-
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
-
1. Gebiet der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft geschützte 2'-Desoxycytidine und hydratisierte Kristalle
davon.
-
Die
an der 5'-Position
geschützten
2'-Desoxycytidine
sind nützliche
Verbindungen als Rohmaterialien für Antisense-DNA, die in den
letzten Jahren entwickelt wurden.
-
2. Beschreibung des Stands
der Technik
-
In
der letzten Zeit wurde mit dem Fortschritt in der Entwicklung von
genomischen Medikamenten intensiv an Antisense-DNA-Arzneimitteln
gearbeitet. Der Fortschritt hat den Bedarf an DNA-Oligomeren, den Rohmaterialien
für Antisense-DNA-Arzneimittel, und
geschützten
Desoxynucleosiden, den Rohmaterialien für DNA-Oligomere, gesteigert. Die Anwendungen
zur Herstellung von Medikamenten erfordern andererseits die Verwendung
von hochreinen Zwischenprodukten, um die Erzeugung von Nebenprodukten,
die Verunreinigungen zugeschrieben wird, zu minimieren.
-
Die
Japanische ungeprüfte Patentveröffentlichungen
Nr. 58-180500 und
63-179889 und
die
japanische Übersetzung
der PCT-Patentveröffentlichung
Nr. 06-507883 offenbaren, dass an der 5'-Position geschützte Desoxynucleoside mittels
Säulenchromatographie
gereinigt werden können.
Durch dieses Verfahren können
Verunreinigungen mit stark unterschiedlichen Polaritäten und
Strukturen leicht entfernt werden, aber Verunreinigungen mit ähnlichen
Strukturen können
nicht zufrieden stellend entfernt werden. Es ist beispielsweise
besonders schwierig, Verunreinigungen, die 5'- oder
3'-Hydroxylgruppen
aufweisen, die durch Trityl-Derivate, wie z.B. Dimethoxytritylgruppen,
geschützt
sind, und jene, die eine nicht erforderliche 3'-Hydroxylgruppe anstelle einer erforderlichen
5'-Hydroxylgruppe
aufweisen, die durch ein Trityl-Derivat,
wie z.B. eine Dimethoxytritylgruppe, geschützt ist, zu entfernen. Zusätzlich dazu
beeinflusst ein Gemisch dieser Verunreinigungen die folgenden Schritte
in der Herstellung von Medikamenten stark. Weiters umfasst die Säulenchromatographie
eine Reinigungsvorrichtung in großem Ausmaß und eine große Menge
an Lösungsmittel
für die
industrielle Herstellung; aus diesen Gründen wird dieses Verfahren
zur Massenproduktion von großen
Mengen eines Produkts in der Zukunft nicht geeignet sein.
-
Andere
Verfahren als eine Säulenchromatographie
zur Entfernung von Verunreinigungen wurden untersucht. Die Reinigung
durch Umfällung
wird in der
Japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung
Nr. 60-152495 und den PCT-Veröffentlichungen Nr. WO00/75154
und WO00/39138 offenbart. Bei dem Umfällungsverfahren wird ein schlechtes
Lösungsmittel
zu einem guten Lösungsmittel,
das eine Rohkomponente enthält,
zugesetzt, oder das gute Lösungsmittel,
das eine Rohkomponente enthält,
wird zu dem schlechten Lösungsmittel
zugetropft, um die Zielsubstanz auszufällen. Dieses Verfahren weist
deshalb im Prinzip eine geringe Reinigungsfähigkeit auf, da es Schwierigkeiten
bei der Entfernung der oben beschriebenen Verunreinigungen verursacht.
Zusätzlich
dazu ist es schwierig, das Volumenverhältnis zwischen dem guten und
dem schlechten Lösungsmittel
bei der industriellen Produktion angemessen zu steuern. Ein nicht
angemessenes Verhältnis
führt zum
Erhalt eines öligen
oder viskosen Niederschlags. In der Folge ist die Reinigung oft
nicht erfolgreich. Gemäß einem
in der
Japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung
Nr. 60-152495 offenbarten Verfahren produziert das Umfällungsverfahren
die Zielsubstanz in Form einer viskosen Flüssigkeit, die für gewerbliche
Anwendungen nicht geeignet ist. Verfahren zur Amorphisierung durch
Umfällung
wurden ebenfalls offenbart, aber es ist kein Verfahren zur Erzeugung
eines Kristalls durch Kristallisation bekannt.
-
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
-
Die
vorliegende Erfindung stellt einen hydratisierten Kristall eines
geschützten
2'-Desoxycytidins der allgemeinen
Formel (1) bereit:
worin m und n jeweils eine
ganze Zahl darstellen; R1 eine 4-Methoxytrityl-, 4,4'-Dimethoxytrityl- oder Triphenylmethylgruppe
darstellt; und B1 eine Cytosingruppe mit einer geschützten Aminogruppe
darstellt.
-
Die
Verbindung der allgemeinen Formel (1) ist vorzugsweise ein geschütztes 2'-Desoxycytidin der allgemeinen Formel
(2):
worin
m und n wie oben definiert sind.
-
In
dem hydratisierten Kristall beträgt
der Gehalt an N4-Benzoyl-3'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'desoxycytidin vorzugsweise 0,1 % oder
weniger.
-
Weiters
wird ein Verfahren zur Reinigung eines geschützten 2'-Desoxycytidins durch die Ausfällung des
geschützten
2'-Desoxycytidins
der allgemeinen Formel (3) in Form eines hydratisierten Kristalls
aus einer Lösung,
die das geschützte
2'-Desoxycytidin
und Wasser enthält,
und die Gewinnung des geschützten
2'-Desoxycytidins
beschrieben:
worin R1 und B1 wie oben
definiert sind.
-
Bei
diesem Verfahren beträgt
der Wassergehalt der Lösung
vorzugsweise 0,5 oder mehr Äquivalente der
durch die allgemeine Formel (3) dargestellten Verbindung.
-
Bei
diesem Verfahren ist die durch die allgemeine Formel (3) dargestellte
Verbindung vorzugsweise ein geschütztes 2'-Desoxycytidin der Formel (4):
-
In
dem Verfahren beträgt
der Gehalt an N4-Benzoyl-3'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin in dem gereinigten Kristall
vorzugsweise 0,1 % oder weniger.
-
Hierin
wird weiters ein Verfahren zur Herstellung eines nicht-hydratisierten
geschützten
2'-Desoxycytidins
der allgemeinen Formel (3) oder (4) durch das Dehydratisieren des
hydratisierten Kristalls eines geschützten 2'-Desoxycytidins der allgemeinen Formel
(1) oder (2) bei reduziertem Druck beschrieben.
-
Das
Verfahren ermöglicht
eine effizientere Herstellung von hochreinen geschützten 2'-Desoxycytidinen
in industriellem Maßstab.
-
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN
AUSFÜHRUNGSFORMEN
-
Die
vorliegende Erfindung wird nun detailliert beschrieben.
-
In
den allgemeinen Formeln (1) und (3) gemäß der vorliegenden Erfindung
steht B1 für
eine Cytosingruppe mit einer durch eine Schutzgruppe geschützten Aminogruppe.
Beispiele für
die Schutzgruppe umfassen eine Alkylgruppe, eine Alkylacylgruppe
und eine Benzoylgruppe, die substituiert werden kann.
-
Die
Alkylgruppe kann unverzweigt oder verzweigt sein und kann eine andere
funktionelle Gruppe (einen Substituenten) aufweisen. Beispiele für den Substituenten
umfassen Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, 2-Propyl-, n-Butyl- und Isobutylgruppen.
-
Die
Alkylacylgruppe kann unverzweigt, verzweigt oder ringförmig sein
und kann eine andere funktionelle Gruppe (einen Substituenten) aufweisen.
Beispiele für
die Substituenten umfassen Acetyl-, Propionyl-, n-Butyryl-, Isobutyryl-,
Pivaloyl-, Valeryl-, Isovaleryl-, Cyclopropyl-, Phenylacetyl-, Phenoxyacetyl-
und (Isopropylphenoxy)acetylgruppen.
-
Die
Benzoylgruppe kann substituiert sein. Die Phenylgruppe in der Benzoylgruppe
kann einen Substituenten entweder an der 2-, der 3- oder der 4-Position
oder eine Vielzahl an Substituenten an diesen Positionen aufweisen.
Beispiele für
den Substituenten umfassen Alkylgruppen, wie z.B. Methyl-, Ethyl-,
2-Propyl-, n-Butyl und tert-Butylgruppen;
Hydroxylgruppen; Alkyloxygruppen, wie z.B. Methoxy-, Ethoxy-, n-Propyloxy-, 2-Propyloxy-
und n-Butyloxygruppen; Nitrogruppen; Halogengruppen, wie z.B. Fluor-,
Chlor-, Brom- und Todgruppen; Aminogruppen; Alkylaminogruppen, wie
z.B. Methylamino-, Ethylamino-, n-Propylamino-, Dimethylamino-,
Diethylamino- und
Diisopropylaminogruppen; Acylgruppen, wie z.B. Acetyl-, Propionyl-
und Benzoylgruppen; Phenylgruppen und Pyridinylgruppen.
-
Beispiele
für die
Benzoylgruppen umfassen spezifisch Benzoyl-, 2-Chlorbenzoyl-, 3-Chlorbenzoyl-, 4-Chlorbenzoyl-,
2-Brombenzoyl-, 3-Brombenzoyl-, 4-Brombenzoyl-, 2-Fluorbenzoyl-,
3-Fluorbenzoyl-, 4-Fluorbenzoyl-, 2-Methoxybenzoyl-, 3-Methoxyenzoyl-,
4-Methoxybenzoyl-, 2-Nitrobenzoyl-, 3-Nitrobenzoyl-, 4-Nitrobenzoyl-,
2-Aminobenzoyl-,
3-Aminobenzoyl-, 4-Aminobenzoyl-, 2-Methylaminobenzoyl-, 3-Methylaminobenzoyl-,
4-Methylaminobenzoyl-, 2-Dimethylaminobenzoyl-, 3-Dimethylaminobenzoyl-,
4-Dimethylaminobenzoyl-, 4-Phenylbenzoyl- und 4-Acetylbenzoylgruppen.
-
Eine
Lösung,
die geschützte
2'-Desoxycytidine
und Wasser enthält,
kann außerdem
ein weiteres mischbares Lösungsmittel
enthalten, das hydratisierte Kristalle der geschützten 2'-Desoxycytidine ausfällen kann. Beispiele für nicht-wässrige Lösungsmittel
umfassen Alkohole, wie z.B. Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropylalkohol,
Butanol, Pentanol und Cyclohexanol; Ether, wie z.B. Diethylether,
Tetrahydrofuran und Dioxan; Ketone, wie z.B. Aceton, Methylethylketon
und Methylisobutylketon; gesättigte
Kohlenwasserstoffe, wie z.B. Pentan, Hexan, Methylpentan, Cyclohexan,
Heptan, Nonan und Decan; aromatische Kohlenwasserstoffe, wie z.B.
Benzol, Toluol, Cumol, Xylol, Mesitylen, Diisopropylbenzol und Triisopropylbenzol;
halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie z.B. Dichlormethan, Chloroform
und Dichlorethan; Pyridine, wie z.B. Pyridin, Lutidin und Chinolin;
und polare Lösungsmittel,
wie z.B. tertiäre
Amine (z.B. Triethylamin und Tributylamin), Acetonitril, Dimethylformamid,
Dimethylimidazolidinon und Dimethylsulfoxid. Diese Lösungsmittel
können
einzeln oder in Kombination eingesetzt werden.
-
In
den hydratisierten Kristallen erleichtert Wasser die Bildung einer
Kristallstruktur. Die hydratisierten Kristalle in der vorliegenden
Erfindung umfassen Kristalle, in denen Wasser in das Kristallgitter
integriert ist, und Verbindungskristalle, die durch eine schwache
Wechselwirkung zwischen den geschützten 2'-Desoxycytidinen und Wasser entstehen.
Die Form der hydratisierten Kristalle und die Kristallstruktur sind
nicht eingeschränkt.
-
Die
hydratisierten Kristalle der geschützten 2'-Desoxycytidine können eine geringe Menge des nicht-wässrigen
Lösungsmittels
enthalten, das in der wässrigen
Lösung von
geschütztem
2'-Desoxycytidin während des
Kristallisationsprozesses enthalten ist.
-
Der
bei der Kristallisation eingesetzte Wassergehalt kann 0,5 Äquivalente
oder mehr, vorzugsweise 1,0 Äquivalent
oder mehr, der geschützten
2'-Desoxycytidine
ausmachen.
-
Die
Verfahren zur Bildung der hydratisierten Kristalle sind nicht eingeschränkt. Die
Kristalle können beispielsweise
durch die Zugabe von Wasser zu einer Lösung aus den geschützten 2'-Desoxycytidinen
oder durch die Zugabe der geschützten
2'-Desoxycytidine zu
einem wässrigen
Lösungsmittel
gebildet werden.
-
Die
Konzentration der geschützten
2'-Desoxycytidine
bei der Kristallisation liegt gewöhnlicherweise im Bereich von
1 % bis 50 % und vorzugsweise im Bereich von 5 % bis 40 %.
-
Die
Temperatur der Lösung
während
der Kristallisation liegt vorzugsweise im Bereich von -10 °C bis zum
Siedepunkt des Lösungsmittels,
wenngleich die Temperatur nicht auf diesen Bereich beschränkt ist.
Ein einziger Kristallisationsschritt stellt gewöhnlicherweise eine ausreichend
hohe Reinheit sicher; ein weiterer Kristallisationsschritt stellt
jedoch höhere
Reinheit bereit. Zur Erleichterung der Kristallisation können Impfkristalle
eingesetzt werden.
-
Die
hydratisierten Kristalle von geschützten 2'-Desoxycytidinen, die auf diese Weise
gereinigt wurden, können,
bei Bedarf, bei reduziertem Druck, vorzugsweise von 0,1 bis 100
mmHg, dehydratisiert werden, wodurch hydratisierte geschützte 2'-Desoxycytidinkristalle mit reduziertem
Wassergehalt, ein Pulver aus nicht hydratisiertem, geschütztem 2'-Desoxycytidin oder
ein Pulver aus teilweise hydratisiertem, geschütztem 2'-Desoxycytidin gebildet werden.
-
Die
Dehydratisierungstemperatur ist nicht eingeschränkt und liegt gewöhnlicherweise
im Bereich von Raumtemperatur bis 200 °C. Die Dehydratisierung kann
mit einem strömenden
trockenen Gas (z.B. Stickstoff) oder einem Dehydratisierungsmittel
(z.B. Silicagel und Diphosphorpentoxid) erfolgen.
-
Verunreinigungen,
die durch das hierin beschriebene Reinigungsverfahren entfernt werden
können, umfassen
N4-Benzoyl-3'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin und N4-Benzoyl-3',5'-O-bis(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin. Der
Gehalt an N4-Benzoyl-3'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin in den geschützten 2'-Desoxycytidinen
beträgt
0,1 % oder weniger, vorzugsweise 0,01 % oder weniger, unabhängig davon,
ob der hydratisierte Kristall verbleibt oder nicht. Der Gehalt an
N4-Benzoyl-3',5'-O-bis(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin in
den geschützten
2'-Desoxycytidinen
beträgt
0,3 % oder weniger, vorzugsweise 0,1 % oder weniger, unabhängig davon,
ob der hydratisierte Kristall verbleibt oder nicht (wobei die Prozentsätze als
durch eine Flüssigkeitschromatographie
gemessene Prozentfläche
ausgedrückt
sind).
-
Wie
oben beschrieben stellt das hierin beschriebene Verfahren eine wirksame
Reinigung für
geschützte
2'-Desoxycytidine
bereit.
-
Die
folgenden Beispiele, die die vorliegende Erfindung beschreiben,
dienen nicht zur Einschränkung des
Umfangs der vorliegenden Erfindung.
-
BEISPIELE
-
Bedingung 1 für Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
(HPLC) für
die Beispiele und Vergleichsbeispiele
-
(Analytische Bedingung für N4-Benzoyl-2'-desoxycytidin und N4-Benzoyl-3',5'-O- bis(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin)
-
- Säule:
Develosil TMS-UG-5
150 mm × 4,6
mm (Durchmesser)
- Durchflussrate: 0,6 ml/min
- Säulentemperatur:
35 °C
- Detektionswellenlänge:
254 nm
- Mobile Phase: Gradienten
-
Zeit
(min) |
Lösung B (%) |
0 |
20 |
30 |
100 |
35 |
100 |
37 |
20 |
50 |
Ende |
-
[Lösung
A]
-
Methanol
(60 ml) wurde einer Lösung
von NaH2PO42H2O (1,92 g) und Na2HPO4
(2,43 g) in Wasser (2.940 ml) beigemischt, und das Gemisch wurde
entgast.
-
[Lösung
B]
-
Methanol
(2.700 ml) wurde einer Lösung
von NaH2PO42H2O (196 mg) und Na2HPO4 (248 mg) in Wasser (300 ml) beigemischt,
und das Gemisch wurde entgast.
-
Bedingung 2 für HPLC für die Beispiele und Vergleichsbeispiele
-
(Analytische Bedingung für N4-Benzoyl-3'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin)
-
- Säule:
YMC-Pack CN A-512
150 mm × 6,0
mm im Durchmesser
- Durchflussrate: 1,0 ml/min
- Säulentemperatur:
35 °C
- Detektionswellenlänge:
235 nm
- Durchlaufzeit: 80 min
- Injektionsvolumen: 10 μl
- Mobile Phase: Gradienten
-
Zeit
(min) |
Lösung B (%) |
0 |
14 |
25 |
50 |
60 |
100 |
80 |
100 |
82 |
14 |
102 |
Ende |
-
[Lösung
A]
-
Eine
Lösung
von NH4H2PO4 (1,15 g) und (NH4)2HPO4 (0,92 g) in
Wasser (2.000 ml) wurde entgast.
-
[Lösung
B]
-
Ein
Gemisch aus Acetonitril (1.200 ml) und Lösung A (400 ml) wurde entgast.
-
Bedingungen für eine Röntgenbeugungsmessung (XRD)
für die
Beispiele und Vergleichsbeispiele
-
- Vorrichtung: RAD-1A (Rigaku International Corporation)
- Röntgenziel:
Cu, 30 kV 15 mA
- Scanningrate: 2°/min
-
Bedingungen für eine Differentialscanning-Kalorimetrie
(DSC) für
die Beispiele und Vergleichsbeispiele
-
- Vorrichtung: DSC821 e (METTLER TOLEDO)
- DSC-Pfanne: Aluminium
- Erhitzungsrate: 5 °C/min
- Atmosphäre:
N2-Strom
-
REFERENZBEISPIEL 1
-
Herstellung von N4-Benzoyl-5'-O-(4,4'-d imethoxytrityl)-2'-desoxycytidin
-
Zu
einer Lösung
von N4-Benzoyl-2'-desoxycytidin (119,0 g) in Pyridin
(1,5 l) wurde 4,4'-Dimethoxytritylchlorid
(113,5 g) im Verlauf von 2 h zugesetzt, und das Gemisch wurde bei
Raumtemperatur weitere 4 h lang gerührt. Natriumhydrogencarbonat
(33,8 g) wurde zugesetzt und 2 h lang gerührt, wonach die Reaktionslösung eingeengt
wurde. Ethylacetat (1,2 l) und Wasser (300 ml) wurden zu dem Rückstand
zugesetzt, und das Gemisch wurde gerührt. Eine kleine Menge gesättigter
Salzlösung
wurde zu dem Gemisch zugesetzt, und die resultierende Flüssigkeit
wurde abgetrennt. Die extrahierte organische Phase wurde mit Wasser
gewaschen und mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Gemisch
wurde filtriert, wonach das Lösungsmittel
entfernt wurde. Der Rückstand
wurde mittels Silicagel-Säulenchromatographie
mit Ethylacetat als Lösungsmittel
gereinigt. Eine Fraktion, die die Zielsubstanz enthielt, wurde zu
Diisopropylether (2,0 l) unter starkem Rühren zugetropft, wonach das
resultierende Gemisch 2 h lang bei Raumtemperatur gerührt wurde.
Das Filtrat wurde in einem Vakuum bei 50 °C getrocknet, um nicht-hydratisiertes
N4-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin (153,3
g) zu liefern. Das XRD-Diagramm zeigte, dass das freie Produkt amorph
war. Weiters enthielt die Komponente N4-Benzoyl-2'-desoxycytidin, das das Rohmaterial war,
N4-Benzoyl-3'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin
und N4-Benzoyl-3',5'-O-bis(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin, wobei
es sich bei beiden um Nebenprodukte handelte, und die Anteile der
entsprechenden Peakbereiche betrugen jeweils 1,0 %, 0,15 % bzw.
2,2 %.
-
BEISPIEL 1
-
Synthese von hydratisierten Kristallen
von N4-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin
-
Das
nicht-hydratisierte N4-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin (2,0
g), das in Referenzbeispiel 1 hergestellt wurde, wurde in 1,2-Dichlorethan
(5 ml) gelöst, und
Wasser (0,1 g) wurde zu der Lösung
zugesetzt. Die Lösung
wurde bei -24 °C
einen Tag lang stehen gelassen, um die Zielsubstanz zu kristallisieren.
Die resultierenden Kristalle wurden abfiltriert und in Vakuum bei
50 °C getrocknet,
um hydratisierte Kristalle von N4-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin (0,8
g) zu erhalten. Der Feuchtigkeitsgehalt in den Kristallen wurde
unter Einsatz des Karl-Fischer-Verfahrens
ermittelt und betrug 2,7 %. Das XRD-Diagramm wies deutliche Reflexe
auf, die den Kristallen zugeordnet wurden, insbesondere bei 5,6°, 7° und 10,3°. Weiters
wies das DSC-Thermogramm einen endothermen Peak bei 109 °C auf, was
den Schmelzpunkt der Kristalle anzeigt.
-
Die
Komponente enthielt N4-Benzoyl-2'-desoxycytidin, N4-Benzoyl-3'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin und
N4-Benzoyl-3',5'-O-bis(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin, und die Anteile der entsprechenden Peakbereiche
entsprachen jeweils 0,05 %, der Nachweisgrenze (0,01 %) oder weniger
bzw. 0,05 %.
1H-NMR(CDCl3): δ 8,7 (s,
1H); 8,3 (d, 1H); 7,9 (d, 2H); 7,2-7,6 (m, 13H); 6,8-6,9 (m, 4H);
6,3 (m, 1H); 4,5 (m, 1H); 4,2 (m, 1H); 3,8 (s, 6H); 3,4-3,5 (m,
2H); 2,7-2,9 (m,
2H); 2,3 (m, 1H)
-
BEISPIEL 2
-
Synthese von hydratisierten Kristallen
von N4-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin
-
Das
nicht-hydratisierte N4-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin (2,0
g), das in Referenzbeispiel 1 hergestellt wurde, wurde in Butylacetat
(5 ml) gelöst.
Hexan (0,5 ml) wurde zu der Lösung
zugetropft. Dann wurden Wasser (0,1 g) und die hydratisierten Kristalle
von N4-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin (10 mg), die in Beispiel
1 hergestellt wurden, zu der Lösung
zugesetzt, und das Gemisch wurde einen Tag lang auf Eis stehen gelassen,
um die Zielsubstanz zu kristallisieren. Die resultierenden Kristalle
wurden abfiltriert und in Vakuum bei 50 °C getrocknet, um hydratisierte
Kristalle von N4-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin (1,3
g) zu erhalten. Der Feuchtigkeitsgehalt in den Kristallen wurde
unter Einsatz des Karl-Fischer-Verfahrens ermittelt und betrug 2,2
%. Das XRD-Diagramm wies deutliche Reflexe auf, die den Kristallen
zugeordnet wurden, insbesondere bei 5,6°, 7° und 10,3°. Weiters wies das DSC-Thermogramm
einen endothermen Peak bei 112 °C
auf, was den Schmelzpunkt der Kristalle anzeigt.
-
Die
Komponente enthielt N4-Benzoyl-2'-desoxycytidin, N4-Benzoyl-3'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin und
N4-Benzoyl-3',5'-O-bis(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin, und die Anteile der entsprechenden Peakbereiche
entsprachen jeweils 0,12 %, der Nachweisgrenze (0,01 %) oder weniger
bzw. 0,07 %.
-
BEISPIEL 3
-
Synthese von hydratisierten Kristallen
von N4-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin
-
Das
nicht-hydratisierte N4-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin (2,0
g), das in Referenzbeispiel 1 hergestellt wurde, wurde in Acetonitril
(5 ml) gelöst.
Wasser (7 ml) wurde zu der Lösung
zugetropft. Dann wurden die hydratisierten Kristalle von N4-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin (10 mg), die in Beispiel
1 hergestellt wurden, zu der Lösung
zugesetzt, und das Gemisch wurde 5 h lang auf Eis stehen gelassen,
um die Zielsubstanz zu kristallisieren. Die resultierenden Kristalle
wurden abfiltriert und in Vakuum bei 50 °C getrocknet, um hydratisierte
Kristalle von N4-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin (1,3
g) zu erhalten. Das DSC-Thermogramm wies einen endothermen Peak
bei 112 °C
auf, was den Schmelzpunkt der Kristalle anzeigt.
-
Die
Komponente enthielt N4-Benzoyl-2'-desoxycytidin, N4-Benzoyl-3'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin und
N4-Benzoyl-3',5'-O-bis(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin, und die Anteile der entsprechenden Peakbereiche
entsprachen jeweils 0,1 %, der Nachweisgrenze (0,01 %) oder weniger
bzw. 0,04 %.
-
BEISPIEL 4
-
Synthese von hydratisierten Kristallen
von N4-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin
-
Das
nicht-hydratisierte N4-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin (2,0
g), das in Referenzbeispiel 1 hergestellt wurde, wurde in Aceton
(5 ml) gelöst.
Wasser (8 ml) wurde zu der Lösung
zugetropft. Dann wurden die hydratisierten Kristalle von N4-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin (10
mg), die in Beispiel 1 hergestellt wurden, zu der Lösung zugesetzt,
und das Gemisch wurde 5 h lang auf Eis stehen gelassen, um die Zielsubstanz
zu kristallisieren. Die resultierenden Kristalle wurden abfiltriert
und in Vakuum bei 50 °C
getrocknet, um hydratisierte Kristalle von N4-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin (1,4 g)
zu erhalten. Das DSC-Thermogramm
wies einen endothermen Peak bei 114 °C auf, was den Schmelzpunkt der
Kristalle anzeigt.
-
Die
Komponente enthielt N4-Benzoyl-2'-desoxycytidin, N4-Benzoyl-3'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin und
N4-Benzoyl-3',5'-O-bis(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin, und die Anteile der entsprechenden Peakbereiche
entsprachen jeweils 0,07 %, der Nachweisgrenze (0,01 %) oder weniger
bzw. 0,1 %.
-
BEISPIEL 5
-
Synthese von hydratisierten Kristallen
von N4-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin
-
N4-Benzoyl-2'-desoxycytidin (40,3 g) wurde in Pyridin
(302,4 g) suspendiert, und die Suspension wurde auf 10 °C abgekühlt. Zu
der Suspension wurde 4,4'-Dimethoxytritylchlorid
(47,5 g) bei 10 °C
zugesetzt, und das Gemisch wurde 4 h lang bei dieser Temperatur
gerührt.
Nach Beendigung der Reaktion wurde Natriumhydrogencarbonat (12,9
g) zu dem Gemisch zugesetzt und 2 h lang bei Raumtemperatur gerührt, anschließend wurde
die Reaktionsflüssigkeit
eingeengt. Butylacetat (473 g) wurde zum Rückstand zugegeben, und das
resultierende Gemisch wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur
gerührt,
wonach die unlösliche
Komponente abfiltriert wurde. Hexan (140 g) wurde zu der resultierenden
organischen Phase bei Raumtemperatur zugetropft. Wasser (3,3 g)
und die hydratisierten Kristalle von N4 Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin (0,1
g), die in Beispiel 1 hergestellt wurden, wurden zu der organischen
Phase zugesetzt. Das Gemisch wurde 1 Tag lang bei Raumtemperatur
stehen gelassen, um die Zielsubstanz zu kristallisieren, wonach
Hexan (93 g) zugetropft wurde und die Kristallisation 5 h lang bei
Raumtemperatur wiederholt wurde.
-
Die
resultierenden Kristalle wurden abfiltriert und in Vakuum bei 50 °C getrocknet,
um hydratisierte Kristalle von N4-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin (63,7
g) zu liefern. Das DSC-Thermogramm wies einen endothermen Peak bei
110 °C auf,
was den Schmelzpunkt der Kristalle anzeigt.
-
Die
Komponente enthielt N4-Benzoyl-2'-desoxycytidin, N4-Benzoyl-3'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin und
N4-Benzoyl-3',5'-O-bis(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin, und die Anteile der entsprechenden Peakbereiche
entsprachen jeweils 0,05 %, der Nachweisgrenze (0,01 %) oder weniger
bzw. 0,15 %.
-
BEISPIEL 6
-
Reinigung von hydratisierten Kristallen
von N4-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin
-
Die
hydratisierten Kristalle von N4-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin (60
g), die in Beispiel 5 hergestellt wurden, und Aktivkohle (3 g) wurden
zu Acetonitril (300 g) zugesetzt, und das resultierende Gemisch
wurde 1 h lang bei 55 °C
gehalten. Die unlösliche
Komponente wurde abfiltriert. Wasser (240 g) wurde zugetropft, und
die hydratisierten Kristalle von N4-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin (0,1
g) wurden zu der Lösung
zugesetzt. Das resultierende Gemisch wurde bei Raumtemperatur 2
h lang stehen gelassen, um die Zielsubstanz zu kristallisieren.
-
Weiters
wurde Wasser (240 g) zugetropft, und die Kristallisation wurde 2
h lang bei Raumtemperatur wiederholt. Die resultierenden Kristalle
wurden abfiltriert und in Vakuum bei 50 °C getrocknet, um die hydratisierten
Kristalle von N4-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin (55,8 g) zu reinigen.
Der Feuchtigkeitsgehalt der Kristalle wurde unter Einsatz des Karl-Fischer-Verfahrens
bestimmt und betrug 2,3 %.
-
Das
DSC-Thermogramm wies einen endothermen Peak bei 114 °C auf, was
den Schmelzpunkt der Kristalle anzeigt.
-
Die
Komponente enthielt N4-Benzoyl-2'-desoxycytidin, N4-Benzoyl-3'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin und
N4-Benzoyl-3',5'-O-bis(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin, und die Anteile der entsprechenden Peakbereiche
entsprachen jeweils der Nachweisgrenze (0,01 %) oder weniger, der
Nachweisgrenze (0,01 %) oder weniger bzw. 0,05 %.
-
BEISPIEL 7
-
Synthese von hydratisierten Kristallen
von N4-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin
-
Die
hydratisierten Kristalle von N4-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin (40
g) wurden in einem Trockenschrank in Vakuum (10 mmHg) bei 65 °C 40 h lang
unter einem Stickstoffstrom getrocknet, um N4-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin (39,1 g) in Form eines
weißen
Pulvers zu liefern. Der Feuchtigkeitsgehalt der Kristalle betrug
0,1 %. Das XRD-Diagramm wies keinen deutlichen Reflex auf, was anzeigt,
dass das Pulver amorph war. Dementsprechend wies das DSC-Thermogramm keinen
endothermen Peak auf.
-
VERGLEICHSBEISPIEL 1
-
Unter
Bezugnahme auf PCT-Veröffentlichung
Nr.
WO00/75154 wurde
das nicht-hydratisierte
N
4-Benzoyl-5'-O-(4,4'-d imethoxytrityl)-2'-desoxycytidin (2,00 g), umfassend N
4-Benzoyl-2'-desoxycytidin, N
4-Benzoyl-3'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin und N
4-Benzoyl-3',5'-O-bis(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin mit
Peakbereichanteilen von 1,0 %, 0,15 % bzw. 2,2 %, in Acetonitril
(2,3 ml) gelöst.
Die Lösung
wurde zu Wasser (41 ml) unter starkem Rühren zugetropft, und das resultierende
Gemisch wurde 1 h lang gerührt.
Ein weißer
Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, zwei Mal mit Wasser
gewaschen und bei 50 °C
in Vakuum getrocknet, um N
4-Benzoyl-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin (1,82
g) zu liefern. Das XRD-Diagramm und das DSC-Thermogramm zeigten
weder einen Absorptionspeak noch einen endothermen Peak aufgrund von
Kristallisation, was anzeigt, dass die resultierenden Komponenten
nicht kristallisiert waren. Weiters enthielt die Komponente N
4-Benzoyl-2'-desoxycytidin, N
4-Benzoyl-3'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2'-desoxycytidin und N
4-Benzoyl-3',5'-O-bis(4,4'-d imethoxytrityl)-2'-desoxycytidin, und
die entsprechenden Peakbereiche betrugen 0,9 %, 0,13 % bzw. 1,8
%, was anzeigt, dass das oben beschriebene Verfahren im Wesentlichen
keine Wirkung auf die Reinigung hatte.