JP6049795B2 - L−グルタミン測定キット - Google Patents
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Description
(1)内在性のグルタミン酸を除去する段階
試料にL−グルタミン酸オキシダーゼおよびカタラーゼを作用させる。L−グルタミン酸オキシダーゼの作用により内在性のグルタミン酸は分解し、また、このとき生じる過酸化水素も、カタラーゼによって分解するため、試料中より除去される。一方、L−グルタミンは未反応のまま試料中に残る。
(2)L−グルタミンをL−グルタミン酸へと反応させる段階
上記(1)の反応が十分に行われた試料中に、L−グルタミナーゼおよびアジ化ナトリウムを作用させる。このとき、反応液Iに含まれていたカタラーゼは、アジ化ナトリウムの作用によりただちに失活する。
(3)生じた過酸化水素を定量する段階
当該過酸化水素の生成量を測定することによって、L−グルタミンを定量する。
(A)反応液I(L−グルタミン酸オキシダーゼ、カタラーゼ、及び新トリンダー試薬を含む)、
(B)反応液II(グルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ失活剤、カプラー化合物を含む)。
(A)反応液I(L−グルタミン酸オキシダーゼ、カタラーゼ及び新トリンダー試薬を含む)、
(B)反応液II(グルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ失活剤及びカプラー化合物を含む)。
反応液中にカプラー化合物および新トリンダー試薬を加えた酵素試薬の安定性を調べるために、安定性試験を実施した。カプラー化合物としては、4−アミノアンチピリンを用いた。
検体測定は、以下のような手順にしたがって実施した。
まず、ガラス試験管に反応液I 450μLおよび試料を入れ、室温で10分間反応させた。その後、反応液IIをさらに450μL添加し、同様に20分間反応させた。反応終了後、ディスポーザブルセミマイクロキュベット(バイオラッド社)に液を0.9mL移し、分光光度計で555nmの吸光度測定(純水を対照として測定)を行った。L−グルタミン濃度10〜500mg/Lで検量線が一次式となるような試料の液量を定めた。試料の添加量は、試験1では60μL、試験2では30μLとした。
測定結果(各検体の吸光度)を表2に示した。新トリンダー試薬としてDAOSを使用した試験2では、30℃で4週間保存したときの試薬ブランクの吸光度は、保存0日のものに比べて38倍に上昇し、それに伴い各試料の吸光度が保存0日の場合に比べて上昇していた。4−アミノアンチピリンと新トリンダー試薬を共存させることで自然に酸化縮合反応が起こって着色し、吸光度上昇をもたらしたと考えられた。
参考例の結果から、反応液IにDAOS、TOOS等の新トリンダー試薬と4−アミノアンチピリンの双方を加えると、時間経過に伴う試薬ブランク吸光度の上昇と、カタラーゼ等の酵素の失活を引き起こす可能性が考えられた。
各試験における吸光度の測定結果を表4に示した。L−グルタミン溶液の吸光度について、「(1)4−AA+(2)TOOS」では37℃4週保存で値の低下がみられたが、「(3)TOOS+(4)4−AA」では、37℃4週でもDay0と同程度の吸光度を示した。「(5)4−AA、TOOS+(6)無」では、L−グルタミン溶液のDay0と比較して37℃1週間保存でL−グルタミン500mg/Lの吸光度が大幅に低下し、37℃4週では全ての検体で発色しなくなった。
下記表5に示す組成の溶液状酵素試薬を調製し、酵素試薬の安定性を確認するために、温度負荷37℃での加速試験を実施した。調製した酵素試薬を等量ずつポリプロピレン製チューブに分注し、冷蔵保存用と37℃保存用に分けて保存し、保存開始後0日目、4週目、10週目に各酵素試薬を用いて検体測定を実施した。
96ウェル丸底アッセイプレート(IWAKI)の各ウェルに、試料4μLと反応液Iを90μL入れ、10分間反応させた。その後、さらに反応液IIを90μL加え、20分間反応させた後、プレートリーダー(TECAN Infinite)で555nmの吸光度測定を行った。L−グルタミン濃度10〜1500mg/Lで検量線が一次式となるような試料の液量として、本試験では、試料量を4μLとした。
測定結果を下表6に示す。37℃保存で10週間保存した酵素試薬による測定において、グルタミン測定時の吸光度およびL−グルタミン測定値はDay0値±10%以内に収まっており、値は安定していると判断された。また、L−グルタミン酸の測り込みも検出されなかった。さらに、L-グルタミン0mg/L(試薬blank)の吸光度は0.01未満であった。すなわち、酵素試薬は37℃で10週間保存しても安定性を保ったと考えられた。
各種新トリンダー試薬における安定性の差を検討するため、下記表7に示す組成の溶液状酵素試薬を調製した。また反応液I(1)〜(6)には新トリンダー試薬として、表8に示す各種試薬をそれぞれ終濃度0.8(μmol/mL)となるよう添加した。新トリンダー試薬としては、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3−メチルアニリン・ナトリウム塩(TOOS)、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3−メトキシアニリン(ADOS)、N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン(HDAOS)、N−エチル−N−スルホプロピル−3−メトキシアニリン(ADPS)、N−エチル−N−スルホプロピルアニリン(ALPS)、N−エチル−N−スルホプロピル−3−メチルアニリン(TOPS)を用いた。
測定では、試料20μLに反応液I 700μLを添加し、10分間反応させた。その後、反応液IIを700μL添加し、10分間反応させた後、吸光度測定を行った。測定ODは各新トリンダー試薬の種類に応じ、表8に示した通りの値とした。
下記表10は、各新トリンダー試薬を用いて検体(a)〜(d)を測定したときの吸光度の値を示す。新トリンダー試薬として、TOOS、ADOS、HDAOS、ADPS、ALPS、TOPSは、酵素を溶液保存するL−グルタミン測定キットに使用するのに適しており、とくにTOOSとALPSが感度良く測定できることが判明した。
表11に示す組成の溶液状酵素試薬を調製し、酵素試薬の長期保存安定性を確認するために、冷蔵条件での長期安定性試験を実施した。酵素試薬を等量ずつポリプロピレン製チューブに分注し、保存開始後0日(Day0)、6ヶ月、9ヶ月、12ヶ月に検体測定を実施した。
96ウェル丸底アッセイプレート(IWAKI)の各ウェルに、試料4μLと反応液Iを90μL入れ、10分間反応させた。その後、さらに反応液IIを90μL加え、20分間反応させた後、プレートリーダー(TECAN Infinite)で555nmの吸光度測定を行った。L−グルタミン濃度10〜1500mg/Lで検量線が一次式となるような試料の液量として、本試験では、試料量を4μLとした。
保管0日目(Day0)、6ヶ月、9ヶ月、12ヶ月経過後の各時点での吸光度と測定値を表13に示した。12ヶ月まで保存した酵素試薬による測定において、標準液および検体の吸光度はDay0とほぼ同等の値を示し、L−グルタミン測定値はDay0値±10%以内に収まっており、値は安定していると判断された。また、L−グルタミン酸1500mg/L水溶液の測定値は0mg/L付近を示しており、L−グルタミン酸の測り込みは完全に抑制されていた。さらに、L−グルタミン0mg/L水溶液の吸光度に経時的な上昇などの異常はみられず、試薬ブランク吸光度は低値を保っていた。以上の結果から、酵素試薬は冷蔵で12ヶ月保存しても安定性を保ったと考えられた。
Claims (6)
- 下記(A)及び(B)を含有する、試料中のL−グルタミン測定キット。
(A)L−グルタミン酸オキシダーゼ、カタラーゼ、及び新トリンダー試薬を含む反応液I、
(B)L−グルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ失活剤、及びカプラー化合物を含む反応液II。 - 新トリンダー試薬が、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3−メチルアニリン・ナトリウム塩(TOOS)、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3−メトキシアニリン(ADOS)、N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン(HDAOS)、N−エチル−N−スルホプロピル−3−メトキシアニリン(ADPS)、N−エチル−N−スルホプロピルアニリン(ALPS)、N−エチル−N−スルホプロピル−3−メチルアニリン(TOPS)から成る群より選ばれるものである、請求項1記載の測定キット。
- カプラー化合物が4−アミノアンチピリンである、請求項1又は2に記載の測定キット。
- 試料に対して、反応液I及び反応液IIをこの順に試薬を添加し、反応を行うための、請求項1〜3のいずれか1項に記載の測定キット。
- 37℃で10週間保管した反応液I及び反応液IIをこの順にグルタミンを所定濃度含む溶液に添加したときの吸光度が、保管0日目の反応液I及び反応液IIをこの順に前記溶液と同一のグルタミン溶液に添加した吸光度の値に対して±10%以内であるような、請求項1〜4のいずれか1項に記載の測定キット。
- 下記(1)〜(3)の工程を含む、試料中のL−グルタミンの測定法であって、反応液IがL−グルタミン酸オキシダーゼ、カタラーゼ、新トリンダー試薬を含み、および反応液IIがL−グルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ失活剤、カプラー化合物を含むことを特徴とする、L−グルタミンの測定方法。
(1)試料に反応液Iを添加する工程、
(2)上記工程(1)で反応液Iを添加した試料に、反応液IIをさらに添加することにより、L−グルタミンをL−グルタミン酸に変換させ、さらにこれを分解し、過酸化水素を生じせしめ、当該過酸化水素と発色剤、ペルオキシダーゼの反応により発色を生じせしめる工程、
(3)生じた発色の程度を、吸光度によって測定する工程。
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