DE69125939T2 - N-acetylcarboxymethylchitosanderivat und verfahren zur herstellung - Google Patents
N-acetylcarboxymethylchitosanderivat und verfahren zur herstellungInfo
- Publication number
- DE69125939T2 DE69125939T2 DE69125939T DE69125939T DE69125939T2 DE 69125939 T2 DE69125939 T2 DE 69125939T2 DE 69125939 T DE69125939 T DE 69125939T DE 69125939 T DE69125939 T DE 69125939T DE 69125939 T2 DE69125939 T2 DE 69125939T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- gly
- complex
- group
- radical
- compound
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 156
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 132
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 claims abstract description 61
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims abstract description 31
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims abstract description 24
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims abstract description 13
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical group C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 claims description 70
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 claims description 70
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 46
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 39
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 29
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 26
- -1 p-methoxybenzyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 claims description 24
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 16
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 16
- 238000001838 alkalimetric titration Methods 0.000 claims description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 11
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 claims description 10
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 claims description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 8
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 6
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid group Chemical group C(CCC(=O)O)(=O)O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 3
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 42
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 38
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 38
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 abstract description 11
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 abstract description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 abstract 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 abstract 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 abstract 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 abstract 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 71
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 60
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 58
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 55
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 39
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 39
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 31
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 30
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 30
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 29
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 29
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 27
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 25
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 24
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 23
- 101000629400 Homo sapiens Mesoderm-specific transcript homolog protein Proteins 0.000 description 22
- 102100026821 Mesoderm-specific transcript homolog protein Human genes 0.000 description 22
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 22
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 18
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 18
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 16
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 16
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 16
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 16
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 16
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 15
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 14
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 13
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 12
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 12
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 12
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 12
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 12
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 12
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 12
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 11
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- CTBWFKIXEVMTRA-IANFNVNHSA-N 2-[(3R,4R,5S,6R)-3-amino-2,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]acetic acid Chemical group C(=O)(O)CC1(O)[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO CTBWFKIXEVMTRA-IANFNVNHSA-N 0.000 description 9
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 8
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 8
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 8
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 7
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 7
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 7
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 description 4
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 4
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 4
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 4
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 3
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 3
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 3
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 3
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 3
- 238000010809 targeting technique Methods 0.000 description 3
- WUBPNOATEITJJC-QNRYFBKSSA-N 2-[(3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]acetic acid Chemical group C(C)(=O)N[C@H]1C(O)(O[C@@H]([C@H]([C@@H]1O)O)CO)CC(=O)O WUBPNOATEITJJC-QNRYFBKSSA-N 0.000 description 2
- GVUGADOWXGKRAE-SRVKXCTJSA-N 4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-(4-nitroanilino)-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 GVUGADOWXGKRAE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- WETWJCDKMRHUPV-UHFFFAOYSA-N acetyl chloride Chemical compound CC(Cl)=O WETWJCDKMRHUPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012346 acetyl chloride Substances 0.000 description 2
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 2
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002485 combustion reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 229960000975 daunorubicin Drugs 0.000 description 2
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 2
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 150000003214 pyranose derivatives Chemical group 0.000 description 2
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 2
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- ZYJPUMXJBDHSIF-NSHDSACASA-N (2s)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]-3-phenylpropanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ZYJPUMXJBDHSIF-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- KKAJSJJFBSOMGS-UHFFFAOYSA-N 3,6-diamino-10-methylacridinium chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(N)C=C2[N+](C)=C(C=C(N)C=C3)C3=CC2=C1 KKAJSJJFBSOMGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IYHHIHIBYVIDMJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[1-[[1-[[3-methyl-1-[[1-(4-nitroanilino)-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxobutan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)NC(C)C(=O)NC(C)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(C)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 IYHHIHIBYVIDMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HOSGXJWQVBHGLT-UHFFFAOYSA-N 6-hydroxy-3,4-dihydro-1h-quinolin-2-one Chemical group N1C(=O)CCC2=CC(O)=CC=C21 HOSGXJWQVBHGLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000238424 Crustacea Species 0.000 description 1
- 206010015719 Exsanguination Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- FEUPVVCGQLNXNP-IRXDYDNUSA-N Gly-Phe-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FEUPVVCGQLNXNP-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 208000006268 Sarcoma 180 Diseases 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 238000004847 absorption spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000012345 acetylating agent Substances 0.000 description 1
- 229940023020 acriflavine Drugs 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004453 alkoxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005277 alkyl imino group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 125000005098 aryl alkoxy carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002102 aryl alkyloxo group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000051 benzyloxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- MAEIEVLCKWDQJH-UHFFFAOYSA-N bumetanide Chemical compound CCCCNC1=CC(C(O)=O)=CC(S(N)(=O)=O)=C1OC1=CC=CC=C1 MAEIEVLCKWDQJH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004064 bumetanide Drugs 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 125000006297 carbonyl amino group Chemical group [H]N([*:2])C([*:1])=O 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- FOCAUTSVDIKZOP-UHFFFAOYSA-N chloroacetic acid Chemical compound OC(=O)CCl FOCAUTSVDIKZOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009838 combustion analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000006196 deacetylation Effects 0.000 description 1
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 229960001342 dinoprost Drugs 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001105 femoral artery Anatomy 0.000 description 1
- 210000003191 femoral vein Anatomy 0.000 description 1
- ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N furosemide Chemical compound C1=C(Cl)C(S(=O)(=O)N)=CC(C(O)=O)=C1NCC1=CC=CO1 ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003883 furosemide Drugs 0.000 description 1
- 210000004013 groin Anatomy 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N hydroxypropyl methyl cellulose Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229940127554 medical product Drugs 0.000 description 1
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- VBEGHXKAFSLLGE-UHFFFAOYSA-N n-phenylnitramide Chemical compound [O-][N+](=O)NC1=CC=CC=C1 VBEGHXKAFSLLGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003372 organotropic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- PXGPLTODNUVGFL-YNNPMVKQSA-N prostaglandin F2alpha Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)C[C@H](O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O PXGPLTODNUVGFL-YNNPMVKQSA-N 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 1
- 108010067016 succinyl-trialanine-4-nitroanilide Proteins 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- CBEQULMOCCWAQT-WOJGMQOQSA-N triprolidine Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1C(\C=1N=CC=CC=1)=C/CN1CCCC1 CBEQULMOCCWAQT-WOJGMQOQSA-N 0.000 description 1
- 229960001128 triprolidine Drugs 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
- C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
- C08B37/0027—2-Acetamido-2-deoxy-beta-glucans; Derivatives thereof
- C08B37/003—Chitin, i.e. 2-acetamido-2-deoxy-(beta-1,4)-D-glucan or N-acetyl-beta-1,4-D-glucosamine; Chitosan, i.e. deacetylated product of chitin or (beta-1,4)-D-glucosamine; Derivatives thereof
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Description
- Diese Erfindung bezieht sich auf neue N-Acetylcarboxymethylchitosan-Derivate oder N-acetylierte Carboxymethylchitosan-Derivate und auf Verfahren zur Herstellung derselben. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine in vivo Target- Technik für medizinische oder pharmazeutische Verbindungen und bezieht sich infolgedessen auf neue N-Acetylcarboxymethylchitosan-Derivate, die als hochmolekulare Trägersubstanzen vom Polysaccharid-Typ nützlich sind und für die Erhöhung der Stabilität pharmazeutischer Verbindungen im Blut, die Organotropie einer pharmazeutischen Verbindung und die Bioabbaubarkeit eines hergestellten medizinischen Produktes verwendbar sind. Diese Erfindung bezieht sich außerdem auf neue N-Acetylcarboxymethylchitosan-Derivate in komplexer Form, die an pharmazeutische Verbindungen gebunden sind.
- Bis heute wurde speziell im Bereich der pharmazeutischen Zubereitungen die Verwendung von wasserlöslichen hochmolekularen Substanzen als Trägersubstanzen für Drogen, besonders für pharmazeutische Verbindungen versucht, und eine Anzahl diesbezüglicher Techniken wurden angeboten. Diese wasserlöslichen, hochmolekularen Substanzen als Drogen-Trägersubstanzen sind schon weithin bekannt. In vielen Fällen wird ein Cellulose-Derivat wie beispielsweise Carboxymethylcellulose, Hydroxypropylcellulose oder Hydroxypropylmethylcellulose benutzt. Diese konventionellen Techniken beziehen sich jeoch auf die soge nannte unterstützende Freisetzung von Drogen und wurde nicht zu Techniken entwickelt, um eine Droge an ein Gewebe zu liefern, wo die Droge benötigt wird, sofern erforderlich nur in einer notwendigen Menge. Gegenwärtig besteht die Situation, daß noch keine zufriedenstellende Technik entwickelt worden ist, um eine wasserlösliche, hochmolekulare Substanz als Trägersubstanz zum Liefern der Droge zu benutzen. Als Beispiel gibt es die unten beschriebenen Publikationen 1) und 2). Die Publikation 1 offenbart die Verwendung von Carboxymethylchitin, als feinkörnige disperse Trägersubstanz des implantierten Typs, wohingegen die Publikation 2) den Gebrauch von carboxyliertem Dextran als Trägersubstanz für die Bildung eines Komplexes mit der Droge of fenbart.
- 1) WATANABE, K. u.a., "Chem. Pharm. Bull.," 38, 506-509, (1990), und
- 2) SEZAKI, Hitoshi, "Yakugaku Zasshi", 109, 611-621 (1989).
- Wenngleich die Technik, die in der Publikation 1) offenbart wird, Gelierfähigkeit und die in vivo Bioabbaubarkeit von Carboxymethylchitin erkennen läßt und von diesen Fähigkeiten Gebrauch macht, so ist Carboxymethylchitin von dem Typ, der an einer besonderen lokalen Stelle im Körper implantiert wird, so daß diese Technik nicht darüber hinausgeht, Drogen kontrolliert freizusetzen, und nicht erwarten läßt, die Organotropie einer Droge auf ein Krebsgewebe oder ein Organ als Ziel zu erhöhen. Andererseits bietet der Drogenkomplex, der in der Publikation 2) offenbart wird, die Möglichkeit einer ausgezeichneten Drogenzustellung, aber die funktionellen Gruppen des carboxylierten Dextrans, die für die molekulare Modifikation eines Drogenkomplexes verwendbar sind, um die Drogen leichter zuzustellen, sind auf alkoholische Hydroxylgruppen beschränkt.
- Der Stand der Technik wird auch durch die zwei folgenden Dokumente wiedergegeben:
- - EP 342 557, das vollständige und teilweise Ester eines Carboxymethyl-Derivates von Cellulose, Stärke oder Chitin oder einem seiner Salze, allein oder als Beförderungsmittel für eine pharmakologisch aktive Substanz offenbart,
- - Macromolecules, 21, 1579-1583 (1988), das sich auf Chitin-Derivate mit Polypeptidseitenketten bezieht, die durch eine Pfropfcopolimerisation von γ-Methyl-L-Glutaminsäureanhydrid an wasserlösliches Chitin hergestellt wurden. Das resultierende Material wird als Träger für bioaktive Spezies nützliches Material dargestellt.
- Im Hinblick auf die Entwicklung einer zunehmenden Anzahl von Wirkstoffen gegen Krebs, Drogen zur Heilung von Hirnkrankheiten und dergleichen gibt es einen nicht gedeckten Bedarffür die dringende Einführung einer Target-Technologie für diese Drogen unter Benutzung einer wasserlöslichen, hochmolekularen Substanz. Nichtsdestoweniger haben die bisherigen Techniken keine vällig zufriedenstellende Lösung gebracht.
- Um eine Target-Technik für Drogen - besonders für pharmazeutische Verbindungen - durch die Benutzung einer wasserlöslichen, hochmolekularen Trägersubstanz zu vervollständigen, ist es hierfür notwendigerweise erforderlich, daß ein Komplex einer Trägersubstanz mit einer Droge primär nach seiner Verabreichung auf dem Weg der introvenösen Injektion bis zu seiner Ankunft am Zielorgan im Blut stabil bleibt, d.h. mit anderen Worten, daß die Droge in der notwendigen Konzentration im Blut erhalten bleibt. Zweitens ist es wichtig, daß die Trägersubstanz im Körper einem stufenweisen Abbau unterliegt und die Trägersubstanz infolgedessen nicht über eine längere Zeit im menschlichen Körper verbleibt. Drittens ist es notwendig, daß die Trägersubstanz, die in Form eines Komplexes mit der Droge verbunden ist, selbst die Tendenz zur Organotropie in vivo zeigt.
- Deshalb muß eine Trägersubstanz zur Verfügung gestellt werden, die all diese Erfordernisse in einem erfüllt.
- Mit Blick auf die Lösung derartiger Probleme haben die Erfinder eine Vielzahl von wissenschaftlichen Forschungen fortgeführt. Als Ergebnis ist es den Erfindern jetzt gelungen, als neue Substanzen bestimmte N-Acetylcarboxymethylchitosan-Derivate, besonders N-acelytierte Carboxymethylchitosan-Derivate zu synthetisieren, indem sie eine N-Peptidkette und eine N-Acetylgruppe in Aminogruppen eines derartigen depolymerisierten Carb oxymethylchitosan einführten, das dadurch erhalten wurde, daß das vorgenannte Carboxymethylchitin einer enzymatischen Behandlung und einer Alkalibehandlung unterworfen wurde. Zusätzlich haben wir, die Erfinder, unerwarteterweise entdeckt, daß diese N-Acetylcarboxymethylchitosan-Derivate als Trägersubstanzen, die in der Lage sind, die verschiedenen oben beschriebenen Erfordernisse zu erfüllen, verwendbar sind, und daß mit ihrer Verwendung die obigen Ziele erreicht werden können. Es wurde außerdem gezeigt, daß die Auswahl geeigneter Peptidketten, wie die genannte N-Peptidkette, die eingefügt werden, den Bereich anwendbarer pharmazeutischer Verbindungen auf den weiten Bereich von Verbindungen mit Carboxylgruppen, von Verbindungen mit Aminogruppen und von alkoholischen Verbindungen erweitern kann und daß sie weiterhin die resultierenden Komplexe mit einer Tendenz zur Organotropie auf ein bestimmtes Organ in vivo bereitstellen kann. Diese Erfindung wurde basierend auf diesen Ergebnissen vervollständigt.
- Im anschließend Teil wird die Erfindung im Detail beschrieben.
- Die neuen Substanzen gemäß der Erfindung sind N-Acetylcarboxymethylchitosan-Derivate, die durch die unten angegebene allgemeine Formel (I) dargestellt sind. Diese neuen Derivate sind in einem ihrer Merkmale dadurch gekennzeichnet, daß die Wasserstoffatome von einigen der 6-Hydroxyl- und/oder 3-Hydroxyl- Gruppen von Glucosamin, das die konstituierende Zuckereinheit des Chitosans der Derivate ist, durch Carboxymethyl-Gruppen ersetzt wurden; die Wasserstoffatome der 2-Amino-Gruppen, die in einigen der Zuckereinheiten vorhanden sind, durch Acetylgruppen ersetzt wurden; und die Wasserstoffatome der 2-Aminogruppen, die in anderen Zuckereinheiten vorhanden sind, durch Peptidketten oder Aminosäuren ersetzt wurden.
- Ein neues N-Acetylcarboxymethylchitosan-Derivat gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung ist in der folgenden allgemeinen Formel (I) dargestellt:
- In der Formel (I) bedeuten R&sub1; und R&sub2; einzeln ein Wasserstoffatom oder eine Carboxymethylgruppe mit der Maßgabe, daß R&sub1; und R&sub2; nicht gleichzeitig Wasserstoffatome sind.
- Weiterhin bezeichnet in der obigen Formel P eine Gruppe R&sub3;CO-, eine Gruppe R&sub4;NH- oder eine Gruppe R&sub5;O-. Hier, in einem Beispiel, kann P an eine N-endständige Aminosäure einer N-Peptidkette gebunden sein, die das Peptid ist, das an die 2-Aminogruppe der Glocosaminbaueinheit gebunden ist und durch X repräsentiert ist. In diesem Fall bedeutet P die Gruppe R&sub3;CO-. In einem anderen Beispiel kann P an eine C-endständige Aminosäure der N-Peptidkette gebunden sein, die durch X repräsentiert wird, wobei in diesem Beispiel P die Gruppe R&sub4;NH- oder die Gruppe R&sub5;O- bedeuten kann. Im oben Gesagten wird angenommen, daß R&sub3;CO- den Rest einer Verbindung bezeichnet, die eine Carboxylgruppe aufweist, also eine Verbindung vom Typ einer Carbonsäure ist, R&sub4;NH- den Rest einer Verbindung, die eine Aminogruppe aufweist, bezeichnet und R&sub5;O- den Rest einer Verbindung, die eine Hydroxylgruppe aufweist, bezeichnet.
- Wie genauer beschrieben wird, kann die R&sub3;CO-Gruppe in vielen Beispielen eine Schutzgruppe für eine Aminogruppe oder eine Acylgruppe sein, die aus einer pharmazeutischen Verbindung vom Typ einer Carbonsäure hervorgeht. Erläuternde Beispiele solcher Amino-Schutzgruppen beinhalten Alkoxycarbonylgruppen, wie z.B. tert.-Butoxycarbonyl und Aralkyloxycarbonyl-Gruppen wie z.B. p- Methoxybenzyloxycarbonyl. Alternativ kann die R&sub3;CO-Gruppe auch eine derartige Gruppe sein, daß ihre entsprechende R&sub3;COOH eine pharmazeutische Verbindung oder eine Drogenverbindung vom Carbonsäure-Typ, z.B. Methotrexat, bezeichnet.
- Beispiele für die R&sub5;O-Gruppe enthalten niedere Alkoxylgruppen, die als Schutzgruppen für Carbonylgruppen verwendbar sind, wie z.B. die t-Butyloxygruppe; und Aralkyloxygruppen, wie z.B. die Benzyloxygruppe. Alternativ kann die R&sub5;O-Gruppe ein derartiger Rest sein, der durch das Entfernen des H von der alkoholischen Hydroxylgruppe einer pharmazeutischen Verbindung R&sub5;OH gebildet wird.
- Die R&sub4;NH-Gruppe kann eine Schutzgruppe vom Amido-Typ sein, um Carboxylgruppen zu schützen, wie z.B. eine niedere Alkyliminogruppe wie die Methyliminogruppe. Als eine Alternative kann die R&sub4;NH-Gruppe eine derartige Gruppe sein, daß ihr entsprechendes R&sub4;NH&sub2; eine pharmazeutische Verbindung vom Typ der Verbindungen darstellt, die eine oder mehrere Aminogruppen aufweisen, wie z.B. Daunorubicin oder Tripolidin.
- Q steht für H oder eine -OH-Gruppe. Q kann an die N-endständige Aminosäure der N-Peptidkette, die als X bezeichnet wird, gebunden sein. In diesem Fall steht Q für H. In einem anderen Fall kann. Q alternativ an die C-endständige Aminosäure der N-Peptidkette, die als X dargestellt ist, gebunden sein, wobei Q die - OH-Gruppe bezeichnet.
- Weiterhin repräsentiert X in der Formel (I) eine Peptidkette, die gleiche oder verschiedene ein bis zehn Aminosäuren enthält. An dieser Stelle ist zu beachten, daß eine einzelne Aminosäure ebenfalls interpretiert wird, als wäre sie durch die Peptide in dieser Spezifikation eingeschlossen. Diese "Peptidkette" sollte so interpretiert werden, daß sie nicht nur Peptidketten einschließt, die nur aus Aminosäuren zusammengesetzt sind, sondern auch solche Peptidketten, die Aminosäuren und eine oder mehrere von Aminosäuren verschiedene Verbindungen im (in) Teil(en) der Peptidkette enthalten. Im letzteren Fall kann (können) die verschiedene(n) Verbindung(en) eine zweibasische Säure, speziell eine zweibasische Carbonsäure sein, wie beispielsweise Succinsäure, die an eine zwischenständige oder endständige Aminosäure(n) in der Peptidkette eingeschoben und eingebunden werden kann, so daß die Peptidkette(n), die gleiche oder unterschiedliche Aminosäuren enthält (enthalten), als vollständiges Resultat hergestellt ist oder sind.
- Zusätzlich umfaßt das N-Acetylcarboxymethylchitosan-Derivat, das durch die Formel (I) wiedergegeben ist, seine Salze, speziell die Alkalimetallsalze an der Carboxymethylgruppe des Derivates, wie z.B. die Natrium-, die Kalium- und die Ammoniumsalze.
- In dem Derivat mit der Formel (I) gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung kann die Anzahl der Aminosäuren, die die Peptidkette X bilden, unter Berücksichtigung der Freisetzung der Drogenverbindung und der Antigenizität der Derivate im allgemeinen 1 bis 4 sein, wobei 3 bis 4 Aminosäuren im speziellen bevorzugt werden. Das folgende sind Beispiele der Bauemheit XP in den Fällen, in denen die Peptidkette X, die in XP in der Formel (I) vorkommt, eine Peptidkette repräsentiert, die einzig aus 1 bis 4 Aminosäuren zusammengesetzt ist und P an die N-endständige Aminosäure der Peptidkette gebunden ist. In solchen Fällen liegt die Peptidbindung, die in der Peptidkette X vorhanden ist, in der Form -NHCO- vor, wenn sie von der Seite der Chitosaneinheit betrachtet wird.
- P-Phe-Phe-Gly-,
- P-Gly-Phe-Gly-Gly-,
- P-Phe-Gly-Phe-Gly-,
- P-Gly-Phe-Gly-Phe-,
- P-Gly-Gly-Gly-, und
- P-Ala-Gly-Gly-Gly-.
- Nachfolgend sind Beispiele der Bauemheit XP für solche Fälle, in denen die in XP anwesende Peptidkette X eine Peptidkette repräsentiert, die eine zweibasische Säure und 1 bis 4 Aminosäuren enthält und P an die C-endständige Aminosäure der Peptidkette gebunden ist. In solchen Fällen hat die Peptidbindung, die in der Peptidkette X vorkommt, die Form CONH-, von der Seite der Chitosan-Einheit betrachtet.
- -Suc-Ala-Ala-Ala-P, und
- -Suc-Ala-Ala-Val-Ala-P,
- wobei Suc den Rest einer Succinsäure repräsentiert.
- Ferner enthalten weitere erläuternde Beispiele der Aminosäuresequenzen, die für die Peptidkette X gemäß dieser Erfindung verwendbar sind:
- (i) H-Gly-Gly-Gly-Val-Ala-OH,
- -Gly-Gly-Gly-Leu-Ala-,
- -Gly-Gly-Phe-Leu-Gly-,
- -Gly-Gly-Phe-Tyr-Ala-,
- -Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-,
- (ii)-Gly-Gly-Gly-Phe-Leu-Gly-,
- -Gly-Gly-Gly-Gly-Leu-Ala-,
- -Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly,
- (iii)-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-Leu-Gly-,
- -(Gly)&sub7;-, -(Gly)&sub5;-Leu-Ala-,
- (iv)-(Gly)&sub5;-Phe-Leu-Gly,
- -(Gly)&sub8;-
- (v)-(Gly)&sub9;-, und
- (vi)-(Gly)&sub1;&sub0;-.
- Nachfolgend sind erläuternde Beispiele von Ausgangsdrogenverbindungen, aus denen der Rest (P-) der pharmazeutischen Verbindung, der in der vorliegenden Erfindung verwendbar ist, derivatisiert werden kann:
- Methotrexat, Levadopa, Bumetanid, Furosemid, Dinoprost, Daunorubicin, Doxorubicin, Mitomycin C, Triprolidin und Acriflavin.
- Weiterhin ist die Verbindung mit der Formel (I) gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung durch ihren Carboxymethylierungsgrad, ihr Molekulargewicht (gemessen mit dem Gelfiltrationsverfahren), den Werten des Verhältnisses a/(a+b) und durch das P/X- Verhältnis (Molverhältnis) kennzeichnend spezifiziert.
- Der Carboxymethylierungsgrad wird mittels colloidaler Titration oder mittels Alkalimetrie der Verbindung mit der Formel (I) dieser Erfindung bestimmt. Im Hinblick auf das Verfahren der colloidalen Titration wird auf die folgende Publikation 3) Bezug genommen:
- 3) OKIMASU, Satoru, "Journal of the Society of Agricultural Chemistry", 32, 303-308, (1958)
- Bei der Erfindung wird das Molekulargewicht der Verbindung mit der Formel (I) gemäß dieser Erfindung mit dem Gelfiltrationsverfahren mit Dextran als Standardsubstanz bestimmt. In den nachfolgenden Beispielen wurde das Molekulargewicht der Verbindung mit der Formel (I) und anderer unter Verwendung einer "TSK-gel G4000PWXL"-Säule gemessen, die mit einer wässrigen 0,1
- M Natriumchloridlösung eluiert wurde, die mit einer Flußrate von 0,8 ml/Minute zugeführt wurde und wobei die Säulentemperatur während der Detektion mit einem Differentialrefraktometer 40ºC betrug.
- Der oben genannte Wert von a/(a+b) ist ein Wert, der z.B. "Peptid-Einführungsgrad" genannt werden kann. Bei diesem Wert repräsentiert a die Summe der Anzahl a&sub1; der Zuckereinheiten, die durch -XP substituiert wurden, plus die Anzahl a&sub2; der Zukkereinheiten, die durch -XQ substituiert wurden, und b steht für die Anzahl der acetyl-substituierten Zuckereinheiten. Jede der Zuckereinheiten der Verbindung mit der Formel (I) ist entweder mit -XP, oder mit -XQ oder mit der Acetylgruppe substitu iert, so daß a+b die Gesamtanzahl der Zuckereinheiten in dem Molekül dieser Verbindung angibt.
- Mit der folgenden Gleichung (1) wird übrigens a/(a+b) bestimmt:
- 20 wobei A den Gehalt (Gew.-%) von P in der Verbindung mit der Formel (I) bezeichnet; Mm repräsentiert das Molekulargewicht von P; M&sub5; bezeichnet das mittlere Molekulargewicht der Zuckereinheiten von N-Acetylcarboxymethylchitosan; und C steht für den Gehalt (Gew.-%) von X (wenn a&sub2; = 0) in der Verbindung mit der Formel (I). C wird gemäß der folgenden Gleichung (2) berechnet:
- C=B(100-A) 10² (2)
- wobei B den Gehalt (Gew.-%) von X (wenn a&sub1; = 0) in der Verbindung mit der Formel (I) repräsentiert. B kann durch die Messung des Peptidgehalts bestimmt werden, z.B. nach der Einführung des Peptids, aber vor der Einführung von P oder nach dem Entfernen von P aus der Verbindung mit der Formel (I). Falls die Aminosäuren in X eine charakteristische Absorption zeigen, kann dies verwendet werden, um B direkt durch UV-Absorptionsspektrophotometrie zu bestimmen. Falls die Aminosäure(n) in X keine charakteristische Absorption hat, kann B gemäß der folgenden Gleichung (3) bestimmt werden.
- wobei D den Gehalt (Gew.-%) an XP (wenn a&sub2; = 0) in der Verbindung mit der Formel (I) repräsentiert. Falls P eine charakte ristische Absorption hat, kann dies verwendet werden, um D mit der Absorptjonsspektroskopie zu bestimmen. Weiterhin gibt r einen Wert an, der durch die folgende Gleichung (4) bestimmt wird:
- r=MPX/MX (4)
- wobei MPX und MX die Molekulargewichte von XP bzw. X repräsentieren.
- Weiterhin ist das Molverhältnis P/X ein Wert, der beispielsweise als Grad der Einführung der pharmazeutischen Verbindung (P) in das Peptid (oder als Grad der Substitution mit P) bezeichnet werden kann, und der einem Wert a&sub1;/(a&sub1;+a&sub2;) entspricht. Das Molverhältnis P/X kann gemäß der folgenden Gleichung (5) bestimmt werden:
- A/Mm÷C/Mx (5)
- In der Verbindung mit der Formel (I) gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung liegt der Carboxymethylierungsgrad, das Molekulargewicht (gemessen mit dem Gelfiltrationsverfahren), der a/(a+b)-Wert und der P/X-Wert, die wie oben beschrieben berechnet werden, in den Bereichen zwischen 0,5 bis 1,2, 3.000 bis 300.000, 0,01 bis 1 bzw. 0,1 bis 1.
- Die Formel (I) in der vorliegenden Spezifikation sagt nichts darüber hinaus aus, als daß in dem Molekül der Verbindung, das durch die Formel (I) repräsentiert ist, die Anzahl der Zuckereinheiten, die mit -XP (dies sind Glucosaminzuckereinheiten) substituiert sind, gleich a&sub1; ist, die Anzahl der Zuckereinheiten, die mit -XQ substituiert sind, gleich a&sub2; ist und die Anzahl der Zuckereinheiten, die mit -COCH&sub3; substituiert sind, gleich b ist. Die Formel (I) zeigt weder an, daß die substituierten Zuckereinheiten der vorgenannten Typen sukzessiv entsprechend der Anzahl ihrer Nummern a&sub1;, a&sub2; oder b aneinander gebunden sind, noch, daß die Zuckereinheiten der vorgenannten drei Typen in der Sequenz oder Ordnung, die durch die Formel (I) ausgedrückt ist, aneinander gebunden sind.
- Zusätzlich ist auch ein teilweise N-acetyliertes Carboxymethylchitosan-Derivat, dem einige der N-Acetylgruppen, die ursprünglich in der Verbindung mit der Formel (I) vorhanden sind, fehlen, gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung ebenfalls eine neue Substanz und hat einen Nutzen, wie nachfolgend beschrieben werden wird.
- In einem zweiten Aspekt der Erfindung ist deshalb ein teilweise N-acetyliertes Carboxymethylchitosan-Derivat, das durch die nachfolgende Formel (II) beschrieben ist, zur Verfügung gestellt.
- In der Formel (II) haben R&sub1;, R&sub2; und X dieselben Bedeutungen, wie die, die für die Formel (I) definiert sind, aber die Bedeutung von P ist etwas weiter gefaßt als für seine Definition in der Formel (I). P bezeichnet H, eine Gruppe -OH, eine Gruppe R&sub3;CO-, eine Gruppe R&sub4;NH- oder eine Gruppe R&sub5;O-. In einigen Fällen kann P an die N-endständige Aminosäure der Peptidkette X gebunden sein. In diesem Fall steht P für H oder die Gruppe R&sub3;CO-. In einigen Fällen kann P auch an die C-endständige Aminosäure der Peptidkette X gebunden sein. In diesem Fall steht P für die Gruppe -OH, die Gruppe R&sub4;NH- oder die Gruppe R&sub5;O-. a, b&sub1; und b&sub2; stellen jeweils positive ganze Zahlen dar.
- Weiterhin kann die Verbindung der Formel (II) auch mittels ihres Carboxymethylierungsgrades und ihres Molekulargewichts (gemessen mit dem Gelfiltrationsverfahren), ebenso wie mittels ihres a/(a+b)-Wertes und des P/X-Molverhältnisses gekennzeichnet werden, die mit den gleichen Verfahren bestimmt werden, wie die oben genannten im Hinblick auf die Formel (I). Der Buchstabe b in dem Wert a/(a+b) in der Verbindung der Formel (II) unterscheidet sich jedoch hinsichtlich seiner Bedeutung etwas von b für die Verbindung der Formel (I), und er repräsentiert die Summe der Anzahl b&sub1; der acetyl-substituierten Zuckereinheiten plus die Anzahl b&sub2; der Zuckereinheiten, in welchen bei jeder die 2-Aminogruppe freibleibt, ohne substituiert zu werden. Diese kennzeichnenden Werte der Verbindung der Formel (II) liegen in denselben Bereichen wie diejenigen der Verbindung der Formel (I)
- Die Formel (II) in der vorliegenden Spezifikation gibt nichts darüber hinaus an, als daß in dem Molekül der Verbindung, die durch die Formel (II) repräsentiert ist, die Anzahl der Zukkereinheiten, die mit -XP substituiert sind, a ist, die Anzahl der Zuckereinheiten, die mit -COCH&sub3; substituiert sind, gleich b&sub1; ist, und die Anzahl der Zuckereinheiten, die die 2-Aminogruppen frei und unsubstituiert haben, gleich b&sub2; ist. Die Formel (II) gibt weder an, ob die Zuckereinheiten eines jeden der vorgenannten drei Typen sukzessiv hinsichtlich der Anzahl ihrer entsprechenden Nummern a, b&sub1; oder b&sub2; aneinander gebunden sind, noch ob die Zuckereinheiten dieser drei Typen in der Sequenz oder der Ordnung, die in der Formel (II) gezeigt ist, aneinander gebunden sind.
- Die Verbindung der Formel (II) kann ein, für die Synthese und das Zubereiten der Substanz der Formel (I), nützliches Zwischenprodukt sein und hat demgemäß die industrielle Anwendbarkeit und die Hauptstruktur der Verbindung, genau so wie die Verbindung der Formel (I).
- Zum Beispiel ist die Verbindung mit der Formel (II), bei der P der Rest R&sub3;CO-, R&sub4;NH- oder R&sub5;O- ist, der aus einer pharmazeutischen Verbindung derivatisiert wurde, in der Lage, die Verbindung der Formel (I) in der Form des Komplexes, der an die pharmazeutische Verbindung gebunden ist, zu liefern, wenn die Aminogruppen der Vorgängerverbindung (II) als solche mit Essigsäureanhydrid oder einem anderen geeigneten acetylierenden Agens, wie beispielsweise Acetylchlorid in einem geeigneten Lösungsmittel, wie z.B. Pyridin, acetyliert werden. Die Verbindung der Formel (I) gemäß der Erfindung kann auch hergestellt werden, wenn R&sub3;COOH, R&sub4;NH&sub2; oder R&sub5;OH, die als pharmazeutische Verbindungen nützlich sind, entweder nach der Entfernung der Schutzgruppen von der Verbindung der Formel (II) an die Verbindung der Formel (II) gebunden werden, wobei Ps die Schutzgruppen waren, oder falls solche R&sub3;COOH, R&sub4;NH&sub2; oder R&sub5;OH direkt an die Verbindung mit der Formel (II) gebunden werden, wobei Ps Hs oder -OH sind, und die verbleibenden Aminogruppen wie oben beschrieben nachfolgend acetyliert werden.
- Zunächst wird eine Beschreibung für die Herstellung der Verbindung der Formel (I) gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung gegeben. Auch wenn sie, so wie unten beschrieben, dargestellt werden kann, so ist die Erfindung nicht auf das folgende Herstellungsverfahren beschränkt.
- Carboxymethylchitin, eines der Ausgangsmaterialien für die Herstellung der neuen Substanz der vorliegenden Erfindung, kann leicht durch die Reaktion von Monochloressigsäure mit Chitin (nämlich β-1, 4-Poly-N-acetylglucosamin) bei Anwesenheit von Alkali hergestellt werden, wobei Chitin umfassend in Krustentieren (cruschymata), wie beispielsweise Krabben, Garnelen und Hummern, in den Schalen von Insekten, in den Zellwänden von Pilzen und dergleichen gefunden wird. Durch Modifizieren der Reaktionsbedingungen kann Carboxymethylchitin mit unterschiedlichen Carboxymethylierungsgraden erhalten werden. Es können auch kommerziell erhältliche Produkte verwendet werden.
- Als nächstes wird Carboxymethylchitin hinsichtlich seines Molekulargewichts durch Zerlegen oder Depolymerisieren zerkleinert. Das Molekulargewicht des resultierenden depolymerisierten Carboxymethylchitins kann reguliert werden, indem man z.B. bei der Depolymerisation des kommerziell erhältlichen Carboxymethylchitins Lysozym aus Eiweiß unter kontrollierten Reaktionsbedingungen auf das kommerziell erhältliche Carboxymethylchitin einwirken läßt. Die Reaktionsbedinqungen hierfür können in Abhängigkeit des Carboxymethylierungsgrads (ds: der Carboxymethylierungsgrad pro Zuckerrest) des Carboxymethylchitins, das angewandt werden soll, variieren. So kann, wenn z.B. der ds-Wert 1,0 ist, ein depolymerisiertes Carboxymethylchitin mit einem verringerten Molekulargewicht von etwa 1 x 10&sup5; durch die Reaktion von Carboxymethylchitin mit einem Molekulargewicht von etwa 1 x 10&sup6; mit etwa 1/400 des Volumens an Lysozym aus Eiweiß bei pH 6,0 und 37ºC in etwa zwei Stunden erhalten werden.
- Das auf diese Weise depolymerisierte Carboxymethylchitin wird weiterhin einer Deacetylierung am Stickstoff unterworfen. Dies kann durch die Behandlung mit Alkali erreicht werden. Durch Auflösen des depolymerisierten Carboxymethylchitins z.B. in 1 N NaOH und durch Erhitzen der resultieren Mischung unter Rückfluß bei 100ºC für einige Stunden bis hin zu einigen 10 Stunden, vorzugsweise für 3 bis 8 Stunden, wird die N-Acetylgruppe teilweise davon entfernt, so daß ein Carboxymethylchitosan erhalten wird, das einige noch darin verbleibende N-Acetylgruppen aufweist. Das so gebildete Carboxymethylchitosan wird "teilweise N-acetyliertes Carboxymethylchitosan" genannt.
- Das teilweise N-acetylierte Carboxymethylchitosan wird als nächstes beispielsweise in einer Lösungsmittelmischung aus Dimethylformamid und einer 0,5-%igen wässrigen NaHCO&sub3;-Lösung aufgelöst, worauf im Anschluß ein N-Hydroxysuccinimido-Ester zugesetzt wird, der von solch einem Peptid ist, das bei der Erfindung verwendbar ist, und wobei das Peptid eine Schutzgruppe gehabt hat, die in die Aminogruppe der endständigen Aminosäure der Peptidkette eingeführt worden ist und hier nachstehend einfach das "geschützte Peptid" genannt werden wird, das durch eine Formel: "HO-X-Schutzgruppe" repräsentiert werden kann. Der N-Hydroxysuccinimido-Ester ist ein aktiver Ester des geschützten Peptids. Sie reagieren miteinander, so daß das "geschützte Peptid" an die freien Aminogruppen des teilweise N-acetylierten Carboxymethylchitosans binden kann. Durch eine Änderung der Menge des aktiven Esters des "geschützten Peptids", das zugesetzt wird, kann ein Komplex eines "teilweise N-acetyliertem Carboxymethylchitosan-geschützten Peptids" gebildet werden, der das geschützte Peptid in unterschiedlichen Mengen gebunden hat. Falls der aktive Ester des geschützten Peptids in einem großen Überschuß reagiert, so ist es möglich, einen Komplex zu erhalten, worin praktisch keine freien Aminogruppen vorhanden sind. Der aktive Ester des geschützten Peptids kann in einer, auf dem Gebiet der Peptidsynthese bekannten Weise erhalten werden, so z.B. durch Auflösen des geschützten Peptids in Dimethylformamid, das Zusetzen von N-Hydroxysuccinimid und N,N'- Dicyclohexylcarbodiimid zu der Lösung, worauf diese reagieren.
- Die Konzentration des teilweise N-acetylierten Carboxymethylchitosans, das in der Reaktionsmischung der obigen Reaktion angewandt wird, um an den aktiven Ester des geschützten Peptids, so wie oben beschrieben, zu binden, kann mit 0,1 - 5% (Gew.-%) geeignet sein. Das Molverhältnis zwischen den Zuckerresten des Polysaccharids (das Chitosan) und dem aktiven Ester des geschützten Peptids kann geeigneter Weise im Bereich von 20:1 bis 1:10 liegen. Die Anzahl der Aminosäuren, die in dem Molekül des geschützten Peptids vorhanden sind, liegt im Bereich von 1-10.
- Wenn die oben erwähnte Bindungsreaktion unter Verwendung einer pharmazeutischen Verbindung, nämlich einer Drogenverbindung, anstelle der Schutzgruppen durchgeführt wird, so ist zu sagen, daß durch den Zusatz des N-Hydroxysuccinimido-Esters eines sol chen Peptids, das in der vorliegenden Erfindung verwendbar ist und das die Drogenverbindung darin eingeführt hat und das durch die Formel: "HO-X-P" repräsentiert ist, wobei P den Rest R&sub3;CO-, den Rest R&sub4;NH- oder den Rest R&sub5;O- bezeichnet, der aus der pharmazeutischen Verbindung oder aus der Drogenverbindung stammt, ein Komplex einer "teilweise-N-acetylierten-Carboxymethylchitosan-Peptid-Droge" gebildet wird.
- Das nachfolgende Entfernen der Schutzgruppen oder des Drogenrests (-P) aus dem Komplex, der so wie oben beschrieben gebil det wurde, wird weiterhin einen Komplex eines "teilweise-N-acetylierten-Carboxymethylchitosan-Peptids" liefern.
- Die Verbindung der Formel (II), die gemäß der Erfindung zur Verfügung gestellt wird, kann drei Substanztypen umfassen, die so wie oben gebildet werden und beschrieben sind. Diese Substanztypen sind der "teilweise-N-acetylierte-Carboxymethylchitosan-geschützte-Peptid"-Komplex, der "teilweise-N-acetylierte- Carboxymethylchitosan-Peptid-Drogen"-Komplex und der "teilweise-N-acetylierte-Carboxymethylchitosan-Peptid"-Komplex.
- Die Verbindung der Formel (II) gemäß der Erfindung kann in die entsprechende Verbindung der Formel (I) gemäß der Erfindung umgewandelt werden, wenn die Vorgängerverbindung (II) in einer gesättigten wässrigen Lösung von NaHCO&sub3; aufgelöst wird und dann mit Essigsäureanhydrid oder einem anderen geeigneten Acetylierungsagens, wie z.B. Acetylchlorid zur Reaktion gebracht wird, um die freien Aminogruppen, die in der komplexen Verbindung der Formel (II) verblieben sind, zu acetylieren. Die so erhaltende Verbindung ist jedoch eine Verbindung der Formel (I), wobei entweder a = a&sub1; und a&sub2; = 0 oder a = a&sub2; und a&sub1; = 0 sind. Entsprechend den oben beschriebenen drei Typen der Verbindung der Formel (II) können durch Acetylierung z.B. ein Komplex eines "N-Acetylcarboxymethylchitosan-geschützen Peptids", ein Komplex einer "N-Acetylcarboxymethylchitosan-Peptid-Droge" bzw. ein Komplex eines "N-Acetylcarboxymethylchitosan-Peptids" hergestellt werden. Die gerade genannten ersteren zwei Komplexe sind die entsprechende Verbindung der Formel (I), wobei a = a&sub1; und a&sub2; 0, wohingegen der zuletzt genannte Komplex die entsprechende Verbindung der Formel (I) ist, wobei a = a&sub2; und a&sub1; = 0. Weiterhin können die ersteren beiden Komplexe in den zuletzt genannten Komplex im allgemeinen durch eine Säurebehandlung umgewandelt werden. So kann z.B. der "N-Acetylcarboxymethylchitosan-Peptid"-Komplex hergestellt werden, indem der entsprechende "N-Acetylcarboxymethylchitosan-geschütztes Peptid"-Komplex einer milden Säurebehandlung unterworfen wird, so z.B. durch die Behandlung des letzteren Komplexes mit einer 0,5 N HCl bei 30ºC über 16 Stunden.
- Der "N-Acetylcarboxymethylchitosan-Peptid-Drogen" -Komplex kann hergestellt werden, indem nachfolgend der oben beschriebene "N- Acetylcarboxymethylchitosan-Peptid"-Komplex z.B. in einer 1- %igen wässrigen NaHCO&sub3;-Lösung aufgelöst wird und anschließend das N-endständige Ende der Peptidkette des letzteren Komplexes mit einer Drogenverbindung, die die Carboxylgruppe in der Form des N-Hydroxysuccinimido-Esters (aktiver Ester) der Drogenverbindung, die eine Carboxylgruppe hat, aufweist, zur Reaktion gebracht wird. Es sollte jedoch beachtet werden, daß die Verbindung (1), die hier hergestellt wurde, nicht notwendigerweise auf die Verbindung mit der Formel (I), bei a = a&sub1; und a&sub2; = sind, beschränkt ist, sondern in der Praxis eine derartige Verbindung der Formel (I), in der a = a&sub1; + a&sub2; und a&sub2; ≠ 0 sind, bedeuten kann. Falls beispielsweise Methotrexat (MTX) als solche Drogenverbindung gewählt wird und mit der Peptidkette des Komplexes zur Reaktion gebracht wird, kann folglich der "N-Acetylcarboxymethylchitosan-Peptid-MTX"-Komplex hergestellt werden. Der Gehalt an MTX, der auf diese Weise in den als letztes hergestellten Komplex eingeführt wird, kann gewöhnlich niedriger sein als der Gehalt der Peptidkette X im Komplex.
- In einem dritten Aspekt der Erfindung wird deshalb ein Verfah ren für die Herstellung eines teilweise N-acetylierten Carboxymethylchitosan-Derivats zur Verfügung gestellt, das durch die folgende Formel (II) repräsentiert wird.
- wobei R&sub1; und R&sub2; jeweils ein Wasserstoffatom oder eine Carboxymethylgruppe bedeuten, mit den Maßgaben, daß R&sub1; und R&sub2; nicht gleichzeitig Wasserstoffatome sind; P ein Wasserstoffatom H, eine Gruppe -OH, eine Gruppe R&sub3;CO-, die der Rest einer Verbindung mit einer Carboxylgruppe ist, oder eine Gruppe R&sub4;NH-, die der Rest einer Verbindung mit einer Aminogruppe ist, oder eine Gruppe R&sub5;O-, die der Rest einer Verbindung mit einer Hydroxylgruppe ist, bezeichnet; X eine Peptidkette darstellt, die gleiche oder verschiedene 1 bis 10 Aminosäuren enthält; und a, b&sub1; und b&sub2; jeweils eine positive ganze Zahl darstellen; und die folgenden kennzeichnenden Werte (1)-(4) hat:
- (1) Carboxymethylierungsgrad: 0,5-1,2 (gemessen nach Alkalimetrie)
- (2) Molekulargewicht (gemessen nach Gelfiltrationsverfahren) : 3.000-300.000
- (3) a/(a+b) : 0,01-1 (vorausgesetzt daß b = b1 + b&sub2;)
- (4) P/X-Verhältnis (Molverhältnis) 0,1-1 und dadurch gekennzeichnet ist, daß das Verfahren die Reaktion einer Verbindung mit der folgenden Formel umfaßt:
- PX-OH (IV),
- wobei P und X die gleichen Bedeutungen haben, wie sie oben für ein teilweise N-acetyliertes Carboxymethylchitosan, das die folgende Formel (III) aufweist, definiert wurden:
- wobei R&sub1; und R&sub2; dieselben Bedeutungen haben, wie oben defi niert, und das die folgenden kennzeichnenden Werte (1)-(2) aufweist:
- (1) Carboxymethylierungsgrad: 0,5 - 1,2
- (2) Molekulargewicht (gemessen nach Gelfiltrationsverfahren) : 3.000 - 300.000.
- In einem vierten Aspekt der Erfindung wird ebenfalls ein Verfahren für die Herstellung eines N-Acetylcarboxymethylchitosan- Derivats zur Verfügung gestellt, das durch die folgende Formel (I) repräsentiert wird:
- wobei R&sub1; und R&sub2; einzeln ein Wasserstoffatom oder eine Carboxymethylgruppe bedeuten, mit den Maßgaben, daß R&sub1; und R&sub2; nicht gleichzeitig Wasserstoffatome sind; P eine Gruppe R&sub3;CO-, die der Rest einer Verbindung mit einer Carboxylgruppe ist, oder eine Gruppe R&sub4;NH-, die der Rest einer Verbindung mit einer Aminogruppe ist, oder eine Gruppe R&sub5;O-, die der Rest einer Verbindung mit einer Hydroxylgruppe ist, bezeichnet; Q für H oder eine Gruppe -OH steht; X eine Peptidkette ist, die gleiche oder unterschiedliche 1 bis 10 Aminosäuren enthält, a&sub1; und a&sub2; einzeln Null oder eine positive ganze Zahl sind, vorausgesetzt, daß a&sub1; und a&sub2; nicht beide zur gleichen Zeit 0 sind, und b für eine positive ganze Zahl steht; und das die nachfolgenden kennzeichnenden Werte (1)-(4) aufweist:
- (1) Carboxymethylierungsgrad: 0,5 - 1,2 (gemessen nach Alkalimetrie)
- (2) Molekulargewicht: (gemessen nach 3.000 - 300.000 Gelfiltrationsverfahren)
- (3) a/(a+b) : 0,01 - 1 (vorausgesetzt, daß a = a&sub1; + a&sub2;)
- (4) P/X-Verhältnis (Molverhältnis) : 0,1 - 1
- dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren folgendes umfaßt:
- - das Acetylieren eines teilweise N-acetylierten Carboxymethylchitosan-Derivats, das die folgende Formel (IIT) hat:
- wobei R&sub1; und R&sub2; einzeln ein Wasserstoffatom oder eine Carboxymethylgruppe bedeuten, mit den Maßgaben, daß R&sub1; und R&sub2; nicht gleichzeitig Wasserstoffatome sind; P&sub1;ein Wasserstoffatom, eine Gruppe -OH, eine Gruppe -R&sub3;'CO, die der Rest einer Verbindung mit einer Carboxylgruppe ist, oder eine Gruppe R&sub4;'NH-, die der Rest einer Verbindung mit einer Aminogruppe ist, oder eine Gruppe R&sub5;'O-, die der Rest einer Verbindung mit einer Hydroxylgruppe ist, bezeichnet; X eine Peptidkette ist, die die gleichen oder unterschiedliche 1 bis 10 Aminosäuren enthält; und a, b&sub1; und b&sub2; einzeln eine positive ganze Zahl sind; und das die nachfolgenden kennzeichnenden Werte (1)-(4) hat:
- (1) Carboxymethylierungsgrad: 0,5 - 1,2 (gemessen nach Alkalimetrie)
- (2) Molekulargewicht: (gemessen nach 3.000 - 300.000 Gelfiltrationsverfahren)
- (3) a/(a+b): 0,01 - 1 (vorausgesetzt daß b = b&sub1; + b&sub2;)
- (4) P&sub1;/X-Verhältnis (Molverhältnis) 0,1 - 1
- - das Entfernen der P&sub1;-Gruppen aus dem resultierenden Acetylierungsprodukt, wobei die P&sub1;-Gruppen andere Gruppen, als H oder die Gruppe -OH sind; und
- - das Reagieren des resultierenden Reaktionsprodukts, bei dem die P&sub1;-Gruppen entfernt wurden, mit einer Verbindung der folgenden Formel aufweist:
- P-H oder P-OH (V)
- wobei P die Gruppe R&sub3;CO-, die Gruppe R&sub4;NH- oder die Gruppe R&sub5;Obedeutet, wie oben definiert.
- Die Erfinder, haben auch die Forschung weitergeführt, um die Eigenschaften des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Derivats mit der Formel (I) gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung zu verbessern. Als Ergebnis ist es gelungen, als neue Substanz ein N-Acetylcarboxymethylchitosan-Derivat zu synthe tisieren, das durch die folgende Formel (X) wiedergegeben wird:
- wobei R&sub1;, R&sub2;, P, Q und X die gleichen Bedeutungen haben, wie oben für die Formel (I) definiert, und wobei PEG eine Gruppe repräsentiert, die eine der folgenden Formeln (VI), (VII),
- wobei n den mittleren Polymerisationsgrad der Polyethylenglycolkette bedeutet; a&sub1; und a&sub2; einzeln Null oder eine positive ganze Zahl sind, vorausgesetzt, daß nicht beide zur gleichen Zeit Null sind; b und c stehen einzeln für eine positive ganze Zahl; und das die nachfolgenden kennzeichnenden Werte (1)-(4) hat:
- (1) Carboxymethylierungsgrad: 0,5 - 1,2 (gemessen nach Alkalimetrie)
- (2) Molekulargewicht: (gemessen nach 3.000 - 300.000 Gelfiltrationsverfahren)
- (3) a/(a+b+c): 0,01 - 1 (vorausgesetzt, daß a = a&sub1; + a&sub2;)
- (4) P/X-Verhältnis (Molverhältnis) 0,1 - 1
- wobei das besagte N-Acetylcarboxymethylchitosan-Derivat (X) durch das Ersetzen einer Vielzahl der N-Acetylcarboxymethylglucosamin-Einheiten, nämlich der Zuckereinheiten, die in dem Derivat der Formel (I) enthalten sind, durch eine entsprechende Vielzahl von solchen Carboxymethylglucosamin-Einheiten, die ihre 2-Aminogruppen mit einer Gruppe substituiert haben, die eine Polyethylenglycolkette enthalten (im nachfolgenden kann diese Gruppe einfach als "PEG" abgekürzt werden), insbesondere es sich um solch eine Polyethylenglycol-substituierte Carboxymethylglucosamin-Einheit handelt, die die Formel (A) hat:
- wobei R&sub1;, R&sub2;, PEG und n die gleichen Bedeutungen haben wie oben definiert wurde. Weiterhin wurde festgestellt, daß das neue N- Acetylcarboxymethylchitosan-Derivat, das durch die Formel (X) wiedergegeben wird, eine gegenüber dem N-Acetylcarboxymethyl chitosan-Derivat mit der Formel (I) stark erhöhte Wasserlöslichkeit zeigt, und als Trägersubstanz für die Zulieferung einer Drogenverbindung brauchbar ist und zudem für einen langen Zeitraum nach seiner Verabreichung im Blut ruhen oder verweilen kann.
- Den Erfindern, ist es ebenfalls gelungen, als eine neue Sub stanz das N-Acetylcarboxymethylchitosan-Derivat zu synthetisieren, das durch die folgende Formel (XI) wiedergegeben wird:
- wobei R&sub1;, R&sub2;, P, Q und X die gleichen Bedeutungen haben, wie sie oben in der Formel (I) definiert wurden; a&sub1; und a&sub2; einzeln Null oder eine positive ganze Zahl darstellen, vorausgesetzt, daß beide, a&sub1; und a&sub2;, nicht gleichzeitig Null sind; und b und c einzeln für eine positive ganze Zahl stehen; und das die nachfolgenden kennzeichnenden Werte (1)-(4) hat:
- (1) Carboxymethylierungsgrad: 0,5 - 1,2
- (2) Molekulargewicht: (gemessen nach 3.000 - 300.000 Gelfiltrationsverfahren)
- (3) a/(a+b+c): 0,01 - 1 (vorausgesetzt, daß a = a&sub1; + a&sub2;)
- (4) P/X-Verhältnis (Molverhältnis) 0,1 - 1
- wobei das N-Acetylcarboxymethylchitosan-Derivat (XI) durch das Ersetzen einer Vielzahl der N-Acetylcarboxymethylglucosamin Einheiten, nämlich der konstituierenden Zuckereinheiten des Deriva-ts mit der Formel (I) durch eine entsprechende Vielzahl von Polyalkohol-Einheiten, die die Formel (B) haben, gebildet wird:
- wobei R&sub1; dieselben Bedeutungen hat, wie oben definiert wurde. Weiterhin wurde festgestellt, daß das neue N-Acetylcarboxymethylchitosan-Derivat, das durch die Formel (XI) wiedergegeben wird, eine gegenüber dem N-Acetylcarboxymethylchitosan-Derivat mit der Formel (I) stark erhöhte Wasserlöslichkeit zeigen kann und als Trägersubstanz für die Zulieferung einer Drogenverbindung brauchbar ist, und daß das Derivat mit der Formel (XI) für eine lange Zeit nach seiner Verabreichung im Blut ruhen und verweilen kann.
- In einem fünften Aspekt der Erfindung wird demgemäß ein N- Acetylcarboxymethylchitosan-Derivat zur Verfügung gestellt, daß durch die folgenden Formeln (X) oder (XI) wiedergegeben wird: wobei R&sub1; und R&sub2; einzeln ein Wasserstoffatom oder eine Carboxymethylgruppe bedeuten, mit den Maßgaben, daß R&sub1; und R&sub2; nicht gleichzeitig Wasserstoffatome sind; P eine Gruppe R&sub3;CO-, die der Rest einer Verbindung mit einer Carboxylgruppe ist, oder eine Gruppe R&sub4;NH-, die der Rest einer Verbindung mit einer Aminogruppe ist, oder eine Gruppe R&sub5;O-, die der Rest einer Verbindung mit einer Hydroxylgruppe ist, bezeichnet; Q für H oder eine Gruppe -OH steht; X eine Peptidkette ist, die gleiche oder unterschiedliche 1 bis 10 Aminosäuren enthält; a&sub1; und a&sub2; einzeln Null oder eine positive ganze Zahl sind, vorausgesetzt, daß a&sub1; und a&sub2; nicht beide zur gleichen Zeit Null sind; b und c einzeln für eine positive ganze Zahl stehen, und -PEG eine Gruppe repräsentiert, die eine der folgenden Formeln (VI), (VII), (VIII) oder (IX) hat:
- in welchen n den mittleren Polymerisationsgrad der Polyethylenglycol-Kette bedeutet; und das die nachfolgenden kennzeichnenden Werte (1)-(4) hat:
- (1) Carboxymethylierungsgrad: 0,5 - 1,2
- (2) Molekulargewicht (gemessen nach 3.000 - 300.000 Gelfiltrationsverfahren)
- (3) a/ (a+b) : 0,01 - 1 (vorausgesetzt, daß a = a&sub1; + a&sub2;)
- (4) P/X-Verhältnis (Molverhältnis) : 0,1 - 1
- Das Derivat der Formel (X) gemäß dem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung ist solch ein N-Acetylcarboxymethylchitosan-Derivat der Formel (I), bei dem einige der Zuckereinheiten durch Zuckereinheiten der Formel (A), die unten wiedergegeben ist, ersetzt wurden. Das Derivat der Formel (XI) gemäß dem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung ist andererseits ein solches N-Acetylcarboxymethylchitosan-Derivat, bei dem ebenfalls einige Zuckereinheiten ersetzt wurden, und zwar durch Polyalkohol-Einheiten der Formel (5), die unten wiedergegeben ist. Die Beispiele 17-21 und 22-23, die im weiteren beschrieben werden, zeigen einige Beispiele der Verbindung mit der Formel (X) und der Verbindung mit der Formel (XI).
- Das Zuckerderivat der obigen Formel (A) ist eine solche Zukkereinheit, in welcher die 2-Aminogruppe der Carboxymethylglucosamin-Einheit durch PEG ersetzt wurde. Insbesondere repräsentiert PEG eine der Gruppen mit den folgenden Formeln (VI) bis (IX), die Polyethylenglycol-Ketten enthalten:
- Die Polyethylenglycol-Kette, die in jeder der Gruppen mit den Formeln (VI) bis (IX) enthalten ist, kann verschiedene Molekulargewichte haben, wobei die Polyethylenglycol-Kette, die von dem Standpunkt ihrer allgemeinen Verwendbarkeit bevorzugt ist, ein mittleres Molekulargewicht von etwa 5000 aufweist. Demgemäß beträgt der bevorzugte mittlere Polymerisationsgrad n der Polyethylenglycol-Kette, die in jeder Gruppe mit den Formeln (VI) bis (IX) vorhanden ist, in etwa 100 - 120, worauf diese Erfindung jedoch nicht beschränkt ist. Der Gehalt des Polyethylenglycols, der in dem Derivat mit der Formel (X) vorhanden ist, kann mit einem NMR-Verfahren bestimmt werden, indem die Peakfläche, die den Methylen-Protonen der Polyethylenglycol- Kette zugeordnet werden kann, gemessen witd. Ein größerer Gehalt an Polyethylenglycol ist bevorzugt und ein Gehalt von 1% (Gewicht) oder höher ist beispielsweise zufriedenstellend. Bezüglich des Gehalts an Polyethylenglycol wird der vorliegenden Erfindung keine besondere Einschränkung auferlegt.
- Andererseits hat die Polyalkohol-Einheit der Formel (B) in dem Derivat mit der Formel (XI) gemäß dem fünften Aspekt der Erfindung eine strukturelle chemische Eigenschaft, die derart gestaltet ist, daß die Bindung zwischen den Kohlenstoffatomen, die sich in der 2- und in der 3-Position der Carboxymethylglucosamin-Einheit befinden, durch Oxidation gespalten wurde, und die Carboxymethylglucosamin-Einheit nach der Spaltung durch Reduktion in die Form eines Polyalkohols umgewandelt wurde.
- Der a/(a+b+c)-Wert in jedem der Derivate mit den Formeln (X) und (XI) gemäß dem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung zeigt den Peptid-Einführungsgrad, der ähnlich definiert ist wie der a/(a+b)-Wert für die Formel (I). Demgemäß kann der a/(a+b+c)-Wert unter Verwendung der obigen Gleichung (1) bestimmt werden. Praktisch kann dieser Wert in genau derselben Weise wie für die Verbindung mit der Formel (I) bestimmt werden, indem man die obigen Gleichungen (2)-(5) benutzt. Auch die Bereiche für den Carboxymethylierungsgrad und das Molekulargewicht (gemessen nach dem Gelfiltrationsverfahren) der Derivate der Formeln (X) und (XI) können ebenfalls dieselben wie diejenigen der Verbindung der Formel (I) sein.
- Der Herstellung der Verbindung der Formel (X) gemäß dem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung wird durch die Zubereitung des Startmaterials, dem "teilweise-N-acetylierten-Carboxymethylchitosan-geschützten-Peptid"-Komplex mit der Formel (II) eingeleitet und anschließend so wie unten beschrieben weiterbehandelt. Folglich wird als erstes ein aktives Derivat der PEG- Kette mit den nicht-N-acetylierten-Carboxymethylglucosamin- Einheiten, die eine freie 2-Aminogruppe enthalten, und die in dem Komplex der Formel (II) vorkommen, zur Reaktion gebracht, um so die PEG-Kette einer der Verbindungen der Formeln (VI)- (IX) in einige der freien 2-Aminogruppen der besagten Einheiten als Substituent einzuführen. Weiterhin sind irgendwelche der verbleibenden freien Aminogruppen der Carboxymethylglucosamin- Einheiten des Komplexes N-acetyliert. Anschließend werden die Schutzgruppen aus der Bauemheit des geschützten Peptids, das in dem N-acetylierten Komplex vorhanden ist, entfernt, um letzteren Komplex schutzlos zu machen. Anschließend reagiert ein reaktives Derivat einer Drogenverbindung mit dem freien Ende der schutzlosen Peptidbaueinheit des Komplexes, so daß sich die Drogenverbindung (P) an das Ende der Peptidbaueinheit des Komplexes bindet.
- In den obigen Reaktionsschritten werden die zahlreichen Zwischenprodukte, die nach der obigen N-Acetylierung gebildet werden, und die Endprodukte, die an die Drogenverbindung gebunden sind, durch die Formel (X), die oben gezeigt ist, repräsentiert.
- Das aktive Derivat der PEG-Kette kann beispielsweise ein aktiver Ester (z.B. der N-Hydroxy-Succinimido-Ester) von 2-O-monomethoxy-polyethylenglycol-3, 5-Dichloro-s-triazin oder Methoxypolyoxy-ethylencarbonsäure sein.
- Für die Herstellung der Verbindung mit der Formel (XI) gemäß dem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung wird als erstes der "teilweise-N-acetylierte-Carboxymethylchitosan-geschützte- Peptid"-Komplex der Formel (II) als Startmaterial, ähnlich wie bei der Herstellung der Verbindung mit der Formel (X), zubereitet. Das Startmaterial wird anschließend so behandelt, wie es im folgenden beschrieben wird. Demgemäß reagiert beispielsweise Periodsäure als erstes mit den nicht-N-acetylierten-Carboxymethylglucosamin-Einheiten des Startkomplexes der Formel (II), die freie Aminogruppen enthalten, so daß die Pyranose- Ringe des Glucosamins durch Oxidation gespalten werden. Die durch die Spaltung entstandenen Aldehydgruppen werden anschließend z.B. mit Natriumborhydrid reduziert, so daß der Komplex der Formel (II) in die Form eines Polyalkohols umgewandelt wird. Im Anschluß werden die Schutzgruppen aus der geschützten Peptidbaueinheit des Komplexes entfernt, um die Peptidbaueinheit des Komplexes schutzlos zu machen. Anschließend reagiert ein reaktives Derivat einer Drogenverbindung mit dem freien Ende der schutzlosen Peptidbaueinheit, wodurch die Drogenverbindung (P) an das Ende der Peptidbaueinheit des Komplexes gebunden wird. In den obigen Reaktionsschritten werden die zahlreichen Zwischenprodukte, die nach der Umwandlung des Komplexes (II) in den Polyalkohol und die Endprodukte, die an die Drogenverbindung gebunden sind, gebildet werden, durch die obige Formel (XI) repräsentiert.
- Die Substanzen der Formeln (X) und (XI) gemäß dem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung haben eine hohe Löslichkeit in Wasser. Demgemäß werden solche Trägersubstanzen, die Drogen zustellen, und ihre Komplexe, die an Drogen gebunden sind und die eine verbesserte Wasserlöslichkeit aufweisen, durch die Verbindungen der Formeln (X) oder (XI) gemäß dem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt. Gemäß dem Experiment 4, das hier im weiteren beschrieben wird, wird offenbar, daß die Substanz der Formel (X) beispielsweise ausgezeichnet ist hinsichtlich ihrer Eigenschaft, im Blut zu ruhen und zu verweilen, und eine verbesserte Selektivität bezüglich der Anlieferung an die Stelle des Krebses (die Organotropie) zeigt, wenn die Substanz einen Antikrebswirkstoff als Drogenverbindung oder als pharmazeutische Verbindung trägt.
- Das Derivat der Formel (I) und die Derivate der Formeln (X) und (XI), die alle die vorliegende Erfindung betreffen, haben die im folgenden beschriebenen vorteilhaften Eigenschaften.
- Wie in den Experimenten, die im folgenden beschrieben werden, gezeigt wird, können die Derivate der Formeln (I) und (X) gemäß der vorliegenden Erfindung während der Zeitdauer nach ihrer Verabreichung mittels einer intravenösen Injektion im Blut stabil verweilen, bis sie an ihrem Zielorgan angekommen sind, in anderen Worten können die Derivate ihr benötigtes hohes Level hinsichtlich der Substanzen der vorliegenden Erfindung im Blut beibehalten. Andererseits können sie in vivo einem stu fenweisen enzymatischen Abbau unterliegen, so daß es kein Problem darstellt, daß die N-Acetylcarboxymethylchitosan-Einheit dieses Derivats unangemessen lange im lebenden Körper verweilen würde. Weiterhin konnte beobachtet werden, daß alle Derivate mit der Formel (I) und die Derivate mit der Formel (X) und (XI) gemäß der vorliegenden Erfindung die Tendenz zur Organotropie zeigen.
- Im übrigen bedeutet die Tendenz zur Organotropie, die die Verbindungen der Formeln (I), (X) und (XI) gemäß der vorliegenden Erfindung innehaben, wenn sie verabreicht werden, bedeutet darüber hinaus weder, daß diese Verbindungen eine Tendenz dazu zeigen, daß sich die Konzentration der vorliegenden Verbindungen, die am Ort des jeweiligen Zielorgans gemessen wird, im Vergleich zu solchen Fällen erhöht, in denen ähnliche Verbin dungen, die nicht in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung zubereitet wurden, verabreicht wurden, noch bedeutet es, daß die vorliegenden Verbindungen der Erfindung selektiv nur an die Stelle des jeweiligen Zielorgans zugeführt werden.
- Die vorliegende Erfindung wird nachstehend genauer durch die folgenden Beispiele beschrieben.
- Die ersten vier Aspekte der Erfindung werden durch die Beispiele 1 bis 16 erläutert, während der fünfte Aspekt der vorliegenden Erfindung durch die Beispiele 17 bis 23 erläutert wird.
- In jedem der unteren Beispiele wurde die Gelfiltration unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Es wurde eine Säule TSK-gel G400PWXL mit 0,1 M NaCl als Eluent mit einer Flußrate von 0,8 ml/min und einer Säulentemperatur von 40ºC benutzt, wobei die injizierte Probenmenge in etwa 75 ug betrug.
- 5,0 Gramm Carboxymethylchitin (sein Carboxymethylierungsgrad war pro Zuckerrest 1,0; kommerziell erhältlich von Funakoshi Pharrnaceutical Co., Ltd.) wurde in 0,05 M Acetatpuffer (mit einem pH 6,0, 500 ml) aufgelöst. Im Anschluß wurde Eiweiß-Lysozym (12,5 mg) hinzugegeben, worauf man die Mischung bei 37ºC für 2 Stunden inkubierte, damit sie reagiert. Die erhaltene Reaktionslösung wurde zu Ethanol gegeben (2 l). Der resultierende Niederschlag wurde gesammelt und im Vakuum getrocknet, wodurch 4,25 g eines depolymerisierten Carboxymethylchitins erhalten wurden. Dieses Carboxymethylchitin (3,9 g) wurde in 1 N wässriger NaOH-Lösung (390 ml) aufgelöst und die resultierende Mischung wurde anschließend unter Rückfluß bei 100ºC für 6 Stunden erhitzt. Nachdem der pH-Wert der resultierenden Reaktionslösung auf 8 eingestellt worden war, wurde die Reaktionslösung zentrifugiert, so daß sich ein Überstand bildete. Der Überstand wurde zu Methanol hinzugefügt (1,9 l) und der resultierende Niederschlag wurde gesammelt. Der Niederschlag wurde im Vakuum getrocknet, so daß er 1,91 g eines teilweise N-acetylierten Carboxymethylchitosans erbrachte, das hier im folgenden einfach ein "Polysaccharid" bezeichnet wird und das ein Beispiel der Substanzen der Formel (III) ist. Mit dem Gelfiltrationsverfahren (Säule: G4000PWXL) wurde unter der Verwendung eines Dextrans als Standardsubstanz das Molekulargewicht dieses Polysacc-harids bestimmt, das etwa 1 x 10&sup5; betrug.
- Das obige Polysaccharid (200 mg) wurde in 0,5%iger wässriger NaHCO&sub3;-Lösung (20 ml) aufgelöst, woraufin die resultierende gleichförmige Lösung des Polysaccharids Dimethylformamid (17,5 ml) hinzugegegeben wurde. Andererseits wurde ein Peptid, dessen endständige Aminogruppe durch eine tert-Butoxycarbonylgruppe (insbesondere Boc) geschützt worden war, und das durch die Formel N-Boc-Phe-Phe-Gly-OH gezeigt worden war (94 mg), in 1,5 ml Dimethylformamid aufgelöst, worauf zu der resultierenden Lösung N-Hydroxysuccinimid (23 mg) und N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (37 mg) hinzugegeben wurden. Das geschützte Peptid und das zugesetzte chemische Reagens reagierten für 24 Stunden bei 4ºC miteinander, damit sich ein aktiver Ester des N-geschützten Peptids bildet. Die gesamte Reaktionsmischung wurde zu der oben erwähnten Polysaccharid-Lösung hinzugegeben, worauf sie für 16 Stunden bei 4ºC reagierten. Die resultierende Reaktionslösung wurde zu Ethanol (160 ml) hinzugegeben. Der resultierende Niederschlag wurde gesammelt und anschließend im Vakuum getrocknet, wodurch sich 200 mg eines Komplexes eines teilweise-N-acetylierten-Carboxymethylchitosan-Gly-Phe-Phe-Boc [als ein Beispiel eines Derivats mit der Formel (II)] ergaben.
- Der obige Komplex (150 mg) wurde in einer gesättigten wässrigen NaHCO&sub3;-Lösung (15 ml) aufgelöst, anschließend wurde Essigsäureanhydrid (0,6 ml) hinzugegeben, und die nachfolgende N-Acetylierung des Komplexes wurde für 17 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die resultierende Reaktionslösung wurde neutralisiert und in Ethanol (80 ml) geschüttet. Der resultierende Niederschlag wurde gesammelt und anschließend im Vakuum getrocknet, wodurch sich 154 mg eines Komplexes eines N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Phe-Phe-Boc als ein Beispiel der Derivate der Formel (I) ergaben. Das ultraviolette Absorptionsspektrum und das GFC (Gelfiltrationschromatographie)-Elutionsmuster, das von dem obigen Komplex erhalten wurde, sind in Fig. 1 und in Fig. 2 der beigefügten Zeichnungen wiedergegeben. Mit der ultravioletten Absorptionsspektrophotometrie (bei 258 nm) wurde der Gehalt des N-Boc-Peptids in diesem Komplex bestimmt, der 14,1% (Gew.-%) betrug.
- Der obige Komplex (130 mg) wurde in 0,5 N HCl (13 ml) aufgelöst und dann für 17 Stunden bei 30ºC zur Reaktion gebracht, so daß der Komplex einer Behandlung unterworfen wurde, die die schützende Boc-Gruppe aus dem Komplex entfernte. Die erhaltene Reaktionslösung wurde neutralisiert und dann in Ethanol (70 ml) gegossen. Der resultierende Niederschlag wurde gesammelt und anschließend im Vakuum getrocknet, wodurch sich 121 mg eines Komplexes eines N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Phe-Phe-H [als einem anderen Beispiel eines Derivats mit der Formel (I)] ergaben. Das ultraviolette Absorptionsspektrum und das GFC-Elutionsmuster, das dieser Komplex lieferte, sind in den Fig. 3 und 4 der begleitenden Zeichnungen abgebildet. Mit der ultravioletten Absorptionsspektrophotometrie (bei 258 nm) wurde bestimmt, daß der Gehalt der Peptidkette in diesem Komplex 11,3% (Gew-%) betrug.
- Methotrexat (MTX) (182 mg) als pharmazeutische oder Drogenverbindung mit einer Carboxylgruppe wurde in Dimethylformamid (4 ml) aufgelöst, wozu anschließend N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (82 mg) hinzugegeben wurde, worauf die Mischung für 17 Stunden bei 4ºC einer Reaktion unterworfen wurde. Zu der resultierenden Reaktionslösung wurden N-Hydroxysuccinimid (46 mg) und Pyridin (63 ul) hinzugegeben und anschließend wurde die so gebildete Reaktionsmischung bei Raumtemperatur für 5 Stunden einer Reaktion unterworfen, damit sich der aktive Ester von MTX in der resultierenden Reaktionslösung bildet. Andererseits wurde der obige Komplex von N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Phe-Phe-H (50 mg) in 0,5%iger wässriger NaHCO&sub3;-Lösung (10 ml) aufgelöst, woraufim folgenden 0,5 ml der oben erwähnten Reaktionslösung, die den aktiven Ester von MTX enthält, hinzugegeben wurden. Die Komponenten wurden für 15 Stunden bei 4ºC einer Reaktion unterworfen, wodurch MTX an die N-Enden der Peptidkette-Gly- Phe-Phe-H des Komplexes gebunden wurde. Anschließend wurde die so erhaltene Reaktionslösung in Ethanol (40 ml) gegossen. Der resultierende Niederschlag wurde gesammelt und anschließend im Vakuum getrocknet, um 53 mg eines Komplexes des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Phe-Phe-MTX [als einem weiteren Beispiel eines Komplexes mit der Formel (I)] als gelbes Pulver zu erhalten. Das ultraviolett-sichtbare Absorptionsspektrum und das GFC-Elutionsmuster dieses Komplexes sind in Fig. 5 und in Fig. 6 der beiliegenden Zeichnungen gezeigt. Mit ultravioletter Absorptionsspektrophotometrie (bei 307 nm) wurde bestimmt, daß der Gehalt von MTX in diesem Komplex 11,5% (Gew.-%) beträgt. Weiterhin wurde das P/X-Molverhältnis dieses Komplexes, genauer, das Verhältnis von MTX/Peptid (Molverhältnis) in diesem Komplex in Übereinstimmung mit der Berechnungsgleichung (5), die hier zuvor beschrieben wurde, zu 0,93 berechnet.
- Im Hinblick auf diesen Komplex war der Wert von a/(a+b), wie er für die Formel (I) definiert wurde, in Übereinstimmung mit der Berechnungsgleichung (1), die zuvor angegeben wurde, in etwa 0,09.
- Das teilweise N-acetylierte Carboxymethylchitosan (100 mg), das im obigen Beispiel 1 erhalten wurde, wurde in 1%iger wässriger NaHCO&sub3;-Lösung (10 ml) aufgelöst, woraufin die resultierende gleichförmige Polysaccharid-Lösung Dimethylformamid (6 ml) hin zugefügt wurde. Ein Peptid, dessen endständige Aminogruppe mit einer p-Methoxybenzyloxycarbonyl-Gruppe (PMZ) geschützt war, und das mit der Formel PMZ-Gly-Gly-Gly-OH wiedergegeben wurde (141 mg), wurde in 4 ml Dimethylformamid aufgelöst, zu welchem anschließend N-Hydroxysuccinimid (46 mg) und N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (74 mg) zugegeben wurden. Man ließ die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur für 3 Stunden reagieren, damit sich ein aktiver Ester des N-geschützten Peptids bildet. Die gesamte Reaktionslösung, die den obigen aktiven Ester enthält, wurde zu der oben erwähnten Polysaccharid-Lösung hinzugegeben, worauf anschließend Dimethylformamid (10 ml) hinzugefügt wurde. Die ganze Mischung wurde für 23 Stunden bei 4ºC einer Reaktion unterworfen. Zu der resultierenden Reaktionslösung wurde Wasser (5 ml) hinzugefügt, worauf anschließend zentrifugiert wurde, um einen Überstand zu erhalten. Der Überstand wurde zu Ethanol (150 ml) hinzugegeben und der resultierende Niederschlag wurde gesammelt. Anschließend wurde der Niederschlag im Vakuum getrocknet, wodurch sich 120 mg eines Komplexes eines teilweise- N-acetylierten-Carboxymethylchitosan-Gly-Gly-Gly-pMZ [als einem Beispiel der Derivate mit der Formel (II)] ergaben.
- In ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 wurde dieser Komplex (100 mg) mit Essigsäureanhydrid N-acetyliert, wodurch ein Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Gly-Gly-PMZ (97 mg) erhalten wurde. Das ultraviolette Absorptionsspektrum und das GFC-Elutionsmuster des resultierenden acetylierten Komplexes sind in Fig, 7 und in Fig. 8 dargestellt. Mit ultravioletter Absorptionsspektrophotometrie (bei 272 nm) wurde bestimmt, daß der Gehalt des PMZ-Peptids in diesem Komplex 20,1% (Gew.-%) betrug.
- In einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 1 wurde dieser Komplex (89 mg) einer Säurebehandlung unterworfen, um PMZ, die Schutzgruppen, zu entfernen, wodurch 78 mg eines Komplexes des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Gly-Gly-H erhalten wurden. Das ultraviolette Absorptionsspektrum dieses Komplexes ist in Fig. 9 gezeigt. Der Gehalt der Peptidkette in diesem Komplex betrug 11,3% (Gew.-%), wie in Übereinstimmung mit der Berechnungs gleichung (3), die zuvor angegeben wurde, bestimmt wurde.
- 50 mg dieses Komplexes wurden in 1%iger wässriger NaHCO&sub3;-Lösung (5 ml) aufgelöst, wozu eine Lösung (1 ml) des aktiven Esters von MTX hinzugefügt wurde, worauf die Mischung anschließend für 21 Stunden bei 4ºC der Reaktion unterworfen wurde. Die resultierende Reaktionslösung wurde in Ethanol (25 ml) gegossen. Der resultierende Niederschlag wurde gesammelt und anschließend im Vakuum getrocknet, um 52 mg eines Komplexes des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Gly-Gly-MTX [als einem weiteren Beispiel eines Komplexes mit der Formel (I)] als gelbes Pulver zu liefern. Das ultraviolett-sichtbare Absorptionsspektrum und das GFC-Elutionsmuster dieses Komplexes sind in Fig. 10 und in Fig. 11 abgebildet. Mit ultravioletter Absorptionsspektrophotometrie (bei 307 nm) wurde bestimmt, daß der Gehalt an MTX in diesem Komplex 21,4% (Gew.-%) betrug. Weiterhin war das P/X- Molverhältnis dieses Komplexes, genauer, das Verhältnis von MTX/Peptid (Molverhältnis) in diesem Komplex in Übereinstimmung mit der Berechnungsgleichung (5), die zuvor beschrieben wurde, 1,0. Im Hinblick auf diesen Komplex war der Wert von wie er für die Formel (I) definiert worden war, 0,2, so wie er in Übereinstimmung mit der Berechnungsgleichung (1), die zuvor angegeben wurde, berechnet wurde.
- In ähnlicher Weise wie im Beispiel 1 wurde Eiweiß-Lysozym mit 5 g Carboxymethylchitin (sein Carboxymethylierungsgrad war pro Zuckerrest 1,0) der Reaktion unterworfen, um ein depolymerisiertes Carboxymethylchitin (4,28 g) herzustellen. Ein Teil von 4,1 g des depolymerisierten Carboxylmethylchitins wurde einer Alkalibehandlung unterworfen, wodurch ein teilweise N acetyliertes Carboxymethylchitosan (2,22 g) mit einem Molekulargewicht von etwa 1 x 10&sup5; erhalten wurde.
- Man ließ einen aktiven Ester des N-geschützten Peptids mit der Formel N-Boc-Gly-Phe-Gly-Gly-OH (90 mg) mit dem teilweise N- acetylierten Carboxymethylchitosan (200 mg), so wie es oben erhalten wurde, in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 1 reagieren, um einen Komplex eines teilweise-N-acetylierten-Carboxymethylchitosan-Gly-Gly-Phe-Gly-Boc (210 mg) herzustellen. Ein Teil von 200 mg dieses Komplexes wurde anschließend N-acetyliert, um einen Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan- Gly-Gly-Phe-Gly-Boc (190 mg) herzustellen. Mit ultravioletter Absorptionsspektrophotometrie (bei 258 nm) wurde bestimmt, daß der Gehalt der N-Boc-Peptidkette in diesem Komplex 9,8% (Gew.- %) beträgt.
- Ein Teil von 160 mg dieses Komplexes wurde durch eine Säurebehandlung in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 1 von der Schutzgruppe befreit, um einen Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Gly-Phe-Gly-H zu erhalten (144 mg, mit einem Peptidgehalt von 7,6%).
- Ein aktiver Ester von MTX (55 mg) reagierte mit einem Teil von 120 mg des letzteren Komplexes, wodurch ein Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Gly-Phe-Gly-MTX (127 mg, mit einem MTX-Gehalt von 9,5%) hergestellt wurde. Im Hinblick auf diesen Komplex waren das Verhältnis von MTX/Peptid (Molverhältnis) in dem Komplex und sein Wert a/(a+b), der für die Formel (I) definiert wurde, 1,0 bzw. 0,07, so wie sie in Übereinstimmung mit den vorgenannten Berechnungsgleichungen (5) und (1) berechnet wurden.
- In ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 reagierte ein aktiver Ester eines N-geschützten Peptids, N-Boc-Gly-Phe-Gly-Phe-OH (105 mg) mit dem teilweise N-acetylierten Carboxymethylchitosan (200 mg), das im obigen Beispiel 3 erhalten wurde. Hierdurch wurde ein Komplex eines teilweise-N-acetylierten-Carboxymethylchitosan-Phe-Gly-Phe-Gly-Boc (199 mg) hergestellt.
- Ein Teil von 188 mg dieses Komplexes wurde N-acetyliert, so daß ein Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Phe-Gly-Phe-Gly- Boc (191 mg) hergestellt wurde. Mit ultravioletter Absorptionsspektrophotometrie (bei 258 nm) wurde der Gehalt der N-Boc- Peptidkette in diesem Komplex beu 4,9% (Gew.-%) bestimmt. Ein Teil von 160 mg dieses Komplexes wurde durch eine Säurebehandlung in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 1 von der Schutzgruppe befreit, um einen Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Phe-Gly-Phe-Gly-H (150 mg, mit einem Peptidgehalt von 4,0%) zu liefern. Anschließend reagierte ein aktiver Ester von MTX (23 mg) mit einem Teil von 50 mg des letzteren Komplexes, wodurch ein Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Phe- Gly-Phe-Gly-MTX (46 mg, mit einem MTX-Gehalt von 4,5 Gew.-%) hergestellt wurde. Im Hinblick auf diesen Komplex waren das MTX/Peptid-Molverhältnis in diesem Komplex und sein Wert a/(a+b), der für die Formel (I) definiert wurde, 1,1 und 0,03, so wie er mit den vorgenannten Berechnungsgleichungen (5) und (1) berechnet wurde.
- In ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 reagiert ein aktiver Ester eines N-geschützten Peptids, N-Boc-Phe-Gly-Phe-Gly-OH (54 mg), mit dem teilweise N-acetylierten Carboxymethylchitosan (100 mg), das in Beispiel 3 erhalten wurde. Auf diese Weise wurde ein Komplex. eines teilweise-N-acetylierten-Carboxymethylchitosan-Gly-Phe-Gly-Phe-Boc (109 mg) hergestellt.
- Ein Teil von 90 mg dieses Komplexes wurde unter Lieferung eines Komplexes des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Phe-Gly-Phe-Boc (85 mg) N-acetyliert. Mit ultravioletter Absorptionsspektrophotometrie (bei 258 nm) wurde bestimmt, daß der Gehalt der N- Boc-Peptidkette in diesem Komplex 12,7% (Gew.-%) ist. Von einem Teil von 72 mg dieses Komplexes wurde durch Säurebehandlung in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 die Schutzgruppe entfernt, um einen Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Phe-Gly- Phe-H (63 mg, mit einem Peptidgehalt von 10,4%) herzustellen.
- Anschließend reagierte ein aktiver Ester von MTX (23 mg) mit einem Teil von 50 mg des letzteren Komplexes, wodurch ein Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Phe-Gly-Phe-MTX (49 mg, mit einem MTX-Gehalt von 9,4%) hergestellt wurde. Im Hinblick auf diesen Komplex sind das Verhältnis von MTX/Peptid (Molverhältnis) in dem Komplex und sein Wert a/(a+b), der für die Formel (I) definiert wurde, 0,94 bzw. 0,07, wie in Übereinstimmung mit den vorgenannten Gleichungen (5) und (1) berechnet wurde.
- In ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 reagierte ein aktiver Ester eines N-geschützten Peptids, N-Boc-Ala-Gly-Gly-Gly-OH (180 mg) mit dem teilweise N-acetylierten Carboxymethylchitosan (200 mg), das in Beispiel 3 erhalten wurde, wodurch ein Komplex eines teilweise-N-acetylierten-Carboxymethylchitosan-Gly-Gly- Gly-Ala-Boc (218 mg) hergestellt wurde. Ein Teil von 150 mg dieses Komplexes wurde unter Lieferung eines Komplexes des N- Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Gly-Gly-Ala-Boc (143 mg) N-acetyliert. Ein Teil von 130 mg des letzteren Komplexes wurde einer Säurebehandlung unterworfen, um in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 die Schutzgruppe zu entfernen, und einen Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Gly-Gly-Ala-H (120 mg) herzustellen.
- Anschließend reagierte der aktive Ester von MTX (46 mg) mit einern Teil von 50 mg des letzterwähnten Komplexes, wodurch ein Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Gly-Gly-Ala-MTX (55 mg, mit einem MTX-Gehalt von 21,5%) erhalten wurde. Das ultraviolett-sichtbare Absorptionsspektrum und das GFC-Elutions muster des letzteren Komplexes sind in Fig. 12 und in Fig. 13 in den beigefügten Zeichnungen abgebildet.
- Ein teilweise N-acetyliertes Carboxymethylchitosan (45 mg), das aus Carboxymethylchitin (sein Carboxymethylierungsgrad war pro Zuckerrest 0,7) in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 1 hergestellt worden war, und das ein Molekulargewicht von etwa 1 x 10&sup5; hat, wurde in einer mit 0,1 M Borat-gepufferten Lösung (pH 8,0, 2 ml) aufgelöst, um eine Lösung des Polysaccharids herzu stellen. Andererseits wurde ein modifiziertes Peptid mit der Formel N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-Nitroanilid (45 mg) in Dimethyl-formamid (2 ml) aufgelöst, wozu anschließend N-Hydroxysuccinimid (12 mg) und N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (41 mg) zugegeben wurden. Die Peaktion wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur und anschließend für 18 Stunden bei 4ºC durchgeführt, so daß ein aktiver Ester des Peptids, das das Nitroanilid gebunden hat, hergestellt wurde. Die resultierende Reaktionslösung wurde unter reduziertem Druck destilliert, um das Lösungsmittel daraus zu entfernen. Der Rest wurde mit Isopropanol gewaschen und anschließend in Dimethylformamid (0,8 ml) aufgelöst. Die erhaltene Lösung wurde zu der oben erwähnten Polysaccharid-Lösung gegeben, und anschließend für 40 Stunden bei Raumtemperatur zur Reaktion gebracht. Zu der resultierenden Reaktionslösung wurde Ethanol hinzugefügt. Der Niederschlag, der sich bildete, wurde gesammelt und anschließend im Vakuum getrocknet, wodurch 46 mg eines Komplexes des teilweise-N-acetylierten- Carboxymethylchitosan-Suc-Ala-Ala-Ala-p-Nitroanilid erhalten wurden.
- 26 mg dieses Komplexes wurden genommen und in einer gesättigten wässrigen NaHCO&sub3;-Lösung (3 ml) aufgelöst, zu der anschließend Essigsäureanhydrid (0,14 ml) zugegeben wurde und die im folgenden für 24 Stunden bei 4ºC reagierte, um den Komplex am Stickstoff zu acetylieren. Nachdem die erhaltene Reaktionslösung gegen Wasser dialysiert worden war, wurde die resultierende nichtdialysierbare Lösung, die nach der Dialyse übrigblieb, in Ethanol gegossen. Der resultierende Niederschlag wurde im Vakuum getrocknet, so daß ein Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Suc-Ala-Ala-Ala-p-Nitroanilid (25 mg) erhalten wurde. Das ultraviolette Absorptionsspektrum und das GFC-Elutionsmuster dieses Komplexes sind in Fig. 14 und in Fig. 15 der beiliegenden Zeichnungen abgebildet. Mit der Absorptionsspektrophotometrie bei 315 nm wurde herausgefunden, daß der Gehalt der Bauemheit Suc-Ala-Ala-Ala-p-Nitroanilid in diesem Komplex 3,9% (Gew.-%) ist
- In ähnlicher Weise wie in Beispiel 7 wurde ein aktiver Ester eines modifizierten Peptids mit der Formel N-Succinyl-Ala-Ala- Val-Ala-p-Nitroanilid (55 mg) mit dem teilweise N-acetylierten Carboxymethylchitosan (45 mg) zur Reaktion gebracht, um einen Komplex des teilweise-N-acetylierten-Carboxymethylchitosan-Suc- Ala-Ala-Val-Ala-p-Nitroanilid (44 mg) herzustellen.
- Anschließend wurden 30 mg dieses Komplexes in ähnlicher Weise wie in Beispiel 7 am Stickstoff acetyliert (N-acetyliert), um einen Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Suc-Ala-Ala- Val-Ala-p-Nitroanilid (22 mg) zu ergeben. Anhand der Absorptionsspektrophotometrie bei 315 nm wurde festgestellt, daß der Gehalt der Bauemheit Suc-Ala-Ala-Val-Ala-p-Nitroanilid in dem letzteren Komplex 4,5% (Gew.-%) ist.
- Das teilweise N-acetylierte Carboxymethylchitosan (50 mg), das in Beispiel 1 erhalten wurde, wurde in einer 0,25%igen wässrigen NaHCO&sub3;-Lösung (7 ml) aufgelöst und zu der resultierenden gleichförmigen Lösung des Polysaccharids wurde Dimethylformamid (6 ml) hinzugegeben. Andererseits wurde ein Phenylalanin, das durch eine Schutzgruppe Boc geschützt worden war und durch eine Formel N-Boc-Phe-OH (256 mg) gezeigt ist, in 3 ml Dimethylformamid aufgelöst. Anschließend wurden N-Hydroxysuccinimid (115 mg) und N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (190 mg) zu der resultierenden Lösung hinzugegeben. Die Reaktion wurde für 20 Stunden bei 4ºC durchgeführt, um einen aktiven Ester des N-geschützten Phenylalanin herzustellen. Ein Teil von 1 ml der resultierenden Reaktionslösung, die den aktiven Ester enthielt, wurde zu der oben erwähnten Polysaccharid-Lösung hinzugegeben. Anschließend ließ man die Lösung bei Raumtemperatur für 20 Stunden reagieren. Die erhaltene Reaktionslösung wurde zu Ethanol (35 ml) zugesetzt. Der resultierende Niederschlag wurde gesammelt und anschließend im Vakuum getrocknet, wodurch 51 mg eines Komplexes des teilweise-N-acetylierten-Carboxymethylchitosan-Phe-Boc erhalten wurden. Mit der ultravioletten Absorptionsspektrophotometrie (bei 258 nm) wurde bestimmt, daß der Gehalt des N-Boc-Phenylalanin (Phe-Boc) in diesem Komplex 14,4% (Gew.-%) ist.
- Das depolymerisierte Carboxymethylchitin (4,1 g), das auf eine ähnliche Weise wie in Beispiel 3 hergestellt worden war, wurde mittels Alkalibehandlung am Stickstoff teilweise deacetyliert und die resultierende Reaktionslösung wurde auf pH 8,5 eingestellt. Die Reaktionslösung wurde anschließend zentrifugiert und der Überstand wurde zu dem 4,4-fachen Volumen von Methanol hinzugefügt. Die resultierende Mischung wurde in den Überstand ünd den Niederschlag getrennt. Zu dem Überstand wurde Ethanol (300 ml) hinzugefügt. Der resultierende Niederschlag wurde gesammelt und anschließend im Vakuum getrocknet, so daß 0,54 g des teilweise-N-acetylierten-Carboxymethylchitosan mit einem Molekulargewicht von etwa 2 x 10&sup4; erhalten wurde.
- Diese Chitosan-Substanz (100 mg) reagierte in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 mit einem N-geschützten Peptid mit der Formel N-Boc-Phe-Gly-Phe-Gly-OH (217 mg). Anschließend wurde es mit Essigsäuseanhydrid N-acetyliert, wodurch ein Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Phe-Gly-Phe-Boc (98 mg, mit einem Gehalt an N-Boc-Peptid von 28%) hergestellt wurde. Dieser Komplex (80 mg) wurde durch Säurebehandlung zur Entfernung der Boc-Gruppen in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 von den Schutzgruppen befreit, um einen Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Phe-Gly-Phe-H (46 mg, mit einem Peptidgehalt von 24%) zu liefern.
- Der -aktive Ester von Methotrexat (MTX, 69 mg) reagierte in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 mit 35 mg des obigen Komplexes, so daß ein Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Phe Gly-Phe-MTX (35 mg, mit einem MTX-Gehalt von 19%) erhalten wurde. Im Hinblick auf diesen Komplex waren das MTX/Peptid-Molverhältnis in dem Komplex und der Wert a/(a+b), der für die Formel (I) definiert wurde, 0,92 bzw. 0,19, wie in Übereinstimmung mit den vorgenannten Gleichungen (5) und (1) berechnet wurde.
- Das teilweise N-acetylierte Carboxymethylchitosan (50 mg), das in ähnlicher Weise wie in Beispiel 10 hergestellt worden war und das ein Molekulargewicht von etwa 2 x 10&sup4; hat, wurde in einer Lösungsmittelmischung aus Wasser (1,25 ml) und Dimethylsulfoxid (1,25 ml) aufgelöst. In ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 wurde ein aktiver Ester eines geschützten Peptids mit der Formel N-Succinyl-Gly-Phe-Gly-Lys(ε-N-Boc)-O-tBu (169 mg) mit der Chitosan-Substanz zur Reaktion gebracht, wodurch ein Komplex des teilweise-N-acetylierten-Carboxymethylchitosan-Suc- Gly-Phe-Gly-Lys(ε-N-Boc)-O-tBu hergestellt wurde. Dieser Komplex wurde N-acetyliert und anschließend durch eine Säurebehandlung von der Schutzgruppe getrennt, um einen Komplex des N- Acetylcarboxymethylchitosan-Suc-Gly-Phe-Gly-Lys-H (47 mg) herzustellen.
- Der aktive Ester von Methotrexat (MTX) (23 mg) wurde mit 35 mg des obigen Komplexes zur Reaktion gebracht, wodurch ein Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Suc-Gly-Phe-Gly-Lys-MTX (29 mg, mit einem MTX-Gehalt von 1,5 Gew.-%) erhalten wurde. Das ultraviolett-sichtbare Absorptionsspektrum und das GFC-Elutionsmuster dieses Komplexes sind in Fig. 20 und in Fig. 21 der beiliegenden Zeichnungen abgebildet.
- In ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 ließ man 25 mg Eiweiß-Lysozym mit 5,0 g Carboxymethylchitin (sein Carboxymethylierungsgrad war pro Zuckerrest 0,7) reagieren, so daß ein depolymerisiertes Carboxymethylchitin (4,37 g) erhalten wurde. Ein Teil von 3,7 g dieser Chitin-Substanz wurde teilweise durch Alkalibehandlung deacetyliert, um ein teilweise N-acetyliertes Carboxymethylchitosan (2,58 g) mit einem Molekulargewicht von etwa 1 x 10&sup5; (unter Benutzung von Dextran als Standardsubstanz gemessen) zu ergeben.
- Der aktive Ester (N-Hydroxysuccinimido-Ester) eines N-geschützten Peptids mit der Formel N-Boc-Phe-Phe-Gly-OH (141 mg) reagierte in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 mit dem oben erwähnten teilweise N-acetylierten Carboxymethylchitosan (300 mg), um einen Komplex von teilweise-N-acetylierten-Carboxymethylchitosan-Gly-Phe-Phe-Boc (340 mg) herzustellen. 300 mg dieses Komplexes wurden mit Essigsäureanhydrid N-acetyliert, so daß ein Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Phe-Phe- Boc (298 mgl mit einem Gehalt des N-Boc-Peptids von 12,0%) erhalten wurde.
- Ein Teil von 100 mg des obigen Komplexes wurde durch eine Säurebehandlung (zur Entfernung der Boc-Gruppen) in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 1 von den Schutzgruppen befreit, um einen Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Phe-Phe-H (89 mg) herzustellen.
- Ein Teil von 75 mg dieses Komplexes wurde in einer 1%igen wässrigen NaHCO&sub3;-Lösung (7,5 ml) aufgelöst, wozu anschließend der aktive Ester von Methotrexat (MTX) (75 mg) hinzugegeben wurde. Die Reaktion wurde für 24 Stunden bei 4ºC durchgeführt, um MTX an die N-endständigen Peptidbaueinheiten des Komplexes zu binden. Die erhaltene Reaktionslösung wurde zu Ethanol (40 ml) hinzugefügt. Der resultierende Niederschlag wurde gesammelt und anschließend im Vakuum getrocknet, so daß ein Komplex des N- Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Phe-Phe-MTX (75 mg, mit einem MTX-Gehalt von 10,1 Gew.-%) als gelbes Pulver erhalten wurde. Das ultraviolett-sichtbare Absorptionsspektrum und das GFC-Elutionsmuster dieses Komplexes sind in der Fig. 22 und in der Fig. 23 der beigefügten Zeichnungen abgebildet.
- 2,0 g Carboxymethylchitin (sein Carboxymethylierungsgrad war 0,7) wurden in einer 0,05 M Acetat-gepufferten Lösung (pH 6,0, 200 ml) aufgelöst, zu der Eiweiß-Lysozym (2,5 mg) anschließend hinzugefügt wurden. Die resultierende Lösung wurde für 1,5 Stunden für die Reaktion bei 37ºC aufbewahrt, wodurch ein depolymerisiertes Carboxymethylchitin erhalten wurde. Dieses depolymerisierte Carboxymethylchitin wurde anschließend mit einer wässrigen 1 N NaOH in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 1 behandelt, um 1,72 g eines teilweise N-acetylierten Carboxymethylchitosans mit einem Molekulargewicht von etwa 3 x 10&sup5; (unter Benutzung von Dextran als Standardsubstanz gemessen) zu liefern. Dieses teilweise N-acetylierte Carboxylmethylchitosan (150 mg) wurde in einer 0,5%igen wässrigen NaHCO&sub3;-Lösung (15 ml) aufgelöst und anschließend mit einem aktiven Ester eines N- geschützten Peptids mit der Formel N-Boc-Ala-Gly-Gly-Gly-OH (135 mg) in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 1 zur Reaktion gebracht, um einen Komplex des teilweise N-acetylierten Carboxymethylchitosan-Gly-Gly-Gly-Ala-Boc (150 mg) herzustellen. Ein Teil von 140 mg dieses Komplexes wurde mit Essigsäureanhydrid N-acetyliert, um einen Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Gly-Gly-Ala-Boc (154 mg) herzustellen. Ein Teil von 130 mg des letzteren Komplexes wurde mit Säure behandelt, um die Boc-Gruppen davon zu entfernen, so daß ein Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Gly-Gly-Ala-H (106 mg) hergestellt wurde. Ein Teil von 95 ml dieses Komplexes wurde in einer l%igen wässrigen NaHCO&sub3;-Lösung (4,8 ml) aufgelöst und anschließend mit dem aktiven Ester von MTX (86 mg) in der resultierenden Lösung zur Reaktion gebracht, um einen Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Gly-Gly-Ala-MTX (88 mg, mit einem MTX-Gehalt von 13,7 Gew.-%) herzustellen.
- In einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 1 reagiert ein aktiver Ester eines N-geschützten Peptids mit der Formel N-Boc-Gly-Gly- Gly-OH (109 mg) mit dem teilweise N-acetylierten Carboxymethylchitosan (150 mg), das in Beispiel 12 erhalten wurde, um einen Komplex des teilweise-N-acetylierten-Carboxymethylchitosan-Gly-Gly-Gly-Boc (167 mg) herzustellen. 150 mg dieses Komplexes wurden mit Essigsäureanhydrid N-acetyliert, so daß ein Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Gly-Gly-Boc (153 mg) hergestellt wurde. Ein Teil von 130 mg des letzteren Komplexes wurde einer Säurebehandlung unterworfen, um die Boc- Gruppen daraus zu entfernen und einen Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Gly-Gly-H (110 mg) herzustellen. Diesen Komplex (100 mg) ließ man mit dem aktiven Ester von MTX (90 mg) reagieren, wodurch ein Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Gly-Gly-MTX (111 mg, mit einem MTX-Gehalt von 17,4 Gew.-%) erhalten wurde.
- In einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 1 wurde ein aktiver Ester eines N-geschützten Peptids mit der Formel N-Boc-Ala-Gly- Gly-Gly-OH (135 mg) mit dem teilweise N-acetylierten Carboxymethylchitosan (150 mg), das in Beispiel 12 erhalten wurde, zur Reaktion gebracht, um einen Komplex des teilweise-N-acetylierten-Carboxymethylchitosan-Gly-Gly-Gly-Ala-Boc (162 mg) herzustellen. 150 mg dieses Komplexes wurden mit Essigsäureanhydrid N-acetyliert, so daß ein Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Gly-Gly-Ala-Boc (157 mg) hergestellt wurde. 130 mg des letzteren Komplexes wurden einer Säurebehandlung unterworfen, um die Boc-Gruppen daraus zu entfernen und einen Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Gly-Gly-Ala-H (114 mg) herzustellen. Dieser Komplex (100 mg) wurde mit dem aktiven Ester von MTX (90 mg) zur Reaktion gebracht, wodurch ein Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Gly-Gly-Ala-MTX (111 mg, mit einem MTX-Gehalt von 17,4%) erhalten wurde.
- In ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 wurde ein aktiver Ester eines N-geschützten Peptids mit der Formel N-Boc-Gly-Phe-Gly- Gly-OH (87 mg) mit dem teilweise N-acetylierten Carboxymethylchitosan (200 mg), wie es in Beispiel 12 erhalten wurde, zur Reaktion gebracht, um einen Komplex des teilweise-N-acetylierten-Carboxymethylchitosan-Gly-Gly-Phe-Gly-Boc (206 mg) herzustellen. 100 mg dieses Komplexes wurden mit Essigsäureanhydrid N-acetyliert, so daß ein Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Gly-Phe-Gly-Boc (92 mg, mit einem Gehalt an N-Boc- Peptid von 7,4%) hergestellt wurde. Ein Teil von 80 mg des letzteren Komplexes wurde einer Säurebehandlung unterworfen, um die Boc-Gruppen daraus zu entfernen und einen Komplex des N- Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Gly-Phe-Gly-H (71 mg) zu ergeben. Dieser Komplex (50 mg) wurde mit dem aktiven Ester von MTX (45 mg) zur Reaktion gebracht, wodurch ein Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Gly-Phe-Gly-MTX (50 mg, mit einem MTX-Gehalt von 7,0%) erhalten wurde.
- Ein Teil von 50 mg des Komplexes des teilweise-N-acetylierten- Carboxymethylchitosan-Gly-Phe-Phe-Boc (mit seinem Carboxymethylierungsgrad von 0,7 und einem Gehalt des N-Boc-Peptids von 13,2%), das in Beispiel 12 erhalten wurde, wurde in einer 0,1%igen wässrigen NaHCO&sub3;-Lösung (2,5 ml) aufgelöst, worauf anschließend 2-O-mono-methoxypolyethylenglycol-3, 5-dichloro-striazin (80 mg) (mit einem Molekulargewicht von 5000, ein Produkt der Sigma Corporation; im weiteren als "PEG&sub1;" abgekürzt) zu der Lösung hinzugegeben wurde. Die Reaktion wurde bei 0ºC für 4 Stunden durchgeführt. Zu der resultierenden Reaktionslösung, die einen hergestellten Komplex des teilweise-N-acetylierten-Carboxymethylchitosan-(PEG&sub1;)-Gly-Phe-Phe-Boc enthielt, wurden Wasser (2,5 ml), Natriumhydrogencarbonat (500 mg) und Essigsäureanhydrid (200 µl) zugegeben. Anschließend reagierte die Mischung bei 4ºC für 18 Stunden, um die N-Acetylierung des Komplexes zu vervollständigen. Die erhaltene Reaktionslösung wurde gegen Wasser dialysiert. Die resultierende nicht-dialysierbare Lösung wurde auf 3 ml konzentriert, zu welchen Aceton (90 ml) hinzugefügt wurde. Der resultierende Niederschlag wurde gesammelt, mit Methylenchlorid gewaschen und anschließend im Vakuum getrocknet, um einen Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-(PEG&sub1;)-Gly-Phe-Phe-Boc (72 mg, mit dem PEG-Gehalt von 37%) zu erhalten.
- Dieser Komplex (60 mg) wurde in 0,5 N HCl (3,5 ml) aufgelöst und die resultierende Lösung wurde bei 3º0C für 16 Stunden aufbewahrt, um die Reaktion für die Entfernung der Boc-Gruppen aus dem Komplex zu bewirken. Die erhaltene Reaktionslösung wurde zu einer Lösungsmittelmischung (60 ml) von Ethanol und Ether im Verhältnis 1:2 hinzugegeben. Der resultierende Niederschlag wurde gesammelt, mit Methylenchlorid gewaschen und anschließend -im Vakuum getrocknet, so daß ein Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-(PEG&sub1;)-Gly-Phe-Phe-H (44 mg, mit dem PEG-Gehalt von 26%) erhalten wurde. Ein GFC-Elutionsmuster dieses Komplexes ist in der Fig. 24 der beigefügten Zeichnungen wiedergegeben. Dieser N-Acetylcarboxymethylchitosan-(PEG&sub1;)-Gly-Phe-Phe- H Komplex (35 mg) wurde in einer 1%igen wässrigen NaHCO&sub3;-Lösung (1,75 ml) aufgelöst, zu welcher der aktive Ester von MTX (16 mg) hinzugegeben wurde. Die Reaktion wurde bei 4ºC für 18 Stunden durchgeführt. Die erhaltene Reaktionslösung wurde gegen Wasser dialysiert. Die resultierende nicht-dialysierbare Lösung wurde auf 3 ml konzentriert, worauf anschließend Aceton (60 ml) hinzugegeben wurde. Der resultierende Niederschlag wurde gesammelt, mit Methylenchlorid gewaschen und anschließend im Vakuum getrocknet, wodurch ein Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-(PEG&sub1;)-Gly-Phe-Phe-MTX (29 mg, mit dem PEG-Gehalt von 21% und einem MTX-Gehalt von 7,9%) in der Form eines gelben Pulvers als ein Beispiel für die Derivate mit der Formel (X) erhalten wurde. Das ultraviolett-sichtbare Absorptionsspektrum und das GFC-Elutionsmuster des letzteren Komplexes sind in Fig. 25 und in Fig. 26 der beigefügten Zeichnungen gezeigt.
- Ein Teil von 50 mg des teilweise-N-acetylierten-Carboxymethylchitosan-Gly-Phe-Phe-Boc Komplex (mit seinem Carboxymethylierungsgrad von 0,7 und einem Gehalt des N-Boc-Peptids von 13,2%), der in Beispiel 12 erhalten wurde, wurde in einer 0,1%igen wässrigen NaHCO&sub3;-Lösung (2,5 ml) aufgelöst, und zu der resultierenden Lösung wurde das PEG&sub1; (12 mg), das in Beispiel 17 benutzt wurde, hinzugegeben. Dadurch, daß die Reaktion in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 17 bewirkt wurde, wurde ein Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-(PEG&sub1;)-Gly-Phe- Phe-Boc (49 mg, mit dem PEG-Gehalt von 8,0%) hergestellt. 40 mg dieses Komplexes wurden einer, die Schutzgruppen entfernenden Behandlung, zur Entfernung der Boc-Gruppen daraus unterworfen, um einen Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-(PEG&sub1;)-Gly- Phe-Phe-H (33 g) zu liefern. Dieser Komplex (21 mg) wurde in einer 1%igen wässrigen NaHCO&sub3;-Lösung (1,1 ml) aufgelöst, zu welcher anschließend der aktive Ester von MTX (9,5 mg) hinzugegeben wurde. Die resultierende Mischung wurde bei 4ºC für 18 Stunden für die Reaktion aufbewahrt. Die Reaktionslösung wurde zu Ethanol (11 ml) hinzugegeben. Der resultierende Niederschlag wurde gesammelt, mit Methylenchlorid gewaschen, und anschließend im Vakuum getrocknet, wodurch ein Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-(PEG&sub1;)-Gly-Phe-Phe-MTX (17 mg, mit dem PEG-Gehalt von 6,1% und einem MTX-Gehalt von 8,6%) erhalten wurde.
- Ein Teil von 50 mg des teilweise-N-acetylierten-Carboxymethylchitosan-Gly-Phe-Phe-Boc Komplex (mit seinem Carboxymethylierungsgrad von 0,7 und einem Gehalt des N-Boc-Peptids von 14,8%), das gemäß dem obigen Beispiel 12 hergestellt worden war, wurde in einer 0,1%igen wässrigen NaHCO&sub3;-Lösung (5 ml) aufgelöst. Anschließend wurde PEG&sub1; (200 mg) zu der Lösung hinzugegeben. Dadurch, daß die Reaktion in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 17 bewirkt wurde, wurde ein Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-(PEG&sub1;)-Gly-Phe-Phe-Boc (100 mg, mit dem PEG-Gehalt von 58%) hergestellt. Ein Teil von 90 mg des letzteren Komplexes wurde zur Entfernung der Boc-Gruppen einer Säurebehandlung unterworfen, um einen Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-(PEG&sub1;)-Gly-Phe-Phe-H(67 mg, mit dem PEG-Gehalt von 45%) zu ergeben. In ähnlicher Weise wie in Beispiel 17 wurde dieser Komplex (50 mg) mit dem aktiven Ester von MTX zur Reaktion gebracht, wobei ein Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-(PEG&sub1;)-Gly-Phe-Phe-MTX (42 mg, mit dem PEG-Gehalt von 43% und einem MTX-Gehalt von 6,3 %) erhalten wurde.
- Ein Teil von 25 mg des Komplexes eines teilweise-N-acetylierten-Carboxymethylchitosan-Gly-Gly-Phe-Gly-Boc (mit seinem Carb oxymethylierungsgrad von 0,7 und einem Gehalt an N-Boc-Peptid von 7,9%), das in ähnlicher Weise wie in Beispiel 16 hergestellt worden war, wurde in einer 0,1%igen wässrigen NaHCO&sub3;-Lösung (1,25 ml) aufgelöst, zu der PEG&sub1; (50 mg) hinzugegeben wurde. Dadurch, daß die Reaktion in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 17 bewirkt wurde, wurde ein Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-(PEG&sub1;)-Gly-Gly-Phe-Gly-Boc (42 mg, mit dem PEG-Gehalt von 42%) hergestellt. 30 mg dieses Komplexes wurden zur Entfernung der Boc-Gruppen einer Säurebehandlung unterworfen, um einen Komplex des N-Acetylcarboxymethylchito san-(PEG&sub1;)-Gly-Gly-Phe-Gly-H (20 mg) zu liefern. Der letztere Komplex wurde mit dem aktiven Ester von MTX in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 17 zur Reaktion gebracht, so daß ein Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-(PEG&sub1;)-Gly-Gly-Phe-Gly- MTX (11 mg, mit dem PEG-Gehalt von 27% und einem MTX-Gehalt von 6,1%) hergestellt wurde.
- Ein Teil von 100 mg des Komplexes des teilweise-N-acetylierten- Carboxymethylchitosan-Gly-Phe-Phe-Boc (mit seinem Carboxyme thylierungsgrad von 0,7 und einem Gehalt an N-Boc-Peptid von 14,8%), das in ähnlicher Weise wie in Beispiel 12 hergestellt worden war, wurde in einer 0,5%igen wässrigen NaHCO&sub3;-Lösung (10 ml) aufgelöst, wozu anschließend Dimethylformamid (8,5 ml) hinzugegeben wurde, damit sich eine gleichförmige Lösung ergibt. Zu dieser Lösung wurde ein aktiver Ester (100 mg) einer Methoxypolyoxyethylencarbonsäure (mit einem Molekulargewicht von 5000, ein Produkt der Sigma Corporation, hier im weiteren als "PEGCO" abgekürzt) hinzugegeben und die resultierende Lösung wurde für 18 Stunden bei 4ºC aufbewahrt, um die Reaktion zu bewirken, damit sich die PEGCO-Kette mit den nicht-N-acetylierten Aminogruppen, die in den Zuckereinheiten des Komplexes vorhanden sind, verbindet. Die resultierende Reaktionslösung wurde gegen Wasser dialysiert. Zu der resultierenden nicht-dialysierbaren Lösung (27 ml) wurden Natriumhydrogencarbonat (3,6 g) und Essigsäureanhydrid (2,1 ml) hinzugegeben. Anschließend wurde bei 4ºC für 20 Stunden die Acetylierung bewirkt, so daß der teilweise-N-acetylierte-Carboxymethylchitosan-(PEGCO)-Gly-Phe- Phe-Boc Komplex N-acetyliert wurde. Die erhaltene Reaktionslösung wurde gegen Wasser dialysiert. Die resultierende nichtdialysierbare Lösung wurde auf 6 ml konzentriert, zu denen Aceton (120 ml) hinzugefügt wurde. Der resultierende Niederschlag wurde gesammelt, mit Methylenchlorid gewaschen und anschließend im Vakuum getrocknet, um einen Komplex eines N-Acetylcarboxymethylchitosan-(PEGCO)-Gly-Phe-Phe-Boc (109 mg, mit dem PEG-Gehalt von 9,0%) zu liefern. Ein Teil von 50 mg des letzteren Komplexes wurde zur Entfernung der Boc-Gruppen daraus einer Säurebehandlung unterworfen, um einen Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-(PEGCO)-Gly-Phe-Phe-H (35 mg, mit dem PEG-Gehalt von 4,7%) herzustellen. Dieser Komplex (25 mg) wurde mit dem aktiven Ester von MTX in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 18 zur Reaktion gebracht, wodurch ein Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-(PEGCO)-Gly-Phe-Phe-MTX (25 mg, mit dem PEG-Gehalt von 4,5% und einem MTX-Gehalt von 9,1%) hergestellt wurde.
- Ein aktiver Ester eines N-geschützten Peptids mit der Formel N- Boc-Gly-Gly-Gly-OH (289 mg) wurde mit einem teilweise N-acetylierten Carboxymethylchitqsan (300 mg), das so wie in Beispiel 1 hergestellt worden war, in einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 1 zur Reaktion gebracht, um einen teilweise-N-acetylierten-Carboxymethylchitosan-Gly-Gly-Gly-Boc Komplex (334 mg) herzustellen.
- Ein Teil von 125 mg dieses Komplexes wurde in Wasser (12 ml) aufgelöst und anschließend wurde ein 3,3%iges wässriges Natriummetaperiodat (5 ml) hinzugegeben. Die Reaktion wurde im Dunkeln für 4 Stunden bei Raumtemperatur bewirkt. Nachdem die resultierende Reaktionslösung gegen Wasser dialysiert worden war, wurde die resultierende nicht-dialysierbare Lösung auf etwa 12 ml konzentriert, und Natriumborhydrid (30 mg) wurden hinzugegeben. Die Reduktionsreaktion wurde anschließend über Nacht bewirkt. Der pH-Wert der resultierenden Reaktionslösung wurde bis auf 4,5 abgesenkt und anschließend wieder auf 8,0 erhöht. Anschließend wurde die Reaktionslösung in Ethanol (60 ml) zugege ben. Der resultierende Niederschlag wurde gesammelt und anschließend im Vakuum getrocknet, wodurch ein Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Gly-Gly-Boc (77 mg) hergestellt wurde, bei welchem einige Pyranose-Ringe geöffnet worden waren und der in das Derivat eines Polyalkohols umgewandelt worden waren.
- Ein Teil von 60 mg dieses Komplexes wurde in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 zur Entfernung der Boc-Gruppen aus dem Komplex einer Säurebehandlung unterworfen, wodurch ein Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Gly-Gly-H, der in das Polyalkohol-Derivat umgewandelt worden war, hergestellt wurde (Ausbeute: 46 mg). Ein aktiver Ester von MTX (46 mg) wurde mit mg des letzteren Komplexes zur Reaktion gebracht, um einen Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Gly-Gly-MTX, der in das Polyalkohol-Derivat umgewandelt wurde (42 mg, mit einem MTX-Gehalt von 29%) herzustellen. Das ultraviolett-sichtbare Absqrptionsspektrum und das GFC-Elutionsmuster des zuletzt erwähnten Komplexes sind in der Fig. 27 und in der Fig. 28 der begleitenden Zeichnungen abgebildet.
- Ein aktiver Ester eines N-geschützten Peptids mit der Formel N- Boc-Gly-Phe-Phe-Gly-OH (527 mg) wurde mit einem teilweise N- acetylierten Carboxymethylchitosan (250 mg), das in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt worden war, in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 zur Reaktion gebracht, um einen Komplex des teilweise-N-acetylierten-Carboxymethylchitosan-Gly-Phe-Phe- Gly-Boc (327 mg) herzustellen. Ein Teil von 200 mg dieses Komplexes wurde einer Periodatoxidation unterworfen und anschließend in einer ähnlichen Weise wie im obigen Beispiel 22 reduziert. Auf diese Weise wurde ein Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Phe-Phe-Gly-Boc, der in das Polyalkohol-Derivat (113 mg, mit einem Gehalt an N-Boc-Peptid von 28%) umgewandelt worden war, hergestellt.
- Ein Teil von 60 mg des letzteren Komplexes wurde in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 zum Entfernen der Boc-Gruppen aus dem Komplex einer Säurebehandlung unterworfen. Auf diese Weise wurde ein Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Phe Phe-Gly-H, der in das Polyalkohol-Derivat (36 mg, mit einem Peptidgehalt von 24%) umgewandelt worden war, hergestellt. Dieser Komplex (30 mg) wurde mit dem aktiven Ester von MTX (55 mg) zur Reaktion gebracht, um einen Komplex des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Phe-Phe-Gly-MTX (22 mg, mit einem MTX-Gehalt von 19%), der in das Polyalkohol-Derivat umgewandelt worden war, hergestellt. Im Hinblick auf diesen Komplex sind das MTX/Peptid-Molverhältnis in dem Komplex und sein Wert a/(a+b), wie er für die Formel (I) definiert wurde, 0,93 bzw. 0,19, wie sie mit den vorgenannten Gleichungen (5) und (1) berechnet wur den.
- Die Eigenschaften der Derivate mit den Formeln (I), (X) oder (XI) gemäß der vorliegenden Erfindung wurden in den folgenden Experimenten 1 bis 4 getestet.
- Der N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Phe-Phe-MTX Komplex, der in Beispiel 1 erhalten wurde, und der N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Gly-Gly-MTX Komplex, der in Beispiel 2 erhalten wurde, wurden als Testsubstanzen benutzt und einzeln in einer physiologischen Kochsalzlösung aufgelöst, um zwei Lösungen der Probe mit 400 µg/ml zuzubereiten. Zu dem Plasma (190 µl), das durch das Zentrifugieren einer Blutmenge, die von verschiedenen Mäusen gesammelt worden war, erhalten worden war, wurde ein Teil von 10 µl jeder Probenlösung hinzugegeben und anschließend bei 37ºC zur Reaktion gebracht. Aus der resultierenden Reaktionsmischung wurden in Zeitintervallen Testlösungen abgetrennt. Nachdem jede Testlösung der Reaktionsmischung von Proteinen getrennt worden war, wurden die Testlösungen mittels eines chromatographischen Gelfiltrationsverfahrens analysiert, so daß der Prozentsatz des verbleibenden Gehalts an MTX, der die Anfangsform seines Komplexes im Plasma beibehielt, bestimmt wurde (es wurde eine TSK-gel G4000 PWXL-Säule benutzt, die mit 0,1 M NaCl mit einer Flußrate von 0,8 ml/min und bei einer Säulentemperatur von 40ºC eluiert wurde, wobei die Detektion durch ultraviolette Absorption (bei 307 nm) durchgeführt wurde)
- Die Testergebnise sind in Fig. 16 der beiliegenden Zeichnungen graphisch dargestellt, wobei die Graphik die zeitabhängigen Veränderungen bezüglich des Prozentsatzes des restlichen Gehalts an MTX, das im Plasma unter Beibehaltung der Form des Komplexes, der durch die Formel (I) wiedergegeben wird, vorhanden war, wiedergibt. In dieser Graphik zeigt die unterbrochene Linie mit Punkten ( ) die Testergebnisse an, die mit dem N- Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Phe-Phe-MTX Komplex erhalten wurden, während die durchgezogene Linie mit den Quadraten ( ) die Testergebnisse angibt, die mit dem N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Gly-Gly-MTX Komplex erhalten wurden.
- Es ist aus Fig. 16 entnehmbar, daß die obigen zwei Komplexe im Blutkreislauf praktisch nicht abgebaut werden und daß sie im Blut stabil bleiben.
- Der N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Phe-Phe-MTX Komplex (1 mg), der in Beispiel 1 erhalten wurde, und der N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Gly-Gly-MTX Komplex, der in Beispiel 2 erhalten wurde, wurden als Testproben herangezogen und einzeln in 0,1 M Acetatpuffer (pH 6,0, 1 ml) bei 37ºC in der Anwesenheit oder in der Abwesenheit von Eiweiß-Lysozym (10 ug) zur Reaktion gebracht. Nach 1, 3, 6 und 23 Stunden wurden aus der Reaktionsmischung Testlösungen entnommen, die anschließend mit einem chromatographischen Gelfiltrationsverfahren, das in Experiment 1 beschrieben wurde, analysiert wurden. Auf diesem Weg wurde die Verlängerung der Elutionszeit des enthaltenen Komplexes (nach der Gelfiltration) durch die Abnahme des Molekulargewichts des Komplexes infolge des Abbaus seiner N-Acetylcarboxymethylchitosan-Baueinheit bestimmt.
- Die Testergebnisse sind in der Fig. 17 der beiliegenden Zeichnungen graphisch wiedergegeben, wobei die Graphik zeigt, wie die Reaktionszeit mit der Elutionszeit, bei der die Elution eines Peaks des Komplexes nach der Elution der Reaktionsmischungen an den unterschiedlichen Punkten der Reaktionszeit erschien, korrelierte. In der Graphik zeigen die Linien mit Kreisen ( ) und die unterbrochenen Linien mit Punkten ( ) die Testergebnisse an, die mit dem N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly- Phe-Phe-MTX Komplex erhalten wurden, der in der Abwesenheit von Lysozyrn und in der Anwesenheit von Lysozym getestet wurde. Die Linien mit Quadraten ( ) und die unterbrochenen Linien mit ausgefüllten Quadraten (E) zeigen indes die Testergebnisse an, die mit dem N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Gly-Gly-MTX Komplex erhalten wurden, der in der Abwesenheit von Lysozyrn und in der Anwesenheit von Lysozym getestet wurde.
- Es kann aus Fig. 17 entnommen werden, daß die N-Acetylcarboxymethylchitosan-Baueinheit der getesteten Komplexe unter der Wirkung von Lysozym einem Abbau unterliegt, und daß als Ergebnis beide Komplexe bezüglich ihres Molekulargewichts kleiner werden. Demgemäß wird erwartet, daß die Komplexe nicht über eine zu lange Zeit im Körper verbleiben.
- Der N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Gly-Gly-MTX Komplex aus Beispiel 2, in welchem der MTX-Teil ³H-markiert wurde, wurde als Testprobenverbindung benutzt. Zusätzlich wurde ein ³H-markiertes Produkt des teilweise N-acetylierten Carboxymethylchitosan, wie es im Verlauf des Verfahrens aus Beispiel 1 erhalten wurde, als Vergleichsprobe verwendet.
- In dem folgenden Experiment wurden tumortragende männliche 1CRMäuse verwandt, die eine subkutane Implantation von Sarcoma 180 erhalten hatten und die man anschließend für 10 Tage heranwachsen ließ. Die zu testende Probenverbindung wurde in physiologischer Kochsalzlösung aufgelöst. Unter Verwendung von drei Mäusen pro Gruppe wurde die Lösung der zu testenden Probenverbindung in einer Dosis von 20 mg/kg durch die Schwanzvene verabreicht. 15 Minuten, 30 Minuten, 1 Stunde, 2 Stunden, 6 Stunden und 24 Stunden nach der Verabreichung wurden die Oberschenkelartene und die Oberschenkelvene der Mäuse der berücksichtigten Gruppen aufgeschnitten, um die Blutproben zu sammeln. Die Radioaktivität einer Serumprobe, die durch das Zentrifugieren jeder der Blutproben erhalten wurde, und die Radioaktivität eines Krebsgewebes, das von der entsprechenden Maus entnommen wurde, wurden mit der Verbrennungsanalyse gemessen. Auf diese Weise wurden die Konzentrationen der zu testenden Probenverbindung, die im Serum oder im Krebsgewebe vorhanden sind, bestimmt.
- Die Testergebnisse sind in den Fig. 18 und 19 der beigefügten Zeichnungen graphisch wiedergegeben. Fig. 18 ist eine Graphik, die die zeitabhängigen Schwankungen der Konzentration der zu testenden Probenverbindung, die im Blutserum vorhanden ist, zeigt, wohingegen Fig. 19 eine Graphik ist, die die zeitabhän gigen Schwankungen der Konzentration der zu testenden Probenverbindung zeigt, die im Krebsgewebe vorhanden ist. In beiden Graphiken zeigt die Linie mit den Quadraten ( ) die Ergebnisse, die mit der Vergleichsprobe erhalten wurden, wohingegen die Linie mit den Punkten ( ) die Ergebnisse zeigt, die mit dem zu testenden Probenkomplex erhalten wurden.
- Aus Fig. 18 kann verstanden werden, daß zu erwarten ist, daß der zu testende Probenkomplex im Blutkreislauf unverzüglich verschwinden wird, da er die Form eines Komplexes aufweist, der MTX enthält, das an das Polysaccharid (N-Acetylcarboxymethylchitosan) über die Peptidkette des Komplexes gebunden ist, aber daß, im Gegensatz zu der Erwartung, die Retention der zu testenden Probenverbindung, die die Form des Komplexes hat, im Blut vergleichbar oder länger ist als die Retention des einfachen Polysaccharids, das als Vergleichsprobe benutzt wurde, und das kein MTX und keine Peptidkette aufweist und das insbesondere das N-Acetylcarboxymethylchitosan selbst ist. Aus Fig. 19 wird auch entnommen, daß im Vergleich mit dem oben erwähnten einfachen Polysaccharid dem zu testenden Probenkomplex solche Eigenschaften verliehen werden können, daß der Komplex sich in einem Krebsgewebe infolge des Besitzes der Peptidkette durch den Komplex konzentrieren kann. Deshalb ist es machbar, daß die Substanz mit der Formel (I) gemäß der vorliegenden Erfindung die Tendenz zur Organotropie durch die Auswahl einer geeignten Peptidkette (-X-) erlangt, die gemäß der vorliegenden Erfindung in der Substanz mit der Formel (I) enthalten ist.
- In diesem Experiment wurden die folgenden Experimente unter der Verwendung verschiedener Beispiele der Substanzen der vorhe genden Erfindung mit der Formel (X) als Testproben durchgeführt.
- Infolgedessen wurden die Komplexe, die als Endprodukte der obigen Beispiele 17, 18 und 19 erhalten wurden und die Polyethylenglycol (PEG)-Gehalte von 6%, 21% und 43% haben, und bei denen die MTX-Teile mit ³H markiert wurden, für den Gebrauch als ³H-markierte Testverbindungen der Testproben 1, 2 und 3 hergestellt und angewandt. Weiterhin wurden Komplexe, wie die oben erwähnten Komplexe, mit der Ausnahme, daß der PEG-Teil daraus entfernt worden war und daß der MTX-Teil ³H-markiert worden war, ebenfalls als ³H-markierte Vergleichsverbindungen hergestellt und benutzt. In jedem der Komplexe, die als Testproben 1, 2 und 3 benutzt wurden, und in den Komplexen, die als Vergleichskomplexe benutzt wurden, war die Peptidkette, die an die 2-Aminogruppe der Carboxylmethylglucosamin-Einheit dieser getesteten Komplexe gebunden war, Gly-Phe-Phe. Der PEG-Teil, der in den als Testproben 1, 2 und 3 verwendeten Komplexen vorhanden ist, war das PEG&sub1; (Molekulargewicht: 5000), wie es in Beispiel 17 beschrieben wurde.
- In den folgenden Experimenten wurde solche tumortragenden weiblichen Wistar-Ratten benutzt, die eine subkutane Transplantation von Krebszellen des Typs Walker 256 in eine Leistengegend erhalten hatten und nachfolgend für 6 Tage großgezogen worden waren. Jede Lösung der Testprobe wurde durch geeignetes Verdünnen des ³H-markierten, zu testenden, Probenkomplexes mit einer Lösung des entsprechenden nichtradioaktiv markierten Komplexes in einer physiologischen Kochsalzlösung für die Verabreichung hergestellt. Es wurden drei Ratten pro Gruppe verwandt, und die Lösung der Testprobe wurde mit einer Dosis von 10 mg/kg des Komplexes in die Halsschlagader der Ratten verabreicht.
- Unter einer Ether-Anesthesie wurden 30 Minuten, 1 Stunde, 2 Stunden, 4 Stunden und 6 Stunden nach der Verabreichung periodisch Blutproben aus der Halsschlagader der Ratten entnommen. Das Blut wurde zentrifugiert, um das Plasma abzutrennen. Nach einem Zeitablauf von 24 Stunden nach der Verabreichung wurde das Blut von Ratten unter einer Ether-Anesthesie gesammelt, bis die Ratten durch Ausbluten geopfert worden waren. Aus den geopferten Ratten wurden zahlreiche Gewebe und Organe abgetrennt. Nach dem Wiegen der gesamten oder einiger Teile der Gewebe und Organe wurde ihre Radioaktivität gemessen.
- Die Radioaktivität der abgetrennten Gewebe wurde in der folgenden Weise gemessen. Nachdem jede Gewebeprobe in einem Verbrennungskonus gesammelt und getrocknet worden war, wurde die Probe in einer automatischen Proben-Verbrennungsvorrichtung ("ASC-113", ALOKA) verbrannt. Das resultierede ³H&sub2;O wurde zu einem Szintillator ("AQUASOL-2", NEN) hinzugefügt und anschließend mit einem Flüssigszintillationszähler ("LCS-3600", ALOKA) gemessen. Der Wert der so gemessenen Radioaktivität wurde mit dem Verfahren einer externen Stardardstrahlenquelle kalibriert.
- Die Testergebnisse sind in Fig. 29 und in Fig. 30 der beigefügten Zeichnungen wie auch in der im weiteren wiedergegebenen Tabelle 1 aufgezeigt. Fig. 29 ist eine Graphik, die die zeitabhängigen Schwankungen der Konzentration eines jeden Probenkom plexes zeigt, der im Plasma vorhanden ist, wie bis zum Ende der 24 Stunden nach der Verabreichung des Komplexes gemessen wurde. Fig. 30 ist eine Graphik, die die Verteilungen eines jeden Probenkomplexes zeigt, der in den Geweben der Rattenkörper vorhanden ist, wobei die Verteilungen als die Konzentration des Komplexes in Prozenteinheiten auf der Basis der Dosis des Komplexes angegeben werden. Die Tabelle zeigt die AUC-Werte eines jeden Probenkomplexes, der auf der Basis der Graphik aus Fig. 29 bestimmt wurde, und Tabelle 1 zeigt ebenfalls die Konzentration eines jeden Probenkomplexes in dem Tumor, die in relativen Prozenteinheiten bezüglich der Dosis des Komplexes ausgedrückt wird.
- Wie durch Fig. 29 gezeigt wird, drückt die getestete Komplexprobe aus, daß der Komplex eine umso bessere Retention im Blutkreislauf hat, je höher der Anteil von PEG ist, das in den Komplex eingeführt wurde. Wenn dies mit Verweis auf die AUC-Werte aus Tabelle 1 betrachtet wird, wird verstanden, daß im Vergleich mit den Vergleichskomplexen die Retention des Testprobenkomplexes im Blut mit der Testprobe 1 (mit einem eingeführten PEG-Gehalt von 6%) weit über das etwa 1,3-fache und mit der Testprobe 2 (mit einem eingeführten PEG-Gehalt von 21%) um das etwa 3-fache und mit der Testprobe 3 (mit dem eingeführten PEG- Gehalt von 43%) ebenso erhöht war.
- Wie aus Fig. 30 ins Auge fällt, wird auch erkannt, daß sich im Hinblick auf das Tumorgewebe die Konzentrationen der getesteten Komplexe, die in dem Tumor vorhanden sind, mit dem höheren Gehalt des eingeführten PEG der Komplexe gleichmäßig erhöhen können, wohingegen im Hinblick auf die anderen Organe, die kein Tumorgewebe sind die Konzentrationen der getesteten Komplexe in diesen Organen sich nicht entscheidend unterscheiden, wobei dies vom Gehalt des eingeführten PEG der Komplexe abhängt. Genauer wird dies aus den Werten der Konzentrationen der getesteten Komplexe im Tumor klar werden, die in Tabelle 1 gezeigt werden. Infolgedessen kann die Einführung der PEG-Bauemheit in ein N-Acetylcarboxymethylchitosan-Derivat darin resultieren, daß der Komplex eine Tendenz das Krebsgewebe zu erkennen erlangt. Infolgedessen macht es die Verwendung solcher Komplexe, die einen PEG-Gehalt aufweisen, möglich, die benötigte Dosis eines Antikrebswirkstoffes zu reduzieren und dadurch die unerwünschten Wirkungen eines Krebswirkstoffes auf andere Organe zu verringern. Tabelle 1
- In den begleitenden Zeichnungen ist folgendes abgebildet:
- Fig. 1 zeigt ein ultraviolettes Absorptionsspektrum des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Phe-Phe-Boc Komplexes, der in Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung erhalten wurde (in einer Konzentration des Komplexes von 1900 µg/ml in 30%igem wässrigen Ethanol als Lösungsmittel);
- Fig. 2 zeigt ein GFC-Elutionsmuster des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Phe-Phe-Boc Komplexes, wie es in Beispiel 1 erhal ten wurde (die Detektion dieses Komplexes erfolgte durch ultraviolette Absorption bei 258 nm);
- Fig. 3 zeigt ein ultraviolettes Absorptionsspektrum des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Phe-Phe-H Komplexes, wie er in Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung erhalten wurde (bei einer Konzentration des Komplexes von 1900 µg/ml in wässrigem 30%igem Ethanol als Lösungsmittel);
- Fig. 4 zeigt ein GFC-Elutionsmuster des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Phe-Phe-H Komplexes, wie er in Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung erhalten wurde (die Detektion des Komplexes erfolgte durch ultraviolette Absorption bei 258 nm);
- Fig. 5 zeigt ein ultraviolett-sichtbares Absorptionsspektrum des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Phe-Phe-MTX Komplexes, das als Endprodukt in Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung erhalten wurde (bei einer Konzentration des Komplexes von 100 ug/ml in wässrigem 0,1%igern NaHCO&sub3; als Lösungsmittel);
- Fig. 6 gibt ein GFC-Elutionsmuster des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Phe-Phe-MTX Komplexes wieder, der als Endprodukt in Beispiel 1 der vorliegenden Erfindung erhalten wurde (die Detektion des Komplexes erfolgte durch ultraviolette Absorption bei 307 nm);
- Fig. 7 zeigt ein ultraviolettes Absorptionsspektrum des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Gly-Gly-PMZ Komplexes, der in Beispiel 2 der vorliegenden Erfindung erhalten wurde (bei einer Konzentration des Komplexes von 500 ug/ml in Wasser als Lösungsmittel;
- Fig. 8 gibt ein GFC-Elutionsmuster des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Gly-Gly-PMZ Komplexes wieder, das in Beispiel 2 der vorliegenden Erfindung erhalten wurde (die Detektion des Komplexes erfolgte durch ultraviolette Absorption bei 272 nm);
- Fig. 9 zeigt ein ultraviolettes Absorptionsspektrum des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Gly-Gly-H Komplexes, der in Beispiel 2 der vorliegenden Erfindung erhalten wurde (bei einer Konzentration des Komplexes von 1000 µg/ml in Wasser als Lösungsmittel);
- Fig. 10 zeigt ein ultraviolett-sichtbares Absorptionsspektrum des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Gly-Gly-MTX Komplexes, der als das Endprodukt in Beispiel 2 der vorliegenden Erfindung erhalten wurde (bei einer Konzentration des Komplexes von 48 pg/ml in wässriger 0,1%iger NaHCO&sub3; als Lösungsmittel);
- Fig. 11 gibt ein GFC-Elutionsmuster des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Gly-Gly-MTX Komplexes wieder, der als Endprodukt in Beispiel 2 der vorliegenden Erfindung erhalten wurde (die Detektion des Komplexes erfolgte durch ultraviolette Absorption bei 307 nm);
- Fig. 12 zeigt ein ultraviolett-sichtbares Absorptionsspektrum des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Gly-Gly-Ala-MTX Komplexes, der in Beispiel 6 der vorliegenden Erfindung erhalten wurde (bei einer Konzentration des Komplexes von 50 ug/ml in wässriger 0,1%iger NaHCO&sub3; als Lösungsmittel);
- Fig. 13 gibt ein GFC-Elutionsmuster des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Gly-Gly-Ala-MTX Komplexes wieder, der in Beispiel 6 der vorliegenden Erfindung erhalten wurde (die Detektion des Komplexes erfolgte durch ultraviolette Absorption bei 307 nm);
- Fig. 14 zeigt ein ultraviolettes Absorptionsspektrum des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Suc-Ala-Ala-Ala-p-Nitroanilid Komplexes, der als Endprodukt in Beispiel 7 der vorliegenden Erfindung erhalten wurde (bei einer Konzentration des Komplexes von 500 µg/ml in Wasser als Lösungsmittel);
- Fig. 15 gibt ein GFC-Elutionsmuster des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Suc-Ala-Ala-Ala-p-Nitroanilid Komplexes wieder, der als Endprodukt in Beispiel 7 der vorliegenden Erfindung erhalten wurde (die Detektion des Komplexes erfolgte durch ultraviolette Absorption bei 315 nm);
- Fig. 16 ist eine Graphik, die die zeitabhängigen Schwankungen in den Prozentsätzen des verbleibenden Gehalts einer pharmazeutischen Verbindung, Methotrexat (MTX) zeigt, die in der Form ihres Komplexes mit dem Chitosan in dem Plasma (in vitro) verbleibt, die in Experiment 1 der vorliegenden Erfindung gemessen wurden;
- Fig. 17 ist eine Graphik, die zeigt, wie die Reaktionszeit bezüglich des Abbaus des Komplexes der vorliegenden Erfindung durch die Reaktion mit einem Acetatpuffer mit der Elutionszeit korreliert, bei der die Elution eines Peaks der Verbindung bei der Elution der Reaktionsmischung zu den unterschiedlichen Zeitpunkten der Reaktionszeit erscheint, wenn die Messung in Experiment 2 der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurde;
- Fig. 18 ist eine Graphik, die die zeitabhängigen Schwankungen der Konzentration oder des Levels einer zu testenden Probenverbindung zeigt, die im Blutserum (in vivo) vorhanden ist, wenn die Messung im Experiment 3 der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurde;
- Fig. 19 ist eine Graphik, die die zeitabhängigen Schwankungen der Konzentration einer Testverbindung zeigt, die in dem Krebsgewebe vorhanden ist, wenn die Messung im Experiment 3 der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurde;
- Fig. 20 zeigt ein ultraviolett-sichtbares Absorptionsspektrum des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Suc-Gly-Phe-Gly-Lys-MTX Komplexes, der in Beispiel 11 der vorliegenden Erfindung erhalten wurde (in einer Konzentration des Komplexes von 490 ug/ml in wässriger 0,1%iger NaHCO&sub3; als Lösungsmittel);
- Fig. 21 gibt ein GFC-Elutionsmuster des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Suc-Gly-Phe-Gly-Lys-MTX Komplexes wieder, der in Beispiel 11 der vorliegenden Erfindung erhalten wurde (die Detektion des Komplexes erfolgte durch ultraviolette Absorption bei 307 nm) ;
- Fig. 22 zeigt ein ultraviolett-sichtbares Absorptionsspektrum des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Phe-Phe-MTX Komplexes (mit seinem Carboxymethylierungsgrad von 0,7), wie er in Beispiel 12 der vorliegenden Erfindung erhalten wurde (bei einer Konzentratiqn des Komplexes von 100 ug/ml in wässriger 0,1%iger NaHCO&sub3; als Lösungsmittel);
- Fig. 23 gibt ein GFC-Elutionsmuster des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Phe-Phe-MTX Komplexes (mit seinem Carboxymethylierungsgrad von 0,7) wieder, wie er in Beispiel 12 der vorliegenden Erfindung erhalten wurde (die Detektion des Komplexes erfolgte durch ultraviolette Absorption bei 307 nm);
- Fig. 24 gibt ein GFC-Elutionsmuster des N-Acetylcarboxymethylchitosan-(PEG&sub1;)-Gly-Phe-Phe-H Komplexes wieder, wie er in Beispiel 17 der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde (die Detektion des Komplexes erfolgte durch ultraviolette Absorption bei 258 nm);
- Fig. 25 zeigt ein ultraviolett-sichtbares Absorptionsspektrum des N-Acetylcarboxymethylchitosan-(PEG&sub1;)-Gly-Phe-Phe-MTX Komplexes, der als Endprodukt in Beispiel 17 der vorliegenden Erfindung erhalten wurde (bei einer Konzentration des Komplexes von 100 ug/ml in wässriger 0,1%iger NaHCO&sub3; als Lösungsmittel);
- Fig. 26 gibt ein GFC-Elutionsmuster des N-Acetylcarboxymethylchitosan-(PEG&sub1;)-Gly-Phe-Phe-MTX Komplexes wieder, der als Endprodkt im Beispiel 17 der vorliegenden Erfindung erhalten wurde (die Detektion des Komplexes erfolgte durch ultraviolette Absorption bei 307 nm);
- Fig. 27 zeigt ein ultraviolett-sichtbares Absorptionsspektrum des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Gly-Gly-MTX Komplexes, der in ein Polyalkohol-Derivat umgewandelt wurde, der in Beispiel 22 der vorliegenden Erfindung erhalten wurde (in einer Konzentration des Komplexes von 40 ug/ml in wässriger 0,1%iger NaHCO&sub3; als Lösungsmittel);
- Fig. 28 zeigt ein GFC-Elutionsmuster des N-Acetylcarboxymethylchitosan-Gly-Gly-Gly-MTX Komplexes, der in ein Polyalkohol- Derivat umgewandelt wurde, und der in Beispiel 22 der vorliegenden Erfindung erhalten wurde (die Detektion des Komplexes erfolgte durch ultraviolette Absorption bei 307 nm);
- Fig. 29 ist eine Graphik, die die zeitabhängigen Schwankungen der Konzentrationen der unterschiedlichen Probenkomplexe zeigt, die im Plasma von Ratten 24 Stunden nach der Verabreichung der Komplexe vorhanden waren und gemessen wurden, wenn die Messungen im Experiment 4 der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurde; und
- Fig. 30 ist eine Graphik, die die Verteilung der unterschiedlichen Probenkomplexe zeigt, die in verschiedenen Körpergeweben von Ratten vorhanden waren und die als die Konzentration des Komplexes in Prozentsätzen bezüglich der Basis der Dosis eines jeden Komplexes ausgedrückt werden.
- Die neuen N-Acetylcarboxymethylchitosan-Derivate gemäß der vorliegenden Erfindung sind geeignet, die in vivo-Zielfindung pharmazeutischer Verbindungen zu erreichen. Die neuen Derivate der vorliegenden Erfindung sind als hochmolekulare Trägersubstanzen vom Polysaccharid-Typ nützlich, die in der Lage sind sowohl die Stabilität solcher pharmazeutischer Verbindungen im Blut als auch die Organotropie solcher pharmazeutischer Verbindungen und die Bioabbaubarkeit solcher pharmazeutischer Produkte zu erhöhen. Weiterhin zeigen die neuen N-Acetylcarboxymethylchitosan-Derivate der vorliegenden Erfindung, so wie sie in der Form ihrer Komplexe zur Verfügung gestellt werden, die an pharmazeutische Verbindungen gebunden sind, Organotropie und haben auch andere vorteilhafte Eigenschaften und sind folglich als pharmazeutische Produkte nützlich.
Claims (12)
1. N-Acetylcarboxymethylchitosan-Derivat, das durch die
nachfolgende Formel (I) wiedergegeben wird:
wobei R&sub1; und R&sub2; einzeln ein Wasserstoffatom oder eine
Carboxymethylgruppe bedeuten, mit der Maßgaben, daß R&sub1;
und R&sub2; nicht gleichzeitig Wasserstoffatome sind; P einen
Rest R&sub3;CO-, der der Rest einer Verbindung mit einer
Carboxylgruppe ist, oder einen Rest R&sub4;NH-&sub1; der der Rest
einer Verbindung mit einer Aminogruppe ist, oder einen
Rest R&sub5;O-, der der Rest einer Verbindung mit einer
Hydroxylgruppe ist, bezeichnet; Q für H oder eine Gruppe
-OH steht; X eine Peptidkette ist, die die gleichen oder
unterschiedliche ein bis zehn Aminosäuren enthält, a&sub1; und
a&sub2; einzeln Null oder eine positive ganze Zahl sind,
vorausgesetzt, daß a&sub1; und a&sub2; nicht beide zur gleichen Zeiü
Null sind, und b für eine positive ganze Zahl steht;
und das die nachfolgenden kennzeichnenden Werte (1)-(4)
hat:
(1) Carboxymethylierungsgrad 0,5 - 1,2
(gemessen nach Alkalimetrie)
(2) Molekulargewicht (gemessen nach
Gelfiltrationsverfahren) : 3000 - 300 000
(3) a/(a + b): 0,01 - 1
[vorausgesetzt daß a = a&sub1; + a&sub2;]
(4) P/X-Verhältnis (Molverhältnis) 0,1 - 1
2. N-Acetylcarboxymethylchitosan-Derivat nach Anspruch 1,
wobei X, das in XF vorhanden ist, eine Peptidkette
bedeutet, die aus den gleichen oder unterschiedlichen 1 bis
4 Aminosäuren besteht, und P an eine N-endständige
Aminosäure der Peptidkette gebunden ist.
3. N-Acetylcarboxymethylchitosan-Derivat nach Anspruch 2,
wobei XP einen der nachfolgenden Reste bedeutet:
P-Phe-Phe-Gly-,
P-Gly-Phe-Gly-Gly-&sub1;
P-Phe-Gly-Phe-Gly-,
P-Gly-Phe-Gly-Phe-,
P-Gly-Gly-Gly-, und
P-Ala-Gly-Gly-Gly-.
4. N-Acetylcarboxymethylchitosan-Derivat nach Anspruch 1,
wobei X, das in XP vorhanden ist, ein Peptidkette
bedeutet, die eine dibasische Säure enthält und aus den
gleichen oder unterschiedlichen 1 bis 4 Aminosäuren
besteht, und P an eine C-endständige Aminosäure der
Peptidkette gebunden ist.
5. N-Acetylcarboxymethylchitosan-Derivat nach Anspruch 4,
wobei XP einen der nachfolgenden Reste bedeutet:
-Suc-Ala-Ala-Ala-P, und
-Suc-Ala-Ala-Val-Ala-P,
in denen Suc ein Succinsäure-Rest ist.
6. N-Acetylcarboxymethylchitosan-Derivat nach einem der
Ansprüche 1 bis 5,
wobei sowohl der Rest R&sub3;CO- wie auch der Rest R&sub5;O-
Schutzgruppen sind.
7. N-Acetylcarboxymethylchitosan-Derivat nach Anspruch 6,
wobei der Rest R&sub3;CO- eine tert-Butoxycarbonylgruppe oder
p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe ist, und der Rest
R&sub5;Oeine tert-Butyloxygruppe ist.
8. N-Acetylcarboxymethylchitosan-Derivat nach einem der
Ansprüche 1 bis 5,
wobei R&sub3;CO- einen Methotrexat-Rest bezeichnet.
9 - Teilweise N-acetyliertes Carboxymethylchitosan-Derivat,
das durch die nachfolgende Formel (II) wiedergegeben
wird:
wobei R&sub1; und R&sub2; einzeln ein Wasserstoffatom oder eine
Carboxymethylgruppe bedeutet, mit der Maßgabe, daß R&sub1; und
R&sub2; nicht gleichzeitig Wasserstoffatome sind; P ein
Wasserstoffatom, eine Gruppe -OH, einen Rest R&sub3;CO-, der
der Rest einer Verbindung mit einer Carboxylgruppe ist,
oder einen Rest R&sub4;NH-, der der Rest einer Verbindung mit
einer Aminogruppe ist, oder einen Rest R&sub5;O-, der der Rest
einer Verbindung mit einer Hydroxylgruppe ist,
bezeichnet; X eine Peptidkette ist, die die gleichen oder
unterschiedliche 1 bis 10 Aminosäuren enthält; und a, b&sub1;
und b&sub2; einzeln Null oder eine positive ganze Zahl sind;
und das die nachfolgenden kennzeichnenden Werte (1)-(4)
hat:
(1) Carboxymethylierungsgrad: 0,5 - 1,2
(gemessen nach Alkalimetrie)
(2) Molekulargewicht (gemessen nach
Gelfiltrationsverfahren) : 3000 - 300 000
(3) a/(a + b): 0,01 - 1
[vorausgesetzt daß b = b&sub1; + b&sub2;J
(4) P/X-Verhältnis (Molverhältnis) 0,1 - 1
10. Verfahren zur Herstellung eines teilweise N-acetylierten
Carboxymethylchitoan-Derivats,
das durch die nachfolgende Formel (II) wiedergegeben
wird:
wobei R&sub1; und R&sub2; einzeln ein Wasserstoffatom oder eine
Carboxymethylgruppe bedeutet, mit der Maßgabe, daß R&sub1; und
R&sub2; nicht gleichzeitig Wasserstoffatome sind; P ein
Wasserstoffatom, eine Gruppe -OH, einen Rest R&sub3;CO-, der
der Rest einer Verbindung mit einer Carboxylgruppe ist,
oder einen Rest R&sub4;NH-, der der Rest einer Verbindung mit
einer Aminogruppe ist, oder einen Rest R&sub5;O-, der der Rest
einer Verbindung mit einer Hydroxylgruppe ist,
bezeichnet; X eine Peptidkette ist, die die gleichen oder
unterschiedliche 1 bis 10 Aminosäuren enthält; und a, b&sub1;
und b&sub2; einzeln eine positive ganze Zahl sind;
und das die nachfolgenden kennzeichnenden Werte (1)-(4)
hat:
(1) Carboxymethylierungsgrad: 0,5 - 1,2
(gemessen nach Alkalimetrie)
(2) Molekulargewicht (gemessen nach
Gelfiltrationsverfahren): 3000 - 300 000
(3) a/ (a + b) : 0,01 - 1
[vorausgesetzt daß b = b&sub1; + b&sub2;]
(4) P/X-Verhältnis (Molverhältnis) 0,1 - 1
dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren die Umsetzung
einer Verbindung mit der nachfolgenden Formel:
PX-OH (IV)
wobei P und X die gleichen Bedeutungen haben, wie
vorstehend angegeben,
mit einem teilweise N-acetylierten Carboxymethylchitosan
mit der nachfolgenden Formel (III) aufweist:
wobei R&sub1; und R&sub2; die gleichen Bedeutungen haben, wie
vorstehen angegeben, und die nachfolgenden kennzeichnenden
Werte (1)-(2) haben:
(1) Carboxymethylierungsgrad: 0,5 - 1,2
(2) Molekulargewicht (gemessen nach
Gelfiltrationsverfahren) : 3000 - 300 000
11. Verfahren zur Herstellung eines
N-Aoetylcarboxymethylchitosan-Derivats,
das durch die nachfolgende Formel (I) wiedergegeben wird:
wobei R&sub1; und R&sub2; einzeln ein Wasserstoffatom oder eine
Carboxymethylgruppe bedeuten, mit der Maßgaben, daß R&sub1;
uxid R&sub2; nicht gleichzeitig Wasserstoffatome sind; P einen
Rest R&sub3;CO-, der der Rest einer Verbindung mit einer
Carboxylgruppe ist, oder einen Rest R&sub4;NH-, der der Rest
einer Verbindung mit einer Aminogruppe ist, oder einen
Rest R&sub5;O-, der der Rest einer Verbindung mit einer
Hydroxylgruppe ist, bezeichnet; Q für H oder eine Gruppe
-OH steht; X eine Peptidkette ist, die die gleichen oder
unterschiedliche ein bis zehn Aminosäuren enthält, a&sub1; und
a&sub2; einzeln Null oder eine positive ganze Zahl sind,
vorausgesetzt, daß a&sub1; und a&sub2; nicht beide zur gleichen
Zeit Null sind, und b für eine positive ganze Zahl steht;
und das die nachfolgenden kennzeichnenden Werte (1)-(4)
hat:
(1) Carboxymethylierungsgrad 0,5 - 1,2
(gemessen nach Alkalimetrie)
(2) Molekulargewicht (gemessen nach
Gelfiltrationsverfahren) : 3000 - 300.000
(3) a/(a + b): 0,01 - 1
[vorausgesetzt daß a = a&sub1; + a&sub2;]
(4) P/X-Verhältnis (Molverhµltnis) 0,1 - 1
dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren folgendes
aufweist:
- Acetylierung eines teilweise N-acetylierten
Carboxymethylchitosan-Derivats mit der nachfolgenden Formel
(II'):
wobei R&sub1; und R&sub2; einzeln ein Wasserstoffatom oder eine
Carboxymethylgruppe bedeutet, mit der Maßgabe, daß R&sub1; und
R&sub2; nicht gleichzeitig Wasserstoffatome sind; P ein
Wasserstoffatom, eine Gruppe -OH, einen Rest R&sub3;CO-, der
der Rest einer Verbindung mit einer Carboxylgruppe ist,
oder einen Rest R&sub4;NH-, der der Rest einer Verbindung mit
einer Aminogruppe ist, oder einen Rest R&sub5;'O-, der der
Rest einer Verbindung mit einer Hydroxylgruppe ist,
bezeichnet; X eine Peptidkette ist, die die gleichen oder
unterschiedliche 1 bis 10 Aminosäuren enthält; und a, b&sub1;
und b&sub2; einzeln eine positive ganze Zahl sind;
und das die nachfolgenden kennzeichnenden Werte (1)-(4)
hat:
(1) Carboxymethylierungsgrad: 0,5 - 1,2
(gemessen nach Alkalimetrie)
(2) Molekulargewicht (gemessen nach
Gelfiltrationsverfahren): 3000 - 300 000
(3) a/ (a + b) : 0,01 - 1
[vorausgesetzt daß b = b&sub1; + b&sub2;]
(4) P&sub1;/X-Verhältnis (Molverhältnis) 0,1 - 1,
- Entfernen der P&sub1;-Reste aus dem erhaltenen
Acetylierungsprodukt, wenn die P&sub1;-Reste kein H oder keine -OH
Gruppe sind; und
- Umsetzen des so erhaltenen Reaktionsproduktes, von dem
die P&sub1;-Reste entfernt wurden, mit einer Verbindung der
nachfolgenden Formel:
P-H oder P-OH (V)
wobei P den Rest R&sub3;CO-, den Rest R&sub4;NH- oder den Rest
R&sub5;Obedeutete, wie vorstehend angegeben.
12. N-Acetylcarboxymethylchitosan-Derivat,
das durch die nachfolgenden Formeln (X) oder (XI)
wiedergegeben wird:
wobei R&sub1; und R&sub2; einzeln ein Wasserstoffatom oder eine
Carboxymethylgruppe bedeuten, mit der Maßgaben, daß R&sub1;
und R&sub2; nicht gleichzeitig Wasserstoffatome sind; P einen
Rest R&sub3;CO-, der der Rest einer Verbindung mit einer
Carboxylgruppe ist, oder einen Rest R&sub4;NH-, der der Rest
einer Verbindung mit einer Aminogruppe ist, oder einen
Rest R&sub5;O-, der der Rest einer Verbindung mit einer
Hydroxylgruppe ist, bezeichnet; Q für H oder eine Gruppe
-OH steht; X eine Peptidkette ist, die die gleichen oder
w unterschiedliche ein bis zehn Aminosäuren enthält, a&sub1; und
a&sub2; einzeln Null oder eine positive ganze Zahl sind,
vorausgesetzt, daß a&sub1; und a&sub2; nicht beide zur gleichen
Zeit Null sind; b und c einzeln für eine positive ganze
Zahl stehen, und -PEG ein Rest mit der nachfolgenden
Formel (VI), (VII), (VIII) oder (IX) ist:
in denen n den durchschnittlichen Polymerisationsgrad der
Polyethylenglycolkette bedeutet;
und die die nachfolgenden kennzeichnenden Werte (1)-(4)
haben:
(1) Carboxymethylierungsgrad 0,5 - 1,2
(gemessen nach Alkalimetrie)
(2) Molekulargewicht (gemessen nach
Gelfiltrationsverfahren) : 3000 - 300 000
(3) a/(a + b) : 0,01 - 1
[vorausgesetzt daß a = a&sub1; + a&sub2;]
(4) P/X-Verhältnis (Molverhältnis) 0,1 - 1.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21580390 | 1990-08-17 | ||
| PCT/JP1991/001101 WO1992003480A1 (fr) | 1990-08-17 | 1991-08-16 | Derive de n-acetylcarboxymethylchitosan et procede de production |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE69125939D1 DE69125939D1 (de) | 1997-06-05 |
| DE69125939T2 true DE69125939T2 (de) | 1997-11-20 |
Family
ID=16678514
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE69125939T Expired - Fee Related DE69125939T2 (de) | 1990-08-17 | 1991-08-16 | N-acetylcarboxymethylchitosanderivat und verfahren zur herstellung |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5463022A (de) |
| EP (1) | EP0544000B1 (de) |
| JP (1) | JPH0742324B1 (de) |
| AT (1) | ATE152455T1 (de) |
| CA (1) | CA2089519C (de) |
| DE (1) | DE69125939T2 (de) |
| DK (1) | DK0544000T3 (de) |
| ES (1) | ES2101750T3 (de) |
| GR (1) | GR3023512T3 (de) |
| WO (1) | WO1992003480A1 (de) |
Families Citing this family (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2610792B2 (ja) * | 1993-02-26 | 1997-05-14 | 株式会社ディ・ディ・エス研究所 | 多糖誘導体および薬物担体 |
| DE4314407A1 (de) * | 1993-05-03 | 1994-11-10 | Zuckerindustrie Verein | 3-(Aminoacyl-amino)-saccharide und Verfahren zu ihrer Herstellung |
| US5858350A (en) | 1993-12-01 | 1999-01-12 | Marine Polymer Technologies | Methods and compositions for poly-β-1→4-N-acetylglucosamine cell therapy system |
| US5665702A (en) * | 1995-06-06 | 1997-09-09 | Biomeasure Incorporated | Ionic molecular conjugates of N-acylated derivatives of poly(2-amino-2-deoxy-D-glucose) and polypeptides |
| US6479457B2 (en) | 1995-06-06 | 2002-11-12 | Kinerton Limited | Ionic molecular conjugates of N-acylated derivatives of poly(2-amino-2-deoxy-D-glucose) and polypeptides |
| SG50747A1 (en) * | 1995-08-02 | 1998-07-20 | Tanabe Seiyaku Co | Comptothecin derivatives |
| WO1998011903A1 (en) * | 1996-09-18 | 1998-03-26 | Chicura Coöperatie U.A. | Chitosan derivatives for treating malignant tumours |
| US6395255B1 (en) * | 1998-06-15 | 2002-05-28 | Thomas Jefferson University | Radiolabeled vasoactive intestinal peptide analogs for imaging and therapy |
| US8394813B2 (en) | 2000-11-14 | 2013-03-12 | Shire Llc | Active agent delivery systems and methods for protecting and administering active agents |
| ATE402213T1 (de) * | 2001-07-10 | 2008-08-15 | Kureha Corp | Verfahren und vorrichtung zur herstellung von polyester |
| US7169752B2 (en) | 2003-09-30 | 2007-01-30 | New River Pharmaceuticals Inc. | Compounds and compositions for prevention of overdose of oxycodone |
| US20060014697A1 (en) | 2001-08-22 | 2006-01-19 | Travis Mickle | Pharmaceutical compositions for prevention of overdose or abuse |
| AU2003210454A1 (en) * | 2002-01-08 | 2003-07-24 | New River Pharmaceuticals, Inc. | Dendritic encapsulation of active agents |
| GB0221941D0 (en) * | 2002-09-20 | 2002-10-30 | Univ Strathclyde | Polysoaps |
| US8133881B2 (en) | 2003-01-13 | 2012-03-13 | Shire Llc | Carbohydrate conjugates to prevent abuse of controlled substances |
| ZA200604869B (en) | 2003-12-04 | 2007-11-28 | Univ Utah Res Found | Modified macromolecules and methods of making and using thereof |
| US20090036553A1 (en) * | 2004-07-08 | 2009-02-05 | Shire Llc | Dendritic encapsulation of active agents |
| WO2006074272A2 (en) * | 2005-01-05 | 2006-07-13 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Conjugates for dual imaging and radiochemotherapy: composition, manufacturing, and applications |
| AU2008219065B2 (en) | 2007-02-19 | 2014-01-30 | Marine Polymer Technologies, Inc. | Hemostatic compositions and therapeutic regimens |
| GB0915449D0 (en) * | 2009-09-04 | 2009-10-07 | Univ Robert Gordon | Composition |
| KR101883797B1 (ko) | 2010-04-15 | 2018-08-30 | 마린 폴리머 테크놀로지스, 인코퍼레이션. | 폴리-ｎ-아세틸글루코사민 나노섬유의 항-세균성 용도 |
| NZ732118A (en) | 2011-04-15 | 2018-11-30 | Marine Polymer Tech Inc | Treatment of disease with poly-n-acetylglucosamine nanofibers |
| US10865383B2 (en) | 2011-07-12 | 2020-12-15 | Lineage Cell Therapeutics, Inc. | Methods and formulations for orthopedic cell therapy |
| US20140228279A1 (en) * | 2011-10-03 | 2014-08-14 | Nanyang Technological University | Cationic peptidopolysaccharides with excellent broad- spectrum antimicrobial activities and high selectivity |
| JP6026192B2 (ja) * | 2012-09-18 | 2016-11-16 | 川研ファインケミカル株式会社 | カルボキシメチルキトサンアセテート化合物、その製造方法及び化粧料 |
| WO2014196562A1 (ja) * | 2013-06-06 | 2014-12-11 | 凸版印刷株式会社 | 針状体 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3223423A1 (de) * | 1982-06-23 | 1983-12-29 | Wella Ag, 6100 Darmstadt | Kosmetische mittel auf der basis von chitosanderivaten, neue chitosanderivate sowie verfahren zur herstellung dieser derivate |
| US4760135A (en) * | 1984-09-06 | 1988-07-26 | University Of Kentucky Research Foundation | Phloretin and phlorizin derivative containing compounds |
| JPS61133232A (ja) * | 1984-12-03 | 1986-06-20 | Agency Of Ind Science & Technol | アミノ酸又はその重合体の結合した多糖複合体の製法 |
| US4619995A (en) * | 1984-12-24 | 1986-10-28 | Nova Chem Limited | N,O-carboxymethyl chitosan and preparative method therefor |
| JPS6270401A (ja) * | 1985-09-24 | 1987-03-31 | Fuji Boseki Kk | カルボキシアルキルキトサン粒状体の製造方法 |
| JPH0613453B2 (ja) * | 1985-10-03 | 1994-02-23 | 株式会社メニコン | 前眼部手術用の前房注入剤 |
| JPH01252604A (ja) * | 1988-04-01 | 1989-10-09 | Ihara Chem Ind Co Ltd | ５−フルオロウラシル担持体 |
| JPH01252605A (ja) * | 1988-04-01 | 1989-10-09 | Ihara Chem Ind Co Ltd | ５−フルオロウラシル担持キトサン |
| JPH01252603A (ja) * | 1988-04-01 | 1989-10-09 | Ihara Chem Ind Co Ltd | ５−フルオロウラシル担持体 |
| IT1219942B (it) * | 1988-05-13 | 1990-05-24 | Fidia Farmaceutici | Esteri polisaccaridici |
-
1991
- 1991-08-16 CA CA002089519A patent/CA2089519C/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-08-16 DE DE69125939T patent/DE69125939T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-08-16 WO PCT/JP1991/001101 patent/WO1992003480A1/ja active IP Right Grant
- 1991-08-16 ES ES91914632T patent/ES2101750T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-08-16 US US07/969,307 patent/US5463022A/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-08-16 EP EP91914632A patent/EP0544000B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-08-16 AT AT91914632T patent/ATE152455T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-08-16 DK DK91914632.4T patent/DK0544000T3/da active
- 1991-08-16 JP JP3513498A patent/JPH0742324B1/ja active Pending
-
1997
- 1997-05-22 GR GR970401159T patent/GR3023512T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE152455T1 (de) | 1997-05-15 |
| GR3023512T3 (en) | 1997-08-29 |
| DK0544000T3 (da) | 1997-11-03 |
| US5463022A (en) | 1995-10-31 |
| CA2089519A1 (en) | 1992-02-18 |
| CA2089519C (en) | 2000-01-11 |
| EP0544000A1 (de) | 1993-06-02 |
| EP0544000B1 (de) | 1997-05-02 |
| ES2101750T3 (es) | 1997-07-16 |
| JPH0742324B1 (de) | 1995-05-10 |
| WO1992003480A1 (fr) | 1992-03-05 |
| DE69125939D1 (de) | 1997-06-05 |
| EP0544000A4 (en) | 1993-08-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE69125939T2 (de) | N-acetylcarboxymethylchitosanderivat und verfahren zur herstellung | |
| DE69730352T2 (de) | Verfahren zur herstellung eines arzneimittelkomplexes | |
| DE69830326T2 (de) | Iminbildende polysaccharide, deren herstellung und verwendung als zusatzmittel und immunstimulierende mittel | |
| DE68917009T2 (de) | Sulfaminoderivate von Chondroitinsulfat, Dermatansulfat und Hyaluronsäure und ihre pharmakologischen Eigenschaften. | |
| DE60025328T3 (de) | Verfahren zur herstellung von mehrfach vernetzten hyaluronsäurederivaten | |
| DE69935982T2 (de) | Lineare cyclodextrincopolymere | |
| DE69629114T2 (de) | Ionisches molekularkonjugat von n-acylierten poly(2-amino-2deoxy-d-glucose) und polypeptide-derivaten | |
| DE69333929T2 (de) | Konjugate von alginat und bioaktiven mitteln | |
| DE3486341T2 (de) | Derivate von Dextran mit antikoagulierenden und antikomplementären Eigenschaften, ihre Herstellung und ihre biologischen Anwendungen. | |
| DE69722434T2 (de) | Buttersäure-ester mit antiproliferativer wirkung und diese enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen | |
| DE68916878T2 (de) | Selektiv O-acylierte Glycosaminoglykane. | |
| DE2758481A1 (de) | Glucan und verfahren zu seiner herstellung | |
| DE2659808C3 (de) | Proteingebundene Polysaccharide und deren Verwendung zur Bekämpfung von Tumoren | |
| DE60113398T2 (de) | Polysaccharidester von n-derivaten der glutaminsäure | |
| DE2751570A1 (de) | Carboxymethylierte beta-1,3-glucane, verfahren zu deren herstellung und antitumormittel | |
| DE69125595T2 (de) | Kombination von hyaluronsäure mit einem medizinischen bestandteil, und seine herstellung | |
| WO2003070772A1 (de) | Stärkederivate, stärke-wirkstoff-konjugate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als arzneimittel | |
| DE69935526T2 (de) | Supramolekulare komplexe enthaltende arzneimittel | |
| EP1567558A2 (de) | Aldonsäure-ester, verfahren zu ihrer herstellung und verfahren zur herstellung von mit polysacchariden oder polysaccharid-derivaten an freien aminogruppen gekoppelten pharmazeutischen wirkstoffen | |
| DE69833487T2 (de) | Polymer-wirkstoff-konjugate zur behandlung von krebs | |
| EP2464669A2 (de) | Verfahren zur modifikation und funktionalisierung von sacchariden | |
| DE68904617T2 (de) | Jodhaltige polymere mit skeletten von dextran, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendungen als kontrastmittel. | |
| DE2339953A1 (de) | Hydroxyalkyl- oder mercaptoalkylglucane | |
| DE2604481A1 (de) | Waessrige loesung eines polysaccharids | |
| DE69023708T2 (de) | Anti-hiv-heilmittel. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8364 | No opposition during term of opposition | ||
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |