SK10442001A3

SK10442001A3 - Farmaceutické prípravky obsahujúce ligand BAFF alebo činidlo blokujúce tento ligand na použitie na stimuláciu a inhibíciu B-lymfocytov a sekrécie imunoglobulínov

Info

Publication number: SK10442001A3
Application number: SK1044-2001A
Authority: SK
Inventors: Jeffrey Browning; Christine Ambrose; Fabienne Mackay; Jurg Tschopp; Pascal Schneider
Original assignee: Biogen, Inc.; Apotech S. A.
Priority date: 1999-01-25
Filing date: 2000-01-25
Publication date: 2002-02-05
Also published as: JP2012087145A; CA2360062A1; EA200100822A1; EP1146892A2; KR20010105331A; WO2000043032A2; CY1107453T1; TR200102147T2; HK1040628B; IL144202A0; EP2319527A3; SK286665B6; EP2298332A1; PL198934B1; EP1146892B1; NO20013641D0; HUP0105283A2; CN100340292C; BR0007719A; JP4955642B2

Description

Farmaceutické prípravky obsahujúce ligand BAFF alebo činidlo blokujúce tento ligand na použitie na stimuláciu a inhibíciu B-lymfocytov a sekrécie imunoglobulínov

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka použitia ligandu BAFF, faktoru aktivujúceho B-lymfocyty patriaceho do rodiny TNF, a blokujúcich činidiel tohto ligandu na stimuláciu alebo inhibíciu expresie Blymfocytov a imunoglobulínov. Tento proteín a jeho receptor môžu byt využité na protinádorové alebo imunoregulačné aplikácie a tiež na liečbu chorôb so zníženou imunitou, ako je HIV. Špecificky tento ligand a jeho blokujúce činidlo môžu hrať úlohu vo vývine hypertenzie a s ňou súvisiacich chorôb. Okrem toho bunky transfekované génom pre tento ligand môžu byť použité v génovej terapii nádorových ochorení, autoimunitných chorôb alebo dedičných genetických porúch zasahujúcich B-lymfocyty. Blokujúce činidlá, ako sú napr. rekombinantné varianty alebo protilátky špecifické pre ligand alebo jeho receptor, je možné tiež využiť na imunoregulačné aplikácie. K príkladom zamýšľaného použitia BAFF ako stimulátoru B-lymfocytov pri chorobách so zníženou imunitou patrí jeho použitie u pacientov s transplantáciou orgánu (napr. transplantáciou kostnej drene) aiebo pacientov zotavujúcich sa z liečby rakoviny na stimuláciu produkcie Blymfocytov. Do úvahy prichádza tiež použitie BAFF ako acjuvans a kostimulátoru na zvýšenie alebo obnovu hladiny B-lymfccytov na približne normálnu hladinu.

Doterajší stav techniky

Cytokíny príbuzné nádorovému nekrotickému faktoru (TNF, Tumor Necrosis Factor) sú mediátormi obrany hostiteľa a regulácie imunity. Členovia tejto rodiny sa vyskytujú vo forme zakotvenej v bunkovej membráne, kde pôsobia lokálne prostredníctvom vzájomného kontaktu medzi bunkami, aiebo sa vyskytujú ako sekrétované proteíny, ktoré sú schopné difur.dovať k vzdialenejším cieiom. Paralelná rodina receptorov upozorňuje na výskyt týchto molekúl vedúcich k iniciácii bunkovej smrti alebo bunkovej proliferácii a diferenciácii v cieľovom tkanive. V súčasnosti rodina TNF ligandov a receptorov obsahuje najmenej 11 známych párov receptor-ligand: TNF:TNF-R, LT-a:TNF-R, LTα/β.-ΙιΤ-β-R, FasL:Fas, CD40L.-CD40, CD30L.-CD30, CD27L:CD27,

OX40L:OX40 a 4-1BBL:4-1BB. Sekvencie DNA, kódujúce tieto ligandy, vykazujú identitu len v 25% až 30%, a to dokonca aj v prípade najväčšej príbuznosti, hoci príbuznosť na úrovni sekvencie aminokyselín je približne 50%.

Zistilo sa, že určujúcou črtou tejto rodiny cytokír.ových receptorov je extracelulárna doména bohatá na cysteín, ktorá bola objavená pri molekulárnom klonovaní dvoch odlišných receptorov TNF. Táto génová rodina kóduje glykoproteiny s vlastnosťami transmembránových proteínov typu I s extracelulárnou doménou viažucou ligand, jednou transmembránovou dcménou a cytoplazmatickým úsekom, ktorý sa podieľa na akttvácii bunkových funkcií. Úsek viažuci ligand, bohatý na cysteín, má centrálnu doménu z husto naviazaných disulfidických mostíkov, ktorá sa, v závislosti na konkrétnom členovi rodiny, niekolko krát opakuje. Vačšina receptorov má štyri domény, hoci sú aj receptory iba s troma doménami alebo naopak zasa so šiestimi doménami.

Pre proteíny z rodiny TNF ligandov je charakteristická prítomnosť krátkeho úseku aminokyselín na N-kcnci, normálne krátkych hydrofilných ktorý často obsahuje niekoľko lyzínových alebo arginínových zvyškov, ktoré zrejme slúžia ako stop-sekvencie prenosu. Potom nasleduje transmembránový úsek a extracelulárny úsek premenlivej dĺžky, ktorý oddeľuje doménu viažucu receptor na C-konci cd bunkovej membrány. Tento úsek sa niekedy nazýva stonka. C-koncový väzbový úsek predstavuje väčšiu časť proteínu a často, aj keď nie vždy, obsahuje glykozylačné miesta. Tieto gény nemajú klasické signálne sekvencie charakteristické pre membránové proteíny typu I, skôr zodpovedajú membránovým proteínom typu II, ktoré majú C-koniec ležiaci mimo bunky a krátky N-koniec v cytoplazme. V niektorých prípadoch, ako sú napr. TNF a LT-α, sa môže objaviť v priebehu skorého opracovania proteínu štiepenie v úseku stopky a ligand potom existuje predovšetkým v sekrétovanej forme. Avšak väčšina ligandov sa vyskytuje v memmbránovej forme a sprostredkováva tak lokalizovaný prenos signálov.

Štruktúra týchto ligandov bola rozpoznaná kryštalografickou analýzou TNF, LT-α a CD40L. Štruktúra TNF a lymfotoxínu-α (LT-a) je sendvičová, t.j. skladajú sa z dvoch antiparalelných βskladaných listov s topológiou tzv. meandra (Greek key alebo jelly roll) . Odchýlka rms medzi zvyškami reťazcov Ca a β je 0,61 C, čo vedie k domnienke o vysokom stupni podobnosti ich molekulárnej topografie. Štrukturálnou črtou, ktorá zjavne vyplýva z molekulárnych štúdií CD40L, TNF a LT-α, je tendencia týchto ligandov vytvárať oligomérne komplexy. Oligomérnej štruktúre je vlastné vytváranie väzbových miest pre receptor v mieste spojenia medzi susednými podjednotkami, čím sa vytvára multivalentný ligand. Analýzou kryštálovej štruktúry sa skúmala kvartérna štruktúra TNF, CD40L a LT-α a ukázalo sa, že CD40L, TNF a LT-α existujú ako triméry. Veľa aminokyselín konzervatívnych pre tieto Ugandy sa vyskytuje práve v oblasti úsekov kostry štruktúry β-listu. Je pravdepodobné, že základná sendvičová štruktúra je zachovaná u všetkých týchto molekúl, pretože časti týchto sekvencií kostry sú zachované medzi rôznymi členmi celej rodiny. Kvartérna štruktúra sa zrejme tiež udržuje, pretože konformácia podjednotiek pravdepodobne tiež zostáva podobná.

Členov rodiny TNF je možné najlepšie opísať ako hlavné prepínače v imunitnom systéme, ktoré riadia prežívanie buniek a diferenciáciu. V súčasnosti sú známe len dva sekrétované cytokíny, a to TNF a LT-α, na rozdiel od väčšiny ostatných členov rodiny TNF zakotvených v membráne. Zatial čo membránové formy TNF boli dobre charakterizované a pravdepodobne majú jedinečnú biologickú funkciu, funkciou sekrétovaných TNF je všeobecná signalizácia poplachu bunkám vzdialenejším od miesta spúšťajúcej udalosti. Sekrécia TNF môže znásobiť udalosť vedúcu k dobre známym zmenám vo výstelke ciev a v bunkách v mieste zápalu. Oproti tomu členovia TNF rodiny viazané na membránu odovzdávajú signál prostredníctvom receptora typu TNF len bunkám v priamom kontakte. Tak napr. pomocné T-lymfocyty poskytujú pomoc sprostredkovanú CD40 len takým B-lymfocytom, s ktorými sa dostanú do priameho kontaktu prostredníctvom interakcií TCR. Podobné obmedzenia na bezprostredný bunkový kontakt sa týkajú schopnosti indukovať bunkovú smrť pri dobre preskúmanom systéme Fas.

Zdá sa, že Ugandy TNF je možné rozdeliť do troch skupín na základe ich schopnosti indukovať bunkovú smrť. V prvej skupine sú ligandy TNF, Fas a TRAIL, ktoré môžu účinne indukovať bunkovú smrť v mnohých bunkových líniách a ich receptory majú väčšinou kanonické smrtiace domény. Pravdepodobne ligand pre DR-3 (TRAMP/WSL-1) by patril tiež do tejto kategórie. Ďalšiu skupinu tvoria také ligandy, ktoré spúšťajú slabší smrtiaci signál obmedzený len na niektoré bunkové typy, príkladmi tejto triedy sú TWEAK, ligand CD30 a LTalb2. Zaujímavou otázkou je, ako členovia tejto skupiny môžu spúšťať mechanizmus vedúci k bunkovej smrti, keď nemajú kanonickú smrtiacu doménu. Neprítomnosť tejto domény vedie k domnienke, že existuje iný spôsob slabšej signalizácie v mechanizme bunkovej smrti. Nakoniec do poslednej skupiny patria tí členovia, ktorí nie sú schopní prenášať žiadny smrtiaci signál. Ale pravdepodobne členovia všetkých skupín mcžu pôsobiť antiproliferačr.e na niektoré typy buniek ako následok indukcie diferenciácie, ako napr. CD40 (Funakoshi et al., 1994).

Rodina TNF sa v poslednom čase dramaticky rozrástla a obsahuje teraz 11 rôznych signálnycn dráh zahrnujúcich reguláciu imunitného systému. Všeobecne rozšírené expresné profily TWEAK a TRAIL ukazujú, že v tejto rodine existuje ešte značná funkčná variabilita, doteraz nerozpoznaná. Tento aspekt vynikol hlavne pri novom objave dvoch receptorov, ktoré ovplyvňujú replikačnú schopnosť vírusu Rousovho sarkómu a vírusu Herpes simplex, ako aj historicky významných cojavoch, že TNF má antivírusovú aktivitu a vírus čiernych kiahní kóduje falošné TNF receptory (Brojatsch et al., 1996, Mor.zgomery et al., 1996, Smith et al., 1994, 76 Celí 959-962, Vassalli et al., 1992, 10 Immunol. 411452) .

TNF je mediátor septického šoku a kachexie a zúčastňuje sa na regulácii vývinu hematopoetických buniek. Zdá sa, že hrá hlavnú úlohu ako mediátor v zápalovej reakcii a v obrane proti bakteriálnym, vírusovým a parazitárnym infekciám a navyše má zrejme protinádorové účinky. TNF sa podieľa aj na rôznych autoimunitných chorobách. TNF je produkovaný rôznymi typmi buniek, napr. sú to makrofágy, fibroblasty, T-lymfocyty a NKlymfocyty (natural kiiler . TNF sa viaže na dva rôzne receptory, z ktorých každý pôsobí prostredníctvom odlišných špecifických intracelulárnych signálnych molekúl, čo následne vedie k odlišným účinkom TNF. TMľ môže existovať buď vo forme viazanej na membránu alebo akt rozpustný sekrétovaný cytokín.

LT-α má s TNF vela spoločných aktivít, ako napr. väzbu na TNF receptory, ale na rozdzel od TNF je sekrétovaný hlavne aktivovanými T-lymfocytmi a niektorými β-lymfoblastoidnými nádormi. Heteromérny komplex IT-α a LT-β je komplex viazaný na membránu, ktorý sa viaže na IT-β receptor. Systém LT (t. j. LT s receptorom LT-R) sa podieľa na vývine periférnych lymfatických orgánov, pretože genetické narušenie LT-β vedie k poruchám T- a B-lymfocytov v slezine a k acsencii lymfatických uzlín. Systém LT-β sa podieľa aj na bunkovej smrti u niektorých adenokarcinómových bunkových línií.

Fas-L, ďalší člen rodiny TNF, je exprimovaný prednostne na aktivovaných T-lymfocytoch. Indukuje smrť buniek nesúcich príslušný receptor, nádorových buniek a buniek infikovaných HIV, a to mechanizmom, ktorý je známy ako programovaná bunková smrť alebo apoptóza. Okrem toho je známe, že nedostatok Fas alebo Fas-L vedie k lymfoproliferatívnym poruchám, čo potvrdzuje úlohu systému Fas v regulácii imunitnej odpovede. Fas systém sa tiež podieľa na poškodení pečene v dôsledku chronickej infekcie vírusovej hepatitídy a na autoimunitnej reakcii u pacientov infikovaných HIV. Systém Fas sa zúčastňuje aj na deštrukcii Tlymfocytov u pacientov infikovaných HIV. TRAIL, ďalší člen tejto rodiny, sa zrejme tiež podieľa na bunkovej smrti mnohých rôznych transformovaných bunkových línií rôzneho pôvodu.

CD40-L, ďalší člen rodiny TNF, je exprimovaný na povrchu Tlymfocytov a indukuje reguláciu B-lymfocytov nesúcich CD40. Okrem toho je známe, že zmeny v géne pre CD40-L sú príčinou choroby známej ako syndróm hyper-IgM viazaný na X chromozóm. Systém CD40 je tiež spojený s mnohými rôznymi autoimunitnými chorobami a CD40-L má tiež známe antivíruscvé vlastnosti. Hoci sa systém CD40 podieľa tiež na obnove apoptóznych E-lymfccytov, u iných buniek ako sú bunky imunitného systému indukuje apoptózu. Mnohí ďalší lymfocytárni členovia rodiny TNF sa podieľajú na kostimulácii.

Všeobecne je možné zhrnúť, že členovia rodiny TNF hrajú základnú regulačnú úlohu v riadení imunitného systému a v aktivácii akútneho obranného systému hostiteľa. Vzhladom na súčasný pokrok v ovplyvňovaní členov rodiny TNF s cieľom terapeutického prospechu je pravdepodobné, že členovia tejto rodiny môžu poskytnúť jedinečné prostriedky na liečbu chorôb. Niektoré ligandy rodiny TNF môžu priamo indukovať apoptickú smrť mnohých transformovaných buniek, napr. LT, TNF, ligand Fas a TRAIL (Nagata, 1997, 88 Celí 355-365). Aktivácia receptora Fas a zrejme aj TNF a CD30 môže indukovať bunkovú smrť netransformovaných lymfocytov, čo môže mať dôležitú

Ί imunoregulačnú funkciu (Amakawa et al., 1996, 84 Celí 551-562, Nagata, 1997, 88 Celí 355-365, Sytwu et al., 1996, Zheng et al., 1995, 377 Náture 348-351). Všeobecne je známe, že bunková smrť sa spustí po agregácii smrtiacich domén, ktoré sú umiestnené na cytoplazmatickej strane receptorov TNF. Tieto smrtiace domény organizujú súbor rôznych zložiek prenosu signálu, čo nakoniec vedie k aktivácii celej kaskády (Nagata, 1997, 88 Celí 355-365). Niektoré receptory nemajú kanonické smrtiace domény, napr. receptor LTb a CD30 (Browning et al., 1996, Lee et al., 1996), napriek tomu môžu indukovať bunkovú smrť, aj keď podstatne slabšie. Tieto receptory pravdepodobne fungujú primárne tak, že indukujú bunkovú diferenciáciu a bunková smrť je aberantným dôsledkom pri niektorých transformovaných bunkových líniách, hoci tento obraz je doteraz nejasný, pretože sa na základe štúdia s myšami CD30 null predpokladá smrtiaca úloha v negatívnej selekcii v týmuse (Amakawa et al., 1996, 84 Celí 551-562). Oproti tomu, prenos signálov inými dráhami, ako napr. práve prostredníctvom CD40, je vyžadovaný na udržovanie a prežívanie buniek. Z vyššie uvedeného vyplýva teda potreba identifikovať a charakterizovať ďalšie molekuly, ktoré sú členmi rodiny TNF, a tým poskytnúť ďalšie prostriedky na liečbu chorôb a ovplyvňovanie imunitného syszému.

Pôvodcovia v predkladanom vynáleze charakterizovali funkčné vlastnosti nového ligancu z rodiny TNF cytokínov. Nový ligand, nazvaný BAFF (odvedené z B celí Activating Factor belonging to TNF family), je exprimevaný T-lymfocytmi a dendritickými bunkami s cieľom kostimulácie B-lymfocytov a hrá zrejme dôležitú úlohu v kontrole funkcie B-lymfocytov. Okrem toho pôvodcovia pripravili transgénne myši nadmerne exprimujúce BAFF pod kontrolou promótora špecifického pre pečeň. Tieto myši majú nadmerný počet zrelých 5-lymfocytov, spontánne reakcie germinálnych centier, sekrétujú autoprotilátky a majú vysoké množstvá plazmatických buniek v sekundárnych lymfatických orgánoch a depozity Ig v obličkách.

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález sa týka použitia ligandov BAFF, blokujúcich činidiel a protilátok k ligandu, buď na stimuláciu alebo inhibíciu rastu B-lymfocytov a sekréciu imunoglobulínov. Vynález môže byť využitý na terapeutické aplikácie pri mnohých chorobách, ako bude ešte ďalej podrobnejšie diskutované, ako aj na zisťovanie informácií o imunitnom systéme a procesoch v ňom a aj na ich ovplyvňovanie. Vynález môže byť ďalej využitý na stimuláciu alebo inhibíciu rastu B-lymfocytov a sekrécie imunoglobulínov. Molekuly asociované s BAFF, ako opisuje predkladaný vynález, môžu byť využité pri liečbe autoimunitných chorôb, porúch súvisiacich s proliferáciou a zrením Blymfocytov, reguláciou ligandu BAFF a zápalmi. Vynález sa môže podielať na regulácii alebo prevencii hypertenzie a chorôb súvisiacich s hypertenziou renálneho a kardiovaskulárneho tkaniva.

Ďalšie vlastnosti a výhody vynálezu budú uvedené ďalej a budú zrejmé z opisu vynálezu alebo z realizácie vynálezu. Predmet vynálezu a jeho ďalšie výhody budú špecificky dosiahnuté metódami zvlášť uvedenými v opise, nárokoch, ako aj obrázkoch.

Predkladaný vynález, tak ako je tu v celej šírke opísaný, v súlade s tu opísanými vykonaniami, sa týka spôsobu ovplyvnenia rastu B-lymfocytov a sekrécie imunoglobulínov podávaním prípravkov obsahujúcich rôzne BAFF ligandy a príbuzné molekuly.

Vynález predpokladá tiež stimuláciu rastu B-lymfocytov použitím BAFF ligandov alebo aktívnych fragmentov polypeptidu. Pclypeptíd môže byť buď samotný alebo s ligandom CD40 alebo s anti-myšou protilátkou.

V inom uskutočnení sa predkladaný vynález týka stimulácie rastu a zrenia B-lymfocytov stimulovaných dendritickými bunkami použitím ligandu BAFF alebo jeho aktívnych fragmentov. A opäť sa «

' ' polypeptid môže použiť buď samotný alebo s ligandom CD40 alebo s anti-μ protilátkou.

V inom uskutočnení vynálezu boli použité činidlá blokujúce BAFF a receptor BAFF na inhibíciu rasru B-lymfocytov a sekrécie imunoglobulínov. Týmito činidlami môžu byť neoperatívny rekombinantný BAFF, protilátky špecifické pre BAFF, protilátky špecifické pre receptor BAFF alebo molekuly anti-BAFF ligand.

V ešte ďalšom uskutočnení sa vynález týka použitia BAFF, molekúl príbuzných s BAFF a činidiel blokujúcich BAFF na liečbu hypertenzie, chorôb súvisiacich s hypertenziou, chorôb imunity, autoimunitných chorôb, zápalov a lýmfoproliferatívnych porúch Blymfocytov.

Vynález sa týka tiež použitia BAFF a molekúl príbuzných s BAFF ako agonistov alebo antagonistov na ovplyvnenie imunitnej reakcie prostredníctvom ovplyvnenia rastu a/alebo zrenia Blymfocytov a sekrécie imunoglobulínov.

V ďalšom uskutočnení sa vynález týka rozpustných konštruktov obsahujúcich BAFF, ktoré môžu byť použité priamo na spustenie farmakologických udalostí sprostredkovaných s BAFF. Také udalosti môžu mať bezprostredne prospešný terapeutický účinok pri liečbe rakoviny, nádorov alebo pri ovplyvňovaní imunitného systému pri liečbe imunologických ochorení.

Ďalšie uskutočnenie predkladaného vynálezu sa týka protilátok namierených proti ligancu BAFF, ktoré môžu byť použité napr. pri liečbe rakoviny alebo pri ovplyvňovaní imunitného systému pri liečbe imunologických ochorení.

Ešte ďalšie uskutočnenie vynálezu sa týka génovej terapie s využitím génov pre BAFF.

Farmaceutické prípravky pcdľa vynálezu môžu obsahovať voliteľne farmaceutický prijateľné ncsiče, adjuvans, plnidlá a ďalšie farmaceutický prijateľné zložky a môžu sa podávať akýmkoľvek spôsobom známym v odbore.

Tak uvedený všeobecný opis vynálezu, ako aj nasledujúci podrobný opis vrátane príkladov slúži na vysvetlenie vynálezu, ktorý je definovaný nárokmi.

Pripojené obrázky slúžia na lepšie porozumenie vynálezu, tvoria nedeliteľnú súčasť opisu a sú uvedené preto, aby ilustrovali vybrané uskutočnenia vynálezu a spoločne s opisom slúžia na objasnenie princípu vynálezu.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 (A) znázorňuje predikovanú aminokyselinovú sekvenciu ľudského (sekvencia SEQ ID NO: 1) a myšieho BAEF (sekvencia SEQ ID NO: 2) . Predikovaná transmembránová doména (TMD, prerušovaná čiara), potenciálne miesta N-glykozylácie (hviezdičky) a prirodzené miesta opracovania ľudského BAFF (šípky) sú znázornené. Dvojitá čiara nad hBAFF ukazuje sekvenciu získanú Edmanovým odbúravaním opracovanej formy BAFF. Obr. 1 (B) ukazuje porovnanie extraceiulárnych proteínových sekvencií BAFF (sekvencia SEQ ID NO: 3) a niektorých členov rodiny TNF licandov (sekvencia SEQ ID NO: 4 (hAPRIL) ; sekvencia SEQ ID NO: 5 (TNF alfa); sekvencia SEQ ID NO: 6 (hFasL) ; sekvencia SEQ ID NO: 7 (hLT alfa); sekvencia SEQ ID NO: 8 (hRANKL)). Identické a homologické aminokyselinové zvyšky sú uvedené v čiernych a sivých rámčekoch. Obr. 1 (C) znázorňuje dendrogram ligandov TNF rodiny.

Obr. 2 je schématickou charakterizáciou rekombinantného BAFF. Obr. 2 (A) predstavuje schému rekombinantného konštruktu BAFF. Rozpustné rekombinantné proteíny BAFF, začínajúce aminokyselinou Leus3 a Gln-_₃g, boli exprimované ako produkt fúzie s N-koncovou Flag značkou a spojovacou sekvenciou (linkérom) 6 aminokyselín. Dlhá forma je v T-lymfocytoch 293 štiepená medzi aminokyselinami Argx33 a Alai34 (šípka) a vzniká tak opracovaná forma BAFF. Asn^ a Asn-42 patria ku kanonickým sekvenciám pre N-glykozyláciu. Nviazaný givkán prítomný na Asn₁₌4 je znázornený ako Y. TMD:

transmembránová doména. Obr. 2B: Opracovanie rekombinantného BAFF peptid-N-glykanázou F (PNGase F) . Koncentrované supernatanty obsahujúce BAFF a APRÍL s Flag značkou boli deglykozylované a analyzované metódou Western blot s použitím polyklonálnej protilátky anti-BAFF alebo anti-Flag M2, ako je uvedené. Všetky pásiky okrem opracovaného BAFF reagovali tiež s anti-Flag M2 (údaje neuvedené). Obr. 2 (C) : Opracovanie BAFF plnej dĺžky na rozpustnú formu. Bunky 293T boli prechodne tra.nsfekované s BAFF plnej dĺžky. Transf ekované bunky a ich koncentrované supernatanty boli analyzované Westernovým prenosom pomocou polyklonálnych anti-BAFF protilátok. Na gél boli nanesené supernatanty zodpovedajúce desaťnásobku množstva buniek. Obr. 2 (D): Vylučovacia chromatografia podlá velkosti (size exclussion) rozpustnej formy BAFF na kolóne Superdex200. Koncentrované supernatanty obsahujúce rozpustný BAFF/krátky boli frakcionované na kolóne Superdex-200 a eluované frakcie boli analyzované Westernovým prenosom použitím protilátky antiFlag M2. Na lavej strane sú uvedené molekulové hmotnosti (kDa) markeru/štandardu pri SDS-PAGE a hore pri chromatografií vylučovacej podlá velkosti.

Obr. 3 ukazuje expresiu BAFF. Obr. 3 (A): Northernové prenosy (Northern blot) (2 μg poly A+ RNA v každej dráhe) rôznych ľudských tkanív hybridizované so sondou antisense BAFF mRNA.

Obr. 3 (B): Reverzná transkripcia a amplifikácia BAFF, alfa reťazca receptora pre IL-2 a aktínu z RNA T-lymfocytov purifikovaných z krvi v rôznych okamihoch aktivácie PHA, krvných buniek negatívnych v E-rozetách (B-lymfocyty a monocyty), nezrelých dendritických buniek získaných in vitro, buniek 293 a buniek 293 sterilné transfekovaných s BAFF plnej dĺžky (293BAFF). Kontrolné amplifikácie boli uskutočnené bez pridania cDNA. Alfa reťazec receptora pre IL-2 bol amplif ikovaný ako marker aktivácie T-lymfocytov.

Obr. 4 ukazuje väzbu BAFF na zrelé B-lymfocyty. Obr. 4 (A) : Väzba rozpustného BAFF na bunkové línie BJAB a Jurkat a purifikované bunky CD19+ z pupočníkovej krvi. Bunky boli zafarbené uvedeným množstvom (ng/50 μΐ) Flag-BAFF a analyzované prietokovou cytometriou. Obr. 4 (B): Väzba rozpustného BAFF na

PBL. PBL boli zafarbené s anti-CD8-FITC alebo anti-CD19-FITC (horizontálna os) a Flag-BAFF s M2-biotínom a avidín-PE (vertikálna os). V kontrolách bol vynechaný Flag-BAFF.

Obr. 5 ukazuje, že BAFF kostimuluje proliferáciu B-lymfocytov. Obr. 5 (A): Povrchová expresia BAFF pri trvalo transformovaných bunkách 293. Bunky 293-BAFF a bunky 293 divého typu boli zafarbené monoklonálnou protilátkou anti-BAFF mAb 43.9 a analyzované prietokovou cytometriou. Obr. 5 (B) : Kostimulácia

PBL buniek prostredníctvom 293-BAFF. PBL (10⁵/jamka) boli inkubované s 15 000 bunkami 293 fixovanými glutaraldehydom (293 divého typu alebo 293-BAFF) v prítomnosti alebo neprítomnosti protilátky proti receptoru B-lymfocytov (anti-μ). Fixované bunky 293 samé inkorporovali 100 cpm. Obr. 5 (C) : Na dávke závislá kosrimulácia proliferácie PBL rozpustným BAFF v prítcmnosti anti-μ. Proliferácie bola určovaná po 72 hodinách inkubácie inkorporáciou [³H]-tymidínu. Kontroly obsahovali bunky ošetrené samotným BAFF, tepelne denaturovaným BAFF alebo protilátkou irelevantného izotypu namiesto anti-μ. Obr. 5 (D) : Porovnanie (ko)stimulačných účinkov SCD40L a sBAFF na proliferáciu PBL. Experiment bol uskutočnený rovnako, ako je opísané pre panel C. Obr. 5 (E): BAFF kostimuluje sekréciu Ig z preaktivovaných ľudských B-lymfocytov. Purifikované B-lymfocyty CD19+ boli aktivované kokultiváciou s T-lymfocytmi EL-4 a supernatantmi aktivovaných T-lymfccytov počas 5 až 6 dní, potom reizolované a kultivované ďalších ~ dní len v samotnom médiu (-) alebo v médiu obsahujúcom 5% supernatanrov aktivovaných T-lymfocytov (T-SUP) alebo zmes cytokíncv (IL-2, IL-4, IL-10). Stĺpce predstavujú priemerné hodnoty koncentrácie imunoglobulínov v kultúrach bez alebo s 1 ng/ml BAFF. Priemer ± smerodajná odchýlka (SD) uvedené ako násobok zvýšenia boli 1,23 ± 0,11 pre samotné médium a 2,06 ± 0,18 pre supernatanty T-lymfocytov (4 pokusy) a 1,45 ± 0,06 pre IL-2, IL-4 a IL-10 (2 pokusy) . Pokusy boli uskutočnené s Blymfocytmi periférnej krvi (3 pokusy) alebo B-lymfocytmi pupočníkovej krvi (1 pokus, 2,3-násobné zvýšenie so supernatantami T-lymfocytov, 1,5-násobné zvýšenie s IL-2, IL-4 a IL-10) . Obr. 5 (F) : Závislosť účinku BAFF na dávke v kultúre so supernatantami T-lymfocytov, uvedených v paneli D. Ukázaná je priemerná hodnota ± smerodajná odchýlka z 3 pokusov.

Obr. 6 ukazuje, že BAFF pôsobí ako kofaktor pri proliferácii Blymfocytov. Proliferácia ľudských B-lymfocytov periférnej krvi bola meraná na samotných PBL (500 cpm), v prítomnosti samotného ligandu BAFF, v prítomnosti samotnej kozej anti-myšej (mu) protilátky a v prítomnosti ligandu BAFF s anti-mu. Kombinácia ligandu BAFF s anti-mu významne zvyšovala proliferáciu PBL s rastúcou koncentráciou BAFF, čo podporuje charakteristiku BAFF ako kofaktora.

Obr. 7 demonštruje zvýšenie počtu B-lymfocytov u BAFF Tg myší. Obr. 7 (A): Zvýšený počet lymfocytov u BAFF Tg myší. Graf porovnáva 12 kontrolných myší (ľavý panel) s 12 myšami BAFF Tg (pravý panel). Množstvá lymfocytov sú na grafe uvedené ako krúžky a množstvá granulocytov (zahrnujúce neutrcfily, eozinofily, bazofily) ako kosoštvorčeky. Obr. 7 (B) : Zvýšený počet B-lymfocytov v PBL u BAFF Tg myší. PBL boli na FACS analýzu zafarbené tak s anti-B220-FITC ako aj s anti-CD4-PE a sledované na živých bunkách pomocou forward side rozptylu. Uvedené sú percentá lymfocytov pozitívnych na CD4 a 3220.

Ukázaná je jedna kontrolné myš (vľavo) a dve BAFF Tg myši (vpravo) a tieto výsledky boli reprezentatívne pre 7 zvierat analyzovaných v každej skupine. Cbr. 7 (C): FACS analýza pomeru

B- a T-lymfocytov v P3L. Rozdiel medzi kontrolnými zvieratami a myšami BAFF Tg v (A) a (C) boli štatisticky významné (p <

0,001). Obr. 7 (D): Zvýšenie expresie MHC triedy II na Blymfocytoch z PBL u BAFF Tg myši. Expresia MHC triedy II bola analyzovaná FACS. Obr. 7 (E): Zvýšenie expresie Bcl-2 v Blymfocytoch z PBL u BAFF Tg myši. Expresia Bcl-2 bola meraná intracytoplazmatickým farbením a bunky boli analyzované metódou FACS. Aj v (D) aj v (E) boli živé bunky indikované forward side rozptylom. Ukázané sú štyri kontrolné zvieratá (biele úsečky) a štyri BAFF Tg myši a reprezentujú aspoň 12 zvierat analyzovaných v každej skupine. MFI: priemerná hodnota intenzity fluorescencie. Rozdiel medzi kontrolnými zvieratami a BAFF Tg myšami bol štatisticky významný (p < 0,005). Cbr. 7 (F): Zvýšená expresia efektorových T-lymfocytov u myší BAFF Tg. PBL boli zafarbené s anti-CD4-Cychrome, anti-CD44-FITC a anti-L-selektínPE. Ukázané sú bunky indikované ako CD4+. Uvedené sú aj percentá buniek CD44^hl/L-selektín^l0. Ukázaná je jedna kontrolná myš (vľavo) a dve transgénne BAFF Tg myši (vpravo) reprezentujúce aspoň 8 zvierat analyzovaných v každej skupine.

Obr. 8 ukazuje zväčšený kompartment B-lymfocytov v slezine, ale nie v kostnej dreni transgénnych myší BAFF Tg. Obr. 8 (A) : FACS farbenie zrelých B-lymfocytcv použitím aj anti-IgM-FITC aj ar.tiB220-PE, v slezine (horný panel), kostnej dreni (stredný panel) a MLN (spodný panel). Uvedené sú percentá zrelých B-lymfocytov E220+/IgM+. Obr. 8 (B): FACS farbenie pre-B-lymfocytov (B220+/CD43-) a pro-B-lymfocytov (B220+/CD43+) v kostnej dreni simultánnym použitím anti-CD43-FITC, anti-3220-Cychrome a antiIgM-PE. Ukázané sú bunky selektované z populácie buniek IgM negatívnych. Uvedené sú percentá pre-B-lymfocytov (B220-/CD43-) a pro-B-lymfocytov (B220+/CD43 + ) . Na všetkých obrázkoch (A a B) je ukázaná jedna kontrolná myš (vľavo) a dve myši BAFF Tg (vpravo) a výsledky reprezentujú 7 zvierat analyzovaných v každej skupine.

Cbr. 9 ukazuje zvýšené hladiny Ig, RF a CIC u myší BAFF Tg.

Obr. 9 (A) : SDS-PAGE analýza séra z 2 kontrolných myší (-) a 4

BAFF Tg myší ( + ) vedľa seba s uvedeným množstvom purifikovaného myšieho IgG na porovnanie. Intenzita albumínového pásiku je podobná vo všetkých dráhach, čo ukazuje, že vo všetkých vzorkách bolo na gél nanesené rovnaké množstvo materiálu.

Analýza založená na teste ELISA celkového myšieho Ig (B) , RF (C) a CIC (D) v sére 19 kontrolných myší (biele stlpčeky) a 21 transgénnych myší BAFF Tg (čierne stípčeky). Pri nedostatku vhodnej kontroly pre RF bol titer (log so základom 2) definovaný ako riedenie séra dávajúceho OD 3x vyššie ako pozadie. Množstvo CIC bolo definované ako množstvo PAP potrebné na vytvorenie OD zhodné s OD dosiahnutým s testovaným sérom. Rozdiely medzi kontrolnými a BAFF Tg myšami boli štatisticky významné (p < 0,001 v (B) a (C), p < 0,003 v (D)).

Obr. 10 ukazuje prítomnosť autoprotilátok anti-ssDNA a antidsDNA u niektorých EAFF Tg myší.

Obr. 10 (A): ELISA analýza anti-ssDNA autoprotilátok u 19 kontrolných myší (sivé stlpčeky) a 21 transgénnych myší BAFF Tg (čierne stlpčeky).

Obr. 10 (B): ELISA analýza anti-ssDNA autoprotilátok u 5 kontrolných myší a 5 zvierat vykazujúcich hladiny anti-ssDNA autoprotilátok z (A).

Obr. 10 (C) : Parafínové rezy obličiek z kontrolnej myši (vľavo) a BAFF Tg myši (vpravo) zafarbené kozím anti-myším Ig s HRP. Depozity Ig sú ukázané ako hnedé zafarbenie. Tieto obrázky sú reprezentatívne pre 6 analyzovaných myší BAFF Tg.

Obr. 11 ukazuje zväčšené Peyerove pláty u myší BAFF Tg. Fotografie Peyerových plátov (ukázané šípkou) v tenkom čreve kontrolnej myši (vľavo) a myši BAFF Tg vpravo) . Obrázok je reprezentatívny pre aspoň 12 myší usmrtených v každej skupine. Zväčšené 5x.

Obr. 12 ukazuje narušenú organizáciu B- a T-lymfocytov, intenzívne reakcie germinálnych centier, znížený počet dendritických buniek a zvýšen_ počet plazmatických buniek v slezine BAFF Tg myši.

Kontrolné myši sú ukázané na A, 0, E a G a BAFF Tg na B, D, F a H. B-lymfocyty sú modré a T-lyrzocyty hnedé (A a B) . Germinálne centrá sú ukázané šípkou (C a “). U kontrolných myší je vidieť len niekoľko reziduálnych germinálnych centier (C) . Dendritické bunky pozitívne na CDllc sú hnedé a vyskytujú sa v zóne Tlymfocytov, spojovacích kanálikoch a marginálnej zóne (E) . Len veľmi málo ich je prítomných v. BAFF Tg myší (F) . Plazmatické bunky pozitívne na Syndecan-1 boli detegovazelné len v červenej dreni BAFF Tg myší (H) , ale nie u kontrolných myší (G) . Tieto obrázky sú reprezentatívne pre aspoň 12 BAFF Tg a 12 kontrolných myší, ktoré boli analyzované. 'äčšenie bolo lCOx pri všetkých obrázkoch s výnimkou C a D, u :torých bolc 50x. B: folikuly Blymfocytov, T: PALS, WP: biela creň, RP: červená dreň.

Obr. 13 ukazuje narušenú organizáciu Ξ- a T-lymfocytov, intenzívne reakcie germináln;ch centier a veľký počet plazmatických buniek v MLN BAFF ľg myší.

Kontrolná myš je ukázaná na A, Z, E a G a BAFF Tg myš je ukázaná na 3, D, F a H. Imunohistcchemi* :á analýza bola uskutočnená, ako je opísané pri obr. 6. Farbení- 3- a T-lymžccytov je ukázané na A a B, germinálnych centier na a D, dendritických buniek na E a F a plazmatických buniek na G a H. GC: germinálne centrá. Zväčšenie lOOx.

Nasledujúca časť sa týka predovšetkým podrobného opisu výhodných uskutočnení predkladaného vynálezu. Predkladaný vynález sa týka hlavne použitia BAFF a príbuzných molekúl na ovplyvnenie rastu a zrenia B-lymfocytov a sekrécie imunoglobulínov. Ďalej sa vynález týka použitia BAFF a príbuzných molekúl na ovplyvnenie reakcie imunitného systému, ktoré je vynútené chorobami súvisiacimi s imunitou. Okrem toho sa vynález týka liečby rakoviny a imunologických ochorení použitím BAFF alebo príbuzných génov v génovej terapii.

Ligand BAFF a jeho homológy produkované v hostiteľovi/ príjemcovi transformovanom sekvenciami podľa vynálezu, ako aj natívny BAFF purifikovaný metódami, ktoré sú odborníkovi známe, alebo pripravený zo známej aminokyselinovéj sekvencie, sú použiteľné pre rôzne protirakovinové, protinádorové a imunitu regulujúce aplikácie. Môžu byť užitočné aj pri terapii iných chorôb.

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu sa týka použitia polypeptidu kódovaného izolovanou nukleovou kyselinou kódujúcou ligand BAFF v „antisense terapii. Termín „antisense” terapia sa v predkladanej prihláške týka podávania alebo in situ vytvárania oligonukleotidov alebo ich derivátov, ktoré špecificky hybridizujú v normálnych podmienkach bunky s bunkovou mRNA a/alebo DNA kódujúcou požadovaný ligand, a tak inhibujú expresiu kódovaného proteínu tým, že inhibujú transkripciu a/alebo Spomínaná väzba je sprostredkovaná konvenčnou báz alebo napr. v prípade väzby na duplexy DNA môže ísť o väzbu prostredníctvom špecifických interakcií v hlavnom žliabku dvojzávitnicovej DNA. Všeobecne sa „antisense” terapia týka celého radu techník v odbore používaných a patrí sem v podstate akákoľvek terapia založená na špecifickej väzbe oligonukleotidových sekvencii.

transláciu. komplementaritou párov „Antisense” konštrukt podľa predkladaného vynálezu môže byť podávaný napr. vo forme expresného plazmidu, ktorý transkripciou v bunke vytvorí RNA, ktorá je komplementárna k bunkovej mRNA kódujúcej BAFF alebo aspoň k jej časti. Alternatívne môže byť antisense konštruktom aj oligonukleotidová sonda pripravená ex vivo. Také oligonukleotidové sondy sú výhodne modifikované oligonukleotidy, ktoré sú rezistentné proti endogénnym nukleázam a sú preto stabilné in vivo. Príkladom takých molekúl nukleových kyselín vhodných ako antisense oligonukleotidy sú fosforamidátv, fosfotiotátové a metylfosfonázové analógy DNA (pozri patenty USA č. 5 176 996, 5 264 564 a 5 2Ξ6 775). Okrem toho všeobecný postup konštrukcie oligomérov vhodných na antisense terapiu boli prehľadne uvedené napr. v publikáciách Van Der Krol et al., 1988, Biotechniques 6: 958-976 a Stein et al., 1988, Cancer Res. 48: 2659-2668, ktoré sú zahrnuté formou odkazu.

Ligand BAFF

Ligand BAFF podľa predkladaného vynálezu, ako už bolo diskutované, je členom rodiny TNF a bol opísaný v medzinárodnej patentovej prihláške PTC/US98/19037 (publikované akt WO99/12964, ktorá je celá vložená formou odkazu. Proteín sám alebo jeho fragmenty alebo homológy majú široké možnosti terapeutického a diagnostického použitia.

Ligand EAFľ sa vyskytuje hlavne v slezine a v lymfccytoch periférnej krvi, čo poukazuje na regulačnú úlohu v imunitnom systéme. Porovnanie sekvencie ligandu EAFF pcola vynálezu s ostatnými členmi ľudskej rodiny TNF ukazuje značnú štruktúrnu podobnosť. Všezkv tieto proteíny majú niekoľko úsekov konzervatívnych sekvencií v extracelulárnej doméne.

Hoci r.ie je doteraz známa presná trojrozmerná štruktúra ligandu podlá vynálezu, ^e možné predikovať, že akz člen rodiny TNF má určité štruktúrne charakteristiky s ostatnými členmi rodiny.

Mcvé polypeptidy podía predkladaného vynálezu špecificky reagujú s receptorom, ktorý doteraz nebol identifikovaný. Avšak peptidy a metódy podľa predkladaného vynálezu umožňujú identifikovať receptory, ktoré špecificky reagujú s ligandom BAFF alebo jeho fragmentárni.

Určité uskutočnenia podľa predkladaného vynálezu sa týkajú peptidov odvodených z ligandu BAFF, ktoré majú schopnosť viazať sa na jeho receptory. Fragmenty ligar.du BAFF je možné pripraviť rôznymi spôsobmi, napr. rekombinantnou technológiou, pomocou PCR, proteolytickým štiepením alebo chemickou syntézou. Vnútorné alebo koncové fragmenty polypeptidu môžu byť pripravené odstránením jedného alebo niekoľkých nuklectidov z jedného alebo z oboch koncov nukleovej kyseliny, ktorá kóduje polypeptid. Fragmenty polypeptidu je tak možné pripraviť expresiou mutovanej DNA.

Polypeptidové fragmenty sa môžu syntetizovať aj chemicky zvyčajným spôsobom metódou známou ako Merrifieldova syntéza na pevnej fáze používajúca f-moc alebo t-boc. Napr. peptidy a sekvencie DNA podlá predkladaného vynálezu je možné v podstate ľubovoľne rozdeliť na fragmenty požadovanej dĺžky, ktoré sa neprekrývajú, alebo na prekrývajúce sa fragmenty požadovanej dĺžky. Príslušné metódy sú podrobnejšie cpísané v nasledujúcom texte.

Príprava rozpustných foriem ligandu BAFF

Rozpustné formy ligandu BAFF môžu byť veľmi účinné v prenose signálu a môžu teda byť podávané ako liek, ktorý napodobňuje prirodzenú membránovú formu. Je možné, že ligand BAFF podľa predkladaného vynálezu je prirodzene sekrétovaný ako rozpustné cytokíny, pokiaľ ale ternu ta.< nie je, je možné modifikovať gén metódami génového inžinierstva tak, aby sa zosilnila sekrécia. Na prípravu rozpustnej sekrétovanej formy BAFF je potrebné odstrániť na úrovni DNA N-koncový transmembránový úsek a niektoré úseky „stonky a nahradiť ich vedúcou sekvenciou typu I alebo alternatívne vedúcou sekvenciou typu II, ktorá umožní účinné proteolytické štiepenie vo vybratom hostiteľskom systéme. Odborník je schopný meniť rozsah „stonkových úsekov ponechaných v sekrečnom expresnom konštrukte tak, aby sa dosiahli optimálne väzbové vlastnosti k receptoru aj sekrečná účinnosť. Tak napr. je možné pripraviť konštrukty obsahujúce všetky možné dĺžky „stonky”, a to skracovaním N-konca, takže vzniknú proteíny, ktoré budú začínať napr. aminokyselinou 81 až 139. Týmto typom analýzy je možné stanoviť optimálnu dĺžku sekvencie „stonky”.

Príprava protilátok reaktívnych s ligandom BAFF

Predkladaný vynález sa týka tiež protilátok špecificky reagujúcich s ligandom 3AFF alebo jeho receptorom. Antiséra rýpu anti-proteín/anti-peptid alebo monoklonálne protilátky je možné pripraviť štandardnými spôsobmi (pozri napr. Anticodies: A Laboratorv Manual, Hariow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Press, 1988). Cicavec, akc napr. myš, škrečok alebo králik, sa môže imunizovat imur.cgénnou formou peptidu. Spôsoby, ako urobiť proteín alebo peptid imunogénnym, napr. tým, že je konjugovaný s nosičom, alebo inými spôsobmi, sú v odbore známe.

Imuncgénna časť Ugandu BAFF alebo jeho receptora môže byť podaná spoločne s adjuvans. Postup imunizácie je možné monitorovať pomocou detekcie titru protilátok v plazme alebo sére. Štandardný test E1ISA alebo iné imunctesty sa môžu použiť s imunogénom ako antigénom r.a hodnotenie hladín protilátok.

Vo výhodnom uskutočnení predkladaného vynálezu sú protilátky imunošpecifioké pre antigénové determinanty ligandu BAFF alebo jeho receptora (t.j. antigénové determinanty polypeptidu so sekvenciou SEQ ID NO: 2, opísanej v PCT/'JS98/19037 (WO95.'12964 , ktorá je vlezená vo forme odkazu v plncm rozsahu), aleco pre tesne príbuzný ľudský alebo cicavčí, iný ako ľudský, r.omclóg (s ’nomológiou 70, 80 alebo 90%, najvýhodnejšie s homciógicu aspoň 95%). V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu protilátky anti-ligand BAFF alebo ar.tireceptor ligandu EAľľ v podstate nereagujú krížovo (tzn. reagujú e * » f · e · len špecificky) s proteinom, ktorý je napr. menej ako v rozsahu 80% homologická so sekvenciou SEQ ID NO: 2 alebo 6 opísanou v PCT/US98/19037 (WO99/12964), ktorá je vložená formou odkazu v plnom rozsahu, výhodne v rozsahu menej ako 90% a najvýhodnejšie menej ako 95% homologický so sekvenciou SEQ ID NO: 2 opísanou v PCT/US98/19037 (WO99/12964), ktorá je vložená formou odkazu v plnom rozsahu. Označením, že v podstate nereagujú krížovo sa myslí to, že protilátka má väzbovú afinitu k nehomologickému proteínu menšiu ako 10%, výhodnejšie menej ako 5% a ešte výhodnejšie menšiu ako 1% väzbovej afinity k proteínu so sekvenciou SEQ ID NO: 2, ktorá bola opísaná v zmienenom PCT/US98/19037 (WO99/12964).

používa vo ktoré tiež pre cele

F(ab')2 sa môžu pripraviť

BAFF)

BAFF

Termín protilátka sa v tejto prihláške význame, ktorý zahŕňa aj fragmenty protilátky, špecificky reagujú s ligandom BAFF alebo jeho receptormi. Protilátky je možné fragmentovať pomocou zvyčajných spôsobov, ktoré sú v odbore známe a možnosti využitia fragmentov sa dajú potom testovať rovnakými spôsobmi, ako bolo opísané protilátky. Tak napr. fragmenty pôsobením pepsínu. Výsledný fragment sa potom môže opracovať tak, aby sa redukovali disulfidické mostíky, čím vznikne fragment Fab'. K protilátkam podľa predkladaného vynálezu ďalej patria biošpecifické a chimérické molekuly, ktoré majú aktivitu namierenú proti Ugandu BAFF (aktivita anti-ligand BAFF) alebo proti receptoru ligandu BAFF (aktivita anti-receptor Ugandu Takže na blokovanie ligandu BAFF alebo receptora ligandu je možné použiť tak monoklonálne ako aj polyklonálne protilátky (Ab) namierené proti ligandu BAFF, nádorovému ligandu a ich receptorom a tiež je možné použiť fragmenty protilátok ako napr. Fab' alebo F(ab'): na zablokovanie činnosti ligandu a príslušného receptora.

Rôzne formy protilátok je možné pripraviť štandardnými technikami rekombinantnej DNA (Winter a Milstein, Náture 349: 293-299, 1991, špecificky vložené formou odkazu). Napr. je možné konštruovať také chimérické protilátky, v ktorých väzbová doména pre antigén z protilátky zvieraťa je spojená s ľudskou konštantnou doménou (Cabilly et al., patent USA č. 4 816 567, vložené formou odkazu). Chimérické protilátky redukujú imunitnú reakciu vyvolanú zvieracími protilátkami, keď sú použité v klinických aplikáciách u luoí.

Okrem toho rekombinar.tné „humanizované protilátky, rozpoznávajúce ligand BAFF alebo jeho receptor, môžu byt syntetizované. Humanizované protilátky sú chimérické protilátky, ktoré obsahujú väčšinou sekvencie ľudského IgG, do ktorých boli vložené sekvencie zodpovedné za špecifickú väzbu k antigénu. Zvieratá sa imunizujú požadovaným antigénom, potom sa izoluje príslušná protilátka a odstráni sa z nej časť variabilného úseku zodpovedná za špecifickú väzbu antigénu. Úsek viažuci antigén pochádzajúci zo zvieraťa sa potom klonuje do vhodného miesta génu ľudskej protilátky, z ktorého bol odstránený úsek viažuci antigén. Humanizované protilátky minimalizujú použitie heterologických (t.j. medzidruhových) sekvencií v ľudských protilátkach a tak znižujú pravdepodobnosť vyvolania imunitnej reakcie u liečeného pacienta.

Rôzne triedy rekombi.nantných protilátok sa môžu vytvárať aj tak, že sa pripravia chimérické alebo humanizované protilátky obsahujúce variabilné domény a ľudské konštantné domény (CH1, CH2 a CH3) izolované z rôznych tried imunoglobulinov. Tak napr. sa môžu pripraviť rekombinantným spôsobom protilátky so zvýšenou valenciou väzbových miest pre antigén, a to tak, že sa klonuje väzbové miesto pre antigén dc vektora nesúceho konštantný úsek reťazca ľudskej protilátky (.-.rulanandam et al., J. Exp. Med. 17“: 1439-1450, 1993, zahrnuté formou odkazu).

Okrem toho je možné použiť štandardné techniky rekombinantnej DNA na modifikáciu väzbovej afinity rekombinantných protilátok s ich antigénmi tým, že sa zmenia zvvšky aminokyselín v blízkosti väzbového miesta pre antigén. Väzbová afinita pre antigén pri humanizovanéj protilátke sa môže zvýšiť mutagenézou založenou na modelovaní molekúl (Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029-33, 1989, zahrnuté formou odkazu).

Príprava analógov: Príprava modifikovaných DNA sekvencií a peptidových sekvencií

Analógy ligandu BAFF podľa vynálezu sa môžu líšiť od prirodzene sa vyskytujúceho ligandu BAFF sekvenciou aminokyselín, alebo spôsobom, ktorý nezahŕňa aminokyselinovú sekvenciu, alebo oboma spôsobmi. K iným modifikáciám ako je modifikácia sekvencie patrí chemická derivatizácia ligandu BAFF, a to tak in vitro ako aj in vivo. K modifikáciám, ktoré nezahŕňajú zmeny sekvencie, patria zmeny v acetylácii, metylácii, fosforylácii, karboxylácii alebo glykozylácii, pričom tento zoznam nie je obmedzujúce.

formou odkazu konzervativnými alebo niekoľkými alebo inzerciami

K výhodným analógom ligandu BAFF patria jeho biologicky aktívne fragmenty, ktorých sekvencia sa líši cd sekvencie SBQ ID NO: 2 opísanej v PC7,^/US98/19037 (WO99/12964, ktorá je vložená v plnom rozsahu) jednou substitúciami, deléciami aminokyselín, ktoré nenarušujú biologickú aktivitu ligandu BAFF. Ku konzervatívnym substitúoiám typicky patrí substitúcia jednej aminokyseliny inou aminokyselinou s podobnými vlastnosťami, napr. substitúcia v rámci nasledujúcich skupín: valín - glycín, glycín - alanín, valín - izoleucín - leucín, kyselina asparágová kyselina glutámové, aspargín - glutamín, serín - treonín, lyzín - arginín a fenylalar.in - tyrozín.

Materiály a metódy pcužité vo vynáleze

Moncklonalna proti protilátka anti-Flag >12 a zakúpené od získané od

Biowhittaker firmy SIGMA, firmy Life (Kalkersville ka anti-Flag M2, bictinylovaná .ti-Flag M2 naviazaná na agarózu boli Reagencie na bunkové kultúry boli Sciences (Basel, Switzerlar.d) a

MD). Rozpustný ľudský Flag-značený

APRÍL (zvyšky Kno - L?5o) bol produkovaný v bunkách 293 ako už bolo opísané (10, 11). FITC-značené protilátky anti-CD4, antiCD8 a anti-CD19 boli zakúpené od firmy Pharmingen (San Diego, CA) . Kozia F(ab')₂ špecifická pre fragment Fc_5m ľudského IgM bola zakúpená od firmy Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA) . Sekundárne protilátky boli získané buď od Pharmingen alebo od Jackson ImmunoResearch a boli použité v riedeniach doporučených výrobcom.

Bunky 293 T (12) ľudských embryonálnych obličiek a fibroblastové bunkové línie (pozri tab. 1) boli udržované v médiu DMEM obsahujúcom 10% tepelne inaktivcvané fetálne teľacie sérum (FCS). Bunky 293 T (12) ľudských embryonálnych obličiek boli udržované v médiu DMEM-živná zmes F12 (1:1) doplnenom s 2% FCS. Línie T-lymfocytov, B-lymfocytov a makrofágov (pozri tab. 1) boli udržované v médiu RPMI doplnenom s 10% FCS. Bunky Molt-4 boli kultivované v médiu podľa Iscoveho doplnenom s 10% FCS. Epitelové bunkové línie boli kultivované v médiu MEM-alfa obsahujúcom 10% FCS, 0,5 mM neesenciálne aminokyseliny, 10 mM Na-Hepes a 1 mM Na-pyruvát. Bunky HLJVEC beli udržované v médiu M199 doplnenom s 20% FCS, 100 gg/ml epiteliálneho rastového faktora (Collaborative Research, Inotech, Dcttikcn, Switzerla.nd) a 100 ng/ml sodnej soli heparínu (Sigma). Všetky médiá obsahovali antibiotiká penicilín a streptomycín. Leukocyty periférnej krvi (PBL) boli izolované z krvi ošetrenej heparínom zdravých dospelých dobrovolníkov použitím centrifugácie v gradiente Ficoll-Paque (Pharmacia, Uppsala, Sweden) a potom boli kultivované v médiu RPMI s 10% FCS.

T-lymfocyty boli získané z neadherujúcich PEL rozetovaním s ovčími červenými krvinkami ošetrenými neuraminidázou a oddelením od nerozetujúcich buniek (hlavne B-lymfocytov a monocytov) centrifugáciou v gradiente Ficoll-Paque. Purifikované Tivmfocyty boli aktivované 24 hodín s fytohemaglutinínom (Sigma) (1 ng/ml), opláchnuté a kultivované v RPMI s 10% FCS a 20 Lľ/ml ZL-2. Monocyty CD14+ boli purifikované metódou magnetického triedenia buniek použitím protilátky anti-CD14, mikroperličiek potiahnutých kozou anti-myšou protilátkou a zariadenie Minimacs™ (Miltenyi Biotech) a potom kultivované v prítomnosti GM-CSF (800 U/ml, Leucomax®, Essex Chemie, Luzern, Switzerland) a IL-4 (20 ng/ml, Lucerna Chem, Luzern, Switzerland) počas 5 dní, potom ďalšie 3 dni s GM-CSF, IL-4 a TNF (200 U/ml, Bender, Vienna, Austria), aby sa získali CD83+, populácia buniek podobných dendritickým bunkám. Ľudské B-lymfocyty v čistote > 57% boli izolované z periférnej krvi alebo pupočníkovej krvi pomocou magnetických perličiek s anti-CD19 (M450, Dynal, Oslo, Norway), ako už bolo opísané (13).

Analýza Northernovým prenosom (Northern blot)

Analýza Northernovým prenosom sa uskutočnila pomocou komerčne dostupných membrán s prenesenou RNA z ľudských tkanív Human Multiple Tissue Northern Blots I, II (Clontech katalóg, č. 7760-1 a 7759-1). Membrány sa hybridizovali v hybridizačnom roztoku (50% formamid, 2,5x Denhardtov roztok, 0,2% SDS, 10 mM EDTA, 2xSSC, 50 mM NaH₂PO₄, pH 6,5, 200 μς/ml sonifikovanej DNA lososej spermy) 2 hodiny pri 6C°C. Antisense RNA sondy obsahujúce nukleotidy zodpovedajúce aminokyselinám 136 až 285 hBAFF boli tepelne denaturované a pridané do čerstvého denaturačného roztoku v množstve 2 x 10^e cpm/ml. Membrána sa hybridizovala 16 hodín pri 62°C, opláchla jedenkrát v 2xSSC, 0,5% SDS (30 minút pri 25°C) , jedenkrát v 0,lxSSC, 0,1% SDS (20 minút pri 65°C) a potom exponovala pri -70°C na róntgenový film.

Charakterizácia BAFF cDNA cDNA ľudského BAFF bola obsiahnutá v niekoľkých EST klor.och (napr. klony č. T87299 a AA166695 v GenBank) získaných z knižníc fetálnej pečene a sleziny a ovariálneho karcinómu. 5'-koncová časť cDNA bola získaná metódou 5'-RACE-PCR amplifikácie (Marathon-Ready cDNA, Clonetech, Palo Alte, CA) s oiigonukleotidmi AP1 a JT1013:

(5'-ACTGTTTCTTCTGGACCCTGAACGGC- 3') (SEQ ID NO: 9) použitím dodanej cDNA knižnice zo zlúčených ľudských leukocytov ako templátu, ako bolo doporučené výrobcom. Výsledný PCR produkt bol klonovaný do vektora PCR-0 blunt (Invitrogen, NV Leek, The Netherlands) a potom subklonovsný ako ŕľcoRI/Psfcl fragment do vektora pT7T3 Pac (Pharmacia) obsahujúceho EST kloň T87299. cDNA hBAFF plnej dĺžky bola teda získaná kombináciou 5' a 3' fragmentov s využitím vnútorného PscI miesta v BAFF. Sekvencii sa v databáze priradilo prístupové číslo AF116456.

Čiastočné sekvencia myšieho BAFF s veľkosťou 617 bp bola obsiahnutá v dvoch čiastočne sa prekrývajúcich EST klonoch (AA422749 a AA25404). PCR fragment zahrnujúci nukleotidy 158 až 391 tejto sekvencie bol použitý ako sonda na skríning cDNA knižnice z myšej sleziny (Stratagene, La Joila, CA).

Expresia rekombinantného 3AFF hBAFF plnej dĺžky sa amplifikovai použitím oligonukleotidov JT1069:

(5' -GACAAGCTTGCCACCAľGGAľGACTCCACA-3') (SEQ 13 NO: 10) a JT637:

(5' -ACTAGTCACAC-CAGTCTCAAľC-C-3' ) SEQ ZD NO: 11).

Produkt PCR bol klonovaný oo vektora PCR-0 blunt a znovu subklonovaný ako Hir.dlII/EcoRI fragment do cicavčieho expresného vektora PCR-3. Krátka verzia rozpustného BAFF (aminokyseliny Q136 - L285) bola amplifikovaná použitím oligonukleotidov JT636:

(5'-CTGCAGGGTCCAGAAGAAACAG-3') :SEQ Z D NO: 12) a JT637.

Dlhá verzia rzzpustného Ξ.-.FF 'aminokyseliny L83 - L285) bola získaná z 3AFF plnez dĺžky využitím vnútorného FstI miesta. Rozpustný BAFF bol znovu subklonovaný ako PstZ/EcoRI fragment za signálny peptid hemaglutinínu a sekvenciu Flag do modifikovaného vektora PCR-Ξ a ako Pstl/SceZ fragment do modifikovaného bakteriálneho expresného vektora pQE16 v súlade s čítacím rámcom z N-koncovej sekvencie Flag (14). Konštrukty sa sekvenovali z oboch strán. Založenie stabilných línií buniek 293 exprimujúcich krátku rozpustnú formu EAFF alebo BAFF plnej dĺžky a expresia a purifikácia rekombinantného rozpustného BAFF z baktérií a cicavčích buniek 293 boli uskutočnené, ako už bolo opísané (14, 15) .

PCR spriahnutá s reverznou transkripciou

Celková RNA extrahovaná z T-lymfocytov, B-lymfocytov, nezrelých dendritických buniek získaných in vitro, buniek 293 divého typu a 293-3AFF (plnej dĺžky) bola reverzne transkribovaná použitím systému Ready to Go (Pharmacia) podľa inštrukcií výrobcu. cDNA pre BAFF a β-aktín sa detegovali pomocou PCR amplifikácie s Taa DNA polymerázou (kroky vždy po 1 minúte pri 94°C, 55°C a 72°C, 30 cyklov) použitím oligonukleotidových primárov špecifických pre BAFF: JT1322:

5'-GGAGAAGGCAACTCCAC-TCAC-AAC-3' (SEQ ID NO: 13) a JT1323:

5' -CAATTCATCCCCAAAGACATC-GAC-3' (SEQ ID NO: 14);

a špecifických pre alfa-reťazec receptora IL-2: JT1368:

5'-ľCGGAACACAACGAAACAAGTC-3' (SEQ ID NO: 15) a JT1369:

5'-CTTCTCCTTCACCTGGAAACTGACTG-3' (SEQ IDNO: 16);

pre β-aktín: 5'-GGCATCGTGATGGACTCCG-3' (SEQ ID NO: 17) a 5'GCTGGAAGGTGGACAGCGA-3' (SEQ ID NO: 18).

Gélcvá permeačná chromatografia

Bunky 293? boli prechodne transfekované krátkou formou rozpustného BAFF a kultivované v médiu Optimem bez séra počas 7 dní. Kondiciované supernatanty boli skoncentrované 20x, zmiešané s vnútorným štandardom katalázou a ovalbumínom a nanesené na kolónu Superdex-200 HR10/30. Proteíny boli eluované v PBS pri prietoku 0,5 ml/min a frakcie (0,25 ml! boli precipitované kyselinou trichlóroctovou a analyzované /Jesternovým prenosom použitím protilátky anti-Flac M2. Kolóna bola kalibrovaná štandardnými proteínmi: feritín (440 kDa), kataiáza (232 kDa), aldoláza (158 kDa), hovädzí sérový albumín (67 kDa), cvalbumín (43 kDa), chymotrypsinogén A (25 kDa) a ribonukleáza A (13,7 kDa) .

Opracovanie pôsobením enzýmu PNGáza F

Vzorky boli zahriate v 20 μΐ 0,5% SDS, 1¾ 2-merkaptoetanolu 3 minúty pri 95°C, potom boli ochladené a bcl pridaný 10¾ Nonidet P-40 (2 μΐ), 0,5 M fosforečnan sodný, pH 1,5 (2 μΐ) a Peptid-Nglykanáza F (125 jednotiek/μΙ, 1 μΐ, v kontrolách bez enzýmu). Vzorky sa inkubovali 3 hodiny pri 37°C pred analýzou Westernovým prenosom.

Edmanove sekvenovanie

Bunky 293T boli prechodne transfekcvané dlhou formou rozpustného BAFF a kultivované v médiu Cptir.em bez séra počas 7 dní. Kondiciované supernatanty boli skoncentrované 20x, frakcionované na SDS-PAGE a prenesené na cciyvynilidéndiflouridovú membránu (BioPad Labs, Hercules, CA) , ako bolo už skôr opísané (16) a potom beli sekvenované na zariadení na sekvenovanie v plynnej fáze ABľ 120A (Perkin Elmer, Foster City, CA) spojenom s analyzátorom ABľ 120A (Per<tn Elmer) vybaveným fenyltiohydantoinovou kolónou C18 2,1 x 250 mm. Dáta boli analyzované použitím scftwaru ABľ 610 (Perkin Elmer).

Protilátky

Polyklonálne protilátky boli pripravené imunizáciou králikov (Eurogentec, Seraing, Belgium) rekombinantným rozpustným BAFF. Slezina potkanov imunizovaných rovnakým antigénom bola fúzcvaná s bunkami x63Ag8.653 myšieho myelómu a hybridómy boli potom testované na BAFF-špecifické IgG. Jednou z týchto protilátok, a to 43.9, bol imunoglobulín IgG2a špecificky rozpoznávajúci h3AFF.

Bunky boli zafarbené v 50 μΐ FACS pufru (PBS, 10% FCS, 0,02% NaNs) s 50 ng (alebo uvedeným množstvom) krátkej formy rozpustného hBAFF značeného s Flag po 20 min. pri 4°C a potom anti-Flag M2 (1 μς) a sekundárnou protilátkou. Monoklonálna protilátka anti-BAFF 43.9 sa použila v množstve 40 μς/ιηΐ. Na dvojfarebnú FACS analýzu boli lymfocyty periférnej krvi zafarbené rozpustným Flag značeným BAFF/dlhý (2 μg/ml), po ktorom nasledovala biotinviovaná anti-Flag M2 (1/400) a PE-značený streptavidín (1/100) a nakoniec buď FITC-značená anti-CD4, antiCD8 alebo anti-CD19.

Proiiferačný test PE1

Leukocyty periférnej krvi boli inkubované v 96-jamkových platničkách (10⁼ buniek/jamka v 100 μΐ RPMI s 10% FCS) 72 hodín buď bez alebo s 2 μς/.’ηΐ kozej protilátky proti ľudskému μ-reťazcu (Sigma) alebo kontrolnej ľ(ab')2 a s uvedenou koncentráciou natívneho alebo povareného rozpustného BAFF/dlhý. Bunky boli vystavené pulzu [³:< tymidínu (1 pCi/jamka) ďalších 6 hodín a potom boli bunky zozbierané. Inkorporácia [³H]tymidínu bola monitorovaná kvapalinovým scintilačným počítačom. V niektorých pokusoch bol rekombtnantný rozpustný BAFF nahradený bunkami 293 trvalo transfekovar.ými BAFF plnej dĺžky (alebo bunkami 293 divého typu ako kontrola), ktoré boli fixované 5 minút v 1% paraformaldehyde pri 25°C. Test sa uskutočnil, ako už bolo skôr opísané (17). V ďalších pokusoch boli z PBL izolované bunky

CD19 + pomocou magnetických perličiek a zostávajúce bunky CD19boli ožiarené (3000 rad) pred rekonštitúciou s bunkami CD19+. Proliferačný test s sBAFF bol uskutočnený rovnako, ako bolo opísané vyššie.

Test aktivácie B-lymfocytov

Purifikované B-lymfocyty boli aktivované v systéme EL-4 kultúry, ako bolo už predtým opísané (13).

Stručne opísané, 10⁴ B-lymfocytov bolo zmiešaných s 5 x 10⁴ožiarených buniek z týmusu myši (kloň B5) a kultivovaných 5 až 6 dní v 200 μΐ média obsahujúceho 5% (obj.) supernatantu z kultúry ľudských T-lymfocytov (10^e/ml), ktoré boli aktivované 48 hodín s PKA (1 μς/ιηΐ) alebo PMA (1 ng/ml) . B-lymfocyty potom boli znovu izolované pomocou anti-CD19 perličiek a kultivované ďalších 7 dní (5 x 10⁴ buniek v 200 μΐ, dve alebo tri opakovania kultúry na 96-jamkových platničkách s plochým dnom) v samotnom médiu alebo v médiu s 5% supernatantom T-lymfocytov alebo s 50 ng/ml IL-2 (láskavý dar od Glaxo Inštitúte for Molecular Biology, Geneva) a 10 ng/ml IL-4 a 11-10 (Peprotech, London, ĽK), a tc v prítomnosti alebo neprítomnosti sBAFF. Protilátka anti-Flag M2 bcla pridaná v koncentrácii 2 μς/ml a sama nemala žiadny účinok. IgM, IgG a IgA boli kvantitatívne stanovené v supernatantoch z kultúr metódou ELISA, ako už bolo opísané (13) .

Ľudský BAFF bol identifikovaný ako možný nový člen rodiny TNF ligandov na základe sekvenčnej homológie skríningom verejne prístupných databáz použitím zlepšeného vyhľadávajúceho profilu (1=). cDNA kódujúca úplný proteín s veľkosťou 285 aminokyselín (aa) bola získaná kombináciou EST klenov (pokrývajúcich 3'kc.ncový úsek) s fragmentárni amplifikovanými pomocou PCR (5'koncový úsek). Absencia signálneho peptidu vedie k domnienke, že BAFF je membránový proteín typu II, čo je typické pre ligandy rodiny TNF. Proteín má predikovanú cvtoplazmatickú doménu 46 aa, hydrofóbny transmembránový úsek a extracelulárnu doménu z 218 aa obsahujúcu dve potenciálne miesta na N-glykozyláciu (pozri obr. IA). Sekvencia extracelulárnej domény BAFF ukazuje najvyššiu homológiu s APRÍL (33% aminokyselinová identita, 48% hcmológia), zatial čo identita s ostatnými členmi rodiny ako je TNF, FasL, LTa, TRAIL alebo RANKL je menšia ako 20% (pozri obr. 13, C) . Myší kloň cDNA izolovaný z knižnice zo sleziny kóduje mierne dlhší proteín (309 aa) obsahujúci inzerciu medzi transmembránovým úsekom a prvým z niekoľkých β-reťazcov, ktoré vytvárajú väzbovú doménu pre receptor pri všetkých členoch rodiny TNF ligandov (19) . Táto ektodoména bohatá na β-reťazce je takmer identická pri myšom a ľudskom BAFF (86% identita, 93% homológia) , čo ukazuje, že gén BAFF je v evolúcii silne konzervatívny (pozri obr. IA).

Hoci členovia TNF rodiny sú syntetizované ako ligandy vložené do membrány, často je pozorované štiepenie v oblasti „stonky medzi transmembránovou doménou a väzbovou doménou pre receptor. Tak napr. TNF alebo FasL sú odštiepené z bunkového povrchu pôsobením metaloproteináz (20, 21) . Pri produkcii rôznych foriem rekombinantného BAFF v bunkách 293T bolc zistené, že rekombinantná rozpustná forma BAFF s veľkosťou 32 kDa (aa 83285, sBAFF/dlhý), obsahujúca okrem väzbovej domény pre receptor úplný úsek stonky a N-koncovú značku Flag, bola extenzívne opracovávaná na malé fragmenty 18 kDa (pozri obr. 2 A, B) . K štiepeniu dochádzalo v úseku stonky, pretože fragmenty boli detegovatelné len protilátkami namierenými prcti kompletnej doméne interakcie s receptorom, ale nie anti-Flag protilátkami (dáta nie sú ukázané) . Zistilo sa tiež, že len N124 (lokalizovaný v úseku stonky) bol glykozylovaný, ale nie N242 (lokalizovaný na začiatku F^-listu) , pretože molekulová hmotnosť neopracovaného sBAFF/dlhý bola znížená z 32 kDa na 30 kDa odstránením N-viazaných cukrov po opracovaní s PNGázou F, zatial čo vyštiepený 18 kDa fragment bol na toto pôsobenie necitlivý. Analýza peptidovej sekvencie 18 kDa fragmentu skutočne ukázala, že k štiepeniu dochádza medzi R133 a A134 (obr. IA) . R133 leží na konci polybázického úseku, ktorý je konzervatívny pre človeka (R-N-K-R) a myš (R-N-R-R). K otestovaniu toho, či štiepenie nebolo len artefaktom, pri expresii rozpustnej, prirodzene sa nevyskytujúcej formy BAFF bol BAFF plnej dĺžky, viazaný na membránu, exprimovaný v bunkách 293T (cbr. 2C) . Úplný BAFF s veľkosťou 32 kDa a aj niekolko molekúl s vyššou molekulovou hmotnosťou (zrejme išlo o nedisociované diméry a triméry) boli pozorované v bunkových extraktoch, ale viac ako 95% BAFF získaného zo supernatantov zodpovedalo opracovanej forme s veľkosťou 18 kDa, čo ukazuje, že BAFF je opracovaný, aj keď je syntetizovaný ako ligand viazaný na membránu.

Skonštruoval sa rozpustný BAFF (Q136-L285, sBAFF/krátky), ktorého aminokyselinová sekvencia začína 2 aa downstream od miesta štiepenia (obr. 1B) . Ako bolo predikovar.é, Flag-značka naviazaná na N-koniec tejto rekombinantnej molekuly nebola odstránená (dáta neuvedené), čo umožnilo jej purifikáciu použitím afinitnej kolóny s anti-Fiag. Na overenie správneho skladania (priestorovej štruktúry) sa purifikovaný sBAFF/krátky analyzoval gélovou filtráciou, keď sa elucvai proteín so zjavnou molekulovou hmotnosťou 55 kDa (obr. 2D) . To, že sBAFF/krátky sa správne usporiadal do homotriméru (3 x 20 kDa), je v súlade s kvartérnou štruktúrou ostatných členov TNF rodiny (19). Nakoniec neopracovaný sBAFF/dlný bol bez ťažkostí exprimovaný v baktériách, čo ukazuje, že štiepenie je špecifické pre eukaryotické bunky.

Northernová analýza BAFF ukázala, že BAFF mRNA s veľkosťou

2,5 kb sa vyskytovala vo veľkom množstve v slezine a PBL (obr. 3A) . V týmuse, srdci, placente, tenkom čreve a pľúcach bola len slabá expresia. Táto obmedzená distribúcia vedie k predpokladu, že bunky v lymfatických tkanivách sú hlavným zdrojom BAFF. Pomocou PCR analýzy bolo zistené, že BAFF mRNA je prítomná v Tiymfocytcch a dendritických bunkách pochádzajúcich z mcnocytov periférnej krvi, ale nie je v B-lymfocytoch (obr. 3B) . Dokonca naivné, nestimulované T-lymfocyty exprimujú aspoň nejakú BAFF mRNA.

V databáze bolo nájdené miesto so sekvenčnou adresou (sequence tagged site, STS, SHGC-36171) obsahujúce ľudskú sekvenciu BAFF. Toto miesto leží na ľudskom chromozóme 13, v intervale dĺžky 9 cM medzi markermi D13S286 a D13S1315. Na cytogenetickej mape tento interval zodpovedá 13q32-34. Zo známych členov rodiny TNF ligandov bol len RANKL (Trance) lokalizovaný na tomto chromozóme (22), aj keď značne vzdialený od BAFF (13ql4).

Aby mohol ligand maximálne prejaviť svoje biologické účinky, je pravdepodobné, že receptor BAFF (BAFF-R) bude exprimovaný na rovnakých alebo susedných bunkách prítomných v lymfatickom tkanive. Použitím rekombinantného sBAFF ako nástroja k špecifickému stanoveniu expresie BAFF-R pomocou FACS boli skutočne zistené vysoké hladiny expresie receptora v rôznych líniách B-lymfocytov, ako sú bunky Raji Burkittovho lymfómu a bunky BJAB (obr. 4A, tab. 1). Oproti tomu bunkové línie Tlymfocytov fibroblastového, epitelového a endotelového pôvodu boli všetky negatívne. Veľmi slabé zafarbenie sa pozorovalo pri línii monocytov THP-1, čo však môže byť spôsobené väzbou na Fc receptory. Takže sa zdá, že expresia BAFF-R je obmedzená na línie B-lymfocytov. Dve testované myšie línie B-lymfocytcv boli negatívne pri použití ľudského BAFF ako sondy, hoci bola pozorovaná slabá väzba pri myších splenocytoch (dáta neuvedené) . Prítomnosť BAFF-R na B-lymfocytoch bola podporená analýzou lymfocytov periférnej krvi a pupočníkovej krvi. Zatiaľ čo Tlymfocyty CD8+ a CD4- nemajú BAFF-R (obr. 4B, ostatné dáta neuvedené), silné zafarbenie bolo pozorované na B-lymfocytoch CD19-*- (obr. 4A a 43), čo ukazuje, že BAFF-R je exprimovaný na všetkých B-lymfocytoch v krvi, vrátane naivných a pamäťových Blymfocytov.

Pretože je BAFF viazaný na B-lymfocyty pochádzajúce z krvi, uskutočnili sa pokusy na zistenie, či je ligand schopný prenášať signály na stimuláciu alebo inhibíciu rastu. Lymfocyty periférnej krvi (PBL) boli stimulované anti-IgM (μ) protilátkami spoločne s fixovanými bunkami 293 trvalo exprimujúcimi povrchový BAFF (obr. 5A) . Hladina inkorporácie [³h? tymidínu indukovaná samou anti-μ sa nezmenila v prítomnosti kontrolných buniek, ale bola dvakrát zvýšená v prítomnosti buniek transfekovaných s BAFF (obr. 5B) . Bola pozorovaná aj na dávke závislá proliferácia Blymfocytov, keď boli bunky, transfekované s BAFF, nahradené purifikovaným sBAFF (obr. 5C) , čo poukazuje r.a to, že BAFF nevyžaduje uchytenie v membráne, aby mohol prejaviť svoju aktivitu. V tomto experimentálnom usporiadaní proliferácia indukovaná s sCD40L vyžadovala koncentrácie presahujúce 1 μg/ml, ale bola menej závislá na prítomnosti anti-μ ako proliferácia sprostredkovaná BAFF (cbr. 5D) . Keď beli purifikované Blymfocyty CD19+ kokultivované s ožiarenými autolčgnymi CD19-PBL, kostimulácia proliferácie nebola s BAFF ovplyvnená, čc ukazuje, že príjem [³H]tymidínu bol spôsobený hlavne proliferáciou Blymfocytov a nie nepriamou stimuláciou buniek iného typu (dáta neuvedené). Pozorovaná odpoveď proliferácie B-lymfocytcv na BAFF bola úplne závislá na prítomnosti anti-μ protilátok, čo· ukazuje, že BAFF pôsobí ako kestimulátor proliferácie B-lymfocytov.

Na výskum možných účinkov BAFF na sekréciu imunoglobulínu boli purifikované B-lymfocyty z periférnej krvi alebo pupočníkovej krvi preaktivované kokultivácicu s ľ-lymfocytmi EL4 v prítomnosti zmesi cytokíncv zo supernatantov T-lymfocytov stimulovaných PHA/FMA (23). Tieto B-lymfocyty boli znovu izolované v čistote 98% a v prítomnosti BAFF a cytckínov z zvýšenie v s cvtokínmi aktivovaných T-lymfocytov vykazovali dvojnásobné sekrécii Ig v sekundárnej kultúre pri porovnaní samotnými. Veľmi slabý účinok bol pozorovaný v neprítomnosti exogénnych cytokínov a mierny účinok (1,5 x) bel pozorovaný v prítomnosti rekombinantných cytokínov IL-2, IL-4 a IL-10 (obr. 5E, F).

Biochemická analýza BAFF je tiež v súlade s typickou homotrimérickou štruktúrou členov TNF rodiny. BAFF vykazuje najvyššiu homológiu v tejto rodine ligandov s APRÍL, ktorý bol nedávno pôvodcami charakterizovaný ako ligand stimulujúci rast rôznych nádorových buniek (11) . Na rozdiel od TNF a LTP, čo sú členovia s rovnako veľkou homológiou (33%), a ktorých gény sú na chromozóme 6, APRÍL a BAFF nie sú zoskupené na rovnakom chromozóme. APRÍL je lokalizovaný na chromozóme 17 (J.L.B., nepublikované) a BAFF leží na distšlnom ramene chromozómu 13 (13q34). Abnormality v tomto lokuse boli charakterizované pri Burkittovom lymfóme ako druhý najčastejší defekt (24) vedia translokácie génu myc do Ig lokusu (25) . Ak vezmeme do úvahy vysokú hladinu expresie BAFF-R pri všetkých analyzovaných bunkových líniách Burkittovho lymfómu (pozri tab. 1), vyvoláva to zaujímavú možnosť, že u niektorých Burkittových lymfómoch mohlo dôjsť k deregulácii expresie BAFF a tým k stimulácii rastu autokrinným spôsobom.

Úloha B-lymfocytov špecifických pre antigén v priebehu rôznych štádií imunitnej reakcie je silne závislá na signáloch od pomocných T-lymfocytov a antigér. prezentujúcich buniek, ako sú dendritické bunky, a kontaktoch s nimi (20) . B-lymfocyty dostávajú tieto signály najskôr na začiatku alebo v priebehu imunitnej reakcie, keď vstupujú do interakcie s T-lymfocytmi na okrajoch folikulov B-lymfocytov v lymfatických tkanivách, čo vedie k ich proliferácii a diferenciácii na bunky vytvárajúce protilátky s nízkou afinitou (18) . Súčasne niektoré antigénovošpecifické B-lymfocyty tiež migrujú do folikulov B-lymfocytov a prispievajú tak k vytváraniu germinálnych centier, ďalších miest, kde B-lymfocyty proliferujú, ale tiež afinitne dozrievajú a vytvárajú pamäťové B-lymfocyty a vysokoafinitné plazmatické bunky (19).

Ukázalo sa, že signály spúšťané ďalším členom rodiny TNF, a to CD40L, sú kritické pre funkciu B-lymfocvtov v mnohých krokoch imunitnej reakcie závislej na T-lymfocytoch. Avšak niekoľko

B-lymfocytcv a ich Štúdie s použitím štúdií zreteľne ukázalo, že interakcia CD40L/CD40 nezodpovedá za všetku pomoc pre B-lymfocyty zo strany T-lymfocytov závislých na kontakte. A skutočne, T-lymŕocyty deficitné na CD40L, izolované z knock-out myší (s vyradenou funkciou príslušného génu) alebo pacientov so syndrómom hyper-IgM viazaným na X chromozóme, boli schopné úspešne indukovať proliferáciu diferenciáciu na plazmatické bunky, blokujúcich protilátok proti CD40L ukázali, že podskupina Blymfocytov pozitívnych na povrchový IgD, izolovaných z ľudských mandlí, proliferuje a diferencuje sa v reakcii na aktivované Tlymfocyty, a to spôsobom nezávislým na CD40. Ukázalo sa, že aj ďalší členovia TNF rodiny, ako je napr. TNF viazaný na membránu a CD30L, sa podieľajú na stimulácii B-lymfocytov nezávislých na CD40 a povrchových Ig. Podobne ako výsledky s BAFF, ukázalo sa tiež, že B-lymfocyty deficitné na CD40 môžu byť stimulované k proliferácii a diferenciácii na plazmatické bunky pomocnými Tlymŕocytmi, pokiaľ sú súčasne spúšťané povrchové Ig receptory. BAFF, rovnako ako CD33L a CD40L, je exprimovaný T-lymfocytmi, ale jeho originalita spočíva v expresii dendritickými bunkami ako aj vo vysokej špecifickej lokalizácii receptora BAFF na Blymfocytoch, na rozdiel od CD4C, CD30 a TNF receptorov, ktorých expresia bola opísaná pri mnohých rôznych bunkách. Tieto pozorovania podporujú nezávislú a špecifickú funkciu lymfocytoch indukovanú s BAFF.

na BZistilo sa, že BAľľ kcstimuluje proliferáciu B-lymfocytov z krvi a súčasne zosieťuje receptory B-lymfocytov, a to nezávisle od CD40 signalizácii, čo podporuje úlohu 3AFF v indukcii rastu a zrenia B-lymfocytov indukovaných T-lymfocytmi a dendritickými bunkami. Okrem toho pri použití B-lymfocytov pozitívnych na CD19, diferencujúcich sa in. vitro na preplazmatické bunky/GCpoaobné B-lymfocyty í 11), bol pozorovaný kostimulačný účinok BAFF na sekréciu lo S-lymfccytmi v prítomnosti supernatantu z aktivovaných T-lymfocytov alebo zmesi IL-2, IL-4 a IL-10. Je zaujímavé, že kostimulačný účinok bol silnejší v prítomnosti supernatantu z aktivovaných T-lymfocytov ako v prítomnosti zmesi cytokínov, čo vedie k predstave, že sú tu ďalšie rozpustné faktory sekrétované aktivovanými T-lymfocytmi, ktoré sa podieľajú na produkcii protilátok so synergickým účinkom s BAFF alebo BAFF samotným. Je teda možné, že BAFF aktívne prispieva k diferenciácii týchto GC-podobných B-lymfocytov na plazmatické bunky.

Je jasné, že BAFF poskytuje in vitro signál tak naivným Blymfocytom ako aj GC-určeným B-lymfocytom. Či sa toto pozorovanie prejavuje v priebehu normálnej imunitnej reakcie alebo nie, je potrebné preskúmať vo vhodných in vivo experimentoch.

Biologické reakcie indukované s BAFF v B-lymfocytcch sú odlišné od reakcií s CD40L, pretože proliferácia vyvolaná s CD40L je menej závislá na kostimulácii anti-μ (17) (pozri tiež obr. 5D). Okrem toho CD40L môže pôsobiť proti apoptóznym signálom v B-lymfocytoch po interakcii s receptormi B-lymfocytov (29) , zatiaľ čo EAFF r.ie je schopný zachrániť B-lymfocyty línie Ramos pred apoptózcu sprostredkovanou anti-μ, aj keď bunky Ramos exprimujú BAFF-R (tab. 1; F.M. a J.L.B., nepublikované pozorovania). Je teda pravdepodobné, že CD40L a BAFF plnia odlišné funkcie. V tejto súvislosti stojí za povšimnutie, že BAFF nereaguje so žiadnym zo 16 testovaných rekombinantných receptorov rodiny TNF vrátane CD40 (P. S. a J.T., nepublikované pozorovania).

Rast E-lymfocvtov bol účinne kostimulovaný rekombinantným rozpustným BAFF, ktorý nemá transmembránovú doménu. Táto aktivita bola v kontraste s niekoľkými členmi rodiny TNF, ktoré sú aktívne len ako ligandy viazané na membránu, ako napr. TRAIL, FasL a CD40L. Rozpustné formy týchto ligandov majú malú biologickú aktivitu, ktorá môže byť zvýšená ich zosieťovaním, čo napodobní ligandy viazané na membránu (15) . Oproti tomu zosietovar.ie Flag-značeného sBAFF s anti-Flag protilátkami alebo použitie membránovo viazaného BAFF, exprimovaného na povrchu epiteliálnych buniek nezvyšuje už mitogénnu aktivitu BAFF, čo naznačuje, že pôsobí systémovo ako sekrétovaný cytokín podobne ako TNF. Toto je v súlade s pozorovaním, že polybázická sekvencia prítomná v „stonke BAFF pôsobí ako substrát pre proteázy. Podobné polybázické sekvencie sa tiež vyskytujú v zodpovedajúcej lokalizácii, tak v APRÍL ako TWEAK, pritom pre obidva existujú dôkazy o proteolytickom opracovaní proteínu (30) (N.H. a J.T., nepublikované pozorovania). Napriek tomu, že sa proteáza zodpovedná za také štiepenie ešte nenašla, je nepravdepodobné, že by to bola metaloproteináza zodpovedná za odštiepenie membránovo viazaného TNF, pretože sa ich preferenčné sekvencie úplne líšia (21). Multibázické motívy v BAFF (R-N-KR), APRÍL (R-K-R-R) a TWEAK (R-P-R-R) pripomínajú minimálny signál na štiepenie furínu (R-X-K/R-R), ktorý je prototypom rodiny proproteínkonvertáz (31).

Pri realizácii predkladaného vynálezu, pokiaľ nie je výslovne uvedené inak, boli použité zvyčajné metódy bunkovej biológie, bunkových kultúr, molekulárnej biológie, mikrobiológie, rekombinantnej DNA, proteínovej chémie a imunológie, ktoré sú odberníkom známe. Tieto metódy boli opísané v odbornej literatúre. Pozri napr. Molecular Cioninc: A Laboratory Manual, 2nd edition (Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, Volumes I and II (D.N. Glover, ed.), 1985; Oiigonucleotide Synthesis, (M.J. Gait, ed.), 1984; U.S. Patent

4,683,195 (Mullis et ai.); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames and S. J. Higgins, eds.), 1984; Trascription and Translation (B.D. Hames and S. J. Higgins, eds.), 1984 ; Culture of Animal Cells (R.I. Freshney, ed.). Alan R. Liss, Inc., 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986;

Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984;

Er.zvmology, Volumes 154 and 155 (Wu et al., eds), Academic Press, New York; Gene Transfer Vecrors for Mammalian Cells (J.H.

A Practical Methcds ir.

Miller and M.P. Calos, eds.), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory; Immunochemical Methods in Celí and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds.), Academic Press, London, 1987; Handbook of Experiment Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.), 1986; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986.

Nasledujúce príklady slúžia na ilustráciu vynálezu a nijakým spôsobom predkladaný vynález neobmedzujú.

Príklady uskutočnenia vynálezu

V príkladoch 1 až 6 boli použité experimentálne postupy, ktoré budú v nasledujúcej časti opísané.

Konštrukt DNA na prípravu transgénnej myši s myším BAFF (EAFF Tg myš)

Tak ludská ako aj myšia sekvencia cDNA boli už opísané (Schneider et al., 1999). PCR fragment kódujúci úplný myší BAFF bol pripravený metódou RT-PCR. Prvý retazec cDNA bol syntetizovaný z polyA+ RNA z pľúc myši (Clontech, Palo Alto, CA) použitím oligo dT podľa pokynov výrobcu (GibcoEPL, Grand Island, NY) . Reakčná zmes na PCR reakciu obsahovala 1 x Pfu pufor (Stratagene, La Jola, CA) , 0,2 mM dNTP, 10* DMSO, 12,5 pM priméry, 5 jednotiek Pfu enzýmu (Stratager.e) a nasledujúce oligonukleotidové priméry obsahujúce reštrikčné miesto NotZ:

5'-TAAGAATGCGGCCGCGGAATGGATGAGTCTGCAAA-3' (SEQ ID NO: 19) a

5' -TAAGAATGCGGCCGCGGGATCACGCACTCCAGCAA-3' (SEQ ID NO: 20).

Templát bol amplifikovaný v 30 cykloch: 94°C, 1 minúta,

54°C, 2 minúty a 72°C, 3 minúty, po ktorých nasledovala extenzia minút pri 72°C. Táto sekvencia zodpovedá nakleotidom 214 až 1171 zo sekvencie AF119383 v GenBank. PCR fragment bol štiepený enzýmom Nôti a potom klonovaný do modifikovaného vektora pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Fragment obsahujúci myší BAFF bol vyštiepený enzýmom Xbal, aby bolo možné vložiť sekvenciu polyA miesta z SV40. Tento fragment bol potom klonovaný do vektora založenom na pUC, kde bola pripojená aj promótorová sekvencia. Tento promótor, 1 kb tupý fragment Egll-Notl obsahujúci ľudský ApoE enhancer a promótor AAT (alfa anti-trypsín), bol purifikovaný z plazmidu klonu 540B (láskavý dar od Dr. Katherine Parker Ponder, Washington LJniversity, St. Louis, MO). Fragment EcoBN/BglIl bol purifikovaný z výsledného vektora a použitý na vytvorenie transgénnej myši. Injikované potomstvo myší z kríženia samica C57BL/6J x samec DEA/2J F1 (BDFI) sa spätne skrížilo s myšami C57BL/6. Techniky mikroinjekcií a príprava transgénnych myší boli už predtým opísané (Mcknights et al., 1983).

Analytické metódy

Vzorky séra sa analyzovali redukujúcou SDS-PAGE v lineárnom 12,5% géli. Celková RNA z myšej pečene bola pripravená a analyzovaná Northernovým prenosom použitím izolačnej súpravy od firmy Promega (Madison, WI) podlá pokynov výrobcu. mRNA špecifická pre transgén BAFF sa detegovala pomocou sondy, zahrnujúcej SV40 polyA chvost transgénneho konštruktu a získala sa štiepením modifikovaného vektora pCEP4 s Xbal a BamHI. Sonda rozpoznávala pásik s veľkosťou 1,8 až 2 kb zodpovedajúci mRNA transgénu BAFF. PCR analýza DNA z chvostu EAFF Tg myši (myš transgénna v BAFF) bola uskutočnené použitím 12,5 pM nasledujúcich oligonukleotidových primárov:

5'-GCAGTTTCACAGCGATGTCCT-3' (SEQ ID NC: 21) a

5'-GTCTCCGTTGCGTGAAATCTG-3' (SEQ ID NC: 22) v reakcii obsahujúcej lx Tag polymerázový pufor (Stratagene), 0,2 r.M dNTP, 10% DMSO a 5 jednotiek Taq-polymerázy (Stratagene). Úsek 719 bp z transgénu bol amplifikcvaný v 35 cykloch: 94°C, 30 sekúnd, 54°C, 1 minúta a extenziou 10 minút pri 72°C.

72°C, 1,5 minúty, nasledovaných

Prítomnosť proteínu v moči myší bola meraná použitím detekčných prúžkov Multistix 10 SG na analýzu moču (Bayer Corporation, Diagnostics Division, Elkhart, IN).

Analýza Cell-dyne a cytofluorimetrická analýza (FACS)

Diferenciálne množstvá bielych krviniek (WBC) v čerstvej krvi, s EDTA ako antikoagulans, beli stanovené použitím zariadenia Abbott Celí Dyne 3500 (Chicago, IL) . Na FACS analýzu boli použité potkanie anti-myšie protilátky značené fluoresceínom (FITC), Cy-chróm- a fykoerytrínom (PE): anti-B220, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD43, anti-IgM, anti-CD5, anti-CD25, anti-CD24, anti-CD38, anti-CD21, anti-CD44, anti-L-selektín a súprava škrečacích anti-Bcl-2/kontrolné škrečacie Ig, ktoré boli zakúpené od firmy Pharmingen (San Diego, CA).

Príprava myšie: v rekombinantných E.

a ľudských BAFF značených s Flag coli alebo cicavčích bunkách bola už predtým opísaná (Schneider et al., 1999). Všetky protilátky boli použité podía inštrukcií výrobcu: PBL boli purifikované z krvi myší nasledujúcim postupom: krv bola odobratá do mikroskúmaviek obsahujúcich EDTA a r.arieder.á 1/2 s PSS. 500 μΐ neriedenej krvi sa potom nanieslo na vrchol 1 ml Ficollu (Celardane, Hornby, Ontario, Canada) v 4 ml sklenených kyvetách a gradient bol pripravený pri 2000 rpm počas 30 minút pri izbovej teplote, medzifáza obsahujúca lymfocyty bola odobratá a dvakrát premytá s PBS pred farbením na FACS.

Slezina, kostná dreň a mezenterické lymfatické uzliny boli rozdrvené na suspenziu jednotlivých buniek v médiu RPMI (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY) , premyté pufrom FACS (PBS s 2% fetálnym teľacím sérom (JRH Biosciences, Lenexa, KS)). Bunky boli najskôr resuspendované vo FACS pufri doplnenom nasledujúcimi blokujúcimi činidlami: 10 gg/ml ľudského Ig (Sandoz, Basel, Switzerland) a 10 gg/ml anti-myšej Fc blokujúcej protilátky (Pharmingen), a potom inkubované 30 minút v laďe pred farbením pomocou fluorocnrómom značených protilátok. Všetky protilátky boli neriedené FACS pufrom s blokujúcimi činidlami opísanými vyššie. Vzorky boli analyzované cytofluorometrom FACScan (Becton Dickinscn) .

Detekcia celkového myšieho Ig a reumatoidných faktorov v myšom sére pomocou ELISA testu

ELISA platničky (Corning glass works, Corning, NY) boli potiahnuté kozou protilátkou anti-myší celkový Ig (Southern Biotechnology Associates, Inc. Birmingham, AL) pri inkubácii cez noc pri 4°C v roztoku 10 Lig/ml tejto protilátky v 50 mM bikarbonátovom pufri pH 9,6. Platničky boli trikrát opláchnuté v PBS/0,1% Tween a blokované inkubáciou cez noc v 1% roztoku želatíny v PBS. Na platničku sa pridalo 100 μΐ/jamka zo sériového alebo štandardného riedenia séra na 30 minút pri 37°C. Myší Ig bol detegovaný použitím 100 μΐ/jamka roztoku 1 μς/πιΐ protilátky anti-myší celkový Ig značenej alkaklickou fosfatázou (AP) (Southern Biotechnology Associates, Inc. Birmingham, AL). Po troch opláchnutiach v ΡΞ3/0,'_% Tween bola vyvolaná enzymarická reakcia použitím 10 μς/η.Ι p-nitrofenylfosfátu (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) v 10% dietanolamíne. Reakcia bola zastavená pridaním 100 μΐ 3K NaOH/jamka. Optická denzita (OD) bola meraná pri 405 nm spektrofotometrom od firmy Molecular Devices (Sunnyvale, CA . Štandardné krivky boli pripravené pomocou purifikovar.ého myšieho Ig získaného od firmy Southern Biotechnology Associates. 7 prípade detekcie reumatoidného faktora (RF) bolo plarničky potiahnuté normálnym kozím Ig (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) namiesto kozieho ar.ti-myšieho Ig a detekcia myšieho Ig bola uskutočnená rovnako akc bolo opísané vyššie. Detekcia izotypcv myších Ig v teste RF cola uskutočnená použitím AP-značených protilátok proti myšiemu IgA, IgM, IgG2a, IgG2b a IgG3 a štandardné krivky boli pripravené pomocou purifikovaných myších IgA, IgM, IgG2a, IgG2b a IgG3 (Southern Biotechnolog Associates Inc.). Všetky štatistické porovnania sa uskutočnili analýzou rozptylu.

Detekcia cirkulujúcich imunitných komplexov (CIC) a precicitácia kryoglobulínov v myšom sére

Test sa uskutočnil postupom už skôr publikovaným (June et al., 1979; Singh a Tingle, 1982) s nasledujúcimi modifikáciami:

ELISA platničky (Corning glass works) boli potiahnuté inkubáciou cez noc pri 4°C v roztoku s 5 μΙ/ml ľudskej Clq (Quidel, San Diego, CA) v 50 mM bikarbonátovom pufri s pH 9,6. Platničky boli 3x opláchnuté s PBS/0,1% Tween. Pridalo sa 50 μΙ/jamka 0,3 M EDTA a 50 μΙ/jamka sériového riedenia séra alebo roztoku so známou koncentráciou štandardného imunitného komplexu („peroxidáza - anti-myšia peroxidáza (PAP) od firmy DÁKO (Carpinteria, CA) . Platničky potom boli inkubované 39 minút pri 37°C. Potom boli 3x opláchnuté v PBS/0,1% Tween. Myší lg v imunitných komplexoch bcl detegovaný použitím 100 μΙ/jamka μg/ml protilátky anti-myší Ic značenej alaklickou (AP) (Southern Biotechnclogy Associates, Inc.

roztoku 1 fosfatázou

Birmingham, AL), ako už bolo vyššie opísané na ELISA test.

Kryoglobulíny boli detegované inkubáciou myšieho séra nariedeného 1/15 vodou pri 4°C cez noc a precipitáty boli hodnotené vizuálne.

Testy na protilátky proti dvojreťazcovej DNA (dsDNA) a jednoreťazcovej DNA (ssDNA)

Testy na anti-ssDNA boli uskutočnené použitím doštičiek NUNC-ImmunoPlate MaxiSorp plates (NUNC A/S, Denmark). Platničky boli cez noc pri 4°C potiahnuté najskôr s 190 μg/ml metylcvaného BSA (Calbiochem Corp., La Jolla, CA) , potom s 50 μg/ml DNA z teľacieho týmusu čistoty I. stupňa (Sigma, St. Louis, MC'. DMA z teľacieho týmusu bola najskôr fragmentovaná sonifikáciou a potom pred použitím naštiepená SI nukleázou. Na test na antissDNA bola DNA povarená 10 minút a potom ochladená v ľade. Po blokovaní bolo pridané sériové riedenie vzoriek séra a platničky sa inkubovali 2 hodiny pri izbovej teplote. Autoprotilátky boli detegované pomocou kozej anti-myšej IgG-ΑΡ (Sigma) a reakcia bola detegovaná rovnako, ako už bolo na ELISA test. Štandardné krivky boli získané použitím známeho množstva monoklonálnej protilátky anti-DNA 205, ktorá je špecifická tak pre ssDNA akc aj dsDNA (Datta et al., 1987).

Imunchistochémia

Slezina a lymfatické uzliny boli zmrazené v zalievacom médiu O.C.T. (Miles, Elkhart, IN) a narezané v kryotóme. Rezy s hrúbkou 7 až 10 gm boli usušené a fixované v acetóne. Všetky inkubácie s protilátkami (10 gg/ml) sa uskutočnili 1 hodinu pri izbovej teplote vo zvlhčovanej komore po nariedení v roztoku TBS-A (0,05 M Tris, 0,15 M NaCl, 0,05% (obj.) Tween-20, C,25% BSA) , opláchli v TBS-E (0,05 M Tris, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween20) a fixovali 1 minútu v metanole pred začatím enzymatickej reakcie. Aktivity chrenovej peroxidázy (HRP) a alkalickej fosfatázy (AP) boli vyvolané použitím substrátových tabliet diaminobenzidínu (DA3) (Sigma) a 5-bromo-4-chloro-3-ir.dolylfosfát/tetrazoliovej nitrcmodrej (BCIP/NBT, Pierce, Rockford, ÍL) . Zafarbené rezy boli nakoniec fixované 5 minút v metanole a zafarbené Giemsovým farbením (Eluka, Buchs, Switzerlar.d) . Biotíncm značené potkanie protilátky anti-B220, anti-CDllc, anti-syndekan-1 a neznačené potkanie protilátky anti-CD4, ar.tiCD8a a anti-CD8p sa zakúpili od firmy Pharmingen. Biotínom značený aglutinín z podzemnice olejnej (PNA) bol získaný od Vector Laboratories (Buriingame, CA) . (HRP)-značená myšia ar.tipotkania Ig a (HRP)-streptavidín boli zakúpené od Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. a AP-značený streptavidín od Southern Biotechnology Associates, Inc. V prípade imunchisto45 chemickej analýzy obličkového tkaniva na detekciu depozitov Ig boli použité parafínové rezy, po odstránení parafínu boli blokované použitím neriedeného konského séra od firmy Vector (Burlingame, CA) a potom zafarbené kozou protilátkou anti-myšie Ig s HRP od Jackson ImmunoResearch. Detekcia sa uskutočnila rovnako ako už bolo opísané.

Príklad 1

BAFF transgénne (BAFF Tg) myši zakladateľskej generácie majú abnormálny fenotyp

V transgénnych myšiach bol exprimovaný myší BAFF plnej dĺžky použitím promótora alfa-1 antitrypsínu špecifického pre pečeň so zosilňovačom ApoE. Verzia s plnou dĺžkou bola vybratá s očakávaním, že BAFF bude buď štiepený a pôsobiť systémovo alebo sa udrží vo forme viazanej na membránu, takže bude možné pozorovať abnormality v pečeni, čo by mcr.lo poskytnúť vodidlo k funkcii. Získalo sa 13 zakladateľských pozitívnych myší s transgénom BAFF (pozri tab. 2) . Štyri z týchto myší uhynuli ako mladé. Rutinné patologické vyšetrenie bolo uskutočnené na myšiach č. 811 a 816 (tab. 2) . U týchto myší neboli vicitelné žiadne príznaky infekcie, avšak boli pozorované kardiovaskulárne a renálne abnormality podobné zmenám pozorovaným pri silnej hypertenzii (Fu, 1595) (tab. 2) . Rezy tkaniva obličiek farbené hematoxylínom a eczíncm (H&E-farbenie) z myši 816 ukázali, že morfológia glomerulov u tejto myši bola abnormálna, zatial čo zvyšok obličkového tkaniva bol normálny (dáta neuvedené). Mnohé z BAFF transgénnych myší mali proteinúriu (tab. 2). Imunohistochemické vyšetrenie zmrazených rezov sleziny z myši 816 ukázalo abnormálne a extenzívne farbenie B-lymfocytov a redukované farbenie T-lymfocytov a toto pozorovanie bolo potvrdené a; u pctomsfa (pozri ďalej a obr. 12) .

Použitím dvojfarebnej FACS analýzy bol vypočítaný pomer % B-lymfocytov pozitívnych na B220 k % T-lymfocytov pozitívnych na CD4. Tento pomer bol 2 až 7x vyšší u zakladateľských BAFF transgénnych myší ako u kontrolných BDF1 negatívnych myši (tab. 2), čo znamená nárast populácie B-lymfocytov u BAFF Tg myší. Bolo vybraných 9 z týchto zakladateľských myší na vytvorenie rôznych línií transgénnych myší (tab. 2). Žiadna zo zostávajúcich zakladateľských BAFF Tg myší ani z potomstva neukazovala žiadne známky zlého zdravotného stavu mesiace po uhynutí zakladateľských myší č. 696, 700, 811 a 816, takže možným vysvetlením je, že tieto myši exprimovali vyššie hladiny BAFF, čo mohlo spôsobiť ich uhynutie. Nadmerná expresia („overexpression) v pečeni bola potvrdená Northernovou analýzou (dáta neuvedené). U všetkých BAFF Tg myší vyšetrených histologický sa v pečeni neukázali žiadne abnormality, čo ukazuje, že lokálna nadmerná expresia BAFF nevyvoláva žiadne imunologické alebo patologické udalosti. ELISA test na myší BAFF nebol k dispozícii, avšak pôvodcovia ukázali, že 2% sérum z BAFF Tg myší, nie však z kontrolných myší, blokovalo väzbu rozpustného myšieho BAFF značeného s Flag, pochádzajúceho z cicavčích buniek, na bunky 3J.-.3. Okrem toho 5¾ sérum z BAFF Tg myší, nie však z kontrolných myší, zvyšovalo proliteráciu ľudských B-lymfocytov z PBL v prítomnosti anti-μ (dáta neuvedené). Na základe týchto údajov je možné odvodiť, že v krvi BAFF Tg myší je prítomné podstatná množstvo rozpustného BAFF.

Príklad 2

Periférna lymfocytóza je u E.-.ľľ Tg myší spôsobená zvýšeným počtom B-lymfocytov

U populácie transgénnych myší bolo zistené, že majú viac lymfocytov v krvi v porovnaní s kontrolnými negatívnymi zvieratami a dosahujú počtu až 13000 lymfocytcv/1 μΐ krvi (obr. 7A^ . Oproti tomu počet granulccytov v 1 μΐ krvi bol tak u BAFF transgénnych ako aj kontrolných myší v medziach normy (obr. 7A). Pretože FACS analýza lymfocytov periférnej krvi (PBL) u 1S BAFF Tg myší pochádzajúcich zo 6 rôznych zakladateľských BAFF Tg myší použitím protilátok anti-CD4 a anti-B220 ukázala zvýšenie pomeru

B/T (obr. 7Β a 7C) , zvýšená hladina B-lymfocytov bola spôsobená expanziou subpopulácie B-lymfocytov. A podobne, použitím tejto metódy výpočty absolútnych množstiev cirkulujúcich T-lymfocytov CD4 ukázali 50% zníženie tejto subpopulácie T-lymfocytov u BAFF Tg myší v porovnaní s kontrolnými zvieratami a to isté bolo pozorované pri subpopulácii T-lymfocytov CD8 (dáta neuvedené). Všetky B-lymfocyty z PBL BAFF Tg myší mali zvýšenú expresiu MHC triedy II a Bcl-2 v porovnaní s B-lymfocytmi kontrolných myší (obr. 7D a 7E) , čo ukazuje na istú mieru aktivácie B-lymfocytov u BAFF Tg myší. T-lymfocyty v krvi BAFF Tg myší neexprimujú včasné aktivačné markery CD69 alebo CD25, avšak 40 až 56% ±lymfocytov CD4 alebo CD8 boli aktivované efektorové T-lymfocyty s fenotypom CD44^hl, L-selektín‘^c, zatial čo u kontrolnýcn myší tento fenotyp predstavuje len 8 až 12% (obr. 7F). Takže BAFF Tg myši vykazovali zreteľné príznaky B-lymfocytózy a globálnej aktivácie B-lymfocytov spoločne so zmenami T-lymfocytov.

Príklad 3

Expandované kompartmenty B-lymfocytov sú zložené zo zrelých buniek

Na zistenie toho, či overexpresia BAFF u transgénnycn myší ovplyvňovala kompartment 3-lymfccytcv centrálne v kostné; dreni a periférne v sekundárnych lymfatických orgánoch, bola technikou FACS vyšetrená slezina, kostná dreň a mezenterické lymfatické uzliny zo siedmych BAFF Tg myší a siedmych kontrolných myší pochádzajúcich zo štyroch rôznych zakladateľských myší. Kompartment zrelých B-lymfocytov bol analyzovaný farbením aj s anti-B220 aj s anti-ľgM. Dve reprezentatívne BAFF Tg myši a jedna kontrolná myš sú ukázané na obr. 8. Kompartment zrelých Elymfocytov (IgM+, Ξ220+) bol zväčšený tak v slezine akc aj v mezenterických lymfatických uzlinách (obr. 8A, horný a spodný panel). Analýza kompartmentov 3-lymfocytov B220+/IgM+ (obr. 7A, stredný panel) alebo proB-buniek (CD43+/B220+) a preB-buniek (CD43-/B220-) v kostnej dreni (obr. 8B) ukázala, že BAFF Tg myši a kontrolné myši boli podobné. Tieto dáta ukazujú, že overexpresia BAFF ovplyvňuje proliferáciu periférnych zrelých Blymfocytov, nie ale prekurzorov B-lymfocytov v kostnej dreni. FACS analýza subpopulácií B-lymfocytov v slezine ukázala zvýšený podiel marginálnej zóny (MZ) B-lymfocytov u BAFF Tg myší v porovnaní s kontrolnými zvieratami (tab. 3). Populácia folikulárnych B-lymfocytov zostala proporcionálna tak u BAFF Tg myší ako aj u kontrolných myší, zatiaľ čo frakcia novo vytváraných B-lymfocytov bola u 3AFF Tg myší v porovnaní s kontrolou mierne znížená (tab. 3). Tento výsledok bol potvrdený tiež na B-lymfocytoch B223t zo sleziny použitím protilátok antiCD38 versus anti-CD24 a anti-IgM versus anti-IgD a analýzou populácie MZ B-lymfocytov na fenctyp CD38^hl/CD24 ⁺ a IgM^hl/IgD^loz ako už bolo publikované íOliver et al., 199^) (dáta neuvedené). Imunohistochemická analýza použitím protilátky anti-myšie IgM ukázala expanziu oblasti IgM-bright MZ B-lymfocytov v slezine BAFF Tg myší v porovnaní s kontrolou (dáta neuvedené). Všetky Blymfocyty B220+ z BAFF Tg myší exprimovali vyššie hladiny MHC triedy II (tab. 3) a Bcl-2 ídáta neuvedené) v porovnaní s Blymfocytmi sleziny kontrolných zvierat, čo ukazuje, že Blymfocyty v slezine a tiež E-lymfocyty z F5L sú v aktivovanom stave.

Príklad 4

BAFF Tg myši majú vyššiu hladinu celkových imunoglobuiínov, reumatoidných faktorov a cirkulujúcich imunitných komplexov v sére

Zväčšený komcartmer.t E-lymfocytov u BAFF Tg myší vedie k predpokladu, že hladina celkových ľg v krvi u týchto myší môže byť tiež zvýšená. SDS-PAGE analýza séra z BAFF Tg myší a kontrolných zvierat ukázala, že pásiky ťažkých a lahkých reťazcov IgG sú prinajmenšom ICx intenzívnejšie u 3 zo 4 BAFF Tg myší v porovnaní s kontrolným sérom (obr. 9A) . Podobne test

ELISA séra BAFF Tg myší ukázal významne vyššiu hladinu celkových Ig v porovnaní s kontrolnými zvieratami (obr. 9B).

SDS-PAGE, testom u vyvolali

Aj napriek vysokým hladinám, pozorovaným v mimoriadne vysoké hladiny Ig detegované ELISA niektorých myší, napr. 697-5, 816-8-3 a 823-20, podozrenie na prítomnosť reumatoidných faktorov (RF) v sére alebo autoprotilátok proti antigénovým determinantom Fc fragmentu IgG (Jefferis, 1995). Tieto protilátky môžu viazať kozí anti-myší Ig použitý na potiahnutie ELISA doštičiek a dávať teda omylom vysoké hodnoty. ELISA platničky boli preto potiahnuté normálnym irelevantným kozím Ig a bola meraná väzba Ig z BAFF Tg myši na normálne kozie Ig. Obr. 9C ukazuje, že sérum z väčšiny EAFF Tg myší obsahuje Ig reagujúce s normálnym kozím Ig, zatiaľ čo len 2 z celkovo 19 kontrolných myší ukazovali reaktivitu v rovnakom teste. Týmito RF boli hlavne protilátky izotypu IgM, IgA a IgG2a (dáta neuvedené).

Prítomnosť RF môže byť spojená s prítomnosťou vysokých hladín cirkulujúcich imunitných komplexov (CIC) a kryoglcbulínov v krvi (Jefferis, 1995) . Na overenie toho, či BAFF Tg myši majú alebo nemajú abnormálne hladiny CIC v sére, bol u 21 BAFF Tg myší analyzovaných vyššie na detekciu CIC použitý väzbový test založený na Ciq. Len 5 BAFF Tg myší malo významne vysoké hladiny CIC v porovnaní s kontrolnými myšami, jednako tieto zvieratá zodpovedali tým, ktoré mali najvyššie hladiny celkového Ig a reumatoidného faktora (obr. 9D) . Pozorovalo sa tiež vytváranie crecipitátov, keď bolo sérum z BAFF Tg myší zriedené 1/15 vodou, na rozdiel od séra kontrolných myší, čo poukazuje na prítomnosť kryogiobuiínov u týchto myší (dáta neuvedené). Takže okrem hycerplázie B-lymfocytov vykazujú BAFF Tg myši aj silnú hyperglobulinémiu spojenú s výskytom RF a CIC.

Príklad 5

Niektoré BAFF Tg myši majú vysoké hladiny autoprotilátok proti -edncreťazcovej (ss) DNA a proti dvojreťazcovej (ds) DNA

Na začiatku sa pozorovali abnormality obličiek pripomínajúce ochorenie ako lupus u dvoch zo štyroch zakladateľských, myši (pozri tab. II) . Prítomnosť anti-DNA autoprotilátok bola opísaná tiež u pacientov so SLE alebo u myší s ochorením podobným SLE (SWR x NZB)Fl (SNF1) myši (Datta et al., 1987). Hladina antissDNA autoprotilátok bola detegovaná u EAFF Tg myší, u ,<torýcn bola predtým nájdená najvyššia hladina celkového Ig v sére (obr. 10A) . Analyzovalo sa sérum dvoch BAFF Tg myší negatívnych na protilátky proti ssDNA (697-5 a 816-1-1) a troch transgénnych myší sekrétujúcich protilátky anti-ssDNA (820-14, 816-8-3 a 8207) na prítomnosť protilátok anti-dsDNA súčasne s piatimi kontrolnými zvieratami. BAFF Tg myši tiež sekrétovali anti-dsDNA protilátky, avšak hladina sekrécie nie vždy korelcvala s hladinou protilátok anti-ssDNA, ako r.apr. v sére BAFF Tg myši č. 697-5, ktoré neobsahovalo detegcvatelnú hladinu protilátok. antissDNA a pritom bolo zreteľne pozitívne na prítomnosť protilátok anti-dsDNA (obr. 10B). Takže BAFF Tg myši vykazujúce najsilnejšiu hyperglobulinémiu sekrétovali patologické hladiny anti-DNA autoprotilátok. Okrem toho boli u týchto myší, čo tiež pripomína problémy spojené s lupusom, detegované depozity imunoglobulínov v obličkách, a to zo šiestich analyzovaných BAFF Tg myší (obr. 10C), tri nesekrétcvali detegovatelnú nladinu anti-DNA protilátok (dáta neuvedené).

Príklad 6

BAFF Tg myši majú zväčšené folikuly B-lymfocytov, početné germinálne centrá, znížený počet der.dritických buniek a zvýšený počet plazmatických buniek tak v slezine ako aj v mezenterických lymfatických uzlinách (MLN)

BAFF Tg myši mali zväčšené sleziny, MLN (dáta neuvecené) a Peyerove pláty (obr. 11) . Imunohistcchemické vyšetrenie ukázalo prítomnosť zväčšených folikulov Ξ-lymfocytov a redukované lymfatické pláty periférnych artérií (PALS alebo oblasť Tlymfocytov) u BAFF Tg myší (obr. 12B) . Zaujímavé je, že u neimunizovaných kontrolných myší bolo pozorovaných len niekolko germinálnych centier (čo bolo typické pre túto skupinu) a tie, ktoré sa vyskytovali, boli len malé (obr. 12C), zatial čo u BAFF Tg myši, ktoré neboli imunizované, sa vyskytovali početné germinálne centrá (obr. 12D) . Farbenie použitím anti-CDllc na dendritické bunky v zóne T-lymfocytov a marginálnej zóne kontrolných myší (obr. 12E) bolo výrazne redukované u BAFF Tg myší (obr. 12F). Plazmatické bunky pozitívne na syndecan-1 boli takmer nedetegovatelné v slezine kontrolných myší (obr. 12G), aj keď červená dreň BAFF Tg myší bola silne pozitívna na syndecan-1 (obr. 12H). Velmi podobné pozorovania boli urobené pri MLN (obr. 13) . V MLN BAFF Tg myší boli oblasti B-lymfocytov výrazne zväčšené (obr. 13B) na rozdiel od normálnych uzlín, kde boli folikuly B-lymfocytcv lahko rozpoznateľné v periférii uzliny pod puzdrom s typickou parakortikálnou oblasťou T-lymfocytov (obr. 13A) . Medula MLN z EAFF Tg myší bola zaplnená bunkami pozitívnymi na syndecan-1, čo sú zrejme plazmatické bunky (obr. 13H). Na záver je možné zhrnúť, že výsledky analýzy sekundárnych lymfatických orgánov u EAFF Tg myší boli úplne konzistentné s fenotypom expandovanýcn B-lymfocytcv ukazujúc početné bunkové abnormality a intenzívnu imunitnú aktivitu.

Zoznam citovanej literatúry

1. Smith et al. (1994)Ce« 76:959-962.

2. Vassalli (1992) Annu. Rev. Immunol. 10:411-452.

3. De Togni et al. (1994) Science 264:703-707.

4. Koni et a!. (1997) Immunity 6:491-500.

5. Amakawa et al. (1996) Celí 84:551-562.

6. Russell et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4409-4413.

7. Zheng et al. (1995) Náture 377:348-351.

8. van Kooten and Bancheieau (1997) Curr. Opin. Immunol. 9:330-337.

9. Stuber and Strober (1996). J. Exp. Med 183:979-989.

10. Schneider et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:18827-18833.

11. Hahne et al. (1998) J. Exp. Med 188:1185-1190.

12. Hahne et al. (1996) Science 274:1363-1366.

13. Grimaitre et al. (1997) Eur. J. Immunol. 27:199-205.

14. Thome et al. (1997) Náture 386:517-521.

15. Schneider et al. (1998) J. Exp. Med 187:1205-1213.

16. Matsudaira, P. (1987) J. Biol. Chem. 262:10035-10038.

17. Armitage et al. (1992) Nalure 357:80-82.

18. Bucher et al. (1996) Computer Chem. 20:3-24.

19. Banner et al. (1993) Celí 73:431-445.

20. Nagata (1997) Celí 88:355-365.

21. Black et al. (1997) Náture 385:729-733.

22. Wong et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:25190-25194.

23. Kindler and Zubler. (1997) J. Immunol. 159:2085-2090.

24. Sonoki et al. (1995) Leukémia 9:2093-2099.

25. Magrath, I. (1990) Adv Cancer Res 55:133-270.

26. Garside et al. (1998) Science 281:96-99.

27. MacLennan etal. (1997) Immunol. Rev. 156:53-66.

28. Dubois et al. (1997). J. Exp. Med. 185:941-951.

29. Tsubata et al. (1993) Náture 364:645-648.

30. Chicheportiche et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:32401-32410.

31. Nakayama (1997) Biochem. J. 327:625-635.

32. Jefferis, R. (1995). Rheumatoid factors, B cells and irnmunoglobulin genes. Br Med. Bull. 57,312-331.

33. Schneider et al. (1999) J. Exp. Med. 189, 1747-1756.

34. Mcknights et al. (1983) Celí 34,335-341.

35. Datta et al. (1987) J. Exp. Med. 165,1252-1261.

Zoznam sekvencií <140> PCT/US00/01788 <141> 2000-01-25 <150> 60/143,228 <151> 1999-07-09 <150> 60/117,169 <151> 1999-01-25 <160> 22 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 218 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Met 1

Asp

Ser

Thr Glu Arg Glu Gin Ser Arg

Leu Thr

Ser

Cys 15

Leu

5

10

Lys

Arg

Glu

Met

Lys

Leu

Lys

Glu

Cys

Val

Ser

íle

Leu

Pro

20

25

30

Arg

Lys

Glu

Ser

Pro

Ser

Val

Leu

Ser

Cys

Leu

Thr

Val

35

40

45

Ser

Phe

Tyr

Gin

Val

Ala

Leu

Gin

Gly

Asp

Leu

Ala

Ser

Leu

Arg

50

55

60

Ala

Glu

Leu

Gin

Gly

His

Ala

Glu

Lys

Leu

Pro

Ala

Gly

Ala

Lys

65

70

75

80

íle

Phe

Glu

Pro

Ala

Pro

Gly

Glu

Gly

Asn

Ser

Gin

Asn

Ser

85

90

95

Arg Asn Lys Arg Ala Val Gin Gly Pro Glu Glu Thr Val Thr Gin Asp

100 105 110

Cys Leu Gin Leu

íle

Ala

Asp

Ser Glu Thr Pro Thr íle Gin Lys

Gly

115

120

125

Ser

Tyr

Thr

Phe

Val

Pro

Trp

Leu

Ser

Phe

Lys

Arg

Gly

Ser

Ala

130

135

140

Leu

Tyr

Gly

Gin

Val

Leu

Tyr

Thr

Asp

Lys

Thr

Tyr

Ala

Met

Gly

Hls

145

150

155

160

Leu

íle

Gin

Arg

Lys

Val

Kis

Val

Phe

Gly

Asp

Glu

Leu

Ser

Leu

165

170

175

Val

Thr

Leu

Phe

Arg

Cys

íle

Gin

Asn

Leu

Glu

Gly

Asp

Glu

Leu

180

185

190

Gin

Leu

Ala

íle

Pro

Arg

Glu

Asn

Ala

Gin

íle

Ser

Leu

Asp

Gly

Asp

195

200

205

Val

Thr

Phe

Gly

Ala

Leu

Lys

Leu

210 215 <210> 2 <211> 232 <212> PRT

<213>

myš

<400> 2

Met

Asp

Glu

Ser

Ala

Lys

Thr

Leu

Pro

Cys

Leu

Cys

Phe

Cys

1

5

10

15

Ser

Glu

Lys

Gly

Glu

Asp

Met

Lys

Val

Gly

Tyr

Asp

Pro

íle

Thr

Pro

20

25

30

Gin

Lys

Glu

Gly

Ala

Val

Leu

Ser

Phe

Thr

Ala

Met

35

40

45

Ser

Leu

Tyr

Gin

Leu

Ala

Leu

Gin

Ala

Asp

Leu

Met

Asn

Leu

Arg

50

55

60

Met

Glu

Leu

Gin

Ser

Tyr

Arg

Gly

Ser

Ala

Thr

Pro

Ala

Lys

65

70

75

80

Leu

Thr

Pro

Ala

Pro

Arg

Pro

His

Asn

Ser

Arg

Gly

His

85

90

95

Arg Asn Arg Arg Ala Phe Pro Gly Pro 100 105

Asp Leu Ser Ala Pro Pro Ala Leu Arg 115 120

Gin Leu íle Ala Asp Ser Asp Thr Pro 130 135

Thr Phe Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe 145 150

Ser Gin Val Leu Tyr Thr Asp Pro íle 165

Gin Arg Lys Lys Val His Val Phe Gly 180 185

Leu Phe Arg Cys íle Gin Asn Leu Glu 195 200

Ala íle Pro Arg Glu Asn Ala Gin íle 210 215

Phe Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu 225 230 <210> 3 <211> 102 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Val Thr Gin Asp Cys Leu Gin Leu íle 1 5 íle Gin Lys Gly Ser Tyr Thr Phe Val 20 25

Arg Gly Ser Ala Leu Glu Glu Lys Tyr 35 40

Lys Thr Tyr Ala Met Gly His Leu íle 50 55

Phe Gly Asp Glu Leu Ser Asn Asn Ser 65 70

Glu Glu Thr Glu Gin Asp Val 110

Asn íle íle Gin Asp Cys Leu 125

Thr íle Arg Lys Gly Thr Tyr 140

Lys Arg Gly Asn Ala Leu Tyr 155 160

Phe Ala Met Gly His Val íle 170 175

Asp Glu Leu Ser Leu Val Thr 190

Glu Gly Asp Glu íle Gin Leu 205

Ser Arg Asn Gly Asp Asp Thr 220

Ala Asp Ser Glu Thr Pro Thr 10 15

Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys 30

Gly Gin Val Leu Tyr Thr Asp 45

Gin Arg Lys Lys Val His Val 60

Cys Tyr Ser Ala Gly íle Ala 75 80

Lys Leu Glu Glu Gly Asp Glu Leu Gin Leu Ala íle Pro Arg Glu Asn 85 90 95

Ala Gin íle Ser Leu Asp 100 <210> 4 <211> 96 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Lys 1

Gin His

Ser Val 5

Leu His Leu Val

Pro íle Asn Ala Thr Ser Lys

10

15

Asp

Ser

Asp

Val

Thr

Glu

Val

Met

Trp

Gin

Pro

Ala

Leu

Arg

20

25

30

Gly

Arg

Gly

Leu

Gin

Ala

Gin

Tyr

Ser

Gin

Val

Leu

Phe

Gin

Asp

Val

35

40

45

Thr

Phe

Thr

Met

Gly

Gin

Val

Ser

Arg

Glu

Gly

Gin

Gly

Arg

Ala

50

55

60

Tyr

Asn

Ser

Cys

Tyr

Ser

Ala

Gly

Val

Phe

His

Leu

His

Gin

Gly

Asp

65

70

75

80

íle

Leu

Ser

Val

íle

Pro

Arg

Ala

Arg

Ala

Lys

Leu

Asn

Leu

Ser

90 95 <210> 5 <211> 104 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5

Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gin Ala Glu Gly 15 10 15

Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly 20 25 30

Val Tyr

Ser Gin 35

Val Leu Phe Lys 40

Gly

Gin

Gly

Cys

Pro 45

Ser Thr His

Val

Leu

Thr

His

Thr

íle

Ser

Arg

íle

Ala

Val

Ser

Tyr

Gin

Thr

50

55

60

Glu

Gly

Ala

Glu

Ala

Lys

Pro

Trp

Tyr

Glu

Pro

íle

Tyr

Leu

Gly

65

70

75

80

Val

Phe

Gin

Leu

Glu

Lys

Gly

Asp

Arg

Leu

Ser

Ala

Glu

íle

Asn

Arg

85

90

95

Pro

Asp

Tyr

Leu

Asp

Phe

Ala

Glu

100 <210> 6 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 6

Glu Leu 1

Arg

Lys Val Ala 5

His

Leu

Thr

Gly 10

Lys

Ser

Asn

Ser

Arg 15

Ser

Met Pro

Leu

Glu Trp Glu 20

Asp

Thr

Tyr 25

Gly

íle

Val

Leu

Leu 30

Ser

Gly

Val Lys

Tyr 35

Ser Lys Val

Tyr

Phe 40

Arg

Gly

Gin

Ser

Cys 45

Asn

Leu

Pro Leu 50

Ser

His Lys Val

Tyr 55

Met

Arg

Asn

Ser

Lys 60

Tyr

Pro

Gin

Met

Trp Ala 65

Arg

Ser Ser Tyr 70

Leu

Gly

Ala

Val

Phe 75

Asn

Leu

Thr

Ser

Ala 80

Asp His

Leu

Tyr Val Asn 85

Val

Ser

Glu

Leu 90

Ser

Leu

Val

Asn

Phe 95

Glu

Glu <210> 7 <211> 102 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 7 Thr Leu Lys 1

Pro Ala 5

Ala

His

Leu

íle Gly Asp Pro Ser Lys Gin Asn

10

15

Ser

Leu

Trp

Arg

Ala

Asn

Thr

Asp

Arg

Ala

Phe

Leu

Gin

Asp

Gly

20

25

30

Phe

Tyr

Ser

Gin

Val

Phe

Ser

Gly

Lys

Ala

Tyr

Ser

Pro

Lys

Ala

35

40

45

Thr

Ser

Pro

Leu

Tyr

Leu

Ala

His

Glu

Val

Gin

Leu

Phe

Ser

50

55

60

Gin

Tyr

Pro

Phe

Pro

Trp

Leu

His

Ser

Met

Tyr

His

Gly

Ala

Phe

65

70

75

80

Gin

Leu

Thr

Gin

Gly

Asp

Gin

Leu

Ser

Thr

His

Thr

Asp

Gly

íle

Pro

85

90

95

His

Leu

Val

Leu

Ser

Phe

100 <210> 8 <211> 109 <212> PRT <213 > Homo sapiens

<400> 8

íle 15

Pro

Glu 1

Ala

Gin

Pro

Phe Ala His Leu Thr íle

Asn Ala Thr

Asp

5

10

Ser

Gly

Ser

His

Lys

Val

Ser

Leu

Ser

Trp

Tyr

His

Asp

Arg

Gly

20

25

30

Trp

Gly

Lys

íle

Ser

Asn

Met

Tyr

Ala

Asn

íle

Cys

Phe

Arg

His

35

40

45

Glu

Thr

Ser

Gly

Asp

Leu

Ala

Thr

Glu

Tyr

Leu

Gin

Leu

Met

Val

Tyr

50

55

60

Val

Thr

Lys

Thr

Ser

íle

Lys

íle

Pro

Ser

Glu

Phe

His

Phe

Tyr

Ser

65

70

75

80

íle

Asn

Val

Gly

Phe

Lys

Leu

Arg

Ser

Gly

Glu

íle

Ser

85

90

95

íle Glu Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gin

100

105 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Homo saplens <400> 9 actgtttctt ctggaccctg aacggc 26 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 gacaagcttg ccaccatgga tgactccaca <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 actagtcaca gcagtttcaa tgc 23 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 ctgcagggtc cagaagaaac ag <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 ggagaaggca actccagtca gaac 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens

<400> 14 caattcatcc ccaaagacat ggac
<210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Homo	saplens
<400> 15 tcggaacaca	acgaaacaag	tc
<210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Homo	sapiens
<400> 16 cttctccttc	acctggaaac	tgactg
<210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Homo	sapiens
<400> 17 ggcatcgtga	tggactccg
<210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Homo	sapiens
<400> 18 gctggaaggt	ggacagcga
<210> 19 <211> 35 <212> DNA <213> Homo	sapiens
<400> 19 taagaatgcg	gccgcggaat	ggatgagtct gcaaa
<210> 20 <211> 35 <212> DNA <213> Homo	sapiens

<400> 20 taagaatgcg gccgcgggat cacgcactcc agcaa
<210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Homo	sapiens
<400> 21 gcagtttcac	agcgatgtcc	t
<210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Homo	sapiens
<400> 22

gtctccgttg cgtgaaatct g

TV 40¼ - ZO O?

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje terapeuticky účinné množstvo prípravku vybratého zo skupiny obsahujúcej:

a) ligand BAFF alebo jeho aktívny fragment,

b) ligand BAFF alebo jeho aktívny fragment a protilátku anti-μ,

c) ligand BAFF alebo jeho aktívny fragment a ligand CD40 a

d) ligand BAFF alebo jeho aktívny fragment a molekulu anti-CD40 ligand a je určený na použitie na stimuláciu rastu B-lymfocytov u zvieraťa.
2. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje terapeuticky účinné množstvo prípravku vybratého zo skupiny obsahujúcej:

a) ligand BAFF alebo jeho aktívny fragment,

b) ligand BAFF alebo jeho aktívny fragment a protilátku anti-μ,

c) ligand BAFF alebo jeho aktívny fragment a ligand CD40 a

d) ligand BAFF alebo jeho aktívny fragment a molekulu anti-CD40 ligand a je určený na použitie na stimuláciu produkcie imunoglobulínov u zvieraťa.
3. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje terapeuticky účinné množstvo prípravku vybratého zo skupiny obsahujúcej:

a) ligand BAFF alebo jeho aktívny fragment, b) ligand BAFF alebo j eho aktívny fragment a protilátku anti-μ, c) ligand BAFF alebo j eho aktívny fragment a ligand CD40 a d) ligand BAFF alebo j eho aktívny ’ fragment a molekulu anti-CD40

ligand a je určený na použitie na kostimuláciu rastu B-lymfocytov a produkcie imunoglobulínov u zvieraťa.
4. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje terapeuticky účinné množstvo prípravku vybratého zo skupiny obsahujúcej:

a) ligand BAFF alebo j eho aktívny fragment, b) ligand BAFF alebo jeho aktívny fragment a protilátku anti-μ, c) ligand BAFF alebo jeho aktívny fragment a ligand CD40 a d) ligand BAFF alebo j eho aktívny fragment a molekulu anti-CD4 0

ligand a je určený na použitie na stimuláciu rastu a zrenia B-lymfocytov indukovaných dendritickými bunkami.
5. Farmaceutický prípravok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že ligand BAFF je rozpustným ligandom BAFF.
6. Farmaceutický prípravok podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že rozpustný ligand BAFF je rekombinantný ligand BAFF.
7. Farmaceutický prípravok podía ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že molekula anti-CD40 je monoklonálnou protilátkou.
8. Farmaceutický prípravok podía ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že zvieraťom je cicavec.
9. Farmaceutický prípravok podía nároku 8, vyznačujúci sa t ý m, že cicavcom je človek.
10. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje terapeuticky účinné množstvo prípravku vybratého zo skupiny obsahujúcej:

a) molekulu anti-BAFF ligand alebo jej aktívny fragment,

b) rekombinantnú neoperívnu molekulu ligandu BAFF alebo jej aktívny fragment,

c) protilátku špecifickú pre ligand BAFF alebo jeho aktívny fragment a

d) protilátku špecifickú pre receptor ligandu BAFF alebo jeho epitop a je určený na použitie na inhibíciu rastu B-lymfocytov u zvieraťa.
11. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje terapeuticky účinné množstvo prípravku vybratého zo skupiny obsahujúcej:

a) molekulu anti-BAFF ligand alebo jej aktívny fragment,

b) rekombinantnú neoperívr.u aktívny fragment, molekulu ligandu EAFF alebo jej c) protilátku špecifickú pre ligand BAFF alebo jeho aktívny fragment a d) protilátku špecifickú pre receptor ligandu BAFF alebo jeho

epitop a je určený na použitie na inhibíciu produkcie imunoglobulínov u zvieraťa.
12. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje terapeuticky účinné množstvo prípravku vybratého zo skupiny obsahujúcej:

a) molekulu anti-3AFľ liganc alebo jej aktívny fragment,

b) rekombinantnú necperívnu molekulu Ugandu BAFF aleoo jej aktívny fragment,

c) protilátku špecifickú pre ligand BAFF alebo jeho aktívny fragment a

d) protilátku špecifickú pre receptor ligandu EAFF alebo jeho epitop e určený na použitie koinhibíciu rastu B-lymfocytov a produkcie imunoglobulínov u zvieraťa.
13. Farmaceutický príprave'-·., vyznačujúci sa že obsahuje terapeuticky ičmné množstvo prípravku vybr skupiny obsahujúcej:

hc zo

a) molekulu anti-BAFF ligand alebo jej aktívny fragment,

b) rekombinantnú neoperívnu molekulu ligandu BAFF alebo jej aktívny fragment,

c) protilátku špecifickú pre ligand BAFF alebo jeho aktívny fragment a

d) protilátku špecifickú pre receptor ligandu BAFF alebo jeho epitop a je určený na použitie na inhibíciu rastu a zrenia B-lymfocytov indukovaných dendritickými bunkami.
14. Farmaceutický prípravok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 10 až 13, vyznačujúci sa tým, že anti-BAFF ligand je rozpustným anti-BAFF ligandcm.
15. Farmaceutický prípravok podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že anti-BAFF ligand je rekombinantným antiBAFF ligandom.
16. Farmaceutický prípravok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 10 až 13, vyznačujúci sa tým, že protilátka anti-BAFF je monoklonálnou protilátkou.
17. Farmaceutický prípravok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 10 až 13, vyznačujúci sa tým, že protilátka anti-BAFF receptor je monoklonálnou protilátkou.
18. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje terapeuticky účinné množstvo prípravku vybratého zo skupiny obsahujúcej:

a) ligand BAFF alebo jeho aktívny fragment,

b) ligand BAFF alebo jeho aktívny fragment a protilátku anti-μ,

c) ligand BAFF alebo jeho aktívny fragment a ligand CD40,

d) ligand BAFF alebo jeho aktívny fragment a molekulu anti-C04C ligand,

e) molekulu anti-BAFF ligand alebo jej aktívny fragment,

f) rekombinantnú neoperívnu molekulu ligandu BAFF alebo jej aktívny fragment,

g) protilátku špecifickú pre ligand BAFF alebo jeho aktívny fragment a

h) protilátku špecifickú pre receptor ligandu BAFF alebo jeho epitop a je určený na použitie na liečbu autoimunitných chorôb.
19. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje terapeuticky účinné množstvo vektora obsahujúceho gén kódujúci molekulu príbuznú s BAFF, ktorý sa a) vnesie do požadovaných buniek a b) exprimuje tam gén a je určený na použitie na liečbu chorôb súvisiacich s ligandom BAFF.

2C. Farmaceutický prípravok podlá nároku 19, vyznačujúci sa tým, že molekula príbuzná s BAFF je vybratá zo skupiny obsahujúcej:

a) ligand BAFF alebo jeho aktívny fragment,

b) ligand BAFF alebo jeho aktívny fragment a protilátku anti-μ,

c) ligand BAFF alebo jeho aktívny fragment a ligand CD40,

d) ligand BAFF alebo jeho aktívny fragment a molekulu anti-CD40 licand, r p

e) molekulu anti-BAFF ligand alebo jej aktívny fragment,

f) rekombinantnú neoperívnu molekulu ligandu BAFF alebo jej aktívny fragment,

g) protilátku špecifickú pre ligand BAFF alebo jeho aktívny fragment a

h) protilátku špecifickú pre receptor ligandu BAFF alebo jeho epitop.
21. Farmaceutický prípravok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 18 až 20, vyznačujúci sa tým, že ligand BAFF je rozpustným ligandom BAFF.
22. Farmaceutický prípravok podľa nároku 21, vyznačuj ú c i sa t ý m, že rozpustný ligand BAFF je rekombinantným ligandom BAFF.
23. Farmaceutický prípravok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 18 až 20, vyznačujúci sa tým, že molekula anti-CD40 je monoklonálnou protilátkou.
24. Farmaceutický prípravok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 18 až 20, vyznačujúci sa tým, že anti-BAFF ligand je rozpustný.
25. Farmaceutický prípravok podľa nároku 24, vyznačujúci sa t ý m, že rozpustný anti-BAFF ligand je rekombinantným anti-BAFF ligandom.

ΊΟ
26. Farmaceutický prípravok podlá ktoréhokoľvek z nárokov 18 až 20, vyznačujúci sa tým, že protilátka anti-BAFF je monoklonálnou protilátkou.
27. Farmaceutický prípravok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 18 až 20, vyznačujúci sa tým, že protilátka anti-BAFF receptor je monoklonálnou protilátkou.
28. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje činidlo schopné interferovať s väzbou ligandu BAFF na jeho receptor a je určený na použitie na indukciu bunkovej smrti.
29. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje účinné množstvo činidla schopného interferovať s väzbou ligandu BAFF na jeho receptor a je určený na použitie na liečbu, potlačenie alebo zmenu imunitnej reakcie zahrnujúc signalizačnú dráhu medzi liaandom BAFF a jeho receptorom.
30. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje terapeuticky účinné množstvo protilátky špecifickej pre ligand BAFF alebo jeho aktívny fragment a je určený na inhibiciu zápalov.
31. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje terapeuticky účinné množstvo protilátky špecifickej pre receptor ligandu BAFF alebo jeho epitop a je určený na inhibiciu zápalov.
32. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje terapeuticky účinné množstvo ligandu BAFF alebo jeho aktívneho fragmentu a je určený na reguláciu vývinu hematopoetických buniek.
33. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje terapeuticky účinné množstvo inhibítora rastu Blymfocytov a je určený na liečbu hypertenzie u zvieraťa.
34. Farmaceutický prípravok podľa náreku 33, vyznačujúci sa t ý m, že inhibítor rastu B-iymfocytov je vybratý zo skupiny obsahujúcej:

a) molekulu anti-BAFF ligand alebo jej aktívny fragment,

b) rekombinantr.ú neoperívnu molekulu ligandu EAFF alebo jej aktívny fragment,

c) protilátku špecifickú pre ligand EAFF alebo jeho aktívny fragment a

d) protilátku špecifickú pre receptor ligandu BAFF alebo jeho epitop.
35. Farmaceutický prípravok podlá nároku 34, vyznačujúci sa t ý m, fe anti-BAFF ligand je rozpustný.
36. Farmaceutický prípravok podľa náro-;u 35, vyznačujúci sa t ý m, že rozpustný anti-BAFF ligand je rekombinantným anti-EAFF iigandom.
37. Farmaceutický prípravou podľa nároku 34, vyznačujúci sa tým, že protilátka anti-BAFF je monoklonálnou protilátkou.
38. Farmaceutický príprave'--, podľa r.ároku Ξ4, vyznačuj ú c i sa tým, že protilátka anti-BAFF receptor je monoklonálnou protilátkou.
39. Farmaceutický prípravc< pcoľa nároku 34, vyznačuj ú c i sa t ý m, že zvieraťom je cicavec.
40. Farmaceutický príprave.-: pcoľa r.ároko 39, vyznačujúci sa t ý m, že cicavcov je človek.
41. Farmaceutický príprave<, vyznačujúci sa tým, že obsahuje terapeuti o-vy ičinné množstvo --.oinhibitora rastu Blymfocytov a sekrécie imunoglcbulínov a je určený na liečbu hypertenzie u zvieraťa.
42. Farmaceutický príprave-:, vyznačujúci sa tým, že obsahuje terapeuti o'-v- ľčinné množstvo inhibítora rastu 3lymfocytov a je určený na liečbu kardiovaskulárnych chorôb u zvieraťa.
43. Farmaceutický prie že obsahuje teraceutio lymfocytov a sekrécie kardiovaskulárnych chcr <, v y z n a č u j ú c i sa tým, činné množstve kcinhibitora rastu Bncglcbulínov a o v i e r a t a.

určený na liečbu
44. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje terapeuticky účinné množstvo inhibítora rastu Blymfocytov a je určený na liečbu renálnych chorôb u zvieratá.
45. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje terapeuticky účinné množstvo koinhibítora rastu Blvmfocytcv a sekrécie imunoglobulínov a je určený na liečbu renálnych chorôb u zvieraťa.
46. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje terapeuticky účinné množstvo inhibítora rastu Blymfocytov a je určený na liečbu lymfoproliferatívnych chcrô’o Blvmfocytov.

4. Farmaceutický crícra' že obsahuye terapeuticky skupiny obsahujúcej:

a) ligand BAFF alebo j ehe b' ligand BAľľ alebo j ehe c' ligana cAF: a~eoo j ehe d; ligand BAľľ alebo j eh:

ligand, c k, vyznačujúci sa tým, účinné množstvo prípravku vybratého zo aktívny fragment, aktívny fragment a protilátku ar.ti-μ, aktívny fragment a licand CD40, aktívny fragment a molekulu anti-CD40 e' molekulu anti-BAľľ licar.d alebo jej aktívny fragment, f, rekombinar.tnú neoperívnu molekulu axtívnv fragment, gandu BAFF alero jej c protilátku špecifickí pre ligand BAFF alebo jeho aktívny fragment a h protilátku špecifickí pre receptor ligandu BAFF alebo jeho ecitoo a je určený na stimuláciu tvorby B-lymfocytov pri liečbe imunosupresívnych chorôb.
48. Farmaceutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje terapeuticky účinné množstve prípravku vybratého zo skupiny obsahujúcej:

a) ligand BAFF alebo j eho aktívny fragment, b) ligand BAFF alebo j eho aktívny fragment a protilátku anti-μ, c) ligand BAFF alebo jeho aktívny fragment a ligand CD40, d) ligand BAFF alebo j ehe aktívn y fragment a molekulu anti-CD40

ligand,

e) molekulu anti-BAFF ligand alebo jej aktívny fragment,

f) rekombinantnú neeperívnu molekulu ligandu BAFF alebo jej aktívny fragment,

g) protilátku špecifickú pre ligand BAFF alebo jeho a<tívny fragment a

h) protilátku špecifickú pre receptor ligandu EAFF alebo jeho epitop a je určený na stimuláciu tvorby Ξ-lymfocytov pri liečbe imunosupresívnych chorôb.
49. Farmaceutický prípravok pccla nároku 43, vyznačujúci sa t ý m, že imunosupresívnou chorobou je infekcia s HIV.
50. Farmaceutický prípravc< podie nároku 45, vyznačujúci sa tým, že imunosueresívna choroba je spojená s transplantáciou orgánu.