DE60210568T2

DE60210568T2 - Coenzym Q10 zur Behandlung von Erkrankungen der Augen

Info

Publication number: DE60210568T2
Application number: DE60210568T
Authority: DE
Inventors: Rosario Brancato; Giorgio Lenaz; Sergio Capaccioli; Nicola Schiavone
Original assignee: SIMONELLI GUISEPPE
Current assignee: SIMONELLI GUISEPPE
Priority date: 2001-12-20
Filing date: 2002-12-17
Publication date: 2007-05-24
Anticipated expiration: 2022-12-18
Also published as: ATE322895T1; ITRM20010755A1; US20030118576A1; ES2262777T3; DE60210568D1; EP1321138A1; US7029672B2; EP1321138B1

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Zusammensetzung aus Coenzym Q₁₀ (oder Ubichinon Q₁₀ oder Chinon Q₁₀, CoQ₁₀) oder Ubichinol zum Herstellen eines Medikaments für die Verhütung, die Behandlung und/oder die Linderung von degenerativen Pathologien des Auges mit einer familienerblichen, entzündlichen, dysmetabolischen, senilen altersbezogenen Natur, wobei sich der degenerative Prozess aus apoptotischen Phänomenen, d. h. dem programmierter Zelltod (PZT) ableitet.
Die vorliegende Erfindung offenbart auch die topische Verabreichung einer Coenzym Q₁₀- oder einer Ubichinonzusammensetzung.
Hintergrund der Erfindung
Apoptose oder der programmierte Zelltod (PZT) ist in eine Vielzahl degenerativer Pathologien einschließlich der Pathologien des hinteren Teils des Auges und der perioptischen Fläche involviert. Unter diesen Krankheiten gibt es familienerbliche, entzündliche, dysmetabolische und altersbezogene makulare und retinale Degenerationen, z. B.: das Glaukom, die altersbezogene makulare Degeneration, die Retinitis pigmentosa, verschiedene familienerbliche Makulopathien wie die Stargardt-Erkrankung, die vitelliformen makularen Zysten und die Konusdystrophie, die diabetische Retinopathie (exudativ oder proliferierend), die durch Bluthochdruck bedingte Retinopathie, die ischämische Optikopathie, die senile Trübung der Linsen, das Katarakt, das Ablösen der Retina (Netzhaut), die Uveitis, das Retinoblastom, die Neuritis und die optischen Neuropathien von toxischem, entzündlichem und degenerativem Ursprung. In all diesen Pathologien ist die Degeneration durch den Zelltod durch Apoptose bedingt.
Das Glaukom kann als ein paradigmatisches Beispiel solch einer Gruppe von Pathologien genommen werden, in denen apoptotische Vorgänge eine wichtige Rolle für sowohl die involvierten pathogenetischen Mechanismen wie auch für die Ausbreitung der Krankheit spielen. Das Glaukom ist eine optische Neuropathie, die einen Verlust an Ganglionzellen mit einem fortschreitenden Verlust des Sichtfeldes und der visuellen Funktion und einem anschließenden Abbau des optischen Nervenkopfes bestimmt. Der hohe intraokulare Druck (Innendruck des Auges) ist ein Risikofaktor für die Entwicklung der Krankheit und es ist bekannt, dass die Verringerung des intraokularen Drucks den optischen Nerv vor weiteren Schäden schützt.
In Patienten, die vom Glaukom betroffen sind, ist der Verlauf der Erkrankung üblicher Weise langsam und unregelmäßig mit einer deutlichen Variabilität zwischen Individuen. Obwohl es nicht so scheint, dass es eine direkte Korrelation zwischen dem Tod der Ganglionzellen und dem Verlauf der Mängel im Sichtfeld gibt, wird angenommen, dass der Zellverlust dem Beginn der Sichtfeldveränderungen vorausgeht. Der fortschreitende Verlust der Sichtfunktion war mit verschiedenen Risikofaktoren wie dem hohen intraokularen Druck oder dem Vorhandensein einer lokalen oder systemischen Deregulation des Blutflusses assoziiert. Da experimentelle und klinische Tests gezeigt haben, dass okularer Bluthochdruck ein ursächlicher Faktor für das Fortschreiten der glaukomatösen optischen Neuropathie ist, ist die universell anerkannte Behandlung zur Zeit im Wesentlichen auf die Verringerung des intraokularen Drucks beschränkt, z. B. durch Medikamente mit einer diuretischen Wirkung, β-Blocker- Medikamente und andere.
Die Beobachtungen betreffen nicht nur Menschen, sondern auch Säugetiere im Allgemeinen und insbesondere Haustiere.
Kürzlich haben in vitro- und in vivo- Studien an Tiermodellen die Möglichkeit vorgeschlagen, dass ein Patient, der von einem Glaukom betroffen ist, von einer neuroprotektiven Behandlung profitieren könnte, die auf die Verlangsamung der Progression des Todes von Ganglionzellen gerichtet ist (Nickells R. W. Apoptosis of retinal ganglion cells in glaucoma: an update of the molecular pathways involved in cell death. Surv. Ophtalmol. 1999; 43: S151 – 161). Zudem ist es bekannt, dass der größte Teil der retinalen Ganglionzellen in Glaukomen durch Apoptose stirbt (Kerrigan L. A., Zack D. J., Quickley H. A., et al. TUNEL-positive ganglion cells in human primary open-angle glaucoma. Arch. Ophtalmol. 1997; 115: 1031 – 1035), und dass die Hypoxie nach der Ischämie eine der sicheren Ursachen des zellulären Todes ist (Gross R. L., Hensley S. H., Gao F., Wu F. M., Retinal ganglion cell dysfunction induced by hypoxia and glutamate: potential neuroprotective effects of beta-blockers. Surv. Ophtalmol. 1999, 43 Erg.: S162 – 70).
Obwohl das Glaukom hierin als ein paradigmatisches Beispiel verwendet wurde, haben alle oben genannten degenerativen Pathologien zwei gemeinsame Merkmale, sie beschädigen den hinteren Teil des Auges (d. h. die Retina und/oder den optischen Nerv) und sie durchlaufen verschiedene Arten von apoptotischen Vorgängen in diesen Geweben, wobei die aptoptotischen Vorgänge durch sehr unterschiedliche Phänomene wie: Ischämie, Hypoxie/Anoxie, Mangel an trophischen Faktoren, das Vorhandensein freier Radikale ausgelöst werden.
Unter Berücksichtigung der gemeinsamen Merkmale, die die oben genannten Pathologien gemeinsam haben, gibt es einen Bedarf an der Bereitstellung von Mitteln für die Behandlung, Linderung oder Verhütung von allen oben genannten apoptotischen Vorgängen, womit auf eine neuroprotektive Aktivität in dem hinteren Teil des Auges gezielt wird.
Die PCT WO 01/37851 in dem Namen des gleichen Anmelders wie der vorliegenden Erfindung offenbart die Verwendung von Coenzym Q₁₀ bei der Verhütung des PZD, der sich aus chirurgischen Behandlungen zur Hornhautfotobrechung (vorderer Teil des Auges) mittels eines Excimer-(Kaltlicht)- Lasers und dem Aussetzen an ultraviolette Strahlen ableitet.
Die oben genannte Patentanmeldung lehrt, wie man die Apoptose der Hornhautzellen (vorderer Teil des Auges), die durch die Generierung freier Radikale ausgelöst wird, die durch elektromagnetische Strahlungen hergestellt werden, bekämpft.
Coenzym Q₁₀ oder Ubichinon ist ein Coenzym, das in der Zelle auf der mitochondrialen inneren Membran vorhanden ist, wo seine Funktion in Verbindung mit einer Reihe von Faktoren in der Elektronentransportkette, die in der Produktion von Energie in der Form von Adenosintriphosphat (ATP) kulminiert, entscheidend ist. Zudem ist das Coenzym Q₁₀ ein aktiver Radikalfänger und sein Vorhandensein, das genau mit dieser Aktivität assoziiert ist, wurde auch auf der Ebene der Plasmamembran nachgewiesen. Man muss darauf hinweisen, dass die tatsächlichen Therapien von z. B. Glaukomen im Wesentlichen auf die Verringerung des intraokularen Drucks beschränkt sind und eine neuroprotektive Aktivität nicht vorsehen. Stattdessen gibt es bis heute keinerlei Wissen, dass die Aktivität von Coenzym Q₁₀ als ein Molekül betrifft, das anti-apoptotische Eigenschaften in pathologischen Zuständen haben könnte, bei denen der apoptotische Vorgang auch unabhängig von der Erhöhung an freien Radikalen zustande kommen kann. Dies ist insbesondere der Fall bei einer durch Ischämie, Hypoxie/Anoxie, Mangel an tropischen Faktoren bedingten Apoptose. Es gibt nämlich keinerlei Hinweise auf die Tatsache, dass Coenzym Q₁₀ auch in einer zu seiner gut bekannten antioxidativen Wirkung verschiedenen Weise fungieren kann. Es gibt daher die Notwendigkeit an einer neuroprotektiven Therapie für die degenerativen Erkrankungen des hinteren Teils des Auges, die auf die Unterbrechung, Verlangsamung oder Verhinderung des programmierten Zelltodes unabhängig von den Mechanismen, die durch PZT ausgelöst werden, gerichtet ist.
Diese Notwendigkeit ergibt sich aus der Beobachtung, dass bei den Pathologien des Auges, wie den familienerblichen, entzündlichen, dysmetabolischen und altersbedingten makularen und retinalen Degenerationen, der degenerative Prozess bedingt durch eine Apoptose nicht einheitlich ausgelöst wird, sondern durch eine Mischung von apoptotischen Phänomenen ausgelöst wird, die durch unterschiedliche Stimuli ausgelöst werden, wie ein Überschuss freier Radikale, Ischämie, Hypoxie/Anoxie, ein Mangel an trophischen Faktoren. In all den genannten Pathologien ist der größte Teil der apoptotischen Vorgänge nicht auf das Vorhandensein freier Radikale zurückzuführen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Beobachtung von zwei verschiedenen unerwarteten Vorgängen.
Der erste ist, dass sich das Coenzym Q_{10 in} unerwarteter Weise in der Retina anhäuft, auch dann wenn es topisch auf den vorderen Teil des Auges verabreicht wird. Der zweite und wichtigere ist, dass das Coenzym Q₁₀ seine anti-apoptotischen Wirkungen auch auf apoptotische Vorgänge überträgt, die nicht durch die Bildung freier Radikaler ausgelöst werden.
Daher stellt die vorliegende Erfindung Mittel zur Verhütung, Behandlung und/oder Linderung apoptotischer Vorgänge in degenerativen Pathologien des hinteren Teils des Auges zur Verfügung, und zwar unabhängig von den Mechanismen, die diese Vorgänge verursachen (somit auch apoptotische Vorgänge, die nicht durch einen Überschuss an freien Radikalen ausgelöst werden). Bedingt durch die Verschiedenheit der unterschiedlichen Stoffwechselwege, die eine apoptotische Reaktion der Zelle verstärken können und bedingt durch die Tatsache, dass das Coenzym Q₁₀ als ein Fänger freier Radikaler wohl bekannt ist, war die anti-apoptotische Wirkung des Moleküls gemäß der Erfindung vollkommen unerwartet.
In der vorliegenden Anmeldung wird die überraschende Fähigkeit des Coenzyms Q₁₀ zur Verhütung von apoptotischen Phänomenen, die durch drei apoptotische Stimuli ausgelöst werden, von denen bekannt ist, dass sie nicht durch die Bildung freier Radikale und durch UVC ausgelöst werden, gezeigt. Diese Stimuli, die unabhängig von der Bildung freier Radikaler sind, sind:

1) Antimycin A, das als ein Modell für die durch Hypoxie ausgelöste Apoptose verwendet wird;
2) C₂-Ceramid, das ein zelldurchlässiges Analogon von Ceramid (ein natürlicher, lipidischer, apoptotischer Botenstoff, der von freien Radikalen unabhängig ist) ist; und
3) Der Entzug von Überlebensfaktoren durch Serumentzug, bei dem man davon ausgeht, dass freie Radikale die primäre apoptotische Bedrohung nicht auslösen.

Die Beispiele der vorliegenden Erfindung zeigen, dass die oben genannten Stimuli apoptotische Vorgänge auslösen, die nicht den Überschuss freier Radikaler involvieren, und dass Coenzym Q₁₀ auch eine anti-apoptotische Wirkung in diesen apoptotischen Vorgängen aufweist. Das in der vorliegenden Erfindung gezeigte, das die allgemeine anti-apoptotische Wirkung von Coenzym Q₁₀ betrifft, ist mit der einen neuen das erste Mal offenbarten Lehre in Verbindung zu bringen, gemäß der Coenzym Q₁₀ sich in den Netzhäuten und in dem optischen Nerv von Augen anhäuft, die mit einer Zubereitung zur topischen Verwendung behandelt werden.
Somit ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Verwendung von Coenzym Q₁₀ oder Ubichinon als ein aktives Prinzip für das Herstellen eines Medikaments zur Verhütung, Behandlung und/oder Linderung apoptotischer Vorgänge, die in degenerativen Pathologien des hinteren Teils des Auges vorkommen; wobei die Verabreichung davon topisch ist.
Die durch die vorliegende Erfindung verhüteten, behandelten oder gelinderten apoptotischen Vorgänge sind alle apoptotische Vorgänge, die okulare degenerative Pathologien auslösen, genauer gesagt, die den hinteren Teil des Auges betreffen. Die Bedeutung des „hinteren Teils des Auges" gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Retina (Netzhaut) und der optische Nerv.
Insbesondere liegt die Verwendung des Coenzyms Q₁₀ oder eines funktionell äquivalenten Derivates davon gemäß der vorliegenden Erfindung in der Herstellung von Medikamenten zur Verwendung in topischen Behandlungen, um die apoptotischen Vorgänge zu verhüten, zu lindern oder zu behandeln, die durch Ischämie, Hypoxie/Anoxie, einen Mangel an trophischen Faktoren, einen Überschuss an freien Radikalen induziert werden, der/die in dem hinteren Teil des Auges zustande kommen. Insbesondere die degenerativen Pathologien des Auges, bei denen apoptotische Vorgänge direkt in den degenerativen Prozess involviert sind. Genauer gesagt, die degenerativen Pathologien gemäß der vorliegenden Erfindung sind neurodegenerative Pathologien.
Genauer gesagt liegt der Nutzen von Coenzym Q₁₀ oder eines funktionell äquivalenten Derivats davon gemäß der vorliegenden Erfindung in der Herstellung eines Medikaments für die topische Behandlung der apoptotischen Vorgänge der Pathologien der Retina und des optischen Nervens wie bei familienerblichen, entzündlichen, dysmetabolischen und altersbedingten makularen und retinalen Degenerationen. Beispiele von solchen Pathologien gemäß der Erfindung sind: das Glaukom, die altersbedingte makulare Degeneration, die Retinitis pigmentosa, verschiedene familienerbliche Makulopathien wie die Stargardt-Erkrankung, die vitelliformen makularen Zysten und die Konusdystrophie, die diabetische Retinopathie (exudativ oder proliferierend), die durch Bluthochdruck bedingte Retinopathie, die ischämische Optikopathie, die senile Trübung der Linsen, das Katarakt, das Ablösen der Retina, die Uveitis, das Retinoblastom, die Neuritis und die optischen Neuropathien aus toxischer, entzündlicher und degenerativer Ursache, wobei der pathogenetische Mechanismus davon auch einen Überschuss an programmiertem Zelltod (PZT) umfasst, bei dem freie Radikale nicht involviert sind. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Coenzym Q₁₀ oder Ubichinol für die oben genannten Behandlungen verwendet werden oder für die Herstellung der oben genannten Medikamente zur Verwendung im Menschen oder im Tier verwendet werden. Unter den Tieren sind domestizierte Tiere wie Haustiere bevorzugt.
Die oben genannte Verwendung von Coenzym Q₁₀ oder eines funktionell äquivalenten Derivats davon kann durch topische oder systemische Verabreichung durchgeführt werden.
Das Coenzym Q₁₀ oder Ubichinol kann topisch in einem Medikament in der Form einer Augensalbe verabreicht werden. Die Formulierungen einer geeigneten Augensalbe, die Coenzym Q₁₀ umfasst, werden in der PCT WO 01/37851 beschrieben.
Coenzym Q₁₀ oder Ubichinol kann topisch durch all die Wege, die dem Fachmann bekannt sind, verabreicht werden. Gemäß der Erfindung können die oben beschriebenen aktiven Verbindungen ein Mal oder mehrere Male am Tag verabreicht werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1) stellt eine Balkengrafik dar, die die Anzahl lebender Zellen 24 Stunden nach der Behandlung mit UVC oder Antimycin A im Vergleich zu der nicht behandelten Kontrolle zeigt.
2) stellt eine Balkengrafik dar, die die schützende Wirkung von Coenzym Q₁₀ gegenüber der Apoptose zeigt, die durch UVC und Antimycin A induziert wird, 24 Stunden nach der Behandlung, die als die Anzahl der gesamten apoptotischen Vorgänge ausgedrückt wird.
3) stellt eine Grafik dar, die die Wirkung von Coenzym Q₁₀ auf die Malondialdehydmengen nach der Behandlung mit UVC oder Antimycin A zeigt.
4) stellt eine Grafik dar, die die Wirkung von Coenzym Q₁₀ auf die Adenosintriphosphat (ATP)- Mengen nach der Behandlung mit UVC und Antimycin A zeigt.
5) stellt eine Grafik dar, die die Einfangkinetiken von Coenzym Q₁₀ durch die Choroidea (Aderhaut)/Retina nach Behandlungen mit einer Augensalbenformulierung an weißen Neuseeland-Kaninchen im Vergleich zu der unbehandelten Kontrolle zeigt.
6) stellt eine Grafik dar, die das Einfangen von Coenzym Q₁₀ durch die Choroidea/Retina von weißen Neuseeland-Kaninchen zeigt, die mit einer Augensalbenformulierung behandelt wurden, im Vergleich zu der nicht behandelten Kontrolle.
7) Nachweis der DNA-Fragmentierung in apoptotischen Nuklei durch die Endmarkierung des Klenow Fragments (FragEL, Oncogene Research Products) der DNA. RCE-Zellen wurden mit Antimycin A (A) stimuliert; mit Coenzym Q₁₀ vor der Stimulierung mit Antimycin A behandelt (B); Serumentzug (C); mit Coenzym Q₁₀ vor dem Serumentzug behandelt (D).
8) Überleben von RCE, ausgedrückt als die Zahl lebender Zellen/Platte, was durch MTT-Analyse 24 Stunden nach UVC-Bestrahlung, Verabreichung von 200 μM Antimycin A oder 20 μM Ceramid bestimmt wird, wobei vorher mit 10 μM Coenzym Q₁₀ (8A) oder 10 μM Vitamin C (8B) oder auch nicht behandelt wird. Die Zellen wurden anfänglich mit 3 × 10⁵ Zellen/Platte ausplattiert. Jeder Punkt ist das Mittel ± SE von 5 Experimenten für die 8A und 3 Experimenten für die 8B. *p ≤ 0,005 im Vergleich zu mit Coenzym Q₁₀ oder Vitamin C unbehandelten Zellen.
9) Videomikroskopie des Zeitverlaufs von RCE-Zellen 24 Stunden nach UVC-Bestrahlung (linker Abschnitt); Stimulation mit 200 μM Antimycin A (mittlere Abschnitte); oder Stimulation mit 20 μM Ceramid (rechte Abschnitte), wobei eine Behandlung mit 10 μM Coenzym Q₁₀ vorausging oder auch nicht. (A) Unbehandelte RCE-Zellen; (B) UVC-bestrahlt; (C) mit Coenzym Q₁₀ vor der UVC-Bestrahlung behandelt; (D) mit Antimycin A stimuliert (AA); (E) mit Coenzym Q₁₀ vor der Stimulierung mit Antimycin A behandelt; (F) mit Ceramid stimuliert; (G) mit Coenzym Q₁₀ vor der Stimulierung mit Ceramid behandelt. Apoptotische RCE-Zellen erscheinen weiß, geschrumpft und vom Substrat losgelöst. Deren Anzahl ist nach der Behandlung mit Coenzym Q₁₀ wesentlich verringert (untere Abschnitte).
10) Verringerung der kumulativen apoptotischen Vorgänge durch Behandlung mit Coenzym Q₁₀ in RCE-Zellen. Die apoptotischen Vorgänge wurden durch die Videomikroskopie des Zeitverlaufs während der 24 Stunden nach apoptotischen Stimuli, wie sie zuvor beschrieben wurden, bewertet. In Bezug auf die unbehandelten Zellen erhöhte die UVC-Bestrahlung, Antimycin A und Ceramid deutlich die Anzahl der kumulierenden apoptotischen Vorgänge in RCE-Zellen, was wesentlich durch die Behandlung mit dem Coenzym Q₁₀ reduziert war.
Jeder Punkt ist das Mittel ± SE von 3 Experimenten. *p ≤ 0,005 im Vergleich zu nicht mit Coenzym Q₁₀ behandelten Zellen. **p ≤ 0,05 im Vergleich zu nicht mit Coenzym Q₁₀ behandelten Zellen.
11) Quantifizierung der Malonaldehyd (MDA)- Mengen und der SOD-Aktivität in RCE-Zellen 24 Stunden nach apoptotischer Simulierung mit UVC bei 254 nm (15 mJ/cm²), mit Antimycin A (200 μM), mit Ceramid (20 μM) oder durch Serumentzug, mit oder ohne vorherige 2 stündige Behandlung mit jeweils 10 μM Coenzym Q₁₀ (links) oder Vitamin C (rechts). RCE-Zellen waren: 1) nicht stimuliert; 2) mit Coenzym Q₁₀ oder Vitamin C- behandelt; 3) UVC-bestrahlt; 4) mit Coenzym Q₁₀ oder Vitamin C behandelt und mit UVC bestrahlt; 5) mit Antimycin A stimuliert; 6) mit Coenzym Q₁₀ oder Vitamin C behandelt und mit Antimycin A stimuliert; 7) mit Ceramid stimuliert; 8) mit Coenzym Q₁₀ oder Vitamin C behandelt und mit Ceramid stimuliert; 9) mit Seriumentzug; 10) mit Coenzym Q₁₀ oder Vitamin C behandelt und mit Serumentzug. Jeder Punkt war das Mittel ± SE von 5 Experimenten, *p ≤ 0,001 im Vergleich zu nicht mit Coenzym Q₁₀ oder Vitamin C behandelten Zellen.
12) Untersuchung der zellulären ATP-Mengen in RCE-Zellen 24 Stunden nach der Anwendung apoptotischer Stimuli. Die Zubereitung der Zelllysate wird in Materialien und Methoden beschrieben. Die Behandlung mit Coenzym Q₁₀ verringerte wesentlich den zellulären ATP-Verlust. Jeder Punkt ist das Mittel ± SE von 3 Experimenten. *p ≤ 0,005 im Vergleich zu nicht mit Coenzym Q₁₀ behandelten Zellen.
13) Nachweis des mitochondrialen Membranpotentials durch den Doppelfluoreszenz JC-1-Assay. Duale Emissionsbilder (525 und 590 nm) zeigen das Signal der monomeren (grün) und der J-Aggregat- (rot) JC-1-Fluoreszenz in RCE-Zellen. (a) Unbehandelte RCE-Zellen zeigen rot gefärbte Mitochondrien (großes negatives Membranpotential). Die Mitochondrien der RCE-Zellen, die 24 Stunden nach apoptotischem Stimulus untersucht wurden mit (b) UVC-Bestrahlung; (d) mit 200 μM Antimycin A, oder (f) mit 20 μM Ceramid schienen einheitlich grün gefärbt zu sein (niedrigeres Membranpotential). Die Behandlung mit Coenzym Q₁₀ schützte wesentlich gegen den Verlust des mitochondrialen Membranpotentials wie es durch das erneute Erscheinen rot gefärbter Mitochondrien in RCE-Zellen zu erkennen war; (c) mit Coenzym Q₁₀ vor der UVC-Bestrahlung behandelt; (e) mit Coenzym Q₁₀ vor der Verabreichung von Antimycin A behandelt; (g) mit Coenzym Q₁₀ vor der Verabreichung von Ceramid.
14) Westernblot-Analyse der cytosolischen Extrakte aus RCE-Zellen mit 1 μg/ml Anti-Cytochrom C – mAb. Bahnen: 1) unbehandelte Kontrolle; 2) UVC-Bestrahlung; 3) Coenzym Q₁₀ Behandlung und UVC-Bestrahlung; 4) 200 μM Antimycin A; 5) Coenzym Q₁₀ Behandlung und 200 μM Antimycin A; 6) 20 μM Ceramid; 7) Coenzym Q₁₀ Behandlung und 20 μM Ceramid. Die Banddichte des cytoplasmatischen Cytochroms C (Pfeil) erhöhte sich nach der apoptotischen Behandlung von RCE-Zellen (Bahnen 2, 4, 6) im Vergleich zu nicht behandelten Kontrollen (Bahn 1). Die Anwendung von Coenzym Q₁₀ vor den apoptotischen Stimuli verringerte signifikant die Banddichte (Bahnen 3, 5, 7).
15) Caspase 9- Aktivität. Bahnen: 1) unbehandelte Kontrolle; 2) UVC-Bestrahlung; 3) Coenzym Q₁₀ Behandlung und UVC-Bestrahlung; 4) 200 μM Antimycin A; 5) Coenzym Q₁₀ Behandlung und 200 μM Antimycin A; 6) 20 μM Ceramid; 7) Coenzym Q₁₀ Behandlung und 20 μM Ceramid. Die Aktivität der Caspase 9 erhöhte sich um das 6 – 8- fache nach der apoptotischen Behandlung der RCE-Zellen (Bahnen 2, 4, 6). Die Anwendung von Coenzym Q₁₀ verringerte deutlich die Caspase 9- Aktivierung in allen Fällen (Bahnen 3, 5, 7).
16) Nukleosomale Leiterbildung. Bahnen: 1) unbehandelte Kontrolle; 2) UVC-Bestrahlung; 3) Coenzym Q₁₀ Behandlung und UVC-Bestrahlung; 4) 200 μM Antimycin A; 5) Coenzym Q₁₀ Behandlung und 200 μM Antimycin A; 6) 20 μM Ceramid; 7) Coenzym Q₁₀ Behandlung und 20 μM Ceramid. Die durch alle drei apoptotischen Stimuli induzierte Fragmentierung der DNA (Bahnen 2, 4, 6) war größtenteils verringert, wenn eine Behandlung mit Coenzym Q₁₀ der Verabreichung eines apoptotischen Stimulus vorausging (Bahnen 3, 5, 7). M) Molekulare DNA-Gewichtsmarken λ/Hind III.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Coenzym Q₁₀- oder Ubichinol- Zusammensetzung zum Herstellen eines Medikaments zur topische Verabreichung auf das Auge verwendet werden. Das Medikament, das das Coenzym Q₁₀ oder ein funktionell äquivalentes Derivat davon umfasst, liegt vorzugsweise in einer Form von Augentropfen vor und kann die opthalmologische Lösung sein, wie sie in der PCT WO 01/37851 beschrieben wird. Die ophtalmologische Lösung kann lokal durch oberflächliches Aufträufeln verabreicht werden.
Die Zusammensetzung umfasst: 0,01 bis zu 2,0 Gewichtsprozent Coenzym Q₁₀ oder ein funktionell äquivalentes Derivat davon; 0,005 bis zu 0,1 Gewichtsprozent Tocopherol; und ein Gemisch umfassend ein modifiziertes Rizinusöl und ein Block Copolymer aus hydrophilem Ethylenoxid und einem lipophilen Propylenoxid mit einem überwiegenden Anteil von Polyoxyethylen, einem mittleren Molekulargewicht zwischen 10.000 und 13.000 Dalton und einem Hydrophilie-Lypophilie-Gleichgewicht (HLB)-Wert von mehr als 15, in einer Menge, die ausreicht, um die Komponenten in einer wässrigen Lösung löslich zu machen, üblicher Weise zwischen 10 und 15 Gewichtsprozent.
Die Mischung aus diesen zwei Tensiden (Polyoxyethylen-Polyoxypropylen) und einem modifizierten Rizinusöl (Polyethylenglycolglyceryltriricinoleat) produziert die vollständige mizellare Solubilisierung der Komponenten der pharmazeutischen Form.
Ein spezielles Beispiel des oben genannten Blockcopolymers ist ein kommerzielles Produkt, das Lutrol F127 genannt wird.
Die Konzentrationen an Coenzym Q₁₀ oder Ubichinol, die zur Formulierung ophtalmologischer Lösungen verwendet werden können, liegen zwischen 0,01 und 2,0 Gewichtsprozent, mehr bevorzugt zwischen 0,1 und 1,0 Gewichtsprozent, wobei die ideale Konzentration als „Anti-hornhautmittel" bei 0,2 Gewichtsprozent liegt. Die Tocopherolkonzentrationen in diesen Zubereitungen liegen im Allgemeinen zwischen 0,005 und 0,1 Gewichtsprozent, mehr bevorzugt zwischen 0,01 und 0,5 Gewichtsprozent.
In einer mehr bevorzugten Weise umfasst eine bevorzugte Zusammensetzung: Coenzym Q₁₀ oder Ubichinol mit ungefähr 0,2 Gewichtsprozent; Tocopherol mit 0,02 bis zu 0,04 Gewichtsprozent und das Gemisch umfasst Polyethylenglycolglyceryltriricinoleat und ein Ethylenoxid-/Propylenoxid-Blockpolymer mit einem Anteil von ungefähr 70 % Polyethylenoxid, einem durchschnittlichen Molekulargewicht von ungefähr 12.000 Dalton und einem HLB-Wert von 22.
Der Inhaltsstoff, der notwendigerweise zu den Formulierungen hinzu gegeben werden muss, ist ein Produkt, das die Lösung veranlasst, den richtigen osmolaren Werten zu haben. Die Lösung, die nur das aktive Prinzip enthält, resultiert tatsächlich in hypotonischer anstatt Tränenflüssigkeit. Andere Inhaltsstoffe, die hinzu gegeben werden können, sind pH-korrigierende Mittel (die Salze umfassen, die einen Puffer in der Lösung bilden), Produkte mit antiseptischen Eigenschaften, komplexierende Mittel und Konservierungsmittel, antioxidative Mittel und synergistische Mittel.
Im Wege eines Beispiels werden einige Ausführungsformen der Formulierung aufgelistet:
Formulierung 1

Konzentration der Inhaltsstoffe in Gewichtsprozent
Coenzym Q₁₀ oder Ubichinol 0,20
Tocopherol 0,04
Copolymer 10,00
modifiziertes Rizinusöl 5,00
NaCl 0,45
Benzalkoniumchlorid 0,01
doppelt destilliertes Wasser q. s. bis 100,00

Formulierung 2

Konzentration der Inhaltsstoffe in Gewichtsprozent
Coenzym Q₁₀ oder Ubichinol 0,10
Tocopherol 0,02
Copolymer 15,00
Mannitol 2,50
Benzalkoniumchlorid 0,01
doppelt destilliertes Wasser q. s. bis 100,00

Formulierung 3

Konzentration der Inhaltsstoffe in Gewichtsprozent
Coenzym Q₁₀ oder Ubichinol 0,20
Copolymer 10,00
NaCl 4,50
Benzalkoniumchlorid 0,01
Phosphat-gepufferte Sorensenlösung mit pH 7,4 bis auf 100,00

Die topische Verabreichung auf das Auge kann auch mit einer Augenpaste durchgeführt werden.
Das Coenzym Q₁₀ oder Ubichinol gemäß der vorliegenden Erfindung kann auch in Kombination mit anderen geeigneten aktiven Prinzipien, die auf dem Gebiet als für die Behandlung oder Linderung oder Verhütung der oben genannten optischen Erkrankungen bekannt sind, verabreicht werden.
EXPERIMENTELLE ERGEBNISSE UND BEISPIELE
In den vorliegenden Beispielen werden Antimycin A, C₂-Ceramid und Serumentzug verwendet, um die anti-apoptotische Wirkung von Coenzym Q₁₀ in anti-apoptotischen Vorgängen zu zeigen, die nicht mit einem Überschuss an freien Radikalen assoziiert sind. Die Wahl der Substanzen ist durch deren Wirkungsmechanismus bedingt.
1) Antimycin A ist ein organisches Gift, das die zelluläre Atmung blockiert, und dadurch die zelluläre Fähigkeit zur Herstellung von Energie, und das durch das Binden des Komplexes III der mitochondrialen Atmungskette. Als eine Folge davon kann das Mitochondrion, auch wenn in der Zelle Sauerstoff verfügbar ist, diesen nicht erfolgreich verwenden und unterbricht daher die Bildung von ATP durch oxidative Phosphorylierungen. Dieses Phänomen zeigt sich als chemische (oder auch als histotoxische) Hypoxie, d. h., die Unmöglichkeit zur Nutzung von Sauerstoff bedingt durch eine Vergiftung der Atmungskette; diese Hypoxie ist mit anderen Arten von Hypoxie (Hypoxie, Anämie und Ischämie) assoziiert, die durch ein Mangel an tatsächlich verwendetem Sauerstoff in der zellulären Umgebung bedingt sind.
Die durch Antimycin A induzierte chemische Hypoxie wurde hier als ein experimentelles Modell eines zellulären Schadens analog zu einem ischämischen Schaden, wie er oben gezeigt wird, verwendet, der sehr häufig in der spontanen Pathologie retinaler Zellen vorkommt und unabhängig von der Bildung freier Radikaler ist.
2) Die durch Ceramid induzierte Apoptose ist hauptsächlich eine Folge von dessen Fähigkeit zum Kollabieren des mitochondrialen Δψ entweder durch die direkte Hemmung des mitochondrialen Komplexes III der Atmungskette oder durch die Bildung von großen Transmembrankanälen zur Erhöhung der mitochondrialen Durchlässigkeit. 3) Der Entzug von überlebenswichtigen Faktoren, der in kultivierten Zellen durch Serumentzug erreicht wird, kann Zellen durch unterschiedliche Mechanismen wie die Induktion der MAP-Kinase, der Ceramidfreisetzung, der COX-2-Aktivierung, deren gemeinsame Wirkung durch den von Mitochondrion abhängigen apoptotischen Stoffwechselweg ausgelöst wird, zur Apoptose führen.
Die Generierung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) als Reaktion auf Antimycin A, C₂-Ceramid und Serumentzug (11) wurde auch in einigen experimentellen Modellen berichtet. Jedoch ist es, da die ROS ein entscheidender Vermittler der Apoptose sind, nicht leicht zu etablieren, ob die Erhöhung an ROS nach der Anwendung apoptotischer Stimuli eine Ursache oder eine Auswirkung der Durchführung der Apoptose ist. Dieser Punkt ist entscheidend, um auszuschließen, dass Antimycin A, C₂-Ceramid und Serumentzug direkt die Bildung freier Radikaler induzieren könnten, dies wurde eine entscheidende Voraussetzung. Dies wurde durch die frühe Quantifizierung der Mengen an freien Radikalen in RCE direkt nach der Anwendung der apoptotischen Stimuli, das bedeutet vor dem Beginn der Durchführung der Apoptose, festgestellt. Die Erhöhung der MDA- und SOD-Aktivität, die in der zweiten Stunde nach der UVC-Bestrahlung, nicht aber nach der Behandlung mit Antimycin A oder C₂-Ceramid oder Serumentzug beobachtet wird, bestätigte, dass die drei letzteren apoptotischen Stimuli keine freien Radikale generieren.
Im Wege eines Vergleichs und immer in den gleichen Zellkulturen wurden die Ultravioletten als ein Modell des apoptotischen Angriffs, der auch durch den Überschuss an freien Radikalen bedingt ist, verwendet.
Die schützende Wirkung von Coenzym Q₁₀ gegenüber der Apoptose in Kaninchenkeratozyten (Hornhautepithelzellen aus Kaninchen, die mit SV40 transformiert wurden, die auch als RCE bezeichnet werden) wurde experimentell in Kulturen nachgewiesen, die mit Antimycin A, Ceramid, Serumentzug und Aussetzen an UVC bei 254 nm induziert wurden. Die Apoptose wurde mittels früher und später Marker wie der Analyse des Redoxstatus des Zytoplasmas (Malondialdehydassay), der Mengen an Adenosintriphosphat (ATP, der Caspase 9 Aktivität, der Zytochrom C – Freisetzung aus Mitochondrien und dem DNA-Fragmentierungsassay) untersucht.
Die Verteilung von Coenzym Q₁₀ auf der Choroidea- und Retinaebene in Kaninchen wurde auch verifiziert. Zu diesem Zweck erhielten weiße Neuseeland-Kaninchen ein Einträufeln (ungefähr 100 μl) der Augensalbe, die in der PCT WO 01/37851 beschrieben wird, in dem Namen des gleichen Anmelders wie der vorliegenden Patentanmeldung, und das jede Minute für 15 Minuten und wurden direkt danach geopfert. Die Augen wurden in physiologischer Lösung gewaschen und die Retina wurde zusammen mit der Choroidea daraus entfernt. Das Gewebe wurde dann homogenisiert und durch HPLC quantifiziert. Die Ergebnisse von all diesen durchgeführten Experimenten, die die überraschenden anti-apoptotischen Wirkungen von Coenzym Q₁₀ zeigen, werden in den folgenden Beispielen gezeigt.
BEISPIELE
Beispiel 1. Schützende Wirkung von Coenzym Q₁₀ gegen die hystotoxische Hypoxiewirkung.
RCE-Zellen wurden in dreißig Platten am Tag vor der Verabreichung des apoptotischen Stimulus mit einer Dichte von 2 × 10⁵/Petrischale mit einem Durchmesser von 100 mm ausplattiert. Am Tag danach wurden zwei Serien von 10 Platten mit jeweils 200 μM Antimycin A und UVC bei 254 nm 15 J/m² behandelt, wohingegen die dritte Serie unbehandelt blieb. Nach 24 Stunden wurden die lebenden Zellen mit dem Trypan-blau-Verfahren gezählt und als Prozentanteil der Kontrolle in der Grafik gezeigt (1).
Die RCE-Zellen wurden am Tag vor der Verabreichung des apoptotischen Stimulus bei der Dichte von 2 × 10⁶/Petrischale mit einem Durchmesser von 100 mm plattiert. Am Tag danach wurden Antimycin A in der Konzentration von 200 μM in Kombination mit 10 μM Coenzym Q₁₀ in 0,04 % Lutrol F127^® oder nur 0,04 % Lutrol F127^® zu einer Platte hinzu gegeben. Von nun an bezieht sich „mit Coenzym Q₁₀ behandelt" auf Coenzym Q₁₀ in 0,04 % Lutrol F127^® als Trägermittel, wohingegen bei der Kontrolle immer gemeint ist, dass sie nur mit 0,04 % Lutrol F127^® behandelt ist. Eine andere Platte wurde mit UVC bei 254 nm 15 J/m² allein oder in Kombination mit 10 μM Coenzym Q₁₀ behandelt. Die Zellen wurden mittels einer Videomikroskopie des Zeitverlaufs aufgezeichnet und die kumulativen apoptotischen Vorgänge, die nach 24 Stunden aufgezeichnet wurden, werden in der Grafik gegen die Zeit gezeigt (2). Die gezeigten Werte stellen den Durchschnitt von 5 Experimenten dar.
Beispiel 2. Indirekte Untersuchung der Produktion freier Radikaler nach der Behandlung mit Antimycin A und mit UVC bei 254 nm durch Messung der Mengen an Malondialdehyd und der Effizienz von Coenzym Q₁₀ bei der Verhinderung dieser Produktion.
Das Malondialdehyd ist ein Produkt der Lipidperoxidation, das nach dem Aussetzen von polyungesättigten Fettsäuren an freie Radikale zustande kommt. Die Produktion von Malondialdehyd wird dann routinemäßig als Index der Produktion der Radikale selbst durch Behandlungen mit elektromagnetischen Strahlungen oder oxidierenden Substanzen angenommen.
Als Antioxidanz verringert Coenzym Q₁₀ die Malondialdehydproduktion durch das Aufzeigen einer Wirkung, die die Bildung freier Radikaler hemmt.
Um den Malondialdehydassay durchzuführen, wurden RCE-Zellen mit einer Dichte von 5 × 10⁵ Zellen/Platte in 20 Petrischalen mit einem Durchmesser von 100 mm ausplattiert und über Nacht in 5 % CO₂ Atmosphäre bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden die Platten für 2 Stunden mit Coenzym Q₁₀ (10 Platten) vorinkubiert oder unbehandelt gelassen (10 Platten), mit 8 ml physiologischer Salzlösung gewaschen, die mit sterilem Phosphat (PBS) gepuffert war, unter Zugabe von Ca⁺⁺ und Mg⁺⁺. Die Platten wurden einer Behandlung mit Antimycin A (200 μM) oder ultravioletter Strahlung bei 254 nm (15 J cm²) ausgesetzt, wie es in 3 gezeigt wird. PBS wurde durch frisches Medium mit und ohne Coenzym Q₁₀ ersetzt und die Platten wurden für weitere 2 Stunden inkubiert. Nach dem Durchführen des Assays wurden die Zellen mit Trypsin gemäß den üblichen Prozeduren abgelöst und mittels einer Globuli-Zählkammer gezählt. Die Zellen der verschiedenen Proben wurden dann durch die Zugabe von Trichloressigsäure (TCA) lysiert und für 20 Minuten bei 12.000 Upm zentrifugiert, um die Proteine zu fällen.
Zu 300 μl des Überstandes von jeder Probe wurden 300 μl 1 % Thiobarbituronsäure (TBA) hinzu gegeben. Die Mischungen wurden bei 95 °C für 30 Minuten inkubiert, für 20 Minuten bei 12.000 Upm zentrifugiert und die optische Absorption des Überstandes, die aus der spektrofotometrischen Analyse bei 532 nm resultiert, wurde untersucht.
Die beobachteten Werte wurden mit einer üblichen Kalibrierungskurve verglichen und auf die Anzahl der Zellen normalisiert. In 3 wird die schützende Wirkung von Coenzym Q₁₀ nach der Behandlung mit Antimycin A oder UVC-Bestrahlung gezeigt.
Der Assay zeigte dann durch den direkten Vergleich mit anderen Mitteln des Standes der Technik die abschwächende Wirkung, die durch Coenzym Q₁₀ auf die peroxidative Menge an Fettsäuren bedingt durch freie Radikale ausgeübt wird, sowie indirekt die schützende Wirkung gegenüber den freien Radikalen selbst, die durch die UVC-Behandlung hergestellt werden. 3 zeigt auch, dass die Peroxidationsmenge der Fettsäuren in dem Fall der Behandlung mit Antimycin A ähnlich wie die der unbehandelten Kontrolle ist und dieses bestätigt die Fähigkeit von Coenzym Q₁₀ gegen Apoptose unabhängig von der Eigenschaft als freier Radikalfänger zu schützen, wie es in 2 betont wird.
Beispiel 3. Auswertung der Mengen an Adenosintriphosphat (ATP) nach Behandlung mit Antimycin A und UVC bei 254 nm.
Die ATP-Mengen korrelieren eng mit dem Muster des Zelltodes, der nach biochemischer Beschädigung zustande kommt. Zum Beispiel ist eine Menge an ATP von weniger als 20 % des normalen Wertes für eine Nekrose verantwortlich, wohingegen höhere Mengen immer noch das Zustandekommen einer Apoptose ermöglichen, da diese ein notarischer Prozess ist, der Energie benötigt.
Während es bestätigt wurde, dass die ATP-Mengen nach der Behandlung mit Bestrahlungen drastisch verringert sind, resultierte es gemäß der vorliegenden Erfindung, dass Coenzym Q₁₀ in der Lage war, solch eine Verringerung zu verhindern.
Um den ATP-Assay durchzuführen, wurden RCE-Zellen mit einer Dichte von 5 × 10⁵ Zellen/Platte in 10 Petrischalen mit einem Durchmesser von 10 cm ausplattiert und über Nacht in einer Atmosphäre von 5 % CO₂ bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden die Platten für 2 Stunden mit Coenzym Q₁₀ bei 10 μM oder nur mit dem Trägermittel allein vorinkubiert. Das Medium wurde dann mit 8 ml steriler PBS unter Zusatz von Ca⁺⁺ und Mg⁺⁺ ersetzt und die Platten wurden mit Antimycin A (200 μM) oder UVC bei 254 nm (15 J/cm²) behandelt, wie es in 4 gezeigt wird. Anschließend wurde das PBS mit frischem Medium mit und ohne Coenzym Q₁₀ ersetzt und die Platten wurden für weitere 2 Stunden inkubiert. Nach der Durchführung des Assays wurden die Zellen mit Trypsin gemäß üblichen Prozeduren abgelöst und mittels einer Globuli-Zählkammer gezählt. Die Zellen wurden dann in destilliertem H₂O in der Konzentration von 6 × 10⁴ Zellen/I resuspendiert, sofort für 5 Minuten gekocht und bei –20 °C zur anschließenden Analyse eingefroren.
Die Quantifizierung des ATPs in den Extrakten wurde durch den „ATP Detennination Kit" (Molecular Probes, USA) durchgeführt, der auf der Luciferase der Feuerfliege basiert, und das gemäß den Instruktionen des Lieferanten. Um eine Fluoreszenz nachzuweisen, wurde eine Analysenvorrichtung für Flüssigkeitszintillation (Camberra Packard, USA) verwendet, die zur Biolumineszenzanalyse voreingestellt war.
Dieser Assay zeigt quantitativ die schützende Wirkung von Coenzym Q₁₀, die der Verringerung der ATP-Menge entgegensteht, die durch Antimycin A und durch UVC-Bestrahlungen zustande kommt.
Beispiel 4. Lokalisierung von Coenzym Q₁₀ auf der Ebene der Choroidea und der Retina von weißen Neuseeland-Kaninchen, die topisch behandelt wurden.
Behandlung von Kaninchen und Isolierung von Choroidea und Retina
Die Tiere wurden mit einer intramuskulären Injektion von Zoletil (0,25 ml pro Kilogramm) und einer mit Rompun (0,15 ml pro Kilogramm) sediert und mit einer Gasmischung aus Sauerstoff, Stickstoffmonoxid und Isofluoran betäubt und durch das Einträufeln von 100 μl (2 Tropfen) der Augensalbe pro Minute behandelt, die in der PCT WO 01/37851 beschrieben wird, in dem Namen des gleichen Anmelders, oder nur mit Trägermittel behandelt.
Die Tiere wurden dann durch eine intrakardiale Injektion mit Tanax 82 (3 ml) geopfert. Die Augen wurden dann ausgeschnitten, mit einer physiologischen Lösung gewaschen, um Blut zu vermeiden, und von Muskeln und optischem Nerv gereinigt. Die Hornhaut wurde dann mit einer Hornhautschere entfernt, die kristallinen Anteile wurden eliminiert, wohingegen die Choroidea und Retina zusammen mit der Sclera (Augenhaut) und Glaskörpersäften bei –80 °C zur Bestimmung der Antioxidanzien konserviert wurden.
Extraktion und chromatographische Bestimmung der Antioxidanzien
Die Probe wurde mit einem Turrax in 1 ml doppelt destilliertem Wasser homogenisiert und die lipidlöslichen Antioxidanzien (Coenzym Q₁₀, Retinol, α-Tocopherol, β-Karotin) wurden durch Verwendung von 2 ml Extraktionsmischung (95 % Ethanol und 5 % Isopropanol) plus 5 ml Hexan extrahiert; die Mischung wurde für zwei Minuten gerührt. Diese Prozedur löste die gesamte Oxidation des Coenzyms Q₁₀ aus, das möglicher Weise in einer reduzierten Form vorliegt. Die Probe wurde dann bei Raumtemperatur bei 3640 g für 10 Min. zentrifugiert, der Überstand wurde zurück gewonnen, zur Trockene verdampft und in Ethanol resuspendiert.
Die Antioxidationsmittel wurden durch Umkehrphasen- HPLC unter Verwendung einer KROMASIL 100 Å – C₁₈ 250 × 4,6 mm Säule mit einer Vorsäule aus dem gleichen Material durch einen konvexen Gradienten (Phase A: 90 % Methanol und 10 % Wasser; Phase B: 50 % Methanol, 25 % Isopropanol und 25 % Hexan; Elutionsgeschwindigkeit: 1,5 ml/Min.) abgetrennt. Das oxidierte Coenzym Q₁₀ wurde mittels eines Multidiodenspektrophotometers bei Wellenlängen von 275 nm nachgewiesen. Die quantitative Bestimmung wurde durch die Bezugnahme auf Standardkurven durchgeführt. Die Ergebnisse, die die Aufnahmekinetiken von Coenzym Q₁₀ zeigen, das durch Choroidea-/Retinazellen aufgenommen wird, sowie die Gegenwart von Coenzym Q₁₀ in diesen Geweben, werden jeweils in den 5 und 6 gezeigt.
Analoge Daten, die die anti-apoptotische Wirkung von Coenzym Q₁₀ zeigen, wurden mit Mausfibroblasten (RAT-1) und mit menschlichen retinalen Zellen (menschliches retinales, pigmentiertes Epithel, das auch als RPE bezeichnet wird) erhalten.
Bei den erhaltenen Ergebnissen zur Hemmung des apoptotischen Phänomens bedingt durch Hypoxie durch Coenzym Q₁₀ beansprucht die vorliegende Erfindung die Verwendung von Coenzym Q₁₀ (oder Ubichinon Q₁₀ oder Coenzym Q₁₀) zur Herstellung eines Medikaments zur Verhütung, Behandlung und/oder Linderung der degenerativen okkularen Pathologien, die sich aus apoptotischen Phänomenen ableiten, d. h., aus dem programmierten Zelltod (PZT) ableiten, und unter Ausschluss der apoptotischen Phänomene, die durch einen Überschuss an freien Radikalen bedingt sind.
Die topische Verabreichung wird durch die Verwendung der Augensalbe durchgeführt, die in der PCT WO 01/37851 in dem Namen des gleichen Anmelders beschrieben wird.
Beispiel 5. Schützende Wirkung von Coenzym Q₁₀ gegenüber einer UVC-Bestrahlung, Antimycin A, C2-Ceramid und der durch Serumentzug induzierten Apoptose.
Eine Zelllinie aus Keratozyten der Kaninchenhornhaut (RCE, „rabbit corneal keratocytes") wurde in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), HAM's Nährstoffmischung F 12 1 : 1 aufbewahrt, ergänzt mit 15 % fötalem Rinderserum (FRS), 2 mM Glutamin, 5 μg/ml Insulin, 10 ng/ml EGF und 50 Ul/ml Penicillin in befeuchteter Atmosphäre mit 5 % CO₂ bei 37 C°. Die Zellen wurden mit 3 × 10⁵/Platte plattiert. Vier schädigende Mittel wurden in Dosen angewendet, von denen experimentell etabliert wurde, dass sie Apoptose induzieren: UVC-Bestrahlung (254 nm) bei 15 mJ/cm², das Blockierungsmittel der Atmungskette Antimycin A in einer Konzentration von 200 μM, das apoptotisch signalisierende Lipid C₂-Ceramid (ein synthetisches zelldurchlässiges Analogon der endogenen Ceramide) in einer Konzentration von 20 μM und die FRS-Beschränkung auf 0,5 %. Die Behandlungen mit 10 μM Coenzym Q₁₀, aufgelöst in 0,04 % Lutrol F107, das als Trägermittel verwendet wurde, um die zelluläre Aufnahme dieses hydrophoben Moleküls sicher zu stellen, oder mit 10 μM Vitamin C (Ascorbinsäure) wurden 2 Stunden vor der Anwendung der apoptotischen Stimuli begonnen. Nur mit Trägermittel allein behandelte Zellen wurden als Kontrolle verwendet. Die antiapoptotischen Wirkungen von Coenzym Q₁₀ oder des Vitamins C gegen die Bestrahlung mit UVC, gegen Antimycin A, gegen C₂-Ceramid und gegen den Serumentzug wurden durch Lichtmikroskopie und Ultramikroskopie ausgewertet. Die Identifizierung apoptotischer Zellen mit fragmentierter DNA wurde durch die Endmarkierung mit dem Klenow-FragEL^® durchgeführt. In diesem Assay werden apoptotische Zellen leicht durch das Vorhandensein einer dunkelbraunen Färbung im Gegensatz zu lebensfähigen Zellen erkannt, die stattdessen grün oder sogar ungefärbt erscheinen. Eine signifikante Anzahl (30 % – 60 %) von RCE-Zellen, die 24 Stunden nach der UVC-Bestrahlung, Verabreichung von Antimycin A oder C₂-Ceramid und Serumentzug untersucht wurden, enthielten braungefärbte fragmentierte DNA. RCE-Zellen, die mit 10 μM Coenzym Q₁₀ 2 Stunden vor der Anwendung apoptotischen Stimuli behandelt wurden, färbten grün. Die Behandlung mit 10 μM Vitamin C verhinderte die Apoptose nur als Reaktion auf die UVC-Bestrahlung. Dies zeigte, dass die Behandlung mit Coenzym Q₁₀ die Apoptose durch einen Mechanismus verhinderte, der unabhängig von seiner Eigenschaft als freier Radikalfänger ist. Der Mangel an schützender Wirkung durch Vitamin C unterstützt diesen Beweis stark. Die mit Antimycin A und dem Serumentzug entweder in der Abwesenheit (Abschnitte links) oder in der Anwesenheit (Abschnitte rechts) von Coenzym Q₁₀ erhaltenen Ergebnisse werden in 7 gezeigt. In weiteren Experimenten war der Serumentzug als apoptotischer Stimulus und die Vorbehandlung mit Vitamin C nicht mit umfasst.
Die Anzahl lebender Zellen nach den oben beschriebenen Behandlungen und durch den MTT-Assay analysiert, wurden dann ausgewertet (8). Wie in 8A gezeigt wird, verringerte die UVC-Bestrahlung, Antimycin A und C₂-Ceramid die Anzahl der lebenden Zellen jeweils um 82 %, 56 % und 61 %. In allen Fällen schützte die Behandlung mit 10 μM Coenzym Q₁₀ die RCE-Zellen, was in eine Anzahl von lebenden Zellen resultierte, die jeweils nur um 49 %, 29 % und 24 % verringert waren. Im Gegensatz dazu (8B) schützte die Behandlung mit Vitamin C, das als reiner freier Radikalfänger verwendet wurde, RCE-Zellen vor der Apoptose nur als Reaktion auf UVC-Bestrahlung wirksam. 9 zeigt die Aspekte der Videomikroskopie des Zeitverlaufs der RCE-Keratozyten, die für 24 Stunden in Abwesenheit jeglicher Behandlung (oberer Abschnitt) oder nach entweder UVC-Bestrahlung (links) oder Behandlung mit Antimycin A (Mitte) oder mit C₂-Ceramid (rechts) jeweils mit oder ohne einer zweistündigen Vorbehandlung mit Coenzym Q₁₀ kultiviert wurden. Nach allen drei Behandlungen durchliefen eine große Anzahl von RCE-Zellen eine Apoptose, aber die Behandlung mit Coenzym Q₁₀ verringerte diese Anzahl dramatisch, was die Wirksamkeit von Coenzym Q₁₀ bei der Verhinderung der Apoptose gegen jeglichen apoptotischen Stimulus zeigt. Korrespondierende quantitative Daten werden in 10 berichtet. In Bezug auf unbehandelte oder mit Coenzym Q₁₀ behandelte Kontrollen erhöhte sich die Anzahl kumulativer apoptotischer Vorgänge bei der Bewertung der Videomikroskopie des Zeitverlaufs deutlich nach der Anwendung aller drei apototischer Stimuli, aber in einem wesentlich geringeren Ausmaß, wenn die Zellen mit Coenzym Q₁₀ für 2 Stunden vor der Induktion der Apoptose behandelt worden waren.
Beispiel 6. Die UVC-Bestrahlung, nicht aber Antimycin A, C₂-Ceramid und Serumentzug erhöht freie Radikale.
Die Wirkungen der UVC-Bestrahlung, von Antimycin A, von C₂-Ceramid und des Serumentzugs auf die Generierung freier Radiale 2 Stunden nach der Anwendung der Stimuli wurde unter Verwendung der Malonaldehydmenge und der SOD-Aktivität als indirekte Parameter analysiert. Die Zellen wurden mit Coenzym Q₁₀ oder Vitamin C, wie in Beispiel 4 beschrieben, vorbehandelt oder auch nicht. Wie in 11 gezeigt wird, wurden wesentliche Erhöhungen der MDA-Menge (oberer Abschnitt) und der SOD-Aktivität (unterer Abschnitt) in Bezug auf unbehandelte Zellen nur als Reaktion auf die UVC-Bestrahlung erhalten (jeweils 1,5 pg/Zelle bis 16,5 pg/Zelle und 6,5 U/mg Protein bis 19,5 U/mg Protein). Die Vorbehandlung mit Coenzym Q₁₀ oder Vitamin C verringerte diese Erhöhung.
Beispiel 7. Coenzym Q₁₀ verringerte die ATP-Mengen als Reaktion auf apoptotische Stimuli, die nicht mit freien Radikalen assoziiert sind
Die Durchführung des apoptotischen Todesprogrammes setzt den massiven Verbrauch von ATP voraus und dem entsprechend wird sie von einer dramatischen Verringerung der zellulären ATP-Mengen begleitet. Die Zellen wurden wie in Beispiel 5 behandelt. Wie es in 12 gezeigt wird, verringerte die UVC-Bestrahlung, Antimycin A und C₂-Ceramid die ATP-Mengen in RCE-Zellen um jeweils 65 %, 76 % und 81 % im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen. Die Verabreichung von Coenzym Q₁₀ schützte RCE-Zellen signifikant gegen die Verringerung der ATP-Mengen. Tatsächlich waren in behandelten RCE-Zellen die Mengen an ATP um 28 % in UVC-bestrahlten Zellen, um 41 % in mit Antimycin A behandelten Zellen und um 51 % in mit C₂-Ceramid behandelten Zellen im Vergleich zu mit nur Coenzym Q₁₀ behandelten Kontrollen verringert.
Beispiel 8. Coenzym Q₁₀ wirkte dem mitochondrialen Δψ-Kollaps der Freisetzung von Cytochrom C, der Caspase 9- Aktivierung und der DNA-Fragmentierung entgegen, die durch apoptotische Stimuli ausgelöst werden die nicht mit freien Radikalen assoziiert sind.
Die Zellen wurden wie in Beispiel 5 behandelt.
Nachweis der Änderung des mitochondrialen Transmembranpotentials (Δψ).
Die Änderung des mitochondrialen Transmembranpotentials (Δψ), die während der Apoptose zustande kommt, wurde durch einen auf Fluoreszenz basierenden Assay in RCE-Zellen nachgewiesen. Die Zellen wurden auf Deckelschalen für 15 Min. bei 37 °C in DMEM-Medium, das die lipophile kationische Sonde 5,5',6,6'-Tetrachlor-1,1'3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyaniniodid (JC-1, 5 mg/ml) (JC-1, Molecular Probes Inc. Eugene, OR, USA) enthält, inkubiert. Dieser Farbstoff hat eine einzigartige Eigenschaft: bei hyperpolarisierten Membranpotentialen (bis –140 mV) bildet er ein rot fluoreszierendes J-Aggregat, wohingegen er bei depolarisierten Membranpotentialen (bis –100 mV) in der grün fluoreszierenden monomeren Form verbleibt. Vor dem Nachweis wurden die Zellen in PBS gewaschen und in eine offene Ojektträgerfliessbeladungskammer platziert, die auf die Plattform eines konfokalen BioRad MRC 1024 ES Mikroskops (BioRad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) aufgesetzt war, das mit einer Krypton-/-Argon-Laserquelle ausgestattet war. Die Fluoreszenz wurde durch die Verwendung der Wellenlängen 488 und 568 nm beobachtet und die ausgestoßene Fluoreszenz wurde mit einem Nikon Plan Apo X 60 Ölimmersionsobjektiv gesammelt. Wie es in 13 gezeigt wird, bestimmte die UVC-Bestrahlung sowie die Behandlungen mit Antimycin A oder C₂-Ceramid den Δψ-Kollaps, tatsächlich wurde eine Verschiebung in der Membranladung als das Verschwinden der fluoreszierenden rotorange gefärbten Mitochondrien und eine Erhöhung in fluoreszierenden grün gefärbten Mitochondrien beobachtet. Westernblot-Analyse des cytoplasmatischen Cytochroms C.
Die RCE-Zellen wurden 24 Stunden nach den apoptotischen Stimuli untersucht. Cytosolische Fraktionen wurden wie in Ruties et al. 1999, J. Biol. Chem. 274, 24799 – 24807 beschrieben, hergestellt. Proteine in den cytosolischen Extrakten wurden durch das BCA-Protein-Assay-Reagenz (PIERCE, Rockford, IL, USA) quantifiziert. Die Proteine (25 μg/Bahn) wurden durch SDS-Polyacrylamidgel (12,5 %) elektrophoretisch behandelt und auf Nitrozellulosemembran (Schleicher & Schuell, Keene, NH) unter Verwendung eines Transblotters (BioRad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) elektrogeblottet. Die nicht spezifischen Signale wurden mit Blockierungspuffer (5 Gew./Vol. fettfreies Instantmilchpulver in PBS) blockiert und über Nacht bei 4 °C mit 1 μg/ml Anti-Cytochrom C monoklonalem Antikörper inkubiert (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA).
Die Membran wurde gewaschen und anschließend mit Ziege – anti-Maus IgG, der mit Meerrettichperoxidase konjugiert war (Sigma-Aldrich, Mailand, Italien), inkubiert. Der Nachweis wurde unter Verwendung einer kommerziellen Lumineszenzprozedur (ECL, Amersham Pharmacia Biotech Europe, Freiburg, Germany) durchgeführt. Wie es in 14 24 Stunden nach der Induktion der Apoptose gezeigt wird, zeigten die RCE-Zellen eine Erhöhung in cytoplasmatischem Cytochrom C, wenn diese mit unbehandelten RCE-Zellen verglichen wurden. Wenn den Behandlungen die Verabreichung von QoC₁₀ vorausging, blieb das Cytochrom C in der gleichen Menge wie bei nicht-induzierte Zellen. Analyse der Caspase 9 Aktivität.
Die Caspase 9 Aktivität wurde durch den Caspase 9 kolorimetrischen Protease Assay (BioSource Europe, S.A., Nivelles, Belgien) bestimmt. Cytosolische Extrakte, die durch das Lysieren von Zellen mit Zelllysepuffer hergestellt wurden, der in dem Kit bereit gestellt wurde, wurden mit dem kolorimetrischen Substrat LEHD (Leu-Glu-His-Asp), das mit dem Chromophor p-Nitroanilid (pNA) konjugiert war, in 50 μl 2X Reaktionspuffer, der 10 mM DTT enthält, inkubiert. Nach einer 2-stündigen Inkubation bei 37 °C wurde die OD der Proben bei 405 nm in dem BioRad-ELISA-Auslesegerät gemessen. 15 zeigt eine 6- bis 8- fache Verstärkung der Caspase 9 Aktivität in RCE-Zellen 24 Stunden nach der Verabreichung von apoptotischen Stimuli. Wenn der Stimulierung eine Verabreichung von Coenzym Q₁₀ vorausging, dann blieb die Caspase 9 Aktivität deutlich niedriger, nicht aber bei der gleichen Menge wie bei nicht stimulierten Zellen.
Der Kollaps des mitochondrialen Membranpotentials (Δψ), cytoplasmatisches Cytochrom C und die Aktivierung der Caspase 9 sind Teil des intrinsischen (Mitonchondrion abhängigen) apoptotischen Stoffwechselweges, der durch Öffnung des PTP ausgelöst wird. Die Vorbehandlung mit Coenzym Q₁₀ verhinderte größtenteils alle diese Vorgänge. Diese Ergebnisse zeigten deutlich, dass das Coenzym Q₁₀ unabhängig von seiner Eigenschaft als Radikalfänger die Durchführung der Apoptose durch die direkte Aufrechterhaltung des PTP in der geschlossnen Konformation verhinderte.
Analyse der DNA (nucleosomale Leiterbildung) Die apoptotische internucleosomale DNA-Fragmentierung wurde durch den klassischen Nachweis ausgewertet, der elektrophoretisch die getrennte Leiter fragmentierter DNA nachweist. Die genomische DNA wurde aus RCE-Zellen extrahiert wie es durch Blankenberg et al., 1997, Blood 89, 3778 – 3786 beschrieben wird. Die Fragmente wurden durch Gelelektrophorese in 0,8 % Agarose aufgetrennt, die Ethidiumbromid (0,2 μg/ml), enthält, durch UV sichtbar gemacht und photographiert. Die Vorbehandlung mit Coenzym Q₁₀ verhinderte auch die internucleosomale DNA-Fragmentierung (16), die durch alle apoptotischen Stimuli ausgelöst wird, was zeigte, dass die Blockierung des intrinsischen apoptotischen Stoffwechselweges mit Coenzym Q₁₀ ausreicht, um die „Zündung" der gesamten apoptotischen Maschinerie zu verhindern, die durch apoptotische Stimuli ausgelöst wird.

Claims

Verwendung einer Zusammensetzung zur topischen Verabreichung am Auge, die Coenzym Q10 oder Ubichinol als Wirkstoff enthält, zum Herstellen eines Medikaments für die Verhütung, Behandlung oder Linderung von neurodegenerativen Pathologien des hinteren Teils des Auges, die von apoptotischen Ereignissen herrühren, wobei die Zusammensetzung umfasst: 0,01 bis 2,0 Gewichtsprozent Coenzym Q10 oder Ubichinol; 0,005 bis 0,1 Gewichtsprozent Tocopherol; und ein Gemisch, enthaltend ein modifiziertes Rizinusöl und ein Blockcopolymer aus hydrophilem Ethylenoxid und einem lipophilen Propylenoxid mit einem überwiegenden Anteil von Polyoxyethylen, einem mittleren Molekulargewicht zwischen 10000 und 13000 Dalton und einem Hydrophile-Lipophile-Gleichgewicht (HLB)-Wert von mehr als 15, in einer Menge, die ausreicht, um die Komponenten in einer wässrigen Lösung löslich zu machen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Menge, die ausreicht, um die Komponenten in einer wässrigen Lösung löslich zu machen, 10 bis 15 Gewichtsprozent beträgt.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das modifizierte Rizinusöl Polyethylenglycol-glyceryl-triricinoleat ist.