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Hintergrund der Erfindung
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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Hybridisierungsnachweisverfahren
zur Analyse der Anwesenheit oder Abwesenheit einer interessierenden
Sequenz in einer Biopolymerprobe unter Verwendung der Hybridisierung
zwischen dem Probenbiopolymer und einem Sondenbiopolymer und betrifft
ebenso einen Biochip, der für
das Verfahren angewendet werden kann.
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Hintergrund
der Erfindung
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Bisher
sind zum Nachweis oder der Fraktionierung eines Moleküls im lebenden
Körper,
insbesondere zum Nachweis von interessierender DNA oder zum Nachweis
der Anwesenheit oder Abwesenheit einer genomischen DNA, oft Hybridisierungsverfahren
verwendet worden, die eine Nukleinsäure oder Protein mit einer
bekannten Sequenz als eine Sonde verwenden. In solchen Hybridisierungsverfahren
wird eine Proben-DNA, die mit einem fluoreszierenden Material markiert
ist, an eine Sonden-DNA hybridisiert, die auf einem Substrat immobilisiert
ist. Wenn die Proben-DNA and die Sonden-DNA gebunden ist, wird die
Proben-DNA wiederum auf dem Substrat zusammen mit der Sonden-DNA
immobilisiert. Das an die Proben-DNA
angehängte
fluoreszierende Material wird zur Fluoreszenz angeregt durch Bestrahlung
mit Anregungslicht aus einer Lichtquelle, um Fluoreszenz zu emittieren,
und die Fluoreszenz wird dann nachgewiesen. Auf diese Weise kann
die Hybridisierung zwischen der Proben-DNA und Sonden-DNA nachgewiesen werden.
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Das
Prinzip des Hybridisierungsnachweisverfahren nach dem Stand der
Technik, wie oben beschrieben, wird in 7, 8 und 9 veranschaulicht.
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Wie
in 7 veranschaulicht, wird eine gegebene Menge einer
Sonden-DNA 1a auf einem Substrat immobilisiert (z.B. einer
Glasplatte) 4 als ein Flecken („spot") 3a. Andere Sonden-DNAs 1b, 1c,
... werden ebenso auf dem Substrat 4 als Flecken 3b, bzw. 3c,
... immobilisiert. In diesem Fall ist es jedoch unmöglich, die
gesamten Sonden-DNAs in gleichen Mengen auf den jeweiligen Flecken
zu immobilisieren.
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Wie
in 8A veranschaulicht, wird jede der Proben-DNAs 5a, 5b, 5c mit
einem fluoreszierenden Material 6 markiert. Wie in 8B gezeigt,
wird das Substrat 4, das mit Flecken der Sonden-DNAs 5a, 5b, 5c,
... versehen ist, in eine Hybridisierungslösung 7 gebracht, und
dann werden die fluoreszierend markierten Proben-DNAs 5a, 5b, 5c,
... hinzugegeben, um Hybridisierung zwischen den Sonden-DNAs und den
Proben-DNAs zu bewirken. Die Hybridisierungslösung 7 ist eine gemischte
Lösung,
umfassend z.B. Formaldehyd, SSC (Natriumchlorid/Trinatriumcitrat), SDS
(Natriumdodecylsulfat), EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), destilliertes
Wasser und ähnliches, in
der das Mischungsverhältnis
zwischen den Bestandteilen abhängig
von der Natur der verwendeten DNAs variieren kann.
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Wie
in 8C gezeigt, wird, wenn irgendeine der Proben-DNAs
zu irgendeiner der Sonden-DNAs
komplementär
ist, die Proben-DNA an die Sonden-DNA hybridisiert, um eine doppelsträngige Struktur
zu bilden (siehe die Darstellung für die Sonden-DNAs 1a und 1b).
Wenn nicht, bleibt die Proben-DNA ungebunden (siehe die Darstellung
für die Sonden-DNA 1c).
Wie in 9 veranschaulicht, kann der Nachweis der Hybridisierung
durchgeführt werden
durch Bestrahlen des Substrats 4 mit Anregungslicht von
einer Lampe 9 (d.h. einer Anregungslichtquelle), um das
fluoreszierende Material 6 anzuregen, durch Herausnehmen
des Lichts mit Wellenlängen,
die außerhalb
des Emissionswellenlängenbereichs
des fluoreszierenden Materials liegen, mit einem optischen Filter 10,
und dann durch Nachweis des Lichts, das von jedem Flecken emittiert
wird, mit einem zweidimensionalen Photosensor 8 (z.B. einer CCD-Kamera).
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In
diesem Falle ist das fluoreszierende Material 6 in den
Flecken, in denen Hybridisierung stattfindet (z.B. Flecken 3a und 3b)
vorhanden, und deshalb kann eine Fluoreszenzemission durch Anregen
des fluoreszierenden Materials 6 durch Bestrahlung mit Anregungslicht
von der Lampe 9 nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu
ist in den Flecken, an denen keine Hybridisierung stattfindet (z.B.
Fleck 3c), kein fluoreszierendes Material 6 vorhanden,
und deshalb wird keine Fluoreszenzemission mittels Bestrahlung mit
Anregungslicht von der Lampe 8 beobachtet. Auf diese Weise
wird ein heller oder dunkler Fleck abhängig von der Anwesenheit oder
Abwesenheit des Hybridisierungsereignisses beobachtet. Die mittels
des zweidimensionalen Photosensors 8 nachgewiesenen Bilddaten
werden auf einen Computer 13 über ein Steuergerät 12 übertragen
und auf einer Anzeige dargestellt.
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Jedoch
ist es bei diesem Verfahren nach der Immobilisierung von Sonden-DNAs
an ein Substrat unmöglich,
alle Sonden-DNAs auf dem Substrat in uniformer Weise oder in gleichen
Mengen in Flecken aufzutragen, was zu einer unerwünschten
Variation hinsichtlich der Menge an Sonden-DNA zwischen den Flecken
mit einer größeren Menge
an Sonden-DNA und den Flecken mit einer kleineren Menge an Sonden-DNA
führt.
Deshalb ist beim Nachweis der Hybridisierung, obwohl die Anwesenheit
des Hybridisierungsereignisses zwischen den Proben-DNAs und den
Sonden-DNAs nachgewiesen werden kann, es unmöglich, quantitativ die Menge
einer jeden Proben-DNA zu bestimmen, die an eine beliebige der Sonden-DNAs
hybridisiert ist, relativ zu der Menge der Sonden-DNA.
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WO
00/34523 offenbart Polynukleotid-Arrays und Verfahren zum Herstellen
und Verwenden derselben, wobei nicht-markierte Tracer verwendet,
um räumlich
adressierbare Anordnungen von immobilisierten Molekülen zu erzeugen,
insbesondere Polynukleotiden, die im Hinblick auf Unterschiede hinsichtlich
Immobilisierungseffizienzen an verschiedenen Adressen in dem Array
normalisiert werden können.
Gemäß WO 00/34523
werden die Hintergrundsignale, die von einem Array von räumlich adressierbaren
immobilisierten Molekülen
erzeugt werden, quantifiziert und aufgezeichnet. Der Array wird
dann mit einem Zielmolekül
in Kontakt gebracht, das in der Lage ist, mit wenigstens einem der
immobilisierten Moleküle
zu Wechselwirken. Das Zielmolekül
wird auf eine Weise markiert, um eine Assay-Signal zu erzeugen,
oder die Wechselwirkung zwischen dem Ziel und dem immobilisierten
Molekül
ist dergestalt, daß nur
diejenigen Flecken auf dem Array, an denen eine Wechselwirkung stattgefunden
hat, ein nachweisbares Assay-Signal erzeugen. Die Intensität der Signale
von den jeweiligen Flecken wird dann normalisiert, typischerweise
durch Erhalt des Verhältnisses
Ia/Ib, wobei Ia die Assaysignalintensität ist und Ib die
Hintergrundsignalintensität
ist, um Signalunterschiede zu berücksichtigen, die durch Abweichungen
hinsichtlich der Mengen von immobilisierten Molekülen verursacht
werden. Das Verfahren bietet kein direktes Maß für die Komplementarität zwischen
einer immobilisierten Sonde und einem Ziel.
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Guo
et al (1994), Nucleic Acids Research, 22:5456–5465, offenbart ein Verfahren
zur Analyse von genetischen Polymorphismen unter Verwendung von
Allel-spezifischen Olignukleotid-Arrays,
die an Glasträger
gebunden sind. Im ersten Schritt werden Oligonukleotide radioaktiv
end-markiert und werden auf derivatisierte Glasträger aufgetragen.
Eine Immobilisierung von Oligonukleotiden wird durch Flüssigszintillationszählung quantifiziert.
In einem getrennten Schritt wird derselbe Array erzeugt, unter den
selben Bedingungen, mit der Ausnahme, daß die immobilisierten Oligonukleotide
nicht radioaktiv markiert sind. Stattdessen werden markierte Zielnukleinsäuren aufgetragen,
und die gebundene Radioaktivität
wird als ein Hybridisierungssignal gemessen. Kein quantitatives
Maß wird
gegeben, das unabhängig
von der Menge an Oligonukleotidsonden ist, die auf dem Substrat
immobilisiert sind.
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Beattie
et al (1995), Molecular Biotechnology, 4:213–225, beschreibt eine Hybridisierung
von DNA-Zielmolekülen
an Glas-gebundene Oligonukleotidsonden. Wiederum werden radioaktiv
markierte Sonden auf Glas-Objektträger immobilisiert, und dann
wird die Immobilisierungsdichte anhand der gebundenen Radioaktivität abgeschätzt. Danach
wird die Fähigkeit
von identischen nicht-markierten Sonden-Arrays beurteilt, mit markierten
Zielsträngen
zu hybridisieren. Wiederum wird kein quantitatives Maß gegeben,
das unabhängig
von der Menge an immobilisierten Sondenmolekülen ist.
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Kurzer Abriß der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung ist zur Verbesserung der oben erwähnten Nachteile
der Verfahren nach dem Stand der Technik gemacht worden. Entsprechend
ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Nachweisverfahren
bereitzustellen, das quantitativ den Grad an Hybridisierung zwischen
einer Sonden-DNA und einer Proben-DNA bestimmen kann.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung werden, um die oben erwähnte Aufgabe zu lösen, ein
Sonden-Biopolymer und ein Proben-Biopolymer mit verschiedenen fluoreszierenden
Materialien markiert, so daß das
Sonden-Biopolymer und das Proben-Biopolymer, die auf Flecken vorhanden
sind, welche auf einem Substrat aufgetragen worden sind, separat
für jeden
Flecken unter Verwendung des Unterschieds der Emissionswellenlänge der
fluoreszierenden Materialien nachgewiesen werden können. Beim
Nachweis der Hybridisierung zwischen dem Sonden-Bioplymer und dem
Proben-Biopolymer werden die Emissionswellenlänge des fluoreszierenden Materials, das
das Sonden-Biopolymer markiert, und die Emissionswellenlänge des
fluoreszierenden Materials, das das Proben-Biopolymer markiert,
separat nachgewiesen, so daß es
möglich
wird, getrennt und deshalb quantitativ die Menge des Sonden-Biopolymers und
die Menge des Proben-Biopolymers zu bestimmen, die an das Sonden-Biopolymer
für jeden
Fleck hybridisiert sind.
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Insbesondere
läßt man ein
fluoreszierendes Material, das ein Sonden-Biopolymer markiert hat, Fluoreszenz
emittieren, um die Menge des Sonden-Biopolymers zu bestimmen, das
auf einem Flecken immobilisiert ist, welcher auf einem Substrat aufgetragen
wurde (z.B. einer Glasplatte). Ein anderer Typ an fluoreszierendem
Material, der ein Proben-Biopolymer markiert hat, läßt man ebenfalls
Fluoreszenz emittieren, um die Menge an Proben-Biopolymer zu bestimmen,
die an das Sonden-Biopolymer hybridisiert ist. Dann wird der Unterschied
zwischen der Menge an Sonden-Biopolymer und der Menge an Proben-Biopolymer
normalisiert mit der Menge des Sonden-Biopolymers. Basierend auf
dem normalisierten Wert kann die Menge des Proben-Biopolymers relativ
zu der Menge an auf dem Substrat in Flecken aufgetragenen Sonden-Biopolymer
bestimmt werden. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Biopolymer" auf jegliches polymeres
Material, das einen lebenden Körper
ausmacht, wie etwa DNA, RNA und Protein.
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Das
heißt,
ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Hybridisierungsnachweisverfahren
zum Nachweis der Hybridisierung zwischen einem Sonden-Biopolymer
und einem Proben-Biopolymer,
wobei das Sonden-Biopolymer auf einem Träger immobilisiert ist, das
Proben-Biopolymer
und das Sonden-Biopolymer markiert sind, wobei das Verfahren den
Nachweis von sowohl der Menge des Sonden-Biopolymers als auch der
Menge des Proben-Biopolymers,
das an das Sonden-Biopoylmer gebunden ist, umfaßt, wobei das Verfahren weiterhin
den Nachweis eines Wertes umfaßt,
der durch Normalisieren der Differenz zwischen der Menge des Sonden-Biopolymers
und der Menge des Proben-Biopolymers, das an das Sonden-Biopoylmer
gebunden ist, mit der Menge des Sonden-Biopolymers erzeugt worden
ist. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Sonde" auf jegliches Biopolymer,
das auf einem Substrat immobilisiert werden soll, wie etwa DNA,
und der Begriff „Probe" bezieht sich auf
jegliches Biopolymer, das an die Sonde hybridisiert werden soll,
wie etwa DNA.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Hybridisierungsnachweisverfahren
zum Nachweis der Hybridisierung zwischen einer Sonde und einer Probe,
das den Nachweis eines Wertes umfaßt, der durch Normalisieren
der Differenz zwischen der Menge der Sonde und der Menge der Probe,
gebunden an die Sonde, mit der Menge der Sonde erzeugt worden ist.
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Beim
Nachweis der Mengen der Sonde und der Probe, die an die Sonde gebunden
ist, kann die Menge der Sonde vor der Hybridisierung nachgewiesen
werden, während
die Menge der Probe, die an die Sonde gebunden ist, nach Abschluß der Hybridisierung
nachgewiesen werden kann. Alternativ können sowohl die Mengen der
Sonde als auch der Probe, gebunden an die Sonde, nach Abschluß der Hybridisierung
nachgewiesen werden.
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Der
Nachweis der Mengen der Sonde und der Probe, gebunden an die Sonde,
kann mittels Markierung der Sonde und der Probe mit verschiedenen Markierungsmaterialien
und dann durch getrennten Nachweis der Markierungsmaterialien erfolgen.
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Ein
Wert, der durch Normalisieren der Differenz zwischen der Menge der
Sonde und der Menge der Probe, gebunden an die Sonde, mit der Menge der
Sonde erzeugt worden ist, kann auf einer Anzeige dargestellt werden.
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In
einer Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird die Sonde auf einem Träger immobilisiert.
In noch einer bevorzugteren Ausführungsform
ist der Träger,
umfassend die Sonde, ein Biochip.
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Ein
noch weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ist ein Biochip,
umfassend eine fluoreszierend markierte Sonde, die auf einem Substrat in
Flecken aufgetragen wird („spotted") ist.
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Die
Menge der auf ein Substrat immobilisierten Sonde kann für jede Sonde
und jedes Substrat unterschiedlich sein.
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Für ein leichtes
Verständnis
der vorliegenden Erfindung wird ein Beispiel, in dem zwei Biochips 1 und 2 mit
dem selben Typ an darauf immobilisierter Sonde und verschiedene
Proben A und B verwendet werden, unten beschrieben, indem sowohl
die Proben als auch die Sonden, die verwendet werden, DNAs sind.
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Es
wird von folgendem ausgegangen: Ein Biochip 1 hat 10 ng
einer darauf immobilisierten Sonde, während ein Biochip 2 8
ng des selben Typs an darauf immobilisierter Sonde hat. Die Fluoreszenzintensitäten der
Sonde vor der Hybridisierung sind 100 für den Biochip 1 und
80 für
den Biochip 2 hinsichtlich einer 256-stufigen Abstufung;
und wenn die Proben A und B an die Sonde auf dem Biochip 1 bzw. 2 hybridisiert
sind, betragen die Fluoreszenzintensitäten der Proben 70 für den Biochip 1 (Probe
A) und 60 für
den Biochip 1 (Probe B). Aus diesem Ergebnis würde vermutet
werden, daß die
Menge an DNA der Probe A, die an die Sonde hybridisiert ist, größer als
die Menge der an die Sonde hybridisierten Probe B ist. Jedoch kann
bei einem Vergleich mit dem Verhältnis der
DNA-Menge der an die Sonde hybridisierten Probe relativ zu der DNA-Menge
der Sonde zwischen den Proben A und B gemäß dem Verfahren der vorliegenden
Erfindung festgestellt werden, daß die Probe A an die Sonde
tatsächlich
in einem geringeren Verhältnis
als die Probe B hybridisiert ist. Das heißt, für die Proben A und B kann das
Verhältnis
der DNA-Menge einer jeden an die Sonde hybridisierten Probe berechnet
werden durch Bestimmung der Differenz zwischen der DNA-Menge der
Sonde, die anfänglich
auf jeden Biochip immobilisiert ist, und der DNA-Menge der Probe,
gebunden an die Sonde, und dann durch Normalisieren der erhaltenen
Differenz mit der DNA-Menge der Sonde, wie folgt: Probe
A: (100 – 70) ÷ 100 =
0,3; und Probe B: (80 – 60) ÷ 80 = 0,25.
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Entsprechend
ermöglicht
das Verfahren der vorliegenden Erfindung eine genauere Analyse der Hybridisierung
im Vergleich mit den Verfahren nach dem Stand der Technik, bei denen
die Hybridisierung nur basierend auf der Fluoreszenzintensität einer Probe
nach der Hybridisierung analysiert wird.
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Diese
Beschreibung enthält
einen Teil oder den gesamten Inhalt der Offenbarung der Beschreibungen
und/oder Zeichnungen der japanischen Anmeldungen Nr. 10-355956 und
11-328352, die Prioritätsdokumente
der vorliegenden Anmeldung sind.
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Die
obigen und andere Aspekte, Wirkungen, Merkmale und Vorteile der
vorliegenden Erfindung werden anhand der folgenden Beschreibung
der Ausführungsformen
davon offensichtlicher werden im Zusammenhang mit den begleitenden
Zeichnungen.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 veranschaulicht
das Prinzip einer Ausführungsform
des Hybridisierungsnachweisverfahrens in Übereinstimmung mit der vorliegenden
Erfindung.
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2A, 2B und 2C veranschaulichen
ebenfalls das Prinzip der Ausführungsform
des Hybridisierungsnachweisverfahrens in Übereinstimmung mit der vorliegenden
Erfindung.
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3 veranschaulicht
ebenfalls das Prinzip der Ausführungsform
des Hybridisierungsnachweisverfahrens in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung.
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4 ist
ein Flussdiagramm der Verarbeitungsschritte zum Bereitstellen eines
errechneten Werts zur Hybridisierung einer Probe an eine Sonde in
dem Hybridisierungsnachweisverfahren in Übereinstimmung mit der vorliegenden
Erfindung.
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5A und 5B veranschaulichen
das Prinzip einer anderen Ausführungsform
des Hybridisierungsnachweisverfahrens in Übereinstimmung mit der vorliegenden
Erfindung.
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6A und 6B veranschaulichen
ebenso das Prinzip einer anderen Ausführungsform des Hybridisierungsnachweisverfahrens
in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung.
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7 veranschaulicht
das Prinzip einer Ausführungsform
des Hybridisierungsnachweisverfahrens in Übereinstimmung mit dem Stand
der Technik.
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8A, 8B und 8C veranschaulichen
ebenfalls das Prinzip der Ausführungsform
des Hybridisierungsnachweisverfahrens gemäß dem Stand der Technik.
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9 veranschaulicht
ebenfalls das Prinzip der Ausführungsform
des Hybridisierungsnachweisverfahrens gemäß dem Stand der Technik.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung wird hiernach im Einzelnen beispielhaft unter
Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben werden. In den unten
beschriebenen Ausführungsformen
sind sowohl Sonden-Biopolymere als auch Proben-Biopolymere DNAs.
Es wird jedoch von Fachleuten verstanden werden, daß andere
Biopolymere, wie etwa RNAs und Proteine, ebenso in der vorliegenden
Erfindung anwendbar sind.
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1 bis 3 veranschaulichen
das Prinzip einer Ausführungsform
des Hybridisierungsnachweisverfahrens in Übereinstimmung mit der vorliegenden
Erfindung. Wie in 1 gezeigt, werden jede der Sonden-DNAs 1a, 1b, 1c ...
mit dem selben fluoreszierenden Material 2 markiert. Als
fluoreszierendes Material 2 kann z.B. Fluoresceinisothiocyanat (FITC)
verwen det werden. Die Sonden-DNA 1a ist auf eine Glasplatte
(Substrat) 4 als ein Flecken 3a immobilisiert.
Andere Sonden-DNAs 1b, 1c, ... sind ebenso auf
die Glasplatte 4 als Flecken 3b, 3c,
... jeweils immobilisiert.
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Wie
in 2A gezeigt, wird jede der Proben-DNAs 5a, 5b, 5c,
... mit einem anderen Typ fluoreszierendem Material 6 markiert.
Als fluoreszierendes Material 6 kann z.B. Cy5 verwendet
werden. Nach der Hybridisierung zwischen den Sonden-DNAs und den
Proben-DNAs, wie in 2B gezeigt, wird die Glasplatte 4,
auf die die Sonden-DNAs in Flecken aufgetragen („spotted") sind (siehe 1), in eine
Hybridisierungslösung 7 gebracht, und
die fluoreszierend markierten Proben-DNAs werden dazu gegeben. Die
Hybridisierungslösung 7 ist eine
gemischte Lösung,
umfassend z.B. Formaldehyd, SSC (Natriumchlorid/Trinatriumcitrat),
SDS (Natriumdodecylsulfat), EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) und
destilliertes Wasser, in der der Anteil der Bestandteile variieren
kann, abhängig
von der Natur der verwendeten Sonden-DNAs und Proben-DNAs.
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Wenn
irgendeine der Proben-DNAs zu irgendeiner der Sonden-DNAs komplementär ist, wird die
Proben-DNA an die Sonden-DNA hybridisiert, um eine doppelsträngige Struktur
zu bilden, wie in 2C veranschaulicht (siehe die
Darstellung für
die Proben-DNAs 5a und 5b und die Sonden-DNAs 1a und 1b).
Im Gegensatz dazu bleibt, wenn irgendeine der Proben-DNAs nicht komplementär zu irgendeiner der
Sonden-DNAs ist, die Proben-DNA ungebunden, wie in 2C veranschaulicht
(siehe die Darstellung für
die Sonden-DNA 1c). Das heißt, in den Flecken, in denen
die Hybridisierung stattfindet (z.B. Flecken 3a und 3b)
liegen sowohl das fluoreszierende Material 2, das die Sonden-DNAs
markiert, als auch das fluoreszierende Material 6, das
die Proben-DNAs markiert, individuell gebunden an die Sonden-DNAs, vor. Im Gegensatz
dazu ist an den Flecken, an denen keine Hybridisierung stattfindet
(z.B. 3c), nur das fluoreszierende Material 2 vorhanden,
das die Sonden-DNAs markiert.
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Der
Nachweis der Hybridisierung kann auf die folgende Weise durchgeführt werden,
wie in 3 veranschaulicht. Das fluoreszierende Material 6,
das die Proben-DNAs markiert, und das fluoreszierende Material 2,
das die Sonden-DNAs markiert, werden durch Bestrahlung mit Anregungslicht
aus einer Lampe 9 angeregt, um Fluoreszenz zu emittieren.
Die als eine Anregungslichtquelle verwendete Lampe 9 kann
z.B. eine Xenonlampe mit einem Emissionswellenlängenbereich von ungefähr 300–700 nm
sein. Der Grund, warum eine solche Lampe verwendet wird, ist, daß sie die
Fluoreszenzemission von sowohl FITC (Anregungs wellenlänge: 490
nm, Emissionswellenlänge:
520 nm) als auch Cy5 (Anregungswellenlänge: 650 nm, Emissionswellenlänge: 667
nm) bewirken kann. Beim Nachweis der Fluoreszenz wird die Emission
von FITC und Cy5 unter Verwendung eines zweidimensionalen Photosensor 8 durch
einen optischen Filter 10 mit einer Transmissionswellenlänge von
520 nm für
FITC und durch einen anderen optischen Filter 11 mit einer Transmissionswellenlänge von
667 nm für
Cy5 abgelesen. Die Daten aus dem zweidimensionalen Photosensor werden
auf einen Computer über
ein Steuergerät 12 übertragen.
Der zweidimensionale Photosensor 8 kann zum Beispiel eine
CCD-Kamera sein. Die optischen Filter 10 und 11 können in
der Richtung des Pfeils durch Antreiben eines Tisches 14 bewegt werden
und sind gegeneinander austauschbar.
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Im
Computer 13 wird die Menge jeder Sonden-DNA für jeden
Flecken, basierend auf dem Emissionswert von FITC, berechnet, und
dann wird die Menge der Proben-DNA, die an die Sonden-DNA hybridisiert
ist, für
jeden Flecken, basierend auf dem Emissionswert von Cy5, berechnet.
Die Emissionsmenge Ai von FITC wird durch die Emissionsmenge Bi
von Cy5 verringert, und die resultierende Differenz wird dann durch
die Emissionsmenge Ai von FITC geteilt, wodurch ein Wert Ci [Ci
= (Ai – Bi)/Ai]
bereitgestellt wird. Auf diese Weise kann die Menge an Proben-DNA,
hybridisiert an eine Sonden-DNA, relativ zu der Menge der Sonden-DNA mit einer hohen Präzision bestimmt
werden.
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Ein
größerer Ci-Wert
[Ci = (Ai – Bi)/Ai]
bedeutet, daß die
Menge einer an eine Sonden-DNA hybridisierten Proben-DNA geringer
ist. In Gegensatz dazu bedeutet ein kleinerer Ci-Wert, daß die Menge einer
an eine Sonden-DNA hybridisierte Proben-DNA größer ist, was ebenfalls bedeutet,
daß die
Proben-DNA in höhere
Komplementarität
zu der Sonden-DNA hat. In der vorliegenden Erfindung ist der Grund,
warum ein Wert Ci [Ci = (Ai – Bi)/Ai]
für die
Bewertung des Verhältnisses
der Hybridisierung verwendet wird, der, daß die Verwendung der Verringerung
der Menge an Proben-DNA von der Menge der Sonden-DNA den Vergleich
zwischen beiden Mengen leichter macht. Dies ist deshalb so, weil
die Menge einer Sonden-DNA,
die auf einem Substrat immobilisiert ist, immer größer als
die Menge an Proben-DNA ist, die an die Sonden-DNA in einer beliebigen
Situation hybridisiert ist.
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4 ist
ein Flußdiagramm
der Verarbeitungsschritte zum Bereitstellen eines Wertes Ci. Im Schritt 11 wird
die Positionszahl eines für
den Wert zu berechnenden Fleckens im Voraus eingestellt. In Schritt 12 werden
sowohl die Emissionsmenge Ai von FITC als auch die Emis sionsmenge
Bi von Cy5 für
einen Flecken i bestimmt. In Schritt 13 wird ein Wert Ci [Ci
= (Ai – Bi)/Ai]
berechnet durch Dividieren der Differenz zwischen Ai und Bi mit
Ai. Der so erhaltene Wert Ci stellt die Menge der Sonden-DNA dar,
die mit keiner Proben-DNA hybridisiert ist. Basierend auf dem Wert
kann der Grad der Komplementarität
zwischen der Proben-DNA und der Sonden-DNA beurteilt werden. In
Schritt 14 wird der erhaltene Wert Ci auf einer Anzeige
des Computers 13 als ein Schattierungsbild („tone image") angezeigt. Auf
der Anzeige wird ein größerer Ci-Wert
heller dargestellt, während ein
geringerer Ci-Wert dunkler dargestellt wird, oder umgekehrt (wie
ein positiver Film). In Schritt 15 wird überprüft, ob die
Verarbeitung aller zu untersuchenden Flecken abgeschlossen ist.
Wenn dies nicht der Fall ist, wird die Positionszahl eines im nächsten Schritt
zu verarbeitenden Fleckens in Schritt 16 bestimmt, und
die Prozedur von Schritt 12 bis Schritt 15 werden
wiederholt. Wenn die Berechnung für alle zu untersuchenden Flecken
abgeschlossen ist, endet der Prozeß.
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5 und 6 veranschaulichen
das Prinzip einer anderen Ausführungsform
des Nachweisverfahrens in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung. Das Nachweisverfahren dieser Ausführungsform
beinhaltet den Schritt des Ablesens einer Emissionsmenge eines fluoreszirenden
Materials (z.B. FITC), das eine Sonden-DNA markiert, was der Menge
einer Sonden-DNA
entspricht, vor der Hybridisierung; das Ablesen einer Emissionsmenge
eines anderen fluoreszierenden Materials (z.B. Cy5), das eine Proben-DNA
markiert, was der Menge einer Proben-DNA entspricht, nach Abschluß der Hybridisierung;
und dann Bestimmen eines Wertes, wie oben beschrieben.
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Wie
in 5A veranschaulicht, werden Sonden-DNAs, von denen
jede mit einem fluoreszierenden Material FITC markiert ist, auf
eine Glasplatte (ein Substrat) 4 als Flecken 3a, 3b, 3c,
... immobilisiert. Die Immobilisierung der Sonden-DNAs kann auf
die selbe Weise durchgeführt
werden, wie in 1 veranschaulicht. Vor der Hybridisierung,
wie in 5B veranschaulicht, wird FITC,
das jede Sonden-DNA markiert, durch Bestrahlung mit Anregungslicht
angeregt, um Fluoreszenz zu emittieren, und die Emissionsmenge an
FITC wird mit einem zweidimensionalen Photosensor 8 abgelesen,
wodurch die Menge einer jeden Sonden-DNA, die für jeden Fleck vorhanden ist,
bestimmt wird. In diesem Fall befindet sich ein optischer Filter 10 mit
einer Transmissionswellenlänge
von 520 nm im Strahlengang des Photosensors 8. Das Ablesen
der Emissionsmenge kann auf die selbe Weise durchgeführt werden,
wie für
FITC in 3 oben veranschaulicht. Die
Emissionsmenge Ai für
jeden Flecken wird in einem Speichermedium 14 (z.B. einer
Floppy-Disk) gespeichert.
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Wie
in 6A veranschaulicht, kann die Hybridisierung zwischen
Proben-DNAs 5a, 5b, ... von denen jede mit einem
fluoreszierenden Material Cy5 6 markiert ist, und den Sonden-DNAs auf die selbe Weise
durchgeführt
werden, wie in 2B oben veranschaulicht. Der
Nachweis der Hybridisierung kann durchgeführt werden wie in 6B veranschaulicht, durch
Bestrahlen der Glasplatte 4 mit Anregungslicht aus der
Lampe 9, um eine Emission von Fluoreszenz von Cy5 zu bewirken,
und durch Ablesen der Emissionsmenge Bi von Cy5 mit dem zweidimensionalen Photosensor 8.
In diesem Falle befindet sich ein anderer optischer Filter 11 mit
einer Transmissionswellenlänge
von 667 nm im Strahlengang des Photosensors 8. Das Ablesen
der Emissionsmenge kann auf die selbe Weise durchgeführt werden,
wie für
Cy5 in 3 oben veranschaulicht. Die Emissionsmenge Ai von
FITC, die in dem Speichermedium 14 gespeichert wird, wird
dann in den Computer 12 eingegeben, und die Differenz zwischen
der Emissionsmenge Ai von FITC und der Emissionsmenge Bi von Cy5 wird
bestimmt. Jeder der bestimmten Differenzwerte wird durch die Emissionsmenge
Ai von FITC dividiert. Die Bestimmung der Differenz kann auf die
selbe Weise durchgeführt
werden, wie in 3 oben veranschaulicht. Das
Verfahren dieser Ausführungsform ermöglicht ebenso,
die Mengen einer Proben-DNA, die an eine Sonden-DNA hybridisiert
sind, quantitativ zu bestimmen.
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Gemäß dem Verfahren
dieser Ausführungsform
kann man wissen, welche Menge einer Sonden-DNA auf einem Substrat
immobilisiert sind, und deshalb kann man ebenfalls wissen, welche
Menge einer Proben-DNA zur Hybridisierung zugegeben werden soll,
die Lage von nicht-reaktiven Flecken, wo jegliche Sonden-DNA nicht
immobilisieren kann, und ähnliches,
bevor die Hybridisierung durchgeführt wird. Daher ermöglicht das
Verfahren die Durchführung
eines Hybridisierungsexperiments mit einer hohen Effizienz auf Grund
seiner Fähigkeit,
sich mit solchen Problemen vor dem Experiment zu beschäftigen.
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Wie
oben bemerkt, wird es gemäß der vorliegenden
Erfindung möglich,
die Menge einer Sonde, die auf einem Substrat in Flecken aufgetragen
ist, und die Menge einer Probe, die an die Sonde hybridisiert ist,
zu bestimmen; die genaue Menge der an die Sonde hybridisierten Probe
zu berechnen (d.h. den Grad der Komplementarität) durch Bestimmen eines Wertes,
der erzeugt wird durch Normalisieren der Differenz zwischen der
Menge der Sonde und der Menge der Probe mit der Menge der Sonde;
und deshalb die Menge der an die Sonde gebundenen Probe mit einer
hohen Genauigkeit zu bestimmen.