ES2262777T3 - Coenzima q10 para el tratamiento de enfermedades oculares. - Google Patents
Coenzima q10 para el tratamiento de enfermedades oculares.Info
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Abstract
La utilización de una composición para la administración tópica sobre el ojo que incluya coenzima Q10 o ubiquinol como principios activos para la fabricación de un medicamento para la profilaxis, tratamiento o atenuación de patologías neurodegenerativas de la parte posterior del ojo, originadas a partir de eventos apoptóticos, Dicha composición contiene: De un 0, 01 a un 2 % ppp de coenzima Q10 o ubiquinol, de un 0, 005 a un 0, 1 % ppp de tocoferol; y una mezcla que incluye un aceite de ricino modificado y un bloque de copolímero de óxido de etileno hidrofílico y un óxido de propileno lipofílico con una proporción dominante de polioxietileno, un peso molecular de entre 10.000 y 13.000 Dalton y un valor de equilibrio hidrófilo/lipófilo (HLB) superior a 15, en una cantidad suficiente para solubilizar dichos componentes en una disolución acuosa.
Description
Coenzima Q_{10} para el tratamiento de
enfermedades oculares.
La presente invención se refiere a la
utilización de una composición de coenzima Q_{10} (o ubiquinona
Q_{10} o quinona Q_{10}, CoQ_{10}) o ubiquinol para la
fabricación de un medicamento destinado a la profilaxis, el
tratamiento o la atenuación de patologías oculares degenerativas de
naturaleza hereditaria, inflamatoria, dismetabólica o senil, en las
que el proceso degenerativo se desarrolla a partir de fenómenos
apoptóticos, es decir a partir de la muerte celular
programada
(MCP).
(MCP).
La presente invención también se refiere a la
administración tópica de la composición de coenzima Q_{10} o de
ubiquinol.
La apoptosis, o muerte celular programada (MCP),
está implicada en una gran cantidad de enfermedades degenerativas,
incluyendo patologías de la cámara posterior ocular y del área
perióptica. Entre estas enfermedades figuran las degeneraciones de
mácula y de retina hereditarias, inflamatorias, dismetabólicas o
debidas a la edad, como son por ejemplo las siguientes: el glaucoma,
la degeneración macular relacionada con la edad, la retinitis
pigmentosa, diversas maculopatías hereditarias (tales como la
enfermedad de Stargardt), los quistes maculares viteliformes y la
distrofia de los conos, la retinopatía diabética (exudativa y
proliferativa), la retinopatía hipertensiva, la oculopatía
isquémica, la opacificación senil de las lentes, las cataratas, el
desprendimiento de retina, la uveitis, el retinoblastoma, la
neuritis y las neuropatías ópticas de origen tóxico, inflamatorio o
degenerativo.
En todas estas patologías la degeneración se
debe a la muerte celular a través de la apoptosis.
Se puede tomar el glaucoma como ejemplo
paradigmático de este grupo de patologías, en las que los eventos
apoptóticos juegan un papel importante, tanto por los mecanismos
patogénicos implicados como por la elevada incidencia de dicha
enfermedad en la población. El glaucoma es una neuropatía óptica que
determina una pérdida de células ganglionares, con una pérdida
progresiva del campo visual y de la función visual y una posterior
excavación de la cabeza del nervio óptico. La presión intraocular
elevada es un factor de riesgo para el desarrollo de la enfermedad y
se sabe que el descenso de la presión intraocular protege al nervio
óptico de daños adicionales.
En los paciente afectados de glaucoma el
transcurso de la enfermedad es generalmente lento e irregular, con
una marcada variabilidad interindividual. Aunque aparentemente no
existe una relación directa entre la muerte de las células
ganglionares y la progresión de las alteraciones en el campo visual,
se cree que la pérdida de células precede a la aparición de las
alteraciones del campo visual. La pérdida progresiva de la función
visual se asoció a diversos factores de riesgo, como la presión
intraocular elevada o la presencia de una desregulación local o
sistémica del flujo hemático. Dado que las pruebas experimentales y
clínicas han demostrado que la hipertensión ocular es un factor
causal del desarrollo de la neuropatía óptica glaucomatosa, en la
actualidad el tratamiento universalmente aceptado se limita
esencialmente a la reducción de la presión intraocular, por ejemplo,
mediante medicamentos con un efecto diurético,
\beta-bloqueantes y otros.
Dichas observaciones no sólo se aplican a los
seres humanos, sino también a los mamíferos en general y, más
particularmente, a los animales de compañía.
Recientemente, estudios in vitro e in
vivo con modelos animales han sugerido la posibilidad de que un
paciente afectado de glaucoma podría beneficiarse de un tratamiento
neuroprotector, con el objetivo de frenar las progresión de la
muerte de las células ganglionares (Nikells R.W. "Apoptosis of
retinal ganglion cells in glaucoma: an update of the molecular
pathways involved in cell death". Surv Ophtalmol 1999; 43:
S151-161). Además, se sabe que en los casos de
glaucoma la mayor parte de las células ganglionares de la retina
mueren por apoptosis (Kerrigan L.A., Zack D.J., Quigley H.A., et
al. "TUNEL-positive ganglion cells in human
primary open-angle glaucoma". Arch Ophtalmol
1997; 115: 1031-1035) y que la hipoxia que sigue a
la isquemia es una de las causas demostradas de dicha muerte celular
(Gross R.L., Hensley S.H., Gao F., Wu S.M. "Retinal ganglion cell
dysfunction induced by hypoxia and glutamate: potential
neuroprotective effects of beta-blockers". Surv
Ophtalmol 1999, 43 Suppl: S 162-70).
Aunque aquí se haya utilizado el glaucoma como
ejemplo paradigmático, todas las patologías degenerativas
mencionadas anteriormente comparten dos características comunes:
dañan la parte posterior del ojo (es decir, la retina o el nervio
óptico) y experimentan en estos tejidos diversos tipos de eventos
apoptóticos causados por fenómenos muy distintos, como: isquemia,
hipoxia/anoxia, falta de factores tróficos o presencia de radicales
libres.
Teniendo en cuenta las caraterísticas comunes
compartidas por las patologías mencionadas anteriormente, existe la
necesidad de proporcionar medios para el tratamiento, atenuación o
profilaxis de los eventos apoptóticos mencionados, buscando
conseguir para ello una actividad neuroprotectora en la parte
posterior del ojo.
\newpage
La PCT WO01/37851, en nombre del mismo
Solicitante de la presente solicitud, describe la utilización de la
coenzima Q_{10} en la profilaxis de MCP derivadas de tratamientos
quirúrgicos fotorefractivos corneales (parte anterior del ojo)
mediante láser excímero y exposición a radiación ultravioleta.
La solicitud de patente mencionada anteriormente
muestra como combatir la apoptosis celular (parte anterior del ojo)
desencadenada por la aparición de radicales libres producidos por
radiaciones electromagnéticas.
La coenzima Q_{10}, o ubiquinona, es una
coenzima que está presente en la célula sobre la membrana
mitocondrial interna, donde es crucial su función en la cadena de
transporte de electrones, junto con una serie de factores, que
culmina en la producción de energía en forma de adenosín trifosfato
(ATP). Además, la coenzima Q_{10} es un colector activo de
radicales libres y su presencia, asociada exactamente con dicha
actividad, también se ha detectado a nivel de la membrana
plasmática. Cabe destacar que los tratamientos actuales frente a,
por ejemplo, el glaucoma están esencialmente limitados a la
reducción de la presión intraocular y no contemplan una actividad
neuroprotectora. Por el contrario, hasta la fecha, no hay
conocimiento de la actividad de la coenzima Q_{10} como una
molécula que pudiese presentar propiedades
anti-apoptóticas en los estados patológicos en los
que el evento apoptótico también puede ser independiente del aumento
de radicales libres. Esto se da particularmente en los casos de
apoptosis debida a isquemia, hipoxia/anoxia y ausencia de factores
tróficos. En concreto, no hay noticias sobre el hecho de que la
coenzima Q_{10} pueda funcionar también de una forma diferente
respecto a su conocida función antioxidante. Por lo tanto, existe la
necesidad de un tratamiento neuroprotector para las enfermedades
degenerativas de la parte posterior del ojo, con el objetivo de
impedir, frenar o evitar la muerte celular programada
independientemente de los mecanismos implicados en dicha MCP.
Esta necesidad deriva de la observación de que,
entre las patologías oculares tales como las degeneraciones
maculares o retinales relacionadas con la edad, dismetabólicas,
inflamatorias y hereditarias, el proceso degenerativo debido a la
apoptosis no está causado de forma uniforme si no que está causado
por una combinación de fenómenos apoptóticos desencadenados por
varios estímulos como son el exceso de radicales libres, la
isquemia, la hipoxia/anoxia o la falta de factores tróficos. En
todas las patologías mencionadas, la mayoría de los eventos
apoptóticos no son atribuibles a la presencia de radicales
libres.
La presente invención se basa en la observación
de dos factores distintos e inesperados.
El primero es que la coenzima Q_{10} se
acumula inesperadamente en la retina, también cuando se administra
de forma tópica en la parte anterior del ojo.
El segundo, y más importante, es que la coenzima
Q_{10} extiende sus efectos antiapoptóticos también sobre los
eventos apoptóticos no causados por la generación de radicales
libres.
Por lo tanto, la presente invención proporciona
medios para la profilaxis, el tratamiento o la atenuación de los
eventos apoptóticos en las patologías degenerativas de la parte
posterior del ojo, independientemente de los mecanismos implicados
en tales eventos (por lo tanto también incluye los eventos
apoptóticos no desencadenados por un exceso de radicales libres).
Debido a la diversidad de vías que pueden potenciar una respuesta
apoptótica de la célula, y debido al hecho de que se sabe que la
coenzima Q_{10} es un colector de radicales libres, el efecto
antiapoptótico de dicha molécula de acuerdo con la invención fue
totalmente inesperado.
En la presente solicitud se demuestra la
capacidad sorprendente que presenta la coenzima Q_{10} en la
profilaxis de los fenómenos apoptóticos inducidos por tres estímulos
apoptóticos que se sabe que no actúan a través de la generación de
radicales libres y mediante UVC. Dichos estímulos independientes de
la formación de radicales libres son:
1) antimicina A, utilizada como modelo para la
apoptosis causada por hipoxia;
2) C2-ceramida, que es un
análogo permeable a células de la ceramida (un mensajero apoptótico
lipídico natural, independiente de los radicales libres) y;
3) Disminución del factor de supervivencia por
privación de suero, en la que no se cree que los radicales libres
causen un insulto apoptótico primario.
Los ejemplos de la presente solicitud demuestran
que los estímulos mencionados anteriormente causan eventos
apoptóticos que no implican el exceso de radicales libres y que la
coenzima Q_{10} también presenta un efecto
anti-apoptótico en dichos eventos. Lo que se ha
demostrado en la presente solicitud en cuanto al efecto
antiapoptótico general de la coenzima Q_{10} está asociado con el
nuevo efecto aquí descrito por primera vez, según el cual la
coenzima Q_{10} se acumula en las retinas y en el nervio óptico de
los ojos tratados con una preparación para uso tópico.
Por lo tanto, un objetivo de la presente
invención es la utilización de la coenzima Q_{10} o ubiquinol como
principio activo para la preparación de un medicamento para la
profilaxis, el tratamiento o la atenuación de los eventos
apoptóticos que tienen lugar en las patologías degenerativas de la
parte posterior del ojo; siendo la administración del mismo por vía
tópica.
Todos los eventos apoptóticos que la presente
invención previene, trata o atenúa son eventos que causan patologías
oculares degenerativas, más concretamente: que afectan a la parte
posterior del ojo. De acuerdo con la presente invención "la parte
posterior del ojo" se refiere a la retina y al nervio óptico.
Particularmente, la coenzima Q_{10}, o un
derivado de la misma funcionalmente equivalente de acuerdo con la
presente invención, se utiliza para producir medicamentos diseñados
para ser utilizados en tratamientos tópicos, para la profilaxis,
atenuación o tratamiento de los eventos apoptóticos inducidos por la
isquemia, la hipoxia/anoxia, la falta de factores tróficos o el
exceso de radicales libres en la parte posterior del ojo. En
concreto, aquellas patologías degenerativas del ojo en las que
dichos eventos apoptóticos están directamente relacionados con el
proceso degenerativo. Particularmente, las patologías degenerativas
de acuerdo con la presente invención son patologías
neurodegenerativas.
Más particularmente, la coenzima Q_{10}, o un
derivado de la misma funcionalmente equivalente de acuerdo con la
presente invención, se utiliza para producir un medicamento
destinado al tratamiento tópico de los eventos apoptóticos de las
patologías de la retina y del nervio óptico, tales como las
degeneraciones retinales y maculares hereditarias, inflamatorias,
dismetabólicas o debidas a la edad. Son ejemplos de dichas
patologías de acuerdo con la invención: el glaucoma, la degeneración
macular debida a la edad, la retinitis pigmentosa, diversas
maculopatías hereditarias (tales como la enfermedad de Stargardt),
los quistes maculares viteliformes y la distrofia de los conos, la
retinopatía diabética (exudativa y proliferativa), la retinopatía
hipertensiva, la oculopatía isquémica, la opacificación senil de las
lentes, las cataratas, el desprendimiento de retina, la uveítis, el
retinoblastoma, la neuritis y las neuropatías ópticas de origen
tóxico, inflamatorio o degenerativo, cuyo mecanismo patogénico
también incluye un exceso de muerte celular programada (MCP) en el
que no están implicados los radicales libres.
De acuerdo con la presente invención, la
coenzima Q_{10} o el ubiquinol pueden utilizarse en los
tratamientos anteriormente mencionados, o en la preparación de los
medicamentos anteriormente mencionados, para su uso en humanos o
animales. Entre los animales se prefieren los animales domésticos y
de compañía.
La utilización mencionada anteriormente de la
coenzima Q_{10}, o de un derivado funcionalmente equivalente de la
misma, puede realizarse a través de la administración tópica o
sistémica.
La coenzima Q_{10}, o el ubiquinol, puede
administrarse de forma tópica, en un medicamento, en forma de
colirio. La formulación de un colirio adecuado que contiene coenzima
Q_{10} se describe en la PCT WO01/37851.
Se puede administrar coenzima Q_{10}, o
ubiquinol, por vía tópica mediante cualquiera de los sistemas
conocidos por los expertos.
De acuerdo con la invención, los compuestos
activos descritos anteriormente pueden administrarse una o varias
veces al día.
Figura 1) Se representa un diagrama de barras
que muestra el número de células vivas 24 horas después del
tratamiento con UVC o antimicina A comparado con el grupo control no
tratado.
Figura 2) Se representa un diagrama de barras
que muestra el efecto protector de la coenzima Q_{10} frente a la
apoptosis inducida por UCV y antimicina A, 24 horas después del
tratamiento, expresado en el número de eventos apoptóticos
totales.
Figura 3) Se representa un diagrama que muestra
el efecto de la coenzima Q_{10} sobre los niveles de
malondialdehído después del tratamiento con UVC o antimicina A.
Figura 4) Se representa un diagrama que muestra
el efecto de la coenzima Q_{10} sobre los niveles de adenosín
trifosfato (ATP) después del tratamiento con UVC y antimicina A.
Figura 5) Se representa un gráfico que muestra
la cinética de captación de la coenzima Q_{10} por la
coroides/retina después del tratamiento con una formulación de
colirio, en conejos blancos New Zealand, comparada con el grupo
control no tratado.
Figura 6) Se representa un diagrama que muestra
la captación de la coenzima Q_{10} por la coroides/retina después
del tratamiento con una formulación de colirio, en conejos blancos
New Zealand, comparada con el grupo control.
Figura 7) Detección de la fragmentación del DNA
en núcleos apoptóticos mediante el marcaje de extremos de DNA con
fragmentos de Klenow (FragEL, Oncogene Research Products).
Tratamiento en células epiteliales corneales de conejo (RCE):
estimulación con antimicina A (A); tratamiento con coenzima Q_{10}
antes de la estimulación con antimicina A (B); privación de suero
(C), tratamiento con coenzima Q_{10} antes de la privación de
suero (D).
Figura 8) Supervivencia de células RCE expresada
como el número de células vivas por placa determinado por análisis
MTT 24 horas tras la irradiación con UVC, administración de 200
\muM de antimicina A o de 20 \muM de ceramida precedidos o no
por el tratamiento con 10 \muM de coenzima Q10 (Figura 8ª) o 10
\muM de vitamina C (Figura 8B). Las células inicialmente se
colocaron en placas con 3 x 10^{5} células/placa. Cada punto es la
media \pm DE de 5 experimentos para la Figura 8A y 3 Experimentos
para la Figura 8B. *p\leq 0,005 en comparación con las células sin
tratar con vitamina C o coenzima Q_{10}.
Figura 9) Videomicroscopía de lapso temporal de
células RCE 24 horas tras la irradiación con UVC (cuadros de la
izquierda). Estimulación con 200 \muM de antimicina A (cuadros
centrales) o estimulación con 20 \muM de ceramida (cuadros de la
derecha), precedida o no por un tratamiento con 10 \muM de
coenzima Q_{10}. (A) Células RCE no tratadas; (B) irradiadas con
UVC; (C) tratadas con coenzima Q_{10} antes de la irradiación con
UVC.; (D) estimuladas con antimicina A (AA); (E) tratadas con
coenzima Q_{10} antes de la estimulación con antimicina A; (F)
estimuladas con ceramida; (G) tratadas con coenzima Q_{10} antes
de la estimulación con ceramida. Las células RCE apoptóticas son
blancas, están encogidas y están separadas del sustrato. Su número
se reduce de forma significativa después del tratamiento con
coenzima Q_{10} (cuadros inferiores).
Figura 10) Reducción de los eventos apoptóticos
acumulativos mediante el tratamiento con coenzima Q_{10} en
células RCE. Los eventos apoptóticos se siguieron mediante
videomicroscopía de lapso temporal durante 24 horas tras el estímulo
apoptótico tal y como se describe anteriormente. Respecto a las
células no tratadas la radiación UVC, la antimicina A y la ceramida
incrementaron de forma marcada el número de eventos apoptóticos
acumulativos en las células RCE, que se redujo de forma
significativa mediante el tratamiento con la coenzima Q_{10}.
Cada punto representa la media \pm DE de 3
experimentos. *p\leq 0,005 en comparación con las células no
tratadas con coenzima Q_{10}. **p\leq 0,05 en comparación con
las células no tratadas con coenzima Q_{10}.
Figura 11) Cuantificación de los niveles de
malonaldehído (MDA) y de la actividad SOD en células RCE, 24 horas
tras el estímulo apoptótico con UVC a 254 nm (15 mJ/cm^{2}),
antimicina A (200 \muM), ceramida (20 \muM) o privación de
suero, precedida o no por 2 horas de tratamiento cada una con 10
\muM de coenzima Q_{10} (izquierda) o vitamina C (derecha). Las
células RCE fueron: 1) no estimuladas; 2) tratadas con coenzima
Q_{10} o vitamina C; 3) irradiadas con UVC; 4) tratadas con
coenzima Q_{10} o vitamina C e irradiadas con UVC; 5) estimuladas
con antimicina A; 6) tratadas con coenzima Q_{10} o vitamina C y
estimuladas con antimicina A; 7) estimuladas con ceramida; 8)
tratadas con coenzima Q_{10} o vitamina C y estimuladas con
ceramida; 9) privadas de suero; 10) tratadas con coenzima Q_{10} o
vitamina C y privadas de suero. Cada punto fue la media \pm DE de
5 experimentos, *p\leq 0,001 en comparación con las células no
tratadas con coenzima Q_{10} o vitamina C.
Figura 12) Evaluación de los niveles celulares
de ATP en células RCE 24 horas después de la aplicación de estímulos
apoptóticos. La preparación de los lisados celulares se describe en
el apartado de Material y Métodos. El tratamiento con coenzima
Q_{10} redujo significativamente el descenso de ATP celular. Cada
punto es la media \pm DE de 3 experimentos, *p\leq 0,005 en
comparación con las células no tratadas con coenzima Q_{10}.
Figura 13) Detección del potencial de membrana
mitocondrial mediante un ensayo de fluorescencia doble
JC-1. Las imágenes de emisión dual (525 y 590 nm)
representan la señal de la fluorescencia de los agregados
monoméricos (verde) y agregados-J (roja) en las
células RCE. (a) Las células RCE no tratadas muestran mitocondrias
teñidas de rojo (potencial de membrana ampliamente negativo). Las
mitocondrias de las células RCE estudiadas 24 horas después de un
estímulo apoptótico con (b) radiación UVC (d) 200 \muM de
antimicina A o (f) 20 \muM de ceramida se tiñeron uniformemente de
color verde (potencial de membrana inferior). El tratamiento con
coenzima Q_{10} protegió de forma significativa frente a la
pérdida de potencial de membrana mitocondrial, como muestra la
reaparición de mitocondrias teñidas de rojo en las células RCE (c)
tratadas con coenzima Q_{10} antes de irradiar con UVC; (e)
tratadas con coenzima Q_{10} antes de administrar anticimina A y
(g) tratadas con coenzima Q_{10} antes de administrar
ceramida.
Figura 14) Análisis "Western blot" de
extractos citosólicos de células RCE con 1 mg/ml de mAb
anticitocromo c. Carriles: 1) control sin tratar; 2) irradiación
UVC; 3) tratamiento con coenzima Q_{10} e irradiación UVC; 4) 200
\muM de antimicina A; 5) tratamiento con coenzima Q_{10} y 200
\muM de antimicina A; 6) 20 \muM de ceramida; 7) tratamiento con
coenzima Q_{10} y 20 \muM de ceramida. La densidad de banda del
citocromo c citoplasmático (flecha) aumentó tras un tratamiento
apoptótico de las células RCE (carriles 2, 4, 6) al compararse con
los controles sin tratar (carril 1). La aplicación de coenzima
Q_{10} antes de los estímulos apoptóticos redujo
significativamente la densidad de banda (carriles 3, 5, 7).
Figura 15) Actividad de la caspasa 9. Carriles:
1) control sin tratar; 2) irradiación UVC; 3) tratamiento con
coenzima Q_{10} e irradiación UVC; 4) 200 \muM de antimicina A;
5) tratamiento con coenzima Q_{10} y 200 \muM de antimicina A;
6) 20 \muM de ceramida; 7) tratamiento con coenzima Q_{10} y 20
\muM de ceramida. La actividad de la caspasa 9 aumentó
6-8 veces después del tratamiento apoptótico de las
células RCE (carriles 2, 4 y 6). La aplicación de coenzima Q_{10}
redujo significativamente la activación de la caspasa 9 en todos los
casos (carriles 3, 5 y 7).
Figura 16) "Laddering" nucleosómico.
Carriles: 1) control sin tratar; 2) irradiación UVC; 3) tratamiento
con coenzima Q_{10} e irradiación UVC; 4) 200 \muM de antimicina
A; 5) tratamiento con coenzima Q_{10} y 200 \muM de antimicina
A; 6) 20 \muM de ceramida; 7) tratamiento con coenzima Q_{10} y
20 \muM de ceramida. La fragmentación de DNA inducida por los tres
estímulos apoptóticos (carriles 2, 4 y 6) se redujo
considerablemente cuando el tratamiento con coenzima Q_{10}
precedió la administración del estímulo apoptótico (carriles 3, 5 y
7). M) marcador de peso molecular de DNA \lambda/Hind III.
De acuerdo con la presente invención, las
composiciones de coenzima Q_{10} o de ubiquinol pueden utilizarse
para la fabricación de un medicamento para la administración tópica
en el ojo. Dicho medicamento que contiene la coenzima Q_{10}, o un
derivado funcionalmente equivalente de la misma, se encuentra
preferentemente en forma de gotas oculares y puede ser la solución
oftálmica que se describe en la PCT QO01/37851. La solución
oftálmica puede administrarse de forma local mediante instilación
superficial.
Dicha composición contiene: coenzima Q_{10}, o
un derivado funcionalmente equivalente de la misma, de un 0,01 hasta
un 2,0% ppp; tocoferol de un 0,005 hasta un 0,1% ppp y una mezcla
que incluye aceite de ricino modificado y un bloque de copolímero de
óxido de etileno hidrofílico y óxido de propileno lipofílico con una
proporción dominante de polioxietileno, un peso medio molecular de
entre 10,000 y 13,000 Dalton y un valor HLB (equilibrio
hidrófilo/lipófilo) superior a 15, en un cantidad suficiente para
solubilizar dichos componentes en una solución acuosa, generalmente
entre el 10 y un 15% ppp.
La mezcla de estos dos surfactantes
(polioxietileno-polioxipropileno) y un aceite de
ricino modificado (polietilenglicol gliceril triricinoleato) conduce
a la solubilización micelar total de los componentes de la forma
farmacéutica.
Un ejemplo concreto de bloque de copolímero es
un producto comercial llamado Lutrol F127.
Las concentraciones de coenzima Q_{10}, o de
ubiquinol, que pueden utilizarse para la formulación de soluciones
oftálmicas son de entre un 0,01 y un 2% de partes por peso (ppp),
más preferiblemente de entre un 0,1 y un 1,0% de partes por peso,
siendo la concentración ideal para la
"anti-opacificación" córnea de 0,2% ppp. Las
concentraciones de tocoferol en estas preparaciones son generalmente
de entre un 0,005 y un 0,1% ppp; preferentemente entre 0,01 y 0,5%
ppp.
En concreto, una composición preferida contiene:
coenzima Q_{10}, o ubiquinol, en aprox. 0,2% ppp; tocoferol de 0,2
y 0,04% ppp y la mezcla que incluye polietilenglicol gliceril
triricinoleato y un bloque de polímero de óxido de etileno/óxido de
propileno con una proporción de polioxietileno de aproximadamente un
70%, un peso molecular medio de unos 12,000 dalton y un valor HLB de
22.
A las formulaciones se les ha de añadir
necesariamente como ingrediente un producto para que la solución
tenga un valor osmótico adecuado. La solución que contiene sólo el
principio activo, de hecho, resulta hipotónica en comparación con el
fluido lacrimal. Otros ingredientes que pueden añadirse son los
correctores de PH (que incluyen sales que forman un tampón en la
solución), productos con propiedades antisépticas, complejantes y
conservantes, antioxidantes y agentes sinérgicos.
A modo de ejemplo se mencionan algunas de las
realizaciones de la formulación:
\vskip1.000000\baselineskip
Formulación
1
| Concentración Ingredientes | ppp |
| coenzima Q_{10} o ubiquinol | 0,20 |
| Tocoferol | 0,04 |
| Copolímero | 10,00 |
| Aceite de ricino modificado | 5,00 |
| NaCl | 0,45 |
| Cloruro de Benzalconio | 0.01 |
| Agua bidestilada | c.s. para 100,00 |
\vskip1.000000\baselineskip
Formulación
2
| Concentración Ingredientes | ppp |
| coenzima Q_{10} o ubiquinol | 0,10 |
| Tocoferol | 0,02 |
| Copolímero | 15,00 |
| Manitol | 2,50 |
| Cloruro de Benzalconio | 0.01 |
| Agua bidestilada | c.s. para 100,00 |
Formulación
3
| Concentración Ingredientes | ppp |
| coenzima Q_{10} o ubiquinol | 0,20 |
| Copolímero | 10,00 |
| NaCl | 4,50 |
| Cloruro de Benzalconio | 0.01 |
| Tampón fosfato Sorensen pH 7,4 | c.s. para 100,00 |
La administración tópica en el ojo también puede
realizarse mediante una pasta oftálmica.
La coenzima Q_{10} o ubiquinol, de acuerdo con
la presente invención, puede administrarse también en combinación
con otros principios activos adecuados conocidos en el campo y
clasificados como adecuados para el tratamiento, atenuación o
profilaxis de las enfermedades oculares mencionadas
anteriormente.
En los presentes ejemplos, la antimicina A, la
ceramida C_{2} y la privación de suero se utilizan para demostrar
el efecto antiapoptótico de la coenzima Q_{10} en los eventos
antiapoptóticos no relacionados con un exceso de radicales libres.
La elección de dichas sustancias se debe a su mecanismo de
acción.
1) La antimicina A es un tóxico orgánico que
bloquea la respiración celular, por lo tanto la capacidad celular
para producir energía, mediante la unión al complejo III de la
cadena respiratoria mitocondrial. Como consecuencia de esto, incluso
si hay oxígeno disponible dentro de la célula, la mitocondria no
consigue utilizarlo y por lo tanto deja de formar ATP a través de
fosforilaciones oxidativas. El fenómeno está clasificado como
hipoxia química (o también histotóxica), es decir, la imposibilidad
de utilizar oxígeno debido al envenenamiento de la cadena
respiratoria; dicha hipoxia está asociada a otros tipos de hipoxia
(hipóxica, anémica e isquémica) debidas a la ausencia de oxígeno
utilizado en las inmediaciones celulares.
La hipoxia química inducida por la antimicina A
se ha utilizado aquí como modelo experimental de daño celular
análogo al daño isquémico, tal como se recuerda anteriormente, que
es muy frecuente en la patología espontánea de las células retinales
e independiente de la formación de radicales libres.
2) La apoptosis inducida por ceramida es
principalmente una consecuencia de su capacidad para colapsar el
\Delta\Psi mitocondrial, mediante inhibición directa del
complejo III de la cadena respiratoria mitocondrial o mediante
formación de grandes canales transmembrana que aumentan la
permeabilidad mitocondrial.
3) La retirada de los factores de supervivencia,
conseguida en las células cultivadas mediante privación de suero,
puede inducir a las células a la apoptosis mediante distintos
mecanismos, tales como la inducción de la MAP cinasa, la liberación
de ceramida o la activación de la COX-2, cuyo efecto
en común es desencadenar la vía apoptótica
mitocondria-dependiente.
La generación de especies reactivas a oxígeno
(ROS) como respuesta a la anticimina A, a la ceramida C_{2} y a la
privación de suero (11) también se ha descrito en algunos modelos
experimentales. Sin embargo, como las ROS son factores clave en la
apoptosis, no es fácil establecer si el aumento de ROS que sigue a
la aplicación de estímulos tópicos es una causa o un efecto de la
ejecución apoptótica. Este dato es crucial para que la exclusión de
que la antimicina A, la ceramida C_{2} o la privación de suero
puedan inducir directamente la formación de radicales libres fuera
una condición preliminar crítica. Esto se realizó mediante la
cuantificación temprana de radicales libres en las RCE,
inmediatamente después de la aplicación de los estímulos
apoptóticos, es decir, antes del comienzo de la ejecución
apoptótica. El aumento de la actividad MDA y SOD, observado durante
la segunda hora tras la irradiación UVC pero no tras el tratamiento
con antimicina A, ceramida C_{2} o privación de suero, confirmó
que los tres últimos estímulos apoptóticos no generaron radicales
libres.
A modo de comparación, y siempre en los mismos
cultivos celulares, la radiación ultravioleta se utilizó como un
modelo de insulto apoptótico debido también al exceso de radicales
libres.
El efecto protector de la coenzima Q_{10}
frente a la apoptosis en queratocitos de ratón (Células Epiteliales
Corneales de Conejo transformadas con SV40, también designados como
RCE) se comprobó experimentalmente en cultivos inducidos por
antimicina A, ceramida, privación de suero y exposición a UVC a 254
nm. La apoptosis se evaluó mediante marcadores tempranos y tardíos
tales como el análisis del estado redox citoplasmático (ensayo del
malondialdehído), los niveles de adenosín trifosfato (ATP), la
actividad de la caspasa 9, la liberación de citocromo c en las
mitocondrias o el ensayo de fragmentación de DNA.
También se verificó la distribución de la
coenzima Q_{10} a nivel de coroide y retina en conejos. Con este
propósito se sometió a ratones blancos New Zealand a instilación (de
unos 100 \mul) del colirio descrito en la PCT WO01/37851, a nombre
del mismo Solicitante de la presente solicitud, cada minuto durante
15 minutos, y después se sacrificaron inmediatamente. Los ojos se
lavaron con solución fisiológica y se les explantaron las retinas
junto con las coroides. Después se homogeneizó el tejido y se
cuantificó mediante HPLC. Los resultados de todos los experimentos
realizados que demostraron los efectos antiapoptóticos sorprendentes
de la coenzima Q_{10} se ilustran en los siguientes
ejemplos.
ejemplos.
Se sembraron células RCE en 30 placas el día
antes de la administración del estímulo apoptótico con una densidad
de 2 x 10^{6}/placa de Petri de 100 mm de diámetro. Al día
siguiente se trataron dos series de 10 placas cada una con
antimicina A (200 \muM) y UVC a 254 nm 15 J/m^{2},
respectivamente, mientras que la tercera serie se mantuvo sin
tratamiento. Tras 24 horas se contaron las células supervivientes
utilizando el método "trypan blue" y se mostraron en una
gráfica como porcentaje del control (Fig. 1).
Se sembraron células RCE el día anterior a la
administración del estímulo apoptótico con la densidad de
2 x 10^{6}/placa de Petri de 100 mm de diámetro. Al día siguiente a una placa se le añadió antimicina A a una concentración de 200 \muM en combinación con coenzima Q_{10}, 10 \muM en Lutrol F127^{TM} al 0,04%, o sólo con Lutrol F127^{TM} al 0,04%. A partir de ahora "tratado con coenzima Q_{10}" se refiere a coenzima Q_{10} vehiculado en Lutrol F127^{TM} al 0,04%, mientras que con "control" nos referimos a tratado solamente con Lutrol F127^{TM} al 0,04%. Otra placa se trató con UVC a 254 nm 15 J/m^{2},sola o en combinación con coenzima Q10 (10 \muM). Las células se grabaron mediante videomicroscopía de lapso temporal y los eventos apoptóticos acumulativos grabados tras 24 horas se representaron en un gráfica frente al tiempo (Fig. 2). Los valores mostrados representan la media de 5 experimentos.
2 x 10^{6}/placa de Petri de 100 mm de diámetro. Al día siguiente a una placa se le añadió antimicina A a una concentración de 200 \muM en combinación con coenzima Q_{10}, 10 \muM en Lutrol F127^{TM} al 0,04%, o sólo con Lutrol F127^{TM} al 0,04%. A partir de ahora "tratado con coenzima Q_{10}" se refiere a coenzima Q_{10} vehiculado en Lutrol F127^{TM} al 0,04%, mientras que con "control" nos referimos a tratado solamente con Lutrol F127^{TM} al 0,04%. Otra placa se trató con UVC a 254 nm 15 J/m^{2},sola o en combinación con coenzima Q10 (10 \muM). Las células se grabaron mediante videomicroscopía de lapso temporal y los eventos apoptóticos acumulativos grabados tras 24 horas se representaron en un gráfica frente al tiempo (Fig. 2). Los valores mostrados representan la media de 5 experimentos.
El malondialdehído es un producto de la
peroxidación de lípidos, que sigue a la exposición de ácidos grasos
poliinsaturados a los radicales libres. Por tanto, la producción de
malondialdehído se asume rutinariamente como el índice de producción
de los radicales en sí por tratamiento con radiaciones
electromagnéticas o sustancias oxidantes.
La coenzima Q_{10}, como antioxidante,
disminuye la producción de malondialdehído mediante indicación de
una acción del mismo, que inhibe la formación de radicales
libres.
Para realizar la prueba del malondialdehído, se
sembraron células RCE a una densidad de 5 x 10^{5} células/placa
en 20 placas de Petri de 100 mm de diámetro y se incubaron durante
la noche en una atmósfera al 5% de CO_{2}, a 37ºC. Después las
placas se preincubaron durante 2 horas con coenzima Q_{10} (10
placas), se lavaron con 8 ml de solución salina fisiológica
tamponada con fosfato estéril (PBS) y se les añadió Ca^{2+} y
Mg^{2+}. Las placas se sometieron a tratamiento con antimicina A
(200 \muM) o radiación ultravioleta a 254 nm (15 J/cm^{2}), como
se muestra en la Figura 3. El PBS se reemplazó por medio fresco
adicionado o no con coenzima Q_{10} y las placas se incubaron
durante otras 2 horas. Para llevar a cabo el ensayo, las células se
separaron con tripsina de acuerdo con los procedimientos estándar y
se contaron utilizando una cámara de contaje de glóbulos. Después se
lisaron las células de varias muestras mediante adición de ácido
tricloroacético (TCA) y se centrifugaron durante 20 minutos a 12.000
RPM para precipitar las
proteínas.
proteínas.
A 300 \mul de sobrenadante de cada muestra se
les añadieron 300 \mul de ácido tiobarbitúrico (TBA) al 1%. Las
mezclas se incubaron a 95ºC durante 30 minutos, se centrifugaron
durante 20 minutos a 12.000 RPM y se determinó la absorción óptica
del sobrenadante mediante análisis espectrofotométrico a 532 nm.
Los valores obtenidos se compararon con un curva
de calibración estándar y se normalizaron para el número de células.
En la Figura 3 se muestra el efecto protector de la coenzima
Q_{10} tras el tratamiento con antimicina A o radiación UVC.
El ensayo demuestra, mediante comparación
directa con otros medios conocidos en el campo, el efecto de
contención de la coenzima Q_{10} sobre el nivel de peroxidación de
los ácidos grasos por los radicales libres y, indirectamente, el
efecto protector frente a los radicales libres producidos por el
tratamiento con UVC. La Figura 3 también muestra que el nivel de
peroxidación de los ácidos grasos en caso de tratamiento con
antimicina A es similar al del control sin tratar y esto confirma la
capacidad de la coenzima Q_{10} para proteger frente a la
apoptosis independientemente de su propiedad captadora de radicales
libres, como se enfatiza en la Figura 2.
Los niveles de ATP están estrechamente
relacionados con el patrón de muerte celular, que se da después del
daño bioquímico. Por ejemplo, un nivel de ATP inferior al 20% del
valor normal es causante de necrosis, mientras que los niveles más
altos aún permiten que tenga lugar la apoptosis, que es un proceso
que se sabe que necesita energía.
A pesar de que está comprobado que los niveles
de ATP disminuyen de forma drástica después de los tratamientos con
radiaciones, de acuerdo con la presente invención se obtuvo como
resultado que la coenzima Q_{10} era capaz de evitar que tuviera
lugar esa reducción.
Para realizar el ensayo de ATP, se sembraron
células RCE a una densidad de 5 x 10^{5} células/placa en 20
placas de Petri de 10 cm de diámetro y se incubaron durante la noche
en una atmósfera al 5% de CO_{2}, a 37ºC. Después, las placas se
preincubaron durante 2 horas con coenzima Q_{10} 10 \muM o con
el vehículo solamente. El medio se reemplazó por 8 ml de PBS
estéril, se le añadieron Ca^{2+} y Mg^{2+} se sometió a
tratamiento con antimicina A (200 \muM) o radiación ultravioleta a
254 nm (15 J/cm^{2}), como se muestra en la Figura 4. Después, el
PBS se reemplazó por medio fresco, adicionado o no con coenzima
Q_{10}, y las placas se incubaron durante otras 2 horas. Para
llevar a cabo el ensayo las células se separaron con tripsina de
acuerdo con los procedimientos estándar y se contaron utilizando una
cámara de contaje de glóbulos. Después las células se resuspendieron
en agua destilada a una concentración de 6 x 10^{4} células/l, se
les hizo hervir inmediatamente durante 5 minutos y se congelaron a
-20ºC para después analizarlas.
La cuantificación de ATP en los extractos se
realizó mediante el equipo "ATP determination kit" (Molecular
Probes, USA), basado en la luciferasa de luciérnaga de acuerdo con
las instrucciones del proveedor. Para detectar la fluorescencia en
el ensayo de bioluminiscencia se utilizó un dispositivo de análisis
para centelleo líquido (Camberra Packard, USA).
Este ensayo demuestra cuantitativamente el
efecto protector de la coenzima Q_{10} frente a la disminución del
nivel de ATP causada por la antimicina A o por las radiaciones
UVC.
Los animales se sedaron mediante una inyección
intramuscular de Zoletil (0,25 ml por Kg) y una de Rompun (0,15 ml
por Kg), se anestesiaron mediante una mezcla gaseosa de oxígeno,
monóxido de nitrógeno e isofluorano y se trataron con instilación,
durante 15 minutos, de 100 \mul (2 gotas) por minuto del colirio
descrito en la PCT WO01/37851, a nombre del mismo Solicitante, o con
el vehículo solamente.
Después los animales se sacrificaron mediante
una inyección intracardíaca de Tanax 82 (3 ml). Después se
explantaron los ojos, se lavaron con una solución fisiológica para
eliminar la sangre y se separaron de los músculos y del nervio
óptico. La ablación de las córneas se realizó con tijeras corneales.
Se eliminaron los cristalinos, mientras que las
coroides-retinas junto con la esclerótica y los
humores vítreos se conservaron a -80ºC hasta realizar la
determinación de antioxidantes.
La muestra se homogeneizó con Turrax en 1 ml de
agua bidestilada y se extrajeron los antioxidantes liposolubles
(coenzima Q_{10}, retinol, \alpha-tocoferol,
\beta-caroteno) mediante la utilización de 2 ml de
mezcla de extracción (95% etanol y 5% isopropanol) y 5 ml de hexano;
la mezcla se sometió a agitación durante dos minutos. El
procedimiento dio como resultado la oxidación total de la coenzima
Q_{10} que pudiera existir en forma reducida. Después se
centrifugó la muestra a temperatura ambiente a 3640 g durante 10
min, se recogió el sobrenadante, se secó por evaporación y se
resuspendió en etanol.
Los antioxidantes se separaron por HPLC de fase
inversa, utilizando una columna KROMASIL
100\ring{A}-C_{18} 250 x 4,6 mm con una
precolumna del mismo material, a través de un gradiente convexo
(fase A: 90% de metanol y 10% de agua; fase B: 50% de metanol, 25%
de isopropanol y 25% de hexano; velocidad de elución: 1,5 ml/min).
La coenzima Q_{10} oxidada se detectó mediante un
espectrofotómetro de multidiodos a longitudes de onda de 275 nm. La
determinación cuantitativa se realizó en referencia a curvas
estándar. Los resultados, que muestran la cinética actualizada de
captación de la coenzima Q_{10} por las células de la
coroide/retina y la presencia de la coenzima Q_{10} en dichos
tejidos, se muestran en las Figuras 5 y 6, respectivamente.
Se obtuvieron datos análogos, mostrando el
efecto antiapoptótico de la coenzima Q_{10}, en fibroblastos de
ratón (RAT-1) y en células retinales humanas
(Epitelio Retinal Humano Pigmentado, también designado como
RPE).
Dados los resultados obtenidos sobre la
inhibición por la coenzima Q_{10} de los fenómenos apoptóticos
debidos a la hipoxia, la presente invención reivindica la
utilización de la coenzima Q_{10} (o ubiquinona Q_{10} o
coenzima Q_{10}) en la fabricación de un medicamento para la
profilaxis, tratamiento o atenuación de las patologías oculares
degenerativas derivadas de fenómenos apoptóticos, es decir, de la
muerte celular programada (MCP) a excepción de los fenómenos
apoptóticos debidos al exceso de radicales libres.
La administración tópica se realiza utilizando
el colirio descrito en la PCT WO01/37851, a nombre del mismo
Solicitante.
Se mantuvo una línea celular de queratocitos
corneales de conejo en medio de cultivo modificado DMEM (Dulbecco's
Modified Eagle's Medium), mezcla de nutrientes HAM F12 1:1,
suplementado con un 15% de suero fetal bovino (FBS), 2 \muM
glutamina, 5 mg/ml de insulina, 10 ng/ml de EGF y 50 UI/ml de
penicilina, en una atmósfera humidificada del 5% de CO_{2} a 37ºC.
Las células se sembraron a una densidad de 3 x 10^{5}/placa. Se
aplicaron cuatro agentes dañinos a dosis establecidas
experimentalmente para inducir la apoptosis: irradiación UVC (254
nm) a 15 mJ/cm^{2}, el bloqueante de la cadena respiratoria
antimicina A a una concentración de 200 \muM, el lípido de señal
apoptótica ceramida C_{2} (un análogo sintético de las ceramidas
endógenas permeable a las células) a una concentración de 20 \muM
y restricción de FBS al 0,5%. Los tratamientos con 10 \muM de
coenzima Q_{10} disuelto en 0,04% de Lutrol F107 utilizado como
vehículo para asegurar la captación celular de esta molécula
hidrofóbica, o con 10 \muM de vitamina C (ácido ascórbico), se
iniciaron dos horas antes de la aplicación de los estímulos
apoptóticos. Como control se utilizaron células tratadas únicamente
con vehículo. Los efectos antiapoptóticos de la coenzima Q_{10} o
de la vitamina C frente a la radiación UVC, la antimicina A, la
ceramida C_{2} y la privación de suero se evaluaron mediante
microscopía óptica y ultramicroscopía. La identificación de las
células apoptóticas con DNA fragmentado se llevó a cabo mediante
marcaje de extremos de DNA con el fragmento de
Klenow-FragEL^{TM}. En este ensayo, las células
apoptóticas se reconocen fácilmente por la presencia de una tinción
marrón oscura en contraste con las células viables que, en cambio,
aparecen de color verde o incluso sin teñir. Un número significativo
(30-60%) de las células RCE examinadas 24 horas tras
la irradiación UVC, administración de antimicina A o ceramida
C_{2} y privación de suero contenían fragmentos de DNA teñidos de
color marrón. Las células RCE tratadas con 10 \muM de coenzima
Q_{10} dos horas antes de la aplicación de los estímulos
apoptóticos se tiñeron de verde. El tratamiento con 10 \muM de
vitamina C evitó la apoptosis sólo como respuesta a la irradiación
con UVC. Esto indicó que la coenzima Q_{10} evita la apoptosis
mediante un mecanismo independiente de sus propiedades como colector
de radicales libres. La falta de efecto protector de la vitamina C
apoyó de forma clara este hecho. Los resultados obtenidos con
antimicina A y privación de suero, en la ausencia (cuadros de la
izquierda) o presencia (cuadros de la derecha) de coenzima Q_{10},
se muestran en la Figura 7. En otros experimentos no se incluyeron
ni la privación de suero como estímulo apoptótico ni el
pretratamiento con vitamina C.
Entonces se evaluó el número de células
supervivientes después de los tratamientos descritos anteriormente y
analizadas mediante ensayo MTT (Figura 8). Como se muestra en la
Figura 8 A, la irradiación con UVC, la antimicina A y la ceramida C2
hicieron disminuir el número de células supervivientes en un 82%, un
56% y un 61%, respectivamente. En todos los casos, el tratamiento
con 10 \muM de coenzima Q_{10} protegió a las células RCE, lo
que condujo a que la disminución del número de células
supervivientes disminuyera en sólo un 49%, un 29% y un 24%,
respectivamente. En cambio (Figura 8B), el tratamiento con vitamina
C, utilizado como captador de radicales libres puro, sólo protegió a
las células de forma efectiva en el caso de la apoptosis como
respuesta a la irradiación con UVC. La Figura 9 muestra las
microscopías de lapso temporal de los queratocitos RCE cultivados
durante 24 horas en ausencia de tratamiento (cuadro superior), o
siguiendo a la irradiación UVC (izquierda) o al tratamiento con
antimicina A (centro) o ceramida C_{2} (derecha), precedidos o no
por un tratamiento de 2 horas con coenzima Q_{10}. Después de
cualquiera de los tres tratamientos, una gran cantidad de células
sufrió apoptosis, pero el tratamiento con coenzima Q_{10} hizo
disminuir esta cifra de forma muy marcada, lo que indica la
efectividad de la coenzima Q_{10} para evitar la apoptosis frente
a cualquier estímulo apoptótico. Los correspondientes datos
cuantitativos se muestran en la Figura 10. Respecto a los controles
no tratados o tratados con coenzima Q_{10}, el número de eventos
apoptóticos grabado por la videomicroscopía de lapso temporal
aumentó de forma marcada después de aplicar cualquiera de los tres
estímulos apoptóticos, pero aumentó significativamente
menos en los casos en los que las células se trataron con coenzima Q_{10} durante 2 horas antes de inducir la apoptosis.
menos en los casos en los que las células se trataron con coenzima Q_{10} durante 2 horas antes de inducir la apoptosis.
Se analizaron los efectos de la irradiación con
UVC, la antimicina A, la ceramida C_{2} y la privación de suero
sobre la generación de radicales libres dos horas tras la aplicación
de los estímulos, utilizando el nivel de malonaldehído y la
actividad SOD como parámetros indirectos. Las células se pretrataron
o no con coenzima Q_{10} o vitamina C como se describe en el
Ejemplo 4. Como se muestra en la Figura 11, los aumentos
significativos de nivel de MDA (cuadro superior) y de actividad SOD
(cuadro inferior) respecto a las células no tratadas se obtuvieron
sólo como respuesta a la irradiación con UVC (de 1,5 pg/célula a
16,5 pg/célula y de 6,5 U/mg de proteína a 19,5 U/mg de proteína,
respectivamente). El pretratamiento con coenzima Q_{10} o vitamina
C redujo este aumento.
La ejecución del programa de muerte celular
apoptótica requiere una consumición masiva de ATP y, por
consiguiente, se ve acompañada por una reducción muy marcada de los
niveles celulares de ATP. Las células se trataron como en el Ejemplo
5. Como se muestra en la Figura 12, la irradiación con UVC, la
antimicina A y la ceramida C2 hicieron disminuir los nieles de ATP
en las células RCE en un 65%, un 76% y un 81%, respectivamente, en
comparación con los controles sin tratar. La administración de
coenzima Q_{10} protegió a las células RCE de forma significativa
frente a la reducción de los niveles de ATP. De hecho, en las
células RCE tratadas, los niveles de ATP se redujeron en un 28% en
las irradiadas con UVC, en un 41% en las tratadas con antimicina A y
en un 51% en las tratadas con ceramida C_{2}, en comparación con
los controles tratados sólo con coenzima Q_{10}.
Las células se trataron como en el Ejemplo
5.
El cambio en el potencial transmembrana
mitocondrial (\Delta\Psi) que tiene lugar después de la
apoptosis se detectó mediante un ensayo basado en la fluorescencia
en células RCE. Las células se cultivaron en cubreobjetos, en medio
DMEM que contenía la sonda lipofílica catiónica de ioduro de
5,5',6,6'-tetracloro-1,1',3,3'-tetraetilbencimidazol-carbocianina
(JC-1, 5 mg/ml) (JC-1, Molecular
Probes Inc. Eugene, OR, EEUU) durante 15 min a 37ºC. Este colorante
posee una propiedad única: en los potenciales de membrana
hiperpolarizados (hasta -140 mV) forma un agregado J fluorescente de
color rojo, mientras que en los potenciales de membrana
despolarizados (hasta -100 mV) permanece en la forma monomérica
fluorescente de color verde. Antes de la detección se lavaron las
células en PBS y se situaron en una cámara de carga de flujo
transversal abierto que estaba montada en el portaobjetos de un
microscopio confocal de barrido BioRad MCR 1024 ES (BioRad
Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) equipado con una fuente de
láser de kriptón/argón. La fluorescencia se monitorizó utilizando
longitudes de onda de 488 y 568 nm y recogiendo la fluorescencia
emitida con un objetivo de inmersión en aceite Nikon plan Apo X60.
Como se muestra en la Figura 13, la irradiación con UVC así como el
tratamiento con antimicina A o ceramida C_{2} determinaron el
colapso del \Delta\Psi, de hecho hubo un cambio en la carga de
la membrana observado como una desaparición de mitocondrias
fluorescentes teñidas de rojo-naranja y un aumento
de las mitocondrias fluorescentes teñidas de
verde.
verde.
Se evaluaron las células RCE 24 horas después
del estímulo apoptótico. Las fracciones citosólicas se prepararon
como se describe en Ruties et al. 1999, J. Biol. Chem. 274,
24799-24807. Las proteínas de los extractos
citosólicos se cuantificaron mediante el Reactivo de Ensayo de
Proteínas BCA (PIERCE Rockford, IL, USA). Las proteínas (25
\mug/carril) se sometieron a electroforesis a través de gel de
poliacridamida SDS al 12,5% y se les realizó un "electroblot"
sobre membrana de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell, Keene,
NH) mediante un "transblotter" (BioRad Laboratories Inc.,
Hercules, CA, USA). Las señales no específicas se bloquearon
utilizando tampón de bloqueo (5% p/v de leche descremada en polvo
instantánea en PBS) y se incubaron durante la noche a 4ºC con 1
mg/ml de anticuerpo monoclonal anti citocromo c (BD Pharmingen, San
Diego, CA, USA). La membrana se lavó y después se incubó con IgG
anti-ratón de cabra, conjugada con peroxidasa de
rábano picante (Sigma-Aldrich, Milán, Italia). La
detección se llevó a cabo mediante un procedimiento comercial de
quimioluminiscencia (ECL, Amersham Pharmacia Biotech Europe,
Freiburg, Alemania). Como se muestra en la Figura 14, 24 horas tras
la inducción de la apoptosis, las células RCE mostraron un aumento
del citocromo c citoplasmático en comparación con las células RCE no
tratadas. Cuando los tratamientos estuvieron precedidos por la
administración de COQ_{10}, el citocromo c citoplasmático
permaneció en niveles similares a los de las células no
inducidas.
La actividad de la caspasa 9 se determinó
mediante el Ensayo de Proteasa Colorimétrico de la Caspasa 9
(BioSource Europe S.A., Nivelles, Bélgica). Se incubaron extractos
citosólicos, preparados mediante la lisis de células utilizando el
Tampón de Lisis Celular que proporciona el equipo, con el sustrato
colorimétrico LEHD
(Leu-Glu-His-Asp)
conjugado con el cromóforo p-nitroanilida (pNA) en 50 ml de
Tampón de Reacción 2X que contenía 10 \muM de DTT. Tras 2 horas de
incubación a 37ºC se midió la DO de las muestras a 405 nm en lector
de ELISA BioRad. La Figura 15 muestra un aumento de 6 a 8 veces de
la actividad de la caspasa 9 en las células RCE 24 horas tras la
administración de los estímulos apoptóticos. Cuando los estímulos
fueron precedidos por la administración de coenzima Q_{10}, la
actividad de la caspasa 9 permaneció a niveles significativamente
más bajos, pero no a los mismos niveles que en las células RCE no
estimuladas.
El colapso del potencial transmembrana
mitocondrial (\Delta\Psi), el citocromo C citoplasmático y la
activación de la caspasa 9 son parte de la vía apoptótica intrínseca
(mitocondria-dependiente) desencadenada por la
apertura de los PTP. El pretratamiento con coenzima Q_{10} evitó
en gran medida estos sucesos. Estos resultados indican claramente
que, independientemente de su capacidad captadora de radicales
libres, la coenzima Q_{10} evitó la ejecución de la apoptosis
manteniendo directamente los PTP mitocondriales en la conformación
cerrada.
La fragmentación apoptótica del DNA
internucleosómico se evaluó mediante un ensayo clásico,
detectando
"ladders" separadas electroforéticamente del DNA fragmentado. El DNA genómico se extrajo de las células RCE como describen Blankenberg et al. 1997, Blood 89, 3778-3786. Los fragmentos se separaron mediante electroforesis en gel en un 0,8% de agarosa con bromuro de etidio (0,2 \mug/ml), se visualizaron por UV y se fotografiaron. El pretratamiento con coenzima Q_{10} también evitó la fragmentación de DNA iternucleosómico (Figura 16) producida por todos los estímulos apoptóticos, lo que indicó que el bloqueo de la vía apoptótica intrínseca debido al pretratamiento con coenzima Q_{10} es suficiente para evitar la "puesta en marcha" del mecanismo apoptótico completo que desencadenan los estímulos apoptóticos.
"ladders" separadas electroforéticamente del DNA fragmentado. El DNA genómico se extrajo de las células RCE como describen Blankenberg et al. 1997, Blood 89, 3778-3786. Los fragmentos se separaron mediante electroforesis en gel en un 0,8% de agarosa con bromuro de etidio (0,2 \mug/ml), se visualizaron por UV y se fotografiaron. El pretratamiento con coenzima Q_{10} también evitó la fragmentación de DNA iternucleosómico (Figura 16) producida por todos los estímulos apoptóticos, lo que indicó que el bloqueo de la vía apoptótica intrínseca debido al pretratamiento con coenzima Q_{10} es suficiente para evitar la "puesta en marcha" del mecanismo apoptótico completo que desencadenan los estímulos apoptóticos.
Claims (3)
1. La utilización de una composición para la
administración tópica sobre el ojo que incluya coenzima Q_{10} o
ubiquinol como principios activos para la fabricación de un
medicamento para la profilaxis, tratamiento o atenuación de
patologías neurodegenerativas de la parte posterior del ojo,
originadas a partir de eventos apoptóticos,
Dicha composición contiene:
De un 0,01 a un 2% ppp de coenzima Q_{10} o
ubiquinol, de un 0,005 a un 0,1% ppp de tocoferol; y una mezcla que
incluye un aceite de ricino modificado y un bloque de copolímero de
óxido de etileno hidrofílico y un óxido de propileno lipofílico con
una proporción dominante de polioxietileno, un peso molecular de
entre 10.000 y 13.000 Dalton y un valor de equilibrio
hidrófilo/lipófilo (HLB) superior a 15, en una cantidad suficiente
para solubilizar dichos componentes en una disolución acuosa.
2. La utilización de acuerdo con la
reivindicación 1, donde dicha cantidad suficiente para solubilizar
dichos componentes en una disolución acuosa es de un 10 a un 15%
ppp.
3. La utilización de acuerdo con las
reivindicaciones 1 o 2, donde dicho aceite de ricino modificado es
polietilenglicol gliceril-triricinoleato.
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| IT1299578B1 (it) * | 1998-07-24 | 2000-03-16 | Rosario Brancato | Uso dell'ubichinone per la produzione di un farmaco efficace nella prevenzione e nel trattamento della degenerazione maculare correlata |
| IT1304406B1 (it) | 1998-10-21 | 2001-03-19 | Danital Italia S R L | Preparazione per la veicolazione di principi attivi basata su acidigrassi polinsaturi del gruppo omega 3. |
| WO2000057871A2 (en) * | 1999-03-30 | 2000-10-05 | Purdue Research Foundation | Methods for identifying agents that inhibit serum aging factors and uses and compositions thereof |
| IT1307281B1 (it) * | 1999-11-25 | 2001-10-30 | Simonelli Giuseppe | Uso di ubichinone q10 per il trattamento locale e la prevenzione dipatalogie oftalmologiche secondarie alla terapia fotorefrattiva, |
| US6441050B1 (en) | 2000-08-29 | 2002-08-27 | Raj K. Chopra | Palatable oral coenzyme Q liquid |
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