DE69821540T2

DE69821540T2 - Mit einem Adapter versehene kompetitive PCR

Info

Publication number: DE69821540T2
Application number: DE69821540T
Authority: DE
Inventors: Kikuya Osaka-shi Kato
Original assignee: Japan Science and Technology Corp
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1997-04-07
Filing date: 1998-04-07
Publication date: 2004-12-30
Anticipated expiration: 2018-04-08
Also published as: EP0870842A3; EP0870842A2; DE69821540D1; US6090556A; EP0870842B1

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Expression eines Gens.
2. Beschreibung des Stands der Technik
Um das Ausmaß einer Genexpression zu bestimmen, wird im Allgemeinen eine Northern-Hybridisierung durchgeführt. Für eine Routinebestimmung im Labor reicht die Gegenwart von 5 pg (Picogramm) RNA zur Detektion aus. In Fällen jedoch, in denen die Expressionsmenge eines Zielgens extrem gering ist, sind 0,3 bis 3 μg mRNA zur Detektion erforderlich. Somit ist es schwierig, Northern-Hybridisierung in Fällen einzusetzen, in denen Proben nur in begrenzter Menge verfügbar sind (z. B. klinische Proben).
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein Verfahren, durch das DNA oder RNA mit viel stärkerer Empfindlichkeit detektiert werden kann als mit anderen Verfahren. Die quantitative Bestimmung von Genexpression durch PCR umfasst jedoch ein Kontrollexperiment, bei dem eine Kalibrierungskurve erstellt wird, wobei ein DNA-Fragment mit einer ähnlichen Amplifikationseffizienz wie ein Zielmolekül als so genannte „interne Kontrolle" verwendet wird. Somit sind diese Vorgänge kompliziert. Außerdem ist zur Durchführung einer quantitativen PCR die Erstellung einer Kalibrierungskurve für jedes der Zielgene, das quantitativ bestimmt werden soll, erforderlich. Somit erfordert eine Untersuchung von Genen oder eine Gendiagnose mit diesem Verfahren viel Zeit und Arbeitsaufwand.
Ziele und Zusammenfassung der Erfindung
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur quantitativen Bestimmung der Expression eines Gens.
Im Laufe intensiver und umfassender Forschungsarbeiten zur Lösung der oben beschriebenen Probleme fand der Erfinder der vorliegenden Erfindung heraus, dass eine Genexpression leicht quantitativ bestimmt werden kann, indem zumindest zwei Arten von Proben bereitgestellt werden, die eine für das Zielgen kodierende cDNA enthalten, zu jeder der in den Proben enthaltenen cDNAs ein anderer Adapter hinzugefügt wird und die resultierenden cDNAs mit Adapter-Markierung in einem einzigen Reaktionssystem amplifiziert werden. So wurde die vorliegende Erfindung entwickelt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Expression eines Gens, umfassend das Bereitstellen von zumindest zwei Arten von Proben, die jeweils für das Gen kodierende cDNA enthalten, das Hinzufügen eines anderen Adapters zu jeder der in den Proben enthaltenen cDNA, das Vermischen gleicher Mengen der Proben, die jeweils die cDNA mit Adapter-Markierung enthalten, das Amplifizieren der resultierenden cDNAs und das Berechnen eines Mengenverhältnisses zwischen den amplifizierten Produkten. Als Adapter können beispielsweise solche verwendet werden, die Oligonucleotide mit unterschiedlicher Länge, Oligonucleotide mit zumindest einer Restriktionsstelle oder Oligonucleotide mit unterschiedlichen Sequenzen umfassen.
Zenilman et al. beschreiben ein auf PCR basierendes Verfahren zur Bestimmung der Menge einer spezifischen mRNA-Spezies in einer Probe unter Verwendung von genomischer DNA als Konkurrent (Analytical Biochemistry 224, 339–346 (1995)).
Kato beschreibt ein Verfahren zum Vergleich von Gesamt-mRNA-Expressionsprofilen verschiedener Proben durch Verdau von cDNA mit Restriktionsenzymen vom Typ IIS, Ligieren von Oligonucleotidadaptern und Amplifizieren der resultierenden Population von cDNA-Konstrukten (Nucleic Acids Research 23, 3686–3690 (1995)).
Kurzbeschreibung der Abbildungen
1 ist eine schematische Darstellung des Verfahrens der Erfindung zur quantitativen Bestimmung einer Genexpression.
2 ist eine schematische Darstellung des Verfahrens der Erfindung zur quantitativen Bestimmung einer Genexpression.
3 zeigt die Ergebnisse einer Analyse von PCR-Produkten (amplifizierte cDNA-Fragmente) unter Verwendung eines Sequenators.
4 zeigt die Ergebnisse einer Analyse von PCR-Produkten (amplifizierte cDNA-Fragmente) unter Verwendung eines Sequenators.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Nachstehend wird die vorliegende Erfindung im Detail erläutert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung eines identischen Gens, das in mehreren Proben enthalten ist, durch Amplifikation des Gens in einem einzigen Reaktionssystem, das die Proben umfasst. Kurz gesagt ist das Verfahren der Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass zumindest zwei Arten von Proben bereitgestellt werden, die jeweils eine für ein Zielgen kodierende cDNA enthalten, zu jeder der in den Proben enthaltenen cDNAs ein anderer Adapter hinzugefügt wird, gleiche Mengen der Proben, die jeweils die cDNA mit Adapter-Markierung enthalten, vermischt werden, die resultierenden cDNAs amplifiziert werden und ein Mengenverhältnis zwischen den amplifizierten cDNAs berechnet wird. Dieses Verfahren wird als kompetitive PCR mit Adapter-Markierung (ATAC-PCR) bezeichnet.
Im Folgenden werden die einzelnen Schritte des Verfahrens beschrieben.
(1) Herstellung von cDNA
Wie in 1 dargestellt werden zumindest zwei Arten von Proben hergestellt, welche eine zu bestimmende cDNA enthalten. Zur Erklärung werden als Beispiel zwei Arten von Proben hergestellt, die jeweils eine identische cDNA enthalten.
Eine der Proben, die eine cDNA enthält, wird als Probe A bezeichnet und die andere als Probe B. Die Herstellung der cDNA in Probe A und Probe B kann durch jedes beliebige herkömmliche Verfahren erfolgen. Beispielsweise kann ein Verfahren zur Herstellung von poly(A)⁺-RNA aus Zellen von verschiedenen Organen und zur Überführung der RNA in cDNA mithilfe einer reversen Transkriptase (U. Gubler und B. J. Hoffman, Gene 25, 263–269 (1983); N. Okayama und P. Berg, Mol. Cell. Biol. 18, 5294 (1982)) eingesetzt werden.
Bei der vorliegenden Erfindung können Probe A und Probe B, die jeweils eine cDNA enthalten, die das Ziel von quantitativer Bestimmung ist, von unterschiedlichem Gewebe oder unterschiedlichen Zellen oder von identischem Gewebe oder identischen Zellen stammen. Probe A kann beispielsweise ein Leberzellextrakt und Probe B ein Nierenzellextrakt sein. In Bezug auf den Typ der quantitativ zu bestimmenden cDNA können cDNAs verwendet werden, die von RNAs von verschiedenen Organen herrühren, beispielsweise cDNA, die für ein von einer Leber stammendes Apolipoprotein kodiert, und cDNA, die für ein von einer Niere stammendes Apolipoprotein kodiert. Die Menge der Ziel-cDNA in Probe A oder Probe B kann bekannt sein. Andererseits kann die Menge der Ziel-cDNA in beiden Proben auch unbekannt sein. Wenn die Menge der Ziel-cDNA in einer Probe bekannt ist, dann kann die absolute Menge der cDNA in der anderen Probe bestimmt werden. Wenn die Menge der Ziel-cDNA in beiden Proben unbekannt ist, kann die relative Differenz zwischen dem cDNA-Gehalt in Probe A und dem in Probe B bestimmt werden.
(2) Hinzufügen der Adapter
Danach werden die cDNAs in Probe A und Probe B mit einem spezifischen Restriktionsenzym (z. B. MboI, NlaIII, HpaII oder TaqI) verdaut. Dann wird an jeder der Schnittstellen ein anderer Adapter hinzugefügt (siehe 1, (1) und (2)). Ein Adapter ist ein Oligonucleotid, das so aufgebaut ist, dass beim Amplifizieren nach cDNA unterschieden werden kann. Ein Adapter ist als doppelsträngiges Oligonucleotid aufgebaut, so dass er an die Schnittstelle einer cDNA ligiert werden kann. Die Adapter, die bei der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, können so aufgebaut sein, dass sich jener, der an cDNA in Probe A hinzugefügt werden soll, in seiner Länge von jenem, der an cDNA in Probe B hinzugefügt werden soll, unterscheidet. Andererseits können sie auch so aufgebaut sein, dass zumindest eine Restriktionsstelle in jedem der Adapter enthalten ist. Oder sie können so aufgebaut sein, dass sich jener, der an cDNA in Probe A hinzugefügt werden soll, in der Nucleotidsequenz von jenem, der an cDNA in Probe B hinzugefügt werden soll, unterscheidet.
Diese Adapter können beispielsweise wie folgt hergestellt werden. Sie können durch chemische Synthese erhalten und mit einer Fluoreszenzmarkierung oder einem Radioisotop markiert werden.
(i) Fälle, in denen Adapter mit unterschiedlicher Länge verwendet werden
Eine gemeinsame Sequenz für beide Adapter (die fette Linie „–" in den Adaptern in 1) wird geschaffen. Dann wird eine Sequenz aus 5 bis 15 Basen an einen der Adapter hinzugefügt, so dass sie nach ihrer Länge unterscheidbar sind. Die hinzuzufügende Sequenz ist so aufgebaut, dass sie zu diesem Zeitpunkt zwischen dem ko häsiven Ende der cDNA und der Bindungsstelle eines Adapterprimers, der für die darauf folgende Amplifikation verwendet werden soll, angeordnet ist (siehe 2; die punktierte Linie „⋯" im Adapter für Probe B).
Um überschüssige Adapter, die in der Probe vermischt sind, zu entfernen (d. h. um die Probe mit Adapter-Markierung alleine zu gewinnen), wird vorzugsweise in jeder Probe zur cDNA eine Substanz (z. B. ein Antigen, ein Enzym, Biotin) zugesetzt, die mit einer spezifischen Substanz (einem Antikörper, einem Substrat, Streptavidin) reagiert (1). 1 zeigt cDNAs, denen Biotin („-b") zugesetzt wurde. Wenn die Menge des Ausgangsmaterials (RNA) für die Probe jedoch groß ist, wird angenommen, dass die relative Differenz zwischen der Menge der durch reverse Transkription der RNA erhaltenen cDNA und der Menge an freiem Adapter gering ist. Somit braucht überschüssiger Adapter in solch einem Fall nicht entfernt zu werden. Daher wird die Substanz bei speziellen Reaktionen wie oben beschrieben mitunter nicht zugesetzt.
(ii) Fälle, in denen Adapter verwendet werden, in die eine Restriktionsstelle eingeführt wurde
Die Restriktionsstellen, die in Adapter eingeführt werden sollen, sind so aufgebaut, dass ein Adapter zumindest eine Restriktionsstelle enthält. Andererseits kann die Anzahl an solchen Stellen auch unter Berücksichtigung der Anzahl an Proben, die jeweils eine Ziel-cDNA enthalten, bestimmt werden. Die Restriktionsstelle kann eine Stelle für MluI, NotI, SalI, SfiI, XhoI oder dergleichen sein.
Wenn cDNAs, die in zwei Proben enthalten sind, quantitativ bestimmt werden sollen, können entweder eine oder zwei Restriktionsstellen in einen Adapter eingeführt werden. Die Restriktionsstelle(n) ist (sind) so aufgebaut, dass sie sich zwischen der Bindungsstelle eines Adapterprimers und dem kohäsiven Ende der cDNA befindet (befinden).
Wenn eine Restriktionsstelle eingeführt wird, sind die Adaptersequenzen so aufgebaut, dass die beiden Adapter unterschiedliche Erkennungsstellen miteinander aufweisen. Eine SalI-Stelle wird beispielsweise in einen Adapter eingeführt, der zur cDNA in Probe A hinzugefügt werden soll, und eine MluI-Stelle in einen Adapter, der zur cDNA in Probe B hinzugefügt werden soll.
Wenn zwei oder mehr Restriktionsstellen eingeführt werden, werden in die einzelnen Adapter, die zu der Probe hinzugefügt werden sollen, zwei unterschiedliche Restriktionsstellen eingeführt (2). Außerdem ist der Adapter so aufgebaut, dass er nur an einer der beiden Restriktionsstellen geschnitten wird, wenn er mit einem Restriktionsenzym behandelt wird. Trotzdem sind die Adapter so aufgebaut, dass ein Restriktionsenzym, das einen Adapter schneidet, mit dem eine cDNA markiert ist, den anderen Adapter, mit dem die andere cDNA markiert ist, nicht schneidet. Wie beispielsweise in 2 dargestellt, ist, wenn die cDNAs in Probe A und Probe B unter Verwendung von Adaptern, die jeweils zwei Restriktionsstellen enthalten (z. B. für MluI und NotI), quantitativ bestimmt werden, der an die cDNA in Probe A gebundene Adapter so aufgebaut, dass er nur vom Restriktionsenzym MluI erkannt werden kann. Genauer gesagt wird ein Teil der NotI-Stelle dieses Adapters durch Substitution oder dergleichen so modifiziert, dass dieser Adapter vom Restriktionsenzym NotI nicht erkannt wird. (In 2 ist dies durch das Durchstreichen von „NotI" angezeigt.) Gleichzeitig ist der Adapter, der an die cDNA in Probe B gebunden ist, so aufgebaut, dass er nur vom Restriktionsenzym NotI erkannt werden kann. Damit dieser Adapter nicht vom Restriktionsenzym MluI erkannt wird, ist ein Teil seiner MluI-Stelle durch Substitution oder dergleichen modifiziert. (In 2 ist dies durch das Durchstreichen von „MluI" angezeigt.)
Vorzugsweise wird Biotin oder dergleichen zur cDNA hinzugefügt, so dass die Probe mit Adapter-Markierung alleine erhalten werden kann.
(iii) Fälle, in denen Adapter mit unterschiedlichen Nucleotidsequenzen verwendet werden
Bei der vorliegenden Erfindung können Adapter, die sich in der Nucleotidsequenz voneinander unterschieden, nach Belieben aufgebaut, synthetisiert und verwendet werden. Wenn solche Adapter verwendet werden, kann die Ziel-cDNA durch Bildung von Oligonucleotiden detektiert werden, die komplementär zu den Adaptern sind und somit daran hybridisieren und sie markieren.
Ein Adapter, der zu einer cDNA in Probe A hinzugefügt werden soll, wird beispielsweise als Adapter X bezeichnet, und ein Adapter, der zu einer cDNA in Probe B hinzugefügt werden soll, als Adapter Y. Diese Adapter sind so aufgebaut, dass die Sequenz von Adapter X sich von der Sequenz von Adapter Y unterscheidet, mit der Ausnahme der Region, an die Adapterprimer hinzugefügt wird, so dass ein Nucleotid, das an Adapter X hybridisiert, zumindest an Adapter Y nicht hybridisieren kann. Die Nucleotidsequenzen von Adapter X und Adapter Y können nach Belieben aufgebaut und chemisch synthetisiert werden. Die Längen der Nucleotidsequenzen dieser Adapter können gleich oder unterschiedlich sein und im Bereich von 15 bis 50 Basen, vorzugsweise 25 bis 30 Basen, liegen.
Bei diesen Adaptern weist die Region, an die ein Adapterprimer zur nachfolgenden Amplifikation hinzugefügt werden soll, dieselbe Sequenz auf. Somit sollte das Oligonucleotid, das an den Adapter hybridisiert werden soll, so aufgebaut und hergestellt werden, dass es nicht an die oben beschriebene Region hybridisiert, an die ein Adapterprimer hinzugefügt werden soll. Demgemäß ist, solange diese Bedingung erfüllt ist, die Region im Adapter, an die das Oligonucleotid hybridisiert werden soll, nicht speziell eingeschränkt.
(3) Amplifikation der cDNAs
Gleiche Mengen der Probe A und der Probe B, die jeweils die cDNA mit Adapter-Markierung enthielten, werden vermischt. Dann wird eine Amplifikation durchgeführt, wobei die cDNAs in diesen Proben als Matrizen verwendet werden (1 und 2). Diese Amplifikation wird beispielsweise mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt.
Als Primer werden ein Adapterprimer und ein genspezifischer Primer verwendet. Ein Adapterprimer ist ein Primer, der an die wie oben beschrieben aufgebauten Adapter hybridisieren kann. Ein genspezifischer Primer ist ein Primer, der an zumindest einen Teil der cDNA hybridisieren kann, die quantitativ bestimmt werden soll. Jeder dieser Primer weist eine Länge von 20 bis 25 Basen auf und kann beispielsweise durch chemische Synthese erhalten werden.
Die Anzahl an PCR-Zyklen und die Temperaturbedingungen usw. können je nach Anlassfall bestimmt werden.
Jedes der cDNA-Fragmente wird so amplifiziert, dass sein Mengenverhältnis erhalten bleibt. Da durch den Adapter von jedem Fragment bestimmt werden kann, ob es von Leber-mRNA oder Nieren-mRNA stammt, kann eine absolute oder relative Expressionsmenge der cDNA durch die im Folgenden beschriebene Detektion und quantitative Bestimmung aus dem Mengenverhältnis zwischen den Endprodukten bestimmt werden.
(4) Detektion und quantitative Bestimmung der amplifizierten Produkte
Nach Durchführung von PCR mit der gemischten Probe werden die amplifizierten Produkte, wenn eine Fluoreszenzmarkierung verwendet wurde, mithilfe eines Autosequenators (von Pharmacia usw.) oder eines Bildabtasters (von Molecular Dyna mics), oder, wenn ein Radioisotop verwendet wurde, mithilfe eines Densitometers detektiert.
(i) Fälle, in denen Adapter mit unterschiedlichen Längen verwendet werden
Basierend auf den durch die Detektion erhaltenen Daten wird das Mengenverhältnis zwischen den cDNAs in den beiden Proben (m₁/m₂) anhand der folgenden Formel berechnet. Der Messwert (Beobachtungswert), der durch die Detektion erhalten wird (als „a₁" bezeichnet), kann durch die folgende Formel I ausgedrückt werden: a1 = m1/m2((1 + e1)n/(1 + e2)n) (I)worin m₁ für die Menge der cDNA in Probe A steht; m₂ für die Menge der cDNA in Probe B steht; e₁ und e₂ jeweils eine Konstante von 0 bis 1 und die Amplifikationseffizienz der einzelnen cDNAs mit Adapter-Markierung für einen einzelnen Zyklus sind; und n die Anzahl der Zyklen ist.
Vorzugsweise werden die Adapter, die an die cDNAs in den beiden Proben hinzugefügt werden, untereinander ausgetauscht, wonach eine ähnliche Amplifikation und Bestimmung durchgeführt wird, um das Mengenverhältnis (m₁/m₂) zu erhalten.
Der beim zweiten Test unter Verwendung der ausgetauschten Adapter erhaltene Beobachtungswert wird als „b₁" bezeichnet und kann durch die folgende Formel II ausgedrückt werden: b1 = m1/m2 ((1 + e2)n/(1 + e1)n) (II)
Basierend auf den Formeln I und II kann das geometrische Mittel des Mengenverhältnisses m₁/m₂ durch die Formel III ausgedrückt werden: m1/m2 = (a1b1)1/2 (III)
(ii) Fälle, in denen Adapter verwendet werden, in die eine Restriktionsstelle eingeführt wurde
Auf der anderen Seite werden, wenn Adapter so aufgebaut sind, dass jeder von ihnen eine Restriktionsstelle enthält (z. B. zwei Restriktionsstellen für MluI und NotI), Proben, die jeweils die cDNA mit Adapter-Markierung enthalten, in gleichen Mengen vermischt und einer PCR unterzogen. Danach wird die cDNA in Probe A mit MluI und die cDNA in Probe B mit NotI verdaut, um so die amplifizierten DNAs zu detektieren, welche zwischen den hinzugefügten Adaptern unterscheiden. Da sich die Schnittstellen in diesen Adaptern voneinander unterscheiden, weisen die amplifizierten Fragmente unterschiedliche Längen auf. So kann das Mengenverhältnis zwischen der cDNA in Probe A und der cDNA in Probe B erhalten werden.
Kurz gesagt sind, wenn der in der PCR verwendete Adapterprimer mit einem Fluoreszenzfarbstoff, einem Radioisotop oder dergleichen markiert wurde, die resultierenden amplifizierten Produkte mit dem Fluoreszenzfarbstoff oder dem Radioisotop markiert (2, gekennzeichnet mit „✩"). Somit werden diese Fragmente, die mit einem Restriktionsenzym verdaut wurden, nicht detektiert, weil ihre markierte Stelle entfernt wurde. Folglich werden nur jene Fragment detektiert, die nicht mit dem Restriktionsenzym verdaut wurden. Durch einen Vergleich zwischen (a) dem Fragment, das als Elektrophoresebande oder als Elektropherogramm von einem Autosequenator aufscheint, wenn es mit einem Restriktionsenzym behandelt wird, und (b) dem Fragment, das als Bande oder als Elektropherogramm aufscheint, wenn es mit dem anderen Restriktionsenzym behandelt wird, kann das Mengenverhältnis zwischen den beiden cDNAs bestimmt werden. Wenn beispielsweise unter Verwendung von Adaptern, die jeweils eine MluI-Stelle und eine NotI-Stelle enthalten, eine PCR durchgeführt und die Reaktionslösung dann Elektrophorese unterzogen wurde, ist die Bande, die aufscheint, wenn die amplifizierten Produkte mit MluI behandelt wur den, die cDNA von Probe B, während die Bande, die aufscheint, wenn die amplifizierten Produkte mit MluI behandelt wurden, die cDNA von Probe A ist (2). Dann können beide Banden mithilfe eines Densitometers oder dergleichen in Zahlenwerte umgerechnet werden, wonach die in (i) beschriebenen Berechnungen folgen. So kann das Mengenverhältnis zwischen den cDNAs erhalten werden.
Auch wenn die Anzahl an Restriktionsstellen, die in die einzelnen Adapter eingeführt werden, eins beträgt, können die amplifizierten cDNAs auf ähnliche Weise detektiert werden, solange die Adapter unterschiedliche Restriktionsstellen enthalten. In diesem Fall werden die amplifizierten Produkte in zwei Teile geteilt, die jeweils mit einem der relevanten Restriktionsenzyme behandelt werden. So können Fragmente mit unterschiedlichen Länge erhalten werden. In 2 wird beispielsweise, anstelle der in dieser Figur verwendeten Adapter, ein Adapter mit einer SalI-Stelle alleine zur cDNA in Probe A (von einer Leber stammend) hinzugefügt, und ein Adapter mit einer MluI-Stelle alleine wird zur cDNA in Probe B (von einer Niere stammend) hinzugefügt. Diese Proben werden in gleichen Mengen vermischt und einer PCR unterzogen. Dann wird die Reaktionslösung in zwei Teile geteilt. Einer wird mit SalI, der andere mit MluI behandelt. So wird ein Fragment, das eine MluI-Stelle enthält (d. h. die von einer Niere stammende cDNA), im SalI-behandelten Teil detektiert und ein Fragment, das eine SalI-Stelle enthält (d. h. die von einer Leber stammende cDNA), im MluI-behandelten Teil detektiert. Aus diesen Ergebnissen kann das Expressionsmengenverhältnis zwischen den cDNAs in den beiden Proben bestimmt werden. Durch Wiederholung des gleichen Verfahrens nach Austausch der Adapter wird die von einer Leber stammende cDNA durch SalI-Behandlung und die von einer Niere stammende cDNA durch MluI-Behandlung detektiert. Danach wird auf ähnliche Weise das Expressionsmengenverhältnis zwischen den cDNAs bestimmt. Dann kann ein geometrisches Mittel dieses Verhältnisses und des vorher erhaltenen Verhältnisses berechnet werden.
(iii) Fälle, in denen Adapter mit unterschiedlichen Nucleotidsequenzen verwendet werden
Zuerst werden Oligonucleotide synthetisiert, die komplementär zu den Oligonucleotidsequenzen der einzelnen wie oben beschrieben hergestellten Adapter sind und somit spezifisch daran hybridisieren. Wie oben erläutert, ist jedes dieser Oligonucleotide so aufgebaut und synthetisiert, dass es an einen Adapter, nicht jedoch an den anderen Adapter hybridisieren kann. Diese Oligonucleotide müssen nur an einen der beiden Stränge der Adapter hybridisieren.
Danach werden die so hergestellten Oligonucleotidsequenzen markiert. Als Markierungssubstanz wird beispielsweise ein Fluoreszenzfarbstoff oder ein Radioisotop verwendet.
Nachdem zwei Proben in gleichen Mengen vermischt und PCR unterzogen wurden, werden die oben beschriebenen markierten Oligonucleotide an, die amplifizierten Produkte hinzugefügt, um eine Hybridisierung der markierten Oligonucleotide an die Sequenzen der Adapterregionen (ausgenommen die Region, an die der Adapterprimer hinzugefügt wird) zu ermöglichen. Hier wird jede der amplifizierten cDNAs mit der Adaptersequenz als doppelsträngige DNA ausgebildet. So wird die oben beschriebene Hybridisierung durchgeführt, nachdem die amplifizierten Produkte in einsträngige cDNAs übergeführt wurden. Die Denaturierung von doppelsträngiger cDNA in einsträngige cDNA kann beispielsweise durch eine Denaturierungsreaktion in einer PCR durchgeführt werden (z. B. 30 s lang bei 94°C). Die Hybridisierung kann beispielsweise durch eine Anellierungsreaktion in einer PCR durchgeführt werden (z. B. 1 min lang bei 55°C).
Es gilt jedoch anzumerken, dass der Adapterstrang, an den das oben genannte Oligonucleotid hybridisiert werden soll, an einer Festphase fixiert sein muss, um das freie, markierte Oligonucleotid nach der Hybridisierung entfernen zu können. Zur Fi xierung wird eine Kombination aus Biotin-Streptavidin oder dergleichen verwendet. In diesem Fall wird Streptavidin auf einer Festphase fixiert, und Biotin wird an den Adapterstrang gebunden, an den das Oligonucleotid hybridisiert werden soll. Durch diesen Vorgang kann ein hybridisierter Strang leicht fixiert werden.
Schließlich wird nach der Hybridisierung die Fluoreszenzintensität oder Konzentration der Markierungssubstanz bestimmt. So kann das Mengenverhältnis zwischen den cDNAs auf die gleiche Weise wie oben berechnet werden.
(5) Anwendung für molekulare Indizierung
Das Verfahren der Erfindung kann für die quantitative Bestimmung von cDNA-Fragmenten, die durch so genannte molekulare Indizierung klassifiziert wurden, verwendet werden.
Die molekulare Indizierung ist ein Verfahren zur Klassifizierung von exprimierten Genen (cDNAs) unter Verwendung spezifischer 3 Restriktionsenzyme (Restriktionsenzyme der Klasse IIS, z. B. FokI, BsmAI und BamFI) und Oligonucleotide, die an die durch die oben genannten Restriktionsenzyme gebildeten Schnittstellen ligiert werden sollen. Bei der molekularen Indizierung werden exprimierte Gene (cDNAs) in 576 Gruppen klassifiziert, und die einzelnen Fragmente werden voneinander getrennt (Kikuya Kato, „Discriminatory Representation Technique for Expressed Genes", Bio Industry 13 (6), 16–23 (1996); ungeprüfte japanische Patentveröffentlichung Nr. 8-322598; und US-Patent Nr. 5.707.807).
Bei der vorliegenden Erfindung werden zumindest zwei Proben, die jeweils ein durch molekulare Indizierung klassifiziertes Ziel-cDNA-Fragment enthalten, in gleichen Mengen vermischt und amplifiziert. Danach kann das Mengenverhältnis zwischen den cDNA-Fragmenten bestimmt werden. Durch Einführung einer oder mehrerer Restriktionsstellen in die bei der molekularen Indizierung verwendeten Oligonucleotide können die Oligonucleotide bei der vorliegenden Erfindung als Adapter verwendet werden. Dann kann eine ähnliche Amplifikationsreaktion wie oben durchgeführt werden, um das cDNA-Fragment quantitativ zu bestimmen.
Die molekulare Indizierung ist ein Verfahren, bei dem eine große Anzahl an Fragmenten durch PCR amplifiziert wird. Die Anwendung des Verfahrens gemäß vorliegender Erfindung (d. h. der kompetitiven PCR mit Adapter-Markierung (ATAC-PCR)) hierbei ist von Vorteil, weil so die Identifizierung der Fragmente, die unterschiedliche Expression aufweisen, einfach ist, auch wenn ein nichtspezifisches Reaktionsprodukt in Proben gemeinsam auftritt.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung
Nachstehend wird die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele genauer erläutert, wodurch der technische Schutzumfang der Erfindung aber keineswegs eingeschränkt werden soll.
Beispiel 1
Kompetitive PCR mit Adapter-Markierung
In diesem Beispiel wurde ein Mengenverhältnis zwischen einer cDNA, die für ein von einer Mäuseleber stammendes Apolipoprotein kodierte, und einer cDNA, die für ein von einer Mäuseniere stammendes Apolipoprotein kodierte, unter Verwendung von Mäuselebergewebe und Mäusenierengewebe bestimmt.
(1) Synthese von einsträngiger cDNA
Von einer Mäuseleber stammende Gesamt-RNA und von einer Mäuseniere stammende Gesamt-RNA wurden unabhängig voneinander durch das Guanidinisothiocyanatverfahren aus gefrorenem Mäusegewebe (Leber und Niere) hergestellt. Zu 7 μl destilliertem Wasser, das 3 μg der Gesamt-RNA enthielt, wurde ein chemisch synthetisierter biotinylierter Oligo(dT)₁₈-Primer zugesetzt und 2 bis 3 min lang auf 70°C erhitzt. Dann wurde die resultierende Lösung in eine Reaktionslösung der folgenden Zusammensetzung gegeben und 1 h lang auf 37°C gehalten:
Zusammensetzung der Reaktionslösung
(2) Synthese von doppelsträngiger cDNA
Zu jeder der in (1) erhaltenen von einer Mäuseleber und einer Mäuseniere stammenden einsträngigen cDNAs wurde eine Reaktionslösung der folgenden Zusammensetzung zugesetzt und zuerst 1 h lang bei 16°C und dann 1 h lang bei Raumtemperatur umgesetzt, um doppelsträngige cDNA separat zu synthetisieren.
Zusammensetzung der Reaktionslösung
Nach Beendigung der Reaktion wurden 3 μl 0,25 M EDTA (pH 7,5) und 2 μl 5 M NaCl zur Reaktionslösung zugesetzt, die dann Phenolextraktion und Ethanolfällung unterzogen wurde. Die resultierende cDNA wurde in 120 μl destilliertem Wasser gelöst.
(3) Verdau mit einem Restriktionsenzym
Eine Reaktionslösung der folgenden Zusammensetzung wurde 1 h lang auf 30°C gehalten:
Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionslösung 10 min lang auf 75°C erhitzt, mit 9 Volumina destilliertem Wasser verdünnt und dann in der nachstehend beschriebenen Adapteradditionsreaktion verwendet.
(4) Adapteradditionsreaktion
Als Proben wurden die von einer Mäuseleber stammende cDNA und ein Gemisch aus der von einer Mäuseleber stammenden und von einer Mäuseniere stammenden cDNA verwendet. Die Kombinationen der Proben und Adapter waren wie in der folgenden Tabelle 1 angeführt.
Tabelle 1
Als genspezifischer Primer wurde ein Apolipoprotein-A-1-spezifischer Primer verwendet. Als Adapterprimer wurde C1S (mit Cy5 markiert) verwendet. Die Sequenzen der einzelnen Primer lauteten wie folgt:
Apolipoprotein-A-1-spezifischer Primer

5'-TTATTGTAAGAAAGCCAATGCG-3' (Seq.-ID Nr. 1)

Adapterprimer C1S

5'-GTACATATTGTCGTTAGAACGC-3' (Seq.-ID Nr. 2)

Die Sequenzen der Adapter waren wie folgt:
MA-1

5'-GATCCGCGTTCTAACGACAATATGTAC-3' (+ Strang; Seq.-ID Nr. 3)
3'-GCGCAAGATTGCTGTTATACATG-5' (– Strang; Seq.-ID Nr. 4)

MA-4:

5'-GATCGAGCACTCTTAGCGTTCTAACGACAATATGTAC-3' (+ Strang; Seq.-ID Nr. 5)
3'-CTCGTGAGAATCGCAAGATTGCTGTTATACATG-5' (– Strang; Seq.-ID Nr. 6)

Eine Reaktionslösung der oben genannten Zusammensetzung wurde über Nacht auf 16°C gehalten.
(5) PCR
Zu den einzelnen Proben wurden 5 μl 5 M NaCl und 3 μl 10 mg/ml Streptavidin-beschichtete paramagnetische Kügelchen zugesetzt und 20 min stehen gelassen, so dass die Kügelchen die Probe absorbieren konnten. Danach wurden zwei Proben, die jeweils eine zu bestimmende cDNA enthielten, wie in Tabelle 1 angegeben vermischt. Dann wurden die Kügelchen mit destilliertem Wasser gewaschen und in 4 gleiche Teile geteilt, zu denen jeweils eine Reaktionslösung der folgenden Zusammensetzung zugesetzt wurde.
Für jede Reaktionslösung der oben genannten Zusammensetzung wurde eine PCR durchgeführt. Der PCR-Zyklus war wie folgt: 30–35 Denaturierungszyklen bei 94°C für 30 s, 1 min dauernde Anellierung bei 55°C und 1 min dauernde Verlängerung bei 72°C; dann 20 min dauernde Endverlängerung bei 72°C.
Nach Beendigung der Reaktion wurde eine Lösung der folgenden Zusammensetzung zugesetzt und das Ganze 1 h lang bei 37°C gehalten.
Nach einer Wärmedenaturierung des Endprodukts wurden 0,5 μl davon mit einem ALF-Express-Sequencer von Pharmacia analysiert.
Die Ergebnisse sind in 3 dargestellt. Unter Verwendung von Formel I und II wurden die Werte von a₁ und b₁ für die Probenkombinationen (a), (b), (c) und (d) aus Peakflächen berechnet. Als Ergebnisse wurden die in der folgenden Tabelle 2 enthaltenen Werte erhalten.
Tabelle 2
Die Ergebnisse von (a) und (c) in Tabelle 2 wurden durch den Austausch der Adapterprimer untereinander erhalten. Auch die Ergebnisse von (b) und (d) wurden auf ähnliche Weise erhalten. Die Angaben (a), (b), (c) und (d) in Tabelle 2 entsprechen (a), (b), (c) bzw. (d) in 3.
Aus diesen Ergebnisse wurde basierend auf Formel III das geometrische Mittel berechnet. Die Ergebnisse sind nachstehend angeführt.

i) Verhältnis (Leber-cDNA 3 μl + Nieren-cDNA 7 μl)/(Leber-cDNA 10 μl) : [(a) und (c) in Tabelle 2] m₁/m₂ = 0,35 (erwarteter Wert: 0,3)
ii) Verhältnis (Leber-cDNA 1 μl + Nieren-cDNA 9 μl)/(Leber-cDNA 10 μl) : [(b) und (d) in Tabelle 2] m₁/m₂ = 0,10 (erwarteter Wert: 0,1)

Da Apolipoproteine nur in der Leber exprimiert werden, wird erwartet, dass das Verhältnis der einzelnen Peaks dem Verhältnis von Leber-cDNA entspricht. Wie aus den oben angeführten Ergebnissen ersichtlich ist, konnten die erwarteten Werte beinahe erhalten werden.
Beispiel 2
Anwendung für molekulare Indizierung
(1) Synthese von cDNA
Die Synthese von cDNA wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei von einer Mäuseleber und von einer Mäuseniere stammende Gesamt-RNAs verwendet wurden. Anstelle des üblichen Oligo-dT-Primers wurden jedoch die folgenden Primer (so genannte „doppelt-verankerte Oligo-dT-Primer") in einem Gemisch aus gleichen Mengen verwendet. Die Menge dieses Primergemischs betrug 1,5 ml eines 10-pmol/μl-Primergemischs.
5'-GGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTA-3' (Seq.-ID Nr. 7)
5'-CAGCTGTTTTTTTTTTTTTTTTA-3' (Seq.-ID Nr. 8)
5'-CTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTA-3' (Seq.-ID Nr. 9)
(2) Verdau mit dem Klasse-IIS-Restriktionsenzym FokI
Eine Reaktionslösung der folgenden Zusammensetzung wurde 50 min bis 1 h lang bei 37°C gehalten.
(3) Adapteradditionsreaktion
Als Adapter wurden die folgenden beiden Adapter verwendet, die jeweils eine Restriktionsenzym-Erkennungsstelle enthielten.
(i) Nxyz-C1GMR
Dieser biotinylierte Adapter weist an seinem kohäsiven Ende eine Basensequenz Nxyz auf [worin N für A, G, C oder T steht (ein Gemisch aus 4 Basen); und xyz für eine der möglichen 64 Sequenzen steht, die 3 Basen bilden können] und besitzt eine Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym SalI in seiner Adaptersequenz. Die Sequenzen dieses Adapters lauten wie folgt:
5'-Biotin-GTACATATTGTCGTTAGAACGCACTCGTCGACGCG-3' (+ Strang, Seq.-ID Nr. 10)
5'-NxyzCGCGTCGACGAGTGCGTTCTAACGACAATATGTAC-3' (– Strang, Seq.-ID Nr. 11)
(ii) Nxyz-C1GSR
Dieser biotinylierter Adapter weist an seinem kohäsivem Ende und eine Basensequenz Nxyz (worin N für A, G, C oder T steht (ein Gemisch aus 4 Basen); und xyz eine der möglichen 64 Sequenzten darstellt, die 3 Basen bilden können) und eine Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym MluI in seiner Adaptersequenz auf. Die Sequenzen dieses Adapters lauten wie folgt:
5'-Biotin-GTACATATTGTCGTTAGAACGCACGCGTCTACGCG-3' (+ Strang, Seq.-ID Nr. 12)
5'-NxyzCGCGTAGACGCGTGCGTTCTAACGACAATATGTAC-3' (– Strang, Seq.-ID Nr. 13)
Unter Verwendung der oben genannten Adapter wurde in einer Reaktionslösung der folgenden Zusammensetzung eine Ligationsreaktion durchgeführt.
Destilliertes Wasser wurde zugesetzt, um 10 μl Lösung zu erhalten. Die resultierende Lösung wurde über Nacht bei 16°C gehalten.
Nach Beendigung der Ligationsreaktion wurden 40 μl destilliertes Wasser und 5 μl 10 × -T-Puffer (NEB-Puffer 4) zur Probe zugesetzt, wonach weiters 0,3 Einheiten des Restriktionsenzyms BsmFI zugesetzt wurden. Die resultierende Probe wurde 50 min lang bei 65°C gehalten.
(4) Gewinnung des Adapters mit paramagnetischen Kügelchen
Mikroröhren, in denen Kügelchen dispensiert werden sollten, wurden mit PBS 0,1% BSA beschichtet. Die Mikroröhren wurden mit 1 × -B&W-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 M NaCl, 1 mM EDTA) zwei Mal gewaschen. Streptavidin-beschichtete paramagnetische Kügelchen wurden mit 1 × -B&W-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 M NaCl, 1 mM EDTA) zwei Mal gewaschen und in einem gleichen Volumen 1 × -B&W- Puffer suspendiert. Außerdem wurde 0,1 M NaOH durch Verdünnen von 5 N NaOH hergestellt. Diese Vorgänge wurden direkt vor der Adaptergewinnung durchgeführt.
Zur Probe wurden 15 μl 5 M NaCl und 5 μl 10 mg/ml paramagnetische Kügelchen zugesetzt. Die resultierende Probe wurde 20 min unter gelegentlichem Rühren stehen gelassen.
Zwei Proben, die miteinander verglichen werden sollten, wurden vermischt und ein Mal mit 50 μl 0,1 M NaOH gewaschen. Dann wurde das Probengemisch mit 50 μl 1 × -B&W-Puffer ein Mal und mit 50 μl destilliertem Wasser zwei Mal gewaschen.
(5) Primäre PCR
Die Kügelchen, auf denen cDNA adsorbiert war, wurden in 3 gleiche Teile geteilt. Dann wurde eine PCR in einer Reaktionslösung der folgenden Zusammensetzung durchgeführt.
20 Zyklen der PCR wurden durchgeführt, wobei ein Zyklus aus einer 1-minütigen Denaturierung bei 94°C, einer 1-minütigen Anellierung bei 55°C und einer 1-minütigen Verlängerung bei 72°C bestand.
(6) Verdau mit Restriktionsenzymen
Nach Beendigung der primären PCR wurden zwei Proben von 5 μl aus der Reaktionslösung entnommen. Zu einer Probe wurden 5 μl 5 × High-Puffer, der 1 Einheit des Restriktionsenzyms MulI enthielt, zugesetzt. Zur anderen Probe wurden 5 μl 5 × High-Puffer, der 1 Einheit des Restriktionsenzyms SalI enthielt, zugesetzt. Die Proben wurden 1 h lang bei 37°C gehalten.
(7) Sekundäre PCR
Eine PCR wurde in einer Reaktionslösung der folgenden Zusammensetzung durchgeführt.
20 Zyklen der PCR wurden durchgeführt, wobei ein Zyklus aus einer 1-minütigen Denaturierung bei 94°C, einer 1-minütigen Anellierung bei 55°C und einer 1-minütigen Verlängerung bei 72°C bestand. Nach Beendigung der Reaktion wurde ein T4DPase-Gemisch der folgenden Zusammensetzung zur Reaktionslösung zugesetzt, die dann 1 h lang bei 37°C gehalten wurde.
Zusammensetzung der T4DPase-Lösung (pro Probe)
Die resultierende Lösung wurde 10 min lang auf 72°C erhitzt und dann einer Dialyse unterzogen. 2 μl des Dialysats wurden wärmedenaturiert und auf einen automatischen Sequenator von Hitachi aufgetragen.
Die Ergebnisse sind in 4 dargestellt, worin 1) ein Fluorogramm und 2) ein Elektropherogramm ist (die vertikale Achse zeigt die Fluoreszenzintensität und die horizontale Achse die Stranglänge im Laufe der Zeit). „A" in der Figur weist auf die Fluoreszenzintensität eines Zielfragments der Detektion hin. „B" in der Figur zeigt die Fluoreszenzintensität eines nichtspezifisch exprimierten Fragments, das in beiden verglichenen Proben vorhanden war. Weiters steht „a" in 4 für eine Probe, in der Nxyz-C1GMR (xyz = CTC) und Leber-cDNA ligiert wurden, und „b" für eine Probe, in der Nxyz-C1GSR (xyz = CTC) und Nieren-cDNA ligiert wurden. Diese Proben wurden vermischt und unter Verwendung eines doppelt-verankerten Primers C einer PCR unterzogen. „a" wurde mit dem Restriktionsenzym MluI verdaut und „b" mit dem Restriktionsenzym SalI. In 4 stellt „c" eine Probe dar, in der Nxyz-C1GMR (xyz = CTC) und Nieren-cDNA ligiert wurden, und „d" stellt eine Probe dar, in der Nxyz-C1GSR (xyz = CTC) und Leber-cDNA ligiert wurden. Diese Proben wurden vermischt und unter Verwendung eines doppelt-verankerten Primers C einer PCR unterzogen. „c" wurde mit dem Restriktionsenzym MluI verdaut und „d" mit dem Restriktionsenzym SalI.
Die Fluoreszenzintensität der einzelnen amplifizierten Fragmente ist in der folgenden Tabelle 3 angeführt. In dieser Tabelle wurde die Fluoreszenzintensität des Zielfrag ments mit der Fluoreszenzintensität des nichtspezifischen Fragments korrigiert, das in beiden zu vergleichenden Proben exprimiert wurde.
Tabelle 3
Da „a" und „d" von einer Leber stammende Fragmente darstellen und „b" und „c" von einer Niere stammende Fragmente darstellen, wird das Expressionsverhältnis zwischen einem Zielfragments in einer Leber und der Expression davon in einer Niere durch a/b und d/c ausgedrückt. Laut den korrigierten Werten ist a/b = 4,04 und d/c = 4,41. Somit beträgt das geometrische Mittel dieser Mengenverhältnisse 4,21. Demgemäß könnte das Verfahren der Erfindung erfolgreich für molekulare Indizierung angewandt werden, um ein Mengenverhältnis zwischen amplifizierten Produkten zu erhalten.
Wirkung der Erfindung
Gemäß vorliegender Erfindung wird ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Expression eines Gens bereitgestellt. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist vor allem zur Handhabung einer großen Anzahl an Proben, wie beispielsweise klinischen Proben, oder zur quantitativen Bestimmung einer großen Anzahl an Genen geeignet.

Claims

Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Expression eines Gens, umfassend das Bereitstellen von zumindest zwei Proben, die jeweils cDNA für das Gen enthalten, das Hinzufügen eines Oligonucleotidadapters zur cDNA, die in jeder Probe enthalten ist, worin die Adaptersequenz für jede Probe unterschiedlich ist, das Vermischen gleicher Mengen der Proben, die jeweils die cDNA mit Adapter-Markierung enthalten, sowie das Amplifizieren der resultierenden cDNAs und das Berechnen eines Mengenverhältnisses zwischen den amplifizierten Produkten.
Verfahren nach Anspruch 1, worin sich die Adapter voneinander in der Länge unterscheiden.
Verfahren nach Anspruch 1, worin einer der Adapter eine Restriktionsstelle enthält, die im anderen Adapter nicht enthalten ist.
Verfahren nach Anspruch 3, worin jeder der Adapter eine Restriktionsstelle enthält, die im anderen Adapter nicht enthalten ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin einer der Adapter zur Hybridisierung an eine Oligonucleotidsonde fähig ist, die nicht an den anderen Adapter hybridisieren kann.