DE3852889T2 - Test von salicylaten oder reduzierten pyridin-nukleotiden. - Google Patents
Test von salicylaten oder reduzierten pyridin-nukleotiden.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Salicylaten und reduzierten Pyridinnucleotiden und einen entsprechend angepaßten Diagnostik-Kit zur Erleichterung der Routinedurchführung dieses Verfahrens.
- Es ist erforderlich, die Menge an Salicylat-Verbindungen, insbesondere der Arzneimittel o-Acetylsalicylsäure (Aspirin) und Salicylsäure (die üblicherweise in Form ihres Natriumsalzes verwendet wird), in einer biologischen Flüssigkeit zu bestimmen. In diesen Fällen, und zwar insbesondere, wenn ein Patient an einer Arzneimittel-Überdosis leidet, ist es wichtig, daß die Arzneimittelmenge im Körper rasch abgeschätzt werden kann, so daß ein Antidot verabreicht oder eine andere Behandlung angewendet werden kann, wenn dies erforderlich ist.
- Zur Bestimmung von Salicylat in einer Probe oder in einer Lösung sind eine Anzahl von Verfahren bekannt. Beispielsweise kann das Salicylation mit dem Folin-Ciocalteau-Reagens in einer stark alkalischen Lösung unter Bildung einer blauen Farbe umgesetzt werden, die dann kolorimetrisch analysiert wird (Smith & Talbot 1950, Brit. J. Exp. Path. 31, 65). Dieses Verfahren liefert jedoch hohe und variable Leerwerte in Proben, in denen keine Salicylate vorhanden sind.
- Alternativ kann das Salicylation mit Eisen(III)-Salzen in saurer Lösung umgesetzt und die gebildete purpurne Farbe mit einer kolorimetrischen Einrichtung analysiert werden (Trinder 1954, Biochem. J. 57, 301). Dieses Verfahren hat ebenfalls Nachteile und unterliegt unspezifischen Störeinwirkungen.
- Bei einem anderen Verfahren zur Salicylat-Bestimmung wird das Salicylat zuerst enzymatisch unter Bildung von Brenzcatechin umgewandelt. Die letztere Verbindung wird dann mit Hydrazon und molekularem Sauerstoff in Gegenwart eines zweiten Enzyms, nämlich Tyrosinase, unter Bildung eines Azinfarbstoffs umgesetzt. (Roder et al. 1980, EP 0 054 146). Es ist bekannt, daß das Enzym Tyrosinase andere Monophenole als Brenzcatechin oxidiert, und das Hydrazon kann oxidativ mit allen sich ergebenden Chinonen unter Bildung eines gefärbten Produkts kuppeln. Außerdem kann die Anwesenheit von anderen Monophenolen und insbesondere von Tyrosin in unbekannten Mengen zur Konkurrenz um Bindungsstellen am Tyrosinase-Enzym führen, was die Leistungsfähigkeit des Systems verringert.
- Bei einem weiteren Verfahren zur Salicylat-Bestimmung, nämlich wie in der europäischen Patentanmeldung 84 306 810.7, offengelegt als EP 0 138 530 A, offenbart, wird das Salicylat zuerst enzymatisch in das Brenzcatechin umgewandelt. Das Brenzcatechin wird dann mit Aminophenol unter alkalischen Bedingungen unter Bildung eines Indophenols umgesetzt, das mit kolorimetrischen Techniken quantitativ bestimmt werden kann. Das Aminophenol ist jedoch unter alkalischen Bedingungen unstabil und daher ist es notwendig, es vor der Umsetzung mit dem Brenzcatechin unter sauren Bedingungen auf zubewahren. Außerdem können, nämlich wenn die Umsetzung des Aminophenols mit dem Brenzcatechin nicht rasch ist, die alkalischen Bedingungen, unter denen die Umsetzung des Aminophenols mit dem Brenzcatechin stattfindet, zur Zersetzung des Aminophenols oder zu Nebenreaktionen des Aminophenols führen, was ungenaue Ergebnisse zur Folge haben kann.
- Ein mit dieser Technik verbundenes weiteres Problem besteht darin, daß es nicht praktisch ist, sie in Form eines leistungsfähigen Reagens-Kits bereitzustellen, in dem alle Komponenten zusammen vorliegen, weil das Aminophenol vor dem Assay unter sauren Bedingungen gehalten werden müßte und das Indophenol-Produkt zu seiner Bildung neutrale oder vorzugsweise alkalische Bedingungen benötigt.
- Idealerweise sind die Bestandteile eines Salicylat-Bestimmungssystems in Wasser löslich, besitzen bei der Umsetzung eine sehr schnelle Farbentwicklung und ergeben eine gute Farbausbeute und eine hohe Stabilität der Endfarbe.
- Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Bestimmung von Salicylat, mit dem die obigen Nachteile überwunden oder zumindest abgeschwächt werden, das aber trotzdem eine so ausreichend rasche Bestimmung der Salicylat-Menge ergibt, daß das Verfahren zur Bestimmung von Arzneimittelmengen in den biologischen Flüssigkeiten von Patienten mit vermuteter Überdosis verwendet werden kann.
- Nach dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Bestimmung von Salicylat in einer Probe bereitgestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das Salicylat enzymatisch durch Einwirkung eines Salicylatmonooxygenase-Enzyms auf das Salicylat in Gegenwart eines reduzierten Pyridinnucleotids (insbesondere NADH oder NADPH) in ein Brenzcatechin umgewandelt wird, das Brenzcatechin mit einer Verbindung umgesetzt wird, die unter Verbindungen der Formel I oder Amin- oder Phenolverbindungen der Formeln II, III und IV ausgewählt ist: Formel
- wobei R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; unabhängig H, -NH&sub2; oder C&sub1;-C&sub6;-Alkyl bedeuten, R&sub4; bis R&sub1;&sub0; unabhängig unter H, Alkyl, -NH&sub2;, -NR&sub1;&sub1;R&sub1;&sub2;, -OH, -CH&sub2;OH, -CHO, -COOH, CO(CH&sub2;)nH, -CONH(CH&sub2;)nCOOH oder -NH&sub2;·HOOCCOOH·H&sub2;NC&sub6;H&sub5; ausgewählt sind, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis einschließlich 5 bedeutet, und R&sub1;&sub1;, R&sub1;&sub2; unabhängig C&sub1;-C&sub5;-Alkyl darstellen, mit der Maßgabe, daß, wenn in Formel II eine der Gruppen R&sub4; bis R&sub9; -NH&sub2; oder NR&sub1;&sub1;R&sub1;&sub2; bedeutet, dann mindestens eine der anderen Gruppen R&sub4; bis R&sub9; unter C&sub1;-C&sub6;-Alkyl, -NH&sub2;, -NR&sub1;&sub1;R&sub1;&sub2;, -CHO, -COOH, -CO(CH&sub2;)nH, CONH(CH&sub2;)nCOOH oder -NH&sub2;·HOOCCOOH·H&sub2;NC&sub6;H&sub5; ausgewählt ist, wobei Formel II Verbindungen, die unter die Bedeutung des Begriffs "Aminophenole" fallen, nicht umfaßt, unter Bildung eines Farbstoffs, dessen Menge kolorimetrisch bestimmt werden kann.
- Die Menge des Farbstoffs wird dann mit der Menge des Salicylats in der Probe in Beziehung gesetzt. Vorzugsweise wird der Farbstoff spektrophotometrisch bestimmt.
- In Formel I bedeuten R&sub1; vorzugsweise Methyl, R&sub2; H oder Methyl und R&sub3; -NH&sub2;. In Formel II bedeuten, vorzugsweise, wenn R&sub4; -COOH bedeutet, R&sub5; -NH&sub2; und R&sub6; bis R&sub9; H; vorzugsweise, wenn R&sub4; CONH(CH&sub2;)nCOOH bedeutet, bedeuten n 1, R&sub7; NH&sub2; und R&sub5;, R&sub6;, R&sub8; und R&sub9; H; vorzugsweise, wenn R&sub4; -CO(CH&sub2;)nH bedeutet, bedeuten n 1, R&sub7; NH&sub2; und R&sub5;, R&sub6;&sub1; R&sub8; und R&sub9; H. In Formel III bedeutet R&sub7; vorzugsweise NH&sub2;, und R&sub4; bis R&sub6; und R&sub8; bis R&sub1;&sub0; bedeuten vorzugsweise H. In Formel IV bedeuten R&sub1; und R&sub2; vorzugsweise Methyl und R&sub3; -NH&sub2;.
- Das Wort Farbstoff bezieht sich hier auf eine Verbindung, die elektromagnetische Strahlung in einem oder mehreren Spektralbereichen, nämlich Ultraviolett (UV), Sichtbar oder Infrarot (IR), absorbiert.
- Die Farbreaktion tritt auf, wenn eine Anzahl von unter Verbindungen der Formeln I bis IV ausgewählter Verbindungen verwendet wird. Vorzugsweise werden Konzentrationen von 0,5 - 50 mmol/l verwendet, noch bevorzugter aber Konzentrationen von 1,3 - 2,9 mmol/l.
- Die Erfindung beruht auf den folgenden Reaktionen (unter Verwendung von (NADPH) oder NADH, um ein Beispiel für das reduzierte Pyridinnucleotid zu geben).
- (i) Salicylat + (NADPH) + O&sub2; (oder NADH)
- Salicylatmonooxygenase/EC: 1.14.13.1 > Brenzcatechin + CO&sub2; + H&sub2; = + (NADP) . . . (A) (oder NAD)
- (ii) Brenzcatechin + Verbindung (I), (II), (III) oder (IV) → Farbstoff . . . (B)
- In der obigen Reaktion A wird das reduzierte Pyridinnucleotid, das entweder reduziertes Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NADH) oder reduziertes Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat (NADPH) darstellt, in seine entsprechende oxidierte Form umgewandelt, nämlich in Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD) oder Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat (NADP).
- Bei diesem Verfahren zum Salicylat-Nachweis wird vorzugsweise eine NADH- oder NADPH-Konzentration im Überschuß gegenüber der Konzentration des höchsten Salicylat-Standards, für die der Assay linear ist, verwendet. Dieser Überschuß bedeutet, daß dieses Verfahren auch zur Bestimmung von NADH oder NADPH verwendet werden kann, und zwar durch den Einsatz von Salicylat im Überschuß bei der Enzymreaktion. Dieses Verfahren kann daher angewandt werden, um das NADH oder NADPH nachzuweisen, das durch die Einwirkung von Dehydrogenase-Enzymen auf Substrate wie Glucose oder Lactate gebildet wird.
- Zweckmäßigerweise können die beiden Reaktionen A und B des Salicylat-Assay-Verfahrens einerseits simultan als Einschritt-Reaktion, bei der alle Reagentien zusammen vorhanden sind, durchgeführt werden. Alternativ dazu können sie auch nacheinander in Form von zwei Schritten durchgeführt werden, nämlich eines Schrittes A, in dem die Bildung des Brenzcatechins stattfindet, und eines Schrittes B, in dem die Farbentwicklung des Brenzcatechins aus Reaktion A mit einer der spezifizierten Amin- oder Phenolverbindungen stattfindet. Das Verfahren kann entweder manuell oder als Teil eines automatisierten Systems durchgeführt werden.
- Die Umwandlung des Salicylats in das Brenzcatechin wird durch jedes Salicylatmonooxygenase-Enzym katalysiert, das von der International Union of Biochemistry (Enzyme Nomenclature 1978, Academic Press, New York 1979) als E.C.1.14.13.1 definiert und mit Salicylatmonooxygenase (decarboxylierend und hydroxylierend) bezeichnet wird. In der katalysierten Reaktion sind das Enzym und das reduzierte Pyridinnucleotid im Überschuß vorhanden.
- Das Enzym Salicylatmonooxygenase besitzt NADH-Oxidase- Aktivität, welche die Oxidation von NADH zu NAD+ bewirkt. Daher kann es erforderlich sein, ein NADH-Regenerationssystem vorzusehen, um das Enzym mit NADH in einem wäßrigen Reagens aufbewahren zu können. Beispiel:
- Die Lagerstabilität von NADH kann durch Zusatz von Chloriden wie Natriumchlorid in einer Konzentration von 10 - 5000 mmol/l und vorzugsweise etwa 100 mmol/l weiter verbessert werden. Weitere geeignete Zusätze zur Wiederherstellung von NADH aus NAD+, um die Oxidation von NADH zu verhindern, sind dem Fachmann geläufig.
- Wenn das Assay-Reaktionsgemisch hohe Konzentrationen an Metallionen enthält, dann sollte auch ein Metallchelatbildner, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,1 bis 1,0 mmol, zum Schutz der Enzymaktivität hinzugegeben werden.
- Die Enzymreaktion wird jedoch durch die Gegenwart bestimmter Metallionen katalysiert und beschleunigt. Die bevorzugten Metalle zur Katalysierung der Enzymreaktion sind Mangan und Cobalt.
- Metall- und Ammoniumionen können auch verwendet werden, um die Farbreaktion (B) des Brenzcatechins mit der Verbindung der Formel I oder der Amin- oder Phenolverbindung der Formel II, III oder IV zur Bildung des Farbstoffs zu katalysieren. Metallionen, die zur Katalysierung der Farbentwicklung verwendet werden können, sind beispielsweise Mangan, Cobalt, Kupfer, Calcium und Magnesium. Andere geeignete Metallionen sind dem Fachmann geläufig. Die Konzentrationen dieser Farbentwicklungsionen liegen gewöhnlich im Bereich 0,01 - 50 mmol/l und vorzugsweise 0,1 - 0,25 mmol/l. Diese Ionenkonzentrationen variieren jedoch mit dem jeweiligen individuellen Assay.
- Vorzugsweise werden die Metallionen in Form einer Verbindung bereitgestellt, die in einem Assay-Gemisch und mit den zu untersuchenden Proben leicht löslich ist. Die Metallionen können beispielsweise von Acetaten wie Cobaltacetat oder alternativ von anderen geeigneten Verbindungen stammen, die dem Fachmann bekannt sind, mit der Maßgabe, daß alle Gegenionen zu den Metallionen die Enzymreaktion oder irgendeinen anderen Teil der Assay-Technik nicht stören.
- Wenn das Salicylat in Form eines acetylierten Derivats vorliegt, sollte es zuerst durch Hydrolyse des acetylierten Derivats in seine nichtacetylierte Form umgewandelt werden, beispielsweise durch eine Reaktion, die durch jedes Enzym des Typs katalysiert wird, der von der International Union of Biochemistry (Literaturstelle wie oben) mit EC:3.1.1.2.
- definiert und mit Arylesterhydrolase bezeichnet wird. Die Umwandlung des Brenzcatechins zum Farbstoff (B) wird durchgeführt, indem das Brenzcatechin mit einer oben spezifizierten Verbindung umgesetzt wird. Bevorzugte Verbindungen in abnehmender Bevorzugungsreihenfolge sind 4-Aminophenazon (I), 2-Aminobenzoesäure (II), 4-Hippursäure (II), 4-Aminoacetophenon (II) und 6-Aminobenzothiazol (III).
- Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Umsetzung des Brenzcatechins mit 4-Aminophenazon schnell, hochspezifisch und erzeugt einen verhältnismäßig farbstabilen Farbstoff. Vorzugsweise wird die Umwandlung des Brenzcatechins zum Farbstoff in einer im wesentlichen wäßrigen Lösung bei einem neutralen oder vorzugsweise einem alkalischen pH-Wert durchgeführt. Noch bevorzugter wird die Farbreaktion im pH-Bereich von 8,0 bis 14 durchgeführt, wobei ein oder mehrere Puffer in Konzentrationen zwischen 0,025 - 1,0 mol/l und vorzugsweise von 100 mmol/l verwendet werden können.
- Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Umwandlung bei einem pH-Wert von 10 durchgeführt. Bei den verwendbaren Puffertypen handelt es sich beispielsweise um Carbonat-Hydrogencarbonat, Borat, Glycin, Diethanolamin, Glycylglycin, Natriumphosphat, Kaliumphosphat, Tris/HCl, 2-N-Cyclohexylaminethansulfonsäure (CHES), 2-Amino-2-methyl-1-propanol (AMP), 2-Amino-2- methyl-1, 3-propandiol (AMPD), N-Tris(hydroxymethyl)methyl- 3-aminopropansulfonsäure (TAPS), 3-Cyclohexylamino-1-propansulfonsäure (CAPS), N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsäure (HEPES) und N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-3-propansulfonsäure (EPPS).
- Der breite pH-Bereich des Salicylatmonooxygenase-Enzyms (6,0 - 10,5) ermöglicht, daß die Enzymreaktion unter verschiedenen pH-Bedingungen, vorzugsweise alkalisch, stattfinden kann und daher sowohl die enzymatische Reaktion (A) als auch die Farbreaktion (B) in der gleichen Lösung in einem Einschritt-Verfahren stattfinden können, z. B. beim bevorzugten pH-Wert von 10.
- Alternativ kann in einem Zweischritt-Verfahren die Enzymreaktion in einer Lösung mit geeignetem pH-Wert durchgeführt werden, die auch die Verbindung der Formel I oder die Amin- oder Phenolverbindung der Formel II, III oder IV enthalten kann, und der pH-Wert kann dann für die Farbreaktion (B) eingestellt werden, z. B., indem die Lösung mit Natriumcarbonatlösung oder einem geeigneten alternativen Alkali wie Natriumhydroxid mit Konzentrationen von 25 - 500 mmol/l, vorzugsweise 120 - 250 mmol/l, gemischt wird.
- Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Bildung des Farbstoffs in Gegenwart des Puffers CHES und am bevorzugtesten bei einem Puffer-pH von 10 durchgeführt. Diese Ausführungsform wird besonders zur Verwendung in einem Einschritt-Salicylat-Bestimmungsverfahren bevorzugt, bei dem Aminophenazon und insbesondere 4-Aminophenazon zur Farbentwicklung mit dem Brenzcatechin verwendet wird.
- Bei einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Farbbildung bewirkt, indem Natriumcarbonat-Puffer mit einem EPPS-enthaltenden Enzymreagens, das zur Umwandlung des Salicylats zum Brenzcatechin verwendet wurde, bei einem bevorzugten pH-Wert von 8,6 gemischt wird.
- Die Reagentien, insbesonders das Enzym, für einen Einschritt-Salicylat-Bestimmungs-Assay werden vorzugsweise in lyophilisierter Form bereitgestellt, um zu verhindern, daß die Reagentien vor der Zugabe einer Probe zum Salicylat- Assay mit sich selbst reagieren.
- Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung werden die Reagentien in Form aufeinanderfolgender gefrorener Schichten auf einem festen Substrat, bei dem es sich zweckmäßigerweise um die Wandung eines Behälters wie eines Vorratsfläschchens handeln kann, abgeschieden; dann werden die Reagentien lyophilisiert.
- Wenn die Farbstoffbildung unter geeigneten Bedingungen zur Erzielung einer maximalen Farbbildungsgeschwindigkeit durchgeführt wird, kann sie mit Serumproben innerhalb von 6 min abgeschlossen werden.
- Einmal gebildet, ist der Farbstoff im allgemeinen mindestens 1 h stabil. In bestimmten Fällen, insbesondere bei Zweischritt-Verfahren, kann es jedoch vorzuziehen sein, grenzflächenaktive Mittel zur Verbesserung der Stabilität des Reaktionsproduktes hinzuzugeben. Geeignete grenzflächenaktive Mittel sind verschiedene Salze von C&sub1;&sub4;-C&sub1;&sub6;-α- Olefinsulfonaten wie Witconate AOS Li8, Witconate SES und Witconate 60L. Dem Fachmann sind andere geeignete grenzflächenaktive Mittel geläufig. Die Menge an gegebenenfalls vorhandenen grenzflächenaktiven Mitteln liegt vorzugsweise im Bereich 0,005 - 5% und beträgt am bevorzugtesten 0,05%.
- Die farbbildende Reaktion mit einem Arylamin des spezifizierten Typs, insbesondere 4-Aminophenazon, ist hochspezifisch. Bei der Reaktion der spezifizierten Arylamine mit Salicylat, acetyliertem Salicylat, Acylaniliden wie Hydroxyacetanilid oder mit Tyrosin wird keine störende Farbbildung beobachtet. Das vorliegende Verfahren stellt daher eine rasche und spezifische Methode zur Bestimmung von Salicylat dar, die besonders günstig anwendbar ist, wenn sich das Salicylat in biologischen Flüssigkeiten befindet.
- Die spektrophotometrische Analyse des Farbstoffs kann bei jeder Wellenlänge durchgeführt werden, bei welcher der Farbstoff absorbiert, wird aber vorzugsweise bei der Wellenlänge maximaler Absorption durchgeführt. Wenn ein Farbstoff durch die Umsetzung von Brenzcatechin mit 4-Aminophenazon gebildet wird, beträgt diese Wellenlänge 520 nm.
- Das vorliegende Verfahren zum Nachweis von Salicylaten hat viele Anwendungen, ist aber besonders anwendbar, wenn ein rasches, aber routinemäßiges Analysenverfahren benötigt wird, und zwar insbesondere, wenn die Flüssigkeit, in der das Salicylat enthalten ist, andere Bestandteile enthält, die bekanntermaßen alternative Analyseverfahren stören. Das vorliegende Verfahren ist besonders auf dem medizinischen Gebiet zum Nachweis von analgetischen Formulierungen nützlich, die auf dem Arzneimittel Salicylat basieren. In diesem Fall wird das Salicylat im Gemisch mit anderen Arzneimittel-Derivaten vorliegen, die bekanntermaßen die herkömmlichen Mittel zur raschen Analyse stören.
- Die Erforderlichkeit eines Cofaktors, insbesondere entweder NADPH oder NADH, zur enzymatischen Umwandlung von Salicylat in Brenzcatechin durch Salicylatmonooxygenase bedeutet, daß das vorliegende Reaktionsschema auch zur Bestimmung eines reduzierten Pyridinnucleotids, insbesondere entweder NADH oder NADPH, angewendet werden kann. Beispiele für Reaktionen, bei denen NADH oder NADPH gebildet (und dann bestimmt) werden können, sind z. B. die Einwirkungen von Dehydrogenase-Enzymen auf Substrate wie Glucose oder Triglyceride oder Lactat.
- Folglich stellt die vorliegende Erfindung nach einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung eines reduzierten Pyridinnucleotids (insbesondere NADH oder NADPH) in einer Probe bereit, bei dem ein Salicylat enzymatisch durch die Einwirkung eines Salicylatmonooxygenase-Enzyms auf das Salicylat in Gegenwart des reduzierten Pyridinnucleotids in ein Brenzcatechin umgewandelt wird, das Brenzcatechin mit einer Verbindung der Formel I oder einer Amin- oder Phenolverbindung der oben definierten Formel II, III oder IV zur Bildung eines Farbstoffs umgesetzt wird und die Menge des Farbstoffs kolorimetrisch bestimmt wird, wobei die Menge an Farbstoff ein Maß für das reduzierte Pyridinnucleotid in der Probe ist. Vorzugsweise wird der Farbstoff spektrophotometrisch bestimmt.
- Das Verfahren zur Bestimmung eines reduzierten Pyridinnucleotids basiert auch auf den obigen Reaktionen (A) und (B). In diesem Fall jedoch sind, anders als bei der Salicylat-Bestimmung (bei der das Enzym und das reduzierte Pyridinnucleotid im Überschuß vorliegen), das Salicylat und das Enzym im Überschuß vorhanden. Wie oben wird das Brenzcatechin zweckmäßigerweise durch Umsetzung mit einer oben definierten Verbindung der Formel I oder einer Amin- oder Phenolverbindung der Formel II, III oder IV, vorzugsweise einer der oben angegebenen bevorzugten Verbindungen, insbesondere 4-Aminophenazon, in einen Farbstoff umgewandelt. Wenn das reduzierte Pyridinnucleotid durch die Einwirkung eines Dehydrogenase-Enzyms auf ein Substrat gebildet wird, kann die Bestimmung des gebildeten Nukleotids verwendet werden, um die Menge des vorhandenen Substrats zu bestimmen. Die Anwendung des Verfahrens zur Bestimmung eines reduzierten Pyridinnucleotids auf diese Weise bildet einen weiteren Aspekt der Erfindung.
- Um die Anwendung der vorliegenden Analysenverfahren für Routinezwecke weiter zu erleichtern, insbesondere in medizinischen Verfahren, stellt die Erfindung außerdem einen Diagnostik-Kit zur Verwendung für die Bestimmung eines Salicylats oder eines reduzierten Pyridinnucleotids (insbesondere NADH oder NADPH) mit einem Verfahren der vorliegenden Erfindung bereit, der folgendes enthält:
- a. ein Salicylatmonooxygenase-Enzym das zur Umwandlung von Salicylat in Brenzcatechin in Gegenwart eines reduzierten Pyridinnucleotids geeignet ist,
- b. eine Verbindung der Formel I, II, III oder IV, die zur Umwandlung des Brenzcatechins in einen Farbstoff geeignet ist, nämlich wie oben spezifiziert, vorzugsweise eine der oben erwähnten bevorzugten Verbindungen, insbesondere 4-Aminophenazon. Wie oben ausgeführt, handelt es sich bei dem Salicylatmonooxygenase-Enzym um alle diejenigen, die von der International Union of Biochemistry mit EC:1.14.1.13.1 definiert werden. Bei der Verbindung kann es sich vorzugsweise um Aminophenazon und insbesondere um 4-Aminophenazon handeln.
- Das Enzym und die anderen Reagentien können in Lösung, insbesondere wäßriger Lösung, vorliegen. In diesem Fall enthält die Enzymlösung vorzugsweise Glycerol oder kann vorzugsweise in Gegenwart eines Schutzmittels lyophilisiert werden, um die Aktivität des Salicylatmonooxygenase-Enzyms über längere Zeiträume aufrecht zu erhalten.
- Bei diesem Schutzmittel kann es sich um einen Zucker handeln, insbesondere um Glucose, Lactose, Raffinose oder um ein Polysaccharid.
- Ein derartiger Kit kann eine einzelne Lösung aufweisen, die alle für die Schritte (A) und (B) erforderlichen Reagentien enthält, z. B. das Enzym, NADH oder NADPH, Puffer, Katalysator und das Arylamin, und zwar bei einem geeigneten pH-Wert. Alternativ kann der Kit zwei separate Lösungen enthalten, z. B. eine, die alle für die Schritte (A) und (B) erforderlichen Reagentien enthält, und eine andere, die ein Alkali zur Einstellung des pH-Werts enthält.
- Alternativ können das Enzym und die anderen Reagentien in immobilisierter Form vorliegen, z. B. auf einen festen oder einen halbfesten Träger imprägniert. In diesem Fall ist ein poröses Material, beispielsweise Papier, besonders bevorzugt. Ein derartiger Kit kann manuell verwendet werden oder mit automatisierten Analysatoren. Der Vorteil der letzteren besteht in der Möglichkeit des Betriebs mit geringen Probenvolumina.
- Um die Aktivität des Enzyms weiter aufrechtzuerhalten, kann es bei niedrigen Temperaturen (50 bis -20ºC) aufbewahrt werden, und zwar entweder mit den anderen Bestandteilen des Kits oder von diesen getrennt.
- Die Verbindung der Formel I oder die Amin- oder Phenolverbindung der Formel II, III oder IV können ebenfalls in dem Kit vorhanden sein, und zwar in Form einer Lösung, vorzugsweise einer wäßrigen Lösung. Alternativ kann die Verbindung immobilisiert sein, z. B. auf einen festen oder halbfesten Träger imprägniert. In diesem Fall ist ein poröses Material, beispielsweise Papier, besonders bevorzugt.
- Bei einer Ausführungsform des vorliegenden Kits sind sowohl das Enzym als auch die Verbindung der Formel I oder die Amin- oder Phenolverbindung der Formel II, III oder IV auf ein poröses Material imprägniert, beispielsweise Papier, das dann in Form eines Teststreifens angewendet wird.
- Alternativ kann der Kit die Reagentien in einer Form enthalten, die zur Tauchstab-Bestimmung geeignet ist, wobei die Reagentien beispielsweise immobilisiert, etwa wie oben erwähnt, oder verkapselt oder eingeschlossen werden können, um ein zweckmäßiges Mittel zur Aufbewahrung und Durchführung von Assays für Salicylat, reduziertes Pyridinnucleotid oder durch die Einwirkung von Dehydrogenase-Enzym verbrauchtes Substrat, bereitzustellen.
- Um die Anwendung des Kits der Erfindung zu erleichtern, kann jeder Kit mit Anweisungen geliefert werden, in denen die Schritte angegeben sind, die in dem Assay-Verfahren eine Rolle spielen.
- Die Anwendung des vorliegenden Verfahrens wird außerdem durch die folgenden Beispiele mit Bezugnahme auf die folgenden Figuren erläutert, von denen:
- Fig. 1 die Geschwindigkeit der Farbentwicklung beim Salicylat-Assay unter Verwendung eines kombinierten Enzymund-Farb-Reagens zeigt,
- Fig. 2 ein Spektrum des Reaktionsendprodukts in einem Salicylat-Assay zeigt,
- Fig. 3 eine Eichkurve mit Serum-Eichsubstanzen für den Salicylat-Assay unter Verwendung eines kombinierten Enzymund-Farb-Reagens zeigt,
- Fig. 4 die Schwankung der Salicylat-Assay-Eichkurve mit der Zeit zeigt,
- Fig. 5 die Lagerstabilität des Enzymreagens für das Zwei-Reagens-System nach der Wiederherstellung zeigt,
- Fig. 6 einen Vergleich der Salicylat-Ergebnisse unter Verwendung des vorgeschlagenen enzymatischen Verfahrens und eines kolorimetrischen Routineverfahrens zeigt.
- Tabelle 2.1(a) zeigt untersuchte potentielle Brenzcatechinreaktanten.
- Tabelle 2.1(b) zeigt die in Tabelle 2.1(a) untersuchten Verbindungen, die mit Brenzcatechin reagierten.
- Tabelle 2.2(a) zeigt Brenzcatechinreaktionen in verschiedenen Puffern.
- Tabelle 2.2(b) zeigt weitere Brenzcatechinreaktionen in Puffern.
- Tabelle 3(a) zeigt Xmax für Brenzcatechinreaktionsprodukte.
- Tabelle 3(b) zeigt optimierte Brenzcatechinreaktionssysteme.
- Tabelle 6(a) zeigt die Optimierung der 4-Aminophenazonkonzentration im Mangan-und-Carbonat-Puffer (pH 10)-System.
- Tabelle 7(a) zeigt die Optimierung von Natriumcarbonat in der 4-Aminophenazon-Reaktion.
- Tabelle 8 zeigt die Tagesgenauigkeit des vorgeschlagenen enzymatischen Assays für Salicylat und Tabelle 9 zeigt die wiedergefundenen scheinbaren Salicylatmengen in Gegenwart von potentiell störenden Verbindungen, wobei die potentiell störenden Substanzen in der Probe in einer Konzentration von 10 mmol/l vorhanden sind.
- In diesem Versuch wurden bei pH 8, 9, 10 und 14 Reaktionen durchgeführt, um den Einfluß des pH-Werts auf die Bildung irgendeines gefärbten Produktes zu bestimmen.
- Es wurden Lösungen der potentiellen Reaktanten (50 mmol/l) hergestellt, wobei die in Wasser unlöslichen in Ethanol gelöst wurden. Die untersuchten Verbindungen sind in Tabelle 2.1a. aufgelistet.
- 500 ul wäßriges Brenzcatechin (50 mmol/l) wurden mit 500 ul der Reaktantenlösung kombiniert und bei Raumtemperatur 10 min inkubiert. Jede beobachtete Farbänderung wurde aufgezeichnet. Dann wurden 2 ml Boratpuffer (100 mmol/l), pH 8, 9, 10 oder Natriumhydroxidlösung (250 mmol/l) zugegeben und alle Farbänderungen nach 10 und 60 min wurden aufgezeichnet. Für jedes Reaktionsgemisch wurde eine kein Brenzcatechin enthaltende Leerprobe angesetzt.
- Bei pH 8,0 wurden keine mit Brenzcatechin reagierenden Verbindungen gefunden. Bei pH 9, 10 und 14 wurden mehrere reagierende Verbindungen gefunden, die in Tabelle 2.1b. zusammengefaßt sind.
- Salicylatmonooxygenase 151 U/l
- NADH oder NADPH 0,25 mmol/l
- CHES-Puffer, pH 10,0 145 mmol/l
- Cobaltacetat 0,25 mmol/l
- 4-Aminophenazon 1,29 mmol/l
- Die Serumprobe (25 ul) wurde mit dem Reagens (1 ml) 6 min inkubiert. Dann wurde die Adsorption bei 520 nm bestimmt. Die Ergebnisse für verschiedene Salicylatkonzentrationen enthaltende Serumproben sind in Tabelle 1 gezeigt.
- Salicylatkonzentration im Serum (mmol/l) A 520 nm
- 1 0,151
- 2 0,300
- 3 0,435
- 4 0,592
- 5 0,746
- Salicylatmonooxygenase 304 U/l
- NADH oder NADPH 1,52 mmol/l
- Tris-HCl-Puffer, pH 8,6 30 mmol/l
- Manganchlorid 0,15 mmol/l
- 4-Aminophenazon 3,94 mmol/l
- Natriumcarbonatlösung
- Whitconate AOS Li8
- Die Serumprobe (25 ul) wurde mit Enzymreagens (330 ul) 4 min inkubiert. Dann wurde Alkalireagens (1 ml) zugegeben, und die Absorption bei 520 nm wurde nach 4 min bestimmt. Die Ergebnisse für verschiedene Salicylatkonzentrationen enthaltende Serumproben sind in Tabelle 2 gezeigt.
- Salicylatkonzentration im Serum (mmol/l) A 520 nm
- 1 0,126
- 2 0,269
- 3 0,405
- 4 0,564
- 5 0,705
- Die folgenden Beispiele werden für das Zwei-Reagens-System angegeben, wären aber mit dem Ein-Reagens-System gleichermaßen anwendbar.
- Natriumchlorid 100 mmol
- 4-Aminophenazon 4 mmol
- Manganchlorid 0,15 mmol
- NADH 4,5 mmol
- EPPS, pH 8,6 150 mmol
- Dextran (Lyophilisationsfüllstoff) 2%
- Rinder-Serumalbumin 2 mg/ml
- Glucose 4,5%
- Glucosedehydrogenase 0,1 U/ml
- Salicylatmonooxygenase 2 Einheiten/ml
- Natriumcarbonatlösung 150 mmol
- Witconate AOS 0,05%
- Natriumazid (Konservierungsmittel) 0,1%
- Die Serumprobe (25 ul) wurde mit Enzymreagens (500 ul) bei Raumtemperatur 4 min inkubiert. Dann wurde Alkalireagens (1 ml) zugegeben, und die Absorption bei 520 nm wurde nach 4 min Inkubation bei Raumtemperatur bestimmt.
- Die Analysatorparameter wurden so eingestellt, daß 5 ul Serumprobe, 70 ul Enzymreagens und 10 ul Wasser (Waschung) in ein Compartment des Analysenrotors pipettiert wurden, und 140 ul Alkalireagens und 10 ul Wasser (Waschung) wurden in das andere Compartment pipettiert. Nach einer Inkubationszeit von 4 min bei 37ºC wurden die Rotorinhalte gemischt. Nach weiteren 2 min wurde die Absorption bei 520 nm abgelesen, und zwar mit einer bichromatischen Leerwertablesung, die 5 s später bei 600 nm vorgenommen wurde. Die Ergebnisse für verschiedene Salicylatkonzentrationen enthaltende Serumproben sind in Tabelle 2a gezeigt.
- Salicylatkonzentration im Serum (mmol/l) A (520 nm - 600 nm)
- 1 0,0656
- 2 0,1516
- 3 0,2355
- 4 0,3214
- 5 0,4084
- Bestimmung von reduziertem Pyridinnucleotid (NADH)
- Salicylatmonooxygenase 304 U/l
- Natriumsalicylat 5 mmol/l
- Tris-HCl-Puffer, pH 8,6 30 mmol/l
- Manganchlorid 0,15 mmol/l
- 4-Aminophenazon 3,94 mmol/l
- Unter Verwendung der identischen Reagentien und Verfahren wie in Beispiel 3 wurde eine Eichkurve für die NADPH- Konzentration erstellt. Die Ergebnisse dieser Eichung sind in Tabelle 4 gezeigt.
- NADPH-Konzentration im Serum (mmol/l) A 520 nm
- 1 0,124
- 2 0,263
- 3 0,407
- 4 0,562
- 5 0,701
- Die Lactatkonzentration wurde unter Verwendung der enzymatischen Reaktion von Lactatdehydrogenase zur Reduktion von NAD+ zu NADH bestimmt. Das gebildete NADH wurde dann unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 3 bestimmt.
- Salicylatmonooxygenase 304 U/l
- Natriumsalicylat 5 mmol/l
- Tris-HCl-Puffer, pH 8,6 30 mmol/l
- Lactatdehydrogenase (E.C.1.1.1.27) 100 U/l
- Manganchlorid 0,15 mmol/l
- 4-Aminophenazon 3,94 mmol/l
- Natriumcarbonatlösung 120 mmol/l
- Whitconate AOS Li8 0,05%
- 330 ul Enzymreagens wurden mit 25 ul lactathaltiger Serumprobe 4 min inkubiert. Dann wurde 1 ml Alkalireagens zugegeben, und die Absorption bei 520 nm wurde nach 4 min bestimmt. Die Resultate für verschiedene Serum-Lactatkonzentrationen sind in Tabelle 5 angegeben.
- Lactatkonzentration im Serum (mmol/l) A 520 nm
- 1 0,124
- 2 0,264
- 3 0,406
- 4 0,562
- 5 0,711
- Die Glucosekonzentration wurde unter Verwendung von ATP und Hexokinase-Enzym zur Umwandlung der gesamten Glucose in Glucose-6-phosphat bestimmt. Das Enzym Glucose-6-phosphatdehydrogenase wurde dann verwendet, um NAD&spplus; in NADH umzuwandeln, welches dann mit dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren nachgewiesen wurde.
- Salicylatmonooxygenase 304 U/l
- Natriumsalicylat 5 mmol/l
- Tris-HCl-Puffer, pH 8,6 30 mmol/l
- Manganchlorid 2 mmol/l
- NAD&spplus; 5 mmol/l
- Glucose-6-phosphatdehydrogenase (E.C.1.1.1.49) 100 U/l
- Manganchlorid 0,15 mmol/l
- 4-Aminophenazon 3,94 mmol/l
- Alkalireagens
- Natriumcarbonatlösung 120 mmol/l
- Whitconate AOS Li8 0,05%
- Die Serumprobe (25 ul) wurde zuerst mit einem Überschuß ATP und Hexokinase-Enzym (E.C.2.7.1.1) umgesetzt. Dann wurden 330 ul Enzymreagens zugegeben, und das Gemisch wurde 4 min inkubiert. Dann wurde Alkalireagens (1 ml) zugegeben, und die Absorption bei 520 nm wurde nach 4 min bestimmt.
- Die Ergebnisse für verschiedene Glucosekonzentrationen sind in Tabelle 6 angegeben.
- Glucosekonzentration im Serum (mmol/l) A 520 nm
- 1 0,122
- 2 0,264
- 3 0,413
- 4 0,570
- 5 0,713
- Das Acetylsalicylat in der Probe wurde zuerst durch das Enzym Arylesterhydrolase zu Salicylat und Acetat hydrolysiert. Das freigesetzte Salicylat wurde dann mit dem in Beispiel 2 angegebenen Verfahren bestimmt.
- Arylesterhydrolase (E.C.3.1.1.2) 200 U/l
- Salicylatmonooxygenase 304 U/l
- NADH oder NADPH 1,52 mmol/l
- Tris-HCl-Puffer, pH 8,6 30 mmol/l
- Manganchlorid 0,15 mmol/l
- 4-Aminophenazon 3,94 mmol/l
- Natriumcarbonatlösung 120 mmol/l
- Whitconate AOS Li8 0,05%
- 25 ul Acetylsalicylat enthaltende Serumprobe wurden mit 330 ul Enzymreagens 4 min inkubiert. Dann wurde 1 ml Alkalireagens zugegeben, und die Absorption bei 520 nm wurde nach 4 min bestimmt. Die Ergebnisse für verschiedene Acetylsalicylatkonzentrationen sind in Tabelle 7 angegeben.
- Acetylsalicylatkonzentration im Serum (mmol/l) A 520 nm
- 1 0,130
- 2 0,274
- 3 0,412
- 4 0,570
- 5 0,715
- Wasserlösliche Verbindungen Alkohollösliche Verbindungen
- Antipyrin p-Aminohippursäure
- Amidol 2-Aminopyrazin
- Anilinoxalat 1-Aminoanthrachinon
- o-Aminobenzoesäure 2-Aminobenzothiazol
- 4-Aminophenazon 6-Aminobenzothiazol
- 5-Aminchinon 6-Amino-2-phenylindenon
- 4-Aminoacetophenon 2-Amino-4-methylbenzothiazol
- 2-Aminobiphenyl 2, 6-Dichlor-p-benzochinon-4-chlorimin
- 3-Amino-5,6-dimethyltriazin 2,6-Dichlorchinon-4-chlorimid
- 2-Aminobenzimidazol 4-Hexylresorcin
- 4-Nitrophenol 8-Hydroxychinolin
- 4-Naphthoresorcin 4-Dimethylaminobenzaldehyd
- Phloroglucinol 4-Nitroanilin
- m-Phenylendiamin o-Phenylendiamin
- Resorcin
- β-Resorcylsäure
- 4,2-Thiazolylazoresorcin Tabelle 2.1b: Verbindungen, die mit Brenzcatechin reagierten Reaktant pH Farbe der Reaktantenlösung Farbe von Reaktant & Brenzcatechin Farbe nach Zugabe von Alkali 10 min 60 min Leerwert p-Aminohippursäure Farblos Rosa Rot Braun 4-Dimethylaminobenzaldehyd 4-Aminophenazon Blaßgelb Blaßrosa Antipyrin 2-Aminobenzothiazol Purrpur Grün 6-Aminobenzothiazol Tabelle 2.1b: (Fortsetzung) Reaktant pH Farbe der Reaktantenlösung Farbe von Reaktant & Brenzcatechin Farbe nach Zugabe von Alkali 10 min 60 min Leerwert 2-Amino-4-methylbenzothiazol Farblos Rosa Purpur Braun 4-Aminoacetophenon o-Aminobenzoesäure Orange Anilinoxalat Resorcin βResorcylsäure Rot 3-Amino-5,6-dimethyltriazin Grün Tabelle 2.2a: Brenzcatechin-Reaktionen in verschiedenen Puffern Legende Reaktant Farbe der Reaktantenlösung Glycin, pH 9,5 Farbe p-Aminohhippursäure Farblos Blaßrosa Dimethylaminobenzaldehyd 4-Aminophenazon Rosa Antipyrin 2-Aminobenzothiazol 6-Aminobenzobenzothiazol Orange 2-Amino-4-methylbenzothiazol 4-Aminoacetophenon o-Aminobenzoesäure Anilinoxalat Resorcin Gelb β-Resorcylsäure 3-Amino-5,6-dimethyltriazin Tabelle 2.2a: (Fortsetzung) Legende Carbonatt AMP AMPD Farbe Orange Rot Blaßorange Braun Blaßrosa Rosa Farblos Grün Blaßgrün Tabelle 2.2b: Brenzcatechin-Reaktionen in verschiedenen Puffern Legende Reaktant Farbe der Reaktantenlösung Diethanolamin Farbe p-Aminohhippursäure Farblos Dimethylaminobenzaldehyd 4-Aminophenazon Blaßgelb Rosa Antipyrin Gelb 2-Aminobenzothiazol 6-Aminobenzobenzothiazol 2-Amino-4-methylbenzothiazol 4-Aminoacetophenon o-Aminobenzoesäure Anilinoxalat Resorcin Blaßgrün Grün β-Resorcylsäure 3-Amino-5,6-dimethyltriazin Braun Tabelle 2.2b: (Fortsetzung) Legende TAPS Glycylglycin Borat Farbe Rosa Farblos Blaßrosa Rot Blaßbraun Orange Braun Grün Tabelle 3a: λmax für Brenzcatechin-Reaktionsprodukte System-Einzelheiten Reaktant Puffer λmax Absorption bei λmax Absorption Leerwert ΔAbsorption bei λmax p-Aminohhippursäure Carbonat 4-Aminophenazon (Schultter) 2-Aminobenzothiazol Diethanolamin 6-Aminobenzobenzothiazol 4-Aminoacetophenon o-Aminobenzoesäure Resorcin Tabelle 3a: (Fortsettzung) System-Einzelheiten Reaktant Puffer λmax Absorption bei λmax Absorption Leerwert ΔAbsorption bei λmax Resorcin 2-Amino-4-methylbenzothiazol Carbonat Tabelle 3.b: Optimierte Brenzcatechin-Reaktionssysteme (Konzentrationen im endgültigen Reaktionsgemisch) Reaktantenkonzentration Metallionenkonzentration Pufferkonzentration λmax des Reaktionsproduktes 4-Aminophenazol Cobalt Carbonat Mangan Resorcin Magnesium Natriumhydroxid 6-Aminobenzothiazol o-Aminobenzoesäure p-Aminohippursäure Tabelle 6(a) Optimierung der 4-Aminophenazonkonzentration im Mangan + Carbonat-Puffer (-H 10)-System 4-Aminophenazonkonzentration Plateau Leerwert Tabelle 7(a) Optimierung der Natriumcarbonatkonzentration in der 4-Aminohenazon-Reaktion Konz. der Natriumcarbonatlösung (Plateau) Zeit bis zum Plateau Tabelle 8 Tagesgenauigkeit des vorgeschlagenen enzymatischen Assays für Salicylat Mittelwert CV: Variationskoeffizient SD: Standardabweichung n: Anzahl der Proben im Test Tabelle 9 Wiedergefundene scheinbare Salicylatmenge in Gegenwart von potentiell störenden Verbindungen. Alle potentiell störenden Stoffe waren in der Probe mit einer Konzentration von mmol/l vorhanden Vorhandene Verbindung Beobachtete Salicylatkonz. Wiedergefundenes Salicylat Keine d. h. Serumkontrolle Salicylursäure Gentisinsäure Benzoat 4-Hydroxybenzoat L-Tyrosin 4-Aminosalicylat Acetoacetat 3-Hydroxybutyrat
Claims (33)
1. Verfahren zur Bestimmung eines Salicylats in einer
Probe, dadurch gekennzeichnet, daß das
Salicylat enzymatisch durch Einwirkung eines
Salicylatmonooxygenase-Enzyms auf das Salicylat in Gegenwart eines
reduzierten Pyridinnucleotids in ein Brenzcatechin
umgewandelt wird, das Brenzcatechin mit einer Verbindung
umgesetzt wird, die unter Verbindungen der Formel I
oder Amin- oder Phenolverbindungen der Formeln II, III
oder IV ausgewählt ist:
Formel
wobei R&sub1;&sub1; R&sub2; und R&sub3; unabhängig unter H, -NH&sub2; oder
C&sub1;-C&sub6;-Alkyl ausgewählt sind, R&sub4; bis R&sub1;&sub0; unabhängig
unter H, Alkyl, -NH&sub2;, -NR&sub1;&sub1;R&sub1;&sub2;, -OH, -CH&sub2;OH, -CHO,
-COOH, -CO(CH&sub2;) nH, -CONH(CH&sub2;)nCOOH und
-NH&sub2;·HOOCCOOH·H&sub2;NC&sub6;H&sub5; ausgewählt sind, wobei n eine
ganze Zahl von 1 bis einschließlich 5 bedeutet, und
R&sub1;&sub1; und R&sub1;&sub2; unabhängig C&sub1;-C&sub5;-Alkyl darstellen, mit der
Maßgabe, daß, wenn in Formel II einer der
Substituenten R&sub4; bis R&sub9; -NH&sub2; oder NR&sub1;&sub1;R&sub1;&sub2; bedeutet, dann
mindestens einer der anderen Substituenten R&sub4; bis R&sub9; unter
C&sub1;-C&sub6;-Alkyl, -NH&sub2;, -NR&sub1;&sub1;R&sub1;&sub2;, -CHO, -COOH, CO(CH&sub2;)nH,
-CONH (CH&sub2;)nCOOH oder -NH&sub2;·HOOCCOOH·NH&sub2;C&sub6;H&sub5; ausgewählt
ist, wobei Formel II Verbindungen, die unter die
Bedeutung des Begriffs "Aminophenole" fallen, nicht
umfaßt,
unter Bildung eines ultraviolette, sichtbare oder
infrarote elektromagnetische Strahlung absorbierenden
Farbstoffs, dessen Menge kolorimetrisch bestimmt
werden kann.
2. Verfahren zur Bestimmung eines Salicylats in einer
Probe nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß es sich bei dem reduzierten Pyridinnucleotid um
NADH oder NADPH handelt.
3. Verfahren zur Bestimmung eines Salicylats in einer
Probe nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß die Verbindung unter den
Verbindungen der Formel I ausgewählt ist.
4. Verfahren zur Bestimmung eines Salicylats in einer
Probe nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,
daß R&sub1; Methyl, R&sub2; H oder Methyl und R&sub3; -NH&sub2; bedeuten.
5. Verfahren zur Bestimmung eines Salicylats in einer
Probe nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß die Verbindung unter den
Verbindungen der Formel II ausgewählt ist.
6. Verfahren zur Bestimmung eines Salicylats in einer
Probe nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
daß R&sub4; -COOH, R&sub5; -NH&sub2; und R&sub6; bis R&sub9; H bedeuten.
7. Verfahren zur Bestimmung eines Salicylats in einer
Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch
gekennzeichnet, daß die Verbindung unter den
Verbindungen der Formel II ausgewählt ist und R&sub4;
CONH(CH&sub2;)nCOOH bedeutet, wobei n 1, R&sub7; NH&sub2; und R&sub5;,
R&sub6;, R&sub8; und R&sub9; H darstellen.
8. Verfahren zur Bestimmung eines Salicylats in einer
Probe nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß die Verbindung unter den
Verbindungen der Formel II ausgewählt ist und R&sub4; -CO(CH&sub2;)nH
bedeutet, wobei n 1, R&sub7; NH&sub2; und R&sub5;, R&sub6;&sub1; R&sub8; und R&sub9; H
darstellen.
9. Verfahren zur Bestimmung eines Salicylats in einer
Probe nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß die Verbindung unter den
Verbindungen der Formel III ausgewählt ist.
10. Verfahren zur Bestimmung eines Salicylats in einer
Probe nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,
daß R&sub7; NH&sub2; und R&sub4; bis R&sub6; und R&sub8; bis R&sub1;&sub0; H bedeuten.
11. Verfahren zur Bestimmung eines Salicylats in einer
Probe nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß die Verbindung unter Verbindungen
der Formel IV ausgewählt ist.
12. Verfahren zur Bestimmung eines Salicylats in einer
Probe nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet,
daß R&sub1; und R&sub2; Methyl und R&sub3; -NH&sub2; bedeuten.
13. Verfahren zur Bestimmung eines Salicylats in einer
Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch
gekennzeichnet, daß die Konzentration unter den
Verbindungen der Formeln I bis IV ausgewählten
Verbindungen 0,5 - 50 mmol/l beträgt.
14. Verfahren zur Bestimmung eines Salicylats in einer
Probe nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß die Umwandlung des
Salicylats in das Brenzcatechin und die Umwandlung des
Brenzcatechins in den Farbstoff als
Einschritt-Reaktion durchgeführt wird, in der alle Reagentien
zusammen vorhanden sind.
15. Verfahren zur Bestimmung eines Salicylats in einer
Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch
gekennzeichnet, daß die Umwandlung des
Salicylats in das Brenzcatechin und die Umwandlung des
Brenzcatechins in den Farbstoff in 2
aufeinanderfolgenden Schritten durchgeführt wird.
16. Verfahren zur Bestimmung eines Salicylats in einer
Probe nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß Lithiumlactat und
Lactatdehydrogenase zur Reduktion der Pyridinnucleotide
verwendet werden.
17. Verfahren zur Bestimmung eines Salicylats in einer
Probe nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß Metallionen zur Katalyse
der Enzymreaktion zugegeben werden.
18. Verfahren zur Bestimmung eines Salicylats in einer
Probe nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet,
daß es sich bei den Metallionen um Mangan oder Cobalt
handelt.
19. Verfahren zur Bestimmung eines Salicylats in einer
Probe nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß es sich bei der Amin- oder
Phenolverbindung um ein Arylamin handelt, das unter
4-Aminophenazon, 2-Aminobenzoesäure, 4-Hippursäure,
4-Aminoacetophenon und 6-Aminobenzothiazol ausgewählt
ist.
20. Verfahren zur Herstellung eines Salicylats in einer
Probe nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet,
daß sich bei es sich bei der Amin- oder
Phenolverbindung um 4-Aminophenazon handelt.
21. Verfahren zur Bestimmung eines Salicylats in einer
Probe nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß die Umsetzung des
Brenzcatechins mit der Amin- oder Phenolverbindung im
pH-Bereich von 8,0 bis 14 durchgeführt wird.
22. Verfahren zur Bestimmung eines Salicylats in einer
Probe nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet,
daß der pH-Wert 10 beträgt.
23. Verfahren zur Bestimmung eines Salicylats in einer
Probe nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß der pH-Wert durch einen
Puffer reguliert wird, der unter
Carbonat-Hydrogencarbonat, Borat, Glycin, Diethanolamin, Glycylglycin,
Natriumphosphat, Kaliumphosphat, Tris-HCl,
2-N-Cyclohexylaminethansulfonsäure (CHES), 2-Amino-2-methyl-1-
propanol (AMP), 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol
(AMPD),
N-Tris-(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropansulfonsäure (TAPS), 3-Cyclohexylamino-1-propansulfonsäure
(CAPS), N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsäure
(HEPES) und
N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-3-propansulfonsäure (EPPS) ausgewählt ist.
24. Verfahren zur Bestimmung eines Salicylats in einer
Probe nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß die Bildung des Farbstoffs
in Gegenwart des Puffers CHES bei pH 10 bewirkt wird.
25. Verfahren zur Bestimmung eines Salicylats in einer
Probe nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet,
daß das Verfahren in Form eines Einschritt-Verfahrens
durchgeführt wird, bei dem 4-Aminophenazon zur
Farbentwicklung mit dem Brenzcatechin verwendet wird.
26. Verfahren zur Bestimmung eines Salicylats in einer
Probe nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Bildung des Farbstoffs bewirkt wird, indem
Natriumcarbonat-Puffer mit einem Enzym-Reagens, das
N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-3-propansulfonsäure bei
einem pH von 8,6 enthält und zur Umwandlung des
Salicylats in das Brenzcatechin verwendet wurde, gemischt
wird.
27. Verfahren zur Bestimmung eines Salicylats in einer
Probe nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet,
daß die Reagentien in lyophilisierter Form
bereitgestellt werden.
28. Verfahren zur Bestimmung eines Salicylats in einer
Probe nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet,
daß die Reagentien in Form von aufeinanderfolgenden
gefrorenen Schichten auf einem festen Substrat
aufgebracht werden und die Reagentien dann lyophilisiert
werden.
29. Verfahren zur Bestimmung eines Salicylats in einer
Probe nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß grenzflächenaktive Mittel
zur Verbesserung der Stabilität des gebildeten
Farbstoffs zugegeben werden.
30. Verfahren zur Bestimmung eines reduzierten
Pyridinnucleotids in einer Probe, dadurch
gekennzeichnet, daß ein Salicylat enzymatisch durch Einwirkung
eines Salicylatmonooxygenase-Enzyms auf das Salicylat
in Gegenwart des reduzierten Pyridinnucleotids in ein
Brenzcatechin umgewandelt wird, das Brenzcatechin mit
einer Verbindung der Formel I oder einer Amin- oder
Phenolverbindung der Formel II, III oder IV, nämlich
wie oben in Anspruch 1 definiert, unter Bildung eines
Farbstoffs umgesetzt wird und die Menge des Farbstoff
kolorimetrisch bestimmt wird, wobei die Menge des
Farbstoffs ein Maß für das reduzierte Pyridinnucleotid
in der Probe ist.
31. Diagnostik-Kit zur Verwendung für die Bestimmung eines
Salicylats oder eines reduzierten Pyridinnucleotids
(insbesondere NADH oder NADPH) mit einem Verfahren
nach einem der Ansprüche 1 bis 30, dadurch
gekennzeichnet,
daß der Kit folgende Komponenten
enthält:
(a) ein Salicylatmonooxygenase-Enzym, das zur
Umwandlung von Salicylat in Brenzcatechin in Gegenwart
eines reduzierten Pyridinnucleotids geeignet ist, und
(b) eine Verbindung, die zur Umwandlung des
Brenzcatechins in einen im obigen Anspruch 1
spezifizierten Farbstoff geeignet ist.
32. Diagnostik-Kit nach Anspruch 31, dadurch
gekennzeichnet, daß die Verbindung der Formel I, II,
III oder IV durch Imprägnieren auf einem festen oder
halbfesten Träger immobilisiert ist.
33. Verfahren nach Anspruch 1 oder 30, dadurch
gekennzeichnet, daß das Verfahren als Teil eines
automatisierten Systems durchgeführt wird.
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