DE60004635T2

DE60004635T2 - Baff, dessen inhibitoren und dessen verwendung zur modulierung der b-zell-antwort

Info

Publication number: DE60004635T2
Application number: DE60004635T
Authority: DE
Inventors: Jeffrey Browning; Christine Ambrose; Fabienne Mackay; Jurg Tschopp; Pascal Schneider
Original assignee: APOTECH SA; Biogen Inc
Current assignee: APOTECH SA; Biogen Inc
Priority date: 1999-01-25
Filing date: 2000-01-25
Publication date: 2004-06-09
Anticipated expiration: 2020-01-26
Also published as: KR20010105331A; AU3214200A; ATE515267T1; JP4955642B2; JP2009102326A; CN1347326A; JP2014141527A; HUP0105283A2; EP2319527A3; JP2012126749A; KR100834809B1; EE05699B1; ATE247482T1; SI1146892T1; TR200102147T2; WO2000043032A2; NO20013641L; JP2002535285A; US20020037852A1; PT1415659E

Description

BEREICH DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Liganden, BAFF, eines zur Tumornekrose-Familie gehörenden, β-Zellen aktivierenden Faktors und seine hemmenden Wirkstoffe, um die Expression von B-Zellen und Immunglobulinen entweder zu stimulieren oder zu inhibieren. Dieses Protein und sein Rezeptor können in Anti-Krebs- und/oder immunregulatorischen Anwendungen, wie auch zur Behandlung immunsuppressiver Erkrankungen, wie etwa HIV, Verwendung finden. Im Besonderen können der Ligand und seine hemmenden Wirkstoffe eine Rolle bei der Entwicklung von Bluthochdruck und die damit zusammenhängenden Erkrankungen spielen. Weiterhin können mit dem Gen für diesen Liganden transfizierte Zellen Verwendung in der Gentherapie zur Behandlung von Tumoren, Autoimmunerkrankungen oder B-Zellen betreffenden Erbkrankheiten Verwendung finden. Hemmende Wirkstoffe, wie etwa rekombinante Varianten oder für den Liganden oder seinen Rezeptor spezifische Antikörper, können ebenso für immunregulatorische Anwendungen Verwendung finden. Die Verwendung von BAFF zur Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung des B-Zell-Wachstums für immunsupprimierte Erkrankungen, einschließlich, zum Beispiel; Verwendungen für Patienten, die sich entweder einer Organtransplantation unterziehen (d.h. einer Knochenmarkstransplantation} oder sich von einer Tumorbehandlung erholen, um die Produktion von B-Zellen zu stimulieren, wird betrachtet.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Tumornekrosefaktor (TNF)-verwandten Cytokine sind Mediatoren der Immunantwort und der Immunregulation. Mitglieder dieser Familie gibt es in Membran-verankerter Form, in der sie lokal durch Zell-Zell-Kontakte wirken, oder als sekretierte Proteine, die in der Lage sind, zu weiter entfernten Zielen zu diffundieren. Eine entsprechende Familie von Rezeptoren signalisiert die Anwesenheit dieser Moleküle, was zur Einleitung des Zelltods oder zu zellulärer Proliferation und Differenzierung im Zielgewebe führt. Gegenwärtig besitzt die TNF-Familie aus Liganden und Rezeptoren mindestens 11 erkannte Rezeptor-Liganden Paare, einschließlich: TNF:TNF-R; LT-α:TNF-R; LT-α/β:LT-β-R; FasL:Fas; CD40L:CD40; CD30L:CD30; CD27L:CD27; OX40L:OX40 und 4-1BBL:4-1BB. Die DNA-Sequenzen, die diese Liganden kodieren, besitzen nur etwa 25% bis etwa 30% Identität, selbst in den am stärksten verwandten Fällen, obwohl die Aminosäure-Verwandschaft etwa 50% beträgt.
Die definierende Eigenschaft dieser Familie von Cytokinrezeptoren liegt in der Cystein-reichen extrazellulären Domäne, die durch die molekulare Klonierung zweier verschiedener TNF-Rezeptoren entdeckt wurde. Diese Genfamilie kodiert für Typ I-Transmembranproteine typische Glykoproteine mit einer extrazellulären Ligandenbindungsdomäne, einer einzelnen Membran-überspannenden Region und einer cytoplasmatischen Region, die an der Aktivierung zellulärer Funktionen beteiligt ist. Die Cystein-reiche Ligandenbindungsregion weist eine eng verknüpfte, Disulfid-verbrückte Kerndomäne auf, die, in Abhängigkeit von dem betreffenden Mitglied der Familie, mehrere Male wiederholt wird. Die meisten Rezeptoren besitzen vier Domänen, obwohl es auch nur drei geben kann, oder auch bis zu sechs.
Proteine der TNF-Ligandenfamilie sind durch einen kurzen N-terminalen Abschnitt von normalerweise kleinen hydrophilen Aminosäuren gekennzeichnet, der oft mehrere Lysin- oder Argininreste enthält, von denen angenommen wird, daß sie als Stop-Transfer-Sequenzen dienen. Darauf folgen eine Transmembranregion und eine extrazelluläre Region variabler Länge, die die C-terminale Rezeptorbindungsdomäne von der Membran trennt. Diese Region wird manchmal als "Stiel" bezeichnet. Die C-terminale Bindungsregion beinhaltet den Hauptanteil des Proteins und enthält oft, aber nicht immer, Glykosylierungsstellen. Diesen Genen fehlen die für Typ I-Membranproteine charakteristischen, klassischen Signalsequenzen, Typ II-Membranproteine mit einem außerhalb der Zelle liegenden C-Terminus, und einer kurzen, im Cytoplasma liegenden N-terminalen Domäne. In einigen Fällen, z.B. bei TNF und LT-α, kann die Spaltung in der Stielregion früh- im Lauf der Proteinprozessierung auftreten, und der Ligand wird dann hauptsächlich in sekretierter Form gefunden. Die meisten Liganden treten jedoch in der Membranform auf, und vermitteln örtlich begrenzte Signalwirkung.
Die Struktur dieser Liganden wurde durch kristallographische Analysen von TNF, LT-α und CD40L gut definiert. TNF und Lymphotoxin-α (LT-α) besitzen beide eine Sandwich-Struktur aus zwei Anti-parallelen β-Faltblättern mit "Jelly Roll"- oder Greek Key-Topologie. Die Abweichung des quadratischen Mittels zwischen den Cα- und β-Resten beträgt 0.61 C, was einen hohen Ähnlichkeitsgrad in ihrer molekularen Topologie nahelegt. Eine aus den molekularen Untersuchungen von CD40L, TNF und LT-α hervorgehende strukturelle Eigenschaft ist die Neigung zur Zusammenlagerung zu oligomeren Komplexen. Die Bildung der Rezeptorbindungsstelle an der Grenze zwischen den benachbarten Untereinheiten ist ein wesentlicher Teil der oligomeren Struktur, wodurch ein multivalenter Ligand entsteht. Durch die Analyse ihrer Kristallstrukturen wurde gezeigt, daß TNF, CD40L und LT-α in ihrer Quartärstrukturen als Trimere vorliegen. Viele der zwischen den verschiedenen Liganden konservierten Aminosäuren liegen in Abschnitten des β-Faltblatt-Gerüstes. Es ist wahrscheinlich, daß die grundlegende Sandwichstruktur in allen diesen Molekülen beibehalten wird, da Teile dieser Gerüstsequenzen in den verschiedenen Mitgliedern der Familie konser viert sind. Die Quartärstruktur kann ebenso aufrechterhalten werden, da die Konformation der Untereinheit wahrscheinlich ähnlich bleibt.
Die Mitglieder der TNF-Familie können am besten als Hauptschalter im Immunsystem beschrieben werden, die sowohl das Überleben der Zelle als auch die Differenzierung kontrollieren. Nur TNF und LT-α sind gegenwärtig als sekretierte Cytokine bekannt, im Gegensatz zu den anderen, hauptsächlich Membran-verankerten Mitgliedern der TNF-Familie. Während eine Membranform von TNF gut charakterisiert wurde und wahrscheinlich sehr spezifische biologische Rollen besitzt, fungiert sekretiertes TNF als allgemeines Alarmsignal für Zellen, die weiter vom Ort des auslösenden Geschehens entfernt sind. So kann die Sekretion von TNF ein Ereignis verstärken, das zu den gut beschriebenen Veränderungen in der Auskleidung der Blutgefäße und dem Entzündungszustand von Zellen führt. Im Gegensatz dazu senden die Membran-gebundenen Mitglieder der Familie Signale durch die Rezeptoren vom TNF-Typ nur an Zellen in direktem Kontakt. Zum Beispiel stellen T-Zellen durch CD40 vermittelte "Hilfe" nur solchen B-Zellen zur Verfügung, die durch verwandte TCR-Wechselwirkungen in direkten Kontakt gebracht wurden. Ähnliche, durch Zell-Zell-Kontakt bedingte Beschränkungen der Fähigkeit zur Einleitung des Zelltods treffen auf das gut untersuchte Fas-System zu.
Offensichtlich kann man die TNF-Liganden auf Grundlage ihrer Fähigkeit zur Einleitung des Zelltods in drei Gruppen aufteilen. Erstens können TNF, Fas-Ligand und TRAIL den Zelltod in vielen Zelllinien effizient induzieren, und ihre Rezeptoren besitzen sehr wahrscheinlich gute kanonische Todesdomänen (death domains). Wahrscheinlich würde der Ligand zu DR-3 (TRAMP/WSL-1) ebenso in diese Kategorie fallen. Als Nächstes gibt es diejenigen Liganden, die ein schwächeres, auf wenige Zelltypen beschränktes Todessignal auslösen, und TWEAK, CD30-Ligand und LTalb2 sind Beispiele für diese Klasse. Wie diese Gruppe den Zelltod in Abwesenheit einer kanonischen Todesdomäne auslösen kann ist eine interessante Frage und legt den Schluß nahe, daß ein gesonderter, schwächerer Todessignal-Mechanismus existiert. Schließlich gibt es diejenigen Mitglieder, die kein effizientes Todessignal vermitteln können. Möglicherweise können alle Gruppen Antiproliferative Wirkungen auf einige Zelltypen haben, die der Induktion der Zelldifferenzierung folgen, z.B. CD40. Funakoshi et al. (1994).
Die TNF-Familie ist in den letzten Jahren dramatisch gewachsen und umfaßt mindestens 11 verschiedene Signalwege, die die Regulation des Immunsystems betreffen. Die weit verbreiteten Expressionsmuster von TWEAK und TRAIL zeigen, daß es noch mehr funktionelle Vielfalt in dieser Familie zu entdecken gibt. Dieser Aspekt wurde vor kurzem durch die Entdeckung von zwei Rezeptoren, die die Replikationsfähigkeit von Rous-Sarcoma- und Herpes-Simplex-Virus beeinflußen, besonders betont, wie auch durch die historischen Beobachtungen, daß TNF antivirale Aktivität besitzt, und Pockenviren Köder-TNF-Rezeptoren kodieren. Brojatsch et al. (1996); Montgomery et al. (1996); Smith et al. (1994), Cell 76, 959–962; Vassalli et al. (1992), Immunol. 10, 411–452.
TNF ist ein Mediator für Septischen Schock und Kachexie, und ist an der Regulation der Entwicklung hämatopoetischer Zellen beteiligt. Er spielt anscheinend eine wesentliche Rolle als Mediator für Entzündung und Verteidigung gegen bakterielle, virale und parasitäre Infektionen und besitzt ebenso Antitumor-Aktivität. TNF ist ebenfalls an verschiedenen Autoimmunerkrankungen beteiligt. TNF kann von verschiedenen Zelltypen, einschließlich Makrophagen, Fibroblasten, T-Zellen und Natürlichen Killer-Zellen, produziert werden. TNF bindet an zwei verschiedene Rezeptoren, von denen jeder durch spezifische intrazelluläre Signalmoleküle wirkt, was unterschiedliche Wirkungen von TNF hervorruft. TNF kann entweder in Membran-gebundener Form oder als lösliches, sekretiertes Cytokin vorliegen.
LT-α hat viele Aktivitäten mit TNF gemeinsam, d.h. die Bindung an TNF-Rezeptoren, aber im Gegensatz zu TNF scheint es hauptsächlich von aktivierten T-Zellen und einigen β-lymphoblastischen Tumoren sekretiert zu werden. Der heteromere Komplex aus LT-α und LT-β ist ein Membran-gebundener Komplex, der an den LT-β-Rezeptor bindet. Das LT-System (LTs und LT-R) scheint an der Entwicklung der peripheren lymphatischen Organe beteiligt zu sein, da die Disruption von LT-β zur Desorganisation von T- und B-Zellen in der Milz und zum Fehlen von Lymphknoten führt. Das LT-β-System ist ebenfalls am Zelltod von einigen Adenokarcinom-Zelllinien beteiligt.
Fas-L, ein anderes Mitglied der TNF-Familie, wird vornehmlich auf aktivierten T-Zellen exprimiert. Er induziert den Tod von Zellen, die seinen Rezeptor tragen, einschließlich Tumorzellen und HIV-infizierter Zellen, durch einen Mechanismus, der als programmierter Zelltod oder Apoptose bekannt ist. Darüberhinaus können Fas- oder Fas-L-Defizienzen zu lymphoproliferativen Erkrankungen führen, wodurch die Rolle des Fas-Systems in der Regulation der Immunantwort bestätigt wird. Das Fas-System ist ebenfalls an der durch eine chronische hepatische Infektion hervorgerufenen Leberschädigung und an der Autoimmunität in HIV-Patienten beteiligt. Das Fas-System ist ebenfalls an der Zerstörung von T-Zellen in HIV-Patienten beteiligt. TRAIL, ein anderes Mitglied dieser Familie, scheint ebenfalls am Zelltod einer großen Anzahl transformierter Zelllinien unterschiedlichen Ursprungs beteiligt zu sein.
CD40-L, ein anderes Mitglied der TNF-Familie, wird auf T-Zellen exprimiert und induziert die Regulation CD40-tragender Zellen. Darüberhinaus führen Änderungen im CD40-L-Gen zu einer als X-linked Hyper-IgM-Syndrom bekannten Erkrankung. Das CD40-System ist ebenfalls an verschiedenen Autoimmunerkrankungen beteiligt und es ist bekannt, daß CD40-L Antivirale Eigenschaften besitzt. Obwohl das CD40-System an der Rettung apoptotischer B-Zellen beteiligt ist, induziert es Apoptose in Zellen, die nicht zum Immunsystem gehören. Viele weitere Lymphocyten-Mitglieder der TNF-Familie sind ebenfalls an Kostimulationen beteiligt.
Allgemein spielen die Mitglieder der TNF-Familie grundlegende regulatorische Rollen bei der Kontrolle des Immunsystems und der Aktivierung der akuten Immunantwort-Systeme. Angesichts des gegenwärtigen Fortschritts bei der Manipulierung von Mitgliedern der TNF-Familie zum therapeutischen Nutzen ist es wahrscheinlich, daß Mitglieder dieser Familie einzigartige Mittel zur – Kontrolle von Erkrankungen liefern können. Einige Liganden aus dieser Familie können direkt den apoptotischen Tod vieler transformierter Zellen auslösen, z.B. LT, TNF, Fas-Ligand und TRAIL. Nagata, Cell 88 (1997), 355–365. Die Aktivierung von Rezeptoren durch Fas und möglicherweise TNF und CD30 kann den Zelltod in nicht transformierten Lymphocyten auslösen, was eine immunregulatorische Funktion besitzen könnte. Amakawa et al., Cell 84 (1996), 551–562; Nagata, Cell 88 (1997), 355–365; Sytwu et al. (1996); Zheng et al., Nature 377 (1995), 348–351. Im Allgemeinen wird der Zelltod als Folge der Zusammenlagerung der Todesdomänen ausgelöst, die sich auf der cytoplasmatischen Seite der TNF-Rezeptoren befinden. Die Todesdomäne bewirkt die Zusammenlagerung verschiedener Signaltransduktions-Komponenten, was die Aktivierung der Caspase-Kaskade zur Folge hat. Nagata, Cell 88 (1997), 355–365. Einigen Rezeptoren fehlen kanonische Todesdomänen, z.B. dem LTb-Rezeptor und CD30 (Browning et al. (1996); Lee et al. (1996)), die dennoch, wenn auch schwächer, den Zelltod auslösen können. Es ist wahrscheinlich, daß diese Rezeptoren eine Funktion in der Induktion der Zelldifferenzierung haben und daß der Zelltod eine abweichende Folge in einigen transformierten Zelllinien ist, obwohl das Bild nicht eindeutig ist, da Untersuchungen an der CD30-Null-Maus eine Rolle beim Zelltod in der negativen Selektion im Thymus nahelegen. Amakawa et al., Cell 84 (1996), 551–562. Umgekehrt sind Signale über andere Wege, wie etwa CD40, zur Aufrechterhaltung des Überlebens von Zellen erforderlich. Es gibt daher einen Bedarf, zusätzliche Moleküle zu identifizieren und zu charakterisieren, die Mitglieder der TNF-Familie sind, wodurch zusätzliche Mittel zur Kontrolle von Erkrankungen und zur Manipulation des Immunsystems bereit gestellt werden.
Wir charakterisieren hier die funktionellen Eigenschaften eines neuen Liganden der TNF-Cytokinfamilie. Der neue Ligand, genannt BAFF (B-Zell-aktivierender Faktor aus der TNF-Familie), scheint von T-Zellen und Dendritischen Zellen zum Zweck der B-Zell-Kostimulation exprimiert zu werden und kann daher eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der B-Zell-Funktion spielen. Darüberhinaus haben wir transgene Mäuse erzeugt, die BAFF unter der Kontrolle eines Leber-spezifischen Promotors überexprimieren. Diese Mäuse haben eine übermäßige Anzahl reifer B-Zellen, spontane Keimzentrums-Reaktionen, sie sekretieren AutoAntikörper, und haben eine hohe Anzahl von Plasmazellen in den sekundären Lymphorganen und Ig-Ablagerungen in der Niere.
INHALT DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist demgemäß auf die Verwendung des Liganden BAFF, hemmender Wirkstoffe und Antikörper gegen den Liganden zur Herstellung eines Arzneimittels gerichtet, um das Wachstum von B-Zellen und die Sekretion von Immunglobulinen entweder zu stimulieren oder zu hemmen. Die beanspruchte Erfindung kann sowohl für therapeutische Anwendungen bei zahlreichen Erkrankungen und Krankheiten verwendet werden, wie weiter unten detaillierter ausgeführt, als auch um Informationen über das Immunsystem und seine Vorgänge und deren Manipulation zu erhalten. Weiterhin, kann diese Erfindung zur Stimulierung oder Inhibierung des B-Zell-Wachstums und der Sekretion von Immunglobulinen verwendet werden. Mit BAFF assoziierte Moleküle können ebenfalls, wie in dieser Erfindung beschrieben, Verwendung in der Behandlung von Autoimmunerkrankungen, von mit der Proliferation und Reifung von B-Zellen, der Regulation von BAFF und mit Entzündung zusammenhängenden Krankheiten finden. Die Erfindung kann an der Regulation oder Prävention von Bluthochdruck und von mit Bluthochdruck zusammenhängenden Krankheiten des renalen und kardiovaskulären Gewebes beteiligt sein.
Zusätzliche Eigenschaften und Vorzüge der Erfindung werden in der folgenden Beschreibung ausgeführt, und werden zum Teil aus der Beschreibung ersichtlich, oder können durch die Anwendung der Erfindung erfahren werden. Die Gegenstände und andere Vorzüge der Erfindung werden durch die sowohl in der schriftlichen Beschreibung und den Patentansprüchen hiervon als auch in den beigefügten Zeichnungen genau aufgezeigten Verfahren ausgeführt und erreicht.
Um diese und andere Vorzüge zu erzielen, und in Übereinstimmung mit dem Zweck der Erfindung, wie hierin dargestellt und ausführlich beschrieben, schließt die Erfindung die Verwendung verschiedener Liganden BAFF und verwandter Moleküle zur Herstellung eines Arzneimittels zur Beeinflussung des B-Zell-Wachstums und der Sekretion von Immunglobulinen ein.
Die Erfindung betrachtet auch die Verwendung von BAFF oder aktiven Fragmenten des Polypeptids zur Herstellung eines Arzneimittels zur Stimulierung des B-Zell-Wachstums. Das Polypeptid kann alleine oder mit einem CD40-Ligand oder einem Anti-Maus-Antikörper verwendet werden.
In anderen Ausführungsformen betrifft die Erfindung die Verwendung von BAFF oder aktiven Fragmenten von BAFF zur Herstellung eines Arzneimittels zur Stimulierung des durch Dendritische Zellen induzierten B-Zell-Wachstums und -Reifung Wiederum kann das Polypeptid alleine oder mit CD40-Ligand oder Anti-μ Antikörpern verwendet werden.
In anderen Ausführungsformen wurden BAFF- und den BAFF-Rezeptor-hemmende Wirkstoffe zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung des B-Zell Wachstums und der Immunglobulin-Sekretion verwendet. Diese Wirkstoffe können nicht funktioneller, rekombinanter BAFF, BAFF-spezifische Antikörper oder BAFF-Rezeptor-spezifische Antikörper sein.
In weiteren anderen Ausführungsformen betrifft die Erfindung die Verwendung von BAFF, BAFF-verwandten Molekülen und BAFF-hemmenden Wirkstoffen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Bluthochdruck, mit Bluthochdruck zusammenhängenden Krankheiten, Immunkrankheiten, Autoimmunerkrankungen, Entzündung und B-Zell-lymphoproliferativen Krankheiten.
Die Erfindung schließt die Verwendung von BAFF und BAFF-verwandten Molekülen als Agonisten oder Antagonisten zur Herstellung eines Arzneimittels zur Beeinflußung von Immunantworten durch die Beeinflußung des Wachstums und/oder der Reifung von B-Zellen und der Sekretion von Immunglobulin ein.
Die Erfindung betrifft in anderen Ausführungsformen aus BAFF bestehende, lösliche Konstrukte, die verwendet werden können; um direkt durch BAFF vermittelte pharmakologische Vorgänge auszulösen. Diese Vorgänge können verwendbaren therapeutischen Nutzen in der Behandlung von Krebs, Tumoren oder der Manipulation des Immunsystems zur Behandlung immunologischer Erkrankungen haben.
Darüberhinaus betrifft die beanspruchte Erfindung in anderen Ausführungsformen gegen BAFF gerichtete Antikörper, die zum Beispiel zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebsarten und der Manipulation des Immunsystems zur Behandlung einer immunologischen Erkrankung verwendet werden können.
In weiteren anderen Ausführungsformen betrifft die Erfindung eine Gentherapie unter Verwendung der Gene für BAFF.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen können, optional, pharmazeutisch verträgliche Träger, Adjuvantien, Füllstoffe, oder andere Arzneimittel beinhalten, und können durch jede der zahlreichen Formen oder Wege, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, verabreicht werden.
Es versteht sich, daß sowohl die vorangegangene allgemeine Beschreibung, als auch die folgende detaillierte Beschreibung nur exemplarisch und erklärend sind und eine weitergehende Erläuterung der Patentansprüche der Erfindung liefern sollen.
Die beigefügten Zeichnungen sind enthalten, um ein weitergehendes Verständnis der Erfindung bereitzustellen, und sind aufgenommen in und bilden einen Teil dieser Spezifikation, veranschaulichen einige Ausführungsformen der Erfindung, und dienen zusammen mit der Beschreibung zur Erklärung der Grundgedanken der Erfindung.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1(A) zeigt die vorhergesagte Aminosäuresequenz von humanem und Maus-BAFF. Die vorhergesagte Transmembrandomäne (TMD, gestrichelte Linie), die potenziellen N-Glykosylierungsstellen (Sterne) und die natürliche Prozessierungsstelle des humanen BAFF (Pfeil) sind bezeichnet. Die Doppellinie über hBAFF bezeichnet die durch Edman-Abbau der prozessierten Form von BAFF erhaltene Sequenz. (B) Zeigt einen Vergleich der extrazellulären Proteinsequenz von BAFF und einigen Mitgliedern der TNF-Ligandenfamilie. Identische und homologe Reste sind durch schwarze bzw. schattierte Unterlegung dargestellt. (C) Zeigt ein Dendogramm der Liganden der TNF-Familie.
2 ist eine schematische Charakterisierung des rekombinanten BAFF. (A) Schematische Darstellung rekombinanter BAFF-Konstrukte. Lösliche rekombinante BAFFs, die bei Leu83 und Gln136 beginnen, werden mit einer N-terminalen Flag-Markierung und einem Linker aus 6 Aminosäuren exprimiert. Die lange Form wird in 293T-Zellen zwischen Arg133 und Arg134 (Pfeil) gespalten, um eine prozessierte Form von BAFF zu liefern. Asn124 und Asn242 sind Teil von Konsensus N-Glykosylierungsstellen. An Asn124 vorhandenes N-gebundenes Glykan ist als Y gezeigt. TMD: Transmembrandomäne. (B) Peptid-N-Glykanase F (PNGase F)-Behandlung von rekombinantem BAFF. Konzentrierte, Flag-markierte BAFFs und APRIL enthaltende Überstände wurden deglykosyliert und im Western-Blot unter Verwendung von polyklonalen Anti-BAFF-Antikörpern oder Anti-Flag-M2, wie angegeben, analysiert. Alle Banden, außer dem prozessierten BAFF, reagierten mit Anti-Flag-M2 (Daten nicht gezeigt). (C) Volllängen-BAFF wird zu einer löslichen Form prozessiert. 293T-Zellen wurden mit Volllängen-BAFF transient transfiziert. Transfizierte Zellen und ihre konzentrierten Überstände wurden im Western-Blot unter Verwendung polyklonaler Anti-BAFF-Antikörper analysiert. Überstände, die der 10fachen Menge an Zellen entsprachen, wurden auf das Gel aufgetragen. (D) Größenausschluß-Chromatographie von löslichem BAFF über Superdex-200. Konzentrierte Überstände, die löslichen BAFF/kurz enthielten, wurden über eine Superdex-200 Säule fraktioniert und die eluierten Fraktionen wurden im Western-Blot unter Verwendung von Anti-Flag-M2-Antikörper analysiert. Die Positionen der Molekulargewichtsmarker (in kDa) sind auf der linken Seite für SDS-PAGE und über der Abbildung für die Größenausschluß-Chromatographie bezeichnet.
3 zeigt die Expression von BAFF. (A) Northern-Blots (2 μg polyA⁺-RNA pro Spur) aus verschiedenen humanen Geweben wurden mit BAFF-Antisense-RNA hybridisiert. (B) Reverse Transkriptase-Amplifikation von BAFF, der alpha-Kette, des IL-2-Rezeptors und Aktin aus RNA von gereinigten T-Zellen aus Blut an verschiedenen Zeitpunkten der PHA-Aktivierung, im E-rosetting negativen Blutzellen (B-Zellen und Monocyten), in vitro gezüchteten unreifen Dendritischen Zellen, 293-Zellen, und mit Volllängen-BAFF steril transfizierten 293-Zellen (293-BAFF). Kontroll-Amplifikationen wurden in der Abwesenheit zugegebener cDNA durchgeführt. Die alpha-Kette des IL-2-Rezeptors wurde als Macker der T-Zell-Aktivierung amplifiziert.
4 zeigt die Bindung von BAFF an reife B-Zellen. (A) Bindung von löslichem BAFF an BJAB- und Jurkat-Zelllinien und an gereinigte CD19⁺-Zellen aus Nabelschnurblut. Die Zellen wurden mit der angegebenen Menge (in ng/50 μl) Flag-BAFF angefärbt und mit Durchflußcytometrie analysiert. (B) Bindung von löslichem BAFF an PBLs. PBLs wurden mit Anti-CD8-FITC oder mit Anti-CD19-FITC (horizontale Achse) und mit Flag-BAFF plus M2-Biotin und Avidin-PE (vertikale Achse) gefärbt. Flag-BAFF wurden in den Kontrollen nicht verwendet.
5 zeigt die Kostimulierung der B-Zell-Proliferation durch BAFF. (A) Oberflächenexpression von BAFF in stabil transfizierten 293-Zellen. 293-BAFF- und 293-Wildtyp-Zellen wurden mit Anti-BAFF mAb 43.9 gefärbt und mit Durchflußcytometrie analysiert. (B) Kostimulierung von PBLs durch 293-BAFF-Zellen. PBLs (10⁵/well) wurden mit 15.000 Glutar aldehyd-fixierten 293-Zellen (293-WT oder 293-BAFF) in Anwesenheit oder Abwesenheit eines Anti-B-Zell-Rezeptor-Antikörpers (Anti-μ) inkubiert. Fixierte 293-Zellen alleine bauten 100 cpm ein. (C) Dosis-abhängige Kostimulierung der PBL-Proliferation durch löslichen BAFF in der Anwesenheit von Anti-μ. Die Proliferation wurde nach 72 h Inkubation durch den [³H]-Thymidin-Einbau bestimmt. Die Kontrollen schließen mit BAFF alleine, mit Hitze-denaturiertem BAFF oder mit einem irrelevanten Antikörper gleichen Isotyps anstelle von Anti-μ behandelte Zellen ein. (D) Vergleich der (ko)stimulatorischen Wirkungen von sCD40L und sBAFF auf die PBL-Proliferation. Der Versuch wurde wie in Abschnitt C beschrieben durchgeführt. (E) BAFF kostimuliert die Ig-Sekretion voraktivierter humaner B-Zellen. Gereinigte CD19⁺-B-Zellen wurden durch Züchtung zusammen mit EL-4 T-Zellen und aktivierten T-Zell-Überständen für 5 – 6 d aktiviert, danach reisoliert und für weitere 7 Tage in Anwesenheit von Medium alleine (-) oder von Medium, das 5% aktivierte T-Zell Überstände enthielt (T-SUP) oder einem Gemisch von Cytokinen (IL-2, IL-4, IL-10) gezüchtet. Die Balken stellen die Mittelwerte der Ig-Konzentrationen von Kulturen mit oder ohne 1 μg/ml BAFF dar. Mittelwerte ± SA ausgedrückt als "-fache Zunahme" betrugen 1.23 ± 0.11 für Medium alleine, 2.06 ± 0.18 mit T-Zell Überständen (4 Versuche) und 1.45 ± 0.06 mit I1-2, IL-4 und IL-10 (2 Versuche). Diese wurden mit peripherem Blut (3 Versuche) oder B-Zellen aus Nabelschnurblut (ein Versuch; 2.3fache Zunahme mit T-Zell Überständen, 1.5fache Zunahme mit IL-2, IL-4 und IL-10) durchgeführt. (F) Dosis-Antwort-Kurve für die Wirkung von BAFF in Kulturen mit T-Zell-Überständen, wie in Abschnitt D gezeigt. Mittelwerte ± SA aus 3 Versuchen.
6 zeigt, daß BAFF als Kofaktor für die B-Zell-Proliferation wirkt. Die Proliferation humaner PBL wurde alleine (500 cpm), in Anwesenheit des Liganden BAFF alleine, in Anwesenheit von Ziegen-Anti-Maus (mu) alleine, und mit dem Liganden BAFF und Anti-mu zusammen gemessen. Die Kombination von Anti-mu und BAFF zusammen erhöhte die Proliferation der PBL mit der Zunahme der Konzentration von BAFF signifikant, was auf Kofaktor-Eigenschaften von BAFF hinweist.
7 zeigt die erhöhte Anzahl von B-Zellen in BAFF-Tg Mäusen.
(A) Anzahl von Lymphocyten in BAFF-Tg Mäusen. Das Diagramm vergleicht 12 Kontroll-Wurfgeschwister (linke Seite) mit 12 BAFF-Tg Mäusen (rechte Seite). Die Lymphocytenzahlen sind als Kreise und Granulocyten (einschließlich Neutrophile, Eosinophile, Basophile) als Rauten gezeigt.
(B) Erhöhter Anteil von B-Zellen in PBL von BAFF-Tg Mäusen. PBL wurden mit Anti-B220-FITC und Anti-CD4-PE zur FACS-Analyse angefärbt und unter Verwendung klein- und großwinkliger Ablenkung (forward side scatter) auf lebende Zellen beschränkt. Die Prozentsätze von CD4- und B220-positiven Zellen sind angegeben. Eine Kontrollmaus (links) und zwei BAFF-Tg Mäuse (rechts) sind gezeigt, und die Ergebnisse waren repräsentativ für 7 in jeder Gruppe analysierte Tiere.
(C) FACS-Analyse des Verhältnisses von B- zu T-Zellen in PBL. Der Unterschied zwischen Kontrolltieren und BAFF-Tg Mäusen in (A) und (C) war statistisch signifikant (P<0.001).
(D) Erhöhte MHC Klasse II-Expression auf B-Zellen aus PBL von BAFF-Tg Mäusen. Die Expression von MHC Klasse II wurde mit FACS analysiert.
(E) Erhöhte Bcl-2 Expression in B-Zellen aus PBL von BAFF-Tg Mäusen.
Die Bcl-2 Expression wurde durch intracytoplasmatische Färbung gemessen und die Zellen wurden mit FACS analysiert.
Sowohl in (D) als auch in (E) wurden lebende Zellen auf klein- und großwinklige Ablenkung beschränkt. Vier Kontroll-Wurfgeschwister (weiße Balken) und 4 BAFF-Tg Mäuse sind gezeigt und sind repräsentativ für mindestens 12 in jeder Gruppe analysierte Tiere. MFI: Mittelwert der Fluoreszenz-Intensität. Der Unterschied zwischen Kontrolltieren und BAFF-Tg Mäusen war statistisch signifikant (P<0.005).
(F) Erhöhte Expression von Effektor-T-Zellen in BAFF-Tg Mäusen. PBL wurden mit Anti-CD4-CyChrome, Anti-CD44-FITC und Anti-L-Selektin-PE gefärbt. Gezeigt sind CD4⁺-beschränkte Zellen. Prozentsätze von CD44^hi/L-Selectin^lo-Zellen sind angegeben. Eine Kontroll-Maus (links) und zwei BAFF-Tg Mäuse (rechts) sind gezeigt und die Ergebnisse waren repräsentativ für 8 in jeder Gruppe analysierte Tiere.
8 zeigt vergrößerte B-Zell-Kompartimente in der Milz, aber nicht im Knochenmark von BAFF-Tg Mäusen.
(A) FACS-Anfärbung für reife B-Zellen unter Verwendung von Anti-IgM-FITC und Anti-B220-PE in Milz (obere Reihe), Knochenmark (mittlere Reihe) und MLN (unter Reihe). Prozentsätze von reifen B220+/IgM+ B-Zellen sind angegeben.
(B) FACS-Anfärbung von Prä-B-Zellen (B220+/CD43–) und Pro-B-Zellen (B220+/CD43+) im Knochenmark unter gleichzeitiger Verwendung von Anti-CD43-FITC, Anti-B220-CyChrome und Anti-IgM-PE. Gezeigt sind die IgM-negative Population beschränkte Zellen. Prozentsätze von Prä-B-Zellen (B220+/CD43–) und Pro-B-Zellen (B220+/CD43+) sind angegeben.
In allen Figuren (A und B) sind eine Kontroll-Maus (links) und zwei BAFF-Tg Mäuse (rechts) gezeigt und die Ergebnisse sind repräsentativ für 7 in jeder Gruppe analysierte Tiere.
9 zeigt erhöhte Ig-, RF- und CIC-Mengen in BAFF-Tg Mäusen (A) SDS-PAGE von zwei Kontrollseren (–) und 4 Seren von BAFF-Tg Mäusen (+) im direkten Vergleich mit der angegebenen Menge von gereinigtem Maus-IgG als Referenz. Die in allen Spuren ähnliche Intensität der Albumin-Bande zeigt an, daß die auf das Gel aufgetragene Materialmenge bei jeder Probe gleich ist.
Analyse auf Basis eines ELISA von gesamtem Maus-Ig (B), -RF (C) und -CIC (D) in den Seren von 19 Kontroll-Wurfgeschwistern (weiße Balken) und 21 BAFF-Tg Mäusen (schwarze Balken). In Abwesenheit einer passenden RF-Kontrolle wird der Titer (log₂) für RF als die Verdünnung der Seren definiert, die eine 3-mal höhere OD als die des Hintergrunds ergibt.
Die Menge an CIC ist definiert als die Menge an PAP, die erforderlich ist, um eine zu der mit dem getesteten Serum vergleichbare OD zu erzeugen. Der Unterschied zwischen Kontrolltieren und BAFF-Tg Mäusen war statistisch signifikant (P<0.001 in (B) und (C), P<0.003 in (D)).
10 zeigt die Anwesenheit von Anti-ssDNA- und Anti-dsDNA-Autoantikörpern in einigen BAFF-Tg Mäusen.
(A) ELISA-Analyse von Anti-ssDNA-Autoantikörpern in 19 Kontroll-Wurfgeschwistern (graue Balken) und 21 BAFF-Tg Mäusen (schwarze Balken).
(B) ELISA-Analyse von Anti-ssDNA-Autoantikörpern in 5 Kontroll-Wurfgeschwistern und den 5 Tieren aus (A), die Anti-ssDNA-Autoantikörper aufweisen.
(C) Paraffinschnitte aus den Nieren einer Kontroll-Maus (links) und einer BAFF-Tg Maus (rechts), angefärbt mit Ziegen-Anti-Maus-Ig-HRP. Die Ig-Ablagerung zeigt sich als braune Färbung. Diese Bilder sind repräsentativ für 6 analysierte BAFF-Tg Mäuse.
11 zeigt vergrößerte Peyersche Plaques in BAFF-Tg Mäusen.
Fotographie von Peyerschen Plaques (mit einem Pfeil gekennzeichnet) auf dem Dünndarm einer Kontroll-Maus (links) und einer BAFF-Tg Maus (rechts). Dieses Bild ist repräsentativ für mindestens 12 in jeder Gruppe getöteten Mäuse. 5-fache Vergrößerung.
12 zeigt gestörte T- und B-Zell-Organisation, intensive Keimzentrumsreaktionen, eine verringerte Anzahl Dendritischer Zellen und eine erhöhte Anzahl von Plasmazellen in der Milz von BAFF-Tg Mäusen.
Eine Kontroll-Maus ist in A, C, E und G und eine BAFF-Tg in B, D, F und H gezeigt. B-Zellen sind blau und T-Zellen braun (A und B). Keimzentren sind mit einem Pfeil gezeigt (C und D): Nur wenige restliche Keimzentren sind in den Kontroll-Mäusen zu sehen (C). CD11c-positive Dendritische Zellen sind braun und erscheinen in der T-Zell-Zone, den verbrückenden Kanälen und dem Randbereich (E). Sehr wenige sind in BAFF-Tg Mäusen vorhanden (F). Syndecan-1-positive Plasmazellen waren nur in der roten Pulpa von BAFF-Tg Mäusen (H), nicht aber von Kontroll-Mäusen (G) zu entdecken.
Diese Bilder sind repräsentativ für mindestens 12 analysierte BAFF-Tg Mäuse und 12 Kontroll-Mäuse. Die Vergrößerung für alle Bilder ist 100-fach, ausgenommen C und D, die 50-fach vergrößert sind.
B: B-Zell-Follikel, T: PALS, WP: weiße Pulpa, RP: rote Pulpa.
13 zeigt gestörte T- und B-Zell-Organisation, intensive Keimzentrumsreaktionen und eine große Anzahl von Plasmazellen in den MLN von BAFF-Tg Mäusen.
Die Kontroll-Maus ist in A, C, E und G und eine BAFF-Tg in B, D, F und H gezeigt. Die Immunhistochemie wurde wie in 12 beschrieben durchgeführt. T- und B-Zell-Färbung ist in A und B gezeigt, Keimzentren in C und D, Dendritische Zellen in E und F und Plasmazellen in G und H. GC: Keimzentrum. 100-fache Vergrößerung.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es wird nun genauer Bezug auf die vorliegenden bevorzugten Ausführungsformen der Endung genommen. Diese Erfindung betrifft die Verwendung von BAFF und BAFF-verwandten Molekülen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Beeinflußung des Wachstums und der Reifung von B-Zellen und der Sekretion von Immunglobulin. Die Erfindung betrifft die Verwendung von BAFF und BAFF-verwandten Molekülen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Beeinflußung von Antworten des Immunsystems, wie bei Immunkrankheiten erforderlich. Darüberhinaus schließt die Erfindung die Verwendung von BAFF und BAFF-verwandten Genen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs und Immunkrankheiten auch durch gentherapeutische Maßnahmen ein.
Der Ligand BAFF und Homologe davon, die von Wirtszellen produziert werden, die mit den erfindungsgemäßen Sequenzen transformiert wurden, wie auch durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren gereinigter, nativer BAFF, oder aus bekannten Aminosäuresequenzen produzierter, sind in einer Vielzahl von Verfahren für Antikrebs-, Antitumor- und immunregulatorische Anwendungen verwendbar. Sie sind ebenfalls in Therapie und Verfahren, die auf andere Erkrankungen gerichtet sind, verwendbar.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung des Polypeptids, das von der Nukleinsäure kodiert wird, die den Liganden BAFF kodiert, zur Herstellung eines Arzneimittels für "Antisense"-Therapie. Wie hier verwendet, bezieht sich "Antisense"-Therapie auf die Verabreichung oder die in situ Erzeugung von Oligonukleotiden oder ihrer Derivate, die unter zellulären Bedingungen mit der zellulären mRNA und/oder DNA, die den Liganden von Interesse kodieren, hybridisieren, um so die Expression des kodierten Proteins zu hemmen, d.h. durch Hemmung der Transkription und/oder der Translation. Die Bindung kann durch konventionelle Basenpaar-Komplementarität erfolgen, oder, zum Beispiel, im Fall der Bindung an DNA-Doppelstränge, durch spezifische Wechselwirkungen in der großen Furche der Doppelhelix. Im Allgemeinen bezieht sich "Antisense"-Therapie auf eine Anzahl von üblicherweise auf dem Fachgebiet verwendeten Verfahren, und schließt jede Therapie ein, die auf der spezifischen Bindung an Oligonukleotidsequenzen beruht.
Ein Antisense-Konstrukt der vorliegenden Erfindung kann, zum Beispiel, als Expressionsplasmid bereitgestellt werden, das, wenn es in der Zelle transkribiert wird, RNA produziert, die zu mindestens einem Teil der zellulären mRNA, die den Kay-Ligand kodiert, komplementär ist. In einer Alternative kann das Antisense-Konstrukt eine Oligonukleotidsonde sein, die ex vivo erzeugt wird. Diese Oligonukleotidsonden sind bevorzugt modifizierte Oligonukleotide, die den endogenen Nukleasen widerstehen, und sind daher in vivo stabil. Beispiele von Nukleinsäuremolekülen zur Verwendung als Antisense-Oligonukleotide sind Phosphoramidate, Phosphothioat- und Methylphosphonat-Analoga von DNA (siehe z.B. U.S.-Patent 5,176,996; U.S.-Patent 5,264,564; und U.S.-Patent 5,256,775). Darüberhinaus wird ein Überblick über allgemeine Verfahren zur Konstruktion von in der Antisense-Therapie verwendbaren Oligomeren gegeben von, zum Beispiel, Van der Krol et al., Biotechniques 6 (1988), 958 – 976; und Stein et al., Cancer Res 48 (1988), 2659 – 2668.
DER LIGAND BAFF
Der erfindungsgemäße Ligand BAFF ist, wie oben erörtert, ein Mitglied der TNF-Familie und wird beschrieben in der PCT-Anmeldung Nummer PCT/US98/19037 (WO99/12964). Das Protein, Fragmente oder Homologe davon können vielfältige therapeutische und diagnostische Anwendungen haben.
Der Ligand BAFF ist hauptsächlich in der Milz und in peripehren Blut-Lymphocyten vorhanden, was stark auf eine regulatorische Rolle im Immunsystem hindeutet. Der Vergleich der beanspruchten Sequenzen des Liganden BAFF mit anderen Mitgliedern der humanen TNF-Familie ergibt eine beträchtliche strukturelle Ähnlichkeit. Allen diesen Proteinen sind einige Regionen konservierter Sequenzen in der extrazellulären Domäne gemeinsam.
Obwohl die genaue dreidimensionale Struktur des beanspruchten Liganden nicht bekannt ist, wird vorhergesagt, daß er als ein Mitglied der TNF-Familie bestimmte strukturelle Eigenschaften mit den anderen Mitgliedern der Familie gemeinsam hat.
Die neuen erfindungsgemäßen Polypeptide wechselwirken spezifisch mit einem bislang noch nicht identifizierten Rezeptor. Die hier offenbarten Peptide und Verfahren ermöglichen jedoch die Identifizierung von Rezeptoren, die spezifisch mit dem Ligand BAFF oder Fragmenten davon wechselwirken.
Die beanspruchte Erfindung schließt in bestimmten Ausführungsformen die Verwendung von aus dem Liganden BAFF abgeleiteten Peptide ein, die in der Lage sind, an ihre Rezeptoren zu binden. Fragmente von BAFF können auf mehrere Arten produziert werden, z.B. rekombinant, durch PCR, proteolytischen Verdau oder durch chemische Synthese. Interne oder terminale Fragmente eines Polypeptids können durch Entfernen eines oder mehrerer Nukleotide von einem Ende oder beiden Enden einer Nukleinsäure, die das Polypeptid kodiert, erzeugt werden. Die Expression der mutagenisierten DNA produziert die Polypeptid-Fragmente.
Polypeptid-Fragmente können unter Verwendung auf dem Fachgebiet bekannter Techniken, wie etwa der herkömmlichen Merrifield Festphasen f-moc oder t-boc Chemie, auch chemisch synthetisiert werden. Zum Beispiel können Peptide und DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung willkürlich in Fragmente von gewünschter Länge ohne Überschneidungen des Fragments geteilt werden, oder in sich überschneidende Fragmente einer gewünschten Länge geteilt werden. Solche Verfahren sind unten genauer beschrieben.
Erzeugung löslicher Formen des Liganden BAFF
Lösliche Formen des BAFF-Liganden können häufig wirksam Signale vermitteln und können daher als Arzneimittel verabreicht werden, das in diesem Fall die natürliche Membranform nachahmt. Es ist möglich, daß der hier beanspruchte Ligand BAFF natürlicherweise als lösliches Cytokin sekretiert wird, wenn aber nicht, kann man das Gen umkonstruieren, um die Sekretion zu erzwingen. Um eine lösliche sekretierte Form von BAFF zu erzeugen, würde man die N-terminalen Transmembranregionen und einen bestimmten Teil der Stielregion auf der Ebene der DNA entfernen, und diese durch eine Typ I-Leader- oder alternativ eine Typ II-Leadersequenz ersetzen, die eine wirksame proteolytische Spaltung in dem gewählten Expressionssystem erlaubt. Ein Fachmann könnte die in dem sekretierten Expressionskonstrukt beibehaltene Größe der Stielregion variieren, um sowohl die Rezeptorbindungseigenschaften als auch die Sekretionseffizienz zu optimieren. Zum Beispiel könnten die Konstrukte, die alle möglichen Stiellängen, d.h. N-terminale Verkürzungen, enthalten, so hergestellt werden, daß Proteine, die mit den Aminosäuren 81 bis 139 beginnen, entstehen würden. Die optimale Länge der Stielsequenz würde aus dieser Art von Analyse hervorgehen.
Erzeugung von Antikörpern, die mit dem Ligand BAFF reagieren
Die Erfindung schließt auch spezifisch mit dem beanspruchten Ligand BAFF oder seinen Rezeptoren reagierende Antikörper ein. Anti-Protein/Anti-Peptid-Antiseren oder monoklonale Antikörper können durch Standardverfahren hergestellt werden (Siehe, zum Beispiel, Harlow and Lane (Hrsg.) (1988), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press). Ein Säugetier, wie etwa eine Maus, ein Hamster oder Kaninchen, kann mit einer immunogenen Form des Peptids immunisiert werden. Verfahren, Immunogenität auf ein Protein oder Peptid zu übertragen, schließen die Bindung an Träger oder andere, auf dem Fachgebiet wohlbekannte Verfahren ein.
Ein immunogener Anteil von BAFF oder seinen Rezeptoren kann in Gegenwart eines Adjuvans verabreicht werden. Der Fortschritt der Immunisierung kann durch die Bestimmung von Antikörpertitern im Plasma oder Serum verfolgt werden. Standard-ELISA oder andere Immuntests können mit dem Immunogen als Antigen zur Bestimmung der Antikörper-Mengen verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die betreffenden Antikörper immunspezifisch für antigene Determinanten von BAFF oder seinen Rezeptoren (z.B. antigene Determinanten eines Polypeptids von SEQ.ID.NR.: 2, die Sequenz wie beschrieben in PCT-Anmeldung Nummer PCT/US98/19037 (WO99/12964) und ist hiermit in ihrer Vollständigkeit eingeschlossen), oder für ein eng verwandtes humanes oder nicht humanes Homolog (z.B. 70, 80 oder 90 Prozent homolog, stärker bevorzugt mindestens 95 Prozent homolog). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kreuzreagieren (d.h. reagieren spezifisch) die Anti-BAFF- oder Anti-BAFF-Rezeptor-Antikörper nicht wesentlich mit einem Protein, das z.B. weniger als 80 Prozent homolog ist zu SEQ.ID.NR.: 2 oder 6, die Sequenz wie beschrieben in PCT-Anmeldung Nummer PCT/US98/19037 (WO99/12964); bevorzugt weniger als 90 Prozent homolog mit SEQ.ID.NR.: 2, die Sequenz wie beschrieben in PCT-Anmeldung Nummer PCT/US98/19037 (WO99/12964); und am stärksten bevorzugt weniger als 95 Prozent homolog mit SEQ.ID.NR.: 2, die Sequenz wie beschrieben in PCT-Anmeldung Nummer PCT/US98/19037 (WO99/12964). Mit "nicht wesentlich kreuzreagieren" ist gemeint, daß der Antikörper eine Bindungsaffinität für ein nicht homologes Protein hat, die weniger als 10 Prozent, stärker bevorzugt weniger als 5 Prozent, und noch stärker bevorzugt weniger als 1 Prozent der Bindungsaffinität für ein Protein der SEQ.ID.NR.: 2, die Sequenz wie beschrieben in PCT-Anmeldung Nummer PCT/US98/19037 (WO99/12964), beträgt.
Der Begriff Antikörper, wie hier verwendet, soll Fragmente davon einschließen, die ebenfalls spezifisch mit BAFF oder seinen Rezeptoren reagieren. Antikörper können unter Verwendung herkömmlicher Verfahren fragmentiert werden, und die Fragmente können auf die gleiche Weise wie oben für vollständige Antikörper beschrieben auf Verwendbarkeit abgesucht werden. Zum Beispiel können F(ab')₂-Fragmente durch Behandlung des Antikörpers mit Pepsin erzeugt werden. Das entstehende F(ab')₂-Fragment kann zur Reduktion von Disulfidbrücken behandelt werden, um Fab'-Fragmente zu produzieren. Die Antikörper der vorliegenden Erfindung sollen weiterhin biospezifische und chimäre Moleküle einschließen, die Anti-BAFF- oder Anti-BAFF-Rezeptor-Aktivität haben. Daher können sowohl gegen BAFF, Tumor-Ligand und ihre Rezeptoren gerichtete monoklonale und polyklonale Antikörper (Ak), als auch Antikörperfragmente wie etwa Fab' und F(ab')₂ verwendet werden, um die Wirkung des Liganden und der jeweiligen Rezeptoren zu hemmen.
Verschiedene Formen von Antikörpern können ebenfalls unter Verwendung von Standardverfahren rekombinanter DNA hergestellt werden. Winter and Milstein, Nature 349 (1991), 293 – 299. Zum Beispiel können chimäre Antikörper konstruiert werden, in denen die Antigen-bindende Domäne aus einem tierischen Antikörper mit einer humanen konstanten Domäne verbunden ist (z.B. Cabilly et al., U.S.-Patent 4,816,567). Chimäre Antikörper können die beobachteten immunogenen Antworten verringern, die durch tierische Antikörper bei der klinischen Behandlung von Menschen hervorgerufen werden.
Darüberhinaus können rekombinante "humanisierte Antikörper" synthetisiert werden, die BAFF oder seinen Rezeptor erkennen. Humanisierte Antikörper sind Chimären, die meist humane IgG-Sequenzen enthalten, in die die für die spezifische Antigenbindung verantwortlichen Regionen eingesetzt wurden. Tiere werden mit dem gewünschten Antigen immunisiert, die entsprechenden Antikörper werden isoliert, und der für die spezifische Antigenbindung verantwortliche Teil der Sequenzen der variablen Region wird entfernt. Die aus dem Tier gewonnenen Antigen-bindenden Regionen werden dann in die entsprechende Position der humanen Antikörpergene kloniert, aus denen die Antigen-bindenden Regionen entfernt wurden. Humanisierte Antikörper minimieren die Verwendung heterologer (d.h. inter-Spezies) Sequenzen in humanen Antikörpern, und rufen daher mit geringerer Wahrscheinlichkeit eine Immunantwort in der behandelten Person hervor.
Die Konstruktion verschiedener Klassen rekombinanter Antikörper kann ebenfalls durch die Herstellung chimärer oder humanisierter Antikörper erreicht werden, die variable Domänen und aus verschiedenen Immunglobulinklassen isolierte humane konstante Domänen (CH1, CH2, CH3) enthalten. Zum Beispiel können Antikörper mit erhöhten Valenzen der Antigenbindungsstelle durch die Klonierung der Antigenbindungsstelle in Vektoren, die konstante Regionen der humanen Kette tragen, rekombinant hergestellt werden. Arulanandam et al., J. Exp. Med. 177 (1993), 1439 – 1450.
Darüberhinaus können Standardverfahren rekombinanter DNA verwendet werden, um die Bindungsaffinitäten rekombinanter Antikörper zu ihren Antigenen durch die Veränderung der Aminosäurereste in der Nachbarschaft der Antigenbindungsstellen zu verändern. Die Antigenbindungsaffinität eines humanisierten Antikörpers kann durch Mutagenisierung auf der Grundlage von molekularem Modelling erhöht werden. Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86 (1989), 10029–33.
Erzeugung von Analoga
Herstellung geänderter DNA- und Peptidsequenzen
Analoga von BAFF können sich von dem natürlich vorkommenden BAFF in der Aminosäuresequenz oder in einer Weise, die nicht die Sequenz betrifft, oder in beidem unterscheiden. Nicht-Sequenz Modifikationen schließen die chemische Derivatisierung von BAFF in vivo oder in vitro ein. Nicht-Sequenz Modifikationen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf: Veränderungen in Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung, Carboxylierung oder Glykosylierung.
Bevorzugte Analoga schließen biologisch aktive Fragmente von BAFF ein, deren Sequenz sich von der in SEQ.ID Nr. 2 angegebenen Sequenz, die Sequenz wie beschrieben in PCT-Anmeldung Nummer PCT/US98/19037 (WO99/12964), in einem oder mehreren konservativen Aminosäureaustauschen; oder in einem oder mehreren nicht konservativen Aminosäure-austauschen, Deletionen oder Insertionen unterscheidet, die nicht die Aktivität von BAFF aufheben. Konservative Austausche schließen typischerweise den Ersatz einer Aminosäure durch eine andere. mit ähnlichen Eigenschaften ein, z.B. Austausche innerhalb der folgenden Gruppen: Valin, Glycin; Glycin, Alanin; Valin, Isoleucin, Leucin; Aspartat, Glutamat; Asparagin, Glutamin; Serin, Threonin; Lysin, Arginin; und Phenylalanin, Tyrosin.
Material und Methoden der Erfindung
Der monoklonale Anti-Flag-M2-Antikörper, biotinylierter Anti-Flag-M2-Antikörper und der an Agarose gekoppelte Anti-Flag-M2-Antikörper wurden bei Sigma gekauft. Reagentien für die Zellkultur wurden von Life Sciences (Basel, Schweiz) und BioWhittaker (Walkersville, MD) erhalten. Flag-markiertes lösliches humanes APRIL (Reste K110 – L250) wurde wie beschrieben (10, 11) in 293-Zellen produziert. FITC-markierte Anti-CD4-, Anti-CD8- und Anti-CD19-Antikörper wurden bei Pharmingen (San Diego, CA) gekauft. Für das Fc_5μ-Fragment von humanem IgM spezifische Ziegen-F(ab')₂ wurde bei Jackson Immuno-Research (West Grove, PA) gekauft. Sekundäre Antikörper wurden entweder von Pharmingen oder von Jackson ImmunoResearch erhalten, und in den empfohlenen Verdünnungen verwendet.
Humane embryonale Nieren-293T(12)-Zellen und Fibroblastenzelllinien wurden in DMEM mit 10% Hitze-inaktiviertem fötalem Kälberserum (FKS) gehalten. Humane embryonale Nieren-293-Zellen wurden in DMEM-Nährstoffmix F 12 (1:1), supplementiert mit 2% FKS, gehalten. T-Zelllinien, B-Zelllinien und Makrophagen-Zelllinien (Tabelle I) wurden in RPMI, supplementiert mit 10% FKS_; gezüchtet. Molt-4 Zellen wurden in Iscove's Medium, supplementiert mit 10% FKS, gezüchtet. Epitheliale Zelllinien wurden in MEM-alpha Medium mit 10% FKS, 0.5 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, 10 mM Na-Hepes und 1 mM Na-Pyruvat gezüchtet. HUVECs wurden in M199-Medium, supplementiert mit 20% FKS, 100 μg/ml epithelialem Wachstumsfaktor (Collaborative Research, Inotech, Dottikon, Schweiz) und 100 μg/ml Heparin-Natriumsalz (Sigma), gehalten. Alle Medien enthielten Penicillin- und Streptomycin-Antibiotika. Periphere Blut-Leukocyten wurden aus heparinisiertem Blut gesunder erwachsener Freiwilliger durch Ficoll-Paque-(Pharmacia, Uppsala, Schweden) Gradientenzentrifugation isoliert und in RPMI, 10% FKS gezüchtet.
T-Zellen wurden aus nicht-adhärenten PBLs durch Rosetting mit Neuraminidase-behandelten roten Blutzellen aus Schaf erhalten und von rosetting-negativen Zellen (meist B-Zellen und Monocyten) durch Ficoll-Paque-Gradientenzentrifugation getrennt. Gereinigte T-Zellen wurden für 24 h mit Phytohämagglutinin (Sigma) (1 μg/ml) aktiviert, gewaschen und in RPMI, 10% FKS, 20 U/ml IL-2 gezüchtet. CD14⁺-Monocyten wurden durch magnetische Zellsortierung unter Verwendung von Anti-CD14-Antikörpern, Ziegen-Anti-Maus-beschichteten Mikrobeads und einem Minimacs^TM-Gerät (Miltenyi Biotech) gereinigt und in Anwesenheit von GM-CSF (800 U/ml, Leucomax^®, Essex Chemie, Luzern, Schweiz) und IL-4 (20 ng/ml, Lucerna Chem, Luzern, Schweiz) für 5 d gezüchtet, danach mit GM-CSF, IL-4 und TNF (200 U/ml, Bender, Wien, Österreich) für weitere 3 d, um eine CD83⁺, Dendritische Zellen-ähnliche Population zu erhalten. Humane B-Zellen mit >97%-iger Reinheit wurden aus peripherem Blut oder Nabelschnurblut unter Verwendung von Anti-CD19-magnetischen Beads (M450, Dynal, Oslo, Norwegen) wie beschrieben (13) isoliert.
Northern-Blot Analyse
Northern-Blot Analyse wurde unter Verwendung der Human Multiple Tissue Northern Blots I und II (Clontech #7760-1 und #7759-1) durchgeführt. Die Membranen wurden für 2 h bei 60°C in Hybridisierungslösung (50% Formamid, 2.5x Denhardt's, 0.2% SDS, 10 mM EDTA, 2x SSC, 50 mM NaH₂PO₄, pH 6.5, 200 μg/ml Ultraschall-behandelte Lachssperma-DNA) inkubiert. Antisense-RNA-Sonden, die die Nukleotide, die den Aminosäuren 136 – 285 von hBAFF entsprechen, enthalten, wurden Hitze-denaturiert und mit 2x 10⁶ cpm/ml in frischer Hybridisierungslösung zugegeben. Die Membran, wurde für 16 h bei 62°C hybridisiert, einmal in 2x SSC, 0.05% SDS (30 min bei 25°C), einmal in 0.1x SSC, 0.1% SDS (20 min bei 65°C) gewaschen und bei –70°C auf Röntgenfilm exponiert.
Charakterisierung von BAFF-cDNA
Eine Teilsequenz der humanen BAFF-cDNA war in mehreren aus Genbanken aus fötaler Leber und Milz und Ovarialkarzinomen erhaltenen EST-Klonen enthalten (z.B. GenBank Zugangsnummern T87299 und AA166695). Der 5'-Teil der cDNA wurde durch Amplifikation über 5'-RACE-PCR (Marathon-Ready cDNA, Clontech, Palo Alto, CA) mit den Oligonukleotiden AP1 und JT1013 (5'-ACTGTTTCTTCTGGACCCTGAACGGC-3') unter Verwendung der bereitgestellten cDNA-Bank aus einem Pool humaner Leukocyten als Ausgangsmaterial nach Angaben des Herstellers erhalten. Das entstandene PCR-Produkt wurde in PCR-0 blunt (Invitrogen, NV Leek, Niederlande) kloniert und als EcoRI/PstI-Fragment in den pT7T3 Pac-Vektor (Pharmacia), der den EST-Klon T87299 enthielt, subkloniert. Die Volllängen-hBAFF-cDNA wurde daher durch Kombination von 5'- und 3'- Fragmenten unter Verwendung der internen PstI-Stelle von BAFF erhalten. Der Sequenz wurde die GenBank Zugangsnummer AF116456 zugewiesen.
Eine Teilsequenz von 617 by des murinen BAFF war in zwei überlappenden EST-Klonen (AA422749 und AA254047) enthalten. Ein die Nukleotide 158 bis 391 überspannendes PCR-Fragment dieser Sequenz wurde als Sonde zum Absuchen einer cDNA-Bank aus Maus-Milz (Startagen, La Jolla, CA) verwendet.
Expression von rekombinantem BAFF
Volllängen-hBAFF wurde unter Verwendung der Oligos JT1069 (5'-GACAAGCTTGCCACCATGGATGACTCCACA-3') und JT637 (5'-ACTAGTCACAGCAGTTTCAATGC-3') amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde in PCR-0 blunt und als HindIII/EcoRI-Fragment in den Säuger-Expressionsvektor PCR-3 subkloniert. Eine Kurzversion von löslichem BAFF (Aminosäuren Q136 – L285) wurde unter Verwendung der Oligos JT636 (5'-CTGCAGGGTCCAGAAGAAACAG-3') und JT637 amplifiziert. Eine lange Version von löslichem BAFF (AS L83 – L285) wurde aus dem Volllängen-BAFF unter Verwendung der internen PstI-Stelle erhalten. Die löslichen BAFFs wurden als PstI/EcoRI-Fragmente hinter das Hämagglutinin-Signalpeptid und die Flag-Sequenz eines modifizierten PCR-3-Vektors und als PstI/SpeI-Fragmente in einen modifizierten bakteriellen pQE16-Expressionsvektor im Leserahmen mit einer N-terminalen Flag-Sequenz (14) subkloniert. Beide Stränge der Konstrukte wurden sequenziert. Die Einrichtung stabiler 293-Zelllinien, die die kurze lösliche Form oder das Volllängen-BAFF exprimieren und die Expression und die Reinigung des rekombinanten löslichen BAFF aus Bakterien und Säuger-293-Zellen wurde wie beschrieben durchgeführt (14, 15).
Reverse Transkriptase PCR
Aus T-Zellen, B-Zellen, in vitro erzeugten unreifen Dendritischen Zellen, 293-WT- und 293-(Volllängen-) BAFF-Zellen extrahierte Gesamt-RNA wurde unter Verwendung des Ready to Go-Systems (Pharmacia) nach Angaben des Herstellers revers transkribiert. BAFF- und β-Aktin-cDNAs wurden durch Amplifizierung mit Taq DNA-Polymerase (Schritte von jeweils 1 min bei 94°C, 55°C und 72°C für 30 Zyklen) unter Verwendung spezifischer Oligonukleotide: für BAFF, JT1322 5'-GGAGAAGGCAACTCCAGTCAGAAC-3' und JT1323 5'-CAATTCATCCCCAAAGACATGGAC-3'; für die alpha-Kette des IL-2-Rezeptors, JT1368 5'-TCGGAACACAACGAAACAAGTC-3' und JT1369 5'-CTTCTCCTTCACCTGGAAACTGACTG-3'; für β-Aktin, 5'-GGCATCGTGATGGACTCCG-3' und 5'-GCTGGAAGGTGGACAGCGA-3' nachgewiesen.
Gelpermeationschromatographie
293T-Zellen wurden mit der kurzen Form von löslichem BAFF transient transfiziert und in Serum-freiem Optimem Medium für 7 d gezüchtet. Konditionierte Überstände wurden 20-fach konzentriert, mit den internen Standards Katalase und Ovalbumin gemischt, und auf eine Superdex-200 HR 10/30-Säule aufgezogen. Die Proteine wurden mit 0.5 ml/min in PSB eluiert und die Fraktionen (0.25 ml) wurden mit Trichloressigsäure gefällt und unter Verwendung des Anti-Flag-M2-Antikörpers im Western-Blot analysiert. Die Säule wurde mit Standardproteinen kalibriert: Ferritin (440 kDa), Katalase (232 kDa), Aldolase (158 kDa), bovines Serumalbumin (67 kDa), Ovalbumin (43 kDa), Chymotrypsinogen A (25 kDa) und Ribonuklease A (13.7 kDa).
PNGase F Behandlung
Proben wurden in 20 μl 0.5% SDS, 1% 2-Mercaptoethanol für 3 min bei 95°C erhitzt, danach abgekühlt und mit 10% Nonidet P-40 (2 μl), 0.5 M Natriumphosphat, pH 7.5 (2 μl) und Peptid-N-Glykanase F (125 U/μl, 1 μl, oder kein Enzym in den Kontrollen) supplementiert. Die Proben wurden für 3h bei 37°C vor der Analyse durch Western-Blot inkubiert.
EDMAN-Sequenzierung
293T-Zellen wurden mit der langen Form von löslichem BAFF transient transfiziert und in Serum-freiem Optimem Medium für 7 d gezüchtet. Konditionierte Überstände wurden 20-fach konzentriert, mit SDS-PAGE fraktioniert und auf eine Polyvinylidendifluorid-Membran (BioRad Labs, Hercules, CA) wie zuvor beschrieben (16) übertragen, und dann mit einem Gasphasen-Sequenzierer (ABI 120A, Perkin Elmer, Foster City, CA) sequenziert, der an einen mit einer Phenylthiohydantoin C18 2.1 × 250 mm Säule ausgestatteten Analysator (ABI 120A, Perkin Elmer) gekoppelt war. Die Daten wurden unter Verwendung der ABI 610-Software (Perkin Elmer) analysiert.
Antikörper
Polyklonale Antikörper wurden durch die Immunisierung von Kaninchen (Eurogentec, Seraing, Belgien) mit rekombinantem löslichen BAFF erzeugt. Mit dem gleichen Antigen immunisierte Rattenmilz wurde mit x63Ag8.653 Maus-Myelomzellen fusioniert, und die Hybridome wurden nach BAFF-spezifischen IgGs abgesucht. Einer dieser monoklonalen Antikörper, 43.9, ist ein IgG2a, das spezifisch hBAFF erkennt.
Die Zellen wurden in 50 μl FACS-Puffer (PBS, 10% FKS, 0.02% NaN₃) mit 50 ng (oder der angegebenen Menge) Flag-markiertem, kurzem löslichem BAFF für 20 min bei 4°C angefärbt, gefolgt von Anti-Flag-M2 (1 μg) und einem sekundären Antikörper. Der Anti-BAFF mAk 43.9 wurde mit 40 μg/ml verwendet. Für Zweifarben-FACS-Analyse wurden Lymphocyten aus peripherem Blut mit Flag-markiertem löslichem BAFF/lang (2 μg/ml) gefärbt, gefolgt von biotinyliertem Anti-Flag-M2 (1/400) und PE-markiertem Streptavidin (1/100), gefolgt von entweder FITC-markiertem Anti-CD4, Anti-CD8 oder Anti-CD19.
PBL Proliferationstest
Leukocyten aus peripherem Blut wurden in 96-well Platten (10⁵ Zellen well in 100 μl RPMI, supplementiert mit 10% FKS) für 72 h in Anwesenheit oder Abwesenheit von 2 μg/ml Ziegen-Anti-human-μ-Ketten-Antikörper (Sigma) oder Kontroll-F(ab')₂ und mit der angegebenen Konzentration von nativem oder gekochtem löslichem BAFF/lang inkubiert. Die Zellen wurden für weitere 6 h mit [³H]-Thymidin (1μCi/well) pulsmarkiert und geerntet. Der [³H]-Thymidin-Einbau wurde durch Messung der Szintillation in Flüssigkeit bestimmt. In manchen Versuchen wurde das rekombinante lösliche BAFF durch mit Volllängen-BAFF stabil transfizierten 293-Zellen (oder 293-WT-Zellen als Kontrolle) ersetzt, die für 5 min bei 25°C in 1% Paraformaldehyd fixiert worden waren. Der Test wurde wie beschrieben (17) durchgeführt. In weiteren Versuchen wurden CD19+-Zellen mit magnetischen Beads aus PBL isoliert, und die verbleibenden CD 19^–-Zellen wurden vor der Rekonstitution mit CD 19⁺-Zellen bestrahlt (3000 rads). Der Proliferationstest mit sBAFF wurde dann wie oben beschrieben durchgeführt.
B-Zell-Aktivierungstest
Gereinigte B-Zellen wurden in dem EL-4 Kultursystem wie beschrieben (13) aktiviert. Kurz geschildert, wurden 10⁴ B-Zellen; gemischt mit 5 × 10⁴ bestrahlten murinen EL-4 Thymom-Zellen (Klon B5) für 5 – 6 d in 200 μl Medium gezüchtet, das 5% v/v Kulturüberstände von humanen T-Zellen (10⁶/ml) enthielt, die für 48 h mit PHA (1 μg/ml) und PMA (1 ng/ml) aktiviert worden waren. Die B-Zellen wurden dann mit Anti-CD19-Beads reisoliert und für weitere 7 d (5 × 10⁴ Zellen in 200 μl, Duplikat- oder Triplikat-Kulturen in 96-well Platten mit flachem Boden) in Medium alleine oder in Medium, das mit 5% T-Zell-Überständen, oder mit 50 ng/ml IL-2 (freundlicherweise zur Verfügung gestellt vom früheren Glaxo-Institut für Molekulare Biologie, Genf) und jeweils 10 ng/ml IL-4 und IL-10 (Peprotech, London, UK) supplementiert war, in Anwesenheit oder Abwesenheit von sBAFF gezüchtet. Der Anti-Flag-M2-Antikörper wurde in einer Konzentration von 2 μg/ml zugegeben und hatte alleine keine Wirkung. IgM, IgG und IgA in Kulturüberständen wurden durch einen ELISA-Test wie beschrieben (13) quantifiziert.
Humanes BAFF wurde durch Sequenzhomologie als ein mögliches neues Mitglied der TNF-Ligandenfamilie identifiziert, während wir öffentliche Datenbanken mit einer verbesserten Profilsuche (18) absuchten. Eine cDNA, die das vollständige Protein mit 285 Aminosäuren (AS) kodiert, wurde durch die Kombination von EST-Klonen (die die 3'-Region abdecken) mit einem durch PCR amplifizierten Fragment (5'-Region) erhalten. Das Fehlen eines Signalpeptids legte nahe, daß BAFF ein Typ II-Membranprotein war, was typisch für Mitglieder der TNF-Ligandenfamilie ist. Das Protein hat eine vorhergesagte cytoplasmatische Domäne von 46 AS, eine hydrophobe Transmembranregion, und eine extrazelluläre Domäne von 218 AS, die 2 mögliche N-Glykosylierungsstellen enthält (1A). Die Sequenz der extrazellulären Domäne von BAFF zeigt die höchste Homologie zu APRIL (33% Aminosäureidentität, 48% Homologie), wobei die Identität zu anderen Mitgliedern der Familie wie etwa TNF, Fast, Lt-α, TRAIL oder RANKL unter 20% liegt (1B, C). Der aus einer Milz-Genbank isolierte Maus-BAFF cDNA-Klon kodiert ein etwas längeres Protein (309 AS) aufgrund einer Insertion zwischen der Transmembranregion und dem ersten von einigen β-Strängen, die die Rezeptorbindungsdomäne in allen TNF-Ligandenmitgliedern bilden (19). Diese β-Strang-reiche Ektodomäne ist in Maus- und humanem BAFF fast identisch (86% Identität, 93% Homologie), was nahe legt, daß das BAFF-Gen im Lauf der Evolution hoch konserviert wurde (1A).
Obwohl die Mitglieder der TNF-Familie als membranständige Liganden synthetisiert werden, wird die Spaltung in der Stielregion zwischen Transmembran- und Rezeptor bindungsdomäne häufig beobachtet. Zum Beispiel werden TNF oder Fast von Metalloproteinasen leicht von der Zelloberfläche abgespalten (20, 21). Während der Herstellung einiger Formen von rekombinantem BAFF in 293T-Zellen bemerkten wir, daß eine rekombinante lösliche 32 kDa-Form von BAFF (AS 83 – 285, sBAFF/lang), die die vollständige Stielregion und eine N-terminale Flag-Markierung zusätzlich zur Rezeptorbindungsdomäne enthielt, weitgehend zu einem kleineren 18 kDa-Fragment prozessiert wird (2A, B). Die Spaltung erfolgte in der Stielregion, da das Fragment nur mit Antikörpern nachzuweisen war, die gegen die vollständige Rezeptorwechselwirkungsdomäne gerichtet waren, aber nicht von Anti-Flag-Antikörpern (Daten nicht gezeigt). Es wurde auch entdeckt, daß nur N124 (im Stiel lokalisiert), aber nicht N242 (am Beginn des F-β-Faltblatts lokalisiert) glykosyliert war, da das Molekulargewicht des nicht prozessierten sBAFF/lang nach der Entfernung der N-gebundenen Kohlenhydrate mit PNGase F von 32 kDa auf 30 kDa verringert wurde, wohingegen die gespaltene 18 kDa-Form dieser Behandlung widerstand. Tatsächlich zeigte die Analyse der Peptidsequenz des 18 kDa-Fragments, daß die Spaltung zwischen R133 und A134 erfolgte (1A). R133 liegt am Ende einer polybasischen Region, die zwischen Mensch (R-N-K-R) und Maus (R-N-R-R) konserviert ist. Um zu überprüfen, ob die Spaltung nicht nur ein Artefakt der Expression einer löslichen, nicht-natürlichen Form von BAFF war, wurde membrangebundenes Volllängen-BAFF in 293T-Zellen exprimiert (2C). Der vollständige 32 kDa-BAFF und einige Spezies mit höherem Molekulargewicht (die möglicherweise nicht dissoziierten Dimeren und Trimeren entsprechen) waren leicht in Zellextrakten nachzuweisen, aber mehr als 95% des aus dem Überstand gewonnenen BAFF entsprach der 18 kDa-Form, was zeigt, daß BAFF auch prozessiert wurde, wenn er als membrangebundener Ligand synthetisiert wurde.
Ein löslicher BAFF wurde konstruiert (Q136 – L285, sBAFF/kurz), dessen Sequenz 2 AS stromabwärts der Prozessierungsstelle begann (1B). Wie vorhergesagt, wurde die am N-Terminus des rekombinanten Moleküls angefügte Flag-Markierung nicht entfernt (Daten nicht gezeigt), was die Reinigung mit einer Anti-Flag Affinitätssäule erlaubte. Um seine korrekte Faltung zu überprüfen, wurde der gereinigte sBAFF/kurz durch Gelfiltration analysiert, wo das Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 55 kDa eluierte (2D). Der sBAFF/kurz lagert sich korrekt als Homotrimer (3 × 20 kDa) zusammen, in Übereinstimmung mit der Quartärstruktur anderer Mitglieder der TNF-Familie (19). Schließlich wurde unprozessierter sBAFF/lang ohne weiteres in Bakterien, exprimiert, was darauf hinweist, daß der Spaltungsvorgang für eukaryotische Zellen spezifisch war.
Die Northern-Blot Analyse von BAFF zeigte, daß die 2.5 kb mRNA in Milz und PBLs reichlich vorhanden war (3A). Thymus; Herz, Placenta, Dünndarm und Lunge zeigten schwache Expression. Diese eingeschränkte Verteilung legt nahe, daß in Lymphgewebe vorhandene Zellen die Hauptquelle von BAFF waren. Durch PCR-Analyse fanden wir heraus, daß die BAFF-mRNA in T-Zellen und in von Monocyten abgeleiteten Dendritischen Zellen aus peripherem Blut, aber nicht in B-Zellen vorkommt (3B). Selbst naive, nicht stimulierte T-Zellen schienen einige BAFF-mRNA zu exprimieren.
Eine Sequenz-markierte Stelle (sequence tagged site, STS, SHGC-36171), die die humane BAFF-Sequenz beinhaltete, wurde in der Datenbank gefunden. Die Stelle ist auf dem menschlichen Chromosom 13, in einem 9 cM-Intervall zwischen den Markern D13S286 und D13S1315 kartiert. Auf der cytogenetischen Karte entspricht dieses Intervall 13g32 – 34. Von den bekannten Mitgliedern der TNF-Familie wurde nur RANKL (Trance) auf diesem Chromosom lokalisiert (22), wenn auch in einiger Entfernung von BAFF (13g14).
Damit der Ligand eine maximale biologische Wirkungen ausüben kann, war es wahrscheinlich, daß der BAFF-Rezeptor (BAFF-R) entweder auf denselben Zellen oder auf in der Nähe vorhandenen Zellen in Lymphgeweben exprimiert wurde. Unter Verwendung des rekombinanten sBAFF als Mittel zum spezifischen Nachweis der Expression von BAFF-R durch FACS fanden wir tatsächlich hohe Werte der Rezeptor-Expression in verschiedenen B-Zelllinien wie etwa den Burkitt-Lymphomen Raji und BJAB (4A, Tabelle I). Im Gegensatz dazu waren Zelllinien aus T-Zellen, fibroblastischen, epithelialen und endothelialen Ursprungs alle negativ. Eine sehr schwache Färbung wurde mit der Monocytenlinie THP-1 beobachtet, die jedoch auf die Fc-Rezeptorbindung zurückzuführen sein könnte. Die Expression von BAFF-R scheint daher auf B-Zelllinien beschränkt zu sein: Die zwei untersuchten Maus-B-Zelllinien waren mit humanem BAFF als Sonde negativ, obwohl eine schwache Bindung an Maus-Milzzellen beobachtet wurde (Daten nicht gezeigt). Die Anwesenheit von BAFF-R auf B-Zellen wurde durch die Analyse von Lymphocyten aus Nabelschnur- und peripherem Blut bestätigt. Während CD8⁺ und CD4⁺-T-Zellen der BAFF-R fehlt (4B und nicht gezeigte Daten), wurde eine kräftige Anfärbung auf CD19⁺-B-Zellen beobachtet (4A und 4B), was darauf hinweist, daß BAFF-R auf allen B-Zellen aus Blut, einschließlich naiven und Gedächtniszellen, exprimiert wird.
Da BAFF an aus Blut gewonnene B-Zellen band, wurden Versuche durchgeführt, um zu bestimmen, ob der Ligand Wachstum-stimulierende oder -hemmende Signale vermitteln konnte. Periphere Blut-Lymphocyten (PBL) wurden mit Anti-IgM (μ)-Antikörpern zusammen mit fixierten 293-Zellen, die BAFF an der Oberfläche stabil exprimierten, stimuliert (5A). Die Höhe des durch Anti-μ alleine induzierten [³H]-Thymidin-Einbaus war in der Anwesenheit von Kontrollzellen nicht verändert, war aber zweifach erhöht in der Anwesenheit BAFF-transfizierter Zellen (5B). Eine Dosis-abhängige Proliferation von PBL wurde auch erhalten, wenn BAFF-transfizierte Zellen durch gereinigtes sBAFF ersetzt wurden (5C), was darauf hinweist, daß BAFF keine Membran-Verankerung benötigt, um seine Wirkung auszuüben. In dieser Versuchsanordnung erforderte die durch sCD40L induzierte Proliferation Konzentrationen von über 1 μg/ml, war aber weniger von der Anwesenheit von Anti-μ abhängig als die durch BAFF vermittelte (5D). Wenn gereinigte CD19⁺-B-Zellen zusammen mit bestrahlten autologen CD19^–-PBL gezüchtet wurden, wurde die Kostimulation der Proliferation durch BAFF nicht beeinflußt, was zeigt, daß die [³H]-Thymidin-Aufnahme hauptsächlich auf die B-Zell-Proliferation und nicht auf eine direkte Stimulierung eines anderen Zelltyps zurückzuführen war (Daten nicht gezeigt). Die als Antwort auf BAFF beobachtete B-Zell-Proliferation war vollständig von der Anwesenheit von Anti-μ-Antikör pern abhängig, was darauf hinweist, daß BAFF als Kostimulator der B-Zell-Proliferation wirkt.
Um eine mögliche Wirkung von BAFF auf die Immunglobulin-Sekretion zu untersuchen, wurden gereinigte B-Zellen aus peripherem oder Nabelschnurblut durch Züchtung zusammen mit EL-4 T-Zellen in der Anwesenheit eines Cytokin-Gemisches aus Überständen von PHA/PMA-stimulierten T-Zellen voraktiviert (23). Diese B-Zellen wurden mit einer Reinheit von 98% reisoliert und erbrachten einen zweifachen Anstieg der Ig-Sekretion während einer zweiten Züchtung in der Anwesenheit von BAFF und aktivierten T-Zell-Cytokinen im Vergleich zu Cytokinen alleine. Eine sehr geringe Wirkung trat in der Abwesenheit exogener Cytokine auf, und eine dazwischen liegende Wirkung (1.5-fach) wurde in der Anwesenheit der rekombinanten Cytokine IL-2, IL-4 und IL-10 beobachtet (5E, F).
Die biochemische Analyse von BAFF stimmt ebenfalls mit der typischen homotrimeren Struktur der Mitglieder der TNF-Familie überein. Innerhalb dieser Familie von Liganden weist BAFF den höchsten Wert der Sequenzähnlichkeit zu APRIL auf, das wir vor kurzem als Liganden charakterisiert haben, der das Wachstum verschiedener Tumorzellen stimuliert (11). Im Gegensatz zu TNF und LT, die zwei Familienmitglieder mit gleich hoher Homologie (33% Identität) sind und deren Gene auf Chromosom 6 lokalisiert sind, liegen APRIL und BAFF nicht zusammen auf dem selben Chromosom. APRIL ist auf Chromosom 17 lokalisiert (J.L.B., unveröffentlichte Daten), wohingegen BAFF auf dem langen Arm des menschlichen Chromosoms 13 (13q34) kartiert wurde. Anomalien in diesem Genort wurden in Burkitt-Lymphomen als zweithäufigster Defekt (24) nach der Translokation des myc-Gens in den Ig-Genort (25) charakterisiert. Angesichts der hohen Expressionswerte von BAFF-R auf allen untersuchten Burkitt-Lymphom-Zelllinien (siehe Tabelle I) ergibt sich die interessante Möglichkeit, daß einige Burkitt-Lymphome eine deregulierte BAFF-Expression haben könnten und daher das Wachstum auf autokrine Weise stimulieren.
Die Rolle Antigen-spezifischer B-Lymphocyten während der verschiedenen Stadien der Immunantwort ist in hohem Maße von Signalen und Kontakten von T-Helferzellen und Antigen-präsentierenden Zellen, wie etwa Dendritischen Zellen, abhängig (20). B-Lymphocyten empfangen diese Signale zum ersten Mal früh in der Immunantwort, wenn sie am Rand der B-Zell-Follikel im Lymphgewebe mit T-Zellen wechselwirken, was zu ihrer Proliferation und Differenzierung in Zellen, die Antikörper niedriger Spezifität bilden, führt (18). Zum gleichen Zeitpunkt wandern einige Antigen-spezifische B-Zellen in den B-Zell-Follikel und tragen zur Bildung der Keimzentren bei, einem anderen Ort der B-Zell-Proliferation, aber auch der Affinitätsreifung und der Erzeugung von B-Gedächtniszellen und hochaffinen Plasmazellen (19).
Es wurde gezeigt, daß die von einem anderen Mitglied der TNF-Superfamilie, CD40L, erzeugten Signale entscheidend für die Funktion von B-Lymphocyten auf mehreren Stufen der T-Zell-abhängigen Immunantwort sind. Einige Untersuchungen zeigen hingegen deutlich, daß die CD40L/CD40-Wechselwirkung nicht für die gesamte Kontakt-abhängige T-Zell-Hilfe für B-Zellen verantwortlich ist. Tatsächlich ist gezeigt worden, daß CD40L-defiziente T- Zellen, die entweder aus Knock-out-Mäusen oder Patienten mit X-linked Hyper-IgM-Syndrom isoliert wurden, erfolgreich die Proliferation von B-Zellen und ihre Differenzierung in Plasmazellen induzieren können. Untersuchungen mit hemmenden Antikörpern gegen CD40L zeigten, daß eine Untergruppe von aus humanen Mandeln isolierten Oberflächen-IgD-positiven B-Zellen als Antwort auf aktivierte T-Zellen in einer CD40-unabhängigen Weise proliferieren und differenzieren. Auch von anderen Mitgliedern der TNF-Familie, wie etwa Membran-gebundenem TNF und CD30L, ist gezeigt worden, daß sie an einer CD40- und Oberflächen-Ig-unabhängigen Stimulierung von B-Zellen beteiligt sind. Es ist in ähnlicher Weise zu unseren Resultaten mit BAFF gezeigt worden, daß CD40-defiziente B-Zellen zur Proliferation und Differenzierung in Plasmazellen durch T-Helferzellen stimuliert werden können, so lange die Oberflächen-Ig-Rezeptoren zur selben Zeit ausgelöst werden. BAFF wird, wie auch CD30L und CD40L, von T-Zellen exprimiert, doch seine Eigenart besteht in seiner Expression durch Dendritische Zellen wie auch der hoch spezifischen Lokalisierung seines Rezeptors auf B-Zellen, die im Gegensatz zu CD40, CD30 und dem TNF-Rezeptor steht, deren Expression auf vielen verschiedenen Zellen beschrieben wurde. Diese Beobachtung legt unabhängige und spezifische BAFF-induzierte Funktionen auf B-Zellen nahe.
Als Bestätigung einer Rolle für BAFF in durch T-Zellen und Dendritischen Zellen induziertem B-Zell-Wachstum und potenzieller Reifung fanden wir heraus, daß BAFF die Proliferation von B-Zellen aus Blut in Begleitung der Kreuzvernetzung der B-Zell-Rezeptoren und daher unabhängig vom CD40-Signalweg kostimuliert. Bei Verwendung CD19-positiver B-Zellen, die in vitro in Prä-Plasmazellen/GC-ähnliche B-Zellen differenziert wurden (14) beobachteten wir darüberhinaus eine kostimulatorische Wirkung von BAFF auf die Ig-Sekretion dieser B-Zellen in Anwesenheit eines Überstands von aktivierten T-Zellen oder eines Gemisches von IL-2, IL-4 und IL-10. Interessanterweise war die kostimulatorische Wirkung in Anwesenheit der aktivierten T-Zell-Überstände im Vergleich zu dem Cytokin-Gemisch stärker, was zusätzliche, von aktivierten, an der Antikörperproduktion beteiligten T-Zellen sekretierte lösliche Faktoren nahe legt, die mit BAFF zusammenwirken können, öder zusätzlicher BAFF selbst. Es ist daher wahrscheinlich, daß BAFF aktiv zur Differenzierung dieser GC-ähnlichen B-Zellen in Plasmazellen beiträgt.
Es ist klar, daß BAFF in vitro sowohl in naiven B-Zellen als auch in GC-lokalisierten B-Zellen signalisieren kann. Ob diese Beobachtung eine Bedeutung in einer normalen Immunantwort hat oder nicht, muß durch geeignete in vivo-Experimente gezeigt werden.
Die durch BAFF in B-Zellen induzierten biologischen Antworten unterscheiden sich von denen von CD40L, da die durch CD40L ausgelöste Proliferation weniger von einem Anti-μ-Kostimulus abhängig war (17) (und 5D). Darüberhinaus kann CD40L apoptotischen Signalen in B-Zellen in der Folge der Aktivierung des B-Zellrezeptors entgegenwirken (29), wohingegen BAFF nicht in der Lage war, die B-Zelllinie Ramos vor Anti-μ-vermittelter Apoptose zu retten, trotz der Tatsache, daß Ramos-Zellen BAFF-R exprimieren (Tabelle I; F.M. und J.L.B., unveröffentlichte Beobachtungen). Es ist daher wahrscheinlich, daß CD40L und BAFF unterschiedliche Funktionen erfüllen. In diesem Zusammenhang ist es erwähnenswert, daß BAFF mit keinem von 16 untersuchten, rekombinanten Rezeptoren der TNF-Familie, einschließlich CD40, wechselwirkte (P.S. und J.T., unveröffentlichte Beobachtungen).
Das B-Zell-Wachstum wurde effizient von rekombinantem löslichen BAFF ohne Transmembrandomäne kostimuliert. Diese Aktivität steht im Gegensatz zu einigen Mitgliedern der TNF-Familie, die nur als Membran-gebundener Ligand aktiv sind, wie etwa TRAIL, Fast und CD40L. Lösliche Formen dieser Liganden haben geringe biologische Aktivität, die durch ihre Kreuzvernetzung verstärkt werden kann, wodurch der Membran-gebundene Ligand nachgeahmt wird (15). Im Gegensatz dazu verstärkte die Kreuzvernetzung von Flag-markiertem sBAFF mit Anti-Flag-Antikörpern oder die Verwendung von Membran-gebundenem, auf der Oberfläche epithelialer Zellen exprimiertem BAFF die mitogene Aktivität von BAFF nicht weiter, was nahe legt, daß er wie TNF systemisch als sekretiertes Cytokin wirken kann. Dies steht in Übereinstimmung mit der Beobachtung, daß eine im Stiel von BAFF vorhandene, polybasische Sequenz als Substrat für eine Protease wirkt. Ähnliche polybasische Sequenzen sind auch an entsprechenden Stellen in APRIL und TWEAK vorhanden, und für beide gibt es Anhaltspunkte für proteolytische Prozessierung (30) (N.H. und J.T., unveröffentlichte Beobachtungen). Obwohl die für die Spaltung verantwortliche Protease noch bestimmt werden muß, ist es unwahrscheinlich, daß es die für die Abspaltung von Membran-gebundenem TNF verantwortliche Metalloproteinase ist, da sich ihre Sequenzspezifitäten vollständig unterscheiden (21). Die multibasischen Motive in BAFF (R-N-K-R), APRIL (R-K-R-R) und TWEAK (R-P-R-R) erinnern an das minimale Spaltsignal für Furin (R-X-K/R-R), den Prototyp einer Proprotein-Konvertasefamilie (31).
Die Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet, wenn nicht anders angegeben, herkömmliche Verfahren aus Zellbiologie, Zellkultur, Molekularbiologie, Mikrobiologie, rekombinanter DNA, Proteinchemie und Immunologie, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Diese Verfahren sind in der Literatur beschrieben. Siehe; zum Beispiel, Sambrook, Fritsch and Maniatis (Hrsg.) (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Auflage), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Glover, D.N. (Hrsg.) (1985), DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, M.J. (Hrsg.) (1984), Oligonucleotide Synthesis; U.S.-Patent Nr. 4,683,195 (Multis et al.); Hames, B.D. and Higgins, S.J. (Hrsg.) (1984), Nucleic Acid Hybridisation; Hames, B.D. and Higgins, S.J. (Hrsg.) (1984), Transcription and Translation; Freshney, R.I. (Hrsg.) (1987), Culture of Animal Cells, Alan R. Liss, Inc.; Immobilized Cells and Enzymes (1986), IRL Press; Perbal, B. (1984), A Practical Guide to Molecular Cloning; Wu et al. (Hrsg.), Methods in Enzymology, Volumes 154 and 155, New York, Academic Press; Miller, J.H. and Calos, M.P. (Hrsg.) (1987), Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Cold Spring Harbor Laboratory; Mayer and Walker (Hrsg.) (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, London, Academic Press; Weir, D.M. and Blackwell, C.C. (Hrsg.) (1986), Handbook of Experiment Immunology, Volumes I – IV; Manipulating the Mouse Embryo (1986), Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um die vorliegende Erfindung zu erläutern, und sollten nicht als Beschränkung davon ausgelegt werden.
BEISPIELE
Die folgenden experimentellen Verfahren wurden in den Beispielen 1 – 6 angewendet.
DNA-Konstrukt zur Erzeugung von Tg Mäusen mit murinem BAFF
Sowohl die humane als auch die murine cDNA-Sequenz sind zuvor beschrieben worden (Schneider et al., 1999). Ein das Volllängen murine BAFF kodierende PCR-Fragment wurde durch RT-PCR erzeugt. Die Erststrang-cDNA wurde mit polyA+-RNA aus Maus-Lunge (Clontech, Palo Alto, CA) unter Verwendung von oligo dT nach Angaben des Herstellers synthetisiert (GibcoBRL, Grand Island, NY). Die PCR-Reaktion enthielt 1 × Pfu-Puffer (Stratagene, La Jolla, CA), 0.2 mM dNTPs, 10% DMSO, 12.5 pM Primer, 5 Einheiten Pfu-Enzym (Stratagene) und die folgenden Primer mit NotI-Restriktionsschnittstellen: 5'-TAAGAATGCGGCCGCGGAATGGATGAGTCTGCAAA-3' und 5'-TAAGAATGCGGCCGCGGGATCACGCACTCCAGCAA-3'. Die Matrize wurde in 30 Zyklen bei 94°C für 1 min, 54°C für 2 min und 72°C für 3 min, gefolgt von einer 10-minütigen Extension bei 72°C, amplifiziert. Diese Sequenz entspricht den Nukleotiden 214 bis 1171 des GenBank-Eintrags AF119383. Das PCR-Fragment wurde mit NotI gespalten und dann in den modifizierten Vektor pCEP4 kloniert (Invitrogen, Carlsbad, CA). Das den murinen BAFF enthaltende Fragment wurde mit XbaI herausgeschnitten, um die Sequenz der SV40-Polyadenylierungsstelle einzufügen. Dieses Fragment wurde in einen pUC-basierten Vektor kloniert, wo die Promotorsequenz hinzugefügt wurde. Der Promotor, ein 1 kb BglII/NotI-Fragment mit stumpfen Enden, das den humanen ApoE-Enhancer und den AAT (alpha Anti-Trypsin)-Promotor enthält, wurde aus dem Plasmidklon 540B (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Katherine Parker Ponder, Washington University, St. Louis, MO) gereinigt. Ein EcoRV/BglII-Fragment wurde aus dem fertigen Vektor gereinigt und zur Erzeugung transgener Mäuse verwendet. Die injizierten Nachkommen von weiblichen C57BL/6J × männlichen DBA/2J F1 (BDF1) Mäusen wurden mit C57BL/6 Mäusen zurückgekreuzt. Verfahren zur Mikroinjektion und Erzeugung transgener Mäuse sind zuvor beschrieben worden (Mcknights et al., 1983).
Analytische Methoden
Serumproben wurden reduzierender SDS-PAGE-Analyse über ein lineares, 12.5%-iges Gel unterzogen. Gesamt-RNA aus Mausleber für die Northern-Blot-Analyse wurde unter Verwendung eines Isolierungskits von Promega (Madison, WI) nach Angaben des Herstellers gewonnen und aufbereitet. Transgen-spezifische BAFF-mRNA wurde mit einer Sonde nachgewiesen, die den SV40-polyA-Schwanz des transgenen Konstrukts überspannte und durch Spaltung des modifizierten pCEP4-Vektors mit XbaI und BamHI erhalten wurde. Die Sonde erkennt eine 1.8 – 2 kb Bande, die der mRNA des BAFF-Transgens entspricht. Die PCR-Analyse von DNA aus den Schwänzen von BAFF-TgMäusen wurde unter Verwendung von 12.5 pmol der folgenden Primer 5'-GCAGTTTCACAGCGATGTCCT-3' [Seq.ID.NR.: 21] und 5'-GTCTCCGTTGCGTGAAATCTG-3' [Seq.ID.NR.: 22] in einer Reaktion, die 1 X Taq Polymerase-Puffer (Stratagene), 0.2 mM dNTPs, 10% DMSO, 5 Einheiten Taq-Polymerase (Stratagene) enthielt, ausgeführt. Ein 719 by Fragment des Transgens wurde in 35 Zyklen bei 94°C für 30 sec., 54°C für 1 min und 72°C für 1.5 min, gefolgt von einer 10-minütigen Extension bei 72°C, amplifiziert.
Die Anwesenheit von Proteinen in Mausurin wurde unter Verwendung von Multistix 10 SG Reagensstreifen für Urinanalyse gemessen (Bayer Corporation, Diagnostics Division, Elkhart, IN).
Cell Dyn und Cytofluorimetrische Analyse (FACS)
Differentielle WBZ-Zählungen von frischem, EDTA-antikoaguliertem Gesamtblut wurden mit einem Abbott Cell Dyn 3500 Gerät (Chicago, IL) durchgeführt. Für die FACS-Analyse wurden Fluorescein (FITC)-, CyChrome- und Phycoerythrin-(PE)-markierte Ratten-Anti-Maus-Antikörper: Anti-B220, Anti-CD4, Anti-CD8, Anti-CD43, Anti-IgM, Anti-CD5, Anti-CD25, Anti-CD24, Anti-CD38, Anti-CD21, Anti-CD44, Anti-L-Selektin und der Hamster-Anti-Bcl2/Kontroll Hamster-Ig Kit wurden bei Pharmingen (San Diego, CA) gekauft. Die Herstellung rekombinanter E. coli, wie auch von humanem und Maus-Flag-markiertem BAFF aus Säugerzellen wurden zuvor beschrieben (Schneider et al., 1999). Alle Antikörper wurden nach Angabe des Herstellers verwendet. PBL aus Mausblut wurden auf folgende Weise gereinigt: Mausblut wurde in EDTA-enthaltenden Reagiergefäßen gesammelt und wurde 1:2 mit PBS verdünnt. Fünfhundert μl des verdünnten Bluts wurden auf 1 ml Ficoll (Celardane, Hornby, Ontario, Kanada) in einem 4 ml Reagensglas aufgetragen, der Gradient bei 2000 Upm für 30 min bei Raumtemperatur durchgeführt und die die Lymphocyten enthaltende Interphase wurde gesammelt und vor der FACS-Färbung zweimal in PBS gewaschen. Milz, Knochenmark und Mesenterial-Lymphknoten wurden zu Einzelzell-Suspensionen in RPMI-Medium (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY) zerkleinert und in FACS-Puffer (PBS, supplementiert mit 2% fötalem Kälberserum (JRH Biosciences, Lenexa, KS)) gewaschen. Die Zellen wurden zuerst in FACS-Puffer, supplementiert mit den folgenden, suspendiert: 10 μg/ml Human-Ig (Sandoz, Basel, Schweiz) und 10 μg/ml Anti-Maus-Fc-Blockierungs-Antikörper (Pharmingen), und vor der Anfärbung mit Fluorochrom-markierten Antikörpern 30 min auf Eis inkubiert. Alle Antikörper wurden in FACS-Puffer mit den oben erwähnten Zusätzen zur Absättigung verdünnt. Proben wurden mit einem FACScan Cytofluorometer (Becton Dickinson) analysiert.
Nachweis von Maus-Gesamt-Ig und Rheuma-Faktoren in Mausseren durch ELISA-Tests.
ELISA-Platten (Corning Blass works, Corning, NY) wurden über Nacht bei 4°C mit einer Lösung von 10 μg/ml Ziegen-Anti-Maus-Gesamt-Ig (Southern Biotechnology Associates, Inc. Birmingham, AL) in 50 mM Natriumhydrogencarbonat pH 9.6 beschichtet. Die Platten wurden dreimal mit PBS/0.1% Tween gewaschen und über Nacht mit 1% Gelatine in PBS abgesättigt. Einhundert μl/well von seriellen Serumverdünnungen oder Standardverdünnungen wurden den Platten für 30 min bei 37°C hinzugefügt. Maus-Ig wurde mit 100 μl/well einer 1 μg/ml Lösung eines mit Alkalischer Phosphatase markiertem Ziegen-Anti-Maus-Gesamt-Ig (Southern Biotechnology Associates) für 30 min bei 37°C nachgewiesen. Nach einem letzten, dreimaligen Waschen mit PBS/0.1% Tween, wurde die enzymatische Reaktion mit einer Lösung von 10 μg/ml p-Nitrophenylphosphat (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) in 10% Diethanolamin entwickelt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 μl 3N NaOH/well gestoppt. Die optische Dichte bei 405 nm wurde mit einem Spektrophotometer von Molecular Devices (Sunnyvale, CA) gemessen. Standardkurven wurden mit gereinigtem Maus-Ig, gekauft bei Southern Biotechnology Associates, erstellt. Zum Nachweis der Rheuma-Faktoren (RF) wurden die Platten mit normalem Ziegen-Ig (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) anstelle von Ziegen-Anti-Maus-Ig beschichtet, und der Nachweis von Maus-Ig wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Der Nachweis der Maus-Isotypen in dem RF-Test wurde sowohl mit AP-markiertem Ziegen-Anti-Maus-IgA, -IgM, -IgG2a, -IgG2b und -IgG3 als auch mit gereinigtem Maus-IgA, -IgM, -IgG2a, -IgG2b und -IgG3 für die Standardkurven (Southern Biotechnology Associates Inc.) durchgeführt. Alle statistischen Vergleiche wurden durch Varianzanalyse durchgeführt.
Nachweis Zirkulierender Immunkomplexe (circulating immun complexes, CIC) und Fällung von Kryoglobulinen in Mausseren
Der Test wurde wie zuvor beschrieben (June et al., 1979; Singh and Tingle, 1982) mit den folgenden Modifikationen durchgeführt: Die ELISA-Platten (Corning Blass works) wurden über Nacht bei 4°C mit 5 μg/ml humanem C1q (Quidel, San Diege, CA) in 50 mM Natriumhydrogencarbonatpuffer pH 9.6 beschichtet. Die Platten wurden dreimal mit PBS/0.1% Tween gewaschen. 50 μl/well 0.3 M EDTA plus 50 μl/well serieller Serumverdünnungen oder von Lösungen bekannter Konzentration eines Standard-Immunkomplexes (Peroxidase-Maus Anti-Peroxidase (PAP) von DAKO (Carpinteria, CA)) wurden hinzugegeben. Die Platten wurden 30 min bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden dreimal mit PBS/0.1% Tween gewaschen. Maus-Ig in den Immunkomplexen wurden mit 100 μl/well einer 1 μg/ml Lösung eines AP-markierten Ziegen-Anti-Maus-Ig (Southern Biotechnology Associates, Inc.), wie oben für die ELISA-Tests beschrieben, nachgewiesen. Kryoglobuline wurden durch Inkubation von 1:15 in Wasser verdünntem Mausserum über Nacht nachgewiesen und die Präzipitate wurden visuell ausgewertet.
Anti-Doppelstrang (ds) und -Einzelstrang (ss) DNA-Tests
Anti-ssDNA wurden unter Verwendung von NUNC-Immuno MaxiSorp Platten (NUNC A/S, Denmark) durchgeführt. Die Platten wurden über Nacht bei 4°C zuerst mit 100 μg/ml methyliertem BSA (Calbiochem Corp., La Jolla, CA) beschichtet, danach mit 50 μg/ml Grade I-Kalbsthymus-DNA (Sigma, St. Louis, MO). Die Kalbsthymus-DNA wurde vor Gebrauch mit Ultraschall geschert und dann mit S1-Nuklease gespalten. Für den Anti-ssDNA-Test wurde die DNA vor Gebrauch 10 min gekocht und auf Eis abgeschreckt. Nach der Absättigung wurden serielle Verdünnungen der Serumproben zugegeben und bei Raumtemperatur für 2 h inkubiert. AutoAntikörper wurden mit Ziegen-Anti-Maus-IgG-AP (Sigma) nachgewiesen und wie oben für die ELISA-Tests beschrieben entwickelt. Standardkurven wurden mit bekannten Mengen des Anti-DNA mAk 205 erhalten, der spezifisch für ss- und dsDNA ist (Datta et al., 1987).
Immunhistochemie
Milz und Lymphknoten wurden in O.C.T.-Einbettungsmedium (Miles, Elkhart, IN) eingefroren und für. Gefrierschnitte eingefaßt. 7 – 10 μm dicke Schnitte wurden getrocknet und in Aceton fixiert. Alle Ak-Inkubationen (10 μg/ml) wurden für 1 h bei Raumtemperatur in einem feuchtgehaltenen Behälter nach Verdünnung in Tris-gepufferter Kochsalzlösung A (TBS-A, 0.05M Tris, 0.15M NaCI, 0.05% Tween-20 (v/v), 0.25% BSA) durchgeführt, in TBS-B (0.05M Tris, 0.15M NaCI, 0.05% Tween-20) gewaschen und vor dem Beginn der enzymatischen Reaktion 1 min in Methanol fixiert. Meerettich-Peroxidase (Horseradish peroxidase, HRP)- und Alkalische Phosphatase (AP)-Aktivität wurden mit dem Diaminobenzidin (DAB)-Tablettensubstrat Kit (Sigma) bzw. 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat/4-Nitro-blau-tetrazolium-chlorid (BCIP/NBT, Pierce, Rockford, IL) nachgewiesen, Angefärbte Gewebeschnitte wurden schließlich 5 min in Methanol fixiert und mit Giemsa (Fluka, Buchs, Schweiz) gegengefärbt. Biotin-markierte Antikörper Anti-B220, Anti-CD11c, Anti-Syndecan-1 aus Ratte wie auch unmarkierte Anti-CD4, Anti-CD8α und Anti-CD8β aus Ratte wurden bei Pharmingen gekauft. Biotin-markiertes Erdnuß-Agglutinin (PNA) wurde von den Vector Laboratories (Burlingame, CA) erhalten. (HRP)-markiertes Maus-Anti-Ratte-Ig und (HRP)-Streptavidin wurde bei Jackson Immuno Research Laboratories, Inc. und AP-markiertes Streptavidin bei Southern Biotechnology Associates, Inc. gekauft. Im Falle von Immunhistochemie an Nierengewebe zum Nachweis von Ig-Ablagerungen wurden Paraffinschnitte verwendet, entwachst und mit verdünntem Pferdeserum von Vector (Burlingame, CA) abgesättigt, gefolgt von einer Anfärbung mit HRP-Ziegen-Anti-Maus-Ig von Jackson Immunoresearch. Der Nachweis wurde wie oben beschrieben durchgeführt.
Beispiel 1
Primär BAFF-transgene (BAFF-Tg) Mäuse haben einen anomalen Phänotyp
Volllängen muriner BAFF wurde in transgenen Mäusen unter Verwendung des Leber-spezifischen alpha-1 Antitrypsinpromotors mit dem ApoE-Enhancer exprimiert. Die Volllängen-Version wurde mit der Erwartung ausgewählt, daß BAFF entweder gespalten würde und systemisch wirkt oder daß, wenn er in einer Membran-gebundenen Form erhalten bleibt, örtliche Leber-spezifische Anomalien zu beobachten wären, die möglicherweise Rückschlüsse auf die Funktion gestatten. Wir erhielten 13 primär für das BAFF-Transgen positive Mäuse (Tabelle II). Vier dieser Mäuse starben in jungem Alter. Routine-Pathologie wurde an den Mäusen 811 und 816 ausgeführt (Tabelle II). Es gab keine offensichtliche Infektion in diesen Mäusen; es waren jedoch kardiovaskuläre und renale Anomalien erkennbar und diese waren denen für schweren Bluthochdruck beschriebenen ähnlich (Fu, 1995) (Tabelle II). Hämatoxylin- und Eosin- (H&E)-gefärbte Nierengewebeschnitte des primären Transgens 816 zeigten, daß die Morphologie der Glomeruli in dieser Maus anomal waren, während das übrige Nierengewebe normal schien (Daten nicht gezeigt). Viele der primär transgenen Mäuse wiesen Proteinurie auf (Tabelle II). Immunhistochemie von gefrorenen Milzgewebeschnitten der Maus 816 zeigten eine anomale und ausgedehnte B-Zell-Färbung und eine verringerte Anfärbung für T-Zellen, und diese Beobachtung wurde in den Nachkommen bestätigt (siehe unten, 12).
Mit einer Zweifarben-FACS-Analyse wurde das Verhältnis von % B220-positiven B-Zellen zu % CD4-positiven T-Zellen berechnet. Dieses Verhältnis war zwei- bis sieben-mal höher in primären BAFF-Tg Mäusen im Vergleich zu BDF1-Mäusen als Negativkontrolle (Tabelle II), was einen Anstieg der B-Zell-Population in BAFF-Tg Mäusen nahe legt. Wir wählten neun dieser primär transgenen Mäuse zur Erzeugung unserer verschiedenen Zuchtlinien transgener Mäuse aus, wie durch Unterstreichung in Tabelle II gezeigt. Keine der verbleibenden primär transgenen BAFF-Tg Mäuse oder ihrer Nachkommen zeigten irgendwelche Anzeichen schlechter Gesundheit Monate nach dem frühen Tod der primär Transgenen 696, 700, 811 und 816, was nahe legt, daß diese 4 Mäuse größere BAFF-Mengen exprimiert haben könnten, die ihren Tod verursachten. Die Überexpression von BAFF in der Leber der transgenen Mäuse wurde durch Northern-Blot Analyse bestätigt (Daten nicht gezeigt). In allen histologisch untersuchten BAFF-Tg Mäusen zeigten die Lebern keine Anomalitäten, was darauf hinweist, daß die örtliche Überexpression von BAFF keinerlei immunologische oder pathologische Wirkungen hervorrief. Ein ELISA-Test für murinen BAFF ist nicht verfügbar; wir zeigten jedoch, daß 2% Serum von BAFF-Tg Mäusen, aber nicht von Kontroll-Mäusen, die Bindung von löslichem, Flag-markiertem, aus Säugerzellen gewonnenem Maus-BAFF an BJAB-Zellen hemmt. Weiterhin erhöhten 5% Serum von BAFF-Tg Mäusen, aber nicht von Kontroll-Mäusen, die Proliferation von humanen B-Zellen aus PBL in Gegenwart von Anti-μ (Daten nicht gezeigt). Diese Daten legen nahe, daß wesentliche Mengen an löslichem BAFF im Blut von BAFF-Tg anwesend sind.
Beispiel 2
Periphere Lymphocytose in BAFF-Tg Mäusen ist auf erhöhte Anzahlen von B-Zellen zurückzuführen
Es wurde nachgewiesen, daß die Population der transgenen Mäuse mehr Lymphocyten im Blut hatte im Vergleich zu negativen Kontroll-Wurfgeschwistern, wobei hohe Werte bis zu 13000 Lymphocyten/μl Blut erreicht wurden (7A). Im Gegensatz dazu blieb die Anzahl der Granulocyten/μl Blut sowohl in BAFF-Tg Mäusen als auch in den Kontroll-Mäusen innerhalb normaler Werte (7A). Da die FACS-Analyse mit Anti-CD4- und Anti-B220-Antikörpern von peripheren Blutzellen (PBL) von 18 aus sechs verschiedenen primär transgenen Mäusen hervorgegangenen BAFF-Tg Mäusen erhöhte B/T-Verhältnisse zeigten (7B und 7C), rührten die erhöhten Lymphocyten-Werte von einer vermehrten B-Zell-Subpopulation her. Ebenso ergab die Berechnung der absoluten Zahlen von zirkulierenden CD4-T-Zellen unter Verwendung dieser Methode eine 50%-ige Verringerung dieser T-Zell-Subpopulation in BAFF-Tg Mäusen im Vergleich zu Kontroll-Mäusen, und die gleiche Beobachtung wurde für die CD8-T-Zell-Subpopulation gemacht (Daten nicht gezeigt). Alle B-Zellen aus den PBL von BAFF-Tg Mäusen weisen eine erhöhte MHC Klasse II- und Bcl-2-Expression im Vergleich zu B-Zellen von Kontroll-Mäusen auf (7D bzw. 7E), was auf einen bestimmten Wert der B-Zell-Aktivierung in PBL von BAFF-Tg Mäusen hinweist. T-Zellen im Blut von BAFF-Tg Mäusen exprimierten die frühen Aktivierungsmarker CD69 oder CD25 nicht; 40 bis 56% der CD4- oder CD8-T-Zellen waren jedoch aktivierte Effektor-T-Zellen mit einem CD44^hi, L-Selektin^lo-Phänotyp verglichen mit nur 8% bis 12% in den Kontroll-Wurfgeschwistern (7F). Daher zeigen BAFF-Tg Mäuse deutliche Anzeichen von B-Zell-Lymphocytose und allgemeiner B-Zell-Aktivierung in Begleitung von T-Zell-Veränderungen.
Beispiel 3
Ausgedehnte B-Zell-Kompartimente setzen sich aus reifen Zellen zusammen
Um zu überprüfen, ob die Überexpression von BAFF in den transgenen Mäusen das zentrale B-Zell-Kompartiment im Knochenmark und das periphere in den sekundären Lymphorganen beeinflußt, untersuchten wir mittels FACS die Milz, Knochenmark und Mesenterial-Lymphknoten von insgesamt sieben BAFF-Tg Mäusen und sieben Kontroll-Wurfgeschwistern, die von vier verschiedenen primär transgenen Mäusen abstammten. Das reife B-Zell-Kompartiment wurde durch Anfärbung mit Anti-B220- und Anti-IgM-Antikörpern analysiert. Zwei repräsentative BAFF-Tg Mäuse und ein repräsentatives Kontroll-Wurfgeschwister sind in 8 gezeigt. Das reife B-Zell Kompartiment (IgM+, B220+) war sowohl in der Milz als auch in den Mesenterial-Lymphknoten vergrößert (8A, obere bzw. untere Reihe). Die Analyse der B220+/IgM+ B-Zellen (8A, mittlere Reihe) oder der Pro-B-Zell-(CD43+/B220+) und der Prä-B-Zell-(CD43-/B220+)Kompartimente im Knochenmark (8B) zeigten, daß die BAFF-Tg Mäuse und die Kontroll-Wurfgeschwister ähnlich waren. Diese Daten weisen darauf hin, daß die Überexpression von BAFF die Proliferation reifer B-Zellen in der Peripherie, aber nicht die Vorläufer-B-Zellen im Knochenmark beeinflußt. Die FACS-Analyse der B-Zell-Subpopulationen in der Milz ergab einen erhöhten Anteil von B-Zellen des Randbereichs (marginal zone, MZ) in BAFF-Tg Mäusen im Vergleich zu den Kontroll-Mäusen (Tabelle 3). Die Population follikulärer B-Zellen blieb in BAFF-Tg und Kontroll-Mäusen gleich, wohingegen der Anteil neu gebildeter B-Zellen in BAFF-Tg Mäusen leicht verringert ist (Tabelle 3). Dieses Ergebnis wurde auch auf B220+-Milz-B-Zellen unter Verwendung von Anti-CD38- versus Anti-CD24-Antikörper und Anti-IgM- versus Anti-IgD-Antikörper und Analyse auf CD38^hi/CD24⁺ bzw. IgM^hi/IgD^lo für die MZ-B-Zell-Population bestätigt, wie zuvor beschrieben (Oliver et al., 1997) (Daten nicht gezeigt). Die immunhistochemische Analyse mit einem Anti-Maus-IgM-Antikörper ergab die Vergrößerung des IgM-gefärbten MZ-B-Zell-Bereichs in der Milz von BAFF-Tg Mäusen im Vergleich zu Kontroll-Mäusen (Daten nicht gezeigt). Alle BAFF-Tg B220+-Milz-B-Zellen exprimieren auch größere Mengen von MHC Klasse II (Tabelle 3) und Bcl-2 (Daten nicht gezeigt) im Vergleich zu Milz-B-Zellen von Kontroll-Mäusen, was darauf hinweist, daß sich sowohl Milz-B-Zellen als auch B-Zellen aus PBL in einem aktivierten Zustand befinden.
Beispiel 4
BAFF-Tg Mäuse haben große Mengen an Gesamt-Immunglobulin, Rheuma-Faktoren und zirkulierenden Immunkomplexen in ihrem Serum
Das vergrößerte B-Zell-Kompartiment in BAFF-Tg Mäusen legte nahe; daß die Menge an Gesamt-Ig im Blut dieser Tiere ebenfalls erhöht sein könnte. Die SDS-PAGE-Analyse des Serums von BAFF-Tg Mäusen und Kontroll-Wurfgeschwistern zeigte, daß die Banden der schweren und leichten Ketten von IgG mindestens 10-mal intensiver in 3 von 4 BAFF-Tg Mäusen im Vergleich zu Kontrollseren waren (9A). Ebenso zeigt eine ELISA-Bestimmung in den Seren von BAFF-Tg Mäusen deutlich höhere Mengen an Gesamt-Ig verglichen mit denen der Kontroll-Mäuse (9B).
Trotz der in der SDS-PAGE sichtbaren großen Mengen brachten uns die in der ELISA-Bestimmung beobachteten ausgeprägt großen Mengen an Ig in einigen Mäusen, z.B., 697-5, 816-8-3 und 823-20, dazu, die Anwesenheit von Rheuma-Faktoren (RF) in den Seren oder von gegen die antigenen Determinanten des Fc-Fragments von IgG gerichteten Autoantikörper zu vermuten (Jefferis, 1995). Diese Antikörper könnten an das zur Beschichtung der ELISA-Platten verwendete Ziegen-Anti-Maus-Ig binden und unrichtig hohe Werte geben. Die ELISA-Platten wurden mit normalem irrelevanten Ziegen-Ig beschichtet und die Bindung von BAFF-Tg-Ig an normales Ziegen-Ig wurde gemessen. 9C zeigt, daß die Seren der meisten BAFF-Tg Mäuse Ig enthielten, das mit normalem Ziegen-Ig reagierte, wohingegen nur zwei von 19 Kontrollmäusen eine Reaktion in dem gleichen Test aufwiesen. Diese RF waren hauptsächlich vom IgM-, IgA- und IgG2a-Isotyp (Daten nicht gezeigt).
Die Anwesenheit von RF kann mit der Anwesenheit großer Mengen zirkulierender Immunkomplexe (circulating immune complexes (CIC)) und Kryoglobulin im Blut verbun den sein (Jefferis, 1995). Um zu bestätigen, ob BAFF-Tg Mäuse anomale Mengen an CIC im Serum haben oder nicht, wurde ein auf C1q basierender Bindungstest verwendet, um CIC in den 21 oben analysierten BAFF-Tg Mäusen nachzuweisen. Nur 5 BAFF-Tg zeigten deutlich größere Mengen an CIC verglichen mit Kontroll-Mäusen; nichtsdestoweniger entsprachen diese Mäuse den Tieren, die die größten Mengen an Gesamt-Ig und Rheuma-Faktoren aufwiesen (9D). Wir beobachteten auch Niederschlagsbildung, wenn Seren von BAFF-Tg Mäusen 1:15 in Wasser verdünnt wurden, nicht jedoch bei Kontrollseren, was auf die Anwesenheit von Kryoglobulin in diesen Mäusen hinweist (Daten nicht gezeigt). Daher weisen BAFF-Tg Mäuse, zusätzlich zu B-Zell-Hyperplasie, eine schwere, mit RF und CIC assoziierte Hyperglobulinämie auf.
Beispiel 5
Einige BAFF-Tg Mäuse haben hohe Mengen an Anti-Einzelstrang (ss)- und Doppelstrang (ds)-DNA-Antikörper
Anfänglich beobachteten wir an eine Lupus-artige Erkrankung erinnernde Anomalien der Niere in zwei unserer primär transgenen Mäuse (Tabelle II). Die Anwesenheit von Anti-DNA-Antikörpern wurde auch in SLE-Patienten oder der SLE-ähnlichen (SWR × NZB)F1 (SNF1) Maus beschrieben (Datta et al., 1987). Anti-ssDNA-Autoantikörper wurden in BAFF-Tg Mäusen nachgewiesen, von denen zuvor gezeigt worden war, daß sie die größten Mengen an Gesamt-Serum-Ig besitzen (10A). Wir analysierten das Serum von zwei für Autoantikörper gegen ssDNA negative BAFF-Tg Mäusen (697-5 und 816-1-1) und von drei transgenen Mäusen, die Anti-ssDNA-Antikörper sekretierten (820-4, 816-8-3 und 820-7) auf die Anwesenheit von Anti-dsDNA-Antikörpern parallel zu fünf Kontroll-Wurfgeschwistern. BAFF-Tg Mäuse sekretierten auch Anti-dsDNA, die Höhe der Sekretion korrelierte jedoch nicht immer mit der der Anti-ssDNA-Antikörper, da das Serum der BAFF-Tg Maus 697-5, das keine nachweisbaren Mengen an Anti-ssDNA-Antikörpern enthielt, deutlich positiv in Bezug auf die Anwesenheit von Anti-dsDNA war (10B). Daher sekretieren die BAFF-Tg Mäuse, die die ausgeprägteste Hyperglobulinämie zeigen, pathologische Mengen an Anti-DNA-Autoantikörpern. Darüberhinaus wiesen wir Immunglobulin-Ablagerungen in den Nieren von sechs untersuchten BAFF-Tg Mäusen nach, was ebenfalls an ein Lupus-ähnliches Symptom in diesen Mäusen erinnert, wobei drei dieser Mäuse keine nachweisbaren Mengen an Anti-DNA-Antikörpern sekretierten (Daten nicht gezeigt).
Beispiel 6
BAFF-TgMäuse haben vergrößerte B-Zell-Follikel, zahlreiche Keimzentren, eine verringerte Anzahl Dendritischer Zellen und eine erhöhte Anzahl von Plasmazellen in der Milz und den Mesenterial-Lymphknoten (MLN)
BAFF-Tg Mäuse hatten große Milzen, MLN (Daten nicht gezeigt) und Peyersche Plaques (11). Immunhistochemie zeigte die Anwesenheit vergrößerter B-Zell-Follikel und verkleinerter periarteriolärer Lymphocytenscheiden (PALS oder T-Zell Bereich) in BAFF-Tg Mäusen (12B). Interessanterweise wurden wenige Keimzentren in nicht-immunisierten Kontroll-Wurfgeschwistern beobachtet (und das ist typisch für diese Kolonie im allgemeinen) und die vorhandenen waren klein (12C), wohingegen BAFF-Tg Mäuse zahlreiche Keimzentren in Abwesenheit einer Immunisierung besaßen (12D). Die Anfärbung der Dendritischen Zellen mit Anti-CD11c in der T-Zell-Zone und dem Randbereich der Kontroll-Mäuse (12E) war in BAFF-Tg Mäusen deutlich verringert (12F). Syndecan-1-positive Plasmazellen waren in der Milz von Kontroll-Wurfgeschwistern fast nicht nachzuweisen (12G), die rote Pulpa der BAFF-Tg Mäuse war hingegen deutlich positiv für Syndecan-1 (12H). Sehr ähnliche Beobachtungen wurden für die MLN gemacht ( 13). In den MLN von BAFF-Tg Mäusen waren die B-Zell-Bereiche dramatisch vergrößert (13B) im Gegensatz zum normalen Knoten, wo die B-Zell-Follikel leicht an der Peripherie des Knotens unter der Kapsel mit einer typischen parakortikalen T-Zell-Zone erkennbar waren (13A). Die Medulla der MLN von BAFF-Tg Mäusen war angefüllt mit Syndecan-1-positiven Zellen, die wahrscheinlich Plasmazellen sind (13H). Die Analyse der sekundären Lymphorgane in BAFF-Tg Mäusen stand schlußendlich im Einklang mit dem erweiterten B-Zell-Phänotyp, der multiple zelluläre Anomalien und eine starke Immunaktivität aufweist.
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Tabelle I Expression von MARCH-R in verschiedenen Zelllinien
Tabelle II ,t von primär transgenen BAFF-Mäusen

Claims

Verwendung einer Zusammensetzung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) BAFF (B-Zelle aktivierender Faktor, der zur TNF-Familie gehört) oder einem aktiven Fragment davon; (b) BAFF oder einem aktiven Fragment davon und einem anti-μ-Antikörper; (c) BAFF oder einem aktiven Fragment davon und einem CD40-Liganden; und (d) BAFF oder einem aktiven Fragment davon und einem monoclonalen anti-CD40-Ligand-Antikörper für die Herstellung eines Arzneimittels zur Stimulation des B-Zellenwachstums.
Verwendung einer Zusammensetzung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) BAFF oder einem aktiven Fragment davon; (b) BAFF oder einem aktiven Fragment davon und einem anti-μ-Antikörper; (c) BAFF oder einem aktiven Fragment davon und einem CD40-Liganden; und (d) BAFF oder einem aktiven Fragment davon und einem monoclonalen anti-CD40-Ligand-Antikörper für die Herstellung eines Arzneimittels zur Stimulation der Immunglobulinproduktion.
Verwendung einer Zusammensetzung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) BAFF oder einem aktiven Fragment davon; (b) BAFF oder einem aktiven Fragment davon und einem anti-μ-Antikörper; (c) BAFF oder einem aktiven Fragment davon und einem CD40-Liganden; und (d) BAFF oder einem aktiven Fragment davon und einem monoclonalen anti-CD40-Ligand-Antikörper für die Herstellung eines Arzneimittels zur Co-Stimulation des B-Zellenwachstums und der Immunglobulinproduktion.
Verwendung einer Zusammensetzung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) BAFF oder einem aktiven Fragment davon; (b) BAFF oder einem aktiven Fragment davon und einem anti-μ-Antikörper; (c) BAFF oder einem aktiven Fragment davon und einem CD40-Liganden; und (d) BAFF oder einem aktiven Fragment davon und einem monoclonalen anti-CD40-Ligand-Antikörper für die Herstellung eines Arzneimittels zur Stimulation des/der von dendritischen Zellen induzierten B-Zellenwachstums und -Reifung.
Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend einen BAFF-spezifischen Antikörper oder ein aktives Fragment davon, oder einen BAFF-Rezeptor-spezifischen Antikörper oder ein Epitop davon für die Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung des B-Zellenwachstums.
Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend einen BAFF-spezifischen Antikörper oder ein aktives Fragment davon, oder einen BAFF-Rezeptor-spezifischen Antikörper oder ein Epitop davon für die Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung der Immunglobulinproduktion.
Verwendung einer, Zusammensetzung, umfassend einen BAFF-spezifischen Antikörper oder ein aktives Fragment davon, oder einen BAFF-Rezeptor-spezifischen Antikörper oder ein Epitop davon für die Herstellung eines Arzneimittels zur Co-Hemmung des B-Zellenwachstums und der Immunglobulinproduktion.
Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend einen BAFF-spezifischen Antikörper oder ein aktives Fragment davon, oder einen BAFF-Rezeptor-spezifischen Antikörper oder ein Epitop davon für die Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung des/der von dendritischen Zellen induzierten B-Zellenwachstums und -Reifung.
Verwendung eines BAFF-spezifischen Antikörpers oder einem aktiven Fragment davon oder eines BAFF-Rezeptor-spezifischen Antikörpers oder eines Epitops davon für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Bluthochdruck.
Verwendung einer Zusammensetzung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) BAFF oder einem aktiven Fragment davon; (b) BAFF oder einem aktiven Fragment davon und einem anti-μ-Antikörper; (c) BAFF oder einem aktiven Fragment davon und einem CD40-Liganden; (d) BAFF oder einem aktiven Fragment davon und einem monoclonalen anti-CD40-Ligand-Antikörper; (e) einem BAFF-spezifischen Antikörper oder einem aktiven Fragment davon; und (f) einem BAFF-Rezeptor-spezifischen Antikörper oder einem Epitop davon für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Autoimmunerkrankung.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 10, wobei der BAFF ein löslicher BAFF ist.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei der lösliche BAFF ein rekombinanter BAFF ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 5 bis 10, wobei der anti-BAFF-Antikörper oder der anti-BAFF-Rezeptorantikörper ein monoclonalen Antikörper ist.
Verwendung eines BAFF-spezifischen Antikörpers oder eines Fragments davon oder eines BAFF-Rezeptor-spezifischen Antikörpers oder eines Epitops davon für die Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung von Entzündungen.
Verwendung von BAFF oder eines aktiven Fragments davon für die Herstellung eines Arzneimittels zur Regulierung der Entwicklung blutbildender Zellen.
Verwendung einer Zusammensetzung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) BAFF oder einem aktiven Fragment davon; (b) BAFF oder einem aktiven Fragment davon und einem anti-μ-Antikörper; (c) BAFF oder einem aktiven Fragment davon und einem CD40-Liganden; (d) BAFF oder einem aktiven Fragment davon und einem monoclonalen anti-CD40-Ligand-Antikörper; (e) einem BAFF-spezifischen Antikörper oder einem aktiven Fragment davon; und (f) einem BAFF-Rezeptor-spezifischen Antikörper oder einem Epitop davon für die Herstellung eines Arzneimittels zur Stimulation der B-Zellenproduktion zur Behandlung von immunsuppressiven Erkrankungen.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei die immunsuppressive Erkrankung HIV oder eine mit Organtransplantation assoziierte Erkrankung ist.