CZ20012696A3

CZ20012696A3 - Farmaceutické přípravky obsahující ligand BAFF nebo činidlo blokující tento ligand pro pouľití ke stimulaci a inhibici B-lymfocytů a sekrece imunoglobulinů

Info

Publication number: CZ20012696A3
Application number: CZ20012696A
Authority: CZ
Inventors: Jeffrey Browning; Christine Ambrose; Fabienne Mackay; Jurg Tschopp; Pascal Schneider
Original assignee: Biogen, Inc.; Apotech S. A.
Priority date: 1999-01-25
Filing date: 2000-01-25
Publication date: 2001-10-17
Also published as: JP2012087145A; CA2360062A1; EA200100822A1; EP1146892A2; KR20010105331A; WO2000043032A2; CY1107453T1; TR200102147T2; HK1040628B; IL144202A0; EP2319527A3; SK286665B6; EP2298332A1; PL198934B1; EP1146892B1; NO20013641D0; HUP0105283A2; CN100340292C; BR0007719A; JP4955642B2

Description

(5 7) Anotace:

Předkládané řešení se týká farmaceutických přípravků obsahujících ligand BAFF nebo činidlo blokující tento ligand, určených ke stimulaci nebo inhibici růstu B-lymfocytů, a sekrece imunoglobulinů. Protein BAFF a jeho receptor mohou být využity při protinádorových nebo imunoregulačních aplikacích a také při léčení nemocí se sníženou imunitou jako je HIV, a také hypertenze a s ní souvisejících nemocí.

K použití BAFF jakožto stimulátoru B-lymfocytů při nemocech se sníženou imunitou patří použití u pacientů s orgánovou transplantací nebo u pacientů po léčení rakoviny ke stimulaci produkce B lymfocytů. Přípravky obsahující BAFF lze užít také jako adjuvans a kostimulátor ke zvýšení nebo obnově hladiny B-lymfocytů.

• · · · · ···· ·· • · · · ···· /θύΊ-ϋ.£^ί, ······« 9 · ·· · * • · ··· ··· ··· · 99 · 9 9 9 9 9

Farmaceutické přípravky obsahující ligand BAFF nebo činidlo blokující tento ligand pro použití ke stimulaci a inhibici B-lymfocytů a sekrece imunoglobulinů

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká použití ligandu BAFF, faktoru aktivujícího B-lymfocyty patřícího do rodiny TNF, a blokujícího činidla tohoto ligandu, ke stimulaci nebo inhibici exprese B-lymfocytů a imunoglobulinů. Tento protein a jeho receptor mohou být využity při protinádorových nebo imunoregulačních aplikacích a také k léčení nemocí se sníženou imunitou jako je HIV. Specificky tento ligand a jeho blokující činidlo mohou hrát roli ve vývoji hypertenze a s ní souvisejících nemocí. Kromě toho buňky transfekované genem pro tento ligand mohou být použity v genové terapii nádorových onemocnění autoimunitnich nemocí nebo dědičných genetických poruch zasahujících B-lymfocyty. Blokující činidlo, jako jsou např. rekombinantní varianty nebo protilátky specifické k ligandu nebo jeho receptoru, lze také využít pro imunoregulační aplikace. K příkladům zamýšleného použití BAFF jakožto stimulátoru B-lymfocytů při nemocech se sníženou imunitou patří použití u pacientů s orgánovou transplantací (např. transplantací kostní dřeně) nebo pacientů zotavujících se z léčení rakoviny ke stimulaci produkce B lymfocytů. Také přichází v úvahu použití BAFF jako adjuvans a kostimulátoru ke zvýšení nebo obnově hladiny B-lymfocytů na přibližně normální hladinu.

*

Dosavadní stav techniky

Cytokiny příbuzné nádorovému nekrotickému faktoru (TNF, Tumor Necrosis Factor) jsou mediátory hostitelské obranné a imunitní regulace. Členové této rodiny se vyskytují ve formě ukotvené na buněčnou membránu, kdy působí lokálně prostřednictvím vzájemného kontaktu mezi buňkami, nebo se vyskytují jako vylučované proteiny, které jsou schopné difundovat ke vzdálenějším cílům. Paralelní rodina receptoru upozorňuje na výskyt těchto molekul vedoucí k iniciaci buněčné smrti nebo buněčné proliferace a diferenciace v cílové tkáni. V současnosti rodina TNF ligandů a receptorů obsahuje nejméně 11 známých párů receptor-ligand: TNF:TNF-R, LT-a:TNF-R, LT-α/β: Ι/Γ-β-R, FasL:Fas, CD40L:CD40, CD30L:CD30, CD27L:CD27, 0X4OL:0X4 0 a 4 -1BBL:4 -1BB. Sekvence DNA kódující tyto ligandy vykazují identitu pouze ve 25 % až 30 %, a to dokonce i v případě největší příbuznosti, ačkoliv příbuznost na úrovni sekvence aminokyselin je přibližně 50%.

Bylo zjištěno, že určujícím rysem této rodiny cytokinových receptorů je extracelulární doména bohatá na cystein, která byla objevena při molekulovém klonování dvou odlišných receptorů TNF. Tato genová rodina kóduje glykoproteiny s vlastnostmi transmembránových proteinů typu I s extracelulární doménou vážící ligand, jednou transmembránovou doménou a cytoplazmatickým úsekem, který se podílí na aktivaci buněčných funkcí. Úsek vázající ligand, bohatý na cystein, má centrální doménu z hustě navázaných disulfidových můstků, která se, v závislosti na konkrétním členu rodiny, několikrát opakuje. Většina receptorů má čtyři domény, ačkoliv jsou i receptory pouze se třemi doménami nebo naopak zase se šesti doménami.

Proteiny z rodiny TNF ligandů jsou charakteristické na • « ' 444 44 4 4444

444 44 4 44 4

4444444 4 4 4 4 · 4 * 4 4 · 4 · · 4 •··· · 44 4 44 444 svém N-konci krátkým úsekem normálně krátkých hydrofilních aminokyselin, který často obsahuje několik lysinových nebo argininových zbytků, které zřejmě slouží jako stop-sekvence přenosu. Pak následuje transmembránový úsek a extracelulámí úsek proměnné délky, který odděluje doménu vázající receptor na C-konci od buněčné membrány. Tento úsek se někdy nazývá stopka. C-koncový vazebný úsek představuje větší část proteinu a často, i když ne vždy, obsahuje glykosylační místa. Tyto geny postrádají klasické signální sekvence charakteristické pro membránové proteiny typu I, spíše odpovídají membránovým proteinům typu II, které mají C-konec zasahující mimo buňku a krátký N-konec ležící v cytoplazmě. V některých případech, jako jsou např. TNF a LT-α, se může objevit v průběhu časného opracování proteinu štěpení v úseku stopky a ligand pak existuje především v secernované formě. Avšak většina ligandů se vyskytuje v membránové formě a zprostředkovává tak lokalizovaný přenos signálů.

Struktura těchto ligandů byla rozpoznána krystalografickou analýzou TNF, LT-α a CD40L. Struktura TNF a lymfotoxinu alfa (LT-α) je sendvičová, tj. skládají se ze dvou antiparalelních β-skládaných listů s topologií tzv. meandru (Greek key nebo jelly roli). Odchylka rms mezi zbytky řetězců Ca a β je 0,61 C, což vede k domněnce o vysokém stupni podobnosti jejich molekulární topografie. Strukturálním rysem, který zjevně vyplývá z molekulárních studií CD40L, TNF a LT-α, je tendence těchto ligandů vytvářet oligomerní komplexy. Oligomerní struktuře je vlastní vytváření vazebných míst pro receptor v místě spojení mezi sousedními podjednotkami, čímž se vytváří multivalentní ligand. Analýzou krystalové struktury se zkoumala kvartérní struktura TNF, CD40L a LT-α, a ukázalo se, že CD40L, TNF a LT-α existují jako trimery. Mnoho aminokyselin konzervativních pro tyto ligandy se vyskytuje právě v oblasti úseků kostry struktury β-listu. Je pravděpodobné, že základní sendvičová struktura je zachována u všech těchto molekul, neboť části těchto sekvencí kostry jsou zachovány mezi různými členy celé rodiny. Kvarterní struktura se zřejmě také udržuje, neboť konformace podjednotek pravděpodobně také zůstává podobná.

Členy rodiny TNF mohou být nejlépe popsány jako hlavní přepínače v imunitním systému, které řídi přežíváni buněk a diferenciaci. V současnosti jsou známy pouze dva secernované cytokiny, a sice TNF a LT-α, na rozdíl od většiny ostatních členů rodiny TNF zakotvených v membráně. Zatímco membránové formy TNF byly dobře charakterizovány a pravděpodobně mají jedinečnou biologickou funkci, funkcí secernovaných TNF je všeobecná signalizace poplachu buňkám vzdáleným od místa události, která příslušnou událost vyvolala. Sekrece TNF může znásobit událost vedoucí k dobře známým změnám ve výstelce cév a v buňkách v místě zánětu. Naproti tomu členy TNF rodiny vázané na membránu předávají signál prostřednictvím receptoru typu TNF pouze buňkám v přímém kontaktu. Tak např. pomocné T-lymfocyty poskytují pomoc zprostředkovanou CD40 pouze takovým B-lymfocytům, se kterými se dostanou do přímého kontaktu prostřednictvím interakcí TCR. Podobná omezení na bezprostřední buněčný kontakt se týkají schopnosti indukovat buněčnou smrt u dobře prozkoumaného systému Fas.

Zdá se, že ligandy TNF je možné rozdělit do třech skupin na základě jejich schopnosti indukovat buněčnou smrt. V první skupině jsou ligandy TNF, Fas a TRAIL, které mohou účinně indukovat buněčnou smrt v mnoha buněčných liniích a jejich receptory mají většinou kanonické smrtící domény.

• · · ·»···· «* · • · · · · · · · · · ··· ·· 9 9 · ·

9999999 ·· · · · «

9 · · · ··· ··«· 9 99 9 99 99 9

Pravděpodobně ligand k DR-3 (TRAMP/WSL-1) by patřil také do této kategorie. Další skupinu tvoří takové ligandy, které spouštějí slabší smrtící signál omezený jen na některé buněčné typy, příklady této třídy jsou TWEAK, ligand CD30 a LTalb2. Zajímavou otázkou je, jak členy této skupiny mohou spouštět mechanismus vedoucí k buněčné smrti, když nemají kanonickou smrtící doménu. Nepřítomnost této domény vede k domněnce, že existuje jiný způsob slabší signalizace v mechanismu buněčné smrti. A nakonec do poslední skupiny patří ty členy, které nejsou schopny přenášet žádný smrtící signál. Ale pravděpodobně členy všech skupin mohou působit antiproliferačně na některé typy buněk jako následek indukce diferenciace, jako např. CD40 (Funakoshi et al., 1994).

Rodina TNF se dramaticky rozrostla v poslední době různých signálních drah zahrnujících systému. Obecně rozšířené expresní profily TWEAK a TRAIL ukazují, že v této rodině existuje ještě značná funkční variabilita, dosud nerozpoznaná. To vyniklo zejména novým objevem dvou receptorů, které ovlivňují replikační schopnost viru Rousova sarkomu a viru Herpes simplex, a také historicky významnými objevy, že TNF má antivirovou aktivitu a virus neštovic kóduje vějičkové TNF receptory (Brojatsch et al., 1996, Montgomery et al., 1996,

Smith 1994, Vassalli 1992).

TNF je mediátor septického šoku a kachexie a účastní se regulace vývoje hematopoetických buněk. Zdá se, že hraje hlavní roli jako mediátor v zánětlivé reakci a v obraně proti bakteriálním, virovým a parazitárním infekcím, a navíc má zřejmě protinádorové účinky. TNF se podílí také na různých autoimunitních chorobách. TNF je produkován různými typy buněk, např. to jsou makrofágy, a NK-lymfocyty (natural killer) a obsahuje nyní 11 regulaci imunitního fibroblasty, T-lymfocyty TNF se váže na dva různé • » • · • · · · receptory, z nichž každý působí prostřednictvím odlišných specifických signálních molekul uvnitř buňky, což výsledně vede k odlišným účinkům TNF. TNF může existovat jednak ve formě vázané na membránu, ale i jako rozpustný secernovaný cytokin.

LT-α sdílí s TNF mnoho společných aktivit, jako např. vazbu na TNF receptory, ale na rozdíl od TNF je secernován hlavně aktivovanými T-lymfocyty a některými β-lymfoblastoidními nádory. Heteromerní komplex LT-α a LT-β je komplex vázaný na membránu, který se váže na LT-β receptor. Systém LT (tj . LT s receptorem LT-R) se podílí na vývoji periferních lymfatických orgánů, neboť. genetické narušení LT-β vede k poruchám T- a B-lymfocytů ve slezině a k absenci lymfatických uzlin. Systém LT-β se také podílí na buněčné smrti u některých adenokarcinomových buněčných linií.

Fas-L, další člen rodiny TNF, je exprimován přednostně na aktivovaných T-lymfocytech. Indukuje smrt buněk nesoucích příslušný receptor, nádorových buněk a buněk infikovaných HIV, a sice mechanismem, který je znám jako programovaná buněčná smrt neboli apoptóza. Kromě toho je známo, že nedostatek Fas nebo Fas-L vede k lymfoproliferativním poruchám, což potvrzuje roli systému Fas v regulaci imunitní odpovědi. Fas systém se také podílí na poškození jater v důsledku chronické infekce virové hepatitidy a na autoimunitní reakci u pacientů infikovaných HIV. Systém Fas se také účastní destrukce T-lymfocytů u pacientů infikovaných HIV. TRAIL, další člen této rodiny, se zřejmě také podílí na buněčné smrti mnoha různých transformovaných buněčných linií různého původu.

CD40-L, další člen rodiny TNF, je exprimován na povrchu T-lymfocytů a indukuje regulaci B-lymfocytů nesoucích CD40.

• 9 **···· « · · · · · ·»·« • · · · 4 * * * ·4····4 · 4 44 4 « • 4 444 4·· • 4 4 4 · »4 tt ♦· 444

Ί

Kromě toho je známo, že změny v genu pro CD40-L jsou příčinou nemoci známé jako syndrom hyper-IgM vázané na X. Systém CD4 0 je také spojen s mnoha různými autoimunitními chorobami a CD40-L má také známé antivirové vlastnosti. Ačkoliv se systém CD40 podílí také na obnově apoptických B-lymfocytů, u jiných buněk než buněk imunitního systému indukuje apoptózu. Mnohé další lymfocytární členy rodiny TNF se podílejí na kostimulaci.

Obecně lze shrnout, že členy rodiny TNF hrají základní regulační roli v řízení imunitního systému a v aktivaci akutního obranného systému hostitele. Vzhledem k současnému pokroku v ovlivňování členů rodiny TNF s cílem terapeutického prospěchu je pravděpodobné, že členy této rodiny mohou poskytnout jedinečné prostředky pro léčení nemocí. Některé ligandy rodiny TNF mohou přímo indukovat apoptickou smrt mnohých transformovaných buněk, např. LT, TNF, ligand Fas a TRAIL (Nagata, 1997, 88 Cell 355-365). Aktivace receptorů

Fas a zřejmě i TNF a CD3 0 mohou indukovat buněčnou smrt netransformovaných lymfocytů, což může mít důležitou imunoregulační funkci (Amakawa et al., 1996, 84 Cell 551-562, Nagata, 1997, 88 Cell 355-365, Sytwu et al. , 1996, Zheng et al., 1995, 377 Nature 348-351). Obecně je známo, že buněčná smrt se spustí po agregaci smrtících domén, které jsou umístěny na cytoplazmatické straně receptorů TNF. Tyto smrtící domény organizují různé složek signální transdukce, což nakonec vede k aktivaci celé kaskády (Nagata, 1997, 88

Cell 355-365) . Některé receptory postrádají kanonické smrtící domény, např. receptor LTb a CD30 (Browning et al. 1996, Lee et al. , 1996), přesto mohou indukovat buněčnou smrt, i když podstatně slaběji. Tyto receptory pravděpodobně fungují primárně tak, že indukují buněčnou diferenciaci a buněčná smrt je aberantním důsledkem u některých transformovaných buněčných linií, ačkoliv celý obrázek je dosud nejasný, neboť na základě studie s myšmi CD30 null se předpokládá smrtící role v negativní selekci v brzlíku (Amakawa et al., 1996, 84 Cell 551-562). Naproti tomu, přenos signálů jinými drahami, jako např. právě prostřednictvím CD40, je vyžadován pro udržováni a přežívání buněk. Z výše uvedeného vyplývá tedy potřeba identifikovat a charakterizovat další molekuly, které jsou členy rodiny TNF, a tím poskytnout další prostředky k léčení nemocí a ovlivňování imunitního systému.

Původci v předkládaném vynálezu charakterizovali funkční vlastnosti nového ligandu z rodiny TNF cytokinů. Nový ligand, nazvaný BAFF (odvozeno z „B-cell Activating Factor belongig to TNF family), je exprimován T-lymfocyty a dendritickými buňkami za účelem kostimulace B-lymfocytů a hraje zřejmě důležitou roli v kontrole funkce B-lymfocytů. Kromě toho původci připravili transgenní myši nadměrně exprimující BAFF řízený promotorem specifickým pro játra. Tyto myši mají nadměrný počet zralých B-lymfocytů, spontánní reakce germinálních center, secernují autoprotilátky a mají vysoké počty plazmatických buněk v sekundárních lymfatických orgánech a depozity Ig v ledvinách.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká užití ligandů BAFF, blokujících činidel a protilátek k ligandu, buďto pro stimulaci nebo inhibici růstu B-lymfocytů a sekrece imunoglobulinů. Vynález může být využit pro terapeutické aplikace při mnohých nemocech, jak bude ještě dále podrobněji diskutováno, a také ke zjišťování informací o imunitním •· · 4 4 «99* «« «4« 44 4 4*4 • 44 «4 9 44 •••••4« «4 94 4 • 4 4 9 4 4 4 <449 4 ·· « 44 4 systému a procesech v něm a také k jejich ovliňování. Vynález může být dále využit ke stimulaci nebo inhibici růstu B-lymfocytů a sekrece imunoglobulinů. Molekuly asociované s BAFF, jak popisuje předkládaný vynález, mohou být využity při léčení autoimunitních nemocí, poruch souvisejících s proliferaci a zráním B-lymfocytů, regulací lígandu BAFF a záněty. Vynález se může podílet na regulaci nebo prevenci hypertenze a nemocí souvisejících s hypertenzí renální a kardiovaskulární tkáně.

Další vlastnosti a výhody vynálezu budou uvedeny dále, a budou zřejmé z popisu vynálezu nebo z realizace vynálezu. Předmět vynálezu a jeho další výhody budou specificky dosaženy metodami zvláště uvedenými v popisu, nárocích a také výkresech.

Předkládaný vynález, tak jak je zde v celé šíři popsán, v souladu se zde popsanými výhodnými provedeními, se týká způsobu ovlivnění růstu B-lymfocytů a sekrece imunoglobulinů podáváním přípravků obsahujících různé BAFF ligandy a příbuzné molekuly.

Vynález také předpokládá stimulaci růstu B-lymfocytů užitím BAFF ligandů nebo aktivních fragmentů polypeptidu. Polypeptid může být buďto samotný nebo s ligandem CD40 nebo s anti-myší protilátkou.

V jiném provedení se předkládaný vynález týká stimulace růstu a zrání B-lymfocytů stimulovaných dendritickými buňkami užitím ligandů BAFF nebo jeho aktivních fragmentů. A opět se polypeptid může užít buďto samotný nebo s ligandem CD4 0 nebo s anti-μ protilátkou.

V jiném provedení vynálezu byly užity činidla blokující BAFF a receptor BAFF k inhibici růstu B-lymfocytů a sekrece imunoglobulinů. Tato činidla mohou být neoperativní rekombinantní BAFF, protilátky specifické k BAFF, protilátky specifické k receptoru BAFF nebo molekuly anti-BAFF ligand.

Ještě v dalším provedení se vynález týká použití BAFF, molekul příbuzných BAFF a činidle blokujících BAFF k léčení hypertenze, nemocí souvisejících s hypertenzí, nemocí imunity, autoimunitních nemocí, zánětů a lymfoproliferativních poruch B-lymfocytů.

Vynález se také týká použití BAFF a molekul příbuzných BAFF jako agonistů nebo antagonistů k ovlivnění imunitní reakce prostřednictvím ovlivnění růstu a/nebo zrání B-lymfocytů a sekrece imunoglobulinů.

V dalším provedení se vynález týká rozpustných konstruktů obsahujících BAFF, které mohou být užity přímo ke spuštění farmakologické události zprostředkované BAFF. Takové události mohou mít bezprostředně prospěšný terapeutický účinek při léčení rakoviny, nádorů nebo při ovlivňování imunitního systému při léčen imunologických onemocnění.

Další provedení předkládaného vynálezu se týká protilátek namířených proti ligandu BAFF, které mohou být použity např. při léčení rakoviny nebo při ovlivňování imunitního systému při léčen imunologických onemocnění.

Ještě další provedení vynálezu se týká genové terapie s využitím genů pro BAFF.

Farmaceutické přípravky podle vynálezu obsahují volitelně farmaceuticky přijatelné nosiče, adjuvans, plnidla a další farmaceuticky přijatelné složky, a mohou se podávat jakýmkoliv způsobem v oboru známým.

Jak výše uvedený všeobecný opis vynálezu, tak i následující podrobný popis včetně příkladů slouží k vysvětlení vynálezu, který je definován nároky.

Připojené obrázky slouží k lepšímu porozumění vynálezu a tvoří nedílnou součást popisu, jsou uvedeny proto, aby ilustrovaly vybraná provedení vynálezu a společně s popisem φφφ ·♦♦··· ·· • φ φ φφ φ φφφ φ φ φ · φ φ φ φφ φφ φ · φ · φφφ · φ φ φφφφ φ φ» φ φφ φφ» slouží k objasnění principu vynálezu.

Popis obrázků

Obr. 1 (A) znázorňuje predikovanou aminokyselinovou sekvenci lidského [SEKVENCE ID. Č. 1] a myšího BAFF [SEKVENCE ID. Č. 2]. Predikovaná transmembránová doména (TMD, čárkovaná čára), potenciální místa N-glykosylace (hvězdičky) a přirozená místa opracování lidského BAFF (šipky) jsou znázorněna. Dvojitá čára nad hBAFF ukazuje sekvenci získanou Edmanovým odbouráváním opracované formy BAFF. Obr. 1 (B) ukazuje srovnání extracelulárních proteinových sekvencí BAFF [SEKVENCE ID. Č. 3] a některých členů rodiny TNF ligandů 4 (hAPRIL); SEKVENCE ID. Č. 5 {hTNF alfa); 6 (hFasL) ; SEKVENCE ID. Č. 7 (hLT alfa); 8 (hRANKL)]. Identické a homologní j sou uvedeny v černých a šedých znázorňuje dendrogram ligandů TNF

C.

Č.

[SEKVENCE ID.

SEKVENCE ID.

aminokyselinové zbytky rámečkách. Obr. 1 (C) rodiny.

Obr. 2 je schéma rekombinantního BAFF. Obr. 2 (A) představuje schéma rekombinantního konstruktu BAFF. Rozpustné rekombinantní proteiny BAFF začínají aminokyselinou Leu₈₃a Glni₃₆ byly exprimovány jako fúze s k N-koncové značce Flag a spojovací sekvenci (linkeru) 6 aminokyselin. Dlouhá forma je v T-lymfocytech 293 štěpena mezi aminokyselinami Argi₃₃a Alai₃₄ (šipka) a vzniká tak opracovaná forma BAFF. Asn_i24 a Asn₂42 patří ke kanonickým sekvencím pro N-glykosylaci. N-vázaný glykan přítomný na Asni₂4 je znázorněn jako Y. TMD: transmembránová doména. Obr. 2B: Ošetření rekombinantního BAFF peptid N-glykanázou F (pNGase F). Koncentrované

9 9

9 9 9 > «99999 • 9 • 9 «·»» supernatanty obsahující BAFF a APRÍL s Flag značkou byly deglykosylovány a analyzovány Westernovým přenosem (Western blot) užitím polyklonální protilátky anti-BAFF nebo anti-Flag M2, jak je uvedeno. Všechny pásy kromě opracovaného BAFF reagovaly také s anti-Flag M2 (údaje neuvedeny). Obr. 2 (C): Opracování BAFF plné délky na rozpustnou formu. Buňky 293T byly přechodně transformovány BAFF plné délky. Transfekované buňky a jejich koncentrované supernatanty byly analyzovány Westernovým přenosem pomocí polyklonálních anti-BAFF protilátek. Na gel byly naneseny supernatanty odpovídající desetinásobku množství buněk. Obr. 2 (D) : Vylučovací chromatografie (size exclussion) rozpustné formy BAFF na koloně Superdex-200. Koncentrované supernatanty obsahující rozpustný BAFF/krátký byly frakcionovány na koloně Superdex200 a eluované frakce byly analyzovány Westernovým přenosem užitím protilátky anti-Flag M2. Na levé straně jsou uvedeny molekulové hmotnosti (kDa) markeru/standardu pro SDS-PAGE a nahoře pro vylučovací chromatografii.

Obr. 3 ukazuje expresi BAFF. Obr. 3 (A) : Northernové přenosy (Northern blot) (2 gg póly A+ RNA v každé dráze) různých lidských tkání hybridizovány se sondou antisense BAFF mRNA. Obr. 3 (B) : Reverzní transkripce a amplifikace BAFF, alfa řetězce receptoru IL-2 a aktinu z RNA T-lymfocytů purifikovaných z krve v různých okamžicích aktivace PHA, krevních buněk negativních v E-rozetách (B-lymfocyty a monocyty), nezralých dendritických buněk získaných in vitro, buněk 2 93 a buněk 2 93 sterilně trans fekovaných BAFF plné délky (293-BAFF). Kontrolní amplifikace byly provedeny bez přidání cDNA. Alfa řetězec receptoru IL-2 byl amplifikován jako markér aktivace T-lymfocytů.

• tttt tttttt··· ·· tttttt tttt tt ··· »···«·· tt* · tt · tt • · tttttt tttttt • tttttt · ·· · tttt tttt ·

Obr. 4 ukazuje vazbu BAFF na zralé B-lymfocyty. Obr. 4 (A) :

Vazba rozpustného BAFF na buněčné linie BJAB a Jurkat a purifikované buňky CD19+ z pupečníkové krve. Buňky byly obarveny uvedeným množstvím (ng/50 μΐ) Flag-BAFF a analyzovány průtokovou cytometrií. Obr. 4 (B) : Vazba rozpustného BAFF na PBL. PBL byly obarveny anti-CD8-FITC nebo anti-CD19-FITC (horizontální osa) a Flag-BAFF s M2-biotinem a avidin-PE (vertikální osa) . V kontrolách byl vynechán Flag-BAFF.

Obr. 5 ukazuje, že BAFF kostimuluje proliferaci B-lymfocytů. Obr. 5 (A) : Povrchová exprese BAFF u trvale transformovaných buněk 293. Buňky 293-BAFF a buňky 293 divokého typu byly obarveny monoklonální protilátkou anti-BAFF mAb 43.9 a analyzovány průtokovou cytometrií. Obr. 5 (B) : Kostimulace

PBL buňkami 293-BAFF. PBL (10⁵/jamka) byly inkubovány s 15000 buňkami 293 fixovanými glutaraldehydem (293 divokého typu nebo 293-BAFF) za přítomnosti či absence protilátky proti receptoru B-lymfocytů (anti-μ). Fixované buňky 293 samy inkorporovaly 100 cpm. Obr. 5 (C) : Na dávce závislá kostimulace proliferace PBL rozpustným BAFF za přítomnosti anti-μ. Proliferace byla určována po 72 hodinách inkubace inkorporací [³H] - thymidinu. Kontroly obsahovaly buňky ošetřené samotným BAFF, tepelně denaturovaným BAFF nebo protilátkou irelevantního isotypu místo anti-μ. Obr. 5 (D): Srovnání (ko)stimulačních účinků sCD40L a sBAFF na proliferaci PBL. Experiment byl proveden stejně jak je popsáno pro panel C. Obr. 5 (E) : BAFF kostimuluje sekreci Ig z preaktivovaných lidských B-lymfocytů. Purifikované B-lymfocyty CD19+ byly aktivovány kokultivací s T-lymfocyty EL-4 a supernatanty aktivovaných T-lymfocytů po 5 až 6 dnů, pak reizolovány ·♦ · · · · a kultivovány dalších 7 dnů pouze v samotném médiu (-)nebo v médiu obsahujícím 5% supernatanty aktivovaných T-lymfocytů (T-SUP) nebo směs cytokinů (IL-2, IL-4, IL-10). Sloupce představují průměrné hodnoty koncentrace imunoglobulinů v kulturách bez nebo s 1 gg/ml BAFF. Jsou uvedeny průměr ± směrodatná odchylka (SD) jakožto násobek zvýšení: 1,23 ± 0,11 pro samotné médium a 2,06 ± 0,18 pro supernatanty T-lymfocytů (4 pokusy) a 1,45 ± 0,06 pro IL-2, IL-4 a IL-10 (2 pokusy). Pokusy byly provedeny s B-lymfocyty periferní krve (3 pokusy) nebo B-lymfocyty pupečníkové krve (1 pokus: 2,3násobné zvýšení se supernatanty T-lymfocytů, 1,5násobné zvýšení s IL-2, IL-4 a IL-10) . Obr. 5 (F) : Závislost účinku BAFF na dávce v kultuře se supernatanty T-lymfocytů, uvedených v panelu D. Ukázána je průměrná hodnota ± směrodatná odchylka ze 3 pokusů.

Obr. 6 ukazuje, že BAFF působí jako kofaktor při proliferaci B-lymfocytů. Proliferace lidských B-lymfocytů periferní krve byla měřena na samotných PBL (500 cpm), za přítomnosti samotného ligandů BAFF, za přítomnosti samotné kozí anti-myší (mu) protilátky, a za přítomnosti ligandů BAFF s anti-mu. Kombinace ligandů BAFF s anti-mu významně zvyšovala proliferaci PBL s rostoucí koncentrací BAFF, což podporuje charakteristiku BAFF jako kofaktoru.

Obr. 7 demonstruje zvýšení počtu B-lymfocytů u BAFF Tg myší. Obr. 7 (A) : Zvýšený počet lymfocytů u BAFF Tg myší. Graf srovnává 12 kontrolních myší (levý panel) s 12 myšmi BAFF Tg (pravý panel). Počty lymfocytů jsou na grafu uvedeny jako kroužky a počty granuloctů (zahrnující neutrofily, eosinofily, basofily) jako kosočtverečky. Obr. 7 (B) : Zvýšený

9 • 9

9 • 999 9

9999

počet B-lymfocytů v PBL u BAFF Tg myší. PBL byly pro FACS analýzu obarveny jak anti-B220-FITC tak i anti-CD4-PE a sledovány na živých buňkách pomocí forward side rozptylu. Jsou uvedena procenta lymfocytů pozitivních na CD4 a B220. Je ukázána jedna kontrolní myš (vlevo) a dvě BAFF Tg myši (vpravo) a tyto výsledky byly reprezentativní pro 7 zvířat analyzovaných v každé skupině. Obr. 7 (C) : FACS analýza poměru B- a T-lymfocytů v PBL. Rozdíl mezi kontrolními zvířaty a myšmi BAFF Tg v (A) a (C) byly statisticky významné (p<0,00l) . Obr. 7 (D) : Zvýšení exprese MHC třídy II na B-lymfocytech z PBL myší BAFF Tg. Exprese MHC třídy II byla analyzována FACS. Obr. 7 (E): Zvýšení exprese Bcl-2 na B-lymfocytech z PBL myší BAFF Tg. Exprese Bcl-2 byla měřena intracytoplazmatickýcm barvením a buňky byly analyzovány FACS. Jak v (D) tak v (E) byly živé buňky indikovány forward side rozptylem. Čtyři kontrolní zvířata (bílé úsečky) a čtyři BAFF Tg myši jsou ukázány a reprezentují alespoň 12 zvířat analyzovaných v každé skupině. MFI: průměrná hodnota intenzity fluorescence. Rozdíl mezi kontrolními zvířaty a BAFF Tg myšmi byl statisticky významný (p < 0,005) . Obr. 7 (F): Zvýšená exprese efektorových T-lymfocytů u myší BAFF Tg. PBL byly obarveny anti-CD4-Cychromé, anti-CD44-FITC a anti-L selektin-PE. Ukázány jsou buňky indikované jako CD4+. Uvedena jsou také procenta buněk CD44^hl/L selektin¹⁰. Je ukázána jedna kontrolní myš (vlevo) a dvě transgenní BAFF Tg (vpravo) reprezentující alespoň 8 zvířat analyzovaných v každé skupině.

Obr. 8 ukazuje zvětšený kompartment B-lymfocytů ve slezině, ale nikoliv v kostní dřeni transgenních myší BAFF Tg. Obr. 8 (A) : FACS barvení zralých B-lymfocytů užitím jak anti-IgMFITC tak i anti-B220-PE, ve slezině (horní panel), kostní • · 9 · » ·«·· · · • · · · · · · · · ·«····· · « ·· « ♦ · · · · · · • · · » « · « · · · dřeni (střední panel) a MLN (spodní panel). Jsou uvedena procenta zralých B-lymfocytů B220+/lgM. Obr. 8 (B) : FACS barvení pre-B-lymfocytů (B220+/CD43-) a pro-B-lymfocytů (B220+/CD43+) v kostní dřeni simultánním užitím anti-CD43ITC, anti-B220-Cychrome a anti-IgM-PE. Ukázány jsou buňky vymezené na populaci IgM negativní. Uvedena jsou procenta pre-B-lymfocytů (B220+/CD43-) a pro-B-lymfocytů (B220+/CD43+). Na všech obrázcích (A a B) jsou ukázány jedna kontrolní myš (vlevo) a dvě myši BAFF Tg (vpravo) a výsledky reprezentují 7 zvířat analyzovaných v každé skupině.

Obr. 9 ukazuje zvýšené hladiny Ig, RF a CIC u myší BAFF Tg. Obr. 9 (A): SDS-PAGE analýza séra ze 2 kontrolních myší (-) a 4 BAFF Tg myší ( + ) vedle sebe s uvedeným množstvím purifikovaného myšího IgG pro srovnání. Intenzita albuminového pásu je podobná ve všech drahách, což ukazuje ve všech vzorcích bylo na gel naneseno stejné množství materiálu.

Analýza, založená na testu ELISA, celkového myšího Ig (B), RF (C) a CIC (D) v séru 19 kontrolních myší (bílé sloupečky) a 21 transgenních myší BAFF Tg (černé sloupečky) . Při nedostatku vhodné kontroly pro RF byl titr (log se základem 2) definován jako ředění séra poskytující OD 3x vyšší než pozadí. Množství CIC bylo definováno jako množství PAP nutné k vytvoření OD shodné s OD pro testované sérum. Rozdíly mezi kontrolními a BAFF Tg myšmi byly statisticky významné (p < 0,001 v (B) a (C), p < 0,003 v (D)).

Obr. 10 ukazuje přítomnost autoprotilátek anti-ssDNA a anti-dsDNA u některých BAFF Tg myší.

*

4 4

4 4 4 4

4

4*44 4

Obr. 10 (A): ELISA analýza anti-ssDNA autoprotilátek 19 kontrolních myší (šedé sloupečky) a 21 transgenních myší BAFF Tg (černé sloupečky).

Obr. 10 (B) : ELISA analýza anti-ssDNA autoprotilátek u 5 kontrolních myší a 5 zvířat vykazujících hladiny anti-ssDNA autoprotilátek v (A).

Obr. 10 (C) : Parafínové řezy ledvin z kontrolní myši (vlevo) a BAFF Tg myši (vpravo) obarvené kozím ant i-myším Ig s HRP. Depozity Ig jsou ukázány jako hnědé zabarvení. Tyto obrázky jsou reprezentativní pro 6 analyzovaných myší BAFF Tg.

Obr. 11 ukazuje zvětšené Peyerovy pláty u myší BAFF. Fotografie Peyerových plátů (ukázány šipkou) v tenkém střevu kontrolní myši (vlevo) a myši BAFF Tg (vpravo) . Obrázek je reprezentativní pro alespoň 12 myší utracených v každé skupině. Zvětšeno 5x.

Obr. 12 ukazuje narušenou organizaci B- a T-lymfocytů, intenzivní reakce germinálních center, snížený počet dendritických buněk a zvýšený počet plazmatických buněk ve slezině BAFF Tg myši.

Kontrolní myši jsou ukázány na A, C, E a G a BAFF Tg na B, D, F a H. B-lymfocyty jsou modré a T-lymfocyty hnědé (A a B) . germinální centra jsou ukázána šipkou (C a D) . U kontrolních myší je vidět pouze několik reziduálních germinálních center (C) . Dendritické buňky pozitivní na CDllc jsou hnědé a vyskytují se v zóně T-lymfocytů, spojovacích kanálcích a marginální zóně (E) . Jen velmi málo jich je přítomno u BAFF Tg myší (F) . Plazmatické buňky pozitivní na Syndecan-1 byly detekovatelné pouze v červené dřeni BAFF Tg myší (Η) , ale nikoliv kontrolních myší (G) . Tyto obrázky jsou reprezentativní pro alespoň 12 BAFF Tg a 12 kontrolních myší, pro všechny

B: folikuly dřeň.

· 44

4« 4 4 4

4 4 · · 4

44···· 4 4

4 4 4 4

4444 4 94 · • 44 4 které byly analyzovány. Zvětšení obrázky s výjimkou C a D, kde B-lymfocytů, T: PALS, WP: bílá dřeň, bylo lOOx bylo 50x. RP: červená

Obr. 13 ukazuje narušenou organizaci B- a T-lymfocytů, intenzivní reakce germinálních center a velký počet plazmatických buněk v MLN BAFF Tg myší.

Kontrolní myš je ukázána na A, C, E a G a BAFF Tg myš je ukázána na B, D, F a H. Imunohistochemická analýza byla provedena jak je popsáno u obr. 6. Barvení B- a T-lymfocytů je ukázáno na A a B, germinálních center na C a D, dendritických buněk na E a F a plazmatických buněk na G a H. GC: germinální centra. Zvětšení lOOx.

Následující popis se týká především podrobného popisu výhodných provedení předkládaného vynálezu. Předkládaný vynález se týká zejména užití BAFF a příbuzných molekul k ovlivnění růstu a zrání B-lymfocytů a sekrece imunoglobulinů. Dále se vynález týká užití BAFF a příbuzných molekul k ovlivnění reakce imunitního systému, které je vynuceno nemocemi souvisejícími s imunitou. Kromě toho se vynález týká léčení rakoviny a imunologických onemocnění užitím BAFF nebo příbuzných genů v genové terapii.

Ligand BAFF a jeho homology produkované v hostiteli/příjemci transformovaném sekvencemi podle vynálezu, a také nativní BAFF purifikovaný metodami, které jsou odborníkovi známy, nebo připravený ze známé aminokyselinové sekvence, jsou užitečné pro různé protirakovinné, protinádorové a imunitu regulující aplikace. Mohou být také užitečné při terapii jiných nemocí.

Další aspekt předkládaného vynálezu se týká použití •0 0000 *

0 0 0

0··0 0099 090 0 » 0 000 000 »00 0 00 0 00 00« oligonukleotidová oligonukleotidové oligonukleotidy, polypeptidu kódovaného izolovanou nukleovou kyselinou kódující ligand BAFF v antisense terapii. Termín antisense terapie se v předkládané přihlášce týká podávání nebo in šitu vytváření oligonukleotidů nebo jejich derivátů, které specificky hybridizují v normálních buněčných podmínkách s buněčnou mRNA a/nebo DNA kódující požadovaný ligand, a tak inhibují expresi kódovaného proteinu tím, že inhibují transkripci a/nebo translaci. Zmíněná vazba je zprostředkována konvenční komplementaritou párů baží nebo např. V případě vazby na duplexy DNA může jít o vazbu prostřednictvím specifických interakcí v hlavním zářezu dvoušroubovicové DNA. Obecně se antisense terapie týká celé řady technik v oboru užívaných a patří sem v podstatě jakákoliv terapie založená na specifické vazbě oligonukleotidových sekvencí.

Antisense konstrukt podle předkládaného vynálezu může být podáván např. ve formě expresního plazmidů, který transkripcí v buňce vytvoří RNA, která je komplementární k buněčné mRNA kódující BAFF nebo alespoň k její části. Alternativně může být antisense konstrukt sonda připravená ex vivo.

sondy j sou výhodně které jsou rezistentní nukleázám a jsou proto stabilní in vivo. Příkladem takových molekul nukleových kyselin vhodných jako antisense oligonukleotidy jsou fosforamidátové, fosfothioátové a metylfosfonátové analogy DNA (viz patenty USA č. 5 176 996, 5 264 564 a 5 256 775). Kromě toho obecný postup konstrukce oligomerů vhodných pro antisense terapii byly přehledně uvedeny např. v publikacích Van Der Krol et al. , 1988,

Biotechniques 6: 958-976, a Stein et al. , 1988, Cancer Res.

48: 2659-2668, které jsou formou odkazu zahrnuty.

také

Takové módi f ikované k endogenním

4« 444 4 ·

• 4 4 4 4 · • 4 · · 4 4 • 4444 9 9 99 • · 4 4 4 •••4 · 444

Ligand BAFF

Ligand BAFF podle předkládaného vynálezu, jak již bylo diskutováno výše, členem rodiny TNF, a byl popsán v mezinárodní patentové přihlášce PCT/US98/19037 (publikované jako WO 99/12964), která je celá vložena formou odkazu. Protein sám, nebo jeho fragmenty či homology, má široké možnosti terapeutického a diagnostického použití.

Ligand BAFF se vyskytuje zejména ve slezině a v lymfocytech periferní krve, což ukazuje na regulační roli v imunitním systému. Srovnání sekvence ligandu BAFF podle vynálezu s ostatními členy lidské rodiny TNF ukazuje značnou strukturní podobnost. Všechny tyto proteiny sdílejí několik úseků konzervativních sekvencí v extracelulární doméně.

Ačkoliv není dosud známa přesná trojrozměrná struktura ligandu podle vynálezu, lze predikovat, že jakožto člen rodiny TNF sdílí určité strukturní charakteristiky s ostatním členy rodiny.

Nové polypeptidy podle předkládaného vynálezu specificky reagují s receptorem, který dosud nebyl identifikován. Avšak peptidy a způsoby podle předkládaného vynálezu umožňují identifikovat receptory, které specificky reagují s ligandem BAFF nebo jeho fragmenty.

Určitá provedení podle předkládaného vynálezu se týkají peptidů odvozených z ligandu BAFF, které mají schopnost vázat se na jeho receptory. Fragmenty ligandu BAFF je možné připravit různými způsoby, např. rekombinantní technologií, pomocí PCR, proteolytickým štěpením nebo chemickou syntézou. Vnitřní nebo koncové fragmenty polypeptidu mohou být připraveny odstraněním jednoho nebo několika nukleotidů z jednoho nebo z obou konců nukleové kyseliny, která kóduje ·· ·· 4 · • 49 9« 4 4444 • 44 4« 4 44 4

444« 444« 444 4

4 444 444

4444 4 4 4 4 4 4 444 polypeptid. Fragmenty polypeptidu lze tak připravit expresí mutované DNA.

Polypeptidové fragmenty se mohou také chemicky syntetizovat obvyklým způsobem metodou známou jako Merriffieldova syntéza na pevné fází užívající f-moc nebo t-boc. Např. peptidy a sekvence DNA podle předkládaného vynálezu je možné v podstatě libovolně rozdělit na fragmenty požadované délky, které se nepřekrývají, nebo na překrývající se fragmenty požadované délky. Příslušné metody jsou podrobněji popsány v následujícím textu.

Příprava rozpustných forem ligandu BAFF

Rozpustné formy ligandu BAFF mohou být velmi účinné v přenosu signálu a mohou tudíž být podávány jako lék, který napodobuje přirozenou membránovou formu. Je možné, že ligand BAFF podle předkládaného vynálezu je přirozeně secernován jako rozpustné cytokiny, ale pokud tomu tak není, je možné modifikovat gen metodami genového inženýrství tak, aby se zesílila sekrece. Pro přípravu rozpustné secernované formy BAFF je třeba odstranit na úrovni DNA N-koncový transmembránový úsek a některé úseky stonku a nahradit je vedoucí sekvencí typu I nebo alternativně vedoucí sekvencí typu II, která umožní účinné proteolytické štěpení ve vybraném hostitelském systému. Odborník je schopen měnit rozsah stonkových úseků ponechaných v expresním konstruktu tak, aby bylo dosaženo optimálních vazebných vlastnosti k receptoru a sekreční účinnosti. Tak např. lze připravit konstrukty obsahující všechny možné délky stonku, a sice zkracováním N-konce, takže vzniknou proteiny, které budou začínat např. aminokyselinou 81 až 139. Tímto typem analýzy lze stanovit optimální délku sekvence stonku.

<·· «111 • · ·<· t • · » · I • φ · · ί • *»»· « » 1 • · * <

··♦· φ ··

Příprava protilátek reaktivních s ligandem BAFF

Předkládaný vynález se také týká protilátek specificky reagujících s ligandem BAFF nebo jeho receptorem. Antiséra typu anti-protein/anti-peptid nebo monoklonální protilátky lze připravit standardními způsoby (viz např. Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lané (eds.), Cold Spring Harbor press, 1988). Savec jako např. myš, křeček nebo králík, se může imunizovat imunogenní formou peptidu. Způsoby, jak učinit protein nebo peptid imunogenním, např. tím, že je konjugován s nosičem, nebo jiné způsoby, jsou v oboru známy.

Imunogenní část ligandu BAFF nebo jeho receptorů může být podána společně s adjuvans. Postup imunizace je možné monitorovat pomocí detekce titru protilátek v plazmě nebo séru. Standardní test ELISA nebo jiné imunotesty se mohou použít s imunogenem coby antigenem k hodnocení hladin protilátek.

Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu jsou protilátky imunospecifické pro antigenní determinanty ligandu BAFF nebo jeho receptorů (tj . antigenní determinanty polypeptidů se sekvencí id. č. 2, popsané v PCT/US98/19037 (WO 99/12964) která je vložena formou odkazu v plném rozsahu), nebo pro blízce příbuzný lidský nebo savčí, jiný než lidský, homolog (s homologií 70, 80 nebo 90 %, nejvýhodněji s homologií alespoň 95 %). V dalším výhodném provedení předkládaného vynálezu protilátky anti-ligand BAFF nebo anti-receptor ligandu BAFF v podstatě nereagují zkříženě (tzn. reagují pouze specificky) s proteinem, který je např. méně než z 80 % homologní se sekvencí id. č. 2 nebo 6 popsanou v PCT/US98/19037 (WO99/12964) která je vložena • 9 9 ·· 9999 • · · · · 9 • · · · · *

9999 · · · · • 9 · 9 · • 999 9 99 9 • 9 • 9 • ·

9 · r

· •

• 99 formou odkazu v plném rozsahu), výhodně méně než z 90 % a nejvýhodněji méně než z 95 % homologní se sekvencí id. č. 2 popsanou v PCT/US98/19037 (WO99/12964) která je vložena formou odkazu v plném rozsahu). Označením, že v podstatě nereagují zkříženě se míní to, že protilátka má vazebnou afinitu k nehomolognímu proteinu menší než 10 %, výhodněji menší než 5 % a ještě výhodněji menší než 1 %, vazebné afinity k proteinu se sekvencí id. č. 2, která byla popsána ve výše zmíněné PCT/US98/19037 (WO99/12964).

Termín protilátka se v této přihlášce užívá ve významu, který zahrnuje i fragmenty protilátky, které také specificky reagují s ligandem BAFF nebo jeho receptory. Protilátky lze fragmentovat pomocí obvyklých způsobů, které jsou v oboru známy, a možnosti využití fragmentů lze pak testovat stejnými způsoby jak bylo popsáno pro celé protilátky. Tak např. fragmenty F(ab')2 je možné připravit působením pepsinu. Výsledný fragment se pak může ošetřit tak, aby se redukovaly disulfidické můstky, čímž vznikne fragment Fab' . K protilátkám podle předkládaného vynálezu dále patří bispecifické a chimérické molekuly, které mají aktivitu namířenou proti ligandu BAFF (aktivita anti-ligand BAFF) nebo proti receptorů ligandu BAFF (aktivita anti-receptor ligandu BAFF). Takže pro blokování ligandu BAFF nebo receptorů ligandu BAFF je možné využít jak monoklonálních tak polyklonálních protilátek (Ab) namířených proti ligandu BAFF, nádorovému ligandu a jejich receptorům, a také je možné užít protilátkové fragmenty jako např. Fab' nebo F(ab')₂k zablokování činnosti ligandu a příslušného receptorů.

Různé formy protilátek je možné připravit standardními technikami rekombinantní DNA (Winter a Milstein, Nátuře 349:

293-299, 1991, specificky vloženo formou odkazu). Např. je možné konstruovat takové chimérické protilátky, kde vazebná ·····«· · · ·· · · • · · · · ··· ···· » ·· · ·· · · · doména pro antigen z protilátky zvířete je spojena s lidskou konstantní doménou (Cabilly et al., patent USA č. 4 816 567). Chimérické protilátky redukují imunitní reakci vyvolanou zvířecím protilátkami, když jsou použity v klinických aplikacích u lidí.

Kromě toho rekombinantní humanizované protilátky, rozpoznávající ligand BAFF nebo jeho receptor mohou být syntetizovány. Humanizované protilátky jsou chimérické protilátky, které obsahují většinou sekvence lidského IgG, do nichž byly vloženy sekvence zodpovědné za specifickou vazbu k antigenu. Zvířata se imunizují požadovaným antigenem, pak se izoluje příslušná protilátka a odstraní se z ní část variabilního úseku zodpovědná za specifickou vazbu antigenu. Úsek vážící antigen pocházející ze zvířete se pak klonuje do vhodného místa genu lidské protilátky, ze kterého byl odstraněn úsek vážící antigen. Humanizované protilátky minimalizují použití heterologních (tj . mezidruhových) sekvencí v lidských protilátkách, a tak snižují pravděpodobnost vyvolání imunitní reakce u léčeného pacienta.

Různé třídy rekombinantních protilátek se mohou vytvářet také tak, že se připraví chimérické nebo humanizované protilátky obsahující variabilní domény a lidské konstantní domény (CH1, CH2 a CH3) izolované z různých tříd imunoglobulinů. Tak např. se mohou připravit rekombinantním způsobem protilátky se zvýšenou valencí vazebných míst pro antigen, a to tak, že se klonuje vazebné místo pro antigen do vektoru nesoucího konstantní úsek řetězce lidské protilátky (Arulandam et al., J. Exp. Med. 177: 1439-1450, 1993, zahrnuto formou odkazu).

Kromě toho lze použít standardní techniky rekombinantní DNA pro modifikaci vazebné afinity rekombinantních protilátek s jejich antigeny tím, že se změní zbytky aminokyselin • · · · · • · · · · ······ · · · · • · · · · · ·· v blízkosti vazebného místa pro antigen. Vazebná afinita pro antigen u humanizované protilátky se může zvýšit mutagenezí založenou na modelování molekul (Quenn et al. , Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 10029-33, 1989, zahrnuto formou odkazu).

Příprava analogů: Příprava modifikovaných a peptidových sekvencí

DNA sekvencí aminokyselin, ami nokys e1inovou modifikacím než

Analogy ligandu BAFF podle vynálezu se mohou lišit od přirozeně se vyskytujícího ligandu BAFF sekvencí nebo způsobem, který nezahrnuje sekvenci, nebo oběma způsoby. K jiným je modifikace sekvence patří chemická derivatizace ligandu BAFF, a to jak in vitro tak in vivo. K modifikacím nezahrnujícím změny sekvence patří změny v acetylaci, metylaci, fosforylaci, karboxylaci nebo glykosylaci, přičemž tento výčet není omezující.

K výhodným analogům ligandu BAFF patří jeho biologicky aktivní fragmenty, jejichž sekvence se liší od sekvence id. č. 2 popsané v PCT/US98/19037 (WO99/12964, která je vložena v plném rozsahu) jednou nebo několika substitucemi, delecemi nebo inzercemi aminokyselin, které nenarušují biologickou aktivitu ligandu BAFF. Ke konzervativním substitucím typicky patří substituce jedné aminokyseliny jinou aminokyselinou s podobnými vlastnostmi, např. substituce v rámci následujících skupin: valin - glycin, glycin - alanin, valin - isoleucin - leucin, kyselina asparagová -kyselina glutamová, asparagin glutamin, serin - threonin, lysin - arginin a fenylalanin tyrosin.

formou odkazu konzervat ivními ••••••· · · · · · ·

9 9 9 9 ···

9999 9 · · · ·· * · ·

Materiály a metody použité ve vynálezu

Monoklonální protilátka anti-Flag M2, biotinylovaná protilátka anti-Flag M2 a protilátka anti-Flag M2 navázaná na agarózu byly zakoupeny od firmy SIGMA. Reagencie pro buněčné kultury byly získány od firmy Life Sciences (Basel, Switzerland) a Biowhittaker (Walkersville, MD). Rozpustný lidský Flag-značený APRÍL (zbytky Kuo - L₂so) byl produkován v buňkách 293 jak bylo již popsáno (10, 11) . FITC-značené protilátky anti-CD4, anti-CD8 a anti-CDl9 byly zakoupeny od firmy Pharmingen (San Diego, CA). Kozí F(ab')2 specifická pro fragment Fc_5g lidského IgM byla zakoupena od firmy Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA) . Sekundární protilátky byly získány buďto od Pharmingen nebo od Jackson ImmunoResearch a byly použity v ředěních doporučených výrobcem.

Buňky 293 T (12) lidských embryonálních ledvin a fibroblastové buněčné linie (viz tab. 1) byly udržovány v médiu DMEM obsahujícím 10% tepelně inaktivované fetální telecí sérum (FCS). Buňky 293 T (12) lidských embryonálních ledvin byly udržovány v médiu DMEM-živná směs F12 (1:1) doplněném 2% FCS. Linie T-lymfocytů, B-lymfocytů a makrofágů (viz tab. 1) byly udržovány v médiu RPMI doplněném 10% FCS. Buňky Molt-4 byly kultivovány v médiu podle Iscoveho doplněném 10% FCS. Epitelové buněčné linie byly kultivovány v médiu MEM-alfa obsahujícím 10% FCS, 0,5 mM neesenciální aminokyseliny, 10 mM Na-Hepes a 1 mM Na-pyruvát. Buňky HUVEC byly udržovány v médiu Ml99 doplněném 2 0% FCS, 100 gg/ml epiteliálního růstového faktoru (Collaborative Research, Inotech, Dottikon, Switzerland) a 100 pg/ml sodné soli heparinu (Sigma). Všechna média obsahovala antibiotika penicilín a streptomycin. Leukocyty periferní krve (PBL) byly izolovány z heparinem ošetřené krve zdravých dospělých • · · • · · · · · • · · · · · • ······ · · • · · · · • ·· · · · · * dobrovolníků užití centrifugace v gradientu Ficoll-Paque (Pharmacia, Uppsala, Sweden) a pak byly kultivovány v médiu RPMI s 10% FCS.

T-lymfocyty byly získány rozetováním s ovčími červenými z neadherujících PBL krvinkami ošetřenými neuraminidázou a oddělením od nerozetujících buněk (hlavně

B-lymfocytů Ficoll-Paque.

a monocytů) Purifikované centrifugací v gradientu T-lymfocyty byly aktivovány 24 hodin s fytohemaglutininem (Sigma) (1 pg/ml), opláchnuty a kultivovány v RPMI s 10% FCS a 20 U/ml of IL-2. Monocyty CD14+ byly purifikovány metodou magnetického třídění buněk užitím protilátky anti-CDl4, mikroperliček potažených kozí anti-myší protilátkou a zařízení Minimacs™ (Miltenyi Biotech), a pak kultivovány v přítomnosti GM-CSF (800 U/ml, Leucomax®, Essex Chemie, Luzern, Switzerland) and IL-4 (20 ng/ml Lucerna Chem, Luzern, Switzerland) po dobu 5 dnů, pak další 3 dny s GM-CSF, IL-4 a TNF (200 U/ml, Bender, Vienna, Austria), aby se získaly CD83+, poulace buněk podobných dendritickým buňkám. Lidské B-lymfocyty v čistotě >97 % byly izolovány z periferní krve nebo pupeční kové krve pomocí magnetických perliček s anti-CDl9 (M450, Dynal, Oslo, Norway) jak bylo již popsáno (13).

Analýza Northernovým přenosem (Northern Blot)

Analýza northernovým přenosem byla provedena pomocí komerčně dostupných membrán s přenesenou RNA z lidských tkání Human Multiple Tissue Northern Blots I, II (Clontech katalog, č. 7760-1 a 7759-1). Membrány byly hybridizovány v hybridizačním roztoku (50% formamid, 2,5x Denhardtův roztok, 0,2% SDS, lOmM EDTA, 2xSSC, 50mM NaH₂PO₄, pH 6,5, 200 μg/ml sonikované DNA lososího spermatu) 2 hodiny při 60 °C. Antisense RNA sondy obsahující nukleotidy odpovídající • ······ 4 4 · • 44 · 4 4 4 · 4 · • · · 4 4 4 44 4

4······ · · ·4 4 4 • 4 ··· · 4 ·

44444 «44 44444 aminokyselinám 136 až 285 hBAFF byly tepelně denaturovány a přidány do čerstvého denaturačního roztoku v množství 2 x 10⁶cpm/ml. Membrána byla hybridizována 16 hodin v 62 °C, opláchnuta jednou ve 2xSSC, 0,5% SDS (30 minutv 25 °C) , jednou v 0,lxSSC, 0,1% SDS (20 minut v 65 °C) a pak exponována v -70 °C na rentgenový film.

Charakterizace BAFF cDNA cDNA lidského BAFF byla obsažena V několika EST klonech (např. klony č. T87299 a AA166695 v GenBank) získaných z knihoven fetálních jater a sleziny a ovariálního karcinomu. 5'-koncová část cDNA byla získána metodou 5¹-RACE-PCR amplifikace (Marathon-Ready cDNA, Clonetech, Palo Alto, CA) s oligonukleotidy API a JT1013:

(5'-ACTGTTTCTTCTGGACCCTGAACGGC-3') [SEKVENCE ID. Č. 9] užitím dodané cDNA knihovny ze sloučených lidských leukocytů jako templátu, jak bylo doporučeno výrobcem. Výsledný PCR produkt byl klonován do vektoru PCR-0 blunt (Invitrogen, NV Leek, The Netherlands) a pak subklonován jako EcoRl/Pstl fragment do vektoru pT7T3 Pac (Pharmacia) obsahujícího EST klon T87299. cDNA hBAFF plné délky byla tedy získána kombinací 5' a 3' fragmentů s využitím vnitřního místa Pstl v BAFF. Sekvenci bylo v databázi GenBank přiřazeno přístupové číslo AF116456.

Částečná sekvence myšího BAFF velikosti 617 bp byla obsažena ve dvou částečně se překrývajících EST klonech (AA422749 a AA254047). PCR fragment zahrnující nukleotidy 158 až 391 této sekvence byl použit jako sonda pro screening cDNA knihovny z myší sleziny (Stratagene, La Jolla, CA).

•· * ······ ·» • · ·· ···· ····«· · · · · · 9 · · · · 9 ·

Exprese rekombinantního BAFF hBAFF plné délky byl amplifikován užitím oligonukleotidů JT1069:

(5'-GACAAGCTTGCCACCATGGATGAGTCCACA-3') [SEKENCE ID. Č. 10] a JT637:

(5'-ACTAGTCACAGCAGTTTCAATGC-3'[SEKVENCE ID. Č. 11].

Produkt PCR byl klonován do vektoru PCR-0 blunt a znovu subklonován jako HindlII/EcoRI fragment do savčího expresního vektoru PCR-3. Krátká verze rozpustného BAFF (aminokyseliny Q136-L285) byla amplifikována užitím oligonukleotidů JT636:

(5'-CTGCAGGGTCCAGAAGAAACAG-3' [SEKVENCE ID. Č. 12] a JT637.

Dlouhá verze rozpustného BAFF (aminokyseliny L83 L285) byla získána z BAFF plné délky využitím vnitřního Pstl místa. Rozpustný BAFF byl znovu subklonován jako Pstl/EcoRI fragment za signální peptid hamaglutininu a sekvenci Flag do modifikovaného vektoru PCR-3, a jako Pstl/Spel fragment do modifikovaného bakteriálního expresního vektoru pQEl6 v souladu se čtecím rámcem s N-koncové sekvence Flag(14). Konstrukty byly sekvencovány z obou stran. Založení stabilních linií buněk 293 exprimujících krátkou rozpustnou formu BAFF nebo BAFF plné délky a exprese a purifikace rekombinantního rozpustného BAFF z baktérií a savčích buněk 293 byla provedeno jak již bylo popsáno (14, 15).

PCR spřažená s reverzní transkripcí

Celková RNA extrahovaná z T-lymfocytů, B-lymfocytů, nezralých dendritických buněk získaných in vitro, buněk 293 divokého typu a 293-BAFF (plné délky) byla reverzně transkribována užitím systému Ready to Go (Pharmacia) podle • ·»··«· «· • · · · · ····

9999999 99 99 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9999 9 99 9 99 999 instrukci výrobce. CDNA pro BAFF a β-aktin byly detekovány pomocí PCR amplifikace s Taq DNA polymerázou (kroky vždy po 1 minutě v 94°C, 55°C a 72°C, 30 cyklů) užitím oligonukleotidových primerů specifických pro 5'-GGAGAAGGCAACTCCAGTCAGAAC-3' [SEKVENCE ID. Č

BAFF: TT1322: 13] a JT1323:

5'-CAATTCATCCCCAAAGACATGGAC-3' [SEKVENCE ID. Č. 14];

a specifických pro alfa-řetězec receptoru IL-2: TT1368:

5¹-TCGGAACACAACGAAACAAGTC-3' [SEKVENCE ID. Č. 15] a JT1369:

5'-CTTGTCCTTCACCTGGAAACTGACTG-3' [SEKVENCE ID. Č. 16];

pro β-aktin: 5'-GGCATCGTGATGGACTCCG-3' [SEKVENCE ID. Č. 17] a 'GCTGGAAGGTGGACAGCGA-3 ' [SEKVENCE ID. Č. 18].

Gelová permeační chromatografie

Buňky 293T byly přechodně transfekovány krátkou formou rozpustného BAFF a kultivovány v médiu Optimem bez séra po 7 dnů. Kondiciované supernatanty byly koncentrovány 2 0x, smíchány s vnitřním standardem katalázou a ovalbuminem a naneseny na kolonu Superdex-200 HR10/30. Proteiny byly eluovány PBS při průtoku 0,5 ml/min a frakce (0,25 ml) byly precipitovány trichloroctovou kyselinou analyzovány Westernovým přenosem užitím protilátky anti-Flag M2. Kolona byla kalibrována standardními proteiny: ferritin (440 kDa), kataláza (232 kDa), aldoláza (158 kDa), hovězí sérový albumnin (67 kDa), ovalbumin (43 kDa), chymotrypsinogen A (25 kDa) a ribonukleáza A (13.7 kDa).

Ošetření působením enzymu PNGase F

Vzorky byly zahřátý ve 20 μΐ 0,5% SDS, 1%

2-merkaptoethanol 3 minuty v 95°C, pak ochlazeny, a byl • · · · • · • tttt «· · · · · · • · · ♦ · · · · · tttt····· tttt tttt tt tt • tt · · · · · · • tttttt tt tttt · · · ··· přidán 10% Nonidet P-40 (2 μΐ) , 0,5 M fosforečnan sodný, pH

7,5 (2 μΐ) a Peptid N-glykanáza F (125 jednotek/μΙ, 1 μΐ, kontroly bez enzymu). Vzorky byly inkubovány 3 hodiny ve 37°C před analýzou Westernovým přenosem.

Edmanovo sekvencování

Buňky 2 93T byly přechodně transfekovány dlouhou formou rozpustného BAFF a kultivovány v médiu Optimem bez séra po 7 dnů. Kondiciované supernatanty byly koncentrovány 2 0x, frakcionovány na SDS-PAGE a přeneseny na polyvinylidendifluoridovou membránu (BioRad Labs, Hercules, CA) jak bylo již dříve popsáno (16), a pak byly sekvencovány na zařízení pro sekvencování v plynné fázi ABI 120A (Perkin Elmer, Foster City, CA) spojeném s analyzátorem ABI 120A, (Perkin Elmer) vybaveným fenylthiohydantoinovou kolonou Cl 8 2,1 x 250 mm. Data byla analyzována užitím softwaru ABI 610 (Perkin Elmer).

Protilátky

Polyklonální protilátky byly připraveny imunizací králíků (Eurogentec, Seraing, Belgium) rekombinantním rozpustným BAFF. Slezina potkanů imunizovaných stejným antigenem byla fúzována s buňkami x63Ag8.653 myšího myelomu a hybridomy pak byly testovány na BAFF-specifické IgG. Jedna z těchto protilátek, a sice 43.9, byl imunoglobulin IgG2a specificky rozpoznávající hBAFF.

Buňky byly obarveny v 50 μΐ FACS pufru (PBS, 10% FCS, 0,02% NaN₃) s 50 ng (nebo uvedeným množstvím) krátké formy rozpustného hBAFF značeného Flag po 20 min ve 4°C a pak anti-Flag M2 (1 pg) a sekundární protilátkou. Monoklonální protilátka Anti-BAFF 43.9 byla použita v množství 40 pg/ml. Pro dvoubarevnou FACS analýzu byly lymfocyty periferní krve • 4

• 44 4 4

4 4 4 · • »····· · ·

4 4 · ·

4444 4 44 4 obarveny rozpustným BAFF/dlouhý značeným Flag (2 μg/ml), po kterém následovala biotinylovaná anti-Flag M2 (1/400) a PE-značený streptavidin (1/100), a nakonec buďto FITC-značená anti-CD4, anti-CD8 nebo anti-CDl9.

Proliferační test PBL

Leukocyty periferní krve byly inkubovány v 96jamkových destičkách (10⁵ buněk/jamka ve 100 μΐ RPMI s 10% FCS) 72 hodin buďto bez nebo se 2 pg/ml kozí protilátky proti lidskému μ-řetězci (SIGMA) nebo kontrolní F(ab')₂a s uvedenou koncentrace nativního nebo povařeného rozpustného BAFF/dlouhý. Buňkám byl podán pul z [³H] thymidinu (1 pCi/jamka) dalších 6 hodin a pak byly buňky sklizeny. Inkorporace [³H] thymidinu byla monitorována kapalinovým scintilačnim počítačem. V některých pokusech byl rekombinantní rozpustný BAFF nahrazen buňkami 293 trvale transfekovanými BAFF plné délky (nebo buňkami 293 divokého typu jako kontrola), které byly fixovány 5 minut v 1% paraformaldehydu ve 25 °C. Test byl proveden jak bylo již dříve popsáno (17) . V dalších pokusech byly z PBL izolovány buňky CD19+ pomocí magnetických perliček a zbývající buňky CD19- byly ozářeny (3000 rad) před rekonstituci s buňkami CD19+. Proliferační test s sBAFF byl proveden stejně jak bylo popsáno výše.

Test aktivace B-lymfocytů

Purifikované B-lymfocyty byly aktivovány v systému EL-4 kultury, jak bylo již popsáno dříve (13).

Stručně popsáno, 10⁴ B-lymfocytů bylo smícháno s 5 x 10⁴ ozářených buněk z thymu myši (klon B5) a kultivováno 5 až dnů ve 200 μΐ média obsahujícího 5 %(obj.) supernatantů • · ♦ · · 4 ♦ ·

4 4

4 4 4 • 4« 44 · 44 4

44·«··· 4 4 ·· · *

4 « 4 · 4 4 4 ···· 4 44 » 44 44« z kultury lidských T-lymfocytů (10⁶/ml), které byly aktivovány 48 hodin PHA (1 μ9/ιη1) nebo PMA (1 ng/ml) . B-lymfocyty pak byly znovu izolovány pomocí anti-CDl9 perliček a kultivovány dalších 7 dnů (5 x 10⁴ buněk ve 2 00 μΐ, dvě nebo tři opakování kultury na 96jamkových destičkách s plochým dnem) v samotném médiu nebo v médiu s 5% supernatantem T-lymfocytů, nebo s 50 ng/ml IL-2 (dar od Glaxo Institute for Molecular Biology, Geneva) a 10 ng/ml IL-4 a IL-10 (Peprotech, London, UK) , a sice za přítomnosti nebo absence sBAFF. Protilátka anti-Flag M2 byla přidána v koncentraci 2 μg/ml a sama neměla žádný účinek. IgM, IgG a IgA byly kvantitativně stanoveny v supernatantech z kultur metodou ELISA, jak již bylo popsáno (13).

Lidský BAFF byl identifikován jakožto možný nový člen rodiny TNF ligandů na základě sekvenční homologie screeningem veřejně přístupných databází užitím zlepšeného vyhledávacího profilu (18). CDNA kódující úplný protein velikosti 285 aminokyselin (aa) byla získána kombinací EST klonů (pokrývajících 3-koncový úsek) s fragmenty amplifikovánými pomocí PCR (5'-koncový úsek). Absence signálního peptidu vede k domněnce, že BAFF je membránový protein typu II, což je typické pro ligandy rodiny TNF. Protein má predikovanou cytoplazmatickou doménu 46 aa, hydrofóbní transmembránový úsek a extracelulámí doménu z 218 aa obsahující dvě potenciální místa pro N-glykosylaci (viz obr. 1A) . Sekvence extracelulámí domény BAFF vykazuje nejvyšší homologii s APRIl (33% aminokyselinová identita, 48% homologie), zatímco identita s ostatními členy rodiny jako je TNF, FasL, LTa, TRAIL nebo RANKL je menší než 20% (viz obr. 1B, C). Myši klon cDNA izolovaný z knihovny ze sleziny kóduje mírně delší protein (309 aa) obsahující inzerci mezi transmembránovým • « • · · · úsekem a prvním z několika β-řetězců, které vytvářejí vazebnou doménu pro receptor u všech členů rodiny TNF ligandů (19) . Tato ektodoména bohatá na β-řetězce je téměř identická u myšího a lidského BAFF (86% identita, 93% homologie), což ukazuje, že gen BAFF je v evoluci silně konzervativní (viz obr. 1A).

bylo zjištěno, velikosti 32 kDa

Ačkoliv členy TNF rodiny jsou syntetizovány jakožto ligandy vložené do membrány, často je pozorováno štěpení v oblasti stonku mezi transmembránovou doménou a vazebnou doménou pro receptor. Tak např. TNF nebo FasL jsou odštěpeny z buněčné povrchu působením metaloproteináz (20, 21). Při produkci různých forem rekombinantního BAFF v buňkách 293T že rekombinantní rozpustná forma BAFF (aa 83-285, sBAFF/dlouhý), obsahující kromě vazebné domény pro receptor úplný úsek stonku a N-koncovou značku Flag, byla extenzivně opracovávána na malé fragmenty 18 kDa (viz obr. 2A,B) . Ke štěpení docházelo v úseku stonku, neboť. fragmenty byly detekovatelné pouze protilátkami namířenými proti kompletní doméně interakce s receptorem, ale nikoliv anti-Flag protilátkami (data nejsou ukázána). Bylo také zjištěno, že pouze N124 (lokalizovaný v úseku stonku) byl glykosylován, a nikoliv N242 (lokalizovaný na počátku F^-listu), jelikož molekulová hmotnost neopracovaného sBAFF/dlouhý byla snížena ze 32 kDa na 30 kDa odstraněním N-vázaných cukrů po ošetření PNGázou F, zatímco vyštěpený 18 kDa fragment byl k tomuto působení necitlivý. Analýza sekvence peptidů 18 kDa skutečně ukázala, že ke štěpení A134 (ibr. 1A). R133 leží na konci který ke konzervativní pro člověka (R-N-K-R) a myš (R-N-R-R). K otestování toho, zda štěpení nebylo pouhým artefaktem při expresi rozpustné, přirozeně se nevyskytující formy BAFF, byl BAFF plné délky, vázaný na dochází mezi R133 a polybazického úseku,

membránu, exprimován v buňkách 293T (obr. 2C) . Úplný BAFF velikosti 32 kDa a také několik molekul s vyšší molekulovou hmotností (zřejmě šlo o nedisociované dimery a trimery) bylo pozorováno v buněčných extraktech, ale více než 95 % BAFF získaného ze supernatantu. odpovídalo opracované formě velikosti 18 kDa, což ukazuje, že BAFF je opracováván i když je syntetizován jako ligand vázaný na membránu.

Byl zkonstruován rozpustný BAFF (Q136-L285, sBAFF/krátký), jehož aminokyselinová sekvence začíná 2 aa downstream od místa štěpení (obr. 1 B) . Jak bylo predikováno, Flag-značka navázaná na N-konec této rekombinantni molekuly nebyla odstraněna (data neuvedena), což umožnilo její purifikací užitím afinitní kolony s anti-Flag. Pro ověření správného složení (prostorové struktury) byl purifikovaný sBAFF/krátký analyzován gelovou filtrací, kdy se eluoval protein se zjevnou molekulovou hmotností 55 kDa (obr. 2D) . To, že sBAFF/krátký se správně uspořádal do homotrimeru (3 x 20 kDa) je v souladu s kvartérní strukturou ostatních členů TNF rodiny (19). Nakonec neopracovaný sBAFF/dlouhý byl lehce exprimován v baktériích, což ukazuje, že štěpení je specifické pro eukaryotické buňky.

Northernová analýza BAFF ukázala, že BAFF mRNA velikosti 2,5 kb se vyskytovala ve velkém množství ve slezině a PBL (obr. 3A) . V thymu, srdci, placentě, tenkém střevu a plicích byla jen slabá exprese. Tato omezená distribuce vede k předpokladu, zdrojem BAFF. je přítomna pocházej ících B-lymfocytech že buňky v lymfatických tkáních jsou hlavním Pomocí PCR analýzy bylo zjištěno, že BAFF mRNA v T-lymfocytech a dendritických buňkách z monocytů periferní krve, ale není v (obr. 3B) . Dokonce naivní, nestimulované

T-lymfocyty exprimují alespoň nějakou BAFF mRNA.

• · · · φφφφ φ φ

V databázi bylo nalezeno místo se sekvenční adresou (sequence tagged site, STS, SHGC-36171) obsahující lidskou sekvenci BAFF. Toto místo leží na lidském chromozómu 13, v intervalu délky 9 cM mezi markéry D13S286 a D13S1315. Na cytogenetické mapě tento interval odpovídá 13q32-34. Ze známých členů rodiny TNF ligandů byl pouze RANKL (Trance) lokalizován na tomto chromozómu (22), i když značně vzdálen od BAFF (13ql4).

Aby mohl ligand maximálně projevit své biologické účinky, je pravděpodobné, že receptor BAFF(BAFF-R) bude exprimován na stejných nebo sousedních buňkách přítomných v lymfatické tkáni. Užitím rekombinantního sBAFF jakožto nástroje ke specifickému stanovení exprese BAFF-R pomocí FACS byly skutečně zjištěny vysoké hladiny exprese receptorů v různých liniích B-lymfocytů jako jsou buňky Ráji Burkittova lymfomu a buňky BJAB (obr. 4A, tab. 1) . Naproti tomu buněčné linie T-lymfocytů, fibroblastového, epitelového a endotelového původu, byly všechny negativní. Velmi slabé obarvení bylo pozorováno u linie monocytů THP-1, což však může být způsobeno vazbou na Fc receptory. Takže se zdá, že exprese BAFF-R je omezena na linie B-lymfocytů. Dvě testované myší linie B-lymfocytů byly negativní při užití lidského BAFF jako sondy, ačkoliv slabá vazba byla pozorována u myších splenocytů (data neuvedena). Přítomnost BAFF-R na B-lymfocytech byla podpořena analýzou lymfocytů periferní krve a pupečníkové krve. Zatímco T-lymfocyty CD8+ a CD4+ postrádají BAFF-R (obr. 4B, ostatní data neuvedena), silné obarvení bylo pozorováno na B-lymfocytech CD19+ (obr. 4A a 4B) , což ukazuje, že BAFF-R je exprimován na všech B-lymfocytech v krvi, včetně naivních a paměťových B-lymfocytů.

·· · · ·« • · ·

Jelikož je BAFF vázaný na B-lymfocyty pocházející z krve, byly provedeny pokusy ke zjištění, zda je ligand schopen přenášet signály pro stimulaci nebo inhibici růstu. Lymfocyty periferní krve (PBL) byly stimulovány anti-IgM (μ) protilátkami společně s fixovanými buňkami 293 trvale exprimujícími povrchový BAFF (obr. 5A) . Hladina inkorporace [³H]thymidinu indukovaná samotnou anti-μ se nezměnila v přítomnosti kontrolních buněk, ale byla dvakrát zvýšena v přítomnosti buněk transfekovaných BAFF (obr. 5B). Byla pozorována také na dávce závislá proliferace B-lymfocytů, když byly buňky transfekované BAFF nahrazeny purifikovaným sBAFF (obr. 5C) , což ukazuje na to, že BAFF nevyžaduje uchycení v membráně, aby mohl projevit svou aktivitu. V tomto experimentálním uspořádání proliferace indukovaná sCD40L vyžadovala koncentrace přesahující 1 μg/ml, ale byla méně závislá na přítomnosti anti-μ, než zprostředkovaná BAFF (obr. 5D). Když byly purifikované B-lymfocyty CD19+ kokultivovány s ozářenými autologními CD19-PBL, kostimulace proliferace nebyla BAFF ovlivněna, což ukazuje, že příjem [³H]thymidinu byl způsoben hlavně proliferací B-lymfocytů a nikoliv nepřímou stimulací buněk jiného typu (data neuvedena). Pozorovaná odpověď proliferace B-lymfocytů na BAFF byla plně závislá na přítomnosti anti-μ protilátek, což ukazuje, že BAFF působí jako kostimulátor proliferace B-lymfocytů.

Pro výzkum možných účinků BAFF na sekreci imunoglobulinu byly purifikovné B-lymfocyty z periferní krve nebo pupečníkové krve preaktivovány kokultivací s T-lymfocyty EL-4 v přítomnosti směsi cytokinů ze supernatantů T-lymfocytů stimulovaných ΡΗΆ/ΡΜΆ (23) . Tyto B-lymfocyty byly znovu izolovány v čistotě 98 % a v přítomnosti BAFF a cytokinů z aktivovaných T-lymfocytů vykazovaly dvojnásobné zvýšení

• 0 · 0 0 · 0 0 0 0 9 0 0 0

0009 · 090

v sekreci Ig v sekundární kultuře při srovnání s cytokiny samotnými. Velmi slabý účinek byl pozorován v nepřítomnosti exogenních cytokinů, a mírný účinek (1,5 x) byl pozorován v přítomnosti rekombinantních cytokinů IL-2,IL-4 a IL-10 (obr. 5E, F).

Biochemická analýza BAFF je také v souladu s typickou homotrimerní strukturou členů TNF rodiny. BAFF vykazuje nejvyšší homologii v této rodině ligandů s APRÍL, který byl nedávno původci charakterizován jako ligand stimulující růst různých nádorových buněk (11) . Na rozdíl od TNF a LTp, což jsou členové se stejně velkou homologii (33 %) a jejichž geny jsou na chromozómu 6, APRÍL a BAFF nejsou shromážděny na stejném chromozómu. APRÍL je lokalizován na chromozómu 17 (J.L.B., nepublikováno) a BAFF leží na distálním ramenu chromozómu 13 (13q34). Abnormality v tomto lokusu byly charakterizovány u Burkittova lymfomu jako druhý nej častější defekt (24) vedle translokace genu myc do Ig lokusu (25) . Vezme-li se v úvahu vysoká hladina exprese BAFF-R na všech analyzovaných buněčných liniích Burkittova lymfomu (viz tab. 1) , vyvolává to zajímavou možnost, že u některých Burkittových lymfomů mohlo dojít k deregulaci exprese BAFF a tím ke stimulaci růstu autokrinním způsobem.

Role B-lymfocytů specifických k antigenu v průběhu různých stadii imunitní reakce je silně závislá na signálech od pomocných T-lymfocytů a antigen prezentujících buněk,jako jsou dendritické buňky, a kontaktech s nimi (20). B-lymfocyty dostávají tyto signály nejdříve na počátku nebo v průběhu imunitní reakce, kdy vstupují do interakce s T-lymfocyty na okrajích folikulů B-lymfocytů v lymfatických tkáních, což vede k jejich proliferaci a diferenciaci na buňky vytvářející protilátky s nízkou afinitou (18). Současně některé antigenně-specifické B-lymfocyty také migrují do folikulů

4 4 »44444 4 4

4 4 4 4 4 4 4 4

44 44 4 4 4 4 4 4 4

4 *44 44

4*44 4 444 444

B-lymfocytů a přispívají tak k vytváření germinálních center, dalších míst, kde B-lymfocyty proliferují, ale také afinitně dozrávají a vytvářejí paměťové B-lymfocyty a vysokafinitní plazmatické buňky (19). Bylo prokázáno, rodiny TNF, a sice že signály spouštěné dalším členem CD40L, jsou kritické pro funkci

B-lymfocytů v mnohých krocích imunitní reakce závislé na

T-lymfocytech. Avšak interakce CD40L/CD40 několik studií jasně ukázalo, že nezodpovídá za všechnu pomoc pro B-lymfocyty ze strany na kontaktu závislých T-lymfocytů. A skutečně, T-lymfocyty deficitní na CD40L izolované z knock-out myší (s vyřazenou funkcí příslušného genu) nebo pacientů s syndromem hyper-IgM vázaným na X byly schopny úspěšně indukovat proliferaci B-lymfocytů a jejich diferenciaci na plazmatické buňky. Studie s užitím blokujících protilátek proti CD40L ukázaly, že podskupina B-lymfocytů pozitivních na povrchový IgD, izolovaných z lidských tonsil, proliferuje a diferencuje se v reakci na aktivované T-lymfocyty, a to způsobem nezávislým na CD40. Bylo ukázáno, že i další členy TNF rodiny, jako je např. TNF vázaný na membránu a CD30L, se podílejí na stimulaci B-lymfocytů nezávislé na CD40 a povrchových Ig. Podobně jako výsledky s BAFF, bylo také ukázáno, že B-lymfocyty deficitní na CD40 mohou být stmulovány k proliferaci a diferenciaci na plazmatické buňky pomocnými T-lymfocyty, dokud jsou současně spouštěny povrchové Ig receptory. BAFF stejně jako CD30L a CD40L je exprimován T-lymfocyty, ale jeho originalita spočívá v expresi dendritickými buňkami a také ve vysoce specifické lokalizaci receptoru BAFF na B-lymfocytech, na rozdíl od CD40, CD30 a TNF receptorů, jejich exprese byla popsána u mnoha různých buněk. Tato pozorování podporují nezávislou a specifickou funkci na B-lymfocytech indukovanou BAFF.

»9 99 » 9

9 9 « 9 9

999 99 9 99 9

9999999 99 99 9 9

9 999 999 •999 9 99 9 99 9*9

Bylo zjištěno, že BAFF kostimuluje proliferaci B-lymfocytů z krve a současně zesíúuje receptory B-lymfocytů, a to nezávisle na CD40 signalizaci, což podporuje úlohu BAFF v indukci růstu a zrání B-lymfocytů indukovaných T-lymfocyty a dendritickými buňkami. Kromě toho při použití B-lymfocytů pozitivních na CD19 diferencujících se in vitro na preplazmatické buňky/GC-podobné B-lymfocyty (14) byl pozorován kostimulační účinek BAFF na sekreci Ig B-lymfocyty v přítomnosti supernatantu z aktivovaných T-lymfocytů nebo směsi IL-2, IL-4 a IL-10. Je zajímavé, že kostimulační účinek byl silnější v přítomnosti supernatantu z aktivovaných T-lymfocytů než v přítomnosti směsi cytokinů, což vede k představě, jsou zde další rozpustné faktory secernované aktivovanými T-lymfocyty, které se podílejí na produkcí protilátek se synergickým účinkem s BAFF nebo BAFF samotného. Je tudíž možné, že BAFF aktivně přispívá k diferenciaci těchto GC-podobných B-lymfocytů na plazmatické buňky.

Je jasné, že BAFF poskytuje in vitro signál jak naivním B-lymfocytům tak i GC-určeným B-lymfocytům. Zda se toto pozorování projevuje v průběhu normální imunitní reakce nebo ne, je třeba vyzkoumat ve vhodných in vivo experimentech.

Biologické reakce indukované BAFF u B-lymfocytů jsou odlišné od reakcí na CD40L, neboť proliferace vyvolaná CD40L je méně závislá na kostimulaci anti-μ (17)(viz také obr. 5D). kromě toho CD40L může působit proti apoptickým signálům v B-lymfocytech po interakci s receptory B-lymfocytů (29) , zatímco BAFF není schopen zachránit B-lymfocyty linie Ramos od apoptózy zprostředkované anti-μ, přestože buňky Ramos exprimují BAFF-R (tab. 1; F. M. a J. L. B., nepublikovaná pozorování) . Je tudíž pravděpodobné, že CD40L a BAFF plní odlišné funkce. V této souvislosti stojí za povšimnutí, že BAFF nereaguje s žádným ze 16 testovaných rekombinantních «< 0090 • 0 0

000 0« 0 0000

090 90 0 90 0

9000009 9« 0* 0 9

0 99« 909

0900 0 90 9 09909 receptorů rodiny TNF včetně CD40 (P.S. a J.T., nepublikovaná pozorování).

Růst B-lymfocytů byl účinně kostimulován rekombinantním rozpustným BAFF postrádajícím transmembránovou doménu. Tato aktivita byla v kontrastu s několika jinými členy rodiny TNF, které jsou aktivní pouze jako ligandy vázané na membránu jako např. TRAIL, FasL a CD40L. Rozpustné formy těchto ligandů mají malou biologickou aktivitu, která může být zvýšena jejich zesítěním, což napodobí ligandy vázané na membránu (15) . Naproti tomu zesítění Flag-značeného sBAFF s anti-Flag protilátkami nebo použití membránově vázaného BAFF epxrimovaného na povrchu epitelových buněk nezvyšuje již mitogenní aktivitu BAFF, což naznačuje, že působí systémově jako secernovaný cytokin, podobně jako TNF. To je v souladu s pozorováním, že polybasická sekvence přítomná ve stonku BAFF působí jako substrát pro proteázy. Podobné polybasické sekvence se také vyskytují v odpovídající lokalizaci jak APRÍL tak TWEAK, přitom pro oba existují důkazy o proteolytickém opracování proteinu (30) (N.H. a J.T., nepublikovaná pozorování). Přestože protáza zodpovědná za takové štěpení ještě nebyla nalezena, je nepravděpodobné, že by to byla metataloproteináza zodpovědná za odštěpení membránově vázaného TNF, jelikož se jejich preferenční sekvence úplně liší (21) . Multibasické motivy v BAFF (R-N-K-R), APRÍL (R-K-R-R) a Tweak (R-P-R-R) připomínají minimální signál pro štěpení furinu (R-X-K/R-R), který je prototypem rodiny proproteinkonvertáz (31).

Při realizaci předkládaného vynálezu, pokud není výslovně uvedeno jinak, byly užity obvyklé metody buněčné biologie, buněčných kultur, molekulární biologie, mikrobiologie, rekombinantní DNA, proteinové chemie a imunologie, které jsou odborníkům známy. Tyto metody byly ·· ···· • · ·» · • » · » » · ··*· • * · • · · ·· φ

Α · 9 • *

Α· ♦ popsány v odborné literatuře. Viz např. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition. (Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, Volumes I and II (D.N. Glover, ed.), 1985; Oligonucleotide Synthesis, (M.J. Gait, ed.), 1984; U.S. Patent 4,683,195 (Mullis et al.); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames and S.J. Higgins, eds.), 1984; Transcription and Translation (B.D. Hames and S.J. Higgins, eds.), 1984; Culture of Animal Cells (R.I. Freshney, ed) . Alan R. Liss, lne., 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984; Methods in Enzymology, Volumes 154 and 155 (Wu et al., eds), Academie Press, New York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos,eds.), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds.), Academie Press. London, 1987; Handbook of Experiment Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.), 1986; Manipulating the Mouše Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986.

Následující příklady slouží k ilustraci vynálezu a nijak předkládaný vynález neomezují.

Příklady provedení vynálezu

V příkladech 1 až 6 byly použity experimentální postupy, které budou v následující části popsány.

• « • · · ·

Konstrukt DNA pro přípravu transgenní myši s myším BAFF (BAFF Tg myš)

Jak lidská tak i myší sekvence cDNA byly již popsány (Schneider et al. , 1999). PCR fragment kódující úplný myší BAFF byl připraven metodou RT-PCR. První řetězec cDNA byl syntetizován z polyA+ RNA z plic myši (Clontech, Palo Alto, CA) užitím oligo dT podle pokynů výrobce (GibcoBRL, Grand Island, NY) . Reakční směs pro obsahovala 1 x Pfu buffer (Stratagene, La Jola, CA), 0,2 mM dNTPs, 10% DMSO, 12,5 pM primery, 5 jednotek Pfu enzymu (Stratagene) a následující oligonukleotidové primery obsahující restrikční místo Notl:

5¹-TAAGAATGCGGCCGCGGAATGGATGAGTCTGCAAA-3' [SEK. ID. Č. 19] a 5'-TAAGAATGCGGCCGCGGGATCACGCACTCCAGCAA-3' [SEK.ID. Č. 20].

Templát byl amplifikován ve 30 cyklech : 94°C, 1 minuty, 54 °C, 2 minuty a 72°C, 3 minuty, po kterých následovala 10 minut extenze ve 72°C. Tato sekvence odpovídá nukleotidům 214 až 1171 sekvence AF119383 v GenBank. PCR fragment byl štěpen enzymem Notl a pak klonován do modifikovaného vektoru pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad,CA). Fragment obsahující myší BAFF byl vyštěpen enzymemm Xbal, aby bylo možné vložit sekvenci polyA místa z SV40. Tento fragment byl pak klonován vektoru založeného na pUC, kam byla připojena také promotorové sekvence. Promotor, tupý fragment BglII-Notl obsahující lidský ApoE enhancer a promotor AAT (alfa anti-trypsin) byl purifikován z plazmidu klonu 540B (laskavý dar od Dr. Katherine Parker Ponder, Washington University, St. Louis, MO) . Fragment EcoRV/BglII byl purifikován z výsledného vektoru a použit k vytvoření transgenní myši. Injikované potomstvo myší z křížení samice CS7BL6J x samec DBA/2J Fl (BDFI) bylo zpětně kříženo s myšmi CS7BL/6. Techniky mikroinjekcí a příprava transgenních myší byly již dříve popsány (Mcknights et al., 1983).

·· · ·

Analytické metody

Vzorky séra byly analyzovány redukující SDS-PAGE na lineárním 12,5% gelu. Celková RNA z myších jater byla připravena a analyzována Northernovým přenosem užitím izolační soupravy od firmy Promega (Madison, WI) podle pokynů výrobce. mRNA specifická pro transgen BAFF byla detekována užitím sondy zahrnující SV4O póly A konec transgenního konstruktu a byla získána štěpením modifikovaného vektoru pCEP4 Xbal a BamHI. Sonda rozpoznávala pás velikosti 1,8 až 2 Kb odpovídající mRNA transgenu BAFF. PCR analýza DNA z ocasu BAFF Tg myši (myš transgenní na BAFF) byla provedena užitím 12,5 pM následujících oligonukleotidových primerů:

5'-GCAGTTTCACAGCGATGTCCT-3¹ [SEKVENCE ID. Č. 21] a

5'-GTCTCCGTTGCGTGAAATCTG-3' [SEKVENCE ID. Č. 22] v reakci obsahující IX Taq polymerázový pufr (Stratagene), 0,2 nM dNTPs, 10% DMSO a 5 jednotek Taqpolymerázy (Stratagene) . Úsek 719 bp z transgenu byl amplifikován v 35 cyklech: 94°C, 30 sekund, 54 °C, 1 minuta a 72°C, 1,5 minuty, následovaných extenzí 10 minut v 72°C.

Přítomnost proteinu v moči myší byla měřena užitím detekčních proužků Multistix 10 SG pro analýzu moči (Bayer Corporation, Diagnostics Division, Elkhart, IN).

Analýza Cell-dyne a cytofluorimetrická analýza (FACS)

Diferenciální počty bílých krvinek (WBC) v čerstvé krvi s EDTA jako antikoagulans byly stanoveny užitím zařízení Abbott Cell Dyne 3500 (Chicago, II.) . Pro FACS analýzu byly použity potkanní anti-myší protilátky značené fluoresceinem (FITC), Cy-chrom- a fykoerythrinem (PE): anti-B220, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD43, anti-IgM, anti-CDS, anti-CD2S, anti-CD24, anti-CD38, anti-CD2l, anti-CD44, anti-L-selektin a souprava křečci anti-Bcl-2/kontrolní křeččí Ig byl zakoupen od firmy Pharmingen (San Diego, CA).

Příprava myších a lidských BAFF značených Flag v rekombinantních E. coli nebo savčích buňkách byla již dříve popsána (Schneider et al., 1999). Všechny protilátky byly použity podle instrukcí výrobce: PBL byly purifikovány z krve myší následujícím postupem: Krev byla odebrána do mikrozkumavek obsahujících EDTA a 1/2 naředěna PBS. 500 μΐ naředěné krve se pak naneslo na vrchol 1 ml Ficollu (Celardane, Hornby, Ontario, Canada) ve 4ml skleněných kyvetách a gradient byl připraven při 2 000 rpm po 3 0 minut při teplotě místnosti, mezifáze obsahující lymfocyty byla odebrána a dvakrát promyta PBS před barvením pro FACS.

Slezina, kostní dřeň a mezenterické lymfatické uzliny byly rozdrceny na suspenze jednotlivých buněk v médiu RPMI (Life Technologies, lne., Grand Island, NY) promyty pufrem FACS (PBS s 2% fetálním telecím sérem (JRH Biosciences, Lenexa, KS) ) . Buňky byly nejdříve resuspendovány ve FACS pufru doplněném o následující blokující činidla: 10 μg/ml lidského Ig (Sandoz, Basel, Switzerland) a 10 μg/ml anti-myší Fc blokující protilátky (Pharmingen), a pak inkubovány 30 minut na ledu před barvením pomocí fluorochromem značených protilátek. Všechny protilátky byly naředěny FACS pufrem s blokujícími činidly popsaným výše. Vzorky byly analyzovány cytofluorometrem FACScan (Becton Dickinson).

Detekce celkového Ig myší a revmatoidního faktoru v myším séru pomocí ELISA testu

ELISA destičky (Corning glass works, Corning, NY) byly potaženy kozí protilátkou anti-myší celkový Ig (Southern

Biotechnolog Associates, lne. Birmingham, AL) při inkubaci • · • · · • ···· » přes noc ve 4 °C v roztoku 10 μ9/πι1 této protilátky v 50mM bikarbonátovém pufru pH 9,6. Destičky byly třikrát opláchnuty v PBS/0,1% Tween a blokovány inkubací přes noc v 1% roztoku želatiny v PBS. Na destičku se přidalo 100 μΐ/jamka sériového nebo standardního ředění séra na 30 minut při 37 °C. Myší Ig byl detekován užitím 100 μΐ /jamka roztoku 1 μg/ml protilátky anti-myší celkový Ig značené alkalickou fosfatázou (AP) (Southern Biotechnolog Associates, lne. Birmingham, AL) . Po třech opláchnutích v PBS/0,1% Tween byla vyvolán enzymatická reakce užitím 10 μg/ml p-nitrofenylfosfátu (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) v 10% diethanolaminu. Reakce byla zastavena přidáním 100 μΐ 3N NaOH/jamka. Optická denzita (O.D.) byla měřena při 405 nm spektrofotometrem od firmy Molecular Devices (Sunnyvale, CA) . Standardní křivky byly připraveny pomocí purifikovaného myšího Ig získaného od firmy Southern Biotechnology Associates. V případě detekce revmatoidního faktoru (RF) byly destičky potaženy normálním kozím Ig Ig (Jackson ImmunoResearch laboratories, lne., West Grove, PA) místo kozího anti-myšího Ig a detekce myšího Ig byla provedena stejně jak bylo popsáno výše. Detekce isotypů myších Ig v testu RF byla provedena užitím AP-značených protilátek proti myšímu IgA, IgM, IgG2a, IgG2b a IgG3, a standardní křivky byly připraveny pomocí purifikovaných myších IgA, IgM, IgG2a, IgG2b a IgG3 (Southern Biotechnology Associates lne.). Všechna statistická srovnání byla provedena analýzou rozptylu.

• · φ · φ φ φ φ φ · · · · φ φ · φφφ φ φ φφφφφ φφφ φφφ

Detekce cirkulujících imunitních komplexů (CIC) a precipitace kryoglobulinů v myším séru

Test byl proveden postupem již dříve publikovaným (June et al. , 1979; Singh a Tingle, 1982) s následujícími modifikacemi:

ELISA destičky (Corning glass works) byly potaženy inkubací přes noc ve 4 °C v roztoku s 5 μΙ/ml lidské Clq (Quidel, San Diego, CA) v 50mM bikarbonátovém pufru s pH 9,6. Destičky byly 3x opláchnuty PBS/0,1% Tween. Bylo přidáno 50 μΐ/jamka 0,3 M EDTA a 50 μΐ/jamka sériového ředění séra nebo roztoku se známou koncentrací standardního imunitního komplexu (peroxidáza - anti-myší peroxidáza (PAP) od firmy DAKO (Carpinteria, CA). Destičky pak byly inkubovány 30 minut ve 37 °C. Pak byly 3 x opláchnuty v PBS/0,1% Tween. Myší lg v imunitních komplexech byl detekován užitím 100 μΐ /jamka roztoku 1 μg/ml protilátky anti-myší lg značené alkalickou fosfatázou (AP) (Southern Biotechnolog Associates, lne. Birmingham, AL) jak bylo již výše popsáno pro ELISA test. Kryoglobuliny byly detekovány inkubací myšího séra naředěného 1/15 vodou ve 4 °C přes noc a precipitáty byly hodnoceny vizuálně.

Testy na protilátky proti dvouřetězcové DNA (dsDNA) a jednořetězcové DNA (ssDNA)

Testy na anti-ssDNA byly provedeny užitím destiček NUNC-ImmunoPlate MaxiSorp plates (NUNC A/S, Denmark). Destičky byly přes noc ve 4 °C potaženy nejdříve 100 μg/ml methylovaného BSA (Calbochem Corp., La Jolla, CA), pak 50 gg/ml DNA z telecího thymu čistoty I. stupně (Sigma, St. Louis, MO). DNA z telecího thymu byla nejdříve fragmentována sonikací a pak před použitím naštěpena SI nukleázou. Pro test ··· ·· · · · • · · ·· · ·♦ • ······ β · · · · • · · · · · · • » · a · » · · · · na anti-ssDNA byla DNA povařena 10 minut a pak schlazena na ledu. Po blokování bylo přidáno sériové ředění vzorků séra a destičky se inkubovaly 2 hodiny při teplotě místnosti. Autoprotilátky byly detekovány pomocí kozí anti-myší IgG-AP (Sigma) a reakce byla detekována stejně jak bylo popsáno výše pro ELISA test. Standardní křivky byly získány užitím známého množství monoklonální protilátky anti-DNA 205, která je specifická jak pro ssDNA tak i dsDNA (Datta et al., 1987).

Immunohistochemie

Slezina a lymfatické uzliny byla zmrazený v zalévacím médiu O.C.T. (Miles, Elkhart, IN) a nařezány v kryotomu. Řezy o tloušúce 7 až 10 μσι byly usušeny a fixovány v acetonu. Všechny inkubace s protilátkami (gg/ml) byly prováděny 1 hodinu při teplotě místnosti ve zvlhčované komoře po naředění v roztoku TBS-A (0,05M Tris, 0,15M NaCI, 0,05% (obj.) Tween-20, 0,25% BSA), opláchnuty TBS-B (0,05M Tris, 0,15M NaCI,0,05% Tween-20) a fixovány 1 minutu v methanolu před zahájením enzymatické reakce. Aktivity křenové peroxidázy (HRP) a alkalické fosfatázy (AP) byly vyvinuty užitím substrátových tablet diaminobenzidinu (DAB) (Sigma) a 5-bromo-4-chloro-3-indolylfosfát/tetrazoliová nitromodř (BCIP/NBT, Pierce, Rockford, IL). Obarvené řezy byly nakonec fixovány 5 minut v methanolu a obarveny Giemsovým barvením (Fluka, Buchs, Switzerland). Biotinem značené potkanní protilátky anti-B220, anti-CDllc, anti-syndekan-1 a neznačené potkanní protilátky anti-CD4, anti-CD8a a anti-CD8P byly zakoupeny od firmy Pharmingen. Biotinem značený aglutinin z podzemnice olejně (PNA) byl získán od Vector Laboratories (Burlingame, CA). (HRP)-značená myší anti-potkanní Ig a (HRP)-streptavidin byly zakoupeny od Jackson ImmunoResearch Laboratories, lne. a AP-značený • 4 • ·

streptavidin od Southern Biotechnology Associates, lne. V případě imunohistochemické analýzy ledvinné tkáně na detekci depozitů Ig byly použity parafinové řezy, po odstranění parafinu byly blokovány užitím naředěného koňského séra od firmy Vector (Burlingame, CA) , a pak obarveny kozí anti-myší Ig s HRP od Jackson Immunoresearch. Detekce byla provedena stejně jak bylo popsáno výše.

Příklad 1

BAFF transgenní (BAFF Tg) myši zakladatelské generace mají abnormální fenotyp.

V transgenních myších byl exprimován myší BAFF plné délky užitím promotoru alfa-1 antitrypsinu specifického pro játra se zesilovačem ApoE. Verze s plnou délkou byla vybrána s očekáváním, že BAFF bude buďto štěpen a působit systémově nebo se udrží ve formě vázané na membránu, takže bude možné pozorovat abnormality na játrech, což by mohlo poskytnout vodítko k funkci. Bylo získáno 13 zakladatelských pozitivních myší s transgenem BAFF (viz tab. 2) . Čtyři z těchto myší uhynuly jako mladé. Rutinní patologické vyšetření bylo provedeno na myších č. 811 a 816 (tab. 2) . U těchto myší nebyly patrny žádné příznaky infekce, avšak byly pozorovány kardiovaskulární a renální abnormality obdobné změnám pozorovaným při silné hypertenzi (Fu, 1995) (tab. 2) . Řezy tkáně ledvin barvené hematoxylinem a eosinem (H&E-barvení) z myši 816 ukázaly, že morfologie glomerulů u této myši byla abnormální, zatímco zbytek ledvinné tkáně byl normální (data neuvedena). Mnohé z BAFF transgenních myší měly proteinurii (Tab. 2) . Imunohistochemické vyšetření zmražených řezů * · sleziny z myši 816 ukázalo abnormální a extenzivní barvení B-lymfocytů a redukované barvení T-lymfocytů a toto pozorování bylo potvrzeno i u potomstva (viz dále a obr. 12).

Užitím dvoubarevné FACS analýzy byl vypočten poměr % B-lymfocytů pozitivních na B220 k % T-lymfocytů pozitivních na CD4. Tento poměr byla 2 až 7 x vyšší u zakladatelských BAFF transgenních myší než u kontrolních BDF1 negativních myší (tab. 2), což znamená nárůst populace B-lymfocytů u BAFF Tg myší. Bylo vybráno 9 z těchto zakladatelských myší k vytvoření různých linií transgenních myší (tab. 2) . Žádná ze zbývajících zakladatelských BAFF Tg myší ani z potomstva žádné známky špatného zdravotního stavu měsíce po uhynutí zakladatelských myší č. 696, 700, 811 a 816, takže možné vysvětlení je, že tyto 4 myši exprimovaly vyšší hladiny BAFF, což mohlo způsobit jejich uhynutí. Nadměrní exprese (overexpression) v játrech byla potvrzena Northernovou analýzou (data neuvedena). U všech BAFF Tg myší vyšetřených histologicky nevykazovala játra žádné abnormality, což ukazuje, že lokální nadměrná exprese BAFF nevyvolává žádné imunologické nebo patologické události. ELISA test pro myší BAFF nebyl k dispozici, avšak původci ukázaly, že 2% sérum z BAFF Tg myší, avšak nikoliv z kontrolních myší, blokovalo vazbu rozpustného myšího BAFF značeného Flag a pocházejících ze savčích buněk na buňky BJAB. Kromě toho 5% sérum z BAFF Tg myší, avšak nikoliv z kontrolních myší, zvyšovalo proliferaci lidských B-lymfocytů z PBL v přítomnosti anti-μ (data neuvedena). Na základě těchto údajů lze odvodit, že v krvi BAFF Tg myší je přítomno podstatné množství rozpustného BAFF.

•0 * 09«··· 99 • · · «9 « ··· • 99 ·· 9 ·· •000990 00 99 9 • 0 9 · 9 · 9 •990 · 99 · 09 9

Příklad 2

Periferní lymfocytóza je BAFF Tg myší způsobena zvýšeným počtem B-lymfocytů

U populace transgennch myší bylo zjištěno, že mají více lymfocytů v krvi ve srovnání s kontrolními negativními zvířaty, a dosahují počtu až 13000 lymfocytů/1 μΐ krve (obr. 7A) . Naproti tomu počet granulocytů v. 1 μΐ krve byl jak u BAFF transgenních tak kontrolních myší v mezích normy (obr. 7A). Jelikož FACS analýza lymfocytů periferní krve (PBL) u 18 BAFF Tg myší pocházejících ze 6 různých zakladatelských BAFF Tg myší užitím protilátek anti-CD4 a anti-B220 ukázala zvýšení poměru B/T (obr. 7B a 7C), zvýšená hladina B-lymfocytů byla způsobena expanzí subpopulace B-lymfocytů. A podobně, využitím této metody, výpočty absolutních počtů cirkulujících T-lymfocytů CD4 ukázalo 50% snížení této subpopulace T-lymfocytů u BAFF Tg myší ve srovnání s kontrolními zvířaty, a to samé bylo pozorováno pro subpopulaci T-lymfocytů CD8 (data neuvedena). Všechny B-lymfocyty z PBL BAFF Tg myší měly zvýšenou expresi MHC třídy II a Bcl-2 ve srovnání s B-lymfocyty kontrolních myší (obr. 7D a 7E) , což ukazuje na jistou míru aktivace B-lymfocytů u BAFF Tg myší. T-lymfocyty v krvi BAFF Tg myší neexprimují časné aktivační markéry CD69 nebo CD2S, avšak 40 až 56 % T-lymfocytů CD4 nebo CD8 byly aktivované efektořové T-lymfocyty s fenotypem CD44^hl, L-selektin¹⁰, zatímco u kontrolních myší tento fenotyp představuje jen 8 až 12 % (obr. 7F) . Takže BAFF Tg myši vykazovaly jasné příznaky B-lymfocytózy a globální aktivace B-lymfocytů společně s alteracemi T-lymfocytů.

• · «9 · · 9 ·

Příklad 3

Expandované kompartmenty B-lymfocytů jsou složeny ze zralých buněk

Ke zjištění toho, zda overexprese BAFF u transgenních myší byla ovlivňovala kompartment B-lymfocytů centrálně v kostní dřeni a periferně v sekundárních lymfatických orgánech byla technikou FACS vyšetřena slezina, kostní dřeň a mezenterické lymfatické uzliny ze sedmi BAFF Tg myší a sedmi kontrolních myší pocházejících ze čtyřech různých zakladatelských myší. Kompartment zralých B-lymfocytů byl analyzován barvením oběma protilátkami anti-B220 a anti-IgM. Dvě reprezentativní BAFP Tg myši a jedna kontrolní myš jsou ukázány na obr. 8. Kompartment zralých B-lymfocytů (IgM+, B220+) byl zvětšen jak ve slezině tak i v mezenterických lymfatických uzlinách (obr. 8A, horní a spodní panel). Analýza kompartmentů B-lymfocytů B220+/lgM+ (obr. 7A, střední panel) nebo proB buněk (CD43+/B220 + ) a preB buněk (CD43-/B220+) v kostní dřeni (obr.8B) ukázala, že BAFF Tg myši a kontrolní myši byly podobné. Tato data ukazují, že overexprese BAFF ovlivňuje proliferací periferních zralých B-lymfocytů, avšak nikoliv prekurzorů B-lymfocytů v kostní dřeni. FACS analýza subpopulací B-lymfocytů ve slezině ukázala zvýšený podíl marginální zóny (MZ) B-lymfocytů u BAFF Tg myší ve srovnání s kontrolními zvířaty (tabulka 3). Populace folikulárních B-lymfocytů zůstala proporcionální jak u BAFF Tg myší tak u kontrolních myší, zatímco frakce nově vytvářených B-lymfocytů byla u BAFF Tg myší ve srovnání s kontrolou mírně zvýšena (tab. 3) . Tento výsledek byl také potvrzen na B-lymfocytech B220+ ze sleziny užitím protilátek ·

9 9 9 9 9 9 9

4*4··«« ·· 44 4 • 4 4 4 · 4 4 •444 4 44 4 44 anti-CD3B versus anti-CD24 a anti-IgM versus anti-IgD a analýzou populace MZ B-lymfocytů na fenotyp CD3 8^hl/CD24+ a IgM^hl/lgD^l0, jak bylo již publikováno (Oliver et al. , 1997) (data neuvedena). Imunohistochemická analýza užitím protilátky anti-myší IgM ukázala expanzi oblasti IgM-bright MZ B-lymfocytů ve slezině BAFF Tg myší ve srovnání s kontrolou (data neuvedena). Všechny B-lymfocyty B220+ z BAFF Tg myší exprimovaly vyšší hladiny MHC třídy II (tab. 3) a Bcl-2 (data neuvedena) ve srovnání s B-lymfocyty sleziny kontrolních zvířat, což ukazuje, že B-lymfocyty ve slezině a také B-lymfocyty z PBL jsou v aktivovaném stavu.

Příklad 4

BAFF Tg myši mají vyšší hladinu celkového imunoglobulinu, revmatoidního faktoru a cirkulujících imunitních komplexů v séru

Zvětšený kompartment B-lymfocytů u BAFF Tg myší vede k předpokladu, že hladina celkových Ig v krvi u těchto myší může být také zvýšena. SDS-PAGE analýza séra z BAFF Tg myší a kontrolních zvířat ukázala, že pásy těžkých a lehkých řetězců Ig jsou přinejmenším lOx intenzivnější u 3 ze 4 BAFF Tg myší ve srovnání s kontrolním séra (obr. 9A) . Podobně test ELISA séra BAFF Tg myší ukázal významně vyšší hladinu celkového Ig ve srovnání s kontrolními zvířaty (obr. 9B).

I přes vysoké hladiny pozorované v SDS-PAGE, mimořádně vysoké hladiny Ig detekované ELISA testem u některých myší, např. 697-5, 816-8-3 a 823-20, vyvolaly podezření na přítomnost revmatoidního faktoru (RF) v séru nebo autoprotilátek proti antigenním determinantám Fc fragmentu Ig

4 4·4 4 (Jefferis, 1995). Tyto protilátky mohou vázat kozí anti-myší Ig použitý k potažení ELISA destiček a dávat tudíž chybně vysoké hodnoty. ELISA destičky byly proto potaženy normálním irelevantním kozím Ig a vazba Ig z BAFF Tg myši na normální kozí Ig byla měřena. Obr. 9C ukazuje, že sérum z většiny BAFF Tg myší obsahuje Ig reagující s normálním kozím Ig, zatímco pouze 2 z celkem 19 kontrolních myší vykazovaly reaktivitu ve stejném testu. Tyto RF byly hlavně protilátky isotypu IgM, IgA a IgG2a (data neuvedena).

Přítomnost RF může být spojena s přítomností vysokých hladin cirkulujících imunitních komplexů (CIC) a kryoglobulinů v krvi (Jefferis, 1995). K ověření toho, zda BAFF Tg myši mají či nemají abnormální hladiny CIC v séru, byl u 21 BAFF Tg myší analyzovaných výše pro detekci CIC užit vazebný test založený na Clq. Pouze 5 BAFF Tg myší mělo významně vyšší hladiny CIC ve srovnání s kontrolními myšmi, nicméně tato zvířata odpovídala těm, která měla nejvyšší hladiny celkového Ig a revmatoidního faktoru (obr. 9D) . Bylo také pozorováno vytváření precipitátů, když bylo sérum z BAFF Tg myší naředěno 1/15 vodou, na rozdíl od séra kontrolních myší, což ukazuje na přítomnost kryoglobulinů u těchto myší (data neuvedena). Takže kromě hyperplázie B-lymfocytů vykazují BAFF Tg myši také silnou hyperglobulinémii spojenou s výskytem RF a CIC.

099 9 • 09 · · 0 «90 • · · · · 9 4 · • 944444 4 4 4 4 · • · · 4 · 0 0

4900 9 99 0 ·9 ·

Příklad 5

Některé BAFF Tg myši mají vysoké hladiny autoprotilátek proti jednořetězcové (ss) DNA a proti dvouřetězcové (ds) DNA

Na počátku byly pozorovány abnormality ledvin připomínající nemoc jako lupus u dvou ze čtyřech zakladatelských myší (viz tab. II). Přítomnost anti-DNA protilátek byla popsána také u pacientů se SLE nebo u myší s nemocí podobnou SLE (SWR χ NZB)Fl (SNF1) myši (Datta et al. , 1987) . Hladina anti-ssDNA protilátek byla detekována u BAFF Tg myší, u kterých byla před tím nalezena nejvyšší hladina celkového Ig v séru (obr. 10A) . Bylo analyzováno sérum dvou BAFF Tg myší negativních na protilátky proti ssDNA (697-5 a 816-1-1) a tří transgenních myší secernujících protilátky anti-ssDNA (820-14, 816-8-3 a 820-7) na přítomnost protilátek anti-dsDNA současně s pěti kontrolními zvířaty. BAFF Tg myši secernovaly také anti-dsDNA protilátky, avšak hladiny sekrece ne vždy korelovala s hladinou protilátek anti-ssDNA, jako např. V séru BAFF Tg myši č. 697-5, které neobsahovalo detekovatelnou hladinu protilátek anti-ssDNA a přitom bylo jasně pozitivní na přítomnost protilátek anti-dsDNA (obr. 10B) . Takže BAFF Tg myši vykazující nej silnější hyperglobulinémii secernovaly patologické hladiny anti-DNA autoprotilátek. Kromě toho byly u těchto myší, což také připomíná problémy spojené s lupusem, detekovány depozity imunoglobulinů v ledvinách, a sice ze šesti analyzovaných BAFF Tg myší (obr. 1OC), tři nescernovaly detekovatelnou hladinu anti-DNA protilátek (data neuvedena).

4 ·· • 4 4 4·

4 4 4 4

444444 4

4 · ·

4444 4 44 »44 ·

Příklad 6

BAFF Tg myši mají zvětšené folikuly B-lymfocytů, četná germinální centra, snížený počet dendritických buněk a zvýšený počet plazmatických buněk jak ve slezině tak v mezenterických lymfatických uzlinách (MLN)

BAFF Tg myši měly zvětšené sleziny, MLN (data neuvedena) a Peyerovy pláty (obr. 11) . Imunohistochemické vyšetření ukázalo přítomnost zvětšených folikulů B-lymfocytů a redukované lymfatické pláty periferních arterií (PALS nebo oblasti T-lymfocytů) u BAFF Tg myší (obr. 12B) . Je zajímavé, že pouze několik germinálních center bylo pozorováno neimunizovaných kontrolních myších (což bylo typické pro tuto skupinu) , a ty, které se vyskytovaly, byly jen malé (obr. 12C) , zatímco u BAFF Tg myší se vyskytovala četná germinální centra, když nebyly imunizované (obr. 12D) . Barvení užitím anti-CDllc na dendritické buňky v zóně T-lymfocytů a marginální zóně kontrolních myší (obr. 12E) bylo výrazně redukované u BAFF Tg myší (obr. 12F) . Plazmatické buňky pozitivní na syndecan-1 byly téměř nedetekovatelné ve slezině kontrolních myší (obr. 12G) , i když červená dřeň BAFF Tg myší byla silně pozitivní na syndecan-1 (obr. 12H) . Velmi podobná pozorování byla učiněna pro MLN (obr. 13). V MLN myší BAFF Tg byly oblasti B-lymfocytů výrazně zvětšeny (obr. 13B) na rozdíl od normálních uzlin, kde byly folikuly B-lymfocytů snadno rozpoznatelné v periferii uzliny pod pouzdrem s typickou parakortikální oblastí T-lymfocytů (obr. 13A) .

Medula MLN z BAFF Tg myší byla zaplněna buňkami pozitivními na syndekan-1, což jsou zřejmě plazmatické buňky (obr. 13H) .

Závěrem lze shrnout, že výsledky analýzy sekundárních lymfatických orgánů u BAFF Tg myší byly zcela konzistentní

4 4· 4 · • * · 4 4

4 4 · »

444444 4 4

4 4 4 »

4444 4 44 * s fenotypem expandovaných B-lymfocytů vykazujícím četné buněčné abnormality a intenzivní imunitní aktivitu.

Seznam citované literatury

1. Smith et al. (1994)Cell 76:959-962.

2. Vassalli (1992) Annu. Rev. Immunol. 10:411-452.

3. De Togni et al. (1994) Science 264:703-707.

4. Koni et al. (1997) Immunity 6:491-500.

5. Amakawa et al. (1996) Cell 84:551-562.

6. Russell et al. (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90:4409-4413.

7. Zheng et al. (1995) Nátuře 377:348-351.

8. van Kooten and Banchereau (1997) Curr. Opin. Immunol. 9:330-337.

9. Stuber and Strober (1996). J. Exp. Med 183:979-989.

10. Schneider et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:18827-18833.

11. Hahneet al. (1998) J. Exp. Med. 188:1185-1190.

12. Hahne et al. (1996) Science 274:1363-1366.

13. Grimaitre et al. (1997) Eur. J. Immunol. 27:199-205.

14. Thome et al. (1997) Nátuře 386:517-521.

15. Schneider et al. (1998) J. Exp. Med 187:1205-1213.

16. Matsudaira, P. (1987) J. Biol. Chem. 262:10035-10038,

17. Armitage et al. (1992) Nátuře 357:80-82.

18. Bucher et al. (1996) Computer Chem. 20:3-24.

19. Banner et al. (1993) Cell 73:431-445.

20. Nagata (1997) Cell 88:355-365.

t* ··v· • · · • · · · · « · · · r •••444« 4 • 4 · · • ·« · 4 9 · ·· t · · • · * « 4 « · • 4 9

21. Black et al. (1997) Nátuře 385:729-733.

22. Wong et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:25190-25194.

23. Kindler and Zubler. (1997) J. Immunol. 159:2085-2090.

24. Sonoki et al. (1995) Leukemia 9:2093-2099.

25. Magrath, I. (1990) Adv Cancer Res 55:133-270.

26. Garside et al. (1998) Science 281:96-99.

27. MacLennan etal. (1997) Immunol. Rev. 156:53-66.

28. Dubois et al. (1997). J. Exp. Med. 185:941-951.

29. Tsubata et al. (1993) Nátuře 364:645-648.

30. Chicheportiche et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:32401-32410.

31. Nakayama (1997) Biochem. J. 327:625-635.

32. Jefferis, R. (1995). Rheumatoid factors, B cells and inununoglobulin genes. Br. Med. Bull. 57,312-331.

33. Schneider et al. (1999) J. Exp. Med. 189, 1747-1756.

34. Mcknights et al. (1983) Cell 34,335-341.

35. Datta et al. (1987) J. Exp. Med. 165,1252-1261.

* · 9

9999 • 9 • 9*9 9 «···

SEZNAM SEKVENCÍ <140> PCT/USOO/01788 <141> 2000-01-25 <150> 60/143,228 <151> 1999-07-09 <150> 60/117,169 <151> 1999-01-25 <160> 22 <17 0> Patentln Ver, 2.0 <210> 1 <211> 218 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Met 1

Asp

Ser

Thr 5

Glu

Arg

Glu

Gin

Ser 10

Arg

Leu

Thr

Ser

Cys 15

Leu

Lys

Arg

Glu 20

Glu

Met

Lys

Leu

Lys 25

Glu

Cys

Val

Ser

Ile 30

Leu

Pro

Arg

Lys

Glu 35

Ser

Pro

Ser

Val

Leu 40

Leu

Ser

Cys

Leu 45

Thr

Val

Ser

Phe 50

Tyr

Gin

Val

Ala

Ala 55

Leu

Gin

Gly

Asp

Leu 60

Ala

Ser

Leu

Arg

Ala 65

Glu

Leu

Gin

Gly

His 70

His

Ala

Glu

Lys

Leu 75

Pro

Ala

Gly

Ala

Lys 80

Ile

Phe

Glu

Pro

Ala

Pro

Gly

Glu

Gly

Asn

Ser

Gin

Asn

Ser

90 95

Arg Asn Lys Arg Ala Val Gin Gly Pro Glu Glu Thr Val Thr Gin Asp • · · ·· · · · ······· ·· ·· · « · · · · · * *··· · ·· · ·· ·

100

105

110

Cys

Leu

Gin

Leu

lle

Ala

Asp

Ser

Glu

Thr

Pro

Thr

lle

Gin

Lys

Gly

115

120

125

Ser

Tyr

Thr

Phe

Val

Pro

Trp

Leu

Ser

Phe

Lys

Arg

Gly

Ser

Ala

130

135

140

Leu

Tyr

Gly

Gin

Val

Leu

Tyr

Thr

Asp

Lys

Thr

Tyr

Ala

Met

Gly

His

145

150

155

160

Leu

lle

Gin

Arg

Lys

Val

His

Val

Phe

Gly

Asp

Glu

Leu

Ser

Leu

165

170

175

Val

Thr

Leu

Phe

Arg

Cys

lle

Gin

Asn

Leu

Glu

Gly

Asp

Glu

Leu

180

185

190

Gin

Leu

Ala

lle

Pro

Arg

Glu

Asn

Ala

Gin

lle

Ser

Leu

Asp

Gly

Asp

195

200

205

Val

Thr

Phe

Gly

Ala

Leu

Lys

Leu

210 215 <210> 2 <211> 232 <212> PRT <213> Myš <400> 2

Met 1

Asp Glu Ser Ala 5

Lys Thr Leu

Pro

Pro Pro 10

Cys

Leu

Cys

Phe 15

Cys

Ser

Glu

Lys

Gly

Glu

Asp

Met

Lys

Val

Gly

Tyr

Asp

Pro

lle

Thr

Pro

20

25

30

Gin

Lys

Glu

Gly

Ala

Val

Leu

Ser

Phe

Thr

Ala

Met

35

40

45

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Ala

Leu

Gin

Ala

Asp

Leu

Met

Asn

Leu

Arg

50

55

60

Met

Glu

Leu

Gin

Ser

Tyr

Arg

Gly

Ser

Ala

Thr

Pro

Ala

Lys

65

70

75

80

Leu

Thr

Pro

Ala

Pro

Arg

Pro

His

Asn

Ser

Arg

Gly

His

85

90

95

Arg	Asn	Arg	Arg 100	Ala	Phe	Pro	Gly
Asp	Leu	Ser 115	Ala	Pro	Pro	Ala	Leu 120
Gin	Leu 130	lle	Ala	Asp	Ser	Asp 135	Thr
Thr 145	Phe	Val	Pro	Trp	Leu 150	Leu	Ser
Ser	Gin	Val	Leu	Tyr 165	Thr	Asp	Pro
Gin	Arg	Lys	Lys 180	Val	His	Val	Phe
Leu	Phe	Arg 195	Cys	lle	Gin	Asn	Leu 200
Ala	lle 210	Pro	Arg	Glu	Asn	Ala 215	Gin
Phe	Phe	Gly	Ala	Leu	Lys	Leu	Leu

Pro Glu Glu Thr Glu Gin Asp Val 105 110

Arg Asn lle lle Gin Asp Cys Leu 125

Pro Thr lle Arg Lys Gly Thr Tyr 140

Phe Lys Arg Gly Asn Ala Leu Tyr 155 160 lle Phe Ala Met Gly His Val lle 170 175

Gly Asp Glu Leu Ser Leu Val Thr 185 190

Glu Glu Gly Asp Glu lle Gin Leu 205 lle Ser Arg Asn Gly Asp Asp Thr 220

225 230 <210> 3' <211> 102 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Val 1	Thr	Gin	Asp	Cys 5	Leu	Gin	Leu
lle	Gin	Lys	Gly 20	Ser	Tyr	Thr	Phe
Arg	Gly	Ser 35	Ala	Leu	Glu	Glu	Lys 40
Lys	Thr 50	Tyr	Ala	Met	Gly	His 55	Leu
Phe 65	Gly	Asp	Glu	Leu	Ser 70	Asn	Asn

lle Ala Asp Ser Glu Thr Pro Thr 10 15

Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys 25 30

Tyr Gly Gin Val Leu Tyr Thr Asp 45 lle Gin Arg Lys Lys Val His Val 60

Ser Cys Tyr Ser Ala Gly lle Ala 75 80 • · · · • · • · · * · • · · · 9 • ······ · • 9 9 9

.......

Lys Leu Glu Glu Gly Asp Glu Leu Gin Leu Ala Ile Pro Arg Glu Asn 85 90 95

Ala Gin Ile Ser Leu Asp 100 <210> 4 <211> 96 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 '

Lys Gin His Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala Thr Ser Lys 15 10 15

Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gin Pro Ala Leu Arg Arg 20 25 30

Gly Arg Gly Leu Gin Ala Gin Tyr Ser Gin Val Leu Phe Gin Asp Val 35 40 45

Thr Phe Thr Met Gly Gin Val Val Ser Arg Glu Gly Gin Gly Arg Ala 50 55 60

Tyr Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gin Gly Asp

70 75 80

Ile Leu Ser Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser

90 95 <210> 5 <211> 104 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5

Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gin Ala Glu Gly 15 10 15

Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly 20 25 30 • * « φ φ · φ ·

Val	Tyr	Ser 35	Gin	Val	Leu	Phe	Lys 40	Gly
Val	Leu 50	Leu	Thr	His	Thr	Ile 55	Ser	Arg
Glu 65	Gly	Ala	Glu	Ala	Lys 70	Pro	Trp	Tyr
Val	Phe	Gin	Leu	Glu 85	Lys	Gly	Asp	Arg
Pro	Asp	Tyr	Leu	Asp	Phe	Ala	Glu

100 • ΦΦ φφ · φ · φ φφφ φ · · φφ φ «φφφφφ φφ φφ · φ φ φφφ · · φφφφ φ φφ * φφ φ ⁶³

Gin Gly Cys Pro Ser Thr His 45

Ile Ala Val Ser Tyr Gin Thr 60

Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly 75 80

Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg 90 95 <210> 6 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6

Glu 1	Leu	Arg	Lys	Val 5	Ala	His	Leu	Thr
Met	Pro	Leu	Glu 20	Trp	Glu	Asp	Thr	Tyr 25
Val	Lys	Tyr 35	Ser	Lys	Val	Tyr	Phe 40	Arg
Pro	Leu 50	Ser	His	Lys	Val	Tyr 55	Met	Arg
Trp 65	Ala	Arg	Ser	Ser	Tyr 70	Leu	Gly	Ala
Asp	His	Leu	Tyr	Val	Asn	Val	Ser	Glu

Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser 10 15

Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly 30

Gly Gin Ser Cys Asn Asn Leu 45

Asn Ser Lys Tyr Pro Gin Met 60

Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala 75 80

Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu 90 95

Glu <210> 7 <211> 102 <212> PRT <213> Homo sapiens • · · · • · ·

0 • · · * · • · · · ·

Λ ······ · • · · · • ·« · · «·

<400> 7

Thr 1

Leu Lys

Pro Ala Ala His Leu Ile Gly Asp

Pro Ser

Lys

Gin 15

Asn

5

10

Ser

Leu

Trp

Arg

Ala

Asn

Thr

Asp

Arg

Ala

Phe

Leu

Gin

Asp

Gly

20

25

30

Phe

Tyr

Ser

Gin

Val

Phe

Ser

Gly

Lys

Ala

Tyr

Ser

Pro

Lys

Ala

35

40

45

Thr

Ser

Pro

Leu

Tyr

Leu

Ala

His

Glu

Val

Gin

Leu

Phe

Ser

50

55

60

Gin

Tyr

Pro

Phe

Pro

Trp

Leu

His

Ser

Met

Tyr

His

Gly

Ala

Phe

65

70

75

80

Gin

Leu

Thr

Gin

Gly

Asp

Gin

Leu

Ser

Thr

His

Thr

Asp

Gly

Ile

Pro

85

90

95

His

Leu

Val

Leu

Ser

Phe

100 <210> 8 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8

Glu 1

Ala

Gin

Pro

Phe 5

Ala

His

Leu

Thr

Ile 10

Asn

Ala

Thr

Asp

Ile 15

Pro

Ser

Gly

Ser

His 20

Lys

Val

Ser

Leu

Ser 25

Ser

Trp

Tyr

His

Asp 30

Arg

Gly

Trp

Gly

Lys 35

Ile

Ser

Asn

Met

Tyr 40

Ala

Asn

Ile

Cys

Phe 45

Arg

His

Glu

Thr 50

Ser

Gly

Asp

Leu

Ala 55

Thr

Glu

Tyr

Leu

Gin 60

Leu

Met

Val

Tyr

Val 65

Thr

Lys

Thr

Ser

Ile 70

Lys

Ile

Pro

Ser

Glu 75

Phe

His

Phe

Tyr

Ser 80

Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ser Gly Glu Glu Ile Ser 85 90 95 · 9 9 «

9 9 9 1

999999 4

9 9 «

9999 9 99

9 9

Ile Glu Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gin 100 105

<210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Homo	sapiens
<400> 9
actgtttctt	ctggaccctg	aacggc
<210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Homo	sapiens
<400> 10
gacaagcttg	ccaccatgga	tgactccaca
<210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Homo	sapiens
<400> 11
actagtcaca	gcagtttcaa	tgc
<210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Homo	sapiens
<400> 12
ctgcagggtc	cagaagaaac	ag
<210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Homo	sapiens
<400> 13
ggagaaggca	actccagtca	gaac
<210> 14 <211> 24 <212> DNA < 213 > Homo	sapiens

<400> 14 caattcatcc	ccaaagacat	ggac
<210>	15
<211>	22
<212>	DNA
<213>	Homo	sapiens
<400>	15
tcggaacaca	acgaaacaag	tc
<210>	16
<211>	26
<212>	DNA
<213>	Homo	sapiens
<400>	16
cttctccttc	acctggaaac	tgactg
<210>	17
<211>	19
<212>	DNA
<213>	Homo	sapiens
<400>	17
ggcatcgtga	tggactccg
<210>	18
<211>	19
<212>	DNA
<213>	Homo	sapiens
<400>	18
gctggaaggt	ggacagcga
<210>	19
<211>	35
<212>	DNA
<213>	Homo	sapiens
<400>	19
taagaatgcg	gccgcggaat	ggatgagtct
<210>	20
<211>	35
<212>	DNA
<213>	Homo	sapiens

• «

I · · · ·

<400> 20
taagaatgcg gccgcgggat cacgcactcc agcaa	35
<210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 gcagtttcac agcgatgtcc t	21
<210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 gtctccgttg cgtgaaatct g	21

4 4 4

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství přípravku vybraného ze skupiny obsahující:

a) ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment,

b) ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment a protilátku anti-μ,

c) ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment a ligand CD40, a

d) ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment a molekulu anti-CD40 ligand, a je určen pro použití ke stimulaci růstu B-lymfocytů u zvířete.
2. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství přípravku vybraného ze skupiny obsahuj ící:

a) ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment,

b) ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment a protilátku anti-μ,

c) ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment a ligand CD40, a

d) ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment a molekulu anti-CD40 ligand, a je určen pro použití ke stimulaci produkce imunoglobulinu u zvířete.
3. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství přípravku vybraného ze skupiny obsahující:

a) ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment, • · • · ♦ » * · ··

b) ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment a protilátku ant i -μ,

c) ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment a ligand CD40, a

d) ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment a molekulu anti-CD40 ligand, a je určen pro použití ke kostimulaci růstu B-lymfocytů a produkce imunoglobulinů u zvířete.
4. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství přípravku vybraného ze skupiny obsahující:

a) ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment,

b) ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment a protilátku anti-μ,

c) ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment a ligand CD40, a

d) ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment a molekulu anti-CD40 ligand, a je určen pro použití ke stimulaci růstu a zrání B-lymfocytů indukovaných dendritickými buňkami.
5. Farmaceutický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 vyznačující se tím, že ligand BAFF je rozpustný ligand BAFF.
6. Farmaceutický přípravek podle nároku 5 vyznačující se tím, že rozpustný ligand BAFF je rekombinantní ligand BAFF.
7. Farmaceutický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 vyznačující se tím, že molekula anti-CD40 je monoklonální protilátka.

4 4

4··· • 9 4 4·· • · 4 4

4 4 4 4 • 4 4 4 4 4 • 4 4 4 • 4 4
8. Farmaceutický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 vyznačující se tím, že zvíře je savec.
9. Farmaceutický přípravek podle nároku 8 vyznačující se tím, že savec je člověk.
10. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství přípravku vybraného ze skupiny obsahující:

a) molekulu anti-BAFF ligand nebo její aktivní fragment,

b) rekombinantní neoperativní molekulu ligandu BAFF nebo její aktivní fragment,

c) protilátku specifickou pro ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment, a

d) protilátku specifickou pro receptor ligandu BAFF nebo jeho epitop,

a je určen u zvířete. pro použití k inhibici růstu B-lymfocytů 11.Farmaceutický přípravek v y značuj ící se tím, že obsahuj e terapeuticky účinné množství přípravku

vybraného ze skupiny obsahuj ící:

a) molekulu anti-BAFF ligand nebo její aktivní fragment,

b) rekombinantní neoperativní molekulu ligandu BAFF nebo její aktivní fragment,

c) protilátku specifickou pro ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment, a

d) protilátku specifickou pro receptor ligandu BAFF nebo jeho epitop, a je určen pro použití k inhibici produkce imunoglobulinů u zvířete.

4 4 4 4 4 ·

44444»» 44 4« 4

4 4 4 4 4 4 4

4444 · 44 4 44 4
12. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství přípravku vybraného ze skupiny obsahující:

a) molekulu anti-ligand BAFF nebo její aktivní fragment,

b) rekombinantní neoperativní molekulu lignadu BAFF nebo její aktivní fragment,

c) protilátku specifickou pro ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment, a

d) protilátku specifickou pro receptor ligandu BAFF nebo jeho epitop, a je určen pro použití ke koinhibici růstu B-lymfocytů a produkce imunoglobulinu u zvířete.
13. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství přípravku vybraného ze skupiny obsahující:

a) molekulu anti-ligand BAFF nebo její aktivní fragment,

b) rekombinantní neoperativní molekulu ligandu BAFF nebo její aktivní fragment, c) protilátku specifickou pro ligand aktivní fragment, a BAFF nebo jeho d) protilátku specifickou pro jeho epitop, receptor ligandu BAFF nebo a je určen pro použití k inhibici růstu a zrání

B-lymfocytů indukovaných dendritickými buňkami.
14.Farmaceutický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 10 až

13 vyznačující se tím, že anti-BAFF ligand je rozpustný anti-BAFF ligand.

44 4444 • 44 44 4 · 4 4

4 444444 4 4 «4 «

4 4 4 4 4 4 4

4444 4 44 4 4 4 4
15.Farmaceutický přípravek podle nároku 14 vyznačující se tím, že rozpustný anti-BAFF ligand je rekombinantní anti-BAFF ligand.
16.Farmaceutický přípravek podle kteréhokoliv 13 vyznačující se tím, anti-BAFF je monoklonální protilátka.

z nároků 10 až že protilátka
17.Farmaceutický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 10 až 13 vyznačující se tím, že protilátka anti-BAFF receptor je monoklonální protilátka.
18. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství přípravku vybraného ze skupiny obsahuj ící:

a) ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment,

b) ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment a protilátku anti-μ,

c) ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment a ligand CD40, a

d) ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment a molekulu anti-CD40 ligand,

e) molekulu anti-BAFF ligand nebo její aktivní fragment,

f) rekombinantní neoperativní molekulu ligandu BAFF nebo její aktivní fragment,

g) protilátku specifickou pro ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment, a

h) protilátku specifickou pro receptor ligandu BAFF nebo jeho epitop, a je určen pro použití k léčení autoimunitních nemocí.
19. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství vektoru obsahujícího gen ·· · kódující molekulu příbuznou BAFF, který se a) vnese do požadovaných buněk a b) exprimuje tam gen, a je určen pro použití k léčení nemocí souvisejících s ligandem BAFF.
20.Farmaceutický přípravek podle nároku 19 vyznačující se tim, že molekula příbuzná BAFF je vybrána ze skupiny obsahující:

a) ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment,

b) ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment a protilátku anti-μ,

c) ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment a ligand CD40, a

d) ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment a molekulu anti-CD40 ligand,

e) molekulu anti-BAFF ligand nebo její aktivní fragment,

f) rekombinantní neoperativní molekulu ligandu BAFF nebo její aktivní fragment,

g) protilátku specifickou pro ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment, a

h) protilátku specifickou pro receptor ligandu BAFF nebo jeho epitop.
21. Farmaceutický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20 vyznačující se tím, že ligand BAFF je rozpustný ligand BAFF.
22. Farmaceutický přípravek podle nároku 21 vyznačující se tím, že rozpustný ligand BAFF je rekombinantní ligand BAFF.
23.Farmaceutický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20 vyznačující se tím, že molekula anti-CD40 je monoklonální protilátka.

44 44·· • · •444· 44 44 · · 4

4 4 4 · 4 4 4

4444 4 44 · ¢4 4
24. Farmaceutický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20vyznačující se tím, že anti-BAFF ligand je rozpustný.
25. Farmaceutický přípravek podle nároku 24 vyznačující se tím, že rozpustný anti-BAFF ligand je rekombinantní anti-BAFF ligand.
26. Farmaceutický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20 vyznačující se tím, že protilátka anti-BAFF je monoklonální protilátka.
27.Farmaceutický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 18 až 20 vyznačující se tím, že protilátka anti-BAFF receptor je monoklonální protilátka.
28. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje Činidlo schopné interferovat s vazbou ligandů BAFF na jeho receptor, a je určen pro použití k indukci buněčné smrti.
29. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství činidla schopného interferovat s vazbou ligandů BAFF na jeho receptor, a je určen pro použití k léčení, potlačení nebo změně imunitní reakce zahrnující signalizační dráhu mezi ligandem BAFF a jeho receptorem.
30. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství protilátky • ··»· · · fefe fe · · • · fefefe fefe • fefefe · fefe · fefe · specifické pro ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment, a je určen k inhibici zánětů.
31. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství protilátky specifické pro receptor ligandu BAFF nebo jeho epitop, a je určen k inhibici zánětů.
32. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství ligandu BAFF nebo jeho aktivního fragmentu, a je určen k regulaci vývoje hematopoetických buněk.
33. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství inhibitoru růstu B-lymfocytů, a je určen pro léčení hypertenze u zvířete.
34. Farmaceutický přípravek podle nároku 33 vyznačující se tím, že inhibitor růstu B-lymfocytů je vybrán ze skupiny obsahující:

a)molekulu anti-BAFF ligand nebo její aktivní fragment,

a) rekombinantní neoperativní její aktivní fragment, molekulu ligandu BAFF nebo b) protilátku specifickou pro ligand aktivní fragment, a BAFF nebo j eho c) protilátku specifickou pro jeho epitop. receptor ligandu BAFF nebo 35.Farmaceutický přípravek podle nároku 34

vyznačující se tím, že anti-BAFF ligand je rozpustný.

··
36.Farmaceutický přípravek podle nároku 35 vyznačující se tím, že rozpustný anti-BAFF ligand je rekombinantní anti-BAFF ligand.
37. Farmaceutický přípravek podle nároku 34 vyznačující se tím, že protilátka anti-BAFF je monoklonální protilátka.
38. Farmaceutický přípravek podle nároku 34 vyznačující se tím, že protilátka anti-BAFF receptor je monoklonální protilátka.
39. Farmaceutický přípravek podle nároku 34 vyznačující se tím, že zvíře je savec.
40. Farmaceutický přípravek podle nároku 39 vyznačující se tím, že savec je člověk.
41. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství koinhibitoru růstu B-lymfocytů a sekrece imunoglobulinů, a je určen k léčení hypertenze u zvířete.
42. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství inhibitoru růstu B-lymfocytů, a je určen k léčení kardiovaskulárních nemocí u zvířete.
43.Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství koinhibitoru růstu B-lymfocytů a sekrece imunoglobulinů, a je určen k léčení kardiovaskulárních nemocí u zvířete.
44 · ····«· ·« • •4 4 4 4 *44

4444444 44 44 4

4 4 4 4 4 4 4 •444 4 444 «44

44. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství inhibitoru růstu B-lymfocytů, a je určen k léčení renálních nemocí u zvířete.
45. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství koinhibitoru růstu B-lymfocytů a sekrece imunoglobulinu, a je určen k léčení renálních nemocí u zvířete.
46. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství inhibitoru růstu B-lymfocytů, a je určen k léčení lymfoproliferativních nemocí B-lymfocytů.
47. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství přípravku vybraného ze skupiny obsahující:

a) ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment,

b) ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment a protilátku anti-μ,

c) ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment a ligand CD40,

d) ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment a molekulu anti-CD40 ligand,

e) molekulu anti-BAFF ligand nebo její aktivní fragment,

f) rekombinantní neoperativní molekulu ligandů BAFF nebo její aktivní fragment,

g) protilátku specifickou pro ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment, a

h) protilátku specifickou pro receptor ligandů BAFF nebo jeho epitop,

9« «999 • 99 9

9 9

9 9 9

4« 9 ·

9 9 9 9

9 9

9999 • 9

9 9 9

9 9

9 9 9

9 9

9 9 0 a je určen ke stimulaci tvorby B-lymfocytů při léčení imunosupresivních nemocí.
48.Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství přípravku vybraného ze skupiny obsahující:

a) ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment,

b) ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment a protilátku anti-μ,

c) ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment a ligand CD40,

d) ligand BAFF nebo jeho aktivní fragment a molekulu anti-CD40 ligandů,

e) molekulu anti-BAFF ligandů nebo její aktivní fragment,

f) rekombinantní neoperativní molekulu ligandů BAFF nebo její aktivní fragment,

g) protilátku specifickou pro ligand BAFF nebo její aktivní fragment, a je určen ke stimulaci tvorby B-lymfocytů při léčení imunosupresivních nemocí.
49.Farmaceutický přípravek vyznačující se nemoc je infekce HIV.

podle tím, že nároku 48 imunosupresivní

Farmaceutický přípravek vyznačující se t nemoc je spojena s transplantací podle í m, že orgánu.

nároku 4 8 imunosupresivní