DE2737288C2 - Verfahren zur Bestimmung des freien und/oder in Form von Triglyceriden vorliegenden gebundenen Glycerins in wäßrigen Flüssigkeiten sowie Bestimmungsreagenz für die Durchführung des Verfahrens und Bestimmungsreagenz für die Bestimmung von Adenosintriphosphat - Google Patents

Description

(a) eine Lipase,

(b) eine Glycerin-Kinase und

(c) AdeEosintriphosphat,

dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem noch

(d) a-Glycerophosphat-Oxidase sowie gegebenenfalls

(e) einen Elektronenakzeptor

enthält.

5. Bestimmungs-Reagenz nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es als Anteil (e> einen Indikator oder ein Indikatorsystem, das in Gegenwart von Wasserstoffperoxid eine feststellbare Veränderung herbeiführt, enthält.

6. Bestimißungs-Reagenz nach Ansprüchen 4 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es eine a-GIycerophosphat-Oxidase von Stroptocoi-vus faecalis enthält.

7. Bestimmungs-Reaeenz für d^:.e Durchführung des Verfahrens nach Ansprüchen 1 bis 3 zur Bestimmung von freiem Glycerin in wäßrit "·^η Flüssigkeiten, enthaltend

(a) eine Glycerin-Kinase;
(b) Adenosintriphosphat;

dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem noch

(c) ar-Glycerophosphat-Oxidase und
(d) einen Elektronenakzeptor

enthält.

8. Bestimmungs-Reagenz nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es als Anteil (d) ein Indikatorsystem mit einer Substanz mit peroxidativer Aktivität und einer Farbstoffvorläuferverbindung, die in Gegenwart eines Peroxides und der Substanz mit peroxidativer Aktivität eine feststellbare Veränderung herbeiführt, enthält.

9. Bestimmungs-Reagenz für die Bestimmung von Adenosintriphosphat in wäßriger Lösung, enthaltend

(a) Glycerin und
(b) eine Glycerin-Kinase,

dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem noch

(c) a-Glycerophosphat-Oxidase und
(d) einen Elektronenakzeptor

enthält.

ifc 60

Die Erfindung betritTt ein Verfahren zur Bestimmung des freien und/oder in Form von Triglyceriden vorliegenden gebundenen Glycerins in wäßrigen Flüssigkeiten, bei dem mar. in einer Probe der zu analysierenden Flüssigkeit gegebenenfalls vorhandene Triglyceride unter Freisetzen von Glycerin hydrolysiert, das freie und/ oder durch Hydrolyse freigesetzte Glycerin in L-a-Glycerophosphat überführt und unter Erzeugung einer feslstellbaren Veränderung weiter umsetzt. Des weiteren betrifft die Erfindung Bestimmungs-Reagenzien zur Durchführung des Verfahrens.

Die üblichen bekannten Verfahren zur Bestimmung des Triglyceridgehaltes von Blutserum bestehen in einer

Hydrolyse der Triglyceride unter Freisetzung vo" jlycerin und Umsetzung des Glycerins mit verschiedenen Reagenzien unter Erzeugung von Verbindungen, jie auf spektrophotometrischem Wege quantitativ bestimmt werden können.

Die Hydrolyse der Triglycende erfolgt dabei unter Verwendung einer Base. Aus den US-PS 37 03 591 und 37 59 793 ist es jedoch auch bereits bekannt, die Hydrolyse auf enzymatischem Wege herbeizuführen, und zwar nach dem Verfahren der US-PS 37 59 793 unter Verwendung einer Lipase allein und nach dem aus der US-PS 37 03 591 bekannten Verfahren unter Verwendung einer Lipase in Kombination mit einer Protease. Weitere nicht-enzymatische Hydrolyseverfahren sind beispielsweise aus den DE-PS 22 29 849 und 23 23 609 bekannt.

Es ist des weiteren bekannt, Glycerin auf enzymatischem Wege zu bestimmen. Die Bestimmung kann dabei nach drei verschiedenen enzymatischen Methoden erfolgen, nämlich:

(a) Methode von Garland und Rändle (vgl. P. B. Garland und P. J. Rändle in Nature, 196 [1962], Seiten 987-988).

Glycerin-Kinase

Glycerin + ATP ► L-tr-Glycerophosphat + ADP

Pyruvat-Kinase
ADF -t- Phiwphoenoipyruväi Pyruvat + ATP

Lactat

Pyruvat + NADH » Lactat + NAD⁺

Dehydrogenase

(b) Verfahren nach Weiland (vgl. O. Weiland in Biochem. Z., [1957], 329, Seite 313)

Glycerin-Kinase
Glycerin + ATP » L-ff-GIycerophosphat + ADP

«r-Glycerophospha:

L-ff-Glycerophosphat + NAD⁺ — * NADH + Dihydroxyacetonphosphat + H⁺

Dehydrogenase ^υ

(C) Glycerin-Dehydrogenase-Verfahren (vgl. J. H. Hagen und P. B. Hagen in Can. J. Biochem. und Physiology, 40 [1962], Seite 1129)

35 Glycerin

Glycerin + NAD⁺ —— > Dihydroxyaceton + NADH + H⁺

Dehydrogenase

Aus der DE-PS 26 65 556, der GB-PS 13 22 462 sowie der US-PS 37 59 793 sind ferner Abwandlungen der Methode (a) bekannt. In allen Fällen wird die Erzeugung von NADH oder das Verschwinden von NADH in einem U.V.-Spektrophotometerbei 340 nm bestimmt. Die Methode (a), zu deren Durchführung Besti/nmungs-Rcagenzien im Handel erhältlich sin 1, besteht aus einem 3-Enzymverfahren, wobei das Verschwinden von NADH gemessen wird. Die Methode (b) ist ein 2-Enzymverfahren, bei dem die NADH-Erzeugung gemessen wird. Auch bei der Methode (c), bei der es sich um eine ein Enzym verwendende Methode, und zwar eine Glycerin-Dehydrogenase-Reaktion handelt, wird die NADH-Erzeugung gemessen. Nachteilig an den beiden zuletzt genannten Methoden ist ihre extreme pH-Wensempfindlichkeit und die hiermit verbundene Störanfälligkeit, sofern keine genaue pH-Wertsüberwachung erfolgt. Nachteilig an allen drei Methoden, insbesondere der Methode (a; ist ferner, daß die Stabilität, und zwar nicht nur der diagnostischen Enzyme, sondern auch des Cofaktors, NADH, ein Problem ist. Fehler, die bei Durchführung der bekannten enzymatischen Methoden auftreten können, werden ausführlich von H. P. Chen und S. S. El-Mequid in der Zeitschrift Biochemical Medicine, 7 (1973), Seite 460 oeschrieben.

Ein weiteres Verfahren zur Bestimmung von Triglyceriden ist aus der DE-PS 21 39 163 bekannt. Dieses Verfahren in einer Hydrolyse der Triglyceride, Oxidation des erhaltenen Glycerins zu Formaldehyd und Umsetzung des Formaldehyds mit Ammoniak und einem stabilen, wasser- und alkohollöslichen, farblosen Metallkomplex des Acetylacetons unter Erzeugung einer farbigen Verbindung.

Es ist fernerauch bekannt, z. B. aus der DE-OS 22 13 721, Glucose in Flüssigkeiten durch enzymatische Oxidation mit Glucoseoxidase und SauerstofTund anschließenden Nachweis der entstehenden Reaktionsprodukte mittels einer Farbreaktion zu bestimmen.

Aus Chemical Abstracts 71, 19034 b (1969) ist es schließlich auch bekannt, daß sich e-Glycerophosphat mit Sauerstoff in Gegenwart von cr-Glycerophosphat-Oxidase zu Dihydroxyacetonphosphat und Wasserstoffperoxid umsetzen läßt.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren und ein Bestimmungs-Reagenz Tür die Bestimmung, insbesondere quantitativ? Bestimmung von Glycerin und Triglyceriden, insbesondere Serum-Triglyceriden anzugeben, bei dessen Durchführung die Einhaltung ganz bestimmter pH-Werte, wie bei den bekannten Verfahren nicht erforderlich ist, und das des weiteren keine so hohen Anforderungen an die Reagenz-Stabilität stellt, wie die bekannten Verfa>i.;::n.

Gelöst wird die gestellte Aufgabe mittels eines Verfahrens und Bestimmungsreagenzien, wie sie in den

Ansprüchen gekennzeichnet sind.

Demzufolge verfährt man erfindungsgemäß in der Weise, daß man das Glycerin in L-ar-Glycerophosphat überführt und das erzeugte L-a-Glycerophosphat in Gegenwart von a-Glycerophosphat-Oxidase unter Erzeugung einer feststellbaren Veränderung oxidiert.

In der zu analysierenden Flüssigkeit vorhandene Fettsäureester des Glycerins werden zunächst nach üblichen bekannten Methoden, vorzugsweise auf enzymatischem Wege, in besonders vorteilhafter Weise mit einer Lipase zu Glycerin hydrolysiert.

Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung verfährt man in der Weise, daß man das L-ar-Glycerophosphat in Gegenwart von «-Glycerophosphat-Oxidase unter Erzeugung von Wasserstoffperoxid oxidiert, das mit einer Substanz mit peroxidativer Aktivität unter Erzeugung einer feststellbaren Veränderung reagiert.

In vorteilhafter Weise führt man das Verfahren der Erfindung in Gegenwart von Sauerstoffals Elektronenakzeptor sowie eines Indikators oder eines Indikatorsystems, der bzw. das bei Kontakt mit Wasserstoffperoxid ein bestimmbares Reaktionsprodukt liefert, durch. Das bestimmbare Reaktionsprodukt besteht dabei in vorteilhafter Weise aus einer farbigen Verbindung, die gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung quantitativ meßbar ist.

In vorteilhafter Weise erfolgt des weiteren die Überführung des Glycerins in L-o-Glycerophosphat unter Verwendung einer Glycerin-Kinase.

Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung verfährt man somit derart, daß man eine Probe der zu analysierenden Flüssigkeit mit einem Bestimmungs-Reagenz in Kontakt bringt, das

(a) eine Lipase;

(b) eine Glycerin-Kinase und

(c) Adenosintriphosphat enthält und außerdem

(d) ύ'-Glycerophosphat-Oxidase sowie gegebenenfalls
is (e) einen Elektronenakzeptor.

Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung führt man das Verfahren in Gegenwart eines Indikatorsystems mit einer Substanz mit peroxidativer Aktivität und einer Farbstoffvorläuferverbindung durch, wobei die FarbstolTvorläuferverbindung entweder (1) eine Verbindung sein kann, die in Gegenwart von Wasser-Stoffperoxid und einer Substanz mit peroxidativer Aktivität einen Farbstoff erzeugt oder (2) aus einer Verbindung oder mehreren Verbindungen bestehen kann, die in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und einer Substanz mit peroxidativer Aktivität keine feststellbare Veränderung im sichtbaren Bereich des Spektrums herbeiführen, jedoch mit einer anderen Verbindung oder einer Reihe von Verbindungen unter Erzeugung eines quantitativ erfaßbaren Reaktionsproduktes zu reagieren vermögen, wobei dieses Reaktionsprodukt proportional zum Glycerin- und/oder Triglyceridgehalt der zu analysierenden Probe erzeugt wird.

Das Verfahren der Erfindung ermöglicht somit die quantitative Bestimmung des freien und/oder in Form von Triglyceriden vorliegenden gebundenen Glycerins in wäßrigen Flüssigkeiten nach folgendem Reaktionsschema:

Lipase
1. Trigycerid + HOH ► Glycerin + Fettsäuren

Glycerin-Kinase
2. Glycerin + ATP * L-a-Glycerophosphat + ADP

a-GP-Oxidase

3. L-tr-Glycerophosphat + Elektronenakzeptor ► Dihydroxyacetonphosphat + Verbindungen zur analytischen Bestimmung.

Bei Verwendung von Sauerstoffals Elektronenakzeptor wird H₂O₂ als analytische bestimmbare Verbindung in der Reaktion (3) erzeugt. In vorteilhafter Weise kann die H₂O₂-Bestimmung nach folgendem Reaktionsschema erfolgen:

Peroxidase
4. H,O, + HjA (red.) ► A (ox) + H₂O (bestimmbare Verbindung)

wobei bedeuten:

H^A (red.) eine Farbstoffvorläuferverbindung, bei der es sich um die reduzierte Form des Farbstoffes handelt;
A(ox) einen Farbstoff, der durch Oxidation von H₂A erhalten wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist gegenüber den bekannten Verfahren des Standes der Technik insbesondere deshalb technisch fortschrittlich, weil es nicht auf der Erzeugung oder Beseitigung von NADH beruht. Es weist gegenüber den bekannten Verfahren des Standes der Technik insbesondere folgende Vorteile auf: Es lassen sich alle Leucofarbstoffe, die Peroxidase als Elektronendonor benutzen können, in dem Indikatorsystem verwenden, weshalb man je nach dem ausgewählten Farbstoff die Umsetzung bei einer von mehreren verschiedenen Wellenlängen des sichtbaren Spektrums messen kann. Die im sichtbaren Spektrum durchführbaren Messungen sind weniger störanfällig als Messungen, die bei einer Wellenlänge von 340 nm durchgeführt werden müssen. Außer Farbstoffen lassen sich praktisch alle Mittel zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid einsetzen.

Es braucht keine Sorge für die Stabilität von NAD* oder NADH getragen zu werden, da O₂ der Cofaktor der j

flr-Glycerophosphat-Oxidasereaktion ist. Das erfindungsgemäße Verfahren wird nicht durch Serumkomponen- !

ten, die NAD* oder NADH alsCofaktoren verwenden (beispielsweise Lactat + Lactat-Dehydrogenase), gestört, ;j

welche die Reaktionsfolge bekannter Verfahren stören können. Es können alle Mittel, die einen O₂-Verbrauch ;

messen, als Bestimmungsmittel eingesetzt werden, wenn O₂ als Elektronenakzeptor verwendet wird. Schließ- 5 ^:4

lieh siiiu die verwendeten Enzyme innerhalb eines vergleichsweise breiten pH-Wert-Bereiches aktiv, so daß eine

sorgfältige pH-Wertsteuerung nicht erforderlich ist. ;j

Die erfindungsgemäß verwendbaren Bestimmungs-Reagenzien können in Form von Lösungen vorliegen oder !'ij

in Form von Trockenansätzen oder in lyophilisierter Form, in welchem Falle sie durch Zusatz von Wasser unmittelbar vor ihrer Verwendung in gebrauchsfertige Lösungen überführt werden können.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat besondere Bedeutung für klinische Untersuchungen, insbesondere die Bestimmung von Serum-Triglyceriden.

In vorteilhafter Weise erfolgt die Hydrolyse vorhandener Fettsäureester des Glycerins der Serumprobe mit einer Lipase oder einer Kombination aus einer Lipase und einem Effektor, beispielsweise einer Protease oder einer oberflächenaktiven Verbindung, je nach der Natur der vorliegenden Triglyceride. Dabei kann beispielsweise nach Methoden verfahren werden, wie sie aus den US-PS 37 03 591 und 37 59 793 bekannt sind.

Ein weiteres bekanntes Verlahren besteht in der Hydrolyse von Serum-Trigiyceriden unter Verwendung einer verträglichen Mischung aus einer Lipase, die normalerweise selbst nicht dazu befähigt ist, proteingebundene Triglyceride zu hydrolysieren, wie sie im Serum vorliegen, und einem Effektor, d. h. einer verträglichen oberflächenaktiven Verbindung. Eine geeignete verträgliche oberflächenaktive Verbindung ist dabei eine Verbindung, die die Triglycerid-Hydrolyse durch die Lipase stimuliert, wie es in dem folgenden Test beschrieben wird. Dies bedeutet also, daß eine verträgliche oberflächenaktive Verbindung eine solche ist, die die Aktivität der Lipase nicht inhibiert, sondern erhöht.

Vorteilhafte Lipasen sind solche von Candida cylindracea (Candida rugosa).

Ganz allgemein jedoch lassen sich die verschiedensten Lipasen für die Triglycerid-Hydrolyse verwenden, und zwar solche pflanzlichen wie auch tierischen Ursprungs. Geeignete Lipasen sind im Handel erhältlich.

Lipase-Präparate, die selbst nicht in der Lage sind, Serum-Triglyceride zu hydrolysieren, können in Kombination rnjt nicht-ionogenen und/oder anionischen oberflächenaktiven Verbindungen verwendet werden. Als besonders vorteilhafte oberflächenaktive Verbindungen haben sich beispielsweise Octyl- und Nonylphenoxypolyäthoxyäthanole erwiesen.

Wird Tür die Hydrolyse eine Protease-Lipase-Kombination des Standes der Technik verwendet, so können hierzu die verschiedensten üblichen bekannten Proteasen verwendet werden. Hierzu gehören beispielsweise Chymotrypsin, Streptomyces griseus protease, Proteasen von Aspergillus oryzae und Bacillus subtilis, Elastase, Papain und Bromelain. Auch können Mischungen derartiger Enzyme verwendet werden.

Die im Einzelfalle optimalen Konzentrationen sn Lipasc und anderen Effektoren, beispielsweise oberflächenaktiven Verbindungen und Protease, können sehr verschieden sein, je nach den zeitlichen Begrenzungen des Bestimmungsverfahrens. Die im Einzelfalle optimalen Konzentrationen lassen sich leicht ermitteln. Typische geeignete Konzentrationen ergeben sich aus den später folgenden Beispielen.

Die Hydrolyse der Triglyceride kann auch nach den üblichen bekannten »nicht-enzymatischen« Methoden durchgeführt werden, beispielsweise auch durch Behandlung mit einer starken Base. Es ist lediglich darauf zu achten, daß das durch Hydrolyse freigesetzte Glycerin dem enzymatischen Glycerin-Bestimmungsreagenz in einem Medium zugeführt wird, das keine Stoffe enthält, die die Enzyme des Glycerin-Bestimmungssystems inhibieren oder die in anderer Weise den Ablauf der Reaktionen, die zur Erzielung eines exakten Glycerin-Bestimmungsergebnisses erforderlich sind, beeinträchtigen könnten.

Sobald die Triglycerid-Hydrolyse erfolgt ist, kann die enzymatische Glycerin-Bestimmung durchgeführt werden.

Das erste Enzym der Glycerinbestimmung besteht aus Glycerin-Kinase, die die Umwandlung von Glycerin in L-<7-Glycerophosphat in Gegenwart von Adenosintriphosphat (ATP) katalysiert. Zur Durchführung des Verfahrens eignen sich die bekannten Glycerin-Kinasen. Als besonders vorteilhafte Glycerin-Kinasen haben sich solche erwiesen, die sich von E. coli und Candida mycoderma erhalten lassen. Eine Übersicht über verwendbare Glycerin-Kinasen, ihre Herstellung und ihre Reaktionsfähigkeit findet sich beispielsweise in dem »Enzyme Handbook« von T. E. Barman, Band I, Springer-Verlag, N. Y. (1969), Seiten 401 bis 402. Im übrigen sind geeignete Glycerin-Kinasen im Handel erhältlieh.

Die nächste Stufe des Bestimmungsverfahrens besteht in der Oxidation von L-tr-Glycerophosphat in Gegenwart von L-a-Glycerophosphat-Oxidase und einem Elektronenakzeptor unter Hervorrufung einer feststellbaren Änderung, vorzugsweise einer Farbveränderung oder Farbbildung, die vorzugsweise quantitativ von dem GIyceringehalt der untersuchten Probe abhängig ist. Die feststellbare Veränderung braucht jedoch nicht unbedingt in einer Farbveränderung oder Farbbildung zu bestehen. Vielmehr ist es beispielsweise auch möglich, andere feststellbare Veränderungen zu bestimmen, beispielsweise den Sauerstofiverbrauch.

Zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung verwendbar sind die verschiedensten Elektronenakzeptoren, die eine Oxidation des a-Glycerophosphates in Gegenwart des Oxidase-Enzymes unter gleichzeitiger Hervorrufung einer feststellbaren Veränderung ermöglichen. Besonders vorteilhafte Elektronenakzeptoren sind solche, die auf direktem oder indirektem Wege ein radiometrisch feststellbares, vorzugsweise farbiges Produkt liefern. Die Verwendbarkeit eines speziellen Elektronenakzeptors läßt sich auf experimentellem Wege leicht feststellen.

Als besonders vorteilhafter Elektronenakzeptor hat sich Sauerstoff erwiesen, der das L-ar-Glycerophosphat in Gegenwart von Oxidase zu Dihydroxyacetonphosphat und Wasserstoffperoxid oxidiert. Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid und Messung des Verbrauches von Sauerstoff in Reaktionen dieses Typs sind bekannt.

Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung wird als Elektronenakzeptor eine farbige oder nicht-farbige Verbindung verwendet, die einer Farbveränderung unterliegt oder die ein farbiges Reaktionsprodukt liefert, und zwar als Folge einer Reduktion in Gegenwart des Enzymes und des Substrates. Derartige Verbindungen lassen sich leicht durch einen Test ermitteln, wie er beispielsweise in dem später folgenden Beispiel 5 beschricben wird. Nach diesem Test-Verfahren sind beispielsweise Indophenole, Kaliumferricyanid und Tetrazoliumsalze geeignete Elektronenakzeptoren. Insbesondere hat sich gezeigt, daß 2,6-Dichlorphenolindolphenol allein oder in Kombination mit Phenazinmethosulfat und 2-(p-Indophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-nheny!-2H-tetrazoliumchlorid entweder allein oder in Kombination mit Phenazinmethosulfat vorteilhafte Elektronenakzeptoren darstellen.

Die feststellbare Veränderung läßt sich gegebenenfalls auch durch Durchführung von potentiometrischen Meßmethoden ermitteln, beispielsweise durch Messung des Sauerstoffverbrauchs unter Verwendung einer Sauerstoffelektrode.

Das Enzym L-a-Glycerophosphat-Oxidase kann verschiedenen Ursprungs sein. Als besonders vorteilhafte Oxidasen haben sich solche erwiesen, die von Streptococcaceae, Lactobacillaceae und Pediococcus erhalten werden. Eine vorteilhafte Oxidase ist weiterhin eine Oxidase von Kulturen von Streptococcus faecalis. Besonders vorteilhafte Oxidasen sind erhältlich von den Stämmen ATCC 11 700, ATCC 19 634 sowie ATCC 12 755 dci American Type Culture Collection.

Wie später noch näher beschrieben werden wird, weist beispielsweise das Enzym von ATCC 12 755 eine Aktivität innerhalb eines etwas breiteren pH-Bereiches auf als Enzyme von den anderen beiden Stämmen, weshalb sich ein Enzym von ATCC 12 755 als besonders vorteilhaft erwiesen hat.

Nähere Angaben bezüglich des Enzymes sowie Verfahren zu ihrer Herstellung und Extraktion finden sich beispielsweise in den folgenden Literaturstellen:

L. K, Koditschek und W. W. Umbreit »ar-Glyccrophosphate Oxidase in Streptococcus faecium, F 24«, Journal of Bacteriology, Band 98, Nr. 3 (1969), Seiten 1063 bis 1068 und N. J. Jacobs und P. J. Van Demark, »The Purification and Properties of the α-Glycerophosphate Oxidizing Enzyme of Streptococcus faecalis, 10 Cl.«, in Archives of Biochemistry and Biophysics, Bd. 88, (1960), Seiten 250-255.

Werden Enzympräparate unbekannter Herkunft verwendet, so ist zu überprüfen, ob nicht Verunreinigungen extrahiert werden müssen, welche die Bestimmungsergebnisse beeinträchtigen könnten. So kann es beispielsweise möglich sein, daß bestimmte L-a-Glycerophosphat-Oxidase-Präparate derart hohe Konzentrationen an Verunreinigungen enthalten, daß das rohe Präparat gereinigt werden muß, wozu übliche bekannte Fraktionierungs- und Kolonnen-Trennmethoden angewandt werden können.

Erfolgt die Bestimmung des Glycerins in wäßrigen Lösungen, beispielsweise in Blutserum, unter Verwendung eines Indikatorsystems, durch das die Wasserstoffperoxidkonzentration festgestellt wird, die bei der Oxidation von L-a-Glycerophosphat in Gegenwart von Sauerstoff erzeugt wird, so können hierzu bekannte Indikator-

ic ci/ctArnA uArurAnHpt wgrHgn

Geeignete Wasserstoffperoxid-Indikatorsysteme bestehen im allgemeinen aus einer Substanz mit peroxidativer Aktivität, vorzugsweise einer Peroxidase und einer Farbstoffvorläuferverbindung, die einer Farbbildungsreaktion oder Farbveränderung in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und der Substanz mit peroxidativer Aktivität unterliegt. Typische verwendbare Indikatorsysteme sind beispielsweise aus der US-PS 29 81 606 gekannt. Als besonders vorteilhaft hat sich die Verwendung von Indikatorsystemen mit Farbstoffvorläuferverbindungen erwiesen, d. h. Verbindungen, die ein farbiges Reaktionsprodukt durch eine Kupplungsreaktion liefern.

Verwendbar sind pflanzliche Peroxidasen, Lacto-Peroxidasen, Verdo-Peroxidasen sowie auch synthetische

Peroxidasen, wie sie beispielsweise von Theorell und Maehly in der Zeitschrift Acta Chem. Scand., Band 4 (1950), Seiten 422 bis 434 beschrieben werden. Verwendbar, wenn auch nicht vorzugsweise verwendet, sind ferner Substanzen, wie Hämin, Methämoglobin, Oxyhämoglobin, Hämoglobin, Hämochromogen, alkalisches Hämatin, Hämin-Derivate und andere Substanzen mit peroxidativer Aktivität.

Farbstoffvorläuferverbindungen, die gegebenfalls unter Verwendung einer Farbkupplerverbindung zu einer farbbildenden Reaktion in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und einer Substanz mit peroxidativer Aktivität geeignet sind, sind beispielsweise:

1. Monoamine, z. B. Anilin und Anilinderivate, o-Toluidin und p-Toluidin;

2. Diamine, z. B. o-Phenylendiamin, Ν,Ν'-Dimethyl-p-phenylendiamin, Ν,Ν'-Diäthylphenylendiamin, Benzidin und Dianisidin;

3. Phenole, z. B. Phenol selbst, Thymol, ο-, m- und p-Kresole, »-Naphthol undjff-Naphthol;

4. Polyphenole, z. B. Brenzcatechin, Guaiacol, Orcin, Pyrogallol, ρ,ρ-Dihydroxydiphenyl sowie Phloroglucin;

5. aromatische Säuren, z. B. Salicylsäure, Pyrocatechuic-Säure sowie Gallensäuren;

6. Leucofarbstoffe, z. B. Leucomalachitgrün und Leucophenolphthalein;

7. Farbstoffe, wie beispielsweise 2,6-Dichlorphenolindolphenol;

8. verschiedene biologische Substanzen, z. B. Epinphrin, Flavone, Tyrosin, Dihydroxyphenylalanin sowie Tryptophan;

9. andere Substanzen wie beispielsweise Gum guaiac, Guaiaconsäure, Kalium, Natrium- und andere wasserlösliche Iodide sowie Bilirubin und

10. spezielle Farbstoffe, z. B. 2,2'-Azin-di(3-äthy!benzoüüazoIin-(6)-su!fonsäure) sowie 3,3'-Diamsnobenzidin.

Weitere Indikatoren oder Indikatorsysteme, die durch Peroxide in Gegenwart von Peroxidase oxidierbar sind und die radiometrisch bestimmbare Reaktionsprodukte liefern, sind bestimmte Farbstoffe liefernde Substanzen. So können geeignete Indikatorsysteme beispielsweise Verbindungen aufweisen, die, wenn sie in Gegenwart von Peroxidase oxidiert werden, mit sich selbst oder mit ihrer reduzierten Form unter Bildung eines Farbstoffes

-eagieren. Derartige auto-kuppelnden Verbindungen können beispielsweise aus den verschiedensten Hydroxyverbindungen bestehen, beispielsweise aus o-Aminophenolen, 4-Alkoxynaphtholen, 4-Amino-5-pyrazolonen, Kresolen, Pyrogallol, Guaiacol, Orcin, Phloroglycin, ρ,ρ-Dihydroxydiphenyl, Gallensäuren, Pyrocate.huic-Säure, Salicylsäure und dergleichen. Verbindungen dieses Typs sind bekannt und werden in der Literatur beispielsweise in dem Buch von Mees und James, »The Theory of the Photographic Process«, 1969, insbesondere in Kapitel 17, beschrieben.

Die feststellbare oder bestimmbare Veränderung kann des weiteren beispielsweise durch Oxidation eines Leucofarbstoffes in Gegenwart von Peroxidase unter Erzeugung des entsprechenden Farbstoffes erfolgen. Typische Leucofarbstoffe, die erfindungsgemäß verwendbar sind, sind beispielsweise Leucomalachitgrün und Leucophenolphthalein. Weitere Leucofarbstoffe, die auch unter der Bezeichnung »oxichromogene Verbindungen« bekannt sind, werden beispielsweise in der US-PS 38 80 658 beschrieben, woraus auch bekannt ist, daß derartige Verbindungen mit entsprechenden Substituenten cfiffusionsfähig sind. Die aus der US-PS 38 80 658 bekannten nicht-stabilisierten oxichromogenen Verbindungen lassen sich im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens in besonders vorteilhafter Weise verwenden.

Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung kann eine feststellbare oder bestimmbare Veränderung durch ein Indikatorsystem herbeigeführt werden, das eine Verbindung enthält, die in Gegenwart von Peroxidase oxidierbar ist und die zu einer oxidativen Kondensationsreaktion mit Kupplerverbindungen befähigt ist, 7. B. solchen Farbkupplerverbindungen mit phenolischen Gruppen oder aktivierten Methylengruppen.

Typische derartige oxidierbare Verbindungen sind beispielsweise Benzidm und Benzidinhomologe, p-Phenylendiamine, p-Aminophenole, 4-Aminoaiitipyrine und dergleichen. Derartige Kuppler sowie auto-kuppelnde Verbindungen sind aus der Literatur bekannt und werden beispielsweise in dem bereits zitierten Buch von Mees und James sowie in dem Buch von Kosar, »Light-Sensitive Systems«, 1965, Seiten 215 bis 248, beschrieben.

Als besonders vorteilhafter Indikator für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens hat sich 4-Methoxy- 1-naphthol erwiesen, das in oxidiertem Zustand einer Selbstkupplung unterliegt oder eine Kombination aus 1,7-Dihydroxynaphthalin und 4-Aminoantipyrin (HCI). Im letzteren Falle kuppelt die oxidierte Pyrinverbindung mit dem Dihydroxyi;aphthalin.

Die optimale Konzentration der Bestandteile der verschiedenen Indikatorsysteme, die sich zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwenden lassen, hängt zu einem großen Teil von der Konzentration des Glycerins in der zu untersuchenden Probe ab, der Bestimmungsvorrichtung und dem erzeugten Farbstoff. Die im Einzelfalle optimalen Konzentrationen lassen sich leicht ermitteln. Typische Konzentrationswerte ergeben sich aus den später folgenden Beispielen.

Die Bestimmung des Wasserstoffperoxides kann jedoch auch auf andere Weise erfolgen. So können beispielsweise die Enzyme und anderen Reagenzien, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erforderlich sind, in Membranen von Sauerstoff-sensitiven poiarographischen Elektroden untergebracht werden, wie sie beispielsweise von Rebecca L. Rawls unter der Überschrift »Electrodes Hold Promise in Biomedical Uses« in der Zeitschrift Chemical and Engineering News, Januar 1976, Seite 19 beschrieben werden.

Anstatt das erzeugte Wasserstoffperoxid zu bestimmen, ist es des weiteren auch möglich, den Sauerstoffverbrauch zu ermitteln, und zwar unter Verwendung einer Sauerstoff-sensitiven Elektrode, in welchem Falle die Menge an Sauerstoff bestimmt wird, die bei der Umsetzung von Sauerstoff als Elektronenakzeptor mit L-a>Glycerophosphat verbraucht wird.

Die optimalen Konzentrationen der anderen Komponenten eines erfindungsgemäßen Bestimmungs-Reagenz können ebenfalls sehr verschieden sein, je nach der zu analysierenden Lösung (z. B. Blutserum, verdünnt oder unverdünnt oder der Zusammensetzung anderer komplexer wäßriger Lösungen von Glycerin und/oder Triglyceriden.

In der folgenden Tabelle I sind allgemein verwendbare und bevorzugt verwendbare Konzentrationsbereiche der einzelnen Komponenten erfindungsgemäß verwendbarer Bestimmungsreagenzien angegeben.

Tabelle I

Enzym

Allgemein
anwendbarer Bereich

(E/ml)

Vorzugsweise
angewandte Menge

(E/ml)

Lipase (falls verwendet) Giycerin-Kinase Glycerophosphat-Oxidase Protease (falls verwendet) Peroxidase

Oberflächenaktive Substanz (falls verwendet)

Gegebenenfalls können jedoch auch vorteilhafte Ergebnisse dann erhalten werden, wenn Enzym-Konzentratio >v;n außerhalb der angegebenen Bereiche angewendet werden.

20-160	80
0,05-1	0,2
1-10	4
300-2400	1200,0
0,2-1,4	0,7
g/ml	g/ml
0,01-0,05	0,02

In der Tabelle I ist eine internationale Einheit eines Enzymes definiert als die Enzymmenge, die die Umwandlung eines Mikromoles eines Substrates in einer Minute bei 37°C und einem pH-Wert von 7 bewirkt.

Es ist bekannt, daß ein jedes Enzym ein pH-Aktivitäts-Profil aufweist, d. h. daß die Aktivität eines jeden Enzymes pH-Wert-abhängig ist. Beispielsweise ergibt sich aus dem pH-Aktivitäts-Profil von L-c-Glycerophosphat-5 Oxidase eine Spitze zwischen einem pH-Wert von etwa 5 und 8.5. Aus der folgenden Tabelle II ergeben sich die pH-Bereiche, in denen die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendeten Enzyme besonders aktiv sind.

Tabelle U

pH-Wertbereich

Lipase 5-9

Glycerin-Kinase 7-9

L-e-Glycerophosphat-Oxidase 6,3-8,0

Peroxidase 6-8

Aus aer Tabelle ergibt sich, daß es vorteilhaft ist, die erfindungsgemäßen Bestimmungs-Reagenzien auf einen pH-Wert zwiscbec etwa 6,0 und etwa 8,0, insbesondere zwischen etwa 7,0 und etwa 8,0 abzupuffern. Dabei können übliche bekannte Methoden angewandt werden. Beispielsweise können entsprechende Konzentrationen an Puffersubstanzen in den erfindungsgemäßen Bestimmungs-Reagenzien gelöst, dispergiert oder in anderer Weise verteilt werden. Andererseits können jedoch auch Puffersubstanzen in trockener Form verwendet werden, beispielsweise dann, wenn die Bestimmungs-Reagenzien in trockener Form in Form von Mischungen hergestellt werden.

Zur Herstellung der Bestimmungs-Reagenzien geeignete Puffersubstansen sind bekannt und werden im Detail beispielsweise von Good in der Zeitschrift Biochemistry, 5, (1966), Seite 467 beschrieben. Besonders vorteilhafte Puffersubstanzen sind Phosphate, beispielsweise Kaliumphosphat.

Die Konzentrationen der erzeugten Verbindungen, die zu bestimmen sind, können nach üblichen bekannten Methoden ermittelt werden, beispielsweise durch Vergleich mit einer standardisierten Farbkarte, auf spektrophotometrischem Wege und dergleichen.

In den später folgenden Beispielen wurden die folgenden Enzympräparate und standardisierten Verfahren angewandt:

Standard-Lösungen

Die genauen Konzentrationen von Glycerin-Standard-Lösungen wurden nach der Methode von Garland und Rändle (Nature, 196 [1962], Seite 987 bis 988) bestimmt.

Wasserstoffperoxid-Lösungen wurden standardisiert durch Messung der optischen Absorption bei 240 nm

*°~ (A₂4o) und unter Verwendung von E₂₄₀ = 43,6 für entsprechende Berechnungen. Die Serumproben wurden auf ihren Triglyceridgehalt nach der halb-automatisierten fluorometrischen Methode von Kessler und Lederer untersucht (vergl. »Fluorometric Measurement of Triglycerides, Automation in Analytical Chemistry«, Technican Symposia, L. T. Sheggs, Jr., Ed. Medical Inc., N. Y., N. Y. 341 [1966]).

Quantitative Glycerin- und Triglyceridbestimmung nach der ar-GP-Oxidase-Methode

Inkubationsmischungen für die Glycerinbestimmung enthielten in einem Gesamtvolumen von 1.0 ml:

200 μ Mole Kaliumphosphat-Puffersubstanz, pH-Wert = e.O^^-Purpurogallin-EinheitenMeerrettich-Peroxidase, 2,5 μ Mole MgSO₄,2,4 μ Mole ATP, 10 mg Triton X-100,96 μ^-ΑηιίηοΒη^Γβη-Ι-^ΓοοΓίΙοΓΪα,

32 μ g 1,7-Dihydroxynaphthalin (zugesetzt in Form einer 0,8%igen Lösung in Äthanol) und 4 Einheiten a-GP-Oxidase (überschüssige Glycerin-Kinase war in dem e-GP-Oxidase-Präparat vorhanden).

Für die quantitativen Triglyceridbestimmungen enthielten die Inkubierungs-Mischungen 10 mg (8 Einheiten/mg) Lipase von Candida rugosa zusätzlich zu den oben angegebenen Komponenten.

Sämtliche Komponenten wurden durch 5 Minuten langes Stehenlassen bei 37°C ins Gleichgewicht gebracht, worauf die Absorption bei 490 nm (A₄₉₀) ermittelt wurde.

Die Reaktionen wurden dann dadurch eingeleitet, daß entweder eine Glycerin-Standardlösung (5-100 η Mole) oder eine Serum-Standardlösung (20 ul) zugegeben wurde, worauf die Mischung 20 bis 30 Minuten lang stehengelassen wurde. Daraufhin wurde von neuem die Absorption bei 490 nm gemessen, und zwar diesmal der (A₄₉₀) Endwert. Abweichungen von diesem Standardsystem werden, falls notwendig, angegeben.

Berechnung der Triglycerid-Konzentrationen

Triglycerid-Glycerin-Konzentrationen von unbekannten Proben wurden in der folgenden Weise bestimmt:

Der Δ Ac₀-WeM (A₄₉₀-WeH [Endwert] minus A»₉₀-Wert [Anfangswert]) der Proben, die in Gegenwart des Stan-

dard-G!ycerin-Bestimmungssystems inkubiert wurden, wurde abgezogen von dem Δ A₄₉₀-Wert der gleichen Proben, die in Gegenwart von Lipase M und des Standard-Glycerin-Bestimmungssystems inkubiert wurden.

Die Triglycerid-Konzentrationen wurden von dieser Lipase M abhängigen Absorptionsveränderung unter Verwendung einer Eichkurve mit entweder Glycerin oder vor-analysierten Serumproben als Standardlösungen bestimmt.

Züchtung von S. faecal is

S. faecal is-Stäm me (vergl. die Angaben in der später folgenden Tabelle III) wurden auf Schrägen mit 0,1% Glucose, 1% Trypton, 1% Hefeextrakt, 0,65% K₂HPO₄ und 1,5% Agar gezüchtet. Wäßrige Suspensionen der Schrägen-Kolonien (0,2 ml einer 1,0-ml-Suspension pro Kolben) wurden zur Inokulierung von Kolben verwendet, die mit jeweils 25 ml Medium gefüllt waren. Die Kolben wurden dann 22 Stunden lang bei 30⁰C in einem Inkubierungs-Schüttelgerät bei 120 Umdrehungen pro Minute geschüttelt.

Herstellung der zellfreien Extrakte

Geerntet wurden die Zellen von 100 ml Medium durch Zentrifugieren (4°C, 10 000 Xg, 10 Minuten). Sie *> vden mit 40 ml eine kalten 0,05 molaren Kaliumphosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0 gewaschen, nochmals zentrifugiert und dann in 10 ml Pufferlösung suspendiert. Die Zellen wurden dann durch Ultraschallbehandlung in einer Rosett-Kühlzelle aufgebrochen. Die Behandlung dauerte 7 Minuten.

Die Temperatur wurde unterhalb 8°C gehalten. Die nach 10 Minuten Zentrifugieren bei 10 000 Xg erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde als Enzymlieferant verwendet. In allen Fällen erreichte die Menge an löslichem Protein während der angegebenen Beschallungsperiode ein Maximum. Bei Verwendung von Bovin-Serum-Albumin als Standard wurde die Proteinkonzentration nach der Methode von Lowry und Mitarbeitern bestimmt (vergl. D. H. Lowry, N. S. Roseborough, A. L. Farr und R. J. Randall in J. Biol. Chem. 193 [1951], Seite 265).

Isolierung von a-Giycerophosphat-Oxidase von Streptococcus faecal is

In der folgenden Tabelle IH sind die Ergebnisse zusammengestellt, die im Falle von drei Stämmen von Streptococcus faecalis erhalten wurden.

In jedem Faile wurden die Organismen aerob 22 Stunden lang bei 30⁰C in einem Glucosemedium kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt und durch Beschallung zerstört.

Die Verstehende Flüssigkeit von einer Zentrifugierung bei 10 000 X g wurde dann als Enzymlieferant (roher Extrakt) verwendet. Jedoch blieb die Oxidase in Lösung auch nach einer einstündigen Zentrifugierung bei 100 000 X g. In allen Fällen war die Abnahme an gelöstem Sauerstoff proportional zur Menge an rohem Extrakt und hing ab von sowohl D,L-a-Glycerophosphat und dem Extrakt.

Wie sich aus der folgenden Tabelle III ergibt, zeigen alle drei Stämme eine Sauerstoff-gebundene Aktivität. Das Enzym von dem Stamm ATCC 11 700 hatte ein pH-Optimum bei 5,8 und die Oxidase von dem Stamm ATCC 19 634 zeigte ein Maximum bei einem pH-Wert von 7,0. Dieser Trend ergibt sich ebenfalls aus Tabelle III. In analoger Weise war die Aktivität des Enzymes von dem Stamm 12 755 ähnlich zu dem Enzym von dem Stamm ATCC 19 634.

Tabelle III

Isolation von α-Glycerophosphat-Oxidase von drei Stämmen von Streptococcus faecalis

Die Reaktionen wurden bei 21°C in einer 0,05molaren Kaliumphosphat-Pufferlösung bei dem angegebenen pH-Wert durchgeführt, unter Verwendung von 0.13 M D.L-ff-Glycerophosphat als Substrat.

S. faecalis Kultur pH-Wert der Abnahme an

Fnkubations-Mischung gelöstem O2 in % ,.

ATCC 11 700 6,0 4,52

7,3 1,49

ATCC 19 634 6,1 3,94 "

7,5 6,90

ATCC 12 755 5,9 4,93

6,8 7,10

Bestimmung von ir-Glycerophosphat-Oxidase mit einer Sauerstoff-Elektrode

Die L-ar-Glycerophosphat-Oxidase wurde bestimmt durch Messung der Verminderung vom gelösten Sauerstoff in einem Analysegerät.

Die Sauerstoff-Elektrode wurde sowohl gegenüber N₂ als auch gegenüber mit Wasser gesättigter Luft geeicht, und zwar bei konstantem Rühren mit einem N'agnetrührer. Die Inkubierungsmischungen enthielten Puffersub:;tanz sowie D.L-a-Glycerophosphat bei einem Gesamtvolu-

men von 7,5 ml. Eine Gleichgewichtseinstellung wurde bei 21°C herbeigeführt. Die Reaktionen wurden dann eingeleitet durch Enzymzusatz, worauf die Abnahme an gelöstem Sauerstoff aus dem linearen Teil der Kurve ermittelt wurde.

Spektrophotometrische Bestimmung von o-Glycerophosphat-Oxidase

a-GP-Oxidase wurde mittels eines Reagenzes bestimmt, das in einem Gesamtvolumen von 1,0 ml enthielt: 100 μ Mole Kaliumphosphat-Pußer, pH-Wert = 7,0,66 ^g o-Dianisidin,25 μg Meerrettich-Peroxidase (4,6 PurpurogaUin-Einheiten) und 200 μ Mole D,L-e-Glycerophosphat (bei einem pH-Wert von 7,0).
ίο Eine Gleichgewichtseinstellung des Reagenzes erfolgte bei 37°C. Die Reaktionen wurden durch Zusatz gleicher Enzymmengen eingeleitet. Die Aktivität wurde aus der anfangs linearen Neigung der Reaktionsspur bei 430 cm mit ε = 1,08 x 10⁴ berechnet

Eigenschaften der o-Glycerophosphat-Oxidase in rohen Extrakten

Ein pH-Aktivitäts-Profil von a-Glycerophosphat-Oxidase des Stammes 12 755 ist in Fig. 1 dargestellt. Eine optimale Aktivität wurde innerhalb des breiten pH-Wertsbereiches von 63 bis 74 beobachtet. Unterhalb eines pH-Wertes voaS.O und oberhalb eines pH-Wertes von 8.0 nahm die Aktivität rasch ab. Aus F i g. 1 ergibt sich des weiteren die offensichtliche Inhibierung des Enzyms durch entweder Tris-HCl (Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid) (A-A) oderGlycin-KOH (X) Puffer. Bei einem pH-Wert von 7,7 war die Aktivität in einerO.lmolaren Kaliumphosphatpufferlösung 4mal so groß als die Aktivität, die im Falle einer 0,1 molaren Glycin-KOH-Lösung beobachtet wurde. Erfolgte die Inkubation jedoch in Gegenwart von sowohl einer 0,lmolaren Glycin-KOH-Lösung wie auch in Gegenwart einer 0,07molaren Kaliumphosphatpufferlösung bei einem pH-Wert von 7,7, so ergaben sich 82'A der ursprünglichen Aktivität (in Gegenwar» einer O.lmolaren Kaliumphosphatpufferlösung). Hieraus ergibt sich, daß Tris-HCl und Glycin-KOH keine Inhibitoren sind, sondern daß vielmehr eine Kaliumphosp'uatpufferlösung das Enzym aktiviert. Auch muß eine Natriumacetatpufferlösung das Enzym stimulieren (F i g. 1), da bei einem pH-Wert von 6,5 die Aktivität in der Natriumacetatpufferlösung mindestens 90% der Aktivität betrug, die im Falle einer Kaliumphosphatpufferiösung zu beobachten war.

L-ff-Glycerophosphat-Oxidase-Reinigung

Untersuchungen des ff-Glycerc^hosphat-Oxidase-Glycerin-Bestimmungssystems zeigten, daß das rohe a-Glycerophosphat (o-GP)-Oxidase-Präparat Verunreinigungen enthielt. Einige dieser Verunreinigungen verhinderten die Verwendung des rohen Enzymes bei Serumuntersuchungen, da im Serum ganz offensichtlich Substrate für diese Enzyme in Konzentrationen vorhanden waren, die vergleichbar waren mit den normalen Triglycerid-Konzentrationen. Bestimmte dieser Verunreinigungen wirkten des weiteren auf im Semm vorhandene Substrate unter Erzeugung von Wasserstoffperoxid, wodurch das bevorzugte Bestimmungsverfahren gestört wurde.

Die Ergebnisse der Reinigung unter Anwendung von Protein-Fraktionierungsverfahren sind in der folgenden Tabelle IV zusammengestellt.

Tabelle IV

Reinigung von e-Glycerophosphat-Oxidase von S. Faecalis ATCC 12 755

*) 1 Einheit entspricht der Menge an Enzym, die erforderlich ist, um 1 uMol Substrat in I uMol Produkt in I Minute

bei 37°C zu überführen. 60

Stabilität von a-Glycerophosphat-Oxidase

Die Enzym-Lösung erwies sich mindestens 4 Monate lang als stabil, wenn sie bei -20⁰C aufbewahrt wurde. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen denaturierte das Enzym nicht. Auch wurde das Enzym nicht durch Octylphenoxypolyethoxyethanol inhibiert, und zwar selbst nicht bei Konzentrationen der oberflächenaktiven Substanz von 2%.

Verfahren	Gesamt-	Gesamt-	Einheiten	Reinigung	Aus
	Einheiten*)	Protein	ff-GP OX		beute
	ar-GP OX	mg	mg Protein
Roher Zeil-freier Extrakt	6300	9850	0,64	1	100
Protamin · SO4-Fraktionierung (0,05%)	6280	9540	0,66	1,03	100
Ammonium · SO4-Fraktionierung	5590	4700	1,2	1,9	89
(50 bis 80%)
DEAE-Cellulose-Fraktionierung	3600	1007	3,6	5,6	57
Dialyse und Konzentration	4250	1007	4,22	6,6	68

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindun· iäher veranschaulichen,

Beispiel 1
Eich-Kurve fur Glycerin und Wasserstoffperoxid

Eine Glycerin-Ansprech-Kurve ist in Fig. 2 dargestellt.

Zunächst wurden Mischungen, wie oben unter der Überschrift »Quantitative Glycerin- und Triglyceridbestimmung nach der α-GP-Oxidase-Methode« beschrieben hergestellt.

Dann wurden Reaktionen durch Substratzusatz eingeleitet, die nach 15 Minuten bei 37°C im wesentlichen beendet waren. Es wurde eine gute Beziehung zwischen den Glycerin-Konzentrationen (·) und der Farbstoffbildung (X) für die gekoppelten Reaktionen ?, 3 und 4 festgestellt.

Beispiel 2

15 Quantitative Bestimmung eines Triglycerid-Substrates

Eine Triglycerid-Emulsion wurde dadurch hergestellt, daß eine Mischung von Olivenöl (3,ιί ,iMole/ml) in 0,4%igem Octylphenoxypolyethoxyethanol r.\ einem Eisbade 10 Minuten lang einer Behandlung mit Ultraschallwellen ausgesetzt wurde.

Eine quantitative Bestimmung des Triglycerid-Substrates durch die gekoppelten Reaktionen 1, 2, 3 und 4 wurde mit der quantitativen Bestimmungsmethode von Garland und Rändle verglichen. Es wurden ausreichende Mengen an Lipase von Candida rugosa zugesetzt, um die Hydrolyse des Triglycerides rasch (weniger als 1 Minute) und vollständig zu katalysieren. Das Triglycerid-Glycerin wurde bestimmt durch einen Vergleich des A A₄J₀-WeHeS nach einer 30mitiütigen Inkubation mit der Glycerin-Konzentration-Ansprechkurve, ähnlich is F i g. 2. Die in Tabelle V dargestellten Werte zeigen eine gute Übereinstimmung zwischen den beiden Methoden. Die Triglyceridwerte. die nach der ar-Glycerophosphat-Oxidase-Methode ermittelt wurden, lagen in allen Fällen etwa höher, jedoch war der Unterschied lediglich im Falle der Probe 2 größer als 10%.

Beispiel 3

Quantitative Bestimmung von Serum-Triglyceriden nach der a-Glycerophosphat-Oxidase-Methode

Unter Verwendung des bevorzugt verwendeten Puffersystems, d. h. eines 0,2molaren Kaliumphosphatpuffers bei einem yH-Wert von 8,0 wurden 10 Serum-Proben auf ihren Triglycerid-Glyceringehalt bei Konzentrationen von 0,50 bis 6,50 mM untersucht.

Die Vergleichsmischungen enthielten lediglich die Standard-Komponenten für die Glycerin-Bestimmung; die Probenmischungen enthielten Lipase von Candida rugosa sowie die Standa'rikomponenten für die Glycerin-Bestimmung.

Die Gleichgewichtseinstellung sämtlicher Mischungen erfolgte durch 5 M'nuten langes Erwärmen auf 37°C, worauf die Ausgangs-A4₉o-Werte ermittelt wurden. 5;

Die Reaktionen wurden durch Zusatz von 20 μΐ einer jeden Serumprobe eingeleitet, wonach nach einer Inkubationsdauer von 20 Minuten die endgültigen A₄₉₀-WeHe ermittelt wurden.

Die Triglycerid-Glycerinkonzentrationen wurden unter Verwendung einer wäßrigen Glycerin-Ekhkurve, wie in F i g. 2 dargestellt, ermittelt, nachdem die Δ A₄₉₀-WeHe der Vergleichsproben von den Δ A₄₉₀-Werten der Proben abgezogen worden waren. In der folgenden Tabelle VI sind die Ergebnisse von Vergleichsversuchen unter Einbeziehung der Methode von Kessler und Lederer (vergl. »Fluorometric Measurement of Triglycerides«, Automation in Analytical Chemistry, Technicon Symposia, L. T. Skeggs, Jr. Editor, Mediad, Inc., New York, New York, 341 [ 1966]) angegeben. Wie sich aus den Date, ι ergibt, besteht eine gute Übereinstimmung zwischen den beiden Methoden.

Tabelle V Triglycerid-Konzentration	Methode nach Garland und Rändle	a-G Iy cerophosp hat- Oxidase-Methode
Probe	18,4 36,8 73,6 110,0	19,0 42,0 78,0 114,0
1 2 3 4

Tabelle VI

Vergleich der quantitativen Serum-Triglyceridbestimmung unter Verwendung des σ-Glycerophosphat-Oxidascsystems mit einer halbautomatischen chemischen Methode

Proben-Nr.

Triglycerid-Konzentration Vergleichs-Methode

mM

mg/dl

<r-Glycerophosphat-Oxidase-	mg/dl
Methode	550,80
mM	416,50
6,48	337,45
4,90	314,50
3,97	161,50
3,70	93,50
1,90	42,50
1,10	53.55
0,50	114,75
0,63	80,75
1,35
0,95

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

6,59
4,82
3,76
3,30
2,00
1,71
1,06
0,59
1,25
1,00

560,15

409,70

319,60

280,50

170,00

145,35

90,10

50,15

106,25

85,00

Beispiel 4

Die Genauigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde durch wiederholte Bestimmung von zwei verschiedenen Serumproben getestet. Eine Serumprobe enthielt eine normale Triglycerin-Konzentration und die andere Serumprobe eine hohe Triglycerid-Konzentration. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VlI zusammengestellt. Im Falle der normalen Probe wurde ein Abweichungs-Koeffizient von 5,1% bestimmt und im Falle der abnormalen Probe ein entsprechender Koeffizient von 2,6%.

Tabelle VII

Reproduzierbarkeit des ar-GP-Oxidase-Systems für die
quantitative Triglyceridbestimmung
Triglycerid-Konzentration (mM)

Normaler Serumspiegel	Hoher Serumspiegel
1,60	4,90
1,66	4,82
1.61	4,80
1,42	5,25
1,62	4,72
1,55	5,00
1.54	4,78
1,70	4,92
1,66	4,96
1,54	4,83
	4,91
	4,79
	4,90
	4,80
Mittelwert = 1,59	4,89
S.D. =±0,081	0,13
COV = 5,10	2,60

Beispiel 5
Verwendung anderer Elektronenakzeptoren

Dies Beispiel veranschaulicht, daß außer Sauerstoff auch andere Elektronenakzeptoren verwendet werden können. Zu diesem Zweck wurden Reaktionsmischungen mit den folgenden Bestandteilen hergestellt:

12

0,1 M Kaliumphosphat-PufTer für die Einstellung eines pH-Wertes von 7; ί

0,2 M D.L-a-Glycerophosphat; j

Elcktronenakzeptor, wie in der folgenden Tabelle VIII angegeben. ■'"!

In jedem Falle erfolgte eine Gleichgewichtseinstellung der Mischung bei 37°C, worauf die Reaktion durch 5 ;i

Enzyinzusatz eingeleitet wurde. Die Aktivität des verwendeten Enzymes wurde in der beschriebenen Weise i

berechnet, unter Verwendung von E₆₀J-, = 16 x 10³ Tür 2,6-Dichlorphenolindolphenol, E₄₀₀ = 1 x 10'¹ für -i

K,Fe(CN₆) und E₅₀, = 18,5 x \Q³ für '.-(p-IndophenylKMp-nitrophenyD-S-phenyl^M-tetrazoliumchlorid j

(INT). ₍j

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VIII zusammengestellt. ic if

Tabelle VIII _Ί

Verwendung anderer Elektronenakzeptoren für die a-GP-Oxidase-Reaktion '

uMüic üxiüicrics Relative

a-GP/Min./mg Geschwindigkeit*)

80	1
4	0,05
70	0,88
21	0,26
35	0,44
0,8	0,01
12	0,15

Sauerstoff ου ι ₂α>

2,6-Dichlorphenolindolphenol (70 um) 2,6-Dichlorphenolindolphenol (70 um) Phenazinmethosulfat (60 um) K₃Fe(CN)₆ (1 mM) K₁Fe(CN)₆ (1 mM) Phenazinmethosulfat (60 um)

INT**)(0,16mM) w,_o u,w. ₃₀

INT (0,16 mM)
Phenazinmethosulfat (60 ,um)

*) Verglichen mit Sauerstoff als Elektronenakzeptor.
*·) INT = 2-(p-Indophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazoliumchlorid. ³⁵

Die Erfindung ermöglicht die quantitative Bestimmung eines jeden Reagenzes und Enzymes, das in dem erfindungsgemäßen Reagenz-System verwendet wird. So läßt sich beispielsweise ATP mit einem Bestimmungs-Reagenz bestimmen, das sämtliche Reagenzien außer ATP enthält, das mit der zu analysierenden Probe züge- -to führt wird. In entsprechender Weise lassen sich Glycerin-Kinase, Lipase und e-Glycerophosphat bestimmen, indem entsprechende Bestimmungsreagenzien verwendet werden, die alle Komponenten enthalten, außer den zu bestimmenden Komponenten.

Die erfindungsgemäßen Bestimmungs-Reagenzien können des weiteren in vorteilhafter Weise in eine Matrix aus einem absorbierenden Material bekannten Aufbaues eingearbeitet werden, beispielsweise durch Imprä- 45 gnieren der Matrix.

Auf diese Weise lassen sich Testmaterialien und Testelemente hersteilen, die sich für die qualitative oder halbquantitative Bestimmung von Glycerin und/oder Trigiyceriden eignen. Die Bestimmungs-Reagenzien können des weiteren zur Herstellung analytischer Elemente verwendet werden, die beispielsweise aus einem Schichtträger und verschiedenen hierauf aufgebrachten Schichten, beispielsweise einer Ausbreitschicht, und einer Rea- 50 genzschicht bestehen können. Dies bedeutet, daß die Bestimmungs-Reagenzien der Erfindung beispielsweise zur Herstellung analytischer Elemente verwendet werden können, wie sie im Aufbau beispielsweise aus den folgenden US-PS bekannt sind:

30 92 465,34 18 099,34 18 083,28 93 843,28 93 844,29 12 309,30 08 879,38 02 842,37 98 064,32 98 739, 55 39 15 647, 39 17 453, 39 33 596 und 39 36 357.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen
1 60

13

Claims (4)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung des freien und/oder in Form von Triglyceriden vorliegenden gebundenen Glycerins in wäßrigen Flüssigkeiten, bei dem man in einer Probe der zu analysierenden Flüssigkeit gegebenenfalls vorhandene Triglyceride unter Freisetzen von Glycerin hydrolysiert, das freie und/oder durch Hydrolyse freigesetzte Glycerin in L-a^Glycerophosphat überführt und unter Erzeugung einer feststellbaren Veränderung weiter umsetzt, dadurch gekennzeichnet, daß mandasL-a-^jlycerophosphat in Gegenwart von ff-Glycerophosphat-Oxidase unter Erzeugung einer feststellbaren Veränderung oxidiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das L-c-GIycerophosphat in Gegenwart von a^Glycerophosphat-Oxidase unter Erzeugung von Wasserstoffperoxid oxidiert, das mit einer Substanz mit peroxidativer Aktivität unter Erzeugung einer feststellbaren Veränderung reagiert.

3. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß man L-a-Glycerophosphat-Oxidase von Streptococcus faecalis verwendet.

4. Bestimmungs-Reagenz für die Durchführung des Verfahrens nach Ansprüchen 1 bis 3, enthaltend