JP2003189862A - ターゲット検出方法、ｄｎａ塩基配列の一塩基多型検出用試薬及び一塩基多型検出方法 - Google Patents
ターゲット検出方法、ｄｎａ塩基配列の一塩基多型検出用試薬及び一塩基多型検出方法Info
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- JP2003189862A JP2003189862A JP2001392018A JP2001392018A JP2003189862A JP 2003189862 A JP2003189862 A JP 2003189862A JP 2001392018 A JP2001392018 A JP 2001392018A JP 2001392018 A JP2001392018 A JP 2001392018A JP 2003189862 A JP2003189862 A JP 2003189862A
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- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
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- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 粒径が同じ１種類のビーズを用いてＤＮＡ塩
基配列の一塩基多型を検出するための試薬及び方法を提
供する。 【解決手段】 一塩基多型のないＤＮＡ塩基配列とハイ
ブリダイズするプローブを固定化したビーズと、一塩基
多型のあるＤＮＡ塩基配列とハイブリダイズするプロー
ブを固定化したビーズとを混合した試薬を、蛍光標識し
た被検ＤＮＡ塩基配列を含むサンプル溶液に添加してハ
イブリダイゼーション反応を行わせ、反応後のビーズを
フローサイトメータに流し、得られた蛍光強度ヒストグ
ラムのパターンにより被検ＤＮＡ塩基配列の一塩基多型
を判定する。
基配列の一塩基多型を検出するための試薬及び方法を提
供する。 【解決手段】 一塩基多型のないＤＮＡ塩基配列とハイ
ブリダイズするプローブを固定化したビーズと、一塩基
多型のあるＤＮＡ塩基配列とハイブリダイズするプロー
ブを固定化したビーズとを混合した試薬を、蛍光標識し
た被検ＤＮＡ塩基配列を含むサンプル溶液に添加してハ
イブリダイゼーション反応を行わせ、反応後のビーズを
フローサイトメータに流し、得られた蛍光強度ヒストグ
ラムのパターンにより被検ＤＮＡ塩基配列の一塩基多型
を判定する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ポリスチレンビー
ズ、ポリプロピレンビーズ、磁気ビーズ、ガラスビーズ
などのビーズを用いたターゲット配列検出方法、ＤＮＡ
塩基配列の一塩基多型（ＳＮＰ：Single Nucleotide Po
lymorphism）検出用試薬及び一塩基多型検出方法に関す
る。
ズ、ポリプロピレンビーズ、磁気ビーズ、ガラスビーズ
などのビーズを用いたターゲット配列検出方法、ＤＮＡ
塩基配列の一塩基多型（ＳＮＰ：Single Nucleotide Po
lymorphism）検出用試薬及び一塩基多型検出方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】サンプル中に含まれる多種類の生体高分
子、例えばＤＮＡ塩基配列を一度に検出するためのもの
としてバイオチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）がある。
バイオチップは、スライドグラス等の平らな支持体上に
固定化された多種類のプローブ（例えばＤＮＡ）に、標
識を付けたサンプル中の多種類のターゲット（例えばＤ
ＮＡ）がハイブリダイゼーションによって選択的に結合
することを利用している。すなわち、プローブを固定化
したスポットにハイブリダイゼーションするターゲット
を介して導入される標識により、サンプル中のターゲッ
ト配列を検出するものであり、非常に多くの種類のプロ
ーブを同一支持体上に固定化することによって、一度に
多くの種類のターゲットを検出することができる。
子、例えばＤＮＡ塩基配列を一度に検出するためのもの
としてバイオチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）がある。
バイオチップは、スライドグラス等の平らな支持体上に
固定化された多種類のプローブ（例えばＤＮＡ）に、標
識を付けたサンプル中の多種類のターゲット（例えばＤ
ＮＡ）がハイブリダイゼーションによって選択的に結合
することを利用している。すなわち、プローブを固定化
したスポットにハイブリダイゼーションするターゲット
を介して導入される標識により、サンプル中のターゲッ
ト配列を検出するものであり、非常に多くの種類のプロ
ーブを同一支持体上に固定化することによって、一度に
多くの種類のターゲットを検出することができる。
【０００３】一方、平板状の支持体の代わりに直径１０
０ｎｍ〜１００μｍ程度の球形のビーズを使用し、プロ
ーブをビーズ表面に固定し、ビーズ表面上でターゲット
とのハイブリダイゼーション反応を行わせる方法が開発
されている。この方法は、反応の場として球体表面を用
いるため、反応効率や洗浄効率が高いという特徴があ
る。
０ｎｍ〜１００μｍ程度の球形のビーズを使用し、プロ
ーブをビーズ表面に固定し、ビーズ表面上でターゲット
とのハイブリダイゼーション反応を行わせる方法が開発
されている。この方法は、反応の場として球体表面を用
いるため、反応効率や洗浄効率が高いという特徴があ
る。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】ビーズ表面でプローブ
とターゲットとのハイブリダイゼーション反応を行う方
法は反応効率が高いものの、ビーズ表面に固定化された
プローブとハイビリダイズしたターゲットの識別はビー
ズ自体を識別することによって行わなければならない。
そのため、ビーズが１種類では１種類の識別しか行うこ
とができないという問題がある。蛍光色素で着色して識
別可能にした複数種類のビーズを用いる方法も提案され
ているが、ターゲットを標識する蛍光色素の励起用レー
ザ光源の他にビーズを着色している蛍光色素の励起用レ
ーザ光源も必要となり、装置が複雑かつ高価になるとい
う問題がある。
とターゲットとのハイブリダイゼーション反応を行う方
法は反応効率が高いものの、ビーズ表面に固定化された
プローブとハイビリダイズしたターゲットの識別はビー
ズ自体を識別することによって行わなければならない。
そのため、ビーズが１種類では１種類の識別しか行うこ
とができないという問題がある。蛍光色素で着色して識
別可能にした複数種類のビーズを用いる方法も提案され
ているが、ターゲットを標識する蛍光色素の励起用レー
ザ光源の他にビーズを着色している蛍光色素の励起用レ
ーザ光源も必要となり、装置が複雑かつ高価になるとい
う問題がある。
【０００５】本発明は、このような従来技術の問題点に
鑑み、異なるプローブを固定化した複数種類のビーズを
用い、ビーズ自身の識別も簡便に行うことのできるター
ゲット検出方法を提供することを目的とする。本発明
は、また、粒径が同じ１種類のビーズを用いてＤＮＡ塩
基配列の一塩基多型を検出するための試薬及び方法を提
供する。
鑑み、異なるプローブを固定化した複数種類のビーズを
用い、ビーズ自身の識別も簡便に行うことのできるター
ゲット検出方法を提供することを目的とする。本発明
は、また、粒径が同じ１種類のビーズを用いてＤＮＡ塩
基配列の一塩基多型を検出するための試薬及び方法を提
供する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明においては、粒径
の異なったビーズを使用し、ビーズをフローサイトメー
タに流して前方散乱光を測定し、前方散乱光強度に基づ
いてビーズの粒径を識別することで前記目的を達成す
る。粒径の異なるビーズの表面に、それぞれ異なるプロ
ーブを固定化しておき、プローブと蛍光標識されたター
ゲットとをハイブリダイザーション反応させた後、フロ
ーサイトメータでビーズからの蛍光強度を測定すること
により検出する。
の異なったビーズを使用し、ビーズをフローサイトメー
タに流して前方散乱光を測定し、前方散乱光強度に基づ
いてビーズの粒径を識別することで前記目的を達成す
る。粒径の異なるビーズの表面に、それぞれ異なるプロ
ーブを固定化しておき、プローブと蛍光標識されたター
ゲットとをハイブリダイザーション反応させた後、フロ
ーサイトメータでビーズからの蛍光強度を測定すること
により検出する。
【０００７】また、一塩基多型のないＤＮＡ塩基配列と
ハイブリダイズするプローブを固定化したビーズと、一
塩基多型のあるＤＮＡ塩基配列とハイブリダイズするプ
ローブを固定化したビーズとを混合した試薬を、蛍光標
識した被検ＤＮＡ塩基配列を含むサンプル溶液に添加し
てハイブリダイゼーション反応を行わせ、反応後のビー
ズをフローサイトメータに流し、得られた蛍光強度ヒス
トグラムのパターンにより被検ＤＮＡ塩基配列の一塩基
多型を判定することによって前記目的を達成する。
ハイブリダイズするプローブを固定化したビーズと、一
塩基多型のあるＤＮＡ塩基配列とハイブリダイズするプ
ローブを固定化したビーズとを混合した試薬を、蛍光標
識した被検ＤＮＡ塩基配列を含むサンプル溶液に添加し
てハイブリダイゼーション反応を行わせ、反応後のビー
ズをフローサイトメータに流し、得られた蛍光強度ヒス
トグラムのパターンにより被検ＤＮＡ塩基配列の一塩基
多型を判定することによって前記目的を達成する。
【０００８】すなわち、本発明によるターゲット検出方
法は、蛍光標識されたターゲットを含むサンプル溶液
に、第１のプローブが表面に固定化された第１の粒径の
ビーズと、第１のプローブとは異なる第２のプローブが
表面に固定化された第２の粒径のビーズを混合してター
ゲットとプローブとのハイブリダイゼーション反応を行
わせるステップと、ハイブリダイゼーション反応の後、
ビーズをフローサイトメータに流し前方散乱光と蛍光と
を同時に検出するステップと、前方散乱光強度に基づい
てビーズの粒径を識別するステップとを含むことを特徴
とする。このとき、粒径の同じビーズには同じプローブ
を固定化し、粒径の異なるビーズにはそれぞれ異なるプ
ローブを固定化することができる。
法は、蛍光標識されたターゲットを含むサンプル溶液
に、第１のプローブが表面に固定化された第１の粒径の
ビーズと、第１のプローブとは異なる第２のプローブが
表面に固定化された第２の粒径のビーズを混合してター
ゲットとプローブとのハイブリダイゼーション反応を行
わせるステップと、ハイブリダイゼーション反応の後、
ビーズをフローサイトメータに流し前方散乱光と蛍光と
を同時に検出するステップと、前方散乱光強度に基づい
てビーズの粒径を識別するステップとを含むことを特徴
とする。このとき、粒径の同じビーズには同じプローブ
を固定化し、粒径の異なるビーズにはそれぞれ異なるプ
ローブを固定化することができる。
【０００９】本発明によるＤＮＡ塩基配列の一塩基多型
検出用試薬は、一塩基多型のないＤＮＡ塩基配列とハイ
ブリダイズするプローブが表面に固定化された第１のビ
ーズと、表面に固定化されている配列が、一塩基多型の
あるＤＮＡ塩基配列とハイブリダイズするプローブであ
る点においてだけ第１のビーズと異なる第２のビーズと
が混合されていることを特徴とする。第１のビーズと第
２のビーズとは、同じ割合で混合してもよいが、異なる
割合で混合してもよい。
検出用試薬は、一塩基多型のないＤＮＡ塩基配列とハイ
ブリダイズするプローブが表面に固定化された第１のビ
ーズと、表面に固定化されている配列が、一塩基多型の
あるＤＮＡ塩基配列とハイブリダイズするプローブであ
る点においてだけ第１のビーズと異なる第２のビーズと
が混合されていることを特徴とする。第１のビーズと第
２のビーズとは、同じ割合で混合してもよいが、異なる
割合で混合してもよい。
【００１０】本発明によるＤＮＡ塩基配列の一塩基多型
検出用試薬は、また、一塩基多型のない第１のＤＮＡ塩
基配列とハイブリダイズするプローブが表面に固定化さ
れた第１の粒径の第１のビーズと、表面に固定化されて
いる配列が、一塩基多型のある第１のＤＮＡ塩基配列と
ハイブリダイズするプローブ配列である点においてのみ
前記第１のビーズと異なる第２のビーズと、一塩基多型
のない第２のＤＮＡ塩基配列とハイブリダイズするプロ
ーブが表面に固定化された第２の粒径の第３のビーズ
と、表面に固定化されている配列が、一塩基多型のある
第２のＤＮＡ塩基配列とハイブリダイズするプローブで
ある点においてのみ前記第３のビーズと異なる第４のビ
ーズとが混合されていることを特徴とする。このとき、
第１のビーズと第２のビーズとを異なる割合で混合し、
第３のビーズと第４のビーズとを異なる割合で混合する
のが好ましい。ビーズの粒径は０．１μｍ〜１ｍｍとす
ることができる。
検出用試薬は、また、一塩基多型のない第１のＤＮＡ塩
基配列とハイブリダイズするプローブが表面に固定化さ
れた第１の粒径の第１のビーズと、表面に固定化されて
いる配列が、一塩基多型のある第１のＤＮＡ塩基配列と
ハイブリダイズするプローブ配列である点においてのみ
前記第１のビーズと異なる第２のビーズと、一塩基多型
のない第２のＤＮＡ塩基配列とハイブリダイズするプロ
ーブが表面に固定化された第２の粒径の第３のビーズ
と、表面に固定化されている配列が、一塩基多型のある
第２のＤＮＡ塩基配列とハイブリダイズするプローブで
ある点においてのみ前記第３のビーズと異なる第４のビ
ーズとが混合されていることを特徴とする。このとき、
第１のビーズと第２のビーズとを異なる割合で混合し、
第３のビーズと第４のビーズとを異なる割合で混合する
のが好ましい。ビーズの粒径は０．１μｍ〜１ｍｍとす
ることができる。
【００１１】本発明によるＤＮＡ塩基配列の一塩基多型
検出方法は、一塩基多型のないＤＮＡ塩基配列とハイブ
リダイズするプローブが表面に固定化された第１のビー
ズと、表面に固定化されている配列が、一塩基多型のあ
るＤＮＡ塩基配列とハイブリダイズするプローブである
点においてのみ第１のビーズと異なる第２のビーズと
を、蛍光標識した被検ＤＮＡ塩基配列を含むサンプル溶
液に混合してハイブリダイゼーション反応を行わせるス
テップと、ハイブリダイゼーション反応の後、ビーズを
フローサイトメータに流し、蛍光強度を測定して蛍光強
度ヒストグラムを作成するステップと、蛍光強度ヒスト
グラムのピークパターンに基づいて被検ＤＮＡ塩基配列
の一塩基多型を判定するステップとを含むことを特徴と
する。一塩基多型の判定は、ピークの数が１つであるか
２つであるかに基づいて行うことができる。
検出方法は、一塩基多型のないＤＮＡ塩基配列とハイブ
リダイズするプローブが表面に固定化された第１のビー
ズと、表面に固定化されている配列が、一塩基多型のあ
るＤＮＡ塩基配列とハイブリダイズするプローブである
点においてのみ第１のビーズと異なる第２のビーズと
を、蛍光標識した被検ＤＮＡ塩基配列を含むサンプル溶
液に混合してハイブリダイゼーション反応を行わせるス
テップと、ハイブリダイゼーション反応の後、ビーズを
フローサイトメータに流し、蛍光強度を測定して蛍光強
度ヒストグラムを作成するステップと、蛍光強度ヒスト
グラムのピークパターンに基づいて被検ＤＮＡ塩基配列
の一塩基多型を判定するステップとを含むことを特徴と
する。一塩基多型の判定は、ピークの数が１つであるか
２つであるかに基づいて行うことができる。
【００１２】第１のビーズと第２のビーズとは、異なる
割合で混合されていることが好ましい。その場合、蛍光
強度ヒストグラムにおける蛍光強度の違う２つのピーク
の比に基づいて被検ＤＮＡ塩基配列の一塩基多型を判定
することができる。ビーズの材質に関しては特に制限は
なく、ポリスチレンビーズ、ポリプロピレンビーズ、磁
気ビーズ、ガラスビーズなど種々のものを用いることが
できる。また、フローサイトメータの排出部にビーズの
粒径に応じたフィルターを設定することで、粒径の異な
るビーズを個別に回収することを可能にする。
割合で混合されていることが好ましい。その場合、蛍光
強度ヒストグラムにおける蛍光強度の違う２つのピーク
の比に基づいて被検ＤＮＡ塩基配列の一塩基多型を判定
することができる。ビーズの材質に関しては特に制限は
なく、ポリスチレンビーズ、ポリプロピレンビーズ、磁
気ビーズ、ガラスビーズなど種々のものを用いることが
できる。また、フローサイトメータの排出部にビーズの
粒径に応じたフィルターを設定することで、粒径の異な
るビーズを個別に回収することを可能にする。
【００１３】
【発明の実施の形態】以下、図面を参照して本発明の実
施の形態を説明する。図１は、粒径４．５μｍのポリス
チレンビーズをフローサイトメータに流し、前方散乱光
を測定した結果を示すフローサイトグラムである。図１
の横軸は前方散乱光強度（任意単位）、縦軸はビーズの
カウント数である。特定の前方散乱光強度のところにカ
ウント数の急峻なピーク１１が形成され、粒径が同じビ
ーズがフローサイトメータのレーザ光を横切るとき、ほ
ぼ同じ強さの前方散乱光が観察されることが分かる。ピ
ーク１１のカウント数の積算値は、検出したビーズの総
数に対応する。このように、前方散乱光強度はビーズや
細胞の大きさ（粒径）を反映し、前方散乱光強度からビ
ーズの粒径を識別することができる。
施の形態を説明する。図１は、粒径４．５μｍのポリス
チレンビーズをフローサイトメータに流し、前方散乱光
を測定した結果を示すフローサイトグラムである。図１
の横軸は前方散乱光強度（任意単位）、縦軸はビーズの
カウント数である。特定の前方散乱光強度のところにカ
ウント数の急峻なピーク１１が形成され、粒径が同じビ
ーズがフローサイトメータのレーザ光を横切るとき、ほ
ぼ同じ強さの前方散乱光が観察されることが分かる。ピ
ーク１１のカウント数の積算値は、検出したビーズの総
数に対応する。このように、前方散乱光強度はビーズや
細胞の大きさ（粒径）を反映し、前方散乱光強度からビ
ーズの粒径を識別することができる。
【００１４】粒径の異なるビーズは、例えばPolyscienc
es, IncやBangs Laboratories, Incなどから、表面にカ
ルボキシル基を持った様々なビーズが粒径０．０５〜９
０μｍの範囲で販売されている。このため、タンパク質
や末端をアミノ化修飾したＤＮＡあるいはＤＮＡ断片な
どをビーズ表面へ受動吸着あるいは共有結合させること
が可能である。蛍光標識したＤＮＡやタンパク質等のタ
ーゲットが入ったサンプル溶液中にＤＮＡやタンパク質
等のプローブを表面に結合させたビーズを混合し、ビー
ズ表面のプローブにターゲットを特異的にハイブリダイ
ズさせる。こうして、ＤＮＡとＤＮＡ（ＲＮＡ（リボ核
酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Locked Nucle
ic Acid）などを含む）のハイブリダイゼーションを利
用してＤＮＡの変異を検出したり、タンパク質とタンパ
ク質あるいはタンパク質とＤＮＡ、糖といった様々な生
体高分子間の相互作用の解析を行うことができる。
es, IncやBangs Laboratories, Incなどから、表面にカ
ルボキシル基を持った様々なビーズが粒径０．０５〜９
０μｍの範囲で販売されている。このため、タンパク質
や末端をアミノ化修飾したＤＮＡあるいはＤＮＡ断片な
どをビーズ表面へ受動吸着あるいは共有結合させること
が可能である。蛍光標識したＤＮＡやタンパク質等のタ
ーゲットが入ったサンプル溶液中にＤＮＡやタンパク質
等のプローブを表面に結合させたビーズを混合し、ビー
ズ表面のプローブにターゲットを特異的にハイブリダイ
ズさせる。こうして、ＤＮＡとＤＮＡ（ＲＮＡ（リボ核
酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Locked Nucle
ic Acid）などを含む）のハイブリダイゼーションを利
用してＤＮＡの変異を検出したり、タンパク質とタンパ
ク質あるいはタンパク質とＤＮＡ、糖といった様々な生
体高分子間の相互作用の解析を行うことができる。
【００１５】以下、本発明の方法を具体的に説明する。
粒径４．５μｍ、６．０μｍ、１０．０μｍの３種類の
ポリスチレンビーズを用意し、それぞれのビーズ表面に
下記の表に示すＤＮＡ（プローブ）を共有結合した。Ｄ
ＮＡは、カルボキシル基の露呈したビーズに末端をアミ
ノ化修飾したＤＮＡをＥＤＣ（エチレンジアミンカルボ
ジイミド）により共有結合させた。
粒径４．５μｍ、６．０μｍ、１０．０μｍの３種類の
ポリスチレンビーズを用意し、それぞれのビーズ表面に
下記の表に示すＤＮＡ（プローブ）を共有結合した。Ｄ
ＮＡは、カルボキシル基の露呈したビーズに末端をアミ
ノ化修飾したＤＮＡをＥＤＣ（エチレンジアミンカルボ
ジイミド）により共有結合させた。
【００１６】
【表１】
各粒径のビーズに関して、normalのプローブを共有結合
したビーズとvariantのプローブを共有結合したビーズ
を用意し、２種類のビーズを等量混合した。こうして得
られた各粒径のビーズをフローサイトメータに流し、前
方散乱光を測定して得たフローサイトグラムを図２に示
す。図２の横軸は前方散乱光強度（任意単位）、縦軸は
検出されたビーズのカウント数である。
したビーズとvariantのプローブを共有結合したビーズ
を用意し、２種類のビーズを等量混合した。こうして得
られた各粒径のビーズをフローサイトメータに流し、前
方散乱光を測定して得たフローサイトグラムを図２に示
す。図２の横軸は前方散乱光強度（任意単位）、縦軸は
検出されたビーズのカウント数である。
【００１７】前記したように前方散乱光強度はビーズの
粒径によって異なり、ピーク２１は粒径４．５μｍのポ
リスチレンビーズによるもの、ピーク２２は粒径６．０
μｍのポリスチレンビーズによるもの、ピーク２３は粒
径１０．０μｍのポリスチレンビーズによるものであ
る。このように、フローサイトメータによって測定され
た前方散乱光強度によりビーズの粒径を識別することが
できる。
粒径によって異なり、ピーク２１は粒径４．５μｍのポ
リスチレンビーズによるもの、ピーク２２は粒径６．０
μｍのポリスチレンビーズによるもの、ピーク２３は粒
径１０．０μｍのポリスチレンビーズによるものであ
る。このように、フローサイトメータによって測定され
た前方散乱光強度によりビーズの粒径を識別することが
できる。
【００１８】次に、normalのプローブを共有結合したビ
ーズとvariantのプローブを共有結合したビーズが等量
混合されている各粒径のビーズに、末端をフルオレセイ
ンイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で蛍光標識したnorm
alプローブの相補鎖を合成したものをハイブリダイズさ
せた。ハイブリダイゼーション後の各粒径のビーズをフ
ローサイトメータに流し、蛍光強度を測定して得た蛍光
強度ヒストグラムを図３（ａ）〜（ｃ）に示す。図３
（ａ）は粒径４．５μｍのポリスチレンビーズの蛍光強
度ヒストグラム、図３（ｂ）は粒径６．０μｍのポリス
チレンビーズの蛍光強度ヒストグラム、図３（ｃ）は粒
径１０．０μｍのポリスチレンビーズの蛍光強度ヒスト
グラムである。各図において、横軸は蛍光強度、縦軸は
ビーズのカウント数である。
ーズとvariantのプローブを共有結合したビーズが等量
混合されている各粒径のビーズに、末端をフルオレセイ
ンイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で蛍光標識したnorm
alプローブの相補鎖を合成したものをハイブリダイズさ
せた。ハイブリダイゼーション後の各粒径のビーズをフ
ローサイトメータに流し、蛍光強度を測定して得た蛍光
強度ヒストグラムを図３（ａ）〜（ｃ）に示す。図３
（ａ）は粒径４．５μｍのポリスチレンビーズの蛍光強
度ヒストグラム、図３（ｂ）は粒径６．０μｍのポリス
チレンビーズの蛍光強度ヒストグラム、図３（ｃ）は粒
径１０．０μｍのポリスチレンビーズの蛍光強度ヒスト
グラムである。各図において、横軸は蛍光強度、縦軸は
ビーズのカウント数である。
【００１９】それぞれの粒径のビーズはnormalプローブ
が共有結合しているビーズにＦＩＴＣ標識した相補鎖が
ハイブリダイズし、variantプローブの方は１塩基の違
いによりハイブリダイゼーションシグナルが著しく減少
し、その結果としてピークがはっきりと２つに分かれて
いるのがわかる。例えば、図３（ａ）におけるピーク３
２はnormalプローブにＦＩＴＣ標識した相補鎖がハイブ
リダイズしているビーズに由来するピークであり、強い
蛍光が観察されている。一方、ピーク３１はvariantプ
ローブが共有結合しているビーズに由来するピークであ
り、蛍光標識したnormalプローブの相補鎖がハイブリダ
イズしていないため、蛍光がほとんど観察されていな
い。図３（ｂ）、図３（ｃ）においても、図の右側の蛍
光強度が強く観察されているピークはnormalプローブに
ＦＩＴＣ標識した相補鎖がハイブリダイズしているビー
ズに由来するピークであり、左側の蛍光強度が弱いピー
クはvariantプローブが共有結合しているビーズに由来
するピークである。
が共有結合しているビーズにＦＩＴＣ標識した相補鎖が
ハイブリダイズし、variantプローブの方は１塩基の違
いによりハイブリダイゼーションシグナルが著しく減少
し、その結果としてピークがはっきりと２つに分かれて
いるのがわかる。例えば、図３（ａ）におけるピーク３
２はnormalプローブにＦＩＴＣ標識した相補鎖がハイブ
リダイズしているビーズに由来するピークであり、強い
蛍光が観察されている。一方、ピーク３１はvariantプ
ローブが共有結合しているビーズに由来するピークであ
り、蛍光標識したnormalプローブの相補鎖がハイブリダ
イズしていないため、蛍光がほとんど観察されていな
い。図３（ｂ）、図３（ｃ）においても、図の右側の蛍
光強度が強く観察されているピークはnormalプローブに
ＦＩＴＣ標識した相補鎖がハイブリダイズしているビー
ズに由来するピークであり、左側の蛍光強度が弱いピー
クはvariantプローブが共有結合しているビーズに由来
するピークである。
【００２０】次に、normalのプローブを共有結合したビ
ーズとvariantのプローブを共有結合したビーズが等量
混合されている前述の粒径４．５μｍと粒径６．０μｍ
のビーズを用い、合成オリゴDNAターゲットではなくＰ
ＣＲ産物を利用してハイブリダイゼーションを行った。
ＰＣＲ産物にはＦＩＴＣ標識を付けた。ＰＣＲに使用し
たプライマーは UGT forward(TAA/ACT/CTT/TCC/AGG/ATG/GCC/TGC) UGT reverse(ACC/ATG/CCC/CCA/AGT/GCT/AAG/AAG) comt forward(ATC/ACC/CAG/CGG/ATG/GTG/GAT/TTC) comt reverse(TTT/TTC/CAG/GTC/TGA/CAA/CGG/GTC) で、２箇所のＳＮＰｓ検出部位を含む１００ｍｅｒのゲ
ノムＤＮＡに対してＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ反応条
件は、９５℃で１０分間熱変性の後に９４℃で１５秒、
５５℃で３０秒、６８℃で３０秒を１サイクルとして、
３５サイクル行った。ＰＣＲの際に使用するｄＮＴＰに
ＦＩＴＣで標識したｄＵＴＰを使用することで、ＤＮＡ
を蛍光標識し、ハイブリダイゼーションに使用する。
ーズとvariantのプローブを共有結合したビーズが等量
混合されている前述の粒径４．５μｍと粒径６．０μｍ
のビーズを用い、合成オリゴDNAターゲットではなくＰ
ＣＲ産物を利用してハイブリダイゼーションを行った。
ＰＣＲ産物にはＦＩＴＣ標識を付けた。ＰＣＲに使用し
たプライマーは UGT forward(TAA/ACT/CTT/TCC/AGG/ATG/GCC/TGC) UGT reverse(ACC/ATG/CCC/CCA/AGT/GCT/AAG/AAG) comt forward(ATC/ACC/CAG/CGG/ATG/GTG/GAT/TTC) comt reverse(TTT/TTC/CAG/GTC/TGA/CAA/CGG/GTC) で、２箇所のＳＮＰｓ検出部位を含む１００ｍｅｒのゲ
ノムＤＮＡに対してＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ反応条
件は、９５℃で１０分間熱変性の後に９４℃で１５秒、
５５℃で３０秒、６８℃で３０秒を１サイクルとして、
３５サイクル行った。ＰＣＲの際に使用するｄＮＴＰに
ＦＩＴＣで標識したｄＵＴＰを使用することで、ＤＮＡ
を蛍光標識し、ハイブリダイゼーションに使用する。
【００２１】図４は、粒径４．５μｍのビーズの前方散
乱光と、粒径６．０μｍのビーズの前方散乱光を測定し
た結果を示している。強度が弱い方のピーク４１は粒径
４．５μｍのビーズに由来する前方散乱光であり、強度
が強い方のピーク４２は粒径６．０μｍのビーズに由来
する前方散乱光である。前記した粒径４．５μｍと６．
０μｍの２種類のビーズに前述のＰＣＲ産物（ターゲッ
ト）をハイブリダイズさせた後、フローサイトメータに
流して蛍光強度を測定し、蛍光強度ヒストグラムを作成
した。図５（ａ）は粒径４．５μｍのビーズに対する蛍
光強度ヒストグラム、図５（ｂ）は粒径６．０μｍのビ
ーズに対する蛍光強度ヒストグラムである。
乱光と、粒径６．０μｍのビーズの前方散乱光を測定し
た結果を示している。強度が弱い方のピーク４１は粒径
４．５μｍのビーズに由来する前方散乱光であり、強度
が強い方のピーク４２は粒径６．０μｍのビーズに由来
する前方散乱光である。前記した粒径４．５μｍと６．
０μｍの２種類のビーズに前述のＰＣＲ産物（ターゲッ
ト）をハイブリダイズさせた後、フローサイトメータに
流して蛍光強度を測定し、蛍光強度ヒストグラムを作成
した。図５（ａ）は粒径４．５μｍのビーズに対する蛍
光強度ヒストグラム、図５（ｂ）は粒径６．０μｍのビ
ーズに対する蛍光強度ヒストグラムである。
【００２２】図５（ａ）、図５（ｂ）とも、蛍光強度ヒ
ストグラムに２つのピークが現れている。これは、ハイ
ブリダイゼーションによって蛍光標識したＰＣＲ産物
（ターゲット）が結合することによって蛍光を発するこ
とになったビーズと、ＰＣＲ産物が結合せず蛍光を生じ
ないビーズが混在していることを示している。すなわ
ち、図５（ａ）あるいは図５（ｂ）の蛍光強度ヒストグ
ラムは、ターゲットがnormalのプローブとvariantのプ
ローブのうちの一方のみと結合したという情報を提示し
ている。もしターゲットがnormalのプローブとvariant
のプローブの両方と結合すれば、全てのビーズに蛍光標
識が導入されることになるため、フローサイトメータの
蛍光強度ヒストグラムには蛍光強度の強い方の位置に一
つのピークが現れるはずである。このように、本発明に
よると、フローサイトメータの蛍光強度ヒストグラムに
現れるピークの数から一塩基多型についての情報を得る
ことができる。
ストグラムに２つのピークが現れている。これは、ハイ
ブリダイゼーションによって蛍光標識したＰＣＲ産物
（ターゲット）が結合することによって蛍光を発するこ
とになったビーズと、ＰＣＲ産物が結合せず蛍光を生じ
ないビーズが混在していることを示している。すなわ
ち、図５（ａ）あるいは図５（ｂ）の蛍光強度ヒストグ
ラムは、ターゲットがnormalのプローブとvariantのプ
ローブのうちの一方のみと結合したという情報を提示し
ている。もしターゲットがnormalのプローブとvariant
のプローブの両方と結合すれば、全てのビーズに蛍光標
識が導入されることになるため、フローサイトメータの
蛍光強度ヒストグラムには蛍光強度の強い方の位置に一
つのピークが現れるはずである。このように、本発明に
よると、フローサイトメータの蛍光強度ヒストグラムに
現れるピークの数から一塩基多型についての情報を得る
ことができる。
【００２３】フローサイトメータは、ビーズを連続的に
流しながら個々のビーズについて前方散乱光と蛍光を同
時に測定することができるため、ビーズがフローサイト
メータの検出部を通って前方散乱光強度と蛍光強度が測
定されたとき、前方散乱光強度のデータと蛍光強度のデ
ータをペアにして記憶しておく。その後、図２や図４に
示すような前方散乱光強度の大きさ（ビーズの粒径に対
応）によってデータを分類し、同じ前方散乱光強度を有
するデータ集合毎に図３や図５に示すような蛍光強度の
ヒストグラムを作成することにより、同じ粒径のビーズ
に結合している異なるプローブに対してターゲットがど
のようにハイブリダイズしているのかの情報、すなわち
ホモタイプであるのかヘテロタイプであるのかの情報を
得ることができる。１つの粒径のビーズを１つの遺伝子
あるいは１つのＤＮＡ塩基配列に対応づけておけば、複
数の粒径ビーズを用いることにより複数の遺伝子あるい
は複数のＤＮＡ塩基配列の一塩基多型を同時に検出する
ことが可能になる。
流しながら個々のビーズについて前方散乱光と蛍光を同
時に測定することができるため、ビーズがフローサイト
メータの検出部を通って前方散乱光強度と蛍光強度が測
定されたとき、前方散乱光強度のデータと蛍光強度のデ
ータをペアにして記憶しておく。その後、図２や図４に
示すような前方散乱光強度の大きさ（ビーズの粒径に対
応）によってデータを分類し、同じ前方散乱光強度を有
するデータ集合毎に図３や図５に示すような蛍光強度の
ヒストグラムを作成することにより、同じ粒径のビーズ
に結合している異なるプローブに対してターゲットがど
のようにハイブリダイズしているのかの情報、すなわち
ホモタイプであるのかヘテロタイプであるのかの情報を
得ることができる。１つの粒径のビーズを１つの遺伝子
あるいは１つのＤＮＡ塩基配列に対応づけておけば、複
数の粒径ビーズを用いることにより複数の遺伝子あるい
は複数のＤＮＡ塩基配列の一塩基多型を同時に検出する
ことが可能になる。
【００２４】次に、ＤＮＡ塩基配列の一塩基多型がホモ
タイプかヘテロタイプかの情報に加えて、置換塩基の種
類等、より詳細な情報を得るための方法について説明す
る。以下では、粒径が同じ一種類のビーズを使用して、
特定の遺伝子の（一カ所の）一塩基多型を検出する例に
ついて説明する。
タイプかヘテロタイプかの情報に加えて、置換塩基の種
類等、より詳細な情報を得るための方法について説明す
る。以下では、粒径が同じ一種類のビーズを使用して、
特定の遺伝子の（一カ所の）一塩基多型を検出する例に
ついて説明する。
【００２５】まず、注目している遺伝子に関し、一塩基
多型のない塩基配列がハイブリダイズするプローブを表
面に共有結合したビーズＡと、一塩基多型の塩基配列が
ハイブリダイズするプローブを表面に共有結合したビー
ズＢとを調製し、ビーズＡとビーズＢを異なる割合、例
えばＡ：Ｂ＝１：２の割合で混合したものを用意する。
次に、被検者から採取した遺伝子の注目領域を蛍光標識
付けしてＰＣＲ増幅したサンプルを、用意したビーズＡ
とビーズＢの混合物に添加してハイブリダイゼーション
反応を行う。その後、サンプル中のターゲットが表面の
プローブにハイブリダイズしたビーズをフローサイトメ
ータで測定する。
多型のない塩基配列がハイブリダイズするプローブを表
面に共有結合したビーズＡと、一塩基多型の塩基配列が
ハイブリダイズするプローブを表面に共有結合したビー
ズＢとを調製し、ビーズＡとビーズＢを異なる割合、例
えばＡ：Ｂ＝１：２の割合で混合したものを用意する。
次に、被検者から採取した遺伝子の注目領域を蛍光標識
付けしてＰＣＲ増幅したサンプルを、用意したビーズＡ
とビーズＢの混合物に添加してハイブリダイゼーション
反応を行う。その後、サンプル中のターゲットが表面の
プローブにハイブリダイズしたビーズをフローサイトメ
ータで測定する。
【００２６】このとき得られる蛍光強度ヒストグラムと
しては、図６（ａ）〜（ｃ）に示すような３種類のパタ
ーンが考えられる。図６（ａ）は、ビーズＢに比べて数
の少ないビーズＡに蛍光標識が導入された場合、すなわ
ち被検者の遺伝子に一塩基多型がない場合のパターンで
ある。ビーズＡとビーズＢの混合比がＡ：Ｂ＝１：２の
場合、理想的にはピーク６１ａのカウント数とピーク６
１ｂのカウント数の比は２：１になる。図６（ｂ）は、
数が多い方のビーズＢに蛍光標識が導入された場合、す
なわち被検者の遺伝子に一塩基多型がある場合のパター
ンである。このとき、ピーク６２ａのカウント数とピー
ク６２ｂのカウント数の比は理想的には１：２になる。
また、図６（ｃ）は、ビーズＡとビーズＢの両方に蛍光
標識が導入された場合、すなわち被検者の遺伝子が一塩
基多型がない塩基配列と一塩基多型がある塩基配列の両
方を有している場合（ヘテロタイプ）のパターンであ
る。このとき、蛍光強度ヒストグラムには１つのピーク
６３のみが現れる。従って、上記の検査を行い、得られ
た蛍光強度ヒストグラムのパターンが図６（ａ）〜
（ｃ）のいずれであるかを判定することにより、被検者
の遺伝子の注目領域の一塩基多型を検出することができ
る。
しては、図６（ａ）〜（ｃ）に示すような３種類のパタ
ーンが考えられる。図６（ａ）は、ビーズＢに比べて数
の少ないビーズＡに蛍光標識が導入された場合、すなわ
ち被検者の遺伝子に一塩基多型がない場合のパターンで
ある。ビーズＡとビーズＢの混合比がＡ：Ｂ＝１：２の
場合、理想的にはピーク６１ａのカウント数とピーク６
１ｂのカウント数の比は２：１になる。図６（ｂ）は、
数が多い方のビーズＢに蛍光標識が導入された場合、す
なわち被検者の遺伝子に一塩基多型がある場合のパター
ンである。このとき、ピーク６２ａのカウント数とピー
ク６２ｂのカウント数の比は理想的には１：２になる。
また、図６（ｃ）は、ビーズＡとビーズＢの両方に蛍光
標識が導入された場合、すなわち被検者の遺伝子が一塩
基多型がない塩基配列と一塩基多型がある塩基配列の両
方を有している場合（ヘテロタイプ）のパターンであ
る。このとき、蛍光強度ヒストグラムには１つのピーク
６３のみが現れる。従って、上記の検査を行い、得られ
た蛍光強度ヒストグラムのパターンが図６（ａ）〜
（ｃ）のいずれであるかを判定することにより、被検者
の遺伝子の注目領域の一塩基多型を検出することができ
る。
【００２７】次に、一塩基多型で置換される可能性のあ
る塩基が２種類ある場合の測定方法について説明する。
この場合には、注目している遺伝子に関し、一塩基多型
のない塩基配列がハイブリダイズするプローブを表面に
共有結合したビーズＡと、多型の位置の塩基が第１の塩
基で置換された一塩基多型の塩基配列がハイブリダイズ
するプローブを表面に共有結合したビーズＢと、多型の
位置の塩基が第１の塩基と異なる第２の塩基で置換され
た一塩基多型の塩基配列がハイブリダイズするプローブ
を表面に共有結合したビーズＣとを調製し、３種類のビ
ーズを異なる割合、例えばＡ：Ｂ：Ｃ＝１：３：５の割
合で混合したものを用意する。次に、被検者から採取し
た遺伝子の注目領域を蛍光標識付けしてＰＣＲ増幅した
ターゲットを、用意した３種類のビーズＡ、Ｂ、Ｃの混
合物に添加してハイブリダイゼーション反応を行う。そ
の後、ターゲットが表面のプローブにハイブリダイズし
たビーズをフローサイトメータで測定する。
る塩基が２種類ある場合の測定方法について説明する。
この場合には、注目している遺伝子に関し、一塩基多型
のない塩基配列がハイブリダイズするプローブを表面に
共有結合したビーズＡと、多型の位置の塩基が第１の塩
基で置換された一塩基多型の塩基配列がハイブリダイズ
するプローブを表面に共有結合したビーズＢと、多型の
位置の塩基が第１の塩基と異なる第２の塩基で置換され
た一塩基多型の塩基配列がハイブリダイズするプローブ
を表面に共有結合したビーズＣとを調製し、３種類のビ
ーズを異なる割合、例えばＡ：Ｂ：Ｃ＝１：３：５の割
合で混合したものを用意する。次に、被検者から採取し
た遺伝子の注目領域を蛍光標識付けしてＰＣＲ増幅した
ターゲットを、用意した３種類のビーズＡ、Ｂ、Ｃの混
合物に添加してハイブリダイゼーション反応を行う。そ
の後、ターゲットが表面のプローブにハイブリダイズし
たビーズをフローサイトメータで測定する。
【００２８】このとき得られる蛍光強度ヒストグラムの
パターンとしては、例えば図７（ａ）〜（ｆ）に示すよ
うなものが考えられる。図７（ａ）は、一番数の少ない
ビーズＡに蛍光標識が導入された場合、すなわち被検者
の遺伝子に一塩基多型がない場合のパターンである。上
述のようにＡ：Ｂ：Ｃ＝１：３：５であるならば、ピー
ク７１ａのカウント数とピーク７１ｂのカウント数の比
は理想的には（３＋５）：１＝８：１になる。図７
（ｂ）は、ビーズＢに蛍光標識が導入された場合、すな
わち被検者の遺伝子に第１の塩基との置換による一塩基
多型がある場合のパターンである。このとき、ピーク７
２ａのカウント数とピーク７２ｂのカウント数の比は理
想的には６：３＝２：１である。図７（ｃ）は、ビーズ
Ｃに蛍光標識が導入された場合、すなわち被検者の遺伝
子が第２の塩基との置換による一塩基多型がある場合の
パターンである。このとき、ピーク７３ａのカウント数
とピーク７３ｂのカウント数の比は理想的には４：５で
ある。
パターンとしては、例えば図７（ａ）〜（ｆ）に示すよ
うなものが考えられる。図７（ａ）は、一番数の少ない
ビーズＡに蛍光標識が導入された場合、すなわち被検者
の遺伝子に一塩基多型がない場合のパターンである。上
述のようにＡ：Ｂ：Ｃ＝１：３：５であるならば、ピー
ク７１ａのカウント数とピーク７１ｂのカウント数の比
は理想的には（３＋５）：１＝８：１になる。図７
（ｂ）は、ビーズＢに蛍光標識が導入された場合、すな
わち被検者の遺伝子に第１の塩基との置換による一塩基
多型がある場合のパターンである。このとき、ピーク７
２ａのカウント数とピーク７２ｂのカウント数の比は理
想的には６：３＝２：１である。図７（ｃ）は、ビーズ
Ｃに蛍光標識が導入された場合、すなわち被検者の遺伝
子が第２の塩基との置換による一塩基多型がある場合の
パターンである。このとき、ピーク７３ａのカウント数
とピーク７３ｂのカウント数の比は理想的には４：５で
ある。
【００２９】図７（ｄ）は、ビーズＡとビーズＢに蛍光
標識が導入された場合、すなわち被検者の遺伝子が一塩
基多型がない塩基配列と第１の塩基との置換による一塩
基多型がある塩基配列とを同時に有している場合のパタ
ーンである。このとき、ピーク７４ａのカウント数とピ
ーク７４ｂのカウント数の比は理想的には５：４であ
る。図７（ｅ）は、ビーズＡとビーズＣに蛍光標識が導
入された場合、すなわち被検者の遺伝子が一塩基多型が
ない塩基配列と第２の塩基との置換による一塩基多型が
ある塩基配列とを同時に有している場合のパターンであ
る。このとき、ピーク７５ａのカウント数とピーク７５
ｂのカウント数の比は理想的には３：６＝１：２であ
る。図７（ｆ）は、ビーズＢとビーズＣに蛍光標識が導
入された場合、すなわち被検者の遺伝子が第１の塩基に
よる一塩基多型がある塩基配列と第２の塩基との置換に
よる一塩基多型がある塩基配列とを同時に有している場
合のパターンである。このとき、ピーク７６ａのカウン
ト数とピーク７６ｂのカウント数の比は理想的には１：
８である。
標識が導入された場合、すなわち被検者の遺伝子が一塩
基多型がない塩基配列と第１の塩基との置換による一塩
基多型がある塩基配列とを同時に有している場合のパタ
ーンである。このとき、ピーク７４ａのカウント数とピ
ーク７４ｂのカウント数の比は理想的には５：４であ
る。図７（ｅ）は、ビーズＡとビーズＣに蛍光標識が導
入された場合、すなわち被検者の遺伝子が一塩基多型が
ない塩基配列と第２の塩基との置換による一塩基多型が
ある塩基配列とを同時に有している場合のパターンであ
る。このとき、ピーク７５ａのカウント数とピーク７５
ｂのカウント数の比は理想的には３：６＝１：２であ
る。図７（ｆ）は、ビーズＢとビーズＣに蛍光標識が導
入された場合、すなわち被検者の遺伝子が第１の塩基に
よる一塩基多型がある塩基配列と第２の塩基との置換に
よる一塩基多型がある塩基配列とを同時に有している場
合のパターンである。このとき、ピーク７６ａのカウン
ト数とピーク７６ｂのカウント数の比は理想的には１：
８である。
【００３０】このように、一塩基多型で置換される可能
性のある塩基が２種類ある場合であっても、蛍光強度ヒ
ストグラムのパターンが図７（ａ）〜（ｆ）のいずれで
あるかを判定することにより、被検者の遺伝子の注目す
る領域の一塩基多型を検出することができる。一塩基多
型で置換される可能性のある塩基が３種類以上ある場合
についても、複数のターゲットをそれぞれ表面に結合し
たビーズを異なる割合にて混合したものと、一塩基多型
の可能性のある遺伝子領域の塩基配列を蛍光標識してＰ
ＣＲ増幅して得たターゲットとを混合してハイブリダイ
ゼーション反応を行わせたのち、フローサイトメータに
かけ、蛍光強度ヒストグラムのパターンを用いた同様の
方法で、被検者の遺伝子が一塩基多型を有するのか、も
し一塩基多型を有するとすればそれはどの様な多型なの
かを判定することができる。
性のある塩基が２種類ある場合であっても、蛍光強度ヒ
ストグラムのパターンが図７（ａ）〜（ｆ）のいずれで
あるかを判定することにより、被検者の遺伝子の注目す
る領域の一塩基多型を検出することができる。一塩基多
型で置換される可能性のある塩基が３種類以上ある場合
についても、複数のターゲットをそれぞれ表面に結合し
たビーズを異なる割合にて混合したものと、一塩基多型
の可能性のある遺伝子領域の塩基配列を蛍光標識してＰ
ＣＲ増幅して得たターゲットとを混合してハイブリダイ
ゼーション反応を行わせたのち、フローサイトメータに
かけ、蛍光強度ヒストグラムのパターンを用いた同様の
方法で、被検者の遺伝子が一塩基多型を有するのか、も
し一塩基多型を有するとすればそれはどの様な多型なの
かを判定することができる。
【００３１】図８は、フローサイトメータで測定した後
に、ビーズとビーズ表面に相互作用している生体高分子
とを回収するシステムの模式図である。このシステム
は、フローサイトメータの流路８０にメッシュの異なる
フィルター８５，８６，８７を多段に配置したものであ
る。例えば、ビーズとして粒径４．５μｍ、６．０μ
ｍ、１０．０μｍの３種類の粒径のビーズを使用する場
合、フィルターとして網目８μｍのフィルター８５、網
目５μｍのフィルター８６、網目３μｍのフィルター８
７を上流側から順に配置する。フローサイトメータで測
定の終了したビーズと溶液は、通常は廃液として排出さ
れるが、このように排出口にビーズの粒径に応じたフィ
ルター８５〜８７を設置することで、フィルターの目開
きによりビーズを回収することが可能となる。図示する
ように、粒径４．５μｍのビーズはフィルター８５，８
６を通過し、一番下流側に設置された網目３μｍのフィ
ルター８７によって回収される。粒径６．０μｍのビー
ズは、網目８μｍのフィルター８５は通過するが網目５
μｍのフィルター８６を通過することができず、フィル
ター８６で捕獲される。また、粒径１０．０μｍのビー
ズは一番上流側に設置された網目８μｍのフィルター８
５によって捕獲され、回収される。
に、ビーズとビーズ表面に相互作用している生体高分子
とを回収するシステムの模式図である。このシステム
は、フローサイトメータの流路８０にメッシュの異なる
フィルター８５，８６，８７を多段に配置したものであ
る。例えば、ビーズとして粒径４．５μｍ、６．０μ
ｍ、１０．０μｍの３種類の粒径のビーズを使用する場
合、フィルターとして網目８μｍのフィルター８５、網
目５μｍのフィルター８６、網目３μｍのフィルター８
７を上流側から順に配置する。フローサイトメータで測
定の終了したビーズと溶液は、通常は廃液として排出さ
れるが、このように排出口にビーズの粒径に応じたフィ
ルター８５〜８７を設置することで、フィルターの目開
きによりビーズを回収することが可能となる。図示する
ように、粒径４．５μｍのビーズはフィルター８５，８
６を通過し、一番下流側に設置された網目３μｍのフィ
ルター８７によって回収される。粒径６．０μｍのビー
ズは、網目８μｍのフィルター８５は通過するが網目５
μｍのフィルター８６を通過することができず、フィル
ター８６で捕獲される。また、粒径１０．０μｍのビー
ズは一番上流側に設置された網目８μｍのフィルター８
５によって捕獲され、回収される。
【００３２】
【発明の効果】本発明によると、簡単な方法でビーズを
識別し、多種類の検体を同時に測定することが可能とな
る。また、簡便な方法でＤＮＡ塩基配列の一塩基多型を
判別することが可能となる。
識別し、多種類の検体を同時に測定することが可能とな
る。また、簡便な方法でＤＮＡ塩基配列の一塩基多型を
判別することが可能となる。
【図１】粒径４．５μｍのビーズの前方散乱光を測定し
た結果を示す図。
た結果を示す図。
【図２】異なる粒径のビーズ（４．５μｍ、６．０μ
ｍ、１０．０μｍ）の前方散乱光と側方散乱光を測定し
た結果を示す図。
ｍ、１０．０μｍ）の前方散乱光と側方散乱光を測定し
た結果を示す図。
【図３】ハイブリダイゼーション後の各粒径のビーズに
対する蛍光強度ヒストグラムの図。
対する蛍光強度ヒストグラムの図。
【図４】粒径４．５μｍのビーズの前方散乱光と、粒径
６．０μｍのビーズの前方散乱光を測定した結果を示す
図。
６．０μｍのビーズの前方散乱光を測定した結果を示す
図。
【図５】２種類のビーズに対するＰＣＲ産物をハイブリ
ダイゼーションした結果の蛍光強度ヒストグラムを示す
図。
ダイゼーションした結果の蛍光強度ヒストグラムを示す
図。
【図６】一塩基多型判定用の蛍光強度ヒストグラムの例
を示す図。
を示す図。
【図７】一塩基多型判定用の蛍光強度ヒストグラムの他
の例を示す図。
の例を示す図。
【図８】ビーズとビーズ表面に相互作用している生体高
分子とを回収するシステムの模式図。
分子とを回収するシステムの模式図。
２１…粒径４．５μｍのポリスチレンビーズによるピー
ク、２２…粒径６．０μｍのポリスチレンビーズによる
ピーク、２３…粒径１０．０μｍのポリスチレンビーズ
によるピーク、３１…弱い蛍光のピーク、３２…強い蛍
光のピーク
ク、２２…粒径６．０μｍのポリスチレンビーズによる
ピーク、２３…粒径１０．０μｍのポリスチレンビーズ
によるピーク、３１…弱い蛍光のピーク、３２…強い蛍
光のピーク
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/58 Ａ
33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｆターム(参考） 2G045 AA35 DA13 FB02 FB07 FB12
GC11 GC15
2G054 AA06 CA22 CE02 EA03 EA05
GA04
4B024 AA11 CA02 CA09 GA18 HA14
4B063 QA01 QA18 QQ03 QQ43 QR08
QR14 QR32 QR38 QR42 QR55
QR83 QS12 QS25 QS34 QS39
QX02
Claims (12)
- 【請求項１】蛍光標識されたターゲットを含むサンプル
溶液に、第１のプローブが表面に固定化された第１の粒
径のビーズと、前記第１のプローブとは異なる第２のプ
ローブが表面に固定化された第２の粒径のビーズを混合
してターゲットとプローブとのハイブリダイゼーション
反応を行わせるステップと、 前記ハイブリダイゼーション反応の後、前記ビーズをフ
ローサイトメータに流し前方散乱光と蛍光とを同時に検
出するステップと、 前記前方散乱光強度に基づいてビーズの粒径を識別する
ステップとを含むことを特徴とするターゲット検出方
法。 - 【請求項２】請求項１記載のターゲット検出方法におい
て、粒径の同じビーズには同じプローブが固定化され、
粒径の異なるビーズにはそれぞれ異なるプローブが固定
化されていることを特徴とするターゲット検出方法。 - 【請求項３】一塩基多型のないＤＮＡ塩基配列とハイブ
リダイズするプローブが表面に固定化された第１のビー
ズと、表面に固定化されている配列が、一塩基多型のあ
るＤＮＡ塩基配列とハイブリダイズするプローブである
点においてのみ前記第１のビーズと異なる第２のビーズ
とが混合されていることを特徴とするＤＮＡ塩基配列の
一塩基多型検出用試薬。 - 【請求項４】請求項３記載のＤＮＡ塩基配列の一塩基多
型検出用試薬において、前記第１のビーズと前記第２の
ビーズとが同じ割合で混合されていることを特徴とする
ＤＮＡ塩基配列の一塩基多型検出用試薬。 - 【請求項５】請求項３記載のＤＮＡ塩基配列の一塩基多
型検出用試薬において、前記第１のビーズと前記第２の
ビーズとが異なる割合で混合されていることを特徴とす
るＤＮＡ塩基配列の一塩基多型検出用試薬。 - 【請求項６】一塩基多型のない第１のＤＮＡ塩基配列と
ハイブリダイズするプローブが表面に固定化された第１
の粒径の第１のビーズと、表面に固定化されている配列
が、一塩基多型のある前記第１のＤＮＡ塩基配列とハイ
ブリダイズするプローブ配列である点においてのみ前記
第１のビーズと異なる第２のビーズと、 一塩基多型のない第２のＤＮＡ塩基配列とハイブリダイ
ズするプローブが表面に固定化された第２の粒径の第３
のビーズと、表面に固定化されている配列が、一塩基多
型のある前記第２のＤＮＡ塩基配列とハイブリダイズす
るプローブである点においてのみ前記第３のビーズと異
なる第４のビーズとが混合されていることを特徴とする
ＤＮＡ塩基配列の一塩基多型検出用試薬。 - 【請求項７】請求項６記載のＤＮＡ塩基配列の一塩基多
型検出用試薬において、前記第１のビーズと前記第２の
ビーズとが異なる割合で混合されており、前記第３のビ
ーズと前記第４のビーズとが異なる割合で混合されてい
ることを特徴とするＤＮＡ塩基配列の一塩基多型検出用
試薬。 - 【請求項８】請求項３〜７記載のＤＮＡ塩基配列の一塩
基多型検出用試薬において、前記ビーズの粒径は０．１
μｍ〜１ｍｍであることを特徴とするＤＮＡ塩基配列の
一塩基多型検出用試薬。 - 【請求項９】一塩基多型のないＤＮＡ塩基配列とハイブ
リダイズするプローブが表面に固定化された第１のビー
ズと、表面に固定化されている配列が、一塩基多型のあ
るＤＮＡ塩基配列とハイブリダイズするプローブである
点においてのみ前記第１のビーズと異なる第２のビーズ
とを、蛍光標識した被検ＤＮＡ塩基配列を含むサンプル
溶液に混合してハイブリダイゼーション反応を行わせる
ステップと、 前記ハイブリダイゼーション反応の後、前記ビーズをフ
ローサイトメータに流し、蛍光強度を測定して蛍光強度
ヒストグラムを作成するステップと、 前記蛍光強度ヒストグラムのピークパターンに基づいて
前記被検ＤＮＡ塩基配列の一塩基多型を判定するステッ
プとを含むことを特徴とするＤＮＡ塩基配列の一塩基多
型検出方法。 - 【請求項１０】請求項９記載のＤＮＡ塩基配列の一塩基
多型検出方法において、前記ピークの数が１つであるか
２つであるかに基づいて前記被検ＤＮＡ塩基配列の一塩
基多型を判定することを特徴とするＤＮＡ塩基配列の一
塩基多型検出方法。 - 【請求項１１】請求項９記載のＤＮＡ塩基配列の一塩基
多型検出方法において、前記第１のビーズと前記第２の
ビーズとが異なる割合で混合されていることを特徴とす
るＤＮＡ塩基配列の一塩基多型検出方法。 - 【請求項１２】請求項１１記載のＤＮＡ塩基配列の一塩
基多型検出方法において、前記蛍光強度ヒストグラムに
おける蛍光強度の違う２つのピークの比に基づいて前記
被検ＤＮＡ塩基配列の一塩基多型を判定することを特徴
とするＤＮＡ塩基配列の一塩基多型検出方法。
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