DE69016870T2 - Verfahren und Satz zur Bestimmung von Bestandteilen. - Google Patents

Verfahren und Satz zur Bestimmung von Bestandteilen.

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Description

    Hintergrund der Erfindung
  • Die vörliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe unter Anwendung einer enzymatischen Redox-Reaktion, bei dem vor der enzymatischen Redox-Reaktion reduzierende Substanzen in der Probe mit Wasserstoffperoxid, das durch eine weitere enzymatische Redox- Reaktion in Gegenwart von Peroxidase gebildet worden ist, oxidiert werden.
  • Es ist bekannt, daß eine Komponente in einer biologischen Probe bestimmt werden kann, indem man die Komponente mit einer für sie spezifischen Oxidase in Gegenwart von Sauerstoff unter Bildung von Wasserstoffperoxid oxidiert und das gebildete Wasserstoffperoxid nach einem an sich bekannten Verfahren bestimmt.
  • Es ist ferner bekannt, daß dann, wenn die Komponente nicht direkt oxidiert werden kann, diese Komponente in eine Verbindung übergeführt wird, die direkt mit Oxidase oxidiert wird, wonach auf die Verbindung das vorstehend genannte Verfahren angewandt wird.
  • Die Bestimmung von Wasserstoffperoxid wird üblicherweise durchgeführt, indem man das Wasserstoffperoxid mit einem Chromogen in Gegenwart van Peroxidase unter Bildung eines Pigments reagieren läßt und die Absorption des Reaktionsgemisches, das durch die Pigmentbildung gefarbt ist, mißt.
  • Das vorstehend beschriebene Verfahren ist empfindlich gegenüber Störungen durch verschiedene Substanzen, die in der biologischen Probe vorhanden sind, z. B. reduzierende Substanzen, wie Bilirubin, Cystein, Glutathion und verabreichte Arzneistoffe.
  • Insbesondere ist eine Störung durch reduzierende Substanzen, wie Bilirubin (sowohl konjugierte als auch freie Typen) schwerwiegend, was eine genaue Bestimmung der Komponente erschwert.
  • Um den Einfluß von derartigen reduzierenden Substanzen zu verringern, wurden Untersuchungen- über Methoden durchgeführt, bei denen ein Enzym, das zur Zersetzung von reduzierenden Substanzen befähigt ist, wie Bilirubin-oxidase, eingesetzt wird. Jedoch tritt bei derartigen Verfahren die Schwierigkeit auf, daß eine lange Zeitspanne zur Zersetzung der reduzierenden Substanzen erforderlich ist.
  • Es ist ferner bekannt, daß Wasserstoffperoxid eine Zersetzung von reduzierenden Substanzen bewirkt [Bulletin of Society of Clinical and Hygienic Assayers in Kyoto Prefecture, Japan, Bd. 10, Nr. 2 (1983), S. 31-36]. Wenn jedoch Wasserstoffperoxid direkt einer Probe zugesetzt wird, kommt es zu einer unerwünschten Zersetzung der zu bestimmenden Komponente, was auf das übermäßig starke Oxidationsvermögen von Wasserstoffperoxid zurückzuführen ist. Außerdem ist die Verwendung von Wasserstoffperoxid nicht zur Herstellung einer Testzusammensetzung in Form eines marktfähigen Kits (Reagentiensatzes) geeignet.
  • Bisher gibt es kein Verfahren, das es ermöglicht, unerwünschte Störungen durch in der Probe enthaltene reduzierende Substanzen zu vermeiden, und das für die Herstellung eines marktfähigen Testkits geeignet ist.
  • Als Ergebnis von Untersuchungen über die Zersetzung von reduzierenden Substanzen in einer biologischen Probe wurde festgestellt, daß die Verwendung von durch eine enzymatische Redox-Reaktion gebildetem Wasserstoffperoxid als eine in der Probe vorhandene Komponente, die von der zu bestimmenden Komponente abweicht, sehr wirksam ist und nicht zu den vorstehend beschriebenen Schwierigkeiten führt.
  • Diesbezüglich beschreibt US-A-4 416 982 ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten, der durch die Einwirkung eines Enzyms (B) in die Verbindung (A) übergeführt werden kann, die dann direkt durch die Einwirkung einer Oxidase, die zur Oxidation der Verbindung (A) befähigt ist, oxidiert werden kann, wobei das Verfahren folgende Stufen umfaßt:
  • (1) Die Verbindung (A) in der ursprünglichen Probe wird durch die Einwirkung der Oxidase unter Bildung von Wasserstoffperoxid oxidiert;
  • (2) das erhaltene Wasserstoffperoxid wird durch Zugabe von Peroxidase und Phenol, Anilin oder Derivaten davon zersetzt;
  • (3) der Analyt wird durch die Einwirkung eines Enzyms (B) in die Verbindung (A) übergeführt,
  • (4) die erhaltene Verbindung (A) wird durch die Einwirkung der Oxidase unter Bildung von Wasserstoffperoxid oxidiert; und
  • (5) das erhaltene Wasserstoffperoxid wird durch ein bekanntes Verfahren bestimmt.
  • Das US-Patent macht keine Aussage über die Zersetzung von reduzierenden Substanzen. Demgegenüber wird erfindungsgemäß eine Komponente, die nicht an einer enzymatischen Redox-Reaktion unter Einsatz des Analyten teilnimmt, für die Zersetzung von reduzierenden Substanzen verwendet, wie nachstehend beschrieben wird.
  • Ein weiteres US-Patent, nämlich US-A-4 820 416, beschreibt ein Verfahren zur Oxidation von Bilirubin, das die Umsetzung einer Lösung mit einem Gehalt an Bilirubin mit Hämoglobin, entweder in freier oder immobilisierter Form, in Gegenwart eines Cxidationsmittels, wie Wasserstoffperoxid, umfaßt.
  • In Beispiel 5 dieses US-Patents ist die Zersetzung von Bilirubin durch Oxidation unter Verwendung von Mikrokapseln mit einem Gehalt an Glucose-oxidase beschrieben. Das Cxidationsmittel wurde in situ erzeugt, und es wurde kein H&sub2;O&sub2; von außen zugegeben. Die vollständige Oxidation (Zersetzung) von Bilirubin dauerte fast 1 Stunde.
    • Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
  • Erfindungsgemäß läßt sich die Bestimmung einer Komponente (nachstehend als "Analyt" bezeichnet) in einer zu messenden Probe durchführen, indem man:
  • - in Gegenwart einer Verbindung (X), die durch Umsetzung mit Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Peroxidase zur Umwandlung in ein nicht-färbendes Radikal umgewandelt werden kann, Wasserstoffperoxid in einer ausreichenden Menge bildet, um reduzierende Substanzen in der Probe durch eine Oxidase-katalysierte, enzymatische Redox-Reaktion (1) unter Verwendung einer Komponente (Y) und eines Enzyms, das dazu befähigt ist, die Komponente (Y) als Substrat in der enzymatischen Redox-Reaktion (1) heranzuziehen, zu zersetzen, wobei eine oder beide der Komponenten (Y) und Enzym ggf. zusammen mit einer geeigneten Oxidase für Komponente (Y) der Probe zugesetzt werden, sofern sie nicht bereits darin enthalten sind, wobei die Komponente (Y) nicht an der enzymatischen Redox- Reaktion (2) unter Verwendung des Analyten beteiligt ist:
  • - die reduzierenden Substanzen mit dem in Gegenwart von Peroxidase gebildeten Wasserstoffperoxid oxidiert;
  • - ggf. das in der enzymatischen Redox-Reaktion (1) verwendete Enzym inaktiviert;
  • - das restliche Wasserstoffperoxid mit Peroxidase und der Verbindung (X) zersetzt;
  • - Wasserstoffperoxid durch die enzymatische Redox-Reaktion (2) unter Verwendung des Analyten bildet; und
  • - das gebildete Wasserstoffperoxid bestimmt.
    • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Handelt es sich bei dem Analyten um ein Substrat, das nicht direkt mit einer Oxidase oxidiert werden kann, wird der Analyt mit einem geeigneten Enzym in ein Substrat übergeführt, das direkt oxidiert werden kann.
  • Handelt es sich bei dem Analyten um ein Enzym, so wird ggf. das Substrat für das Enzym der Probe zusammen mit geeignetem Substrat und Enzym zur Bildung eines Substrats, das direkt oxidiert werden kann, zugesetzt.
  • Beispiele für den Analyten, der direkt oxidiert werden kann, sind freies Cholesterin, Glycerin, Glucose, Cholin, Brenztraubensäure (Pyruvat), Harnsäure, Harnstoff, Sarcosin und Milchsäure (Lactat).
  • Beispiele für den Analyten, der in ein direkt oxidierbares Substrat übergeführt werden kann, sind Cholesterinester, Triglyceride, Phospholipide, L-Alanin, L-Asparaginsäure, Oxalessigsäure, Stärke, Maltose, Sialinsäure, Creatin und Creatinin.
  • Reaktionen zur Bestimmung der Analyten, die in direkt oxidierbare Substrate übergeführt werden können, sind nachstehend erläutert. (1) Cholesterinester Cholesterinester Cholesterin-esterase Cholesterin Säure Cholesterin-oxidase Cholestenon Nachweis (2) Triglycerid Triglycerid Lipoprotein-lipase Glycerin-oxidase Glycerinaldehyd Nachweis (3) Phospholipid Phospholipid Phospholipase D Cholin Cholin-oxidase Cholinaldehyd Nachweis (4) Transaminase-Aktivität Glutamat-oxalacetat-transaminase (GOT) Glutamat-pruvat-transaminase (GPT) L-Alanin α-Ketoglutarsäure Brenztraubensäure L-Glutaminsäure Pyruvat-oxidase und Phosphat Acetylphosphat Nachweis (5) α-Amylase-Aktivität Starke α-Amylase Maltose α-Glucosidase Glucose-oxidase oder Pyranose-oxidase Gluconsäure Nachweis (6) Sialinverbindung Sialinverbindung Neuraminidase N-Acetylneuraminsäure Asialinverbindung N-Acetylneuraminsäure-aldolase Brenztraubensäure N-Acetylmannosamin Pyruvat-oxidase Acetylphosphat Nachweis (7) Creatinin Creatinin Creatininase Ceatinase Harnstoff Sarcosin Sarcosin-oxidase Formaldehyd Glycin Nachweis
  • Ein Beispiel für einen Analyten, bei dem es sich um ein Enzym handelt, ist Cholinesterase.
  • Als Komponente (Y) für die enzymatische Redox-Reaktion (I) kann eine beliebige Komponente verwendet werden, sofern Wasserstoffperoxid durch die Reaktion gebildet wird und die Komponente an der enzymatischen Redox-Reaktion (2) unter Verwendung des Analyten nicht teilnimmt.
  • Unter dem Ausdruck "Komponente, die an der enzymatischen Redox-Reaktion (2) unter Verwendung des Analyten teilnimmt" ist folgendes zu verstehen: Wenn es sich beim Analyten um ein Substrat handelt, das direkt oxidiert werden kann, bedeutet der Ausdruck den Analyten selbst; wenn der Analyt in ein Substrat übergeführt wird, das direkt oxidiert werden kann, bedeutet der Ausdruck den Analyten selbst und das bei der enzymatischen Umwandlung verwendete Substrat und Enzym; und wenn es sich beim Analyten um ein Enzym handelt, bedeutet der Ausdruck den Analyten selbst und das für die Bildung von Wasserstoffperoxid aus dem Analyten erforderliche Substrat und Enzym.
  • Beispiele für die Komponente (Y) sind die gleichen Substanzen, die vorstehend als Beispiele für den Analyten angegeben worden sind.
  • Üblicherweise wird eine Komponente, die direkt oxidiert werden kann, als Komponente (Y) verwendet.
  • Die Anzahl der Komponenten (Y) ist nicht auf eine beschränkt, sondern es können zwei oder mehr derartige Komponenten verwendet werden. Wenn die zu bestimmende Probe keine Komponente (Y) enthält oder darin die Komponente (Y) in einer zur Oxidation der reduzierenden Substanzen in der Probe unzureichenden Menge enthalten ist, können ein geeignetes Substrat und eine Oxidase für das Substrat der Probe zugesetzt werden, um die enzymatische Redox-Reaktion (1) durchzuführen.
  • Als Verbindung (X) können beliebige Verbindungen verwendet werden, sofern sie nicht mit Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Peroxidase unter Bildung eines Radikals, bei dem es sich um eine nicht-färbende Verbindung handelt, reagieren.
  • Beispiele für die Verbindung (X) sind die Verbindungen der Formel (I):
  • in der Z die Bedeutung OH oder NR&sub4;R&sub5; hat, worin R&sub4; und R&sub5; gleich oder verschieden sind und Wasserstoffatome, Alkylreste, substituierte Alkylreste oder Acylreste bedeuten und R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; gleich oder verschieden sind und Wasserstoffatome Halogenatome, Alkyl-, Alkoxy-, Amino-, Nitro-, Carboxy- oder Sulfonsäurereste bedeuten.
  • In den vorstehenden Definitionen bedeutet "Alkylrest" einen Alkylrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, wie Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl und Pentyl. Beispiele für Substituenten von substituierten Alkylresten sind Hydroxyl-, Amino- und Acylaminoreste. Der Acylrest im Acylaminorest hat die gleiche Bedeutung wie in R&sub4;. Unter einem Acylrest ist ein Rest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen zu verstehen, z.B. Formyl, Acetyl, Propionyl und Butyryl. Unter einem Alkoxyrest ist ein Rest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen zu verstehen, z. B. Methoxy, Ethoxy, Propoxy und Butoxy.
  • Spezielle Beispiele für die Verbindung (X) sind Phenol, 2,4-Dichlorphenol, p-Chlorphenol, 2,4-Dibromphenol, p-Bromphenol, 2,3-Dichlorphenol, 2-Nitrophenol, 3-Nitrophenol, 2- Aminophenol, 3-Aminophenol, Anilin, 2-Bromanilin, 3-Bromanilin, 2-Chloranilin, 3-Chloranilin, o-Toluidin, m-Toluidin, Dimethylanilin, Diethylanilin, o-Phenylendiamin, p-Phenylendiamin, o-Anisidin, m-Anisidin, o-Cresol, m-Cresol, 2- Methyl-2,6-dinitrophenol, 2-Methoxy-5'-nitroanilin, 2-Methyl-5-nitroanilin, 3,5-Dihydroxytoluol, 3-Methoxyphenol, 2- Amino-5-methylphenol, 2-Hydroxy-3-methylbenzoesäure, 2-Hydroxyphenylessigsäure, 2,3-Dimethylphenol, 2,5-Dimethylphenol, 2-Ethylphenol, 3-Ethylphenol, 2-Methoxymethylphenol, 2,3-Dimethylanilin, 2,5-Dimethylanilin, 3,5-Diethylanilin, 3-(Dimethylamino)-phenol, 3-Methoxy-N,N-dimethylanilin, N,N- Diethyl-1,3-phenylendiamin, 3, 5-Dimethyl-1,2-phenylendiamin und N-(Ethyl-N-(3-methylphenyl)-N'-acetylethylendiamin.
  • Die Bestimmung des Analyten kann durch stufenweise Durchführung der Reaktionen oder zweckmäßigerweise durch Kombination der folgenden Stufen A und B durchgeführt werden.
    • Stufe A (Zersetzung von reduzierenden Substanzen)
  • I. In Fällen, bei denen es sich bei der Komponente (Y) um eine direkt oxidierbare Komponente in einer Probe handelt, können die Probe, die Oxidase für die Komponente, die Peroxidase und die Verbindung (X) zu einer geeigneten Pufferlösung gegeben werden.
  • Bei dieser Stufe wird die Komponente (Y) mit der Oxidase in Gegenwart von Sauerstoff unter Bildung von Wasserstoffperoxid oxidiert. Anschließend werden die reduzierenden Substanzen in der Probe mit dem gebildeten Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Peroxidase und der Verbindung (X) oxidiert. Das restliche Wasserstoffperoxid reagiert mit der Verbindung (X) unter Bildung eines Radikals. Wenn die Oxidationsreaktion der reduzierenden Substanzen rascher als die Bildung des Radikals abläuft, werden die reduzierenden Substanzen innerhalb kurzer Zeit vollständig oxidiert, auch wenn die Reaktion von Wasserstoffperoxid mit der Verbindung (X) gleichzeitig abläuft.
  • Obgleich die Oxidationsreaktion der reduzierenden Substanzen ohne die Verbindung (X) ablaufen kann, wird sie durch Verwendung der Verbindung (X) beschleunigt.
  • (II). In Fällen, bei denen es sich bei der Komponente (Y) um ein nicht direkt oxidierbares Substrat (A) handelt, konnen die Probe, ein für die Umwandlung des Substrats (A) in das Substrat (B), das direkt oxidiert werden kann, erforderliches Enzym, die Oxidase für das Substrat (B), Peroxidase und die Verbindung (X) zu einer geeigneten Pufferlösung gegeben werden.
  • Bei dieser Stufe wird das Substrat (A) zunächst in das Substrat (B) übergeführt, und anschließend laufen die gleichen Reaktionen, wie sie in Stufe A-I beschrieben worden sind, ab. Wenn ein beliebiges anderes Substrat, Verbindung oder Enzym bei der Umwandlungsreaktion erforderlich sind, können diese Substanzen ebenfalls zur Pufferlöslung gegeben werden.
  • III. In Fällen, bei denen es sich bei der Komponente (Y) um ein Enzym handelt, werden die Probe, das Substrat (A) für das Enzym, die Oxidase für das Substrat (B), das durch Umwandlung des Substrats (A) erhalten werden kann, Peroxidase und die Verbindung (X) zu einer geeigneten Pufferlösung gegeben.
  • Nach Beendigung der Oxidation von reduzierenden Substanzen wird ein Inaktivierungsmittel für das als Komponente (Y) verwendete Enzym zum Reaktionsgemisch gegeben.
  • Bei dieser Stufe wird zunächst die Bildung des Substrats (B) durchgeführt, und anschließend können die gleichen Reaktionen, wie sie in Stufe A-1 beschrieben worden sind, erfolgen. Wenn beliebige andere Substrate und Enzyme für die Umwandlungsreaktion erforderlich sind, können diese zur Pufferlösung gegeben werden.
    • Stufe B (Bestimmung eines Analyten)
  • Als Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid können beliebige, an sich bekannte Verfahren herangezogen werden. Nachstehend wird ein besonders gebräuchliches Verfahren beschrieben.
  • Dieses Verfahren besteht darin, daß man Wasserstoffperoxid, das bei der enzymatischen Redox-Reaktion (2) gebildet worden ist, mit einem Chromogen in Gegenwart einer Peroxidase unter Bildung eines Pigments reagieren läßt und die Absorption des durch die Pigmentbildung gefärbten Reaktionsgemisches mißt.
  • I. In Fällen, bei denen es sich beim Analyten um ein direkt oxidierbares Substrat handelt, werden die Oxidase für den Analyten und ein Chromogen zu dem in Stufe A erhaltenen Reaktionsgemisch gegeben, um die Oxidationsreaktion durchzuführen.
  • Die Absorption des Reaktionsgemisches wird bei λmax des verwendeten Chromogens gemessen.
  • In dieser Stufe wird ein Pigment durch die Oxidationsreaktion gebildet, wobei eine Färbung entwickelt wird.
  • II. In Fällen, bei denen es sich beim Analyten um eine nicht direkt oxidierbare Komponente handelt, werden ein Enzym und/oder ein Substrat, die zur Bildung von Wasserstoffperoxid erforderlich sind, in stöchiometrischen Mengen zu der Komponente gegeben, und ein Chromogen wird zu dem in Stufe A erhaltenen Reaktionsgemisch zugesetzt.
  • Die Absorption des Reaktionsgemisches wird bei λmax des Chromogens gemessen.
  • Wenn es sich bei dieser Stufe bei der Komponente um ein Substrat handelt, wird dieses in ein weiteres Substrat, das direkt oxidiert werden kann, übergeführt.
  • Wenn es sich bei der Komponente um ein Enzym handelt, wird das Substrat für das Enzym zum Reaktionsgemisch von Stufe A gegeben, um ein weiteres Substrat zu erhalten, das direkt oxidiert werden kann.
  • In beiden Fällen wird durch die Oxidationsreaktion ein Pigment gebildet, wodurch sich eine Färbung entwickelt.
  • Als erfindungsgemäßes Chromogen können beliebige Chromogene eingesetzt werdend sofern sie mit Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Peroxidase unter stöchiometrischer Bildung eines Pigments reagieren.
  • Die Verbindung (X) kann als ein Teil des Chromogens verwendet werden. In diesem Fall kann ein Kupplungsmittel, wie 4-Aminoantipyrin (nachstehend als "4-AA" bezeichnet) oder 3-Me- thyl-2-benzothiazolinonhydrazon (nachstehend als MBTH bezeichnet), in Kombination mit der Verbindung (X) verwendet werden.
  • Die durch die nachstehende Formel wiedergegebene Verbindung kann als Chromogen verwendet werden.
  • In den vorstehenden Formeln bedeutet Z' eine Hydroxylgruppe, Aminogruppe oder substituierte Aminogruppe, Y' ein Sauerstoff- oder Schwefelatom, R'&sub1; ein Wasserstoffatom, einen Alkyl-, Alkenyl-, Aryl-, Amino- oder monosubstituierten Aminorest, R'&sub2; ein Wasserstoffatom, eine Hydroxyl-, Alkyl-, Alkenyl-, Aryl-, Amino-, Alkylamino- oder Alkoxygruppe, R'&sub3;, R'&sub4;, R'&sub5; und R'&sub6; ein Wasserstoffatom, eine Alkyl-, Alkenyl-, Acyl-, Aryl-, Halogen-, Sulfo-, Nitro-, Carboxyl-, Hydroxyl-, Hydroxyalkyl- oder Alkoxygruppe, R'&sub3; und R'&sub4; oder R'&sub5; und R'&sub6; können einen Alkenylenrest bilden, X' bedeutet eine der folgenden Gruppierungen -S-, -O-,
  • R'&sub7; und R'&sub8; bedeuten Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl oder Aryl (US-A-4 384 042).
  • Ferner kann das in US-A-4 810 642 beschriebene Chromogen verwendet werden.
  • Wenn es sich beim Analyten in einer Probe um ein Substrat (A) handelt, das nicht direkt oxidiert werden kann, wird das Substrat (A) in das Substrat (B) übergeführt, das sodann mit der Oxidase für das Substrat (B) unter Bildung von Wasserstoffperoxid oxidiert wird, wonach sich die Bestimmung des Wasserstoffperoxids anschließt.
  • Wenn beim vorstehend beschriebenen Verfahren die Probe sowohl das Substrat (A) als auch das Substrat (B) enthält, muß das ursprünglich in der Probe enthaltene Substrat (B) vor der Bestimmung des Substrats (A) entfernt oder zersetzt werden.
  • In einem derartigen Fall wird die Oxidase für das Substrat (B) zu einer Pufferlösung in Stufe (A) zugegeben, um das ursprünglich in der Probe enthaltene Substrat (B) zu oxidieren. Das durch die Oxidation gebildete Wasserstoffperoxid reagiert mit reduzierenden Substanzen in der Probe oder mit der Verbindung (X) unter Bildung eines Radikals.
  • Beispielsweise kann die Bestimmung eines Esters von Cholesterin in einer Probe, die Cholesterin in freier Form und Cholesterin in Esterform enthält, auf folgende Weise durchgeführt werden. Cholesterin-oxidase wird zu der Probe gegeben, um die freie Form von Cholesterin zu oxidieren. Das durch die Oxidation gebildete Wasserstoffperoxid läßt man mit Phenol oder 4-Aminoantipyrin reagieren, wobei das Wasserstoffperoxid zersetzt wird.
  • Anschließend wird die Esterform von Cholesterin bestimmt, indem man sie durch Esterase in die freie Form von Cholesterin überführt; die freie Form von Cholesterin mit Cholesterin-oxidase unter Bildung von Wasserstoffperoxid oxidiert; das Wasserstoffperoxid mit Phenol und 4-Aminoantipyrin in Gegenwart von Peroxidase unter Bildung eines Pigments reagieren läßt; und die Absorption des durch die Pigmentbildung gefärbten Reaktionsgemisches mißt.
  • In diesem Fall wird Cholesterin-oxidase in Stufe A zu einer Pufferlösung gegeben, wobei die freie Form von Cholesterin in der ursprünglichen Probe mit Cholesterin-oxidase unter Wasserstoffperoxid oxidiert wird, wobei letzteres sodann bei der Oxidation der reduzierenden Substanzen verwendet oder durch die Umsetzung mit der Verbindung (X) zersetzt wird. Somit kann die Stufe B durch ein einstufiges Verfahren durchgeführt werden, d. h. durch Zugabe von Cholesterinesterase und eines Chromogens zum in Stufe A erhaltenen Reaktionsgemisch.
  • Bei der Durchführung der Bestimmung wird die enzymatische Reaktion üblicherweise bei einer Temperatur von 5-50ºC und vorzugsweise 25-40 ºC in einer Pufferlösung mit einem pH- Wert von 2-10 durchgeführt und in einigen Minuten zu Ende gebracht.
  • Das Chromogen wird mit Wasserstoffperoxid in einer äquimolaren Menge oder mehr, vorzugsweise 10-1000 Moläquivalente, eingesetzt. Enzyme werden in einer Konzentration von 0,1-1000 IU/ml und vorzugsweise 1-100 IU/ml verwendet.
  • Als Puffer können Phosphatpuffer, Tris-HCl-Puffer, Succinatpuffer, Citratpuffer, Acetatpuffer und dergl. in einer Konzentration von 0,001-2 Mol/Liter verwendet werden.
  • Erfindungsgemäß wird auch ein Kit (Reagentiensatz) bereitgestellt, das folgendes umfaßt
  • eine Zusammensetzung (a), enthaltend
  • (1) eine Oxidase für die Komponente (Y) oder ein Substrat und/oder ein Enzym, das für die Bildung von Wasserstoffperoxid unter Verwendung der Komponente (Y) erforderlich ist
  • (2) Peroxidase und
  • (3) Verbindung (X)
  • und eine Zusammensetzung (b), enthaltend
  • (1) eine Oxidase für den Analyten oder ein Substrat und/oder ein Enzym, das für die Bildung von Wasserstoffperoxid unter Verwendung des Analyten erforderlich ist und
  • (2) ein Chromogen.
  • Nachstehend werden bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung durch die folgenden repräsentativen Beispiele erläutert.
  • In den Beispielen wurden Seren verwendet, die im wesentlichen keine reduzierenden Substanzen enthielten.
    • Beispiel 1 Bestimmung von Creatin
  • Eine Lösung wurde hergestellt, indem man 20 uMol Phenol, 10 Einheiten Peroxidase und 30 Einheiten Sarcosin-oxidase in 2,25 ml 10 millimolarem Phosphatpuffer (pH-Wert 7,4) löste. Die gleiche Lösung wurde getrennt hergestellt und mit 4 Einheiten L-Lactat-oxidase (LOD) versetzt. Die beiden Lösungen wurden jeweils mit 0,06 ml eines 1:1-Gemisches (bezogen auf das Volumen; das gleiche gilt auch für die späteren Ausführungen) aus einer 5 mg/dl Creatin enthaltenden Lösung und gereinigtem Wasser, eines 1:1-Gemisches aus Serum und gereinigtem Wasser, eines 1:1-Gemisches aus Serum und einer Bilirubinlösung mit der in Tabelle 1 angegebenen Konzentration oder gereinigtem Wasser versetzt. Die erhaltenen Gemische wurden zur Zersetzung von Bilirubin etwa 3 Minuten in einem Thermostaten auf 37 ºC vorerwärmt.
  • Sodann wurden die einzelnen Gemische mit einem Reagens versetzt, das durch Lösen von 1-Mol 4,4-Bis- (dimethylamino)-diphenyl-(2,7-dihydroxy-1-naphthyl)-methan und 100 Einheiten Creatinase in 0,75 ml 50 millimolarem N,N- Bis-(2-hydroxyethyl)-glycinpuffer (pH-Wert 8,0) hergestellt worden war. Nachdem die erhaltenen Gemische 10 Minuten in einem Thermostaten bei 37 ºC belassen worden waren, wurde die Absorption bei einer Wellenlänge von 633 nm mit einem Spektrophotometer (Modell 228, Produkt der Firma Hitachi, Ltd.) unter Verwendung von gereinigtem Wasser als Kontrolle gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Tabelle 1 Probe Creatin (mg/dl) Serum gereinigtes Wasser Bilirubin (mg/dl)
    • Beispiel 2
  • Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Abänderung, daß Glutathion anstelle von Bilirubin verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt. Tabelle 2 Probe Creatin (mg/dl) Serum gereinigtes Wasser Glutathion (mg/dl)
    • Beispiel 3 Bestimmung von Harnsäure
  • Eine Lösung wurde hergestellt, indem man 2,7 uMol N- Ethyl-N-(3-methylphenyl)-N'-succinylethylendiamin und 10 Einheiten Peroxidase in 1,5 ml 25 millimolarem Kaliumhydrogenphthalatpuffer (pH-Wert 6,5) löste. Die gleiche Lösung wurde getrennt hergestellt und mit 10 Einheiten Cholesterinoxidase (CHOD) und 5 Einheiten Cholesterin-esterase (CHER) versetzt.
  • Die beiden Lösungen wurden jeweils mit 0,08 ml eines 1:1- Gemisches aus einer 5 mg/dl Harnsäure enthaltenden Lösung und gereinigtem Wasser, eines 1:1-Gemisches aus Serum und gereinigtem Wasser, eines 1:1-Gemisches aus Serum und einer Bilirubinlösung mit der in Tabelle 3 angegebenen Konzentration oder gereinigtem Wasser versetzt. Die erhaltenen Gemische wurden zur Zersetzung von Bilirubin 5 Minuten in einem Thermostaten auf 37 ºC vorerwärmt.
  • Sodann wurden die einzelnen Gemische mit einem Reagens versetzt, das durch Lösen von 1 uMol 4-Aminoantipyrin und 2 Einheiten Uricase in 1,5 ml 0,1 m Phosphatpuffer (pH-Wert 6,5) hergestellt worden war. Nachdem die erhaltenen Gemische etwa 5 Minuten in einem Thermostaten bei 37 ºC belassen worden waren, wurde die Absorption bei einer Wellenlänge von 555 nm mit einem Spektrophotometer (Modell 228, Produkt der Firma Hitachi, Ltd.) unter Verwendung von gereinigtem Wasser als Kontrolle gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengestellt Tabelle 3 Probe Harnsäure (mg/dl) Serum gereinigtes Wasser Bilirubin
    • Beispiel 4
  • Das Verfahren von Beispiel 3 wurde wiederholt, mit der Abänderung, daß Glutathion anstelle von Bilirubin verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengestellt. Tabelle 4 Probe Harnsäure (mg/dl) Serum gereinigtes Wasser Glutathion (mg/dl)
    • Beispiel 5 Bestimmung von Milchsäure
  • Eine Lösung wurde hergestellt, indem man 3,6 uMol 4- Aminoantipyrin, 38 Einheiten Peroxidase und 7 Einheiten Cholin-oxidase in 2,5 ml 60 millimolarem Tris-Puffer (pH-Wert 7,5) löste. Die gleiche Lösung wurde getrennt davon hergestellt und mit 1,5 uMol o-Toluoylcholin (OTCC: ein Substrat für Cholinesterase) versetzt. Die beiden Lösungen wurden jeweils mit 0,04 ml eines 1:1-Gemisches aus einer 40 mg/dl Milchsäure enthaltenden Lösung und gereinigtem Wasser, eines 1:1-Gemisches aus Serum und gereinigtem Wasser, eines 1:1- Gemisches aus Serum und einer Bilirubinlösung mit einer in Tabelle 5 angegebenen Konzentration oder gereinigtem Wasser versetzt. Die erhaltenen Gemische wurden zur Zersetzung von Bilirubin 5 Minuten in einem Thermostaten auf 37 ºC vorerwärmt.
  • Die einzelnen Gemische wurden mit einem Reagens versetzt, das durch Lösen von 1,5 uMol Phenol, 0,1 mMol Neostigmin (Cholin-esterase-Inhibitor) und 4 Einheiten L-Lactat-oxidase in 0,5 ml 60 millimolarem Tris-Puffer (pH-Wert 7,5) hergestellt worden war. Nachdem die erhaltenen Gemische etwa 5 Minuten in einem Thermostaten auf 37 ºC belassen worden waren, wurde die Absorption bei einer Wellenlänge von 500 nm mit einem Spektrophotometer (Modell 228, Produkt der Firma Hitachi, Ltd.) unter Verwendung von gereinigtem Wasser als Kontrolle gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengestellt. Tabelle 5 Probe Milchsäure (mg/dl) Serum gereinigtes Wasser Bilirubin (mg/dl)
    • Beispiel 6
  • Das Verfahren von Beispiel 5 wurde wiederholt, mit der Abänderung, daß Glutathion anstelle von Bilirubin verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengestellt. Tabelle 6 Probe Milchsäure (mg/dl) Serum gereinigtes Wasser Glutathion (mg/dl)

Claims (7)

1. Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe.bei dem man
- in Gegenwart einer Verbindung (X), die durch Umsetzung mit Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Peroxidase zur Umwandlung in ein nicht-färbendes Radikal umgewandelt werden kann, Wasserstoffperoxid in einer ausreichenden Menge bildet, um reduzierende Substanzen in der Probe durch eine Oxidase-katalysierte, enzymatische Redox-Reaktion (1) unter Verwendung einer Komponente (Y) und eines Enzyms, das dazu befähigt ist, die Komponente (Y) als Substrat in der enzymatischen Redox-Reaktion (1) heranzuziehen, zu zersetzen, wobei eine oder beide der Komponenten (Y) und Enzym ggf. zusammen mit einer geeigneten Oxidase für Komponente (y) der Probe zugesetzt werden, sofern sie nicht bereits darin enthalten sind, wobei die Komponente (Y) nicht an der enzymatischen Redox- Reaktion (2) unter Verwendung des Analyten beteiligt ist;
- die reduzierenden Substanzen mit dem in Gegenwart von Peroxidase gebildeten Wasserstoffperoxid oxidiert;
- ggf. das in der enzymatischen Redox-Reaktion (1) verwendete Enzym inaktiviert;
- das restliche Wasserstoffperoxid mit Peroxidase und der Verbindung (X) zersetzt;
- Wasserstoffperoxid durch die enzymatische Redox-Reaktion (2) unter Verwendung des Analyten bildet; und
- das gebildete Wasserstoffperoxid bestimmt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich beim Analyten um einen Bestandteil aus der Gruppe Creatin, Harnstoff, freie Form von Cholesterin, Cholin, Glucose, Lactat, Glycerin, Pyruvat, Esterform von Cholesterin, Triglyceride, Sialinsäuren und Creatinin handelt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Komponente (Y) um einen Bestandteil aus der Gruppe Creatin, Harnstoff, Lactat, freie Form von Cholesterin, Esterform von Cholesterin, Glucose, Pyruvat und Phospholipide handelt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Oxidase um einen Bestandteil aus der Gruppe Cholesterin-oxidase, Cholin-oxidase, Pyruvat-oxidase, Lactat-oxidase, Sarcosin-oxidase, Glycerin-oxidase und Pyranose-oxidase handelt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bestimmung von Wasserstoffperoxid durchgeführt wird, indem man das Wasserstoffperoxid mit einem Chromogen in Anwesenheit einer Peroxidase unter Bildung eines Pigments reagieren läßt und die Veränderung der Absorption des durch die Pigmentbildung gefärbten Gemisches mißt.
6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Verbindung (X) aus folgender Gruppe ausgewählt wird:
Phenol, 2,4-Dichlörphenol, p-Chlorphenol, 2,4-Dibromphenol, p-Bromphenol, 2,3-Dichlorphenol, 2-Nitrophenol, 3-Nitrophenol, 2-Aminophenol, 3-Aminophenol, Anilin, 2-Bromanilin, 3-Bromanilin, 2-Chloranilin, 3-Chloranilin, o-Toluidin, m-Toluidin, Dimethylanilin, Diethylanilin, o-Phenylendiamin,
p-Phenylendiamin, o-Anisidin, m-Anisidin, o-Cresol, m- Cresol, 2-Methyl-2,6-dinitrophenol, 2-Methoxy-5-nitroanilin, 2-Methyl-5-nitroanilin, 3,5-Dihydroxytoluol, 3-Methoxyphenol, 2-Amino-5-methylphenol, 2-Hydroxy-3-methylbenzoesäure, 2-Hydroxyphenylessigsäure, 2,3-Dimethylphenol, 2,5- Dimethylphenol, 2-Ethylphenol, 3-Ethylphenol, 2- Methoxymethylphenol, 2,3-Dimethylanilin, 2,5-Dimethylanilin, 3,5-Diethylanilin, 3-(Dimethylamino)-phenol, 3-Methoxy-N,N- dimethylanilin, N,N-Diethyl-1,3-phenylendiamin, 3,5-Dimethyl-1,2-phenylendiamin und N-Ethyl-N-(3-methlyphenyl)-N'- acetylethylendiamin.
7. Reagentiensatz, umfassend
eine Zusammensetzung (a), enthaltend
(1) eine Oxidase für die Komponente (Y) oder ein Substrat und/oder ein Enzym, das für die Bildung von Wasserstoffperoxid unter Verwendung der Komponente (Y) erforderlich ist
(2) Peroxidase und
(3) Verbindung (X)
und eine Zusammensetzung (b), enthaltend
(1) eine Oxidase für den Analyten oder ein Substrat und/oder ein Enzym, das für die Bildung von Wasserstoffperoxid unter Verwendung des Analyten erforderlich ist und
(2) ein Chromogen.
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