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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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1. Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Verbessern der
Unterscheidung eines Einzelbasen-Mismatches unter Verwendung einer "Hurdle" (Basis)-DNA und
einer Sonde mit künstlichem
Mismatch.
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2. Beschreibung des Standes
der Technik
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Ein übliches
Verfahren zum Nachweis einer Variation in einer Nukleinsäure-Sequenz
hängt von
dem spezifischen Erkennen eines komplementären Nukleinsäure-Zielstranges
durch einen Oligonukleotid-Strang ab. Wenn die Sonde und das Ziel
(Target) nicht identisch sind, ist die Affinität der beiden Stränge füreinander reduziert.
Die reduzierte Affinität
zeigt sich durch eine Abnahme in der Duplex-Thermostabilität, die üblicherweise
verfolgt werden kann durch Messung der Duplex-Schmelztemperatur
(Tm). Der Unterschied in Duplex-Schmelztemperaturen
(ΔTm) zwischen,
auf der einen Seite, einer perfekt passenden Sonde mit einem ersten
Ziel und, auf der anderen Seite, der gleichen Sonde mit einem zweiten
Ziel, das von dem ersten Ziel um ein Nukleotid unterschiedlich ist,
hat sich als bedeutsam beim Nachweis verschiedener Variationen in
DNA erwiesen. Wallace, B. R. et al., Nucleic Acids Research 9: 879
(1981) unterschieden zwischen kurzen Oligomeren, die sich in einer
einzelnen Base unterscheiden. Nachfolgend verwendeten Conner, B.
J. et al., Proceedings of the Nation Academy of Sciences USA 80:
278 (1983) den Wallace-Ansatz, um Punktmutationen im β-Globin-Gen
zu untersuchen. Als ein Ergebnis konnte die Duplex-Thermostabilität vernünftig und
akkurat vorhergesagt werden auf der Basis von Sequenzen zwischen
Sonde und Ziel.
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Obwohl
die Hybridisierung eine sinnvolle und leistungsstarke Technik sein
kann, ist sie begrenzt, dahingehend, dass der Stabilitätsunterschied
zwischen einem perfekt passenden Duplex und einem Mismatch-Duplex,
speziell falls der Mismatch nur eine einzelne Base ausmacht, relativ
klein sein kann, was mit einem Unterschied in Tm zwischen den beiden
von nicht mehr als 0,5°C
einhergeht. Siehe Tibanyenda, N. et al., Eur. J. Biochem. 139: 19
(1984) und Ebel, S. et al., Biochem. 31: 12083 (1992). Noch wichtiger
ist es, dass verstan den ist, dass mit zunehmender Länge der
Oligomersonde der negative Effekt eines Einzelbasen-Mismatches auf
die gesamte Duplex-Stabilität
abnimmt. Dies ist eine wichtige Beschränkung, da es wünschenswert
ist, die Sondenlänge
ansteigen zu lassen, um die Hybridisierungsspezifität für einzelne
Gene zu erhöhen, während schwach
verwandte Gene ausgeschlossen werden sollen. Folglich ist die Fähigkeit,
spezifisch eng miteinander verwandte Gene voneinander zu unterscheiden,
nicht ausreichend entwickelt mit Blick auf den Wunsch, Hybridierungsuntersuchungen
auf zunehmend enge Regionen des Genoms zu fokussieren. Was gebraucht
wird, ist ein Verfahren, das die Fähigkeit verbessert, eng miteinander
verwandte Gene zu unterscheiden durch Erhöhen des Unterschiedes in den
Schmelztemperaturen von Duplizes, die zwischen Sonde und Ziel ausgebildet
werden.
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Das
US-Patent Nr. 6,764,693 offenbart
ein Nukleinsäure-Hybridiserungsverfahren
zum Verbessern der Fähigkeit,
Mismatches eines Kontroll-Nukleinsäure-ziels und eines Mutanten-Nukleinsäure-Ziels
nachzuweisen, einschließend
Sequenzvariation unter Verwendung eines modifizierten Oligonukleotids.
Ein künstlicher
Mismatch wird induziert unter Verwendung von 1-(2'-Deoxy-β-D-ribofuranosyl)-3-Nitropyrrol
als ein Basenanalog, um den Unterschied für ein Einzelbasen-Mismatch
zu erhöhen.
Jedoch ist die Synthese des Basenanalogs schwierig und es gibt keine
Beschreibung mit Blick auf den Blockadeeffekt aufgrund der Hinzufügung einer "Hurdle"-DNA der vorliegenden
Erfindung.
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung haben ein Verfahren untersucht
zum Verbessern des Nachweises eines Unterschiedes für einen
einzelnen Basen-Mismatch, basierend auf herkömmlichen Technologien, die
oben beschrieben werden, und haben herausgefunden, dass unter Verwendung
der Zugabe einer "Hurdle"-DNA und der Variation
einer Sondenbase, die Diskriminierung für einen einzelnen Basen-Mismatch erhöht wird.
Folglich wurde die vorliegende Erfindung realisiert.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Verfügung zum
Erhöhen
der Unterscheidung für
einen einzelnen Basen-Mismatch unter Verwendung einer "Hurdle"-DNA und einer künstlichen
Mismatch-Sonde.
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Entsprechend
einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Verfügung gestellt,
zur Verbesserung der Unterscheidung von einer Ziel-DNA, die eine
polymorphe Stelle hat, wobei das Verfahren folgendes umfasst: Synthetisieren
einer ersten Sonde durch künstliches
Substituieren einer Base einer Sonde, welche vollständig komplementär mit einer
Ziel-DNA, die eine polymorphe Stelle aufweist, ist, durch eine natürliche Mismatch-Base
und Synthetisieren einer zweiten Sonde durch künstliches Substituieren einer
Base einer anderen Sonde, die einen Einzelbasen-Mismatch an einer
Position aufweist, welche zur polymorphen Stelle der Ziel-DNA korrespondiert,
mit einer natürlichen
Mismatch-Base; Synthetisieren einer ersten Basis-DNA, die vollständig komplementär zur ersten
Sonde ist und kürzer
ist als die erste Sonde, sowie einer zweiten Basis-DNA, welche vollständig komplementär zur zweiten
Sonde ist, und kürzer
als die zweite Sonde ist; Immobilisieren der ersten und zweiten
Sonden auf einem Substrat; Hybridisieren der immobilisierten ersten und
zweiten Sonden mit den ersten bzw. zweiten Basis-DNAs; und Hybridisieren
der Ziel-DNA mit den Hybriden.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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Die
oben genannten weiteren Merkmale sowie Vorteile der Erfindung werden
offensichtlicher werden, folgt man der Beschreibung der beispielhaften
Ausführungsformen
davon im Detail unter Verweis auf die beigefügten Zeichnungen; in diesen:
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illustriert 1 schematisch
ein Verfahren zum Erhöhen
der Unterscheidung nach einem Einzelbasen-Mismatch unter Verwendung
einer "Hurdle"-DNA und einer künstlich
mit Mismatch versehenen Sonde entsprechend einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung;
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2 illustriert
schematisch die relative Stabilität eines Hybrids einer künstlich
mit Mismatch versehenen Sonde und einer "Hurdle"-DNA sowie einem Hybrid, der künstlich
mit Mismatch versehenen Sonde und einer Ziel-DNA;
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3 illustriert
schematisch die relative Stabilität eines Hybrids einer normalen
Sonde und einer "Hurdle"-DNA sowie eines
Hybrids der normalen Sonde und einer Ziel-DNA;
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4 illustriert
Tm von Hybriden von künstlich
mit Mismatch versehenen Sonden und "Hurdle"-DNAs und Tm von Hybriden, der künstlich
mit Mismatch versehenen Sonden und einer Ziel-DNA;
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5 illustriert
die Fluoreszenz-Intensität
von Hybriden einer CY-3 gelabelten Ziel-DNA und einem jeden der vier Sätze von
verschiedenen Sonden gemäß Tabelle
1;
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6 ist
ein Diagramm, das ein Verhältnis
von PM (perfekt passenden, perfectly matched)/MM (mit Mismatch versehenen,
mismatched) eines jeden Sondensatzes gemäß Tabelle 1 illustriert; und
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7 ist
ein Graph ist, der ein PM/MM-Verhältnis eines jeden Probensatzes
von Tabelle 2 illustriert.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Ein
Verfahren zum Erhöhen
der Diskriminierung für
ein Ziel (Target) mit einer polymorphen Stelle gemäß einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung schließt folgendes ein: Synthetisieren
einer ersten Sonde durch künstliches
Substituieren einer Base einer Sonde, welche vollständig komplementär mit einer Ziel-DNA,
die eine polymorphe Stelle aufweist, ist, durch eine natürliche Mismatch-Base
und Synthetisieren einer zweiten Sonde durch künstliches Substituieren einer
Base einer anderen Sonde, die einen Einzelbasen-Mismatch an einer
Position aufweist, welche zur polymorphen Stelle der Ziel-DNA korrespondiert,
mit einer natürlichen
Mismatch-Base; Synthetisieren einer ersten Basis-DNA, die vollständig komplementär zur ersten
Sonde ist und kürzer
ist als die erste Sonde, sowie einer zweiten Basis-DNA, welche vollständig komplementär zur zweiten
Sonde ist, und kürzer
als die zweite Sonde ist; Immobilisieren der ersten und zweiten
Sonden auf einem Substrat; Hybridisieren der immobilisierten ersten
und zweiten Sonden mit den ersten bzw. zweiten Basis-DNAs; und Hybridisieren
der Ziel-DNA mit den Hybriden. Hier bindet die Ziel-DNA an die Sonden-DNA
im kompetitiven Modus mit den "Hurdle"-DNAs.
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In
dem Verfahren der vorliegenden Erfindung werden eine "Hurdle"-DNA und eine Sonde
mit einer modifizierten Base verwendet, um die Unterscheidung für einen
Einzelbasen-Mismatch
in einem DNA-Chip zu erhöhen. 1 illustriert
schematisch ein Verfahren zum Erhöhen der Unterscheidung für einen
Einzelbasen-Mismatch unter Verwendung einer "Hudle"-DNA und einer künstlich mit Mismatch versehenen
Sonde entsprechend einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung. Es wird Bezug genommen auf 1;
eine erste Sonde und eine Ziel-DNA sind zueinander komplementär in allen
Abschnitten, abgesehen von der einen mit künstlichen Mismatch versehen
Base (T-T, gekennzeichnet durch einen Pfeil) und eine zweite Sonde
schließt eine
mit Mismatch versehene Base (C-C) auf einer Ziel-DNA ein, sowie
eine künstlich
mit Mismatch versehene Base (T-T, angegeben durch einen Pfeil).
Eine erste "Hurdle"-DNA ist vollständig komplementär zur ersten Sonde
und kürzer
als die erste Sonde. Eine zweite "Hurdle"-DNA ist vollständig komplementär zu der
zweiten Sonde und ist kürzer
als die zweite Sonde. Die erste "Hurdle"-DNA hat die gleiche
Sequenzlänge,
wie die zweite "Hurdle"-DNA.
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Für die Zwecke
der vorliegenden Patentanmeldung kann eine "Target-DNA" (Ziel-DNA) ein Chromosom oder jeglicher
Abschnitt davon sein, oder kann ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül sein,
wie z. B. ein Plasmid, Oligonukleotid oder ein anderes Nukleinsäurefragment
und kann natürlich
auftretend sein oder synthetisch sein. Wenn das Target eine DNA
ist, versteht sich, dass die DNA bereitgestellt wird zum Zwecke
der Verwendung in dem Verfahren, oder eine einzelsträngige Form
darstellt, die in der Lage ist, mit einer einzelsträngigen Oligonukleotidsonde
zu hybridisieren.
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In
einem herkömmlichen
Verfahren wird eine künstlich
mit Mismatch versehene Base in eine Sonde eingebracht, um einen
Einzelbasen-Mismatch zu unterscheiden, ohne dass die erste "Hurdle"-DNA verwendet wird
und die zweite "Hurdle"-DNA. Jedoch in dem
Verfahren der vorliegenden Erfindung wird die "Hurdle"-DNA hybridisiert mit der Sonde vor
der Hybridisierung der Ziel-DNA mit der Sonde. Da die erste "Hurdle"-DNA kürzer ist
als die Ziel-DNA, ist der Schmelzpunkt "TN" des
Hybrids der ersten "Hurdle"-DNA und ersten Sonde niedriger
als derjenige des Hybrids der Ziel-DNA und der ersten Sonde. Folglich
tritt unter geeigneten Hybridiserungsbedingungen eine Substitution
der ersten "Hurdle"-DNA, die zuvor mit
der ersten Sonde hybridisiert wurde, durch die Ziel-DNA auf. Inzwischen
ist, obwohl die zweite "Hurdle"-DNA kürzer ist
als die Ziel-DNA, der Schmelzpunkt (TM) des Hybrids der zweiten "Hurdle"-DNA und der zweiten
Sonde höher
als derjenige des Hybrids der Ziel-DNA und der zweiten Sonde (4).
Dies liegt daran, dass die zweite Sonde eine mit Mismatch versehene
Base einschließt.
Folglich tritt unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen Substitutionen
der zweiten "Hurdle"-DNA, die zuvor mit
der zweiten Sonde hybridisiert wurde, durch die Ziel-DNA nicht auf.
Folglich verhindert die zweite "Hurdle"-DNA, dass eine nicht
komplementäre
Ziel-DNA mit der zweiten Sonde hybridisiert.
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Das
heißt,
während
die erste "Hurdle"-DNA leicht durch
die Ziel-DNA substituiert wird, wird die zweite "Hurdle"-DNA nicht leicht durch die Ziel-DNA
substituiert. Daher hybridisiert die Ziel-DNA leichter mit der ersten Sonde,
als die zweite Sonde. Folglich kann eine Fähigkeit, einen Einzelbasen-Mismatch
zu unterscheiden, verbessert werden. Dies kann leichter beobachtet
werden, wenn eine mit Fluoreszenz gelabelte Ziel-DNA in dem Experiment
verwendet wird und ein Unterschied in der relativen Intensität in der
Fluoreszenz, d. h. ein Verhältnis einer
Fluoreszenzintensität
der Ziel-DNA, hybridisiert mit der ersten Sonde mit Blick auf eine
Fluoreszenzintensität
der Ziel-DNA, hybridisiert mit der zweiten Sonde, verwendet wird.
Wenn ein Unterschied in der Fluoreszenz-Intensität zunimmt, nimmt die Fähigkeit
einen Einzelbasen-Mismatch zu unterscheiden, zu.
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Desweiteren
kann die Mismatch-Base lokalisiert werden an einer Position, die
mit einer polymorphen Stelle des Ziels korrespondiert. Single nucleotide
polymorphism (SNP) bezieht sich auf eine polymorphe Stelle auf dem
Target. Single nucleotide polymorphism (SNP) bezieht sich auf eine
oder auf einen Bereich von Zehnern von Basen-Variationen unter drei
Milliarden Basen-Sequenzen eines Chromosoms in einem Zellkern von unterschiedlichen
Individuen. Eine beispielhafte Erkrankung, die von dem SNP herrührt, ist
Sichelzell-Anämie, welche
verursacht wird durch die Substitution einer einzelnen Base an einer
spezifischen Stelle durch eine andere Base. Um einen Mismatch, der
an einer spezifischen Stelle eines Gens auftritt zu unterscheiden,
ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung notwendig.
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In
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung können
die erste Sonde und die zweite Sonde des weiteren eine Base mit
künstlich
eingefügtem
Mismatch an derselben Position einschließen. 2 illustriert
schematisch die relative Stabilität eines Hybrids einer Sonden-DNA und einer "Hurdle"-DNA und eines Hybrids
der Sonden-DNA und einer Ziel-DNA, wobei die Sonden-DNA eine mit
künstlichem
Mismatch versehene Base zum Erhöhen
der Unterscheidung für
einen Einzelbasen-Mismatch aufweist. In dem Verfahren der vorliegenden
Erfindung ist, wenn nur eine "Hurdle"-DNA eingesetzt wird,
um einen Einzelbasen-Mismatch zu unterscheiden, ein Unterschied
in der Schmelztemperatur zwischen dem Hybrid der ersten Sonde und
der Ziel-DNA sowie dem Hybrid der zweiten Sonde und der Ziel-DNA
relativ klein und folglich kann eine effiziente Unterscheidung auf
einen Einzelbasen-Mismatch nicht erzielt werden. Folglich wird zur
effizienteren Unterscheidung eines Einzelbasen-Mismatch eine Base
mit künstlich
eingeführtem
Mismatch in eine Sonde eingebracht (in 2 und 4 wird
A in einer ursprünglichen
Sonden-Sequenz substituiert durch T an einer Position, die mit einem
Pfeil gekennzeichnet ist). Das heißt, wenn eine mit künstlichem
Mismatch versehene Base eingebracht wird in die erste Sonde und
die zweite Sonde an der gleichen Position, wird die Fähigkeit
zur Unterscheidung eines Einzelbasen-Mismatches verbessert, wie
in den folgenden Beispielen demonstriert wird.
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In
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung kann die polymorphe Stelle erzeugt werden durch
eine Maßnahme
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Substitution, Ad dition und Deletion
eines Nukleotids. Obwohl ein Mismatch, der von einer Substitution
einer Nukleinsäure
anstelle einer Ziel-DNA herrührt,
oben beschrieben wurde, sind Addition und Deletion einer Nukleinsäure auch
eingeschlossen.
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In
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung kann der künstliche Mismatch erzeugt werden in
zwei Nukleotiden. Selbst wenn eine mit künstlichem Mismatch versehene
Base in eine Sonde eingebracht werden kann, können zwei oder mehr mit künstlichem
Mismatch versehene Basen auch eingebracht werden, um die Unterscheidung
auf einen Einzelbasen-Mismatch
zu erhöhen.
Dies kann in geeigneter Form entsprechend einer Ziel-DNA angewandt
werden. Vorzugsweise wird der künstliche
Mismatch in zwei Nukleotide erzeugt.
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In
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung können
die künstlichen
Mismatches kontinuierlich angeordnet werden, oder durch ein oder
mehrere Nukleotide unterschieden werden. Wenn zwei oder mehr künstliche
Mismatches erzeugt werden, kann eine mit künstlichen Mismatches versehene
Base eingebracht werden in ein Nukleotid und eine weitere mit künstlichen
Mitmatches versehene Base kann in ein Nukleotid eingebracht werden,
das benachbart ist zu dem mit Mismatch versehenen Nukleotid. Alternativ
kann eine mit künstlichen
Mismatches versehen Base eingebracht werden in ein Nukleotid und
eine weitere mit künstlichen Mismatches
versehene Base kann eingebracht werden in ein Nukleotid, abgetrennt
von dem mit Mismatch versehenen Nukleotid durch ein oder mehrere
Nukleotide. Dies kann entsprechend einer Ziel-DNA in geeigneter Form
angewandt werden. Wenn die künstlichen
Mismatches durch eine oder mehrere Nukleotide getrennt sind, sind
sie vorzugsweise um 8 bis 20 Nukleotide voneinander getrennt.
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In
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung können
die polymorphe Stelle und der künstliche Mismatch
getrennt sein, um ein oder mehrere Nukleotide. Ein Mismatch, der
in einer Region vorliegt, in der Hybridisierung der "Hurdle"-DNA auftritt, und
ein künstlicher
Mismatch können
durch ein oder mehrere Nukleotide, vorzugsweise durch 3 bis 5 Nukleotide,
getrennt werden.
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Die
vorliegende Erfindung wird nun beschrieben werden im größeren Detail
unter Verweis auf die folgenden Beispiele. Die folgenden Beispiele
dienen für
illustrative Zwecke allein und sie sind nicht dazu gedacht, den
Umfang der Erfindung zu begrenzen.
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Beispiel 1: Unterscheidung für eine Einzelbasen-substituierte
DNA.
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Um
den Effekt der Unterscheidung einer Einzelbasen-substituierten DNA
zu untersuchen, wurden die vier unterschiedlichen folgenden Sonden-Sätze eingesetzt. Tabelle
1
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Vier
unterschiedliche DNA-Sondensätze,
wie in Tabelle 1 repräsentiert,
wurden auf einem mit Amino-Silan überzogenen Wafer immobilisiert
unter Verwendung einer herkömmlichen
Immobilisierungstechnik in einer Konzentration von 1 μM. Die Hybridisierung
einer "Hurdle"-DNA an eine Sonden-DNA wurde durchgeführt durch
Umsetzen von 1 μM "Hurdle"-DNA mit der DNA-Sonde
bei 40°C
für 1 Stunde.
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Die
erstellten vier unterschiedlichen DNA-Sonden-Sätze wurden hybridisiert mit
einem 2 nM CY-3 gelabelten Ziel-Oligomer (5'-TAGGCATACTCATTGTCAT-3') (SEQ ID No: 7,
das perfekt mit der ersten Sonde des normalen Sondensatzes, der
in Tabelle 1 offenbart wird, zusammenpasste und mit dem zweiten
Sondensatz ein Mismatch in einer Base aufwies) bei 40°C für 1 Stunde.
Anschließend
wurde der Chip gewaschen mit einer 3 × SSC-Lösung für 5 Minuten unter mildem Rühren und
anschließend
weiter gewaschen mit 1 × SSC-Lösung für 5 Minuten.
Nachdem der Chip getrocknet worden war, wurde die Fluoreszenzintensität gemessen
unter Verwendung eines Scanner (CY-3) bei 532 nm, um ein Verhältnis eines
Signals der Ziel-DNA, gebunden an die erste Sonde zu einem Signal
der Ziel-DNA, gebunden an die zweite Sonde [PM (perfekt passend,
perfectly matched)/MM (mismatched, Mismatch)]. zu bestimmen. Die
Schmelzpunktwerte wurden berechnet unter Verwendung eines Santalucia
Parameter (1998).
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3 illustriert
die relative Stabilität
eines Hybrids einer normalen Sonden-DNA und einer "Hurdle"-DNA sowie eines
Hybrids einer normalen Sonden-DNA und einer Ziel-DNA. Nun wird auf 3 Bezug
genommen; als ein Ergebnis des Berechnens des TMs unter Verwendung
des Sondensatzes Nr. 3 war der Tm des Hybrids der ersten Sonde und
der Ziel-DNA höher
als der Tm des Hybrids der ersten Sonde und der ersten "Hurdle"-DNA und folglich
war das Hybrid der ersten Sonden- und der Ziel-DNA stabiler. Folglich
konnte die erste "Hurdle"-DNA leicht substituiert
werden durch die Ziel-DNA. Desweiteren wies das Hybrid der zweiten Sonde
und der Ziel-DNA einen Schmelzpunkt auf, der höher war als derjenige des Hybrids
der zweiten Sonde und der zweiten "Hurdle"-DNA und folglich war das Hybrid der
zweiten Sonde und der Ziel-DNA stabiler. Folglich konnte die zweite "Hurdle"-DNA leicht substituiert
werden durch die Ziel-DNA. Dies ist ein Resultat, das im Gegensatz
steht zu der Aufgabe der vorliegenden Erfindung, welche erforderlich
macht, dass die erste "Hurdle"-DNA leicht substituiert sein sollte
durch die Ziel-DNA und die zweite "Hurdle"-DNA nicht leicht substituiert werden
sollte durch die Ziel-DNA. Jedoch wird dieses Resultat erhalten
aus einem Beispiel der vorliegenden Erfindung.
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Folglich
wurde eine Basen-Variation in die erste Sonde und die zweite Sonde
an der gleichen Position eingebracht, um die Fähigkeit, einen Einzelbasen-Mismatch
zu unterscheiden, zu verbessern. 4 illustriert den
Schmelzpunkt eines Hybrids einer mit künstlichem Mismatch versehenen
Sonde und einer "Hurdle"-DNA sowie den Tm
eines Hybrids einer mit künstlichem
Mismatch versehenen Sonde und einer Ziel-DNA. Nun wird auf 4 Bezug
genommen; eine Basenvariation (A→T)
wurde an der Stelle eingebracht, die mit einem Pfeil gekennzeichnet
wurde und Tm-Werte wurden berechnet. Als ein Ergebnis wurde der
Tm des Hybrids der ersten Sonde und der ersten "Hurdle"-DNA nicht verändert und der Tm des Hybrids
der ersten Sonde und der Ziel-DNA reduzierte sich von 63,5°C auf 55,2°C. Jedoch
wies das Hybrid der ersten Sonde und der Ziel-DNA immer noch einen
Tm auf, der höher
war als derjenige des Hybrids der ersten Sonde und der ersten "Hurdle"-DNA und war folglich
stabiler. Daher kann die erste "Hurdle-DNA
leicht substituiert werden durch die Ziel-DNA. Inzwischen bliebt der Tm des Hybrids
der zweiten Sonde und der zweiten Hurdle-DNA unverändert und
der Tm des Hybrids der zweiten Sonde und der Ziel-DNA reduzierte
sich von 54,7°C
auf 44,2°C.
Jedoch das Hybrid der zweiten Sonde und der Ziel-DNA wies einen
Tm auf, der niedriger war als beim Hybrid der zweiten Sonde und
der zweiten "Hurdle"-DNA und war folglich
weniger stabil. Daher kann die zweite "Hurdle"-DNA nicht leicht substituiert werden
durch die Ziel-DNA. Dies ist das Ergebnis, das mit der Aufgabe der
vorliegenden Erfindung zusammenfällt,
welche erforderlich macht, dass die erste "Hurdle"-DNA leicht substituiert werden sollte
und die zweite "Hurdle"-DNA nicht leicht
substituiert werden sollte. Desweiteren passt dieses Ergebnis mit
dem PM/MM-Verhältnis,
erhalten nach Hybridisieren der Ziel-DNA mit den Sonden (siehe 5)
zusammen.
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5 illustriert
die Fluoreszenz-Intensität,
gemessen nach Hybridisieren der CY-3 gelabelten Ziel-DNA mit vier
unterschiedlichen Sondensätzen. 6 ist
ein Diagramm, der das PM/MM-Verhältnis
einer jeden Sonde illustriert (normal = Sondensatz #1, Hurdle =
Sondensatz #3, Hurdle + Basen – Variation
= Sondensatz #4, Basen-Variation = Sondensatz #2). Nun wird auf
die 5 und 6 Bezug genommen; das Einbringen
der "Hurdle"-DNA und einer Basen-Variation
erhöht
signifikant das PM/MM-Verhältnis
im Vergleich zum normalen Sondensatz. Auch das Einbringen von nur
einer Basen-Variation erhöhte
das PM/MM-Verhältnis
im Vergleich zum normalen Sondensatz. Jedoch das Einbringen von
nur einer "Hurdle"-DNA zeigte, dass das
PM/MM-Verhältnis
nahezu identisch ist mit dem normalen Sondensatz. Jedoch können die
Ergebnisse abhängig
sein von der jeweiligen Sequenz und der Länge einer Sonde sowie der Länge einer "Hurdle"-DNA. Das heißt, wenn
die Sequenz und die Länge
einer Sonde sowie die Länge
einer "Hurdle"-DNA geeignet ausgewählt werden,
kann der Effekt der vorliegenden Erfindung erhalten werden, selbst
bei Einbringen von nur einer "Hurdle"-DNA.
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Beispiel 2: Unterscheidung auf Einzelbasen-insertierte
DNA
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Um
eine Unterscheidung auf eine Einzelbasen-insertierte DNA zu untersuchen,
wurden fünf
unterschiedliche Sondensätze,
wie in Tabelle 2 dargestellt, verwendet. Tabelle
2
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Die
experimentelle Prozedur war die gleiche, wie diejenige, beschrieben
in Beispiel 1 und die Ziel-DNA-Sequenz war 5'-tgctgacAGGGGGGAggggg-3' (SEQ ID No: 18).
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7 ist
eine Diagramm, das das PM/MM-Verhältnis eines jeden Sondensatzes
von Tabelle 2 illustriert (normal = Sondensatz #1, 1 MM = Sondensatz
#2, 2 MM = Sondensatz #3, 1 MM + H = Sondensatz #4, 2 MM + H = Sondensatz
#5). Nun wird auf 7 Bezug genommen; es ist offensichtlich,
dass das Einbringen der "Hurdle"-DNA und von zwei
Basen-Mismatches
signifikant das PM/MM-Verhältnis
im Vergleich zum normalen Sondensatz erhöht. Es kann auch gesehen werden,
dass das Einbringen der "Hurdle"-DNA und einem Basen-Mismatch
das PM/MM-Verhältnis
erhöhte
im Vergleich zum normalen Sondensatz.
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Wie
oben beschrieben, kann das Hinzufügen einer "Hurdle"-DNA und die Variation einer Sondenbase die
Fähigkeit
des Unterscheidens eines Einzelbasen-Mismatches erhöhen.
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