DE3348379C2 - - Google Patents

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DE3348379C2
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reaction
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Hidehiko Ishikawa
Hideo Misaki
Naoki Tagata Shizuoka Jp Muto
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Auffinden von L-Glutaminsäure oder L-Glutamat, das als Analysenverfahren zu dienen vermag.
Es wird erfindungsgemäß eine (H₂O₂-bildende) L-Glutaminsäure-Oxidase, die die im Kennzeichen des Anspruchs 1 angegebenen biochemischen Eigenschaften hat, in der im Kennzeichen des Anspruchs 1 angegebenen Verfahrensweise mit der Materialprobe, die auf L-Glutaminsäure oder L-Glutamat untersucht werden soll, zur Reaktion gebracht, und an den Reaktionsprodukten kann die analytische Bestimmung quantitativ vorgenommen werden. Es läßt sich so diese H₂O₂-bildende) L-Glutaminsäure-Oxidase für ein Analysenverfahren einsetzen.
Bisher kannte man als Substrat-Spezifität für L-Glutaminsäure aufweisende Oxidase nur L-(+)-Glutamat-Oxidoreduktase. Dieses Enzym weist eine enzymatische Wirkung auf, durch die eine Reaktion katalysiert wird, bei der zwei Mole α-Ketoglutarsäure, zwei Mole Ammoniak und ein Mol Wasser aus zwei Molen L-Glutaminsäure, einem Mol Sauerstoff und einem Mol Wasser gebildet werden (Biochem. Biophys. Acta, 368, 158-172 (1974)).
Bekannt ist weiterhin für L-Aminosäure substratspezifische L-Aminosäure-Oxidase, die eine enzymatische Wirkung aufweist, durch die eine Reaktion katalysiert wird, bei der ein Mol α-Ketosäure, ein Mol Ammoniak und ein Mol Wasserstoffperoxid aus einem Mol Aminosäure, einem Mol Sauerstoff und einem Mol Wasser gebildet werden (Methods in Enzymology, Vol. II, 204-211 (1955) und andere).
Die zuvor erwähnte bekannte L-(+)-Glutamat-Oxidoreduktase katalysiert die zuvor beschriebene Reaktion, bei der Wasserstoffperoxid nicht entsteht. Zwar entsteht Wasserstoffperoxid bei der vorstehend erwähnten Enzym-Reaktion, die durch die bekannten L-Aminosäure-Oxidasen katalysiert wird; jedoch ist unter den bekannten L-Aminosäure-Oxidasen bisher nicht von einem Enzym berichtet worden, das auf ein L-Glutaminsäure-Substrat zu wirken vermag (Methods in Enzymology, Vol. II, S. 204-211 (1955)).
Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird ein neues Enzym verwendet, das Mikroorganismen der Gattung Streptomyces, Streptomyces sp. NRRL 15267 oder Streptomyces sp. NRRL 15268, produzieren und das substratspezifisch auf L-Glutaminsäure wirkt, für eine neue Bestimmungsmethode für L-Glutaminsäure, die in einer flüssigen Materialprobe enthalten ist.
Das erfindungsgemäß verwendete Enzym gewinnt man aus Streptomyces Art A7700, der aus einer Bodenprobe eines Feldes in Saku-shi, Nagano-ken, Japan, isoliert wurde, und aus Streptomyces Art A8063, der aus einer Bodenprobe eines Süßkartoffel-Feldes in Naganohara-cho, Azuma-gun, Gunma-ken, Japan, gewonnen wurde.
Die taxonomischen Eigenschaften der für die Gewinnung des erfindungsgemäß verwendeten Enzyms eingesetzten Mikroorganismen Streptomyces Art A7700 und A8063 sind in der Parallelanmeldung P 33 07 607.3-41 beschrieben.
Der Mikroorganismus Streptomyces Art A7700 wurde hinterlegt beim Fermentation Institut, Agency of Industrial Science and Technology, M.I.T.I., Japan, unter der ursprünglichen Hinterlegungsnummer FERM P-6241; diese ursprüngliche FERM P-6241 Hinterlegung wurde in FERM-BP-2676 umgewandelt. Der Mikroorganismus Streptomyces Art A8063 wurde hinterlegt beim M.I.T.I. unter der ursprünglichen Hinterlegungsnummer FERM P-6242; diese ursprüngliche FERM P-6242 Hinterlegung wurde in FERM-BP-2677 umgewandelt.
Das beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Enzym, die (H₂O₂-bildende) L-Glutaminsäure-Oxidase, ist ein Enzym, das eine Reaktion katalysiert, bei der ein Mol α-Ketoglutarsäure, ein Mol Ammoniak und ein Mol Wasserstoffperoxid aus einem Mol L-Glutaminsäure, einem Mol Sauerstoff und einem Mol Wasser gebildet werden. Die erfindungsgemäße Verwendung des Enzyms führte zu einer neuen Methode zur Auffindung und/oder quantitativen Erfassung von L-Glutaminsäure in einer L-Glutaminsäure enthaltenden Materialprobe. Zu diesem Zweck wird erfindungsgemäß eine flüssige Materialprobe, die L-Glutaminsäure enthält, bzw. darauf analysiert werden soll, mit der erfindungsgemäßen (H₂O₂-bildenden) L-Glutaminsäure-Oxidase in Kontakt gebracht, und es wird in diesem enzymatischen Reaktionssystem die der Umsetzung des L-Glutamats entsprechende Menge an verbrauchtem Sauerstoff und/oder gebildetem Wasserstoffperoxid, Ammoniak und/oder α-Ketoglutarat quantitativ gemessen.
Das beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendete (H₂O₂-bildende) Enzym L-Glutaminsäure-Oxidase weist zumindest die folgenden biochemischen Eigenschaften auf:
Substrat-Spezifizität: L-Glutaminsäure
Enzymwirkung: Es wird eine Reaktion katalysiert, bei der ein Mol Glutaminsäure, ein Mol Sauerstoff und ein Mol Wasser zu einem Mol α-Ketoglutarsäure, einem Mol Ammoniak und einem Mol Wasserstoffperoxid umgesetzt werden, gemäß der nachstehenden Formel (I)
Bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens als ein Prüfverfahren auf L-Glutaminsäure wird zweckmäßig so gearbeitet, daß man eine L-Glutaminsäure enthaltende bzw. auf L-Glutaminsäure zu prüfende flüssige Materialprobe mit erfindungsgemäßer (H₂O₂-bildender) L-Glutaminsäure-Oxidase, die substratspezifisch auf L-Glutaminsäure wirkt, in Kontakt bringt. Dadurch wird eine Reaktion katalysiert, bei der ein Mol α-Ketoglutarsäure, ein Mol Ammoniak und ein Mol Wasserstoffperoxid aus einem Mol L-Glutaminsäure, einem Mol Sauerstoff und einem Mol Wasser gebildet werden. Man bestimmt dabei quantitativ die verbrauchte Menge an Sauerstoff und/oder die gebildete Menge an α-Ketoglutarsäure, Ammoniak und/oder Wasserstoffperoxid.
Die beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendete H₂O₂-bildende) L-Glutaminsäure-Oxidase (die nachfolgend als L-Glutaminsäure-Oxidase (H₂O₂) bezeichnet wird) läßt sich ausreichend charakterisieren als ein Enzym, das die zuvor beschriebenen Eigenschaften der Substrat-Spezifizität und der enzymatischen Wirkung aufweist, und jegliche Enzyme, die diese gleichen Charakteristiken haben, sind naturgemäß solche erfindungsgemäßen Enzyme, auch wenn sie unterschiedliche isoelektrische Punkte, Km-Werte, pH-Optima, Hitzebeständigkeits- und pH-Stabilitätswerte haben und durch Zusätze inhibiert oder aktiviert werden.
Bei einer mit dieser erfindungsgemäßen Methode zu prüfenden flüssigen Materialprobe kann es sich um eine flüssige Probe handeln, die L-Glutaminsäure enthält. Solche L-Glutaminsäure als Reagens enthaltende Materialproben sind beispielsweise L-Glutaminsäure aufweisende Fermentationsflüssigkeit, L-Glutaminsäure enthaltende Getränke sowie Materialproben für die Prüfung der Enzymaktivität oder die Bestimmung des Substrats in einem enzymatischen Reaktionssystem, in dem L-Glutaminsäure gebildet oder entwickelt wird, oder einem System, in dem L-Glutaminsäure als Substrat verbraucht wird.
Beispiele für solche enzymatischen Reaktionssysteme werden nachfolgend gegeben; darin bedeuten:
α-KG α-Ketoglutarsäure und
L-GA L-Glutaminsäure.
Diese Enzym-Reaktionssysteme sind lediglich Beispiele für die Anwendung und den Einsatz der genannten Enzyme für eine solche Prüfmethode.
Weiterhin kann man damit die Enzym-Aktivität oder die Menge des Substrats prüfen bzw. quantitativ ermitteln in der Weise, daß man die Menge an gebildeter bzw. freigesetzter L-Glutaminsäure bestimmt, beispielsweise für folgende Vorgänge:
Die zuvor veranschaulichten Enzymreaktionssysteme sind nur Beispiele für Systeme, die unter Verwendung des angegebenen Enzyms untersucht werden können. Bei den dabei erfolgenden enzymatischen Reaktionen wird Glutaminsäure als Substrat verbraucht, und dieser Verbrauch kann zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität quantitativ ermittelt werden.
Für diese Analysenmethode bringt man die L-Glutaminsäure-Oxidase (H₂O₂) mit der L-Glutaminsäure enthaltenden flüssigen Materialprobe zur Reaktion. Man kann dabei die L-Glutaminsäure-Oxidase (H₂O₂) in verschiedenen Formen einsetzen, beispielsweise als Enzymlösung, gelöst in einer Pufferlösung, deren pH-Wert der pH-Stabilität des Enzyms entspricht, mikroverkapselt in einer solchen Weise, daß das Enzym vor Denaturierung geschützt ist, oder in immobilisierter Form, beispielsweise kovalent an Harz, Polysaccharid oder anorganischem Glas gebunden.
Die Menge an L-Glutaminsäure-Oxidase (H₂O₂) kann je nach der Menge an flüssiger Materialprobe und Reaktionszeit unterschiedlich gewählt werden; sie liegt vorzugsweise bei 2-10 Einheiten. Es ist wünschenswert, das Enzym mit möglichst hoher spezifischer Aktivität zu verwenden, jedoch ist es nicht in jedem Fall erforderlich, das Enzym in höchster Reinheit einzusetzen.
Mengenmäßig ist für die L-Glutaminsäure enthaltende flüssige Materialprobe keine Grenze gesetzt; die Probe wird in zweckmäßiger Weise hergestellt, verdünnt oder unverdünnt verwendet.
Bei diesem Analysenverfahren unterwirft man die L-Glutaminsäure-Oxidase (H₂O₂) der Reaktion mit der flüssigen Materialprobe. Dazu bebrütet man das Reaktionsgemisch bei konstanter Temperatur während einer bestimmten Zeit, beispielsweise 5 bis 20 Minuten lang bei 37°C, so daß je Mol L-Glutaminsäure ein Mol Sauerstoff verbraucht und ein Mol α-Ketoglutarsäure, ein Mol Ammoniak und ein Mol Wasserstoffperoxid gebildet werden.
Dieser Sauerstoff sowie die α-Ketoglutarsäure, das Ammoniak bzw. das Wasserstoffperoxid lassen sich quantitativ bestimmen. Den Sauerstoff bestimmt man vorteilhafterweise elektrisch mittels einer Sauerstoff-Elektrode. Die α-Ketoglutarsäure wird zweckmäßig colorimetrisch mittels der Hydrazin-Methode mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin (Absorption bei 415 nm oder 530 nm) bestimmt. Der Ammoniak läßt sich elektrisch an einer Ammoniak-Elektrode oder an einer Ionen-Elektrode, nachdem das Ammoniak-Ion gebildet wurde, oder mittels der Indophenol-Methode bestimmen. Wasserstoffperoxid läßt sich messen an einer Wasserstoffperoxid-Elektrode oder mit Hilfe eines Indikators, der mit Wasserstoffperoxid reagiert, wobei eine bestimmbare Verbindung gebildet wird. Beispiele für einen solchen Indikator sind ein Farbindikator, der sich sichtbar ändert, ein Fluoreszenz-Indikator, der unter ultravioletter Bestrahlung Leuchterscheinungen abgibt, oder eine Lumineszenz-Verbindung. Beispiele für einen Farbindikator sind Zusammensetzungen, in denen eine Peroxidase-aktive Substanz und ein Pigment-Precursor enthalten sind. Dafür wird vorzugsweise mit Meerrettich-Peroxidase und die Kombination von Elektron-Akzeptor, Phenol-Derivat und Anilin-Derivat eingesetzt. Beispiele für Elektron-Akzeptoren sind 4-Aminoantipyrin, 4-Amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-triazol, 2-Hydrazinobenzothiazol, 3-Methyl-2-benzothiazolonhydrazon und 2-Aminobenzothiazol. Beispiele für Phenol-Derivate oder Anilin-Derivate sind Phenol, Natrium-p-hydroxybenzoesäure, p-Chlorphenol, 2,4-Dichlorphenol, 4,6-Dichlor-o-cresol, 2,4-Dibromphenol, N,N-Dimethylanilin, N,N-Diethylanilin, N,N-Dimethyl-m-toluidin, N,N-Diethyl-m-toluidin, N,N-Dimethyl- m-methoxytoluidin, N,N-Diethanol-m-toluidin, 3-Methyl-N-ethyl- N-hydroxyethylanilin, N-Ethyl-N-(3-methylphenyl)-N-acetyl­ ethylendiamin, Natrium-N-ethyl-N-hydroxyethyl-m-toluidin, N-Ethyl-N-sulfopropyl-m-toluidin, Natrium-N-ethyl-N-(2-hy­ droxy-3-sulfopropyl)-m-toluidin oder m-Acetamino-N,N-di­ ethylanilin. Farbstoff-Komplexverbindungen von 4-Amino­ antipyrin und einem Phenol-Derivat geben Meßwerte bei 500-520 nm, und Komplexverbindungen von 4-Aminoantipyrin und einem Anilin-Derivat geben Maßwerte bei 535-580 nm.
Beispiele für in der Fluorometrie und der Luminometrie verwendbare Fluoreszenz-Substrate sind Bis(2,4,6-Trichlor­ phenol)oxalat, Phenylthiohydantoin, Homovanillinsäure, 4-Hydroxyphenylessigsäure, Vanillylamin, 3-Methoxythiramin, Phloretin, Hordenin, Luminolmonoanion, Lucigenin oder Waffin. Diese Substanzen können besonders zweckmäßig zusammen mit einem Elektronen-Akzeptor und einer Peroxidase-aktiven Substanz zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid verwendet werden. Für ein Indikator-Reagens, bei dem die zu ermittelnde Substanz durch Reaktion mit Wasserstoffperoxid umgewandelt wird, verwendet man die Peroxidase in einer Menge von beispielsweise mehr als 0,1 Einheiten je Test, zweckmäßig mit 1 bis 10 Einheiten.
Da der Elektronen-Akzeptor, beispielsweise das 4-Aminoantipyrin oder die Phenol-Derivate oder die Anilin-Derivate reagieren und je zwei Mol Wasserstoffperoxid ein Mol dieser dieser Substanzen verbraucht wird, sollte man sie im Überschuß gegenüber der zu entwickelnden Wasserstoffperoxidmenge einsetzen, wobei vorteilhaft ein fünfmolarer Überschuß, bezogen auf die Menge an Wasserstoffperoxid, verwendet wird.
Diese Reagentien werden zweckmäßig miteinander vermischt und zu einer Lösung verarbeitet, oder man mischt sie in eine Lösung von L-Glutaminsäure-Oxidase (H₂O₂) ein, oder man fertigt daraus ein festphasiges Mischprodukt, zum Beispiel als Schicht auf einer Folie aus synthetischem Harz oder auf Filterpapier. Man kann weiterhin für die elektrische Bestimmung vorteilhaft eine Enzym-Elektrode einsetzen, die an der immobilisierten L-Glutaminsäure-Oxidase (H₂O₂) befestigt ist.
Die Menge an L-Glutaminsäure in einer Materialprobe kann an Hand einer Eichkurve für die in dieser Weise quantitativ ermittelte Menge an Sauerstoff, α-Ketoglutarsäure, Ammoniak bzw. Wasserstoffperoxid zahlenmäßig festgestellt werden.
Mit den folgenden Beispielen, die jedoch nicht die vorliegende Erfindung begrenzend auszulegen sind, wird diese noch näher erläutert.
Beispiel 1
(Quantitative Bestimmung von L-Glutaminsäure):
40 mM Phosphatpuffer (pH 6,5)
0,03% 4-Aminioantipyrin
0,04% N,N-Dimethyl-m-toluidin
2 µ/ml Peroxidase
2 µ/ml L-Glutaminsäure-Oxidase (H₂O₂)
Dieses zuvor angegebene Reaktionsgemisch (3,0 ml) wurde vermischt mit zu 1/1, bzw. 3/4, bzw. 1/2, bzw. 1/4, bzw. 1/5, bzw. 1/10 verdünnter 10 mM L-Glutaminsäure-Lösung (50 µl), und dann wurde 10 Minuten lang bei 37°C bebrütet. Nach dem Bebrüten wurde das Reaktionsgemisch bei 545 nm colorimetrisch geprüft.
Die Ergebnisse sind in Fig. 1 veranschaulicht. Darin ist auf der Abszisse die Verdünnung und auf der Ordinate die optische Dichte bei 545 nm abgetragen. Die Markierungen o beziehen sich auf eine L-Glutaminsäure-Oxidase (H₂O₂), Herstellung A und die Markierungen Δ geben die gefundenen Werte für eine L-Glutaminsäure-Oxidase (H₂O₂), Herstellung B. Wie ersichtlich, sind die Ergebnisse für beide Enzyme die gleichen, und es wurde eine gute Linearität zwischen der Menge an L-Glutaminsäure und dem Ausmaß der Absorption erzielt.
Beispiel 2
(Prüfung auf Serum GPT)
N,N-Diethyl-m-toluidin|3 mM
4-Aminoantipyrin 1,5 mM
Peroxidase 5 Einheiten/ml
L-Alanin 200 mM
α-Ketoglutarsäure 10 mM
Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) 50 mM
L-Glutaminsäure-Oxidase (H₂O₂) (Herstellung A) 6 Einheiten/ml
Das zuvor beschriebene Raktionsgemisch (1,0 ml) wurde in schmale Teströhrchen eingefüllt und bei 37°C vorbebrütet. Serum (50 µl, in einer Verdünnung von 1/1 bzw. 3/4 bzw. 1/2 bzw. 1/4 bzw. 1/10) wurde zugegeben, und es wurde genau 20 Minuten lang bei 37°C bebrütet. 0,1 M McIlvain-Puffer (pH 5,5, 2,0 ml) wurde dazu gegeben, und es wurde colorimetrisch gemessen und die Werte bei 545 nm aufgezeichnet. Als Kontrollprobe wurde ein Gemisch untersucht, das aus den oben aufgeführten Reaktionsbestandteilen mit Ausnahme von L-Alanin bestand. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 veranschaulicht. Es ist auf der Abszisse die Verdünnung und auf der Ordinate die optische Dichte bei 545 nm abgetragen. In dieser grafischen Darstellung läßt sich Serum GPT exakt prüfen.
Beispiel 3
(Prüfung auf Serum GOT)
N,N-Diethyl-m-toluidin|3 mM
4-Aminoantipyrin 1,5 mM
Peroxidase 5 µ/ml
L-Asparaginsäure 200 mM
α-Ketoglutarsäure 10 mM
Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) 50 mM
L-Glutaminsäure-Oxidase (H₂O₂) 6 µ/ml
Das aus den zuvor aufgeführten Bestandteilen zusammengesetzte Reaktionsgemisch (1,0 ml) wurde in schmale Teströhrchen eingefüllt und bei 37°C vorbebrütet. Dazu wurde Serum (in Verdünnungen von 1/1 bzw. 3/4 bzw. 1/2 bzw. 1/4 bzw. 1/10) (50 µl) gegeben, und es wurde genau 20 Minuten lang bei 37°C bebrütet. Dann wurde 0,1 M McIlvain-Puffer (pH 5,5, 2,0 ml) hinzugefügt und es wurden colorimetrisch die Werte bei 545 nm gemessen. Als Kontrollprobe wurde ein wie oben beschrieben, jedoch ohne L-Asparaginsäure zusammengesetztes Reaktionsgemisch verwendet.
Die Ergebnisse sind in Fig. 3 veranschaulicht. Darin ist auf der Abszisse die Verdünnung und auf der Ordinate die optische Dichte bei 545 nm abgetragen. Diese grafische Darstellung ermöglicht es, Serum GOT exakt zu untersuchen.
Beispiel 4
(Serum GPT-Prüfung)
(Reagens I)
N-Ethyl-N-sulfopropyl-m-toluidin) 3 mM
Peroxidase 5 µ/ml
L-Alanin 200 mM
α-Ketoglutarsäure 10 mM
Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) 50 mM
L-Glutaminsäure-Oxidase (H₂O₂) 5 µ/ml
Ascorbinsäure-Oxidase 5 µ/ml
(Reagens II) @ 4-Aminoantipyrin 15 mM
Reagens I (1 ml) wurde in eine Quarzzelle eingefüllt. Dazu wurde Serum (50 µl) gegeben, und es wurde 5 Minuten lang bei 37°C bebrütet. Dann wurde Reagens II (0,1 ml), das bei 37°C vorbebrütet worden war, hinzugefügt, und es wurde über verschiedene Zeiten bei 37°C bebrütet und anschließend colorimetrisch bei 545 nm der jeweilige Meßwert ermittelt.
Die Ergebnisse sind in Fig. 4 veranschaulicht. Darin ist auf der Abszisse die Reaktionszeit und auf der Ordinate die optische Dichte bei 545 nm abgetragen. Man erkennt, daß keine Zeitverzögerung bei dem Serum GPT-Versuch gefunden wurde, und daß eine gut lineare Eichkurve, die durch den Nullpunkt geht, erhalten wurde.
Bei dieser Prüfungsmethode sind bei der ersten Reaktionsstufe die nichtspezifische Reaktion und die Verzögerungszeit getilgt, und demzufolge ist keine Kontrollprüfung erforderlich.
Beispiel 5
(Serum GOT-Prüfung)
(Reagens I)
N-Ethyl-N-sulfopropyl-m-toluidin) 3 mM
Peroxidase 5 µ/ml
L-Asparaginsäure 200 mM
α-Ketoglutarsäure 10 mM
Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) 50 mM
L-Glutaminsäure-Oxidase (H₂O₂) 5 µ/ml
Ascorbinsäure-Oxidase 5 µ/ml
(Reagens II) @ 4-Aminoantipyrin 15 mM
Reagens I (1,0 ml) wurde in eine Quarzzelle eingefüllt und dazu wurde das Serum (50 µl) gegeben, und dann wurde 5 Minuten lang bei 37°C bebrütet. Zu dem Reaktionsgemisch wurde das Reagens II (0,1 ml), das bei 37°C vorbebrütet worden war, hinzugefügt, und es wurde über unterschiedliche Zeiten bei 37°C bebrütet und dann colorimetrisch bei 545 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 veranschaulicht. Es ist darin auf der Abszisse die Reaktionszeit und auf der Ordinate die optische Dichte bei 545 nm abgetragen. Wie man erkannt, liegen die Prüfwerte für GOP auf einer gut linearen Eichkuve, die durch den Nullpunkt geht.
Beispiel 6
Es wurden die in Beispiel 4 beschriebenen Reagentien I und II verwendet, und es wurde wie dort beschrieben gearbeitet, jedoch wurden als Serumproben 40 Serum-Portionen (je 50 µl) zur Prüfung auf Serum GPT-Aktivität verwendet.
Weiterhin wurden die gleichen Serum-Portionen mittels der bisher bekannten Methode (UV-Methode, Wako Pure Chem- Co., Prüfungs-Set GPT-UV WAKO) geprüft.
Die aus den Ergebnissen berechnete Korrelation bei der Methode war die folgende:
γ = 0,998
y = 1,03x + 1,6,
es wurde also eine gute Korrelation erhalten. Eine Korrelationskurve ist in Fig. 6 veranschaulicht. Auf der Abszisse sind die Werte nach der UV-Methode in IU/1 und auf der Ordinate die nach der erfindungsgemäßen Methode gewonnenen Werte in IU/1 abgetragen.
Beispiel 7
Die Serum GOT-Aktivität wurde wie in Beispiel 5 beschrieben geprüft, jedoch wurden 40 Serum-Portionen (je 50 µl) als Proben verwendet.
Die gleichen Serum-Probeportionen wurden mittels bekannter GOT-Prüfmethode (UV-Methode, Wako Pure Chem. Co., Set GOT-UV WAKO) untersucht.
Die Korrelation beider Resultate betägt:
γ = 0,997
y = 1,01x + 1,1,
wodurch die Korrelationskurve erhalten wurde, wie sie in Fig. 7 veranschaulicht ist. Darin sind auf der Abszisse die Werte nach der UV-Methode in IU/1 und auf der Ordinate die Werte nach der erfindungsgemäßen Methode in IU/1 abgetragen.
Die L-Glutaminsäure-Oxidase (H₂O₂), Herstellung A, die in den Beispielen 1 und 2 verwendet wurde, war gemäß dem Beispiel 3 in der Parallel-Anmeldung P 33 07 607.3-41) gewonnen worden; und die L-Glutaminsäure-Oxidase (H₂O₂), Herstellung B, die in dem Beispiel 1 verwendet wurde, war gemäß dem Beispiel 4 in der Parallel-Anmeldung P 33 07 607.3-41 gewonnen worden.

Claims (10)

1. Verfahren zum Auffinden von L-Glutaminsäure oder L-Glutamat, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem wäßrigen Medium die L-Glutaminsäure-Oxidase, die die folgenden biochemischen Eigenschaften hat:
(i) Substrat-Spezifizität: L-Glutaminsäure
(ii) Enzymwirkung: Es wird eine Reaktion katalysiert, bei der ein Mol Glutaminsäure, ein Mol Sauerstoff und ein Mol Wasser zu einem Mol α-Ketoglutarsäure, einem Mol Ammoniak und einem Mol Wasserstoffperoxid umgesetzt werden, gemäß der nachstehender Formel mit der zu analysierenden Materialprobe in Kontakt bringt und den bei der dadurch katalysierten Reaktion verbrauchten Sauerstoff und/oder die dabei gebildete α-Ketoglutarsäure und/oder Ammoniak und/oder Wasserstoffperoxid quantitativ bestimmt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die quantitative Bestimmung von Wasserstoffperoxid mittels eines indikators vornimmt, der bei Reaktion mit Wasserstoffperoxid eine meßbare Veränderung zeigt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Indikator ein Farbreagenz, ein Fluoreszenzreagenz oder ein Lumineszenzreagenz verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als (H₂O₂-bildende) L-Glutaminsäure-Oxidase ein aus Streptomyces sp. FERM BP-2676 oder Streptomyces sp. FERM BP-2677 gewonnenes Enzym verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als zu analysierende Materialprobe eine Flüssigkeit verwendet, die mit dem Enzym ein Reaktionssystem für das Freisetzen von L-Glutaminsäure bildet.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Flüssigkeit ein Reaktionssystem einsetzt, das zur Prüfung auf Glutamat-Pyruvat-Transaminase-Aktivität geeignet ist.
7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Flüssigkeit ein Reaktionssystem einsetzt, das zur Prüfung auf Glutamat-Oxalacetat-Transaminase-Aktivität geeignet ist.
8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Flüssigkeit ein Reaktionssystem einsetzt, das zur Prüfung auf Peptidase-Aktivität geeignet ist.
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