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Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft
neue Teil- oder Gesamt-Buttersäureester
von Polysacchariden mit hoher antiproliferativer Aktivität; diese
Ester sind therapeutisch wirksam zur Behandlung und Verhinderung
von Krankheiten, die durch eine abnorme Zellproliferation gekennzeichnet
sind, wie Neoplasmen und Synovialerkrankungen.
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Stand der Technik
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Die biologische Aktivität vieler
Klassen von Polysacchariden wurde im Hinblick auf ihre Verwendung als
Arzneimittel für
die Behandlung verschiedener pathologischer Zustände ausgiebig untersucht. Unter
diesen für
die Therapie verwendeten Polysacchariden sind Heparine mit entweder
hohem oder niedrigem Molekulargewicht als ein die Blutgerinnung
hemmendes Mittel bekannt, während
Dextrane als Plasma-Expander
allgemein verwendet werden.
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Kürzlich
wurden neue biologische Aktivitäten
von Polysaccharid-Verbindungen identifiziert, was es ermöglichte,
eine breitere Verwendung dieser Polysaccharide in der Medizin vorherzusagen.
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Unter den Polysacchariden, die die
aktiven Verbindungen von Arzneimitteln, die zur Zeit in Verwendung
sind, bilden, ist es wert, die Hyaluronsäure zu erwähnen, die für die Behandlung der Osteoarthrose
und anderer pathologischer Zustände
verwendet wird, da sie die Lymphozyten-Proliferation inhibieren
kann (G. F. Peluso et al., Current Therapeutic Research, 47(3):
437–443,
März 1990),
wie auch Skleroglucan (als aktive Verbindung in einer Formulierung,
die Sizofiran® genannt
wird, kommerziell vermarktet), das als Immunstimulanz bei der Behandlung
einiger Tumoren verwendet wird (Eric J. Lien, Prog. Drug. Disc.,
34: 395–420,
1990).
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Außerdem sind einige Arzneimittel
mit polysaccharidischer Natur in einem fortgeschrittenen Stand der klinischen
Entwicklung bekannt, wie z. B. Pentosan-Polysulfat, das für die Behandlung
einiger Tumoren verwendet wird und etliche Derivate der Hyaluronsäure, die
als Adjuvantien beim Heilprozeß und
bei der Verhinderung von postchirurgischen Adhäsionen verwendet werden.
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Ergebnisse von besonderer Bedeutung
haben sich kürzlich
bei der Suche nach neuen pharmakologischen Verwendungen von Polysacchariden
ergeben.
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Unter den vielen pharmakologischen
Aktivitäten,
die von einigen Familien der Polysaccharide ausgeübt werden,
führt die
antiproliferative Aktivität
zu der Möglichkeit
ihrer Verwendung als Antitumormittel, da sie die Entwicklung einiger
Tumorzellinien inhibieren können.
(A. Misaki et al., Carbohydrate Research, 92 (1981): 115–192).
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Die Buttersäure ist eine Verbindung von
natürlichem
Ursprung, nicht toxisch, liegt in der Regel in Nahrungsmitteln und
im Gastrointestinaltrakt als Produkt der bakteriellen Fermentation
von komplexen Kohlehydraten vor. Von einem pharmakologischen Standpunkt
aus betrachtet, übt
diese Verbindung eine antiproliferative Aktivität aus, indem sie das Zellwachstum
inhibiert und die Differenzierung einer großen Vielzahl neoplastischer
Zellen induziert, wie deutlich dargestellt durch Experimente, die
sowohl in vitro als auch in vivo bei verschiedenen Zellinien durchgeführt wurden.
Die zellulären
und molekularen Mechanismen, die der differenzierenden Aktivität der Buttersäure zugrunde
liegen, sind noch nicht vollständig
erhellt worden.
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Insbesondere ist das Natriumsalz
der Buttersäure
ein bekannter Induktor der Zelldifferenzierung (A. Leder u. P. Leder,
Cell, 5: 319, 1975). Obwohl es jedoch mit einem antiproliferativen
Potential versehen ist, zeigt das Natriumsalz der Buttersäure den
Nachteil, dass es nur eine sehr kurze Halbwertszeit aufweist, die seine
Verwendung in vivo bis jetzt begrenzt hat und die Möglichkeit
seiner Verwendung als Arzneimittel ausschließt, da es schwierig ist, ausreichende
Plasma-Konzentrationen zur Ausübung
einer therapeutischen Wirksamkeit zu erhalten.
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Tatsächlich zirkuliert die aktive
Verbindung, nachdem sie durch den intravenösen Weg verabreicht wurde,
nur 5 bis 6 Minuten vor ihrer Verstoffwechslung.
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Verschiedene Versuche zur Überwindung
dieses Nachteils sind durchgeführt
worden:
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- – ein
chemischer Versuch, der auf die Stabilisierung des Moleküls durch
Veresterung abzielt, um seinen Abbau zu verzögern und die biologische Aktivität zu verlängern. Einige
einfache Ester der Buttersäure
sind tatsächlich
bekannt; unter diesen das Phenylbutyrat, das eine antineoplastische
Aktivität
bei Prostatakrebsmodellen ausübt
(Proceedings of the American Association for Cancer Research, Band
37, März
1996, 498) und bei anderen Tumoren. In diesem Fall zielt die Veresterung
einfach auf eine Erhöhung
der Halbwertszeit im Plasma der aktiven Verbindung durch Umwandlung
der aktiven Verbindung in ein Proarzneimittel ab, das durch Hydrolyse
die Buttersäure
in dem Zielorgan langsam freisetzt. Die Aktivität dieser Ester erweist sich
jedoch immer als niedriger als diejenige der freien Säureform,
da die Bioverfügbarkeit
der aktiven Verbindung niedriger ist. Es haben sich in dieser Richtung
keine ermutigenden Ergebnisse ergeben.
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Eine interessante Alternative zu
der Veresterung der Buttersäure
und der Modifikation ihrer chemischen Struktur beinhaltet die Verkapselung
in Liposomen, die einen besseren Schutz gegenüber dem Abbau und eine Trägerbildung
der aktiven Verbindung selbst in höheren Konzentrationen bereitstellen
kann (G. Storm et al., Biotherapy, 3: 25, 1991); selbst in diesem
Fall sind die soweit erhaltenen Ergebnisse jedoch nicht vollständig zufriedenstellend
und zwar aufgrund der niedrigen Einfangwirksamkeit, die von den
Liposomenträgern ausgeübt wird.
Die
EP 0356275 beschreibt
Glykosaminoglykane, worin die Hydroxyl- und Amingruppen unterschiedlich
durch funktionelle acyclische oder sulfatierte Gruppen substituiert
sind. Die
US 5,185,436 beschreibt die
Herstellung von Buttersäurederivaten,
worin das aktive Molekül
(n-Buttersäure)
kovalent durch eine Esterbindung an einen atoxischen Träger gebunden
ist.
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Zusammenfassung
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Die Anmelderin hat neue Polysaccharidderivate
hergestellt, sowohl anionisch als auch neutral, die in überraschender
Weise die abnorme Zellproliferation in einer deutlich höheren Menge
inhibieren als die des korrespondierenden nicht modifizierten Polysaccharids
(hiernach als Quellpolysaccharid bezeichnet). Eine neue Klasse von
Buttersäureestern
der Polysaccharide ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung.
Diese Buttersäureester
können
ein oder mehr Substituenten an den Kohlenstoffatomen des glycosidischen
Rings aufweisen, gewählt
aus der Gruppe, bestehend aus den niederen Alkylen, -NH2-,
-NH-COR-, -OSO3H, -OPO3H2, -COOH, -COO-(CH2)n-COOH, -COOR, -COR, -OR und -O-(CH2)n-O-COR, worin
n = 1–4
und R = Alkyl-C1-C10 ist,
wobei die Hydroxylgruppen dieser Polysaccharide teilweise oder vollständig mit
Buttersäureresten
verestert sind und wobei die zusätzlichen
freien Hydroxylgruppen des glycosidischen Rests möglicherweise
mit Dicarbonsäureresten
verestert sind.
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Vorzugsweise ist die Anzahl der Hydroxylgruppen,
die mit Buttersäureresten
verester sind, für
jedes glycosidische Monomer höher
als 0,001.
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Eine weitere Aufgabe der vorliegenden
Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung dieser Buttersäureester,
einschließlich
der Behandlung der Polysaccharide mit Buttersäureestern oder einer ihrer
aktivierten Formen, möglicherweise
in einem geeigneten Lösungsmittel
und/oder in Gegenwart eines geeigneten Katalysators.
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Weiterhin betrifft die vorliegende
Erfindung die Verwendung der obigen Buttersäureester als antiproliferatives
Mittel und neue pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend eine
therapeutisch wirksame Menge von mindestens einem der obigen Buttersäureester
als aktive Verbindung, zusammen mit Exzipientien und/oder Lösungsmitteln,
die pharmazeutisch akzeptabel sind.
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Kurze Beschreibung
der Figuren
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1 zeigt
die oben erwähnten
Zahlen in Bezug auf die antiproliferative Aktivität der Verbindungen gemäß Beispiel
3, 4, 6, 8 und 9 gemäß der vorliegenden
Erfindung in graphischer Darstellung, wobei die prozentuale Inhibition
der Tumorzellproliferation als Funktion der Konzentration der getesteten
Verbindungen dargestellt wird (ausgedrückt als mg der Verbindung/ml
der Gesamtlösung).
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2 illustriert
die obigen Zahlen in einer Darstellung, die die prozentuale Inhibition
des Zellwachstums gegenüber
der Konzentration der getesteten Verbindungen zeigt.
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Diese Figuren zeigen, dass die Buttersäureester
der Polysaccharide eine antiproliferative Aktivität ausüben, die
in unerwarteter Weise höher
ist als die Aktivität,
die von einer Mischung der Bestandteile ausgeübt wird.
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3 zeigt
die antiproliferative Wirkung der Buttersäureester der Beispiele 3 und
4 auf das Wachstum einer MDA-MB231-Zellinie nach 6 Tagen Behandlung
als Vergleich der Wirkung von Natriumbutyrat, das in den selben
Konzentrationen und unter den selben experimentellen Bedingungen
verwendet wird. Das Diagramm zeigt die prozentuale Inhibition des
Zellwachstums gegenüber
der Konzentration der getesteten Verbindungen (die (mM) Molarität ist bezogen
auf die Konzentration des Butyrats der geprüften Verbindungen).
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Diese Eigenschaften und die Vorteile
der neuen Buttersäureester
der Polysaccharide, des Verfahrens für ihre Herstellung, ihrer therapeutischen
Verwendung und der pharmazeutischen Zusammensetzungen, die sie enthalten,
gemäß der vorliegenden
Erfindung, werden durch die folgende detaillierte Beschreibung besser erhellt.
Gemäß einer
ersten Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Buttersäureestern
für die
Herstellung eines antiproliferativen Medikaments für die Behandlung
oder Verhinderung von Krankheiten, gekennzeichnet durch eine abnorme
Zellproliferation. Diese Buttersäureester
werden entweder aus vollständig
oder teilweise butyrierten Polysacchariden hergestellt, wobei die
Zahl der veresterten Hydroxylgruppen mit Buttersäureresten für jedes glycosidische Monomer
vorzugsweise höher
als 0,001 liegt. Die Buttersäurereste
können
im Bereich von 1 bis 10 Gew.-% im Hinblick auf das Gesamtgewicht
liegen; der Substitutionsgrad (DS) liegt vorzugsweise im Bereich
von 0,001 bis 3 und noch bevorzugter bei 0,01 bis 1. Die Bezeichnung "Substitutionsgrad
(DS)" bezeichnet
die Anzahl der derivatisierten Hydroxylgruppen für jedes glycosidische Monomer
des Polysaccharids.
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Die möglichen zusätzlichen freien Hydroxylgruppen
des glycosidischen Rests der Polysaccharide können mit Resten von C2-C9-Dicarbonsäuren verestert
sein, vorzugsweise gewählt
aus der Gruppe, bestehend aus Bernsteinsäure, Weinsäure, Apfelsäure und Azelainsäure.
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Die Buttersäureester haben ein durchschnittliches
Molekulargewicht, das vorzugsweise höher als 2 × 103 Dalton
und noch bevorzugter im Bereich von 1 × 104 bis
5 × 106 liegt.
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Die Bezeichnung "Polysacccharide" bezeichnet Verbindungen polysaccharidischer
Natur, vorzugsweise natürlich,
z. B. isoliert aus Quellen von natürlichem Ursprung, wie z. B.
Bakterien, Pilzen, Flechten, höheren Pflanzen,
Algen, Mikroalgen und Schalentieren; oder die natürlichen
Polysaccharide können
von Tieren erhalten werden (z. B. Brathähnchenkamm) und menschlichen
Quellen (z. B. aus der Nabelschnur), wie auf dem Gebiet bekannt.
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Diese Polysaccharide können entweder
linear oder verzweigt sein, wobei das Grundgerüst und die möglichen
Seitenketten vorzugsweise glycosidische Reste enthalten, gewählt aus
der Gruppe, bestehend aus D-Glukose, D-Ribose, D-Gulose, D-Xylose,
D-Arabinose, D- und L-Mannose, D-Galactose, L-Fucose, L-Rhamnose,
D-Uronsäure,
D-Glukuronsäure,
D-Mannuronsäure,
D-Guluronsäure
und D-Galacturonsäure.
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Das Grundgerüst des Polysaccharids weist
eine β(1→3) oder β(1→4)D-glycosidische
Bindung auf oder noch bevorzugter glukosidische oder eine α-(1→3) oder α-(1→4) oder α-(1→6)-glycosidische Bindung.
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Die Seitenketten bestehen vorzugsweise
aus einzelnen D-glycosidischen Resten, gebunden in β(1→3) oder β(1→4), β(1→6) oder α-(1→4)-Konfiguration
oder bestehen noch bevorzugter aus β(1→6)-Glykosylresten.
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Das Polysaccharid kann ein β(1→3)-D-Glucan
sein, wobei die Bezeichnung "Glucan" ein lineares Polysaccharid
mit β(1→3)-D-Glucopyranose-Resten
bedeutet; die Polysaccharide können β(1→3)-D-Glucane
mit (1→6)-Seitenketten
sein und sind vorzugsweise gewählt
aus der Gruppe, bestehend aus Skleroglucan, das ein β(1→3)-D-glucopyranosidisches
lineares Grundgerüst
mit einer β(1→6)-D-glucopyranosidischen
Seitenkette pro alle 3 glycosidischen Einheiten der Hauptkette aufweist,
Lentinan (β(1→3)-D-glucosidische
Bindungen), Pachimaran (β(1→3)-D-glucosidische
Bindungen), Curdlan (β(1→3)-D-glucosidische
Bindungen und Pullulan (α-(1→3) und α-(1→6)-D-glucosidische
Bindungen). Das Molekulargewicht dieser Glucane liegt vorzugsweise im
Bereich von 1 × 104 bis 1 × 106.
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Weiterhin können die Polysaccharide an
den Kohlenstoffatomen des saccharidischen Rests ein oder mehr Substituenten
aufweisen, gewählt
aus der Gruppe, bestehend aus niederen Alkylen, -NH2,
-NH-COR, -OSO3H, -OPO3H2, -COOK, -COO-(CH2)n-COOH, -COOR, -COR, -OR und -O-(CH2) n-O-COR, worin
n = 1–4 oder
R = Alkyl-C1-C10.
In diesem Fall können
die Buttersäureester
der Erfindung möglicherweise
mit Kationen von Alkalimetallen (vorzugsweise Na und K), Erdalkalimetallen
(vorzugsweise Ca und Mg) und Übergangsmetallen
(vorzugsweise Cu, Zn, Ag und Au) versalzt sein. Die derivatisierten
Polysaccharide können
durch chemische Modifikation natürlicher
Polysaccharide gemäß den auf
dem Gebiet bekannten Verfahren erhalten werden.
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Unter den carboxylierten Polysacchariden
kann Hyaluronsäure,
bestehend aus alternierenden Resten von D-N-Acetylglucosamin und
D-Glucuronsäure
in profitabler Weise verwendet werden. Das Molekulargewicht der
Hyaluronsäure
liegt zwischen 104 und 2 × 106.
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Pektin ist ein weiteres Beispiel
von carboxylierten Polysacchariden, die in der vorliegenden Erfindung geeignet
sind. Pektin ist ein carboxyliertes Polysaccharid, bestehend hauptsächlich aus
D-Galakturonsäure oder
D-Galaktose. Die Carboxylgruppen von Pektin können teilweise in Form von
Methylestern vorliegen. Das Molekulargewicht von Pektin variiert
zwischen 2 × 104 bis 4 × 105.
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Weitere Polysaccharide, die in der
Erfindung nützlich
sind, sind Alginsäure,
bestehend aus (1→4)-α-L-Guluron-
und β-D-Mannuronsäure, mit
einem Molekulargewicht, das vorzugsweise höher ist als 104 und
vorzugsweise im Bereich von 105 bis 106 liegt. Andere Beispiele werden durch die
Heparine, Heparinoide und Karrageene (sulfatierte Polysaccharide
aus Algen) dargestellt.
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Ein natürliches Polysaccharid, das
besonders geeignet ist zum Erhalt der Buttersäureester gemäß der vorliegenden
Erfindung ist ein sulfatiertes Polysaccharid, isoliert aus marinen
Algen, Grateloupia doryphora (die zur Grateloupiacea-Familie gehören). Auch
andere natürliche
Polysaccharide, erhalten von anderen Algen als der Grateloupiacea-Spezies,
mit D-Galaktoseresten mit (1→3)-Bindungen
und mit sulfatierten Resten in den Stellungen 2, 3 und/oder 6 können profitabel
verwendet werden. Das Molekulargewicht des Polysaccharids liegt
vorzugsweise im Bereich von 104 bis 5 × 106.
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung neue Buttersäureester eines Polysaccharids,
wobei das Polysaccharid gewählt
ist aus: Hyaluronsäure, β(→3)-D-Glucan
oder sulfatierten Polysacchariden, extrahiert aus Grateloupia doryphora,
wobei die Polysaccharide oben beschrieben sind und wobei die Hydroxylgruppen
des Polysaccharids teilweise oder vollständig mit Buttersäureresten
verestert sind.
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Das Verfahren für die Herstellung der Buttersäureester
gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet vorzugsweise natürliche Polysaccharide als Quell-Polysaccharide,
Rohmaterialien, die einfach aus Quellen von natürlichem Ursprung isoliert werden
können
und in großen
Mengen gefunden werden. Die Verbindungen der Erfindung können durch
eine Veresterungsreaktion sowohl unter homogenen als auch heterogenen
Bedingungen hergestellt werden, unter Umständen in Gegenwart eines Katalysators.
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Die Veresterung kann durch Verwendung
von Buttersäure
oder einer ihrer aktivierten Formen, z. B. eines korrespondierenden
Esters, Anhydrids und Acylhalogenids durchgeführt werden.
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Dank der oben beschriebenen Veresterungsreaktion
ist es möglich,
Buttersäureester
mit unterschiedlichen Substitutionsgraden (DS) durch Einstellung
adäquater
Temperaturen und Reaktionszeiten und durch Verwendung geeigneter
molarer Verhältnisse
zwischen den Reaktionsmitteln zu erhalten.
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Die Buttersäureester der Polysaccharide
gemäß der vorliegenden
Erfindung üben
eine hohe antiproliferative Aktivität aus, was sie für die Behandlung
von Krankheiten geeignet macht, die durch eine abnorme Zellproliferation
gekennzeichnet sind.
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Ein Beispiel für diese Krankheiten wird durch
die Neoplasmen dargestellt: die vorliegenden Verbindungen sind so
für die
Behandlung und Verhinderung von Tumoren geeignet. Die präventive
Behandlung von Tumoren wird auf die Behandlung von Zuständen ausgedehnt,
die gegenüber
einer neoplastischen Degeneration empfänglich sind, wie entzündliche
Intestinalerkrankungen, Divertikulose, die Crohn'sche Erkrankung, entzündliche
Colitis, ulzerative Colitis; die Möglichkeit der neoplastischen
Degeneration dieser Erkrankungen ist aus dem Stand der Technik bekannt
(cf. J. Cell. Biochem. Suppl., 1992, 16G: 47–50; Dis. Colon Rectum, 1991, 34(2),
174–180).
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Ein anderes Anwendungsbeispiel wird
durch die Behandlung der Synovial-Zellproliferation dargestellt. Dieser
Zustand liegt bei einer Anzahl von artikulären Erkrankungen vor, wie der
rheumatoiden Arthritis, der juvenilen Arthritis und der Psoriasis-Arthritis.
Die Proliferation der Gelenkzellentzündungen führt zu einer Degeneration des
artikulären
Knorpels, der Knochen und der Sehnen (J. Immunol. 1993, 151(9),
4908–4917).
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können die synoviale Zellproliferation
effektiv umkehren, und dadurch der Entwicklung der obigen Störungen entgegenwirken.
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Weitere Zustände, die durch eine abnorme
Zellproliferation gekennzeichnet sind, wie z. B. Psoriasis, Hyperkeratose,
Prostata-Hyperplasie oder Erkrankungen des Gastrointestinaltraks
können
durch Verwendung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung behandelt
und verhindert werden.
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Für
die obigen Buttersäureester
ist die systemische Verabreichung entweder oral oder parenteral,
topisch oder transdermal empfehlenswert. Diese Ester werden vorzugsweise
durch die folgenden Verabreichungswege verabreicht: oral, intravenös, intraperitoneal,
intraartikulär,
intramuskulär,
subkutan, rektal, intravaginal.
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Die therapeutisch effektive Dosis
variiert gemäß dem Verabreichungsweg
wie auch der Schwere der Pathologie. Weiterhin variiert sie in Bezug
auf Alter, Gewicht und allgemeinem Gesundheitszustand des Patienten.
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Die therapeutisch wirksame Dosis
variiert vorzugsweise von 0,2 bis 500 mg/kg/Tag für die Tage
1 bis 15.
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Im Fall von intravenösen Injektionen
wird der Buttersäureester
vorzugsweise in Dosierungen von 0,2 bis 50 mg/kg/Tag für 8 bis
12 Tage verabreicht. Wenn intraperitoneal injiziert wird, wird der
Buttersäureester vorzugsweise
in Form einer Lösung
oder wässrigen
Suspension und noch bevorzugter in einem physiologischen Puffer
in einer Menge von 1 bis 100 mg/kg/Tag und noch bevorzugter 10 bis
50 mg/kg/Tag für
8 bis 12 Tage verabreicht. Schließlich wird bei oraler Verabreichung
der Buttersäureester
vorzugsweise in einer Menge von 300 bis 500 mg/kg/Tag für 8 bis
12 Tage verabreicht.
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Die neuen Buttersäureester der Erfindung, erhalten
durch teilweise oder gesamte Veresterung mit Buttersäure der
freien Hydroxylgruppen der Saccharidreste der Polysaccharide zeigen
einen überraschenden
Anstieg der antiproliferativen Aktivität der Quellpolysaccharide und
der Buttersäure,
bekannt auf dem Gebiet für ihre
anti-neoplastische Aktivität.
Die antiproliferative Aktivität,
die von den neuen Buttersäureestern
der Erfindung ausgeübt
wird, ist überraschend
höher als
die theoretische Summe der Wirkungen beider Bestandteile, was die
unerwartete Synergie der Wirkung der Buttersäure und des Polysaccharids
beweist, die aneinander durch eine Esterbindung gebunden sind. Daher
unterscheiden sich die neuen Derivate von den einfachen Estern der
Buttersäure,
die auf dem Gebiet bekannt sind, und die lediglich als Pro-Arzneimittel verwendet
werden, um die Halbwertszeit der Buttersäure zu verlängern.
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In den unten gezeigten Beispielen
wurde die biologische Aktivität
der neuen Buttersäureester
der Erfindung und ihre anti-proliferative Aktivität auf verschiedene
Tumorlinien getestet.
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Schließlich umfaßt die vorliegende Erfindung
neue pharmazeutische Zusammensetzungen, enthaltend eine therapeutisch
wirksame Menge von mindestens einem der Buttersäureester der Erfindung. Diese pharmazeutischen
Zusammensetzungen liegen vorzugsweise in Form von injizierbaren
Lösungen
oder Suspensionen für
die systemische, intravenöse,
intraperitoneale, intraartikuläre,
hypoderme, subkutane oder intramuskuläre Verabreichung vor. In diesem
Fall können
die Formulierungen direkt vor der Verwendung durch Löslichmachen
oder Suspension der Ester der Erfindung in Form von Lyophilen in
geeigneten Verdünnungsmitteln
hergestellt werden.
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Für
die orale Verabreichung werden feste Präparationen, wie Körnchen,
Tabletten, Pillen oder Kapseln wie auch halbfeste Formen, wie Gels,
bevorzugt. Daneben können
die obigen Formulierungen die Buttersäureester in Kombination mit
anderen Anti-Tumor-Arzneimitteln von allgemeiner klinischer Verwendung.
enthalten, wie z. B. 5-Fluoruracil, Cisplatin und Cyclophosphamid,
die in polychemotherapeutischen Protokollen verwendet werden können.
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Einige illustrative, jedoch nicht
begrenzende Beispiele für
die Herstellung und Aktivität
der Buttersäureester
gemäß der vorliegenden
Erfindung werden hiernach angegeben.
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Beispiel 1
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Isolierung von
sulfatiertem Polysaccharid aus Grateloupia doryphora
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5 g Grateloupia doryphora, gesammelt
in der nördlichen
adriatischen See, in trockener und gemahlener Form wurden in 500
ml Milli-Q® Wasser
unter Rühren
für 16
Stunden bei 25°C
suspendiert. Die Extraktionsmischung wurde einer Filtration im Vakuum
durch eine 1,2 μm
Faserglasmembran unterzogen. Die erhaltene Lösung wurde in flüssigem Stickstoff
eingefroren und dann getrocknet und 2 g des Endprodukts wurden erhalten.
Die physikochemischen Eigenschaften des von Grateloupia doryphora
erhaltenen sulfatierten Polysaccharids sind wie folgt beschrieben:
Molekulargewichts-Bestimmung:
das Molekulargewicht des erhaltenen Polysaccharids wurde gemäß dem hiernach
beschriebenen Verfahren bestimmt.
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20 mg des Polysaccharids wurden in
einen 10 ml Kolben eingewogen; dieser Kolben wurde auf 2/3 des Gesamtvolumens
mit 0,15 M NaCl aufgefüllt,
die Lösung
wurde einem magnetischen Rühren
bei Raumtemperatur, bis zu ihrer vollständigen Löslichmachung unterzogen und
dann wurden 0,15 M NaCl zu einem Endgesamtvolumen von 10 ml zugefügt. Die
erhaltene Lösung
wurde dann auf 0,45 μm
Filtern (MILLEXD-Filtereinheiten,
Millipore, Nr. SLHA 025 NB, 1996) gefiltert, direkt auf einen Satz
von Größenausschluß-chromatographischen
Säulen
injiziert (TSK-G600 PWx1, TSK-G500 PWx1 und TSK-G3000 PWx1,
Tosohaas, jeweils Nr. 08024, 08023 und 08021, 1995). Die Molekulargewichte
der eluierten Fraktionen von den Säulen wurden dann durch den
RI410 (Waters) Brechindex erhalten.
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Für
die Bestimmung des Molekulargewichts und der Molekulargewichtsverteilung
wurde eine "breite Standard"-Kalibrierung (basierend auf einem Standard-Polysaccharid)
verwendet. Das Acquise- und Computersystem (Chromstar, Rev. 3.13,
Bruker Spectro) wurde auf einem PC 486 IBM kompatibel implementiert.
Das durchschnittliche Molekulargewicht des Polysaccharids betrug
251.000, während
die Refraktions- und Polydispersitäts-Indizes bei 4,2 lagen.
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1H-NMR: die
Struktur des erhaltenen Polysaccharids, wie oben beschrieben, wurde
durch NMR bestimmt. Die folgenden, sich wiederholenden dimeren Strukturen
wurden identifiziert: 3→[O-β-D-Galactopyranosyl-4-sulfat-(1→4)-O-α-D-galactopyranosyl-3,6-anhydro]→1; 3→[O-β-D-Galactopyranosyl-4-sulfat-(1→4)-O-α-D-galactopyranosyl-3,6-anhydro-2- sulfat]-→1; 3-→[O-β-D-Galactopyranosyl-4-(1→4)-O-α-D-galactopyranosyl-3,6-anhydro]-→1; 3→[O-β-D-Galactopyranosyl-4-(1→4)-O-α-L-galactopyranosyl-3,6-anhydro]→1.
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Sulfatierungsgrad-Bestimmung: Der
Sulfatierungsgrad des wie oben beschrieben erhaltenen Polysaccharids
wurde gemäß dem folgenden
colorimetrischen Verfahren bestimmt.
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Es wurde Milli-Q® Wasser verwendet.
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Das A-Reagenz (Pufferlösung von
BaCl2) wurde durch Vermischen von 10 ml
Essigsäure
2 M in Wasser, 2 ml BaCl2 × 2H2O, 0,01 M, in Wasser und 8 ml NaHCO3, 0,02 M in Wasser erhalten und durch schlieflliche Zugabe
von EtOH abs. bis zu 100 ml.
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Das B-Reagenz (Lösung aus Natriumrhodizonat)
wurde durch Lösen
von 5 mg Natriumrhodizonat (Fluka, Nr. 71940, 1995) in 20 ml Wasser
durch Zugabe von 100 mg Ascorbinsäure und durch Zugabe von EtOH
abs. bis zu einem Volumen von 100 ml hergestellt.
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Die A- und B-Reagenzien-Lösungen wurden
im Dunklen für
30 Minuten vor ihrer Verwendung gehalten.
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Für
die Bestimmung der in der Verbindung vorliegenden Sulfatmenge wurden
geeignete Standardlösungen
von SO4
2- in H2SO4 zu 96% und eine
Leerlösung,
hergestellt mit Wasserverwendet. Eine Kalibrierungskurve wurde durch
Vermischen von 2 ml EtOH abs., 1 ml A-Reagenz und 1,5 ml B-Reagenz
mit der Standardlösung
von SO4
2- und mit
der Leerlösung
erhalten. Nach einem Rühren
ließ man
die Lösungen
im Dunklen bei Raumtemperatur für
10 Minuten. Die Absorption bei 520 nm wurde dann aufgezeichnet,
wobei die Leerprobe als Null betrachtet wurde und zwar durch ein
UV-VIS CARY 3E Spektrophotometer (Varian).
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Vor der Durchführung der quantitativen Analyse
der Sulfatgruppe in dem Polysaccharid durchlief das Polysaccharid
eine Hydrolyse.
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Ein Pyrex-Glas-Bakelit-versiegeltes
Teströhrchen,
enthaltend 3,00 mg Polysaccharid in 1 ml HCl, wurde für 4 Stunden
bei einer Temperatur von 120°C
in einem Ofen gehalten und es wurde eine vollständige Hydrolyse der Sulfatgruppen
erhalten.
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Mehrere Messungen, die zu unterschiedlichen
Zeitpunkten der Hydrolyse durchgeführt wurden, bewiesen, dass
eine verlängerte
Erwärmung
für 3 bis
4 Stunden ausreicht, um eine vollständige Hydrolyse der Sulfatgruppen
zu erhalten.
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Nach dieser Zeit wurde die Probe
in einen Rotations-Evaporator übertragen.
Die Badtemperatur wurde bei ungefähr 50°C gehalten, um das HCl zu eliminieren.
Die erhaltene Lösung
wurde dann mit Wasser versetzt, um eine endgültige Konzentration der hydrolysierten
Probe von 2 mg/ml zu erhalten.
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Nach Behandlung der hydrolysierten
Probe mit den Reagenzien A und B wie für die Sulfatproben, die für die Kalibrierungsprobe
verwendet wurden, beschrieben, wurde die Absorption bei 520 nm abgelesen
und die Sulfatmenge wurde unter Verwendung des Winkelkoeffizienten
der Kalibrierungskurve bestimmt.
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Die obige Analyse ergab, dass der
Gehalt der Sulfatgruppen bei 31% G/G lag.
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Beispiel 2
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Herstellung des Buttersäureesters
von Hyaluronsäure
mit einem Subistitutionsgrad DS von 0,08
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0,2 g Hyaluronsäure (4 × 104 MW)
wurden in einen 250 ml Rundbodenkolben abgewogen, versehen mit einer
Rührvorrichtung
und in 25 ml deionisiertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde mit 0,23 ml HCl
angesäuert
und nach 5 Minuten wurden 0,132 ml Collidin zugefügt. Nach
5 Minuten wurde die Lösung
auf ein Volumen von ungefähr
15 ml unter Vakuum konzentriert. 60 ml wasserfreies DMF wurden dann
zugefügt
und das System wurde auf ungefähr
40% des anfänglichen
Volumens konzentriert. Die letzten zwei Schritte wurden noch mal
wiederholt. Die Mischung wurde mit 40 ml DMF verdünnt, gefolgt
von einer Zugabe von 0,2 ml Pyridin und 0,163 ml Buttersäureanhydrid.
Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur durchgeführt und nach 18 Stunden gestoppt.
Die Lösung
durchlief eine Konzentration im Vakuum und dann wurden 50 ml deionisiertes
Wasser zugefügt.
Der pH der Lösung
wurde dann auf ungefähr
6,5 bis 7 mit wässrigem
NaHCO3 eingestellt, gefolgt von einer Dialyse
gegen deionisiertes Wasser (4 × 2
l). Das Produkt wurde durch Gefriertrocknen gewonnen und es wurden
0,135 g Buttersäurederivat
erhalten.
-
Die physikochemischen Eigenschaften
der butyrierten Hyaluronsäure,
erhalten wie oben beschrieben, sind die folgenden:
1H-NMR: Zusätzlich zu den typischen Signalen
der Hyaluronsäure
können
einige 0,90 ppm, 1,62 ppm und 2,39 ppm Signale nachgewiesen werden,
die jeweils den Protonen der Methyl- und Methylengruppen des Butyrats zugeordnet
werden.
-
Der Veresterungsgrad wurde auf der
Basis des NMR-Spektrums geschätzt;
die Prozentzahl der Buttersäureester
wurde dann durch Integration des Signals bestimmt, bezogen auf die
Methylgruppe im Hinblick auf das Signal der N-Acetylgruppe der Hyaluronsäure. Folgend
auf dieses Verfahren waren 16% der sich wiederholenden disaccharidischen
Einheiten der Hyaluronsäure
durch Buttersäurereste
substituiert mit einem korrespondierenden DS von 0,08.
-
Beispiel 3
-
Herstellung des Buttersäureesters
non Hyaluronsäure
mit einem Substitutionsgrad DS von 0,2
-
1,5 g Hyaluronsäure (4 × 104 MW)
wurden in einen 1 1 Rundbodenkolben gewogen, ausgerüstet mit einer
Rührvorrichtung
und gelöst
in 50 ml deionisiertem Wasser. Die Lösung wurde mit 1,71 ml HCl,
2 N, angesäuert
und nach 5 Minuten wurden 0,993 ml Collidin zugefügt. Nach
5 Minuten wurde die Lösung
auf ungefähr
die Hälfte
des Volumens im Vakuum konzentriert. 190 ml wasserfreies DMF wurden
dann zugefügt
und das System wurde auf ungefähr
50 bis 60 ml herabkonzentriert. Weiterhin wurden 100 ml wasserfreies
DMF zugefügt.
Die Lösung
wurde wiederum konzentriert. Die Mischung wurde dann mit weiteren
100 ml DMF verdünnt,
gefolgt von einer Zugabe von 2,85 ml Pyridin und 1,76 ml Buttersäureanhydrid.
Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur durchgeführt und nach 20 Stunden beendet.
Die Lösung
durchlief eine Konzentration im Vakuum und dann wurde der Rest in
150 ml deionisiertem Wasser suspendiert. Der pH der Lösung wurde
dann auf ungefähr
6,5 mit wässrigem
NaHCO3 eingestellt und die Lösung wurde
gegen deionisiertes Wasser (5 × 2 l)
deionisiert. Das Produkt wurde durch Gefriertrocknen gewonnen und
1,04 g des Derivats wurden erhalten. Die physiochemischen Eigenschaften
der butyrierten Hyluronsäure,
wie oben beschrieben, sind die Folgenden:
1H-NMR:
Zusätzlich
zu den typischen Signalen der Hyaluronsäure können einige 0,90 ppm, 1,62
ppm und 2,39 ppm-Signale nachgewiesen werden, die jeweils den Protonen
der Methyl- und Methylengruppen des Butyrats zugeordnet werden.
-
Durch Anwendung des in Beispiel 2
beschriebenen Verfahrens waren 40% der sich wiederholenden disaccharidischen Einheiten
der Hyaluronsäure
mit Buttersäureresten
substituiert mit einem korrespondierenden DS von 0,2.
-
Beispiel 4
-
Herstellung des Buttersäureesters
von Hyaluronsäure
mit einem D5 von 0,075
-
Eine Lösung von 2,0 g Hyaluronsäure (4 × 104 MW) wurde in einen 1 lRundbodenkolben in
60 ml deionisiertem Wasser abgewogen. Die Lösung wurde mit 2,30 ml HCl
2 N angesäuert
und nach 5 Minuten wurden 1,32 ml Collidin zugefügt. Die Lösung wurde auf ungefähr ein halbes
Volumen konzentriert und dann wurden weiterhin 300 ml wasserfreies
DMF zugefügt
um eine volle Lösung
des Polysaccharids zu erhalten. Die Lösung wurde auf ungefähr 80 ml
konzentriert; es wurden weitere 200 ml DMF zugefügt und die Lösung wurde
wiederum konzentriert. Das oben beschriebene Verfahren wurde dann
wiederholt. Nach weiterer Zugabe von DMF (60 ml) zu der auf diesem
Weg erhaltenen Mischung wurden 3,8 ml Pyridin und 1,634 ml Buttersäureanhydrid
zugefügt
und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 16 Stunden durchgeführt. Die
Lösung
wurde dann im Vakuum getrocknet und der erhaltene Rest wurde mit
120 ml deionisiertem Wasser zum Erhalt eines dichten Sirups gewonnen,
um dann in 50 ml deionisiertem Wasser suspendiert zu werden. Der
pH der Lösung wurde
dann auf ungefähr
6,5 bis 7 mit wässrigem
NaHCO3 eingestellt und die Lösung wurde
gegen deionisiertes Wasser (5 × 1
l) dialysiert. Das Produkt wurde nach Gefriertrocknen gewonnen und
1 g des Produkts wurden erhalten.
-
Die physikochemischen Eigenschaften
der butyrierten Hyaluronsäure
wie oben beschrieben sind die Folgenden:
1H-NMR:
Zusätzlich
zu den typischen Signalen der Hyaluronsäure können einige 0,90 ppm, 1,62
ppm und 2,39 ppm Signale nachgewiesen werden, die jeweils den Protonen
der Methyl- und Methylengruppen des Butyrats zugeordnet werden.
-
Durch Anwendung des in Beispiel 2
beschriebenen Verfahrens waren 15% der sich wiederholenden disaccharidischen
Einheiten der Hyaluronsäure
mit Buttersäureresten
substituiert mit einem korrespondierenden DS von 0,075.
-
Beispiel 5
-
Herstellung des Buttersäureesters
von Hyaluronsäure
mit einem D5 von 0,06
-
Eine Lösung, enthaltend 1,5 g Hyaluronsäure (MW
4 × 104) in 60 ml deionisiertem Wasser wurde 5 Minuten
in einem Rundbodenkolben gerührt,
ausgerüstet
mit einer Rührvorrichtung
und dann wurden 1,71 ml HCl 2 N zugefügt. Nach weiteren 5 Minuten
wurden 0,99 ml Collidin zugefügt
und die resultierende Mischung wurde auf ungefähr die Hälfte des Volumens konzentriert.
Nach Zugabe von 250 ml wasserfreien DMF wurde die Lösung auf
ungefähr
80 ml konzentriert und es wurden weitere 200 ml DMF zugefügt; die
Lösung
wurde dann wiederum durch Wiederholung des Verfahrens konzentriert
und eine schließliche
Zugabe von 150 ml wurde durchgeführt.
-
2,85 ml Pyridin und 1,22 ml Buttersäureanhydrid
wurden der Lösung
zugefügt.
Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 18 Stunden durchgeführt. Die
Mischung wurde unter Vakuum konzentriert und dann wurden 150 ml
deionisiertes Wasser zugefügt.
Der pH wurde auf ungefähr
6,5 mit NaHCO3 eingestellt. Die Lösung wurde
gegen deionisiertes Wasser (5 × 1
l) dialysiert und gefriergetrocknet; 1,32 g des Produkts wurden
gewonnen.
-
Die physikochemischen Eigenschaften
des Butyrats von Hyaluronsäure,
erhalten wie oben beschrieben, sind die Folgenden:
1H-NMR: Zusätzlich zu den typischen Signalen
der Hyaluronsäure
können
einige 0,90 ppm, 1,62 ppm und 2,39 ppm Signale nachgewiesen werden,
die jeweils den Protonen der Methyl- und Methylengruppen des Butyrats zugeordnet
werden.
-
Durch das in Beispiel 2 beschriebene
Verfahren wurden 12% der sich wiederholenden disaccharidischen Einheiten
der Hyaluronsäure
durch Buttersäurereste
substituiert (DS 0,06).
-
Beispiel 6
-
Herstellung des Buttersäureesters
von Hyaluronsäure
mit DS 0,25
-
0,75 g Hyaluronsäure (MW 4 × 104)
wurden in einen Rundbodenkolben abgewogen, ausgerüstet mit einer
Rührvorrichtung
und in 40 ml deionisiertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde mit 0,465 ml HCl
4 N angesäuert
und nach 10 Minuten wurden 0,31 ml Collidin und 70 ml DMF zugefügt. Die
resultierende Mischung wurde auf 90% des Volumens konzentriert.
Nach Zugabe von weiteren 70 ml wasserfreien DMF wurde die Lösung auf
50% des Volumens konzentriert. Das Verfahren wurde zweimal wiederholt.
70 ml Reagenz wurden jedes Mal zugefügt. 40 ml DMF, 3 ml Pyridin
und schließlich
1,22 ml Buttersäureanhydrid
wurden dann in der Reihenfolge der Mischung zugefügt. Die
Reaktion wurde bei Raumtemperatur durchgeführt und nach 17 Stunden beendet.
Nach einer Zugabe von 3 ml Pyridin und 0,56 Bernsteinsäureanhydrid
wurde die Mischung bei Raumtemperatur für 6 Stunden gehalten und dann
für eine
Zeitspanne von 16 Stunden auf 70°C
erwärmt.
Die Lösung
wurde dann im Vakuum konzentriert und der Rest wurde dann in Wasser
gelöst.
Der pH der Lösung wurde
auf 6 bis 6,5 mit wässrigem
NaHCO3 eingestellt und die Lösung wurde
gegen deionisiertes Wasser (5 × 2
l) dialysiert. Das Produkt wurde nach einem Gefriertrocknen gewonnen
und es wurden 0,8 g des Derivats erhalten.
-
Die physikochemischen Eigenschaften
des Hyaluronsäurederivats,
verestert mit Buttersäure
und Bernsteinsäureanhydrid,
wie oben beschrieben erhalten sind die Folgenden:
1H-NMR-spektrum:
Zusätzlich
zu den typischen Signalen der Hyaluronsäure können 0,90 ppm., 1,62 ppm und 2,39
ppm Signale nachgewiesen werden, die jeweils den Protonen der Buttersäuregruppen
zugeordnet werden können.
-
Durch Verwendung des in Beispiel
2 beschriebene Verfahrens erwiesen sich 50% der sich wiederholenden
disaccharidischen Einheiten der Hyaluronsäure als mit Buttersäureresten
substituiert (DS 0,25), während
70% der sich wiederholenden disaccharidischen Einheiten succinyliert
war (DS 0,35).
-
Beispiel 7
-
Herstellung des Buttersäureesters
von Hyaluronsäure
mit einem DS von 0,3 durch das Homogen-Phasen-Verfahren
-
Hyaluronsäure (0,10 g) mit einem MW von
4 × 104 wurde in 10 ml DMSO suspendiert und einige
Tropfen HCl (37%) wurden zugefügt,
um den pH auf einen Wert von 4 bis 5 einzustellen. Die Mischung
wurde dann unter magnetischem Rühren
bei Raumtemperatur bis zur vollständigen Auflösung gehalten. Dann wurden
0,40 g Dimethylaminopyridin und 1,14 ml Buttersäureanhydrid der Lösung zugefügt und die
Mischung wurde unter konstantem Rühren für 18 Stunden bei Raumtemperatur
gehalten. Der pH der Lösung
wurde dann auf ungefähr
5 bis 6 mit wässrigen
NaHCO3 angehoben und die Lösung wurde
gegen deionisiertes Wasser (5 × 1
l) dialysiert. Die Lösung
wurde schließlich
gefriergetrocknet und 0,04 g des Buttersäurederivats wurden in Form eines
Lyophilisats erhalten.
-
Die physikochemischen Eigenschaften
der butyrierten Hyaluronsäure,
wie oben beschrieben erhalten, sind die Folgenden:
1H-NMR: Zusätzlich zu den typischen Signalen
der Hyaluronsäure
können
einige 0,90 ppm, 1,62 ppm und 2,39 ppm Signale nachgewiesen werden,
die jeweils den Protonen der Methyl- und Methylengruppen des Butyrats zugeordnet
werden.
-
Der Veresterungsgrad wurde auf der
Basis des NMR-Spektrums bestimmt: die Prozentzahl der Buttersäureester
wurde dann durch Integration des Signals bestimmt, bezogen auf die
Methylgruppe, im Hinblick auf das Signal der N-Acetlygruppe der
Hyaluronsäure.
Auf der Basis dieses Spektrums ist der DS 0,3.
-
Beispiel 8
-
Herstellung des Buttersäureesters
eines Polysaccharids, isoliert aus Grateloupia doryphora mit DS
0,1
-
0,2 g des sulfatierten Polysaccharids,
isoliert aus Grateloupia doryphora wie beschrieben in Beispiel 1,
wurden in deionisiertem Wasser (10 ml) in einem Rundbodenkolben
gelöst,
ausgerüstet
mit einer Rührvorrichtung
und 0,117 ml HCl 4 N wurden der Lösung, abgekühlt auf 5°C, zugefügt. Die Lösung wurde unter Rühren 5 Minuten
gehalten und es wurden weitere 0,99 ml Collidin zugefügt. Nach
15 Minuten wurden weiterhin 30 ml wasserfreies DMF zugefügt und die
erhaltene Lösung
wurde auf ungefähr
30% des anfänglichen
Volumens konzentriert. Nach weiterer Zugabe von 30 ml DMF wurde
die Lösung
unter Rühren
bei einer Temperatur von 5°C
für eine
Stunde gehalten und 2 ml Pyridin und 0,175 ml Buttersäureanhydrid
wurden zugefügt.
Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur durchgeführt und nach 42 Stunden beendet.
Sie wurde dann konzentriert, um eine dichte Mischung zu erhalten.
-
Dieser Sirup wurde dann in 75 ml
deionisiertem Wasser für
45 Minuten gelöst.
Nach Einstellung des pH's
auf 6 mit NaHCO3 wurde die Lösung gegen
deionisiertes Wasser (2 × 2
l, 1 × 1
l) dialysiert und schließlich gefriergetrocknet.
0,19 g des Produkts wurden gewonnen.
-
Die physikochemischen Eigenschaften
der Butyrats des sulfatierten Polysaccharids, erhalten aus Grateloupia
doryphora, erhalten wie oben beschriebenn, sind die Folgenden:
1H-NMR-Spektriun: Der Substitutionsgrad wurde
durch Integration der Signale im Bereich von 5,5 und 5,0 ppm durchgeführt, zugeschrieben
den anomeren Protonen der saccharidischen Reste in α-Konfiguration
und dem Signal bis ungefähr
1,0 ppm, zugeschrieben den Methylprotonen von Butyrat. Aus dem Verhältnis zwischen den
Integralen ist es möglich
festzuhalten, dass die Reste der Buttersäure mit 20% im Hinblick auf
die sich wiederholenden saccharidischen Einheiten in α-Konfiguration
vorliegen (DS 0,1).
-
Kolorimetrische Analyse:
-
Diese Analyse ergab eine Menge der
sulfatierten Gruppen von 31% G/G, wie bei dem in Beispiel 1 hergestellten
Quell-Polysaccharid.
-
Beispiel 9
-
Herstellung
des Buttersäureesters
von Skleroglucan
-
0,5 g Skleroglucan (MW 7 × 105) wurden in 75 ml wasserfreiem DMF in einem
Rundbodenkolben gelöst,
versehen mit einer Rührvorrichtung.
Die erhaltene Mischung wurde für
eine Stunde bei einer Temperatur 50°C erwärmt und wurde dann unter Rühren bei
der Temperatur von 70°C
für 3 Stunden
erhalten. Die Lösung wurde
auf 55°C
abgekühlt
und dann wurden 0,25 ml Pyridin und 0,15 g Bernsteinsäureanhydrid
zugefügt.
Die erhaltene Mischung wurde unter Rühren bei einer Temperatur von
55°C für 64 Stunden
gehalten. Die Mischung wurde dann zum Erhalt eines dichten Sirups
konzentriert, der dann in 75 ml deionisiertem Wasser wieder suspendiert
wurde. Nach Einstellung des pH's
auf 6 mit NaHCO3 wurde die Mischung gegen
deionisiertes Wasser (4 × 2
l) dialysiert. Die auf diesem Weg erhaltene Lösung wurde dann filtriert und
gefriergetrocknet. Das Lyophilisat wurde in 20 ml Wasser in 60 Minuten
in einem Rundbodenkolben, versehen mit einer Rührvorrichtung, gelöst. Nach
Zugabe von 0,65 ml HCl 2 N wurde die Lösung wenn und opaque und wurde
unter Rühren
5 Minuten gehalten. Dann wurde 1 ml Pyridin zugefügt und man
ließ die
Lösung
10 Minuten bei einem pH von 4 bis 5 rühren. Es wurden 75 ml wasserfreies
DMF zugefügt
und die Mischung wurde auf ein Volumen von 72 ml konzentriert. Das
Verfahren wurde einmal wiederholt und 70 ml der Lösung wurden
entfernt. Nach Zugabe von 30 ml DMF und 2 ml Pyridin wurde die Mischung
bei Raumtemperatur für
15 Minuten gehalten. 0,38 ml Buttersäureanhydrid wurden zugefügt und die
Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 18 Stunden durchgeführt. Nach
einer Konzentration wurde der Rest in Wasser wieder suspendiert
und sein pH wurde auf 6,9 mit wässrigem
NaHCO3 eingestellt. Die auf diesem Weg erhaltene
Mischung wurde gefriergetrocknet und dann eingefroren. 0,196 g des
Produkts wurden erhalten.
-
Tests auf die biologische
Aktivität
-
Beispiel 10
-
Test auf die in vitro
antiproliferative Aktivität
-
Material und Methoden
-
Die antiproliferative Aktivität der Buttersäureester
der Erfindung wurde an verschiedenen Tumorzellinien getestet und
insbesondere:
-
- – MCF7:
Zellen von hormonabhängigem
Brust-Karzinom;
- – MDA-MB231:
Zellen von hormonabhängigem
Brust-Karzinom;
- – IGROVI:
Zellen von Ovarkarzinom;
- – HeLa:
Zellen aus Cervix-Karzinom;
- – CaLu:
Zellen aus Lungen-Karzinom;
- – HT29:
Zellen aus Colon-Karzinom.
-
Die obigen Zellen wurden als Monolayer
auf DMEM/F12 Dulbecco-modifiziertem
Eagle's Medium (Sigma
Chemical Co., St. Louis), supplementiert mit 2% V/V FCS (foetales
Kälberserum)
in einer T-75 cm2 Kunststofflasche (Corning
Industries, Corning, NY), gehalten bei einer Temperatur von 37°C, unter
feuchter Atmosphäre,
enthaltend 5% CO2 gezüchtet. Sie werden wöchentlich
in ein frisches Medium übertragen.
Vor dem Beginn der Experimente wurden die Zellen in der exponentiellen
Wachstumsphase aus den Kolben mit einer 0,05% Trypsin- und 0,02%
EDTA-Lösung
entfernt. Die Zellen wurden dann in Schalen mit 12 Vertiefungen
ausgesät
(50.000 Zellen/Vertiefung) auf DMEM/F12 Medium, supplementiert mit
2% FCS. Die Zellen wurden dann 24 Stunden gezüchtet, um die Adhäsion zu
unterstützen
und das Medium wurde dann entfernt und durch das experimentelle
Medium ersetzt. Die Zellen wurden dann 6 bis 9 Tage auf einen DMEM/F12-Medium,
supplementiert mit 2% FCS, gehalten und verschiedene Konzentrationen
der Verbindungen der Beispiele 2 und 4 gemäß der vorliegenden Erfindung
wurden zugefügt.
Ein Vergleichstest wurde mit Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht
von 4 × 104, zugefügt
mit den selben Konzentrationen, durchgeführt.
-
Die HeLa- und CaLu-Zellen wurden
wie oben für
die anderen Zellinien beschrieben behandelt, unter Verwendung des
DMEM/F12-Mediums, supplementiert mit 10% FCS und 1% Glutamin im
HeLa-Fall und das RPMI 1640 Medium, supplementiert mit 10% FCS und
1% Glutamin im Fall von CaLu anstelle des DMEM/F12-Mediums, supplementiert
mit 2% FCS.
-
Die antiproliferative Aktivität wurde
durch colorimetrische Bestimmung der DNA-Gehaltsvariation (Burton-Verfahren)
bestimmt, was proportional zur Zahl der Zellen ist und auf der colorimetrischen
Reaktion zwischen Biphenylamin und den Indolgruppen der durch Temperatur
denaturierten DNA basiert.
-
Ergebnisse
-
Tabelle 1 zeigt die Wachstumsprozentzahl
der Zellinie des MCF7 Brust-Karzinoms in Gegenwart der Buttersäureester
der Polysaccharide gemäß der vorliegenden
Erfindung im Hinblick auf unbehandelte Zellen (Kontrolle), nach
6 Tagen Behandlung. Jeder Wert ergibt sich aus dem Mittel von 4
Tests (wurde nach 4 Tests gemittelt) gemäß dem faktoriellen Ziehen (factorial
drawing) 4 × 4.
-
Die Molarität der Buttersäureester
der Erfindung wird auf die Molarität des Butyrats, das in dem
Ester selbst vorliegt, bezogen. Soweit die Hyaluronsäure betroffen
ist, ist die Molarität
dieselbe wie die Molarität
der Verbindung gemäß Beispiel
2, wo dieselbe Menge an Hyaluronsäure vorliegt.
-
-
Aus den oben dargestellten Zahlen
ergibt sich deutlich, dass die Buttersäureester gemäß der vorliegenden
Erfindung eine hohe antiproliferative Aktivität im Hinblick auf die Kontrolle
und im Hinblick auf die nicht veresterte Hyaluronsäure ausüben können.
-
Tabelle 2 zeigt die Wachstumsprozentzahl
der Zellinien von MCF7 Brust-Karzinom in Gegenwart der Buttersäureester
gemäß der vorliegenden
Erfindung nach 6 Behandlungstagen im Hinblick auf nicht behandelte
Zellen (Kontrolle), im Hinblick auf das nicht butyrierte natürliche Polysaccharid,
extrahiert aus Grateloupia doryphora gemäß Beispiel 1 und im Hinblick
auf das nicht veresterte Skleroglucan, das als Quell-Produkt für die in
Beispiel 9 beschriebene Synthese verwendet wird.
-
Selbst in diesem Fall wurde jeder
Wert nach 4 Tests Bemittelt, placiert auf die Schale gemäß dem faktoriellen
Ziehen 4 × 4.
Die Konzentrationen der getesteten Verbindungen sind als mg der
Verbindung pro ml der Gesamtlösung
ausgedrückt.
-
-
Die Zahlen zeigen, dass die oben
erwähnten
Buttersäureester
eine hohe antiproliferative Aktivität im Hinblick auf die Leerprobe,
das Polysaccharid gemäß Beispiel
1 und das Skleroglucan ausüben.
-
1 zeigt
die oben beschriebenen Zahlen im Hinblick auf. die antiproliferative
Aktivität
der Verbindungen gemäß Beispiel
3, 4, 6, 8 und 9 gemäß der vorliegenden
Erfindung in graphischer Form durch Nachweis der prozentualen Inhibition
der Tumorzell-Proliferation als Funktion der Konzentration der getesteten
Verbindungen (ausgedrückt
als mg der Verbindung pro ml der Gesamtlösung).
-
Weiterhin zeigt Tabelle 3 die Werte
von IC50 (notwendige Konzentration zur Inhibition des Zellwachstums
um 50%) der Buttersäureester
gemäß der vorliegenden
Erfindung nach 6 Behandlungstagen von unterschiedlichen Tumorzellinien.
Die Konzentrationen der Ester der Erfindung sind sowohl als Molaritäten des
in dem Ester selbst vorliegenden Butyrats (mM) als auch als mg der
Verbindung pro ml der Gesamtlösung (mg/ml)
ausgedrückt.
-
-
Beispiel 11
-
In vitro antiproliferative
Aktivität
des Butyrats von Hyaluronsäure
wie beschrieben in Beispiel 2 im Hinblick auf Einzelbestandteile
(Hyaluronsäure
und Buttersäure)
und ihre physikalische Mischung
-
Material und
Methoden
-
Zellen der MCF7-Linien des hormonabhängigen Brust-Karzinoms,
behandelt und kultiviert wie beschrieben in Beispiel 10, wurden
für 6 Tage
auf einem DMEM/F12-Medium, supplementiert mit 2% FCS in Gegenwart
von unterschiedlichen Konzentrationen des Buttersäureesters
gemäß Beispiel
2 gemäß der vorliegenden
Erfindung, seiner Bestandteile, d. h. Hyaluronsäure (MW 4 × 104),
mit Buttersäure
und der physikalischen Mischung von Hyaluronsäure und Buttersäure gehalten.
-
Die antiproliferative Aktivität wurde
gemäß dem Burton-Verfahren wie beschrieben
in Beispiel 10, bestimmt.
-
Ergebnisse
-
Tabelle 4 zeigt die antiproliferative
Aktivität
des Butyrats der Hyaluronsäure
wie beschrieben in Beispiel 2 auf das Wachstum der MCF7-Zellinien
nach 6 Behandlungstagen im Vergleich zu der Wirkung von Hyaluronsäure, von
Natriumbutyrat und der physikalischen Mischung beider Komponenten,
verwendet mit denselben Konzentrationen und unter denselben experimentellen
Bedingungen.
-
Die oben berichteten Zahlen geben
die Prozentzahl der Inhibition des Zellwachstums im Hinblick auf die
nicht behandelten Zellen (Kontrolle) an. Die Molaritäten (mM)
werden im Hinblick auf die Molaritäten der überprüften Verbindungen angegeben;
für die
Hyaluronsäure
zeigt die Molarität
dieselbe Quantität
der Hyaluronsäure
in dem Buttersäureester
wie beschrieben in Beispiel 2 an, wo der Molaritätswert auf die Butyratkonzentration
bezogen ist.
-
-
2 illustriert
die oben beschriebenen Zahlen in einer Darstellung, die die prozentuale
Inhibition des Zellwachstums gegenüber der Konzentration der getesteten
Verbindungen zeigt.
-
Diese Zahlen zeigen, dass die Buttersäureester
der Polysaccharide eine anti-proliferative Aktivität ausüben können, die
unerwartet höher
ist als die durch die Mischung der Bestandteile ausgeübte Aktivität.
-
Beispiel 12
-
In vitro anti-proliferative Aktivität der Buttersäureester
gemäß Beispiel
3 und 4 im Hinblick auf Natriumbutyrat Materialien und Methoden
Zellen des Brust-Karzinoms der hormonabhängigen MDA-MB231-Linie, behandelt
und kultiviert wie beschrieben in Beispiel 10, wurden 6 Tage auf
DMEM/F12-Medium, supplementiert mit 2% FCS, in Gegenwart unterschiedlicher
Konzentrationen von Buttersäureestern
wie in Beispiel 3 und 4 gemäß der vorliegenden
Erfindung und von Natriumbutyrat gehalten.
-
Die anti-proliferative Aktivität wurde
gemäß dem Burton-Verfahren, wie beschrieben
in Beispiel 10, bestimmt.
-
Ergebnisse
-
3 zeigt
die anti-proliferative Wirkung des Buttersäureesters der Beispiele 3 und
4 auf das Wachstum der MDA-MB231-Zellinie nach 6 Behandlungstagen
als Vergleich zur Wirkung von Natriumbutyrat, verwendet in denselben
Konzentrationen und unter denselben experimentellen Bedingungen.
Das Diagramm zeigt die prozentuale Inhibition des Zellwachstums
gegenüber
der Konzentration der getesteten Verbindungen (die (mM) Molarität bezieht
sich auf die Konzentration des Butyrats in den überprüften Verbindungen).