DE3634525A1 - Testmittel und indikatoren zum nachweis von thiolgruppen und verfahren zu deren herstellung - Google Patents
Testmittel und indikatoren zum nachweis von thiolgruppen und verfahren zu deren herstellungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft Indikatoren und Mittel zum Nachweis
von Thiolgruppen, die in einem System vorhanden
sind oder in einem der Nachweisreaktion vorgelagerten
Schritt gebildet werden. Verfahren zur Herstellung der
Indikatoren werden ebenfalls beschrieben. Die Bildung
der Thiolgruppen kann durch chemische Reaktionen, wie
z. B. Reduktion von Disulfiden, oder biochemische Reaktionen
erfolgen. Die bevorzugten biochemischen Reaktionen,
die zur Bildung von Thiolgruppen führen, werden
durch das folgende Formelschema verdeutlicht:
Es sind zahlreiche Methoden zum Nachweis von Thiolgruppen
enthaltenden Verbindungen bekannt. Eine besonders
häufig zitierte Methode ist die von G. H. Ellman in
"Arch. Biochem. Biophys. 1959, 82, 70-77" beschriebene,
die auf der Bildung des gelben Anions der 3-Mercapto-6-
nitro-benzoesäure beruht, das durch Reaktion zwischen
einem Thiol und der 3,3′-Dithio-bis-6-nitro-benzoesäure
(Ellmans Reagenz) entsteht.
Die Reaktion ist empfindlich und schnell. Allerdings ist
das Anion des Ellman Reagenzes sehr oxidationsempfindlich
und somit die entstandene Färbung instabil. Außerdem
ist das Ellman Reagenz in polaren Lösungsmitteln,
wie z. B. Wasser, sehr schwer löslich und somit für
manche Thiol-Lösungen, besonders diejenigen, die biochemisch
in wäßrigen Systemen dargestellt werden, nur
bedingt brauchbar.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen
Formel I
worin
Xfür Wasserstoff oder -SO₂R¹, Yfür Wasserstoff oder -NO₂,
Xfür Wasserstoff oder -SO₂R¹, Yfür Wasserstoff oder -NO₂,
R² und R³unabhängig voneinander für Wasserstoff, C₁-C₄-
Alkyl, das substituiert sein kann durch Halogen,
-COOH, Cyano, C₁-C₄-Alkoxy, Hydroxy, -OSO₃H, -SO₃H,
Amino, wobei die Aminogruppe ihrerseits durch
gegebenenfalls mit Halogen, Hydroxy, Cyano, -OSO₃H,
-SO₃H substituiertes C₁-C₄-Alkyl, Phenyl oder
Benzylgruppen substituiert sein kann, stehen, oder
R² und R³gemeinsam mit dem N-Atom für einen Pyrrolidin-,
Pyrazolin-, Piperidin-, Piperazin- oder Morpholinring
stehen, der durch C₁ bis C₄-Alkyl oder
Phenyl substituiert sein kann,
weisen diese Nachteile nicht auf.
Besonders bevorzugt sind Verbindungen der allgemeinen
Formel II
worin X, Y und R¹ die oben angegebene Bedeutung haben.
Von besonderem Interesse sind Verbindungen der allgemeinen
Formel III
worin X, Y und R¹ die oben angegebene Bedeutung haben.
Ganz besonders bevorzugt sind Verbindungen der allgemeinen
Formel IV
worin R¹ die oben angegebene Bedeutung hat.
Steht R¹ für
worin R² verschieden von Wasserstoff ist, R² und R³ ansonsten
aber die gleiche Bedeutung wie oben angeführt haben, so
sind die Verbindungen als solche neu.
Von ganz besonderem Interesse sind Verbindungen der allgemeinen
Formel V
worin R² und R³ die bei der Formel I angegebene Bedeutung
haben.
Ganz besonders bevorzugt sind Verbindungen der allgemeinen
Formel VI
worin R² und R³ die bei der Formel I beschriebene Bedeutung
haben.
Die Herstellung der Verbindungen I erfolgt nach in den
Einzelschritten bekannten Verfahren.
Hergestellt werden die Verbindungen der Formel I, indem
man ein Chlor-nitro-benzolsulfochlorid der Formel
mit einem Amin oder Alkoholat der Formel H-R¹
wobei R¹ die obengenannte Bedeutung hat,
in das entsprechende Chlor-nitro-benzolsulfonsäurederivat überführt und anschließend in Anwesenheit von Na₂S einen Chlor-Sulfid-Austausch und darauf eine Oxidation durchführt, wodurch man ein symmetrisches Disulfid erhält. Asymmetrische Disulfide der Formel I werden hergestellt, indem man ein durch Chlor-Sulfid-Austausch erhaltenes Mercapto-nitro-benzol-sulfonsäurederivat der Formel
wobei R¹ die obengenannte Bedeutung hat,
in das entsprechende Chlor-nitro-benzolsulfonsäurederivat überführt und anschließend in Anwesenheit von Na₂S einen Chlor-Sulfid-Austausch und darauf eine Oxidation durchführt, wodurch man ein symmetrisches Disulfid erhält. Asymmetrische Disulfide der Formel I werden hergestellt, indem man ein durch Chlor-Sulfid-Austausch erhaltenes Mercapto-nitro-benzol-sulfonsäurederivat der Formel
worin R¹ die obengenannte Bedeutung hat,
mit einem substituierten Phenylsulfensäurechlorid der Formel
mit einem substituierten Phenylsulfensäurechlorid der Formel
worin X und Y die obengenannte Bedeutung haben, umsetzt.
Das folgende Schema zeigt beide Wege der Synthese:
a) Symmetrische Disulfide
a) Symmetrische Disulfide
b) Asymmetrische Disulfide
Die Verbindungen der allgemeinen Formel I können besonders
gut als Indikatoren in Testmitteln für Thiole oder
Thiolvorläufer wie z. B. Liponamid, Glutathion oder
Coenzym A eingesetzt werden.
Unter Testmittel oder Testsystem im Rahmen der vorliegenden
Erfindung sind z. B. solche zu verstehen, die in
einer Küvette vermessen werden können. Die Testmittel
enthalten neben den Verbindungen der allgemeinen Formel
(I) alle für den der jeweiligen Analysesubstanz notwendigen
Reagenzien wie Enzyme, Substrate, Coenzyme, Effektoren,
Antigene, Antikörper usw. Weiterhin können diese
Testmittel noch nicht reagierende Substanzen wie z. B.
Puffer, Netzmittel und Stabilisatoren enthalten. Als
Thiolgruppen-bildende Enzyme sind zu nennen Thiolglykosidasen,
Thioetherhydrolasen und auch Esterasen wie z. B.
die Cholinesterase. Weiterhin zu nennen sind Enzyme, die
mit Hilfe von NADH und NADPH als Coenzym Thiolgruppen
bilden wie die Liponamiddehydrogenase und die Glutathionreduktase.
Die letztgenannten Enzyme können in
Testsystemen eingesetzt werden, bei denen NADH oder
NADPH gebildet wird. Solche Reaktionen sind die bekannten
durch Dehydrogenasen katalysierten Oxidationen
von Substraten. Aus den genannten Reagenzien und Substanzen
können Reagenzkombinationen hergestellt werden,
die als Lösung, als Pulver vermischt, als Tabletten oder
als Lyophylisat vorliegen. Die Reagenzkombination (falls
sie nicht schon als Lösung vorliegt) wird mit Wasser
oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel aufgenommen
und zu einer Reagenzlösung bereitet. Besteht die Reagenzkombination
aus einzelnen Komponenten so sind diese
miteinander zu mischen. Nach Vermischen der Probe (z. B.
Substratlösung, Enzymlösung, Blut, Serum, Plasma oder
Urin) mit einem aliquoten Teil der Reagenzmischung wird
die entstehende Farbe am Photometer vermessen und über
den molaren Extinktionskoeffizienten und die zugesetzten
Reagenz- bzw. Probevolumina die jeweilige Konzentration
bzw. Substratkonzentration berechnet. Es sind sowohl
kinetische als auch Endpunktmessungen möglich.
Ebenso können die Verbindungen der allgemeinen Formel
(I) zusammen mit dem/den für den jeweiligen Parameternachweis
notwendigen Reagenzien bzw. anderen Enzymen,
dem Puffersystem, gegebenenfalls Netzmitteln und Aktivatoren
sowie anderen Hilfsstoffen auf saugfähigen
Reagenzträgern wie Papieren, Vliesen etc. imprägniert
werden. Dazu kann man eine oder mehrere Imprägnierlösungen
in Form von wäßrigen oder organischen bzw. gemischten
Lösungen herstellen, je nachdem wie sich die
Reagenzien oder Hilfsstoffe lösen. Mit diesen Lösungen
werden saugfähige oder quellfähige Träger, vorzugsweise
Filterpapier oder saugfähige Glas- oder Kunststoffvliese,
imprägniert oder besprüht. Anschließend wird getrocknet.
Die so hergestellten Reagenzträger können entweder
als Schnelldiagnostica zur direkten Bestimmung von
Inhaltsstoffen von Flüssigkeiten (z. B. in Körperflüssigkeiten
wie Blut, Urin oder Speichel, oder in Lebensmitteln
z. B. Fruchtsäften, Milch o. a.) eingesetzt werden.
Die Flüssigkeit wird dabei direkt auf den Reagenzträger
gebracht und dieser kurz in die Flüssigkeit eingetaucht.
Eine semi quantitative Bestimmung ist möglich,
indem man die so entstandene Farbe einer Vergleichsfarbe
zuordnet. Eine quantitative Auswertung läßt sich remissionsphotometrisch
durchführen.
Ebenso ist es möglich die Verbindungen der allgemeinen
Formel (I) in Trägermatrices einzubringen, die aus Gießlösungen
hergestellt wurden. Beispielhaft sind hier Cellulose,
Cellulosederivate, Gelatine, Gelatinederivate
oder auch Kunststoffe wie Polyurethane und Acrylamid zu
nennen. Dabei ist es vorteilhaft, wenn die Verbindungen
der allgemeinen Formel (I) und gegebenenfalls die anderen
notwendigen Reagenzien der Gießlösung direkt zugesetzt
werden, wodurch es möglich wird, die Testvorrichtung,
bestehend aus Träger und Reagenzien, in einem Arbeitsgang
herzustellen.
Durch Eluieren der vorweggenannten Reagenzien mit Wasser
bzw. Puffer oder Serum aus dem saugfähigen Träger läßt
sich eine Reagenzlösung herstellen, mit der man wie oben
beschrieben Substrate oder Enzyme in der Küvette am
Photometer bestimmen kann.
Geeignete Puffer für die genannten Testmittel sind Phosphat-,
Citrat-, Borat-, GOOD-Puffer mit Alkali- oder Ammoniumgegenionen.
Andere Systeme sind jedoch ebenfalls
brauchbar. Als pH-Werte sind 6 bis 10, insbesondere 6,5
bis 7,5 anzustreben.
Netzmittel sind insbesondere anionische und kationische
Netzmittel, die mit den erfindungsgemäßen Verbindungen
ionische Wechselwirkungen eingehen. Nichtionogene Netzmittel,
die die Enzyme aktivieren, sind jedoch ebenfalls
brauchbar, Natriumlaurylsulfat, Dioctylnatriumsulfosuccinat
und Alkylarylpolyetheralkohole werden bevorzugt.
Als Effektoren sind die für die jeweilige enzymatische
Reaktion bekannten einzusetzen.
Als sonstige Hilfsstoffe können übliche Verdicker, Lösungsvermittler,
Emulgatoren, optische Aufheller, Kontrastmittel
etc. sinnvoll sein, wie sie in entsprechenden
Testen mit anderen Chromogenen bekannt sind.
Zu einer Lösung von 120 g Natriumsulfid · 9 H₂O in 750 ml
Wasser gibt man 130 g des Natriumsalzes der 2-Chlor-5-
nitrobenzolsulfonsäure. Man läßt 10 Stunden bei Raumtemperatur
rühren und säuert die Lösung an. Mit Hilfe von
Stickstoff entfernt man den entstandenen Schwefelwasserstoff.
Anschließend stellt man mit Natronlauge einen pH-
Wert von 10 ein und führt die Oxidation zum Disulfid mit
125 g Iod durch. Während der Iod-Zugabe muß der pH-Wert
ständig mit Natronlauge nachreguliert werden. Nach beendeter
Oxidation wird ein pH-Wert von 7,5 eingestellt und
die folgende Verbindung mit 20%-Kochsalz ausgesalzen.
In einer Lösung aus 500 ml Wasser und 126 g Natriumsulfit
werden 101 g 3,4-Dinitro-chlorbenzol 30 Stunden zum
Rückfluß erhitzt. Man läßt abkühlen und kristallisiert
den ausgefallenen gelben Niederschlag der folgenden
Formel aus Wasser um.
25,9 g des oben hergestellten Natriumsalzes der 3-Chlor-
6-nitro-benzolsulfonsäure werden bei Raumtemperatur zu
einer Lösung von 25,0 g Natriumsulfid · 9 H₂O in 250 ml
Wasser gegeben. Nach 5 Stunden Reaktionszeit (DC-Kontrolle)
säuert man die Lösung an, entfernt mit Stickstoff
den entstandenen Schwefelwasserstoff und klärt anschließend
über Aktivkohle. Das gelbe Filtrat mit der
Mercaptoverbindung der folgenden Struktur
wird anschließend mit Natronlauge auf pH 10 gestellt und
mit 25 g Iod oxidiert. Der pH-Wert wird während der Oxidation
durch Zugabe von Natronlauge gehalten. Das entstandene
Disulfid wird mit Kochsalz ausgesalzen und aus
Wasser umkristallisiert. Es wird durch das folgende ¹³C-
NMR-Spektrum charakterisiert.
¹³C-Shifts in DMSO-D₆
C-Atomeδ [ppm]
C-1/C-1138.300
C-2/C-2126.478
C-3/C-3140.481
C-4/C-4127.248
C-5/C-5123.948
C-6/C-6146.616
Man löst 50,0 g N-Methyl-piperazin in 300 ml Chloroform.
Nach Zugabe von 69 ml Triethylamin trägt man bei Raumtemperatur
128 g 2-Chlor-5-nitrobenzolsulfonsäurechlorid
ein. Nach 5 Stunden gießt man den Ansatz auf Eis und extrahiert
das entstandene Sulfonamid der folgenden Formel
mit Chloroform.
Zu einer Lösung von 63,9 g der oben hergestellten Nitroverbindung
in 300 ml Ethanol tropft man eine frisch bereitete
Natriumdisulfid-Lösung, die man aus 48,0 g
Natriumsulfid · 9 H₂O in 250 ml Ethanol mit 6,4 g Schwefel
erhält. Man kocht 2 Stunden am Rückflußkühler und trägt
den Ansatz anschließend in 1 l Eiswasser aus. Das ausgefallene
hellgelbe Produkt wird abgesaugt und kristallisiert
aus Ethanol mit dem Schmelzpunkt 205°C.
Zu einer Mischung aus 50 ml Phosphoroxychlorid und 25 g
Phosphorpentachlorid gibt man bei 80°C portionsweise
25,9 g des Natriumsalzes der 3-Chlor-6-nitrobenzolsulfonsäure.
Nach 2 Stunden ist die HCl-Entwicklung abgeklungen.
Man rotiert die Lösung ein, nimmt den Rückstand
in Toluol auf, wäscht die Toluolphase mit Eiswasser,
trocknet den Extrakt und rotiert nochmals ein. Das Sulfochlorid
der folgenden Formel bleibt als hellkristalline
Masse zurück.
25,6 g des 3-Chlor-6-nitrobenzolsulfochlorids in 100 ml
Chloroform gelöst tropft man bei Raumtemperatur zu
250 ml Chloroform, in dem sich eine Mischung aus 10,0 g
N-Methylpiperazin und 11 ml Triethylamin befinden. Nach
dem Reaktionsende trägt man auf Eis aus, extrahiert mit
Chloroform und isoliert so das folgende Sulfonamid.
Man gibt anschließend 31,95 g des oben hergestellten
Sulfonamids bei Raumtemperatur zu einer Suspension von
25,0 g Natriumsulfid · 9 H₂O in 100 ml DMF. Nach 1 Std. ist
der Chlor-Sulfid-Austausch beendet. Der Reaktionsansatz
wird auf Eis ausgetragen, angesäuert und abgesaugt. Man
erhält 27,3 g der folgenden Mercapto-Verbindung.
Man löst 15,85 g der oben hergestellten Mercapto-Verbindung
in einer Mischung aus 200 ml Ethanol und 50 ml Triethylamin
und gibt anschließend portionsweise 12,5 g Iod
hinzu. Das Reaktionsende wird durch den Farbumschlag von
rotbraun nach gelb angezeigt. Man trägt das Reaktionsprodukt
auf Eis aus und saugt den hellgelben Niederschlag
ab. Das aus Chloroform/Ethanol umkristallisierte
Disulfid der folgenden Konstitution schmilzt ab 173°C
(Zers.).
Man löst 58,0 g Natriumphenolat in 300 ml Wasser. Hierzu
gibt man portionsweise bei Raumtemperatur 128 g des 4-
Chlor-5-nitrobenzolsulfonsäurechlorids. Man läßt über
Nacht rühren und saugt das ausgefallene Produkt der folgenden
Formel ab.
Man suspendiert 25,0 g Natriumsulfid · 9 H₂O in 100 ml DMF
und fügt anschließend bei Raumtemperatur 91,3 g des 4-
Chlor-5-nitro-benzolsulfonsäurephenylesters hinzu. Nach
1 Std. trägt man auf Eis aus, säuert an und saugt die
Mercapto-Verbindung ab.
15,55 g der oben hergestellten Mercaptoverbindung werden
in 200 ml Ethanol und 50 ml Triethylamin gelöst. Durch
Zugabe von 12,0 g Iod wird die Mercaptoverbindung ins
Disulfid übergeführt. Die Verbindung der folgenden Formel
schmilzt bei 148-151°C.
Zu einer Lösung von 27,9 g 4-Mercapto-5-nitro-benzolsulfonsäurephenylester
in 500 ml Chloroform tropft man eine
Lösung von 19,0 g 4-Nitrobenzolsulfensäurechlorid in
200 ml Chloroform bei 0°C. Mit einem trockenen Stickstoffstrom
sorgt man für die Entfernung des entstehenden
HCl-Gases. Nach Beendigung der Reaktion wird der Ansatz
einrotiert und der Rückstand aus Ethanol umkristallisiert.
Man erhält 39,8 g des folgenden Disulfids.
3,04 g des nach Beispiel 4 hergestellten 3-Mercapto-6-
nitrobenzolsulfonsäuremorpholids werden in 50 ml Methylenchlorid
gelöst. Unter Eiskühlung tropft man eine Lösung
von 2,0 g 4-Nitrobenzolsulfensäurechlorid in 30 ml
Methylenchlorid hinzu. Das entstehende HCl-Gas wird mit
einem Stickstoffstrom entfernt. Nach Beendigung der
Reaktion wird das Methylenchlorid im Vakuum abgezogen
und der Rückstand aus Acetonitril umkristallisiert. Man
erhält 4,5 g der folgenden Verbindung.
Nach den in den Beispielen 1 bis 7 beschriebenen Methoden
sind die folgenden Disulfate hergestellt worden.
Zur Prüfung der Verbindung aus Beispiel 2 als Indikator
für NADH in dem beschriebenen Testsystem wurde die Verbindung
20 mM in Wasser gelöst. In einer Küvette wurden
folgende Reagenzbestandteile zusammenpipettiert:
1810 µl Puffer (0,1 M/l Tris, pH 7)
100 µl Verbindung Beispiel 2 (20 mmol/l in H₂O)
50 µl Liponamid (50 mmol/l)
20 µl Liponamid-Dehydrogenase (1200 kU/l)
100 µl Verbindung Beispiel 2 (20 mmol/l in H₂O)
50 µl Liponamid (50 mmol/l)
20 µl Liponamid-Dehydrogenase (1200 kU/l)
Nach Messung des Reagenzien-Leerwertes wurde die Reaktion
durch Zugabe von 20 µl NADH gestartet. Das gemessene
Extinktionsmaximum liegt bei 400 nm. Kinetische
Untersuchungen ergaben einen stabilen Endpunkt (Extinktionsveränderung
innerhalb 20 Minuten <1%) bereits
nach einer Reaktionszeit von 1 Minute.
Zur Prüfung der Funktionsfähigkeit und Linearität wurden
im Testansatz NADH-Konzentrationen im Bereich 1-10 mmol/l
gemessen. Die gemessenen Extinktionsdifferenzen
bei 400 nm sind in Tabelle 1 zusammengestellt.
Tabelle 2 zeigt die Resultate der Prüfung auf Störungen
durch Ascorbinsäure. Für diese Prüfung werden dem obigen
Ansatz 20 µl einer NADH-Lösung (5 mmol/l) und noch 20 µl
einer Ascorbinsäurelösung von 1 mmol/l zugesetzt und
die resultierenden Extinktionen gemessen.
Die gemessenen Werte in Anwesenheit von Ascorbinsäure
liegen im Mittel um 0,7% über den Werten, die in Abwesenheit
von Ascorbinsäure gemessen wurden. Der vorliegende
Test wird durch Ascorbinsäure nicht beeinflußt.
Prüfung der Verbindung aus Beispiel 1. Es wurden gleiche
Reaktionsbedingungen wie in Beispiel 37 gewählt. Als
Puffer wurde jedoch 0,1 M Tris pH 9 gewählt, da mit dieser
Substanz bei pH 9 eine schnellere Reaktion (Endpunkt
innerhalb 1 Minute) als pH 7 erzielt wurde.
Das gemessene Absorptionsmaximum liegt bei 425 nm. Die
Färbung ist innerhalb der gemessenen Zeit (20 min)
stabil.
Die Prüfung der Ascorbinsäureinterferenz wurde analog
Beispiel 37 durchgeführt. Tabelle 3 zeigt die
Ergebnisse.
In Anwesenheit von Ascorbinsäure liegen die Werte im
Mittel um 0,2% höher. Der vorliegende Test wird durch
Ascorbinsäure nicht gestört.
Tabelle 4 zeigt die Funktions- und Linearitätsprüfung
nach Zugabe von NADH-Konzentrationen im Bereich 1-10 mmol/l.
Zur Bestimmung der Extinktionsmaxima wurden weitere Verbindungen
in DMF gelöst und jeweils 50 µl der Lösung mit
2 ml 0,1 M/l Tris-Puffer pH 9 und 10 µl Mercaptoethanol
versetzt. In Tabelle 5 sind die Extinktionsmaxima
wiedergegeben.
Extinktionsmaximum
Beispiel 34420 nm
Beispiel 36434 nm
Beispiel 35464 nm
Beispiel 16445 nm
Claims (15)
1. Testmittel zum Nachweis von Thiolgruppen, enthaltend
als Indikator für die Thiolgruppen Verbindungen
der allgemeinen Formel I
worinXfür Wasserstoff oder -SO₂R¹,
Yfür Wasserstoff oder -NO₂,
R² und R³unabhängig voneinander für Wasserstoff,
C₁-C₄-Alkyl, das substituiert sein kann durch
Halogen, -COOH, Cyano, C₁-C₄-Alkoxy, Hydroxy,
-OSO₃H, -SO₃H, Amino, wobei die Aminogruppe
ihrerseits durch gegebenenfalls mit Halogen,
Hydroxy, Cyano, -OSO₃H substituiertes
C₁-C₄-Alkyl, Phenyl oder Benzylgruppen substituiert
sein kann, stehen, oder
R² und R³gemeinsam mit dem N-Atom für einen Pyrrolidin-,
Pyrazolin-, Piperidin-, Piperazin-
oder Morpholinring stehen, der durch C₁ bis
C₄-Alkyl oder Phenyl substituiert sein kann.
2. Mittel gemäß Anspruch 1, enthaltend Verbindungen
der allgemeinen Formel II
worin X, Y und R¹ die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung
haben.
3. Mittel gemäß den Ansprüchen 1 und 2, enthaltend
Verbindungen der allgemeinen Formel III
worin X, Y und R¹ die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung
haben.
4. Mittel gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, enthaltend
Verbindungen der allgemeinen Formel IV
worin R¹ die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat.
5. Mittel gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, enthaltend
Verbindungen der allgemeinen Formel V
worin R² und R³ die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung
haben.
6. Mittel gemäß den Ansprüchen 1 bis 5, enthaltend
Verbindungen der allgemeinen Formel VI
worin R² und R³ die in Anspruch 1 beschriebene Bedeutung
haben.
7. Mittel gemäß den Ansprüchen 1 bis 6, zusätzlich
enthaltend eine oder mehrere Substanzen aus der
Gruppe Enzyme, Substrate, Coenzyme, Effektoren,
Antigene, Antikörper, Puffer, Netzmittel und Stabilisatoren.
8. Verwendung des Mittels gemäß den Ansprüchen 1 bis
7 zum Nachweis von Thiolgruppen in einer Probe.
9. Verbindungen der allgemeinen Formel I
worinXfür Wasserstoff oder -SO₂R¹,
Yfür Wasserstoff oder -NO₂,
R³Wasserstoff, C₁-C₄-Alkyl, das substituiert
sein kann durch Halogen, -COOH, Cyano, C₁-C₄-
Alkoxy, Hydroxy, -OSO₃H, -SO₃H, Amino, wobei
die Aminogruppe ihrerseits durch gegebenenfalls
mit Halogen, Hydroxy, Cyano, -OSO₃H,
-SO₃H substituiertes C₁-C₄-Alkyl, Phenyl oder
Benzylgruppen substituiert sein kann, steht,
R²außer Wasserstoff die gleiche Bedeutung hat
wie R³, oder
R² und R³gemeinsam mit dem N-Atom für einen Pyrrolidin-,
Pyrazolin-, Piperidin-, Piperazin-
oder Morpholinring stehen, der durch C₁ bis
C₄-Alkyl oder Phenyl substituiert sein kann.
10. Verbindungen der allgemeinen Formel II
worin X, Y und R¹ die in Anspruch 9 angegebene Bedeutung
haben.
11. Verbindungen der allgemeinen Formel III
worin X, Y und R¹ die in Anspruch 9 angegebene Bedeutung
haben.
12. Verbindungen der allgemeinen Formel IV
worin R¹ die in Anspruch 9 angegebene Bedeutung hat.
13. Verbindungen der allgemeinen Formel V
worin R² und R³ die in Anspruch 9 angegebene Bedeutung
haben.
14. Verbindungen der allgemeinen Formel VI
worin R² und R³ die in Anspruch 9 beschriebene Bedeutung
haben.
15. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der
allgemeinen Formel I
worinXfür Wasserstoff oder -SO₂R¹,
Yfür Wasserstoff oder -NO₂,
R³Wasserstoff, C₁-C₄-Alkyl, das substituiert
sein kann durch Halogen, -COOH, Cyano, C₁-C₄-
Alkoxy, Hydroxy, -OSO₃H, -SO₃H, Amino, wobei
die Aminogruppe ihrerseits durch gegebenenfalls
mit Halogen, Hydroxy, Cyano, -OSO₃H,
-SO₃H substituiertes C₁-C₄-Alkyl, Phenyl oder
Benzylgruppen substituiert sein kann, steht,
R²außer Wasserstoff die gleiche Bedeutung hat
wie R³ oder
R² und R³gemeinsam mit dem N-Atom für einen Pyrrolidin-,
Pyrazolin-, Piperidin-, Piperazin-
oder Morpholinring stehen, der durch C₁ bis
C₄-Alkyl oder Phenyl substituiert sein kann,dadurch gekennzeichnet, daß man ein Chlor-nitro-
benzolsulfochlorid der Formel
mit einem Amin oder Alkoholat der Formel H-R¹,
wobei R¹ die obengenannte Bedeutung hat, in das
entsprechende Chlor-nitro-sulfonsäurederivat überführt
und anschließend in Anwesenheit von Na₂S
einen Chlor-Sulfid-Austausch und dann eine Oxidation
durchführt, wodurch man ein symmetrisches
Disulfid erhält oder
daß man ein durch Chlor-Sulfid-Austausch erhaltenes Mercapto-nitro-benzol-sulfonsäurederivat der Formel worin R¹ die obengenannte Bedeutung hat
mit einem substituierten Phenylsulfensäurechlorid der Formel worin X und Y die obengenannte Bedeutung haben
umsetzt, wodurch man ein asymmetrisches Disulfid erhält.
daß man ein durch Chlor-Sulfid-Austausch erhaltenes Mercapto-nitro-benzol-sulfonsäurederivat der Formel worin R¹ die obengenannte Bedeutung hat
mit einem substituierten Phenylsulfensäurechlorid der Formel worin X und Y die obengenannte Bedeutung haben
umsetzt, wodurch man ein asymmetrisches Disulfid erhält.
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