nach 1 Std. ist der Chlor-Sulfid-Austausch beendet. Der Reaktionsansatz wird auf Eis ausgetragen, angesäuert und abgesaugt. Man erhält 27,3 g der folgenden Mercapto-Verbindung.
Man löst 15,85 g der oben hergestellten Mercapto-Verbindung in einer Mischung aus 200 ml Ethanol und 50 ml Triethylamin und gibt anschließend portionsweise 12,5 g Iod hinzu. Das Reaktionsende wird durch den Farbumschlag von rotbraun nach gelb angezeigt. Man trägt das Reaktionsprodukt auf Eis aus und saugt den hellgelben Niederschlag ab. Das aus Chloroform/Ethanol umkristallisierte Disulfid der folgenden Konstitution schmilzt ab 173°C (Zers.).
Beispiel 5
Man löst 58,0 g Natriumphenolat in 300 ml Wasser. Hierzu gibt man portionsweise bei Raumtemperatur 128 g des 4- Chlor-5-nitrobenzolsulfonsäurechlorids. Man läßt über Nacht rühren und saugt das ausgefallene Produkt der folgenden Formel ab.
Man suspendiert 25,0 g Natriumsulfid · 9 H₂O in 100 ml DMF und fügt anschließend bei Raumtemperatur 91,3 g des 4- Chlor-5-nitro-benzolsulfonsäurephenylesters hinzu. Nach 1 Std. trägt man auf Eis aus, säuert an und saugt die Mercapto-Verbindung ab.
15,55 g der oben hergestellten Mercaptoverbindung werden in 200 ml Ethanol und 50 ml Triethylamin gelöst. Durch Zugabe von 12,0 g Iod wird die Mercaptoverbindung ins Disulfid übergeführt. Die Verbindung der folgenden Formel schmilzt bei 148-151°C.
Beispiel 6
Zu einer Lösung von 27,9 g 4-Mercapto-5-nitro-benzolsulfonsäurephenylester in 500 ml Chloroform tropft man eine Lösung von 19,0 g 4-Nitrobenzolsulfensäurechlorid in 200 ml Chloroform bei 0°C. Mit einem trockenen Stickstoffstrom sorgt man für die Entfernung des entstehenden HCl-Gases. Nach Beendigung der Reaktion wird der Ansatz einrotiert und der Rückstand aus Ethanol umkristallisiert. Man erhält 39,8 g des folgenden Disulfids.
Beispiel 7
3,04 g des nach Beispiel 4 hergestellten 3-Mercapto-6- nitrobenzolsulfonsäuremorpholids werden in 50 ml Methylenchlorid gelöst. Unter Eiskühlung tropft man eine Lösung von 2,0 g 4-Nitrobenzolsulfensäurechlorid in 30 ml Methylenchlorid hinzu. Das entstehende HCl-Gas wird mit einem Stickstoffstrom entfernt. Nach Beendigung der Reaktion wird das Methylenchlorid im Vakuum abgezogen und der Rückstand aus Acetonitril umkristallisiert. Man erhält 4,5 g der folgenden Verbindung.
Nach den in den Beispielen 1 bis 7 beschriebenen Methoden sind die folgenden Disulfate hergestellt worden.
Beispiel 37 Verbindung aus Beispiel 2
Zur Prüfung der Verbindung aus Beispiel 2 als Indikator für NADH in dem beschriebenen Testsystem wurde die Verbindung 20 mM in Wasser gelöst. In einer Küvette wurden folgende Reagenzbestandteile zusammenpipettiert:
1810 µl Puffer (0,1 M/l Tris, pH 7)
 100 µl Verbindung Beispiel 2 (20 mmol/l in H₂O)
  50 µl Liponamid (50 mmol/l)
  20 µl Liponamid-Dehydrogenase (1200 kU/l)
Nach Messung des Reagenzien-Leerwertes wurde die Reaktion durch Zugabe von 20 µl NADH gestartet. Das gemessene Extinktionsmaximum liegt bei 400 nm. Kinetische Untersuchungen ergaben einen stabilen Endpunkt (Extinktionsveränderung innerhalb 20 Minuten <1%) bereits nach einer Reaktionszeit von 1 Minute.
Zur Prüfung der Funktionsfähigkeit und Linearität wurden im Testansatz NADH-Konzentrationen im Bereich 1-10 mmol/l gemessen. Die gemessenen Extinktionsdifferenzen bei 400 nm sind in Tabelle 1 zusammengestellt.
Tabelle 1
Tabelle 2 zeigt die Resultate der Prüfung auf Störungen durch Ascorbinsäure. Für diese Prüfung werden dem obigen Ansatz 20 µl einer NADH-Lösung (5 mmol/l) und noch 20 µl einer Ascorbinsäurelösung von 1 mmol/l zugesetzt und die resultierenden Extinktionen gemessen.
Tabelle 2
Die gemessenen Werte in Anwesenheit von Ascorbinsäure liegen im Mittel um 0,7% über den Werten, die in Abwesenheit von Ascorbinsäure gemessen wurden. Der vorliegende Test wird durch Ascorbinsäure nicht beeinflußt.
Beispiel 38
Prüfung der Verbindung aus Beispiel 1. Es wurden gleiche Reaktionsbedingungen wie in Beispiel 37 gewählt. Als Puffer wurde jedoch 0,1 M Tris pH 9 gewählt, da mit dieser Substanz bei pH 9 eine schnellere Reaktion (Endpunkt innerhalb 1 Minute) als pH 7 erzielt wurde.
Das gemessene Absorptionsmaximum liegt bei 425 nm. Die Färbung ist innerhalb der gemessenen Zeit (20 min) stabil.
Die Prüfung der Ascorbinsäureinterferenz wurde analog Beispiel 37 durchgeführt. Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse.
Tabelle 3
In Anwesenheit von Ascorbinsäure liegen die Werte im Mittel um 0,2% höher. Der vorliegende Test wird durch Ascorbinsäure nicht gestört.
Tabelle 4 zeigt die Funktions- und Linearitätsprüfung nach Zugabe von NADH-Konzentrationen im Bereich 1-10 mmol/l.
Tabelle 4
Beispiel 39
Zur Bestimmung der Extinktionsmaxima wurden weitere Verbindungen in DMF gelöst und jeweils 50 µl der Lösung mit 2 ml 0,1 M/l Tris-Puffer pH 9 und 10 µl Mercaptoethanol versetzt. In Tabelle 5 sind die Extinktionsmaxima wiedergegeben. Extinktionsmaximum
Beispiel 34420 nm Beispiel 36434 nm Beispiel 35464 nm Beispiel 16445 nm

Claims (15)

1. Testmittel zum Nachweis von Thiolgruppen, enthaltend als Indikator für die Thiolgruppen Verbindungen der allgemeinen Formel I worinXfür Wasserstoff oder -SO₂R¹, Yfür Wasserstoff oder -NO₂, R² und R³unabhängig voneinander für Wasserstoff, C₁-C₄-Alkyl, das substituiert sein kann durch Halogen, -COOH, Cyano, C₁-C₄-Alkoxy, Hydroxy, -OSO₃H, -SO₃H, Amino, wobei die Aminogruppe ihrerseits durch gegebenenfalls mit Halogen, Hydroxy, Cyano, -OSO₃H substituiertes C₁-C₄-Alkyl, Phenyl oder Benzylgruppen substituiert sein kann, stehen, oder R² und R³gemeinsam mit dem N-Atom für einen Pyrrolidin-, Pyrazolin-, Piperidin-, Piperazin- oder Morpholinring stehen, der durch C₁ bis C₄-Alkyl oder Phenyl substituiert sein kann.
2. Mittel gemäß Anspruch 1, enthaltend Verbindungen der allgemeinen Formel II worin X, Y und R¹ die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben.
3. Mittel gemäß den Ansprüchen 1 und 2, enthaltend Verbindungen der allgemeinen Formel III worin X, Y und R¹ die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben.
4. Mittel gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, enthaltend Verbindungen der allgemeinen Formel IV worin R¹ die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat.
5. Mittel gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, enthaltend Verbindungen der allgemeinen Formel V worin R² und R³ die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben.
6. Mittel gemäß den Ansprüchen 1 bis 5, enthaltend Verbindungen der allgemeinen Formel VI worin R² und R³ die in Anspruch 1 beschriebene Bedeutung haben.
7. Mittel gemäß den Ansprüchen 1 bis 6, zusätzlich enthaltend eine oder mehrere Substanzen aus der Gruppe Enzyme, Substrate, Coenzyme, Effektoren, Antigene, Antikörper, Puffer, Netzmittel und Stabilisatoren.
8. Verwendung des Mittels gemäß den Ansprüchen 1 bis 7 zum Nachweis von Thiolgruppen in einer Probe.
9. Verbindungen der allgemeinen Formel I worinXfür Wasserstoff oder -SO₂R¹, Yfür Wasserstoff oder -NO₂, R³Wasserstoff, C₁-C₄-Alkyl, das substituiert sein kann durch Halogen, -COOH, Cyano, C₁-C₄- Alkoxy, Hydroxy, -OSO₃H, -SO₃H, Amino, wobei die Aminogruppe ihrerseits durch gegebenenfalls mit Halogen, Hydroxy, Cyano, -OSO₃H, -SO₃H substituiertes C₁-C₄-Alkyl, Phenyl oder Benzylgruppen substituiert sein kann, steht, R²außer Wasserstoff die gleiche Bedeutung hat wie R³, oder R² und R³gemeinsam mit dem N-Atom für einen Pyrrolidin-, Pyrazolin-, Piperidin-, Piperazin- oder Morpholinring stehen, der durch C₁ bis C₄-Alkyl oder Phenyl substituiert sein kann.
10. Verbindungen der allgemeinen Formel II worin X, Y und R¹ die in Anspruch 9 angegebene Bedeutung haben.
11. Verbindungen der allgemeinen Formel III worin X, Y und R¹ die in Anspruch 9 angegebene Bedeutung haben.
12. Verbindungen der allgemeinen Formel IV worin R¹ die in Anspruch 9 angegebene Bedeutung hat.
13. Verbindungen der allgemeinen Formel V worin R² und R³ die in Anspruch 9 angegebene Bedeutung haben.
14. Verbindungen der allgemeinen Formel VI worin R² und R³ die in Anspruch 9 beschriebene Bedeutung haben.
15. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel I worinXfür Wasserstoff oder -SO₂R¹, Yfür Wasserstoff oder -NO₂, R³Wasserstoff, C₁-C₄-Alkyl, das substituiert sein kann durch Halogen, -COOH, Cyano, C₁-C₄- Alkoxy, Hydroxy, -OSO₃H, -SO₃H, Amino, wobei die Aminogruppe ihrerseits durch gegebenenfalls mit Halogen, Hydroxy, Cyano, -OSO₃H, -SO₃H substituiertes C₁-C₄-Alkyl, Phenyl oder Benzylgruppen substituiert sein kann, steht, R²außer Wasserstoff die gleiche Bedeutung hat wie R³ oder R² und R³gemeinsam mit dem N-Atom für einen Pyrrolidin-, Pyrazolin-, Piperidin-, Piperazin- oder Morpholinring stehen, der durch C₁ bis C₄-Alkyl oder Phenyl substituiert sein kann,dadurch gekennzeichnet, daß man ein Chlor-nitro- benzolsulfochlorid der Formel mit einem Amin oder Alkoholat der Formel H-R¹, wobei R¹ die obengenannte Bedeutung hat, in das entsprechende Chlor-nitro-sulfonsäurederivat überführt und anschließend in Anwesenheit von Na₂S einen Chlor-Sulfid-Austausch und dann eine Oxidation durchführt, wodurch man ein symmetrisches Disulfid erhält oder
daß man ein durch Chlor-Sulfid-Austausch erhaltenes Mercapto-nitro-benzol-sulfonsäurederivat der Formel worin R¹ die obengenannte Bedeutung hat
mit einem substituierten Phenylsulfensäurechlorid der Formel worin X und Y die obengenannte Bedeutung haben
umsetzt, wodurch man ein asymmetrisches Disulfid erhält.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4962019A (en) * 1986-10-10 1990-10-09 Miles Inc. Indicators for the detection of thiol groups

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8710882D0 (en) * 1987-05-08 1987-06-10 Health Lab Service Board Estimation of reduced pyridine nucleotides
US5274725A (en) * 1991-02-06 1993-12-28 Bottoms Jack Jr Tight buffered fiber optic groundwire cable
US5933567A (en) * 1993-01-13 1999-08-03 Hitachi America, Ltd. Method and apparatus for controlling the position of the heads of a digital video tape recorder during trick play operation and for recording digital data on a tape
US5446090A (en) * 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
US7723118B2 (en) * 2002-10-18 2010-05-25 Alt Bioscience, Llc. Compositions and methods for simultaneous detection of volatile sulfur compounds and polyamines
US8129193B2 (en) * 2009-07-30 2012-03-06 Anaspec Incorporated Thiol quantitation assays and related methods

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3119668A (en) * 1959-01-26 1964-01-28 Dow Chemical Co Sulfhydryl tests and compounds therefor
NL120355C (de) * 1960-05-20
US3698866A (en) * 1971-05-24 1972-10-17 Arequipa Foundation Spectrophotometric method and reagents for quantitative determination of thiols
US3982018A (en) * 1973-08-08 1976-09-21 Ciba-Geigy Corporation 4-Ethers of 3-amino-5-sulfamoylbenzoic acids
SU613590A1 (ru) * 1976-06-18 1983-01-15 Предприятие П/Я А-7850 Производные 4,4-диазидостильбен-2,2-дисульфокислоты в качестве фотосшивающих агентов
DE3130844A1 (de) * 1981-08-04 1983-02-24 Bayer Ag, 5090 Leverkusen Neue n,n-disubstituierte sulfonamidgruppen aufweisende aromatische diisocyanate, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung als aufbaukomponente bei der herstellung von polyurethanen
US4615972A (en) * 1983-11-04 1986-10-07 Immuno Concepts, Inc. Stabilization of indicators for detecting enzyme activity
JPS618759A (ja) * 1984-06-20 1986-01-16 Toshiba Corp トラツキング制御方式
CH670709A5 (de) * 1986-04-24 1989-06-30 Univ Moskovsk
DE3634525A1 (de) * 1986-10-10 1988-04-21 Miles Lab Testmittel und indikatoren zum nachweis von thiolgruppen und verfahren zu deren herstellung
CS274299B2 (en) * 1989-01-27 1991-04-11 Vaclav Pistek Pressure packing
DE3909818A1 (de) * 1989-03-24 1990-09-27 Pohl Metall Kunststoff Spender
JPH09184A (ja) * 1995-06-19 1997-01-07 Haruzou Nishida 穀類及び麺類保存処理方法並びに水蒸気加熱装置付き食品

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4962019A (en) * 1986-10-10 1990-10-09 Miles Inc. Indicators for the detection of thiol groups
US4994570A (en) * 1986-10-10 1991-02-19 Miles Inc. Indicators for the detection of thiol groups

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