CN1347326A - Baff,其封闭剂以及它们在b细胞应答的调节中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了治疗或预防与BAFF的表达相关的疾病的方法,所述BAFF包括BAFF及其片断,抗体,激动剂和拮抗剂。

Description

BAFF，其封闭剂以及它们在 B细胞应答的调节中的应用
                 发明领域
本发明涉及配体BAFF及其封闭剂刺激或抑制B-细胞和免疫球蛋白表达的用途，所述BAFF是属于肿瘤坏死因子家族的B-细胞活化因子。该蛋白质及其受体具有抗癌和/或免疫调节作用，并且可用于治疗免疫抑制疾病，如HIV。特别是，该配体及其封闭剂可对高血压及其相关疾病的发展起作用。另外，可在基因治疗中使用被该配体的基因转染的细胞来治疗涉及B-细胞的肿瘤，自身免疫病或先天性遗传病。封闭剂，例如特异于该配体或其受体的重组变体或抗体也具有免疫调节作用。希望将BAFF用作免疫抑制疾病的B-细胞刺激剂，包括例如用于经受器官移植(即骨髓移植)以及从癌症治疗中恢复的患者以刺激B-细胞的产生。也希望将BAFF用作佐剂和/或共刺激剂以将B细胞水平升高或恢复至大致正常的水平。
                 发明背景
与肿瘤坏死因子(TNF)-相关的细胞因子是宿主防御和免疫调节的媒介。该家族的成员以膜-锚着的形式存在，局部通过细胞与细胞的接触发挥作用，或者作为能扩散至远处靶的分泌型蛋白起作用。平行的受体家族发出存在这些分子的信号，导致启动靶组织中的细胞死亡或细胞增殖和分化。目前，TNF家族的配体和受体有至少11对公认的受体-配体对，包括TNF：TNF-R；LT-α：TNF-R；LT-α/β：LT-β-R；FasL：Fas；CD40L：CD40；CD30L：CD30；CD27L：CD27；OX40L：OX40和4-1BBL：4-1BB。甚至在最相关的情况下，编码这些配体的DNA序列仅有约25％至约30％同一性，但氨基酸的相关性约为50％。
该细胞因子受体家族的确定特征体现在富含半胱氨酸的胞外结构域，其最初由两种不同的TNF受体的分子克隆揭示出。该基因家族编码I型跨膜蛋白质所特有的糖蛋白，其具有胞外配体结合结构域，单个膜跨越区域和参与活化细胞功能的胞质区域。富含半胱氨酸的配体结合区域呈现出紧密交织的二硫键连接的核心结构域，该结构域根据特定的家族成员而重复多次。大多数受体具有4个结构域，但也有的受体具有少至3个，或多至6个结构域。
TNF家族配体蛋白质的特征在于一段短的N-末端序列，它一般是短的亲水性氨基酸，经常含有几个据认为可用作终止转移序列的赖氨酸或精氨酸残基。紧接着的是跨膜区域和各种长度的胞外区域，其可将C-末端受体结合结构域与膜分开。该区域有时也被称为“茎”。C-末端结合区域含有该蛋白质的主要部分，并经常，但不总是含有糖基化位点。这些基因缺乏I型膜蛋白，具有位于细胞外部的C末端的II型膜蛋白，和位于胞质中的短的N-末端结构域所特有的典型的信号序列。在某些情况下，例如对TNF和LT-α而言，在蛋白质加工早期可发生茎区域中的裂解，然后发现配体主要为分泌形式。然而，大多数配体以膜形式存在，可介导局部的信号传导。
对TNF，LT-α和CD40L的晶体学分析已较好地确定了这些配体的结构。TNF和淋巴毒素-α(LT-α)均为夹心结构，有两个具有“果冻卷筒蛋糕(jellyroll)”或希腊钥匙(Greek key)拓扑结构的反-平行β-折叠。Cα和β残基之间的rms偏差是0.61C，暗示它们的分子拓扑图具有高水平的相似性。CD40L，TNF和LT-α的分子研究所阐明的结构特征是倾向于装配成寡聚体复合物。寡聚体结构的内在特征是在产生多价配体的相邻亚单位之间的连接处形成受体结合位点。通过分析其晶体结构，证实TNF，CD40L和LT-α的四级结构以三聚体的形式存在。在不同配体之间保守的氨基酸大多为支架型β-片层链。很可能在所有这些分子中保留了所述基本夹心结构，因为多个家族成员之间的这些支架序列部分是保守的。由于亚单位构象倾向于保持相似，因此，也可以维持四级结构。
对TNF家族成员的最好描述是，其为控制细胞存活和分化的免疫***的主开关。与其它占优势的TNF家族膜锚着成员相反，目前只知TNF和LT-α是分泌型细胞因子。尽管已明确鉴定了TNF的膜形式，而且所述膜形式很可能具有独特的生物学作用，但分泌形式的TNF可为距离触发事件位点更远的细胞提供一般性的警示信号。因此，TNF分泌可以放大导致血管***内层明确改变和细胞炎性状态的事件。与之相反，该家族的膜结合成员通过TNF型受体仅给直接接触的细胞发送信号。例如，T细胞仅给那些经由同族TCR相互作用直接接触的B细胞提供CD40介导的“帮助”。在研究得较为充分的Fas***中也存在类似的细胞-细胞接触对诱导细胞死亡之能力的限制。
根据TNF配体导致细胞死亡的能力，似乎可以将它们分成三组。首先，TNF，Fas配体和TRAIL可在很多细胞系中有效诱导细胞死亡，它们的受体很可能具有典型的致死结构域。据推测，DR-3的配体(TRAMP/WSL-1)可能都属于这一类。其次，另一类配体仅触发局限于少数细胞类型的较弱死亡信号，此类配体的例子有TWEAK，CD30配体和LTalb2。该组配体如何在缺乏典型致死结构域的情况下触发细胞死亡是一个有趣的问题，这暗示着存在另一个较弱的死亡信号传导机制。最后，有一些成员不能有效传递死亡信号。可能所有组别的TNF配体对一些细胞类型都有抗增殖效应，继而导致细胞分化，如CD40。Funakoshi等(1994)。
近年来，TNF家族显著壮大，包括至少11种参与免疫***调节的不同信号传导途径。TWEAK和TRAIL的广泛表达模式表明：该家族中仍有更具功能性的品种未被发现。最近，这一方面尤其引人注意，因为发现了有能影响rous肉瘤和单纯疱疹病毒复制能力的两种受体，还通过组织学观察TNF具有抗病毒活性，痘病毒编码诱骗型TNF受体。Brojatsch等(1996)；Montgomery等(1996)；Smith等(1994)，76细胞959-962；Vassalli等(1992)，10，免疫，411-452。
TNF是败血性休克和恶病质的媒介，并且参与调节造血细胞发育。它可以用作炎症以及抗细菌，病毒和寄生虫感染之防御的媒介，并且具有抗肿瘤活性。TNF还介入不同的自身免疫病。TNF可由几种类型的细胞产生，包括巨噬细胞，成纤维细胞，T细胞和自然杀伤细胞。TNF与两种不同的受体结合，它们各通过特定的细胞内信号传导分子起作用，从而导致不同的TNF效应。TNF可作为膜结合形式或可溶性的分泌型细胞因子存在。
LT-α与TNF共享很多活性，即与TNF受体结合，但与TNF不同的是，它主要是由活化的T细胞和一些β-淋巴母细胞样(lymphoblastoid)肿瘤分泌。LT-α和LT-β的异聚体复合物是能与LT-β受体结合的膜结合复合物。LT***(LT和LT-R)似乎参与外周淋巴器官的发育，因为破坏LT-β基因会导致T和B细胞在脾脏中的解构和***中的缺乏。LT-β***也参与一些腺癌细胞系的细胞死亡。
TNF家族的另一个成员Fas-L在活化的T细胞上显著表达。它能通过已知为程序性细胞死亡或凋亡的机制导致携有其受体的细胞，包括肿瘤细胞和被HIV-感染的细胞死亡。此外，Fas或Fas-L中的缺陷可导致淋巴增殖性疾病，由此证实Fas***调节免疫应答的作用。Fas***也介入由肝炎慢性感染引起的肝损害和HIV-感染患者的自身免疫。Fas***还与HIV患者的T细胞破坏有关。该家族的另一个成员TRAIL似乎也参与多种不同来源的转化细胞系的死亡。
TNF家族的另一个成员CD40-L在T细胞上表达，并能诱导对携有CD40的B细胞的调节。另外，CD40-L基因的变化导致已知为X-连锁高-IgM综合征的疾病。CD40***还涉及不同的自身免疫病，已知CD40-L具有抗病毒特性。尽管CD40***参与拯救凋亡性B细胞，但在非-免疫细胞中，它诱导凋亡。TNF家族的很多其它淋巴细胞成员也参与共刺激。
一般说来，TNF家族的成员在控制免疫***和活化急性宿主防御***方面具有十分重要的调节作用。考虑到目前以治疗为目的而操作TNF家族成员的进展，该家族的成员可能会提供独特的疾病控制方式。该家族的一些配体可直接诱导很多转化细胞的凋亡，例如LT，TNF，Fas配体和TRAIL。Nagata(1997)88细胞，355-365。Fas，可能还有TNF和CD30受体的活化可诱导未转化的淋巴细胞死亡，这些细胞可能有免疫调节作用。Amakawa等(1996)84细胞551-562；Nagata(1997)88细胞355-365；Sytwu等(1996)；Zheng等(1995)377自然348-351。通常，位于TNF受体胞质侧的死亡结构域聚集之后会引发死亡。死亡结构域协调安排多种信号转导组分的装配，所述装配导致活化天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶级联***。Nagata(1997)88细胞355-365。一些受体缺乏典型的死亡结构域，例如LTb受体和CD30(Browning等(1996)；Lee等(1996))，但仍能诱导细胞死亡，尽管是较弱的诱导。这些受体的作用可能主要是诱导细胞分化，死亡是一些转化型细胞系中的异常结果，但该情况仍不清楚，因为对CD30裸鼠的研究暗示了胸腺阴性选择中的死亡作用。Amakawa等(1996)84细胞551-562。相反，通过其它途径，如CD40进行信号传导是维持细胞存活所必需的。因此，需要鉴定和定性身为TNF家族成员的其它分子，从而提供其它控制疾病和操作免疫***的工具。
在本文中，我们鉴定了TNF细胞因子家族一种新配体的功能特性。该新配体被称为BAFF(属于TNF家族的B细胞活化因子)，它似乎由T细胞和树突细胞表达以进行B-细胞共-刺激，因此，可能在控制B细胞功能方面起着重要作用。另外，我们还生产出在肝脏-特异性启动子的控制之下过量表达BAFF的转基因小鼠。这些小鼠具有过量的成熟B细胞数目，自发的生发中心反应，分泌自身抗体，并在次级淋巴器官中具有高浆细胞数目，在肾脏中具有Ig沉积。
                 发明简述
因此，本发明涉及BAFF-配体，该配体的封闭剂和抗体刺激或抑制B-细胞生长和免疫球蛋白分泌的用途。所要求的发明可用于多种疾病和紊乱的治疗性应用(这一点将在下文中更详细地讨论)，并可用于得到免疫***的相关信息，以及用于操作免疫***及其过程。另外，本发明可用作刺激或抑制B-细胞生长和免疫球蛋白分泌的方法。本发明所述的BAFF相关分子也可用于治疗自身免疫病，与B-细胞增殖和成熟化，BAFF配体调节相关的疾病和炎症。本发明包括调节或防止高血压和高血压-相关的肾和心血管组织疾病。
下文的描述中列出了本发明的其它特征和优点，从描述中可以清楚了解，或者通过实施本发明可以了解部分特征和优点。通过说明书和 书以及附图中特别指出的方法，可以理解并获得本发明的目的和其它优点。
因此，为了获得这些和其它优点，根据本文所体现并广泛描述的本发明目的，本发明包括通过施用多种BAFF配体和相关分子影响B-细胞生长和免疫球蛋白分泌的方法。
本发明还希望通过使用BAFF配体或该多肽的活性片断来刺激B-细胞生长。该多肽可以单独使用，或者与CD40配体或抗-鼠抗体一起使用。
在其它实施方案中，本发明涉及通过使用BAFF配体或BAFF的活性片断刺激树突细胞-诱导的B-细胞生长和成熟化的方法。同样，该多肽可以单独使用，或者与CD40配体或抗-μ抗体一起使用。
在其它实施方案中，使用BAFF和BAFF受体的封闭剂抑制B-细胞生长和免疫球蛋白分泌。这些封闭剂可以是不可操作的重组BAFF，BAFF特异性抗体，BAFF-受体特异性抗体或抗-BAFF配体分子。
在其它实施方案中，本发明涉及BAFF，BAFF相关分子和BAFF封闭剂治疗高血压，高血压-相关疾病，免疫疾病，自身免疫病，炎症和B-细胞淋巴-增生性疾病的用途。
本发明包括BAFF和BAFF-相关分子作为激动剂或拮抗剂以通过影响B-细胞的生长和/或成熟化和免疫球蛋白的分泌来影响免疫应答的用途。
在其它实施方案中，本发明涉及含有BAFF的可溶性构建体，该构建体可用于直接引发BAFF介导的病理学事件。所述事件在治疗癌症，肿瘤或操作免疫***以治疗免疫疾病方面具有有益的治疗效果。
另外，在其它实施方案中，所要求的发明涉及抗BAFF配体的抗体，所述抗体可用于例如治疗癌症，和操作免疫***以治疗免疫疾病。
在其它实施方案中，本发明涉及使用BAFF基因进行基因治疗的方法。
本发明的药物制品可任选包括药物可接受的载体，佐剂，填充剂，或其它药物组合物，可以本领域已知的多种形式或途径中的任何一种施用所述药物制品。
应理解以上的一般性描述和以下的详细描述是举例和解释性的，欲为所要求的发明提供进一步的解释。
提供附图是为了进一步理解本发明，附图掺入并构成了本说明书的一部分，并且阐明了本发明的几个实施方案，附图与描述部分一起用于解释本发明的原理。
                 附图描述
图1(A)显示了人和小鼠BAFF的推测氨基酸序列。图中显示出推测的跨膜结构域(TMD，破折号线)，潜在的N-联糖基化位点(星号)和人BAFF的天然加工位点(箭头)。hBAFF上的双线表示通过Edman降解BAFF的经加工形式而得到的序列。(B)显示了BAFF和一些TNF配体家族成员的胞外蛋白质序列比较。相同的和同源的残基分别以黑色和带阴影的方框表示。(C)显示了TNF家族配体的树状图。
图2图解表征了重组BAFF。(A)图示重组BAFF构建体。以Leu83和Gln136开始的可溶性重组BAFF被表达成与N-末端Flag标记和6-氨基酸接头的融合蛋白。在293T细胞中，长型在Arg133和Ala134(箭头)之间被裂解，产生经加工的BAFF形式。Asn124和Asn242属于N-糖基化的共有位点。存在于Asn124上的N-联聚糖被表示为Y.TMD：跨膜结构域。(B)用肽N-聚糖酶F(PNG酶F)处理重组BAFF。使含有Flag标记的BAFF和APRIL的浓缩上清液去糖基化，并如图所示用多克隆抗-BAFF抗体或抗-Flag M2进行Westem印迹分析。除经加工的BAFF外的所有带也与抗-Flag M2反应(未显示数据)。(C)全长BAFF被加工成可溶性的形式。用全长BAFF瞬时转染293T细胞。用多克隆抗BAFF抗体经Western印迹分析经转染的细胞及其浓缩上清液。将对应于10倍细胞量的上清液上样于凝胶。(D)在Superdex-200上对可溶性BAFF进行大小排阻层析。在Superdex-200柱上分级分离含有可溶性BAFF(短型)的浓缩上清液，并用抗-Flag M2抗体经Western印迹分析洗脱的级分。SDS-PAGE的左手侧和大小排阻层析图的上方示出了分子量标记(以kDa计)的迁移位置。
图3显示了BAFF的表达。(A)用BAFF反义mRNA探测多种人组织的Northern印迹(每个泳道上样2μg poly A+RNA)。(B)由以下细胞的RNA逆转录酶扩增BAFF，IL-2受体α链和肌动蛋白，所述细胞是处于PHA活化的不同时间点的纯化血T细胞，E-花结阴性血细胞(B细胞和单核细胞)，体外获得的不成熟树突细胞，293细胞和被全长BAFF无菌转染的293细胞(293-BAFF)。在不添加cDNA时进行对照扩增，扩增IL-2受体α链以作为T细胞活化的标记。
图4显示了BAFF与成熟B细胞的结合。(A)可溶性BAFF与BJAB和Jurkat细胞系，以及脐带(cord)血中的纯化CD19+细胞的结合。用所示量(ng/50μl)的Flag-BAFF染色细胞，并通过流式细胞仪进行分析。(B)可溶性BAFF与PBL的结合。用抗-CD8-FITC或抗-CD19-FITC(水平轴)和Flag-BAFF加M2-生物素和亲和素-PE(垂直轴)染色PBL。对照中无Flag-BAFF。
图5显示了BAFF共刺激B细胞增殖。(A)稳定转染的293细胞中BAFF的表面表达。用抗-BAFF mAb 43.9染色293-BAFF和293野生型细胞，并通过流式细胞仪进行分析。(B)通过293-BAFF细胞共刺激PBL。在存在或缺乏抗-B细胞受体抗体(抗-μ)时，将PBL(105/孔)与15,000个用戊二醛-固定的293细胞(293wt或293-BAFF)一起保温。只有固定的293细胞掺入了100cpm。(C)在抗-μ存在下，可溶性BAFF对PBL增殖进行依赖于剂量的共刺激。保温72小时之后，通过[3H]-胸苷掺入测定增殖。对照包括仅用BAFF处理的细胞，经热变性的BAFF处理的细胞，或用无关同种型匹配抗体替代抗-μ而处理的细胞。(D)比较sCD40L和sBAFF对PBL增殖的共刺激效应。如实验组(panel)C中所述进行实验。(E)BAFF共刺激预活化的人B细胞的Ig分泌。通过与EL-4T细胞和活化的T细胞上清液共培养5-6天来活化纯化的CD19+B细胞，然后重新分离，并在仅有培养基(-)或含有5％活化的T细胞上清液的培养基(T-SUP)或含细胞因子混合物(IL-2，IL-4，IL-10)的培养基存在下再培养7天。条形柱表示含或不含1μg/ml BAFF的培养物中的Ig平均浓度。平均值±SD为下列值时意味着“成倍增加”：即培养基中为1.23±0.11，T细胞上清液中为2.06±0.18(4次实验)，IL-2，IL-4和IL-10中为1.45±0.06(2次实验)。用外周血(3次实验)或脊髓血B细胞进行这些实验(1次实验；如T细胞上清液：增加2.3倍，加IL-2，IL-4和IL-10：增加1.5倍)。(F)如实验组D所示，含T细胞上清液的培养物中BAFF效应的剂量-反应曲线。数值为3次实验的平均值±SD。
图6显示了BAFF可用作B细胞增殖的辅因子。测定仅有人PBL(500cpm)时，仅存在BAFF配体时，仅存在山羊抗-鼠(mu)时，以及同时存在BAFF配体和抗-mu时的增殖。当BAFF的浓度增加时，抗-mu和BAFF的组合使PBL增殖显著增加，这暗示了BAFF的辅因子特性。
图7显示了BAFF Tg小鼠中增加的B细胞数目。(A)BAFF Tg小鼠中增加的淋巴细胞计数。图中将12只同窝对照小鼠(左边的实验组)与12只BAFFTg小鼠(右边的实验组)相比较。用圆圈表示淋巴细胞计数，用菱形表示粒细胞(包括嗜中性，嗜酸性，嗜碱性粒细胞)计数。(B)BAFF Tg小鼠的PBL中B细胞的比例增加。PBL用抗-B220-FITC和抗-CD4-PE染色以进行FACS分析，并用前向散射选通(gate)在活细胞上。示出了CD4和B220阳性细胞的百分比。显示出一只对照小鼠(左边)和两只BAFF Tg小鼠(右边)，将每组分析的7只动物中的代表作为结果。(C)PBL中B/T细胞比率的FACS分析。在(A)和(C)中，对照动物和BAFF Tg小鼠之间的差异存在统计学显著性(P＜0.001)。(D)BAFF Tg小鼠PBL的B细胞上增加的MHC II类表达。通过FACS分析MHC II类表达。(E)BAFF Tg小鼠PBL的B细胞中增加的Bcl-2表达。通过胞质内染色测定Bcl-2表达，并通过FACS分析细胞。在(D)和(E)中，使活细胞选通前向散射。显示出4只同窝对照小鼠(白色条形)和4只BAFFTg小鼠，它们代表每组所分析的至少12只动物。MFI：荧光强度的平均值。对照动物和BAFF Tg小鼠之间的差异有统计学显著性(P＜0.005)。(F)BAFF Tg小鼠中增加的效应T细胞表达。用抗-CD4-Cychrome，抗-CD44-FITC和抗-L选择蛋白-PE染色PBL。显示出CD4+-选通的细胞。示出了CD44hi/L-选择蛋白lo细胞的百分比。显示出一只对照小鼠(左边)和两只BAFF Tg小鼠(右边)，将每组分析的8只动物中的代表作为结果。
图8显示了BAFF Tg小鼠的脾脏而不是骨髓中增加的B细胞区室。(A)使用抗-IgM-FITC和抗-B220-PE对脾脏(上方的实验组)，骨髓(中间的实验组)和MLN(下方的实验组)中的成熟B细胞进行FACS染色。示出了B220+/IgM+成熟B细胞的百分比。(B)同时使用抗-CD43-FITC，抗-B220-Cy-chrome和抗-IgM-PE对骨髓中的preB细胞(B220+/CD43-)和proB细胞(B220+/CD43+)进行FACS染色。显示出选通于IgM阴性群体的细胞。示出了preB细胞(B220+/CD43-)和proB细胞(B220+/CD43+)的百分比。所有图(A和B)均显示出一只对照小鼠(左边)和两只BAFF Tg小鼠(右边)，将每组分析的7只动物中的代表作为结果。
图9显示了BAFF Tg小鼠中增加的Ig，RF和CIC水平。(A)以所示量的纯化的小鼠IgG为参照，一个挨着一个地对2份对照血清(-)和BAFF Tg小鼠的4份血清(+)进行SDS-PAGE。所有泳道中，白蛋白带的强度类似，这表明对每份样品而言，上样于凝胶的样品量相等。对19只同窝对照小鼠(白色条形)和21只BAFF Tg小鼠(黑色条形)的血清中的总小鼠Ig(B)，RF(C)和CIC(D)进行基于ELISA的分析。当缺乏适当的RF对照时，RF的滴度(以2为底的对数)被定义为给出的O.D.值比背景的O.D.值高3倍的血清稀释度。CIC的量被定义为产生与用受试血清所得的O.D.值相等的O.D.值所需的PAP量。对照动物和BAFF Tg小鼠之间的差异具有统计学显著性(在(B)和(C)中，P＜0.001，在(D)中，P＜0.003)。
图10显示了一些BAFF Tg小鼠中抗-ssDNA和抗-dsDNA自身抗体的存在。(A)通过ELISA分析19只同窝对照小鼠(灰色条形)和21只BAFF Tg小鼠(黑色条形)中的抗-ssDNA自身抗体。(B)通过ELISA分析来自于(A)的5只同窝对照小鼠和5只显示出抗-ssDNA自身抗体水平的动物中的抗-ssDNA自身抗体。(C)对照小鼠(左边)和BAFF Tg小鼠(右边)肾脏的石蜡切片，所述切片已用山羊抗-小鼠Ig-HRP染色。通过棕色染色显示出Ig沉积。这些图是所分析的6只BAFF Tg小鼠中的代表。
图11显示了BAFF Tg小鼠中肿大的集合***(Peyer’s patch)。对照小鼠(左边)和BAFF Tg小鼠(右边)小肠上的集合***(以箭头表示)照片。该图是每组处死的至少12只小鼠中的代表。放大倍数5X。
图12表示BAFF Tg小鼠脾脏中被破坏的T和B细胞结构，强烈的生发中心反应，降低的树突细胞数目和增加的浆细胞数目。对照小鼠以A，C，E和G表示，BAFF Tg小鼠以B，D，F和H表示。B细胞是蓝色的，T细胞是棕色的(A和B)。生发中心以箭头表示(C和D)。在对照小鼠中仅发现很少的残留生发中心(C)。CD11c阳性树突细胞是棕色的，出现在T细胞区，桥连通道和边缘区(E)。很少存在于BAFF Tg小鼠中(F)。仅在BAFF Tg小鼠(H)而不是对照小鼠(G)的红髓中可以检测到多配体聚糖-1-阳性浆细胞。这些图是所分析的至少12只BAFF Tg小鼠和12只对照小鼠的代表。除了C和D图的放大倍数为50外，其它所有图的放大倍数皆为100。B：B细胞滤泡，T：PALS，WP：白髓，RP：红髓。
图13显示了BAFF Tg小鼠MLN中被破坏的T和B细胞结构，强烈的生发中心反应和大量的浆细胞。对照小鼠以A，C，E和G表示，BAFF Tg小鼠以B，D，F和H表示。按图6所述进行免疫组化反应。T和B细胞染色示于A和B，生发中心示于C和D，树突细胞示于E和F，浆细胞示于G和H。GC：生发中心，放大倍数：100。
                 发明详述
以下将详细参照本发明优选的实施方案。本发明涉及BAFF和BAFF相关分子影响B-细胞生长和成熟化和免疫球蛋白分泌的用途。本发明涉及BAFF和BAFF相关分子影响免疫-相关疾病所必需的免疫***反应的用途。另外，本发明包括使用BAFF，或BAFF相关基因通过基因治疗方法治疗癌症和免疫疾病。
由被本发明的序列转化的宿主产生的BAFF配体及其类似物，以及通过本领域已知的方法纯化的，或由已知氨基酸序列产生的天然BAFF可用于抗癌，抗肿瘤和免疫调节应用的多种方法。它们也可用于针对其它疾病的治疗和方法。
本发明的另一方面涉及由分离的编码BAFF-配体的核酸编码的多肽在“反义”疗法中的用途。本文所用的“反义”疗法指的是施用或原位产生寡核苷酸或其衍生物，它们在细胞条件下能与编码所需配体的细胞性mRNA和/或DNA特异性杂交，从而通过抑制转录和/或翻译来抑制所编码蛋白质的表达。这种结合可以是常规的碱基对互补，或者，例如，当与DNA双螺旋结合时，可通过与双螺旋主沟的特异性相互作用进行结合。一般说来，“反义”疗法指的是通常应用于本领域的一系列技术，包括依靠与寡核苷酸序列特异性结合的任何疗法。
本发明的反义构建体可作为例如表达质粒被传递，当其在细胞中被转录时，可产生与编码Kay-配体的细胞mRNA的至少一部分互补的RNA。或者，反义构建体可以是离体(ex vivo)产生的寡核苷酸探针。优选这种寡核苷酸探针是对内源性核酸酶具有抗性，因而能在体内稳定存在的，经修饰的寡核苷酸。例如，可用作反义寡核苷酸的核酸分子是DNA的氨基磷酸酯，硫代磷酸酯和甲基磷酸酯类似物(例见美国专利5,176,996；美国专利5,264,564和美国专利5,256,775)。另外，有关构建反义疗法中所用寡聚体的一般方法的评论可参见例如Van Der Krol等(1988)生物技术6：958-976和Stein等(1988)癌症研究48：2659-2668(列入本文作为参考)。
C.BAFF-配体
如上所述，本发明的BAFF-配体是TNF家族的成员，它被描述于PCT申请号PCT/US98/19037(WO99/12964)中(其全文列入本文作为参考)。该蛋白质，其片断或同系物可能具有广泛的治疗和诊断用途。
BAFF-配体主要存在于脾脏和外周血淋巴细胞中，这有力地说明它在免疫***中的调节作用。将本发明所要求的BAFF-配体序列与人TNF家族其它成员相比较，揭示出相当大的结构相似性。所有蛋白质共享在胞外结构域中保守的几个序列区域。
尽管仍不知道所要求的配体的精确三维结构，但据推测，作为TNF家族的成员，它可与该家族的其它成员共享某些结构特征。
本发明的新多肽与目前尚未被鉴定的受体特异性地相互作用。然而，本文所述的肽和方法使得能够鉴定与BAFF-配体或其片断特异性相互作用的受体。
在某些实施方案中，所要求的发明包括衍生自BAFF-配体并能与其受体结合的肽的使用方法。可以用几种方法产生BAFF-配体的片断，例如重组方法，PCR，蛋白酶消化或化学合成。通过从编码该多肽的核酸的一端或两端除去一个或多个核苷酸，可以产生多肽的内部或末端片断。表达经诱变的DNA可产生多肽片断。
也可以使用本领域已知的技术，例如常规的Merrifield固相f-moc或t-boc化学法化学合成多肽片断。例如，可将本发明的肽和DNA序列任意分成互不重叠的所需长度的片断，或者分成所需长度的重叠片断。下文中将更详细地描述诸如此类的方法。
产生可溶形式的BAFF-配体
可溶形式的BAFF-配体经常可以有效地发出信号，因此可将它作为目前能模拟天然膜形式的一种药物来使用。本文所要求的BAFF-配体可以作为可溶性细胞因子被天然分泌，然而，如果不能分泌，可以对其基因进行再改造以迫使它分泌。为了产生可溶性分泌型BAFF-配体，应在DNA水平上除去N-末端跨膜区以及茎区的某些部分，并用I型前导序列或者II型前导序列取而代之，所述前导序列允许在选定的表达***中进行有效的蛋白酶裂解。本领域技术人员可以改变分泌表达构建体中保留的茎区的量，从而使受体结合特性和分泌效力均最优化。例如，可以制备含有所有可能的茎长度的构建体，即N-末端截短形式，以产生从氨基酸81至139的蛋白质。这种类型的分析可产生最佳长度的茎序列。
E.产生与BAFF-配体反应的抗体
本发明也包括与所要求的BAFF-配体或其受体特异性反应的抗体。可通过标准方法制备抗-蛋白质/抗-肽抗血清或单克隆抗体(例见抗体：实验室手册，由Harlow和Lane编(冷泉港出版社：1988))。可用免疫原形式的肽免疫哺乳动物，如小鼠，仓鼠或兔。赋予蛋白质或肽免疫原性的技术包括与载体偶联，或本领域众所周知的其它技术。
可在佐剂的存在下施用BAFF-配体或其受体的免疫原性部分。可通过检测血浆或血清中的抗体滴度来监测免疫的进程。将免疫原用作抗原时，可使用标准的ELISA或其它免疫分析来评估抗体的水平。
在优选的实施方案中，本发明的抗体对BAFF-配体或其受体，或与其密切相关的人或非人哺乳动物同系物(例如70，80或90％同源，更优选至少95％同源)的抗原决定簇(例如SEQ ID NO：2的多肽的抗原决定簇，所述序列如PCT申请号PCT/US98/19037(WO99/12964)所述，该文献列入本文作为参考)具有免疫特异性。在本发明另一个优选的实施方案中，抗-BAFF-配体或抗-BAFF-配体-受体的抗体基本上不与同SEQ ID NO：2或6(所述序列如PCT申请号PCT/US98/19037(WO99/12964)所述，该文献全文列入本文作为参考)的同源性低于80％，优选同SEQ ID NO：2(所述序列如PCT申请号PCT/US98/19037(WO99/12964)所述，该文献全文列入本文作为参考)的同源性低于90％，最优选同SEQ ID NO：2(所述序列如PCT申请号PCT/US98/19037(WO99/12964)所述，该文献全文列入本文作为参考)的同源性低于95％的蛋白质交叉反应(即特异性反应)。“基本上不交叉反应”指的是抗体对非-同源蛋白质的结合亲和力低于对SEQ ID NO：2(所述序列如PCT申请号PCT/US98/19037(WO99/12964)所述，该文献全文列入本文作为参考)的结合亲和力的10％，更优选低于5％，甚至更优选低于1％。
本文所用术语抗体欲包括也能与BAFF-配体或其受体特异性反应的抗体片断。可使用常规技术使抗体片断化，并使用与上文所述的筛选完整抗体相同的方法来筛选抗体片断以供使用。例如，通过用胃蛋白酶处理抗体可产生F(ab’)2片段。可处理所得F(ab’)2片段以还原二硫键，产生Fab’片段。本发明的抗体进一步包括生物特异性的和嵌合的分子，所述分子具有抗-BAFF-配体或抗-BAFF-配体-受体活性。因此，可使用抗BAFF-配体，肿瘤-配体及其受体的单克隆和多克隆抗体(Ab)，以及诸如Fab’和F(ab’)2等抗体片段来阻断所述配体与其各自受体的作用。
也可使用标准的重组DNA技术制备多种形式的抗体。Winter和Milstein(1991)自然349：293-299(列入本文作为参考)。例如，可构建嵌合抗体，其中将来自动物抗体的抗原结合结构域与人的恒定区相连(例如，Cabilly等，美国专利4,816,567，列入本文作为参考)。嵌合抗体可减轻所观察到的由动物抗体用于人临床治疗时引发的免疫应答。
另外，可合成识别BAFF-配体或其受体的重组“人源化抗体”。人源化抗体是主要含有人IgG序列的嵌合体，其中***了负责特异性抗原-结合的区域。用所需抗原免疫动物，分离相应的抗体，除去负责特异性抗原结合的可变区序列部分。然后将来自动物的抗原结合区域克隆至人抗体基因中已缺失了抗原结合区域的相应位置。人源化抗体在人抗体中最低限度地使用了异源(即种间)序列，因此，最不可能在治疗的受试者中引发免疫应答。
通过制备含有可变结构域和分离自不同类免疫球蛋白的人恒定区结构域(CH1，CH2，CH3)的嵌合或人源化抗体，即可构建不同类的重组抗体。例如，通过将抗原结合位点克隆至携有人：链恒定区的载体，即可重组产生抗原结合位点效价增加了的抗体。Arulanandam等(1993)，实验医学杂志，177：1439-1450(列入本文作为参考)。
另外，可使用标准的重组DNA技术，通过改变抗原结合位点附近的氨基酸残基来改变重组抗体与其抗原结合的亲和力。通过基于分子模型制作的诱变可增加人源化抗体与抗原结合的亲和力。Queen等，(1989)Proc.NatlAcad.Sci，86：10029-33(列入本文作为参考)。
F.产生类似物：产生已改变的DNA和肽序列
BAFF-配体的类似物与天然BAFF-配体在氨基酸序列上，或者在不涉及序列的方面，或者在这两个方面可以有所不同。非-序列修饰包括BAFF-配体的体内或体外化学衍生化。非-序列修饰包括但不限于乙酰基化，甲基化，磷酸化，羧基化或糖基化中的变化。
优选的类似物包括BAFF-配体的生物活性片段，其序列与SEQ ID NO：2所述的序列(该序列如PCT申请号PCT/US98/19037(WO99/12964)所述，该文献全文列入本文作为参考)因一个或多个保守氨基酸取代，或一个或多个非-保守氨基酸取代，缺失或***而有所不同，但不会取消BAFF-配体的活性。保守的取代一般包括用一个氨基酸取代另一个具有相似特性的氨基酸，例如，在以下组别的氨基酸中进行取代：缬氨酸，甘氨酸；甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。
G.本发明的材料和方法
抗-Flag M2单克隆抗体，生物素化的抗-Flag M2抗体和与琼脂糖偶联的抗-Flag M2抗体可购自Sigma。细胞培养物试剂得自Life Science(Basel，瑞士)和Biowhittaker(Walkersville，MD)。按文献(10，11)所述在293细胞中产生Flag标记的可溶性人APRIL(残基K110-L250)。经FITC-标记的抗-CD4，抗-CD8和抗-CD19抗体购自Pharmingen(San Diego，CA)。特异于人IgM的Fc5μ片段的山羊F(ab’)2购自Jackson ImmunoResearch(West Grove，PA)。第二抗体得自Pharmingen或Jackson ImmunoResearch，并使用推荐的稀释度。
在含有10％经热灭活的胎牛血清(FCS)的DMEM中维持人胚肾293T(12)细胞和成纤维细胞系(表1)。在添加有2％FCS的DMEM-营养成分混合物F12(1∶1)中维持人胚肾293细胞。在添加有10％FCS的RPMI中培养T细胞系，B细胞系和巨噬细胞系(表1)。在添加有10％FCS的Iscove培养基中培养Molt-4细胞。在含有10％FCS，0.5mM非必需氨基酸，10mM Na-Hepes和1mM丙酮酸钠的MEM-α培养基中培养上皮细胞系。在添加有20％FCS，100μg/ml上皮细胞生长因子(Collaborative Research，Inotech，Dottikon，瑞士)和100μg/ml肝素钠盐(Sigma)的M199培养基中维持HUVEC。所有培养基中都含有青霉素和链霉素。通过Ficoll-Paque(Pharmacia，Uppsala，瑞典)梯度离心，从健康成年自愿者的肝素化血液中分离外周血白细胞，并在RPMI，10％FCS中培养。
T细胞通过与经神经氨酸酶-处理的绵羊红细胞形成花结而由非-粘附的PBL中得到，并通过Ficoll-Paque梯度离心将T细胞与未形成花结的细胞(主要是B细胞和单核细胞)分开。用植物凝集素(Sigma)(1μg/ml)将纯化的T细胞活化24小时，洗涤并在RPMI，10％FCS，20U/ml IL-2中培养。使用抗-CD14抗体，山羊抗-小鼠-包被的微珠和MinimacsTM装置(Miltenyi Biotech)，经磁性细胞分选而纯化CD14+单核细胞，并在GM-CSF(800U/ml，Leucomax，Essex Chemie，Luzern，瑞士)和IL-4(20ng/ml，Lucerna Chem，Luzern，瑞士)的存在下培养5天，然后在GM-CSF，IL-4和TNF□□(200U/ml，Bender，Vienna，奥地利)的存在下再培养3天以得到CD83+，树突细胞-样群体。按文献(13)所述，使用抗-CD19磁珠(M450，Dynal，Oslo，挪威)，从外周血或脐血中分离纯度＞97％的人B细胞。
-Northern印迹分析
使用人多组织Northern印迹I和II(Clontech #7760-1和#7759-1)进行Northern印迹分析。于60℃，在杂交溶液(50％甲酰胺，2.5×Denhardt’s，0.2％SDS，10mM EDTA，2×SSC，50mM NaH2PO4，pH6.5，200μg/ml经超声处理的鲑精DNA)中将膜保温2小时。热变性反义RNA探针，并在新鲜杂交溶液中加入2×106cpm/ml该探针，其中所述探针含有对应于hBAFF的氨基酸136-285的核苷酸。于62℃将膜杂交16小时，用2×SSC，0.05％SDS洗涤一次(25℃，30分钟)，再用0.1×SSC，0.1％SDS洗涤一次(65℃，20分钟)，于-70℃暴露于X-射线胶片。
-鉴定BAFF cDNA
人BAFF cDNA的部分序列包含在几个EST克隆(例如GenBank登记号T87299和AA166695)中，所述克隆得自胎肝和脾脏和卵巢癌文库。通过按厂商推荐的方法，使用厂商提供的来自人白细胞库的cDNA文库为模板，用寡核苷酸AP1和JT1013(5’-ACTGTTTCTTCTGGACCCTGAACGGC-3’)进行5’-RACE-PCR(Marathon-Ready cDNA，Clonetech，Palo Alto，CA)扩增，得到所述cDNA的5’部分。将所得的PCR产物克隆至PCR-0平端(Invitrogen，NV Leek，荷兰)，并作为EcoRI/PstI片断亚克隆至含有EST克隆T87299的pT7T3 Pac载体(Pharmacia)。因此，通过使用BAFF内部的PstI位点组合5’和3’片断即可得到全长hBAFF cDNA。该序列的GenBank登记号为AF116456。
鼠BAFF的617bp部分序列包含在两个重叠的EST克隆(AA422749和AA254047)中。将跨越该序列中核苷酸158至391的PCR片断用作探针来筛选小鼠脾脏cDNA文库(Stratagene，La Jolla，CA)。
-表达重组的BAFF
使用寡核苷酸JT1069(5’-GACAAGCTTGCCACCATGGATGACTCCACA-3’)和JT637(5’-ACTAGTCACAGCAGTTTCAATGC-3’)扩增全长hBAFF。将PCR产物克隆至PCR-0平端，并作为HindIII/EcoRI片断重新亚克隆至PCR-3哺乳动物表达载体。使用寡核苷酸JI636(5’-CTGCAGGGTCCAGAAGAAACAG-3’)和JT637扩增短的可溶性BAFF形式(氨基酸Q136-L285)。使用内部PstI位点由全长BAFF获得长的可溶性BAFF形式(氨基酸L83-L285)。将可溶性BAFF作为PstI/EcoRI片断重新亚克隆至经改良的PCR-3载体的血凝素信号肽和Flag序列之后，并作为与N-末端Flag序列在同一读码框内的PstI/SpeI片断重新亚克隆至经改良的pQE16细菌表达载体(14)。测序构建体的两条链。建立表达短的可溶性形式或全长BAFF的稳定的293细胞系，按文献(14，15)所述，由细菌和哺乳动物293细胞表达和纯化重组的可溶性BAFF。
-逆转录酶PCR
根据厂商说明，使用Ready to Go***(Pharmacia)逆转录提取自T细胞，B细胞，体外获得的不成熟树突细胞，293wt和293-BAFF(全长)细胞的总RNA。使用特异性的寡核苷酸，用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增以检测BAFF和β-肌动蛋白cDNA(94℃，55℃和72℃各1分钟，共30轮循环)，对BAFF而言，寡核苷酸为JT13225’-GGAGAAGGCAACTCCAGTCAGAAC-3’和JT13235’-CAATTCATCCCCAAAGACATGGAC-3’；对IL-2受体α链而言，寡核苷酸为JT1368 5’-TCGGAACACAACGAAACAAGTC-3’和JT1369 5’-CTTCTCCTTCACCTGGAAACTGACTG-3’；对β-肌动蛋白而言，寡核苷酸为5’-GGCATCGTGATGGACTCCG-3’和5’-GCTGGAAGGTGGACAGCGA-3’。
-凝胶渗透层析
用短的可溶性BAFF形式瞬时转染293T细胞，并在无血清的Optimem培养基中培养7天。将经调节的上清液浓缩20倍，与内部标准过氧化氢酶和卵白蛋白混合，上样于Superdex-200 HR10/30柱。以0.5ml/分钟的流速，用PBS洗脱蛋白质，用三氯醋酸沉淀级分(0.25ml)，并使用抗-Flag M2抗体进行Western印迹以分析级分。用标准的蛋白质：铁蛋白(440kDa)，过氧化氢酶(232kDa)，醛缩酶(158kDa)，牛血清白蛋白(67kDa)，卵白蛋白(43kDa)，胰凝乳蛋白酶原A(25kDa)和核糖核酸酶A(13.7kDa)校准柱。
-PNG酶F处理
于95℃，在含0.5％SDS，1％2-巯基乙醇的20μl溶液中将样品加热3分钟，然后冷却，添加10％Nonidet P-40(2μl)，0.5M磷酸钠，pH7.5(2μl)和PeptideN-聚糖酶(glycanase)F(125个单位/μl，1μl或在对照中不含酶)。在进行Western印迹分析之前，于37℃将样品保温3小时。
-EDMAN测序
用可溶性BAFF长形式瞬时转染293T细胞，并在无血清的Optimem培养基中培养7天。将经调节的上清液浓缩20倍，按文献(16)所述通过SDS-PAGE分级分离，并印迹至聚偏氟乙烯膜(BioRad Labs，Hercules，CA)上，然后使用气相测序仪(ABI 120A，Perkin Elmer，Foster City，CA)进行测序，所述测序仪与配备有乙内酰苯硫脲C182.1×250mm柱的分析仪(ABI 120A，PerkinElmer)相连接。使用软件ABI610(Perkin Elmer)分析数据。
-抗体
通过用重组的可溶性BAFF免疫兔(Eurogentec，Seraing，比利时)以产生多克隆抗体。将用相同抗原免疫的大鼠脾脏与x63Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞融合，筛选杂交瘤中的BAFF-特异性IgG。这些单克隆抗体中的一个，即43.9是特异性识别hBAFF的IgG2a。
细胞于4℃，在50μl FACS缓冲液(PBS，10％FCS，0.02％NaN3)中，用50ng(或所示量)的Flag标记的可溶性hBAFF短形式染色20分钟，接着用抗-Flag M2(1μg)和第二抗体染色。抗-BAFF mAb 43.9的使用浓度为40μg/ml。为了进行双色FACS分析，外周血淋巴细胞用Flag标记的可溶性BAFF/长型(2μg/ml)染色，接着用生物素化的抗-Flag M2(1/400)和PE-标记的链霉抗生物素蛋白(1/100)染色，接着用经FITC-标记的抗-CD4，抗-CD8或抗-CD19染色。
-PBL增殖试验
在存在或缺乏2μg/ml山羊抗-人μ链抗体(Sigma)或对照F(ab’)2时，在96-孔培养板中将外周血白细胞与所示浓度的天然或经煮沸的可溶性BAFF/长型一起保温72小时(以105个细胞/孔在100μl添加有10％FCS的RPMI中保温)。再用[3H]胸苷(1μCi/孔)脉冲细胞6小时，并收获细胞。通过液体闪烁计数监测[3H]胸苷掺入。在一些实验中，用被全长BAFF稳定转染的293细胞(或用作对照的293wt)替代重组可溶性BAFF，所述293细胞已于25℃在1％低聚甲醛中固定了5分钟。按文献(17)所述进行试验。在另一些实验中，用磁珠从PBL中分离CD19+细胞，照射(3000拉德)剩下的CD19-细胞，然后与CD19+细胞重建。按上文所述以sBAFF进行增殖试验。
-B细胞活化试验
按文献(13)所述，在EL-4培养***中活化纯化的B细胞。简单地说，在200μl培养基中将与5×104个经照射的鼠EL-4胸腺瘤细胞(克隆B5)混合的104个B细胞培养5-6天，所述培养基含有5％v/v人T细胞(106/ml)培养物上清液，所述T细胞已用PHA(1μg/ml)和PMA(1ng/ml)活化48小时。然后再次用抗-CD19珠分离B细胞，并在存在或缺乏sBAFF时，在单纯的培养基或添加有5％T细胞上清液，或50ng/ml IL-2(former Glaxo Institute for MolecularBiology，Geneva馈赠)和各10ng/ml的IL-4和IL-10(Peprotech，伦敦，英国)的培养基中将该B细胞再培养7天(5×104个细胞/200μl，在平底96孔培养板中进行双份或三份试验)。加入浓度为2μg/ml的抗-Flag M2抗体，独自使用该抗体是无效的。按文献(13)所述，通过ELISA试验定量培养物上清液中的IgM，IgG和IgA。
我们使用改良的分布图检索(18)筛选了公共数据库，通过序列同源性可将人BAFF鉴定为TNF配体家族可能的新成员。通过组合EST-克隆(覆盖3’区域)和经PCR扩增的片段(5’区域)，获得编码285-氨基酸(aa)长的完整蛋白质的cDNA。缺乏信号肽表明BAFF是II型膜蛋白，是典型的TNF-配体家族成员。该蛋白质具有推定的46aa胞质结构域，疏水跨膜区域和含有两个潜在的N-糖基化位点的218aa胞外结构域(图1A)。BAFF胞外结构域的序列与APRIL显示出最高的同源性(33％氨基酸同一性，48％同源性)，而与该家族其它成员，如TNF，FasL，LTα，TRAIL或RANKL的同一性低于20％(图1B，C)。分离自脾脏文库的小鼠BAFF cDNA克隆编码稍长一些的蛋白质(309aa)，因为在跨膜区域和几个β链的第一链之间具有***片段，所述β链构成所有TNF配体成员的受体结合结构域(19)。在小鼠和人BAFF中，这一富含β链的外结构域几乎是相同的(同一性86％，同源性93％)，这表明BAFF基因在进化过程中是高度保守的(图1A)。
尽管TNF家族成员是作为***膜的配体被合成的，但经常可以观察到跨膜结构域和受体结合结构域之间的茎区域中的裂解。例如，用金属蛋白酶可以容易地将TNF或FasL从细胞表面裂解下来(20，21)。当在293T细胞中产生几种重组BAFF形式时，我们注意到32kDa的重组可溶性BAFF形式(aa83-285，sBAFF/长型)除含有受体结合结构域以外，含有完整的茎区域和N-末端Flag-标记，该形式被充分加工成较短的18kDa片段(图2A，B)。裂解发生在茎区域，因为只有用抗BAFF完整受体相互作用结构域的抗体，而不是抗-Flag抗体才能检测到该片段(数据未显示)。也揭示出只有N124(位于茎区域)，而不是N242(位于F-β片层的入口处)是糖基化的，因为通过用PNG酶F除去N联糖类，未经加工的sBAFF/长型的分子量由32kDa降低为30kDa，而18kDa的裂解形式对此处理不敏感。对18kDa片段的肽序列分析实际上显示出裂解发生在R133和A134之间(图1A)。R133位于多碱(polybasic)区域的末端，所述区域在人(R-N-K-R)和小鼠(R-N-R-R)之间是保守的。为了检测裂解是否不仅仅是表达可溶性的，非天然BAFF形式的假象，在293T细胞中表达与膜结合的全长BAFF(图2C)。在细胞提取物中可以容易地检测到32kDa的完整BAFF和一些较高分子量的类别(可能相当于未-解离的二聚体和三聚体)，但从上清液中回收的95％以上的BAFF相当于经加工的18kDa形式，这表明当作为与膜结合的配体合成时，BAFF也被加工过。
对可溶性BAFF进行基因工程改造(Q136-L285，sBAFF/短型)，其序列自加工位点下游2aa开始(图1B)。正如所预测的那样，与该重组分子的N末端结合的Flag-标记未被去除(数据未显示)，这样的话，就可以通过抗-Flag亲和柱纯化该重组分子。为了检测其正确的折叠，通过凝胶过滤分析纯化的sBAFF/短型，其中洗脱表观分子量为55kDa的蛋白质(图2D)。sBAFF/短型被正确装配成同三聚体(3×20kDa)，这与其它TNF家族成员的四级结构一致(19)。最后，在细菌中可容易地表达未经加工的sBAFF/长型，这表明裂解事件是真核细胞所特有的。
对BAFF进行Northern印迹分析，结果表明脾脏和PBL中富含2.5kbBAFF mRNA(图3A)。胸腺，心脏，胎盘，小肠和肺显示出微弱的表达。这种局限分布暗示淋巴组织中存在的细胞是BAFF的主要来源。通过PCR分析，我们发现BAFF mRNA存在于T细胞和外周血单核细胞-衍生的树突细胞中，而不存在于B细胞中(图3B)。甚至首次用于实验的，未经刺激的T细胞似乎也能表达一些BAFF mRNA。
在包括人BAFF序列的数据库中发现序列标记位点(STS，SHGC-36171)。该位点被作图于人染色体13，D13S286与D13S1315标记之间的9cM间隔中。在细胞遗传图谱上，该间隔相当于13q32-34。在已知的TNF配体家族成员中，只有RANKL(Trance)被定位于该染色体(22)，但与BAFF(13q14)距离很远。
为了使配体发挥最大的生物效应，可以在淋巴组织中存在的相同细胞或相邻细胞上表达BAFF受体(BAFF-R)。使用重组sBAFF作为工具以通过FACS特异性测定BAFF-R表达，我们实际上在多个B细胞系，如Burkitt淋巴瘤Raji和BJAB中发现了高水平的受体表达(图4A，表1)。与之相反，T细胞，成纤维细胞，上皮细胞和内皮细胞来源的细胞系全为阴性。单核细胞系THP-1观察到很弱的染色，然而，这可能是由Fc受体结合引起的。因此，BAFF-R表达似乎局限于B细胞系。使用人BAFF为探针，受试的两个小鼠B细胞系为阴性，但在小鼠脾细胞上观察到微弱的结合(数据未显示)。通过分析脐带和外周血淋巴细胞证实B细胞上存在BAFF-R。尽管CD8+和CD4+T细胞上缺乏BAFF-R(图4B，数据未显示)，但在CD19+B细胞上观察到强染色(图4A和4B)，这表明所有血液B细胞(包括首次用于实验的B细胞和记忆B细胞)上都表达BAFF-R。
由于BAFF与来自血液的B细胞结合，进行实验以测定配体是否传递生长-刺激或生长-抑制信号。用抗-IgM(μ)抗体以及稳定表达表面BAFF的经固定的293细胞刺激外周血淋巴细胞(PBL)(图5A)。对照细胞的存在未改变仅由抗-μ诱导的[3H]胸苷掺入水平，但如果存在经BAFF转染的细胞，所述水平会增加2倍(图5B)。当用纯化的sBAFF替代经BAFF转染的细胞时，也可以获得依赖于剂量的PBL增殖(图5C)，这表明BAFF不需要与膜结合即可发挥其活性。在此实验方案中，由sCD40L导致的增殖需要超过1μg/ml的浓度，但相对于由BAFF介导的增殖而言，前者对抗-μ存在的依赖性较小(图5D)。当将纯化的CD19+B细胞与经照射的自身CD19-PBL共培养时，BAFF对增殖的共刺激未受影响，说明[3H]胸苷摄取主要是由B细胞增殖而不是间接刺激另一细胞类型引起的(数据未显示)。所观察到的对BAFF反应所致的B细胞增殖完全依赖于抗-u抗体的存在，这表明BAFF作为B细胞增殖的共刺激物起作用。
为了研究BAFF对免疫球蛋白分泌可能造成的影响，通过在存在细胞因子混合物时与EL-4T细胞共培养来预活化纯化的外周血或脐血B细胞，所述细胞因子混合物来自经PHA/PMA刺激的T细胞的上清液(23)。重新分离这些B细胞，使其纯度达到98％，在存在BAFF和活化的T细胞细胞因子时的次级培养过程中，这些B细胞的分泌Ig相对于仅存在细胞因子时的培养过程中的分泌Ig而言增加2倍。缺乏外源细胞因子时，仅产生很有限的影响，存在重组细胞因子IL-2，IL-4和IL-10时，观察到中等程度(1.5倍)的影响(图5E，F)。
对BAFF进行的生物化学分析也与TNF家族成员的典型同三聚体结构一致。在该配体家族中，BAFF与APRIL的序列相似性水平最高，而APRIL最近被我们鉴定为能刺激多种肿瘤细胞生长的配体(11)。与具有相同高同源性(同一性33％)，其基因在染色体6上连锁的两个家族成员TNF和LT□不同的是，APRIL和BAFF不在相同染色体上簇集。APRIL位于染色体17(J.L.B.数据未显示)，而BAFF被作图于人染色体13的远侧臂上(13q34)。在Burkitt淋巴瘤中，该基因座的异常被鉴定为第二常见的缺陷(24)，而最常见的缺陷是myc基因被转运至Ig基因座(25)。考虑到所分析的所有Burkitt淋巴瘤细胞系上BAFF-R的高表达水平(见表1)，这增加了令人感兴趣的可能性，即一些Burkitt淋巴瘤具有下调的BAFF表达，因此，以自泌的方式刺激生长。
抗原-特异性B淋巴细胞在免疫应答不同阶段的作用高度依赖于辅助T细胞和抗原-呈递细胞，如树突细胞发出的信号和与这些细胞的接触(20)。当B淋巴细胞早在免疫应答期间当与淋巴组织中B细胞滤泡边缘的T细胞相互作用时，就首次接收到这些信号，导致它们增殖和分化成低亲和力抗体形成细胞(18)。同时，一些抗原-特异性B细胞也迁移至B细胞滤泡中，为生发中心的形成作出贡献，生发中心是B细胞增殖，以及亲和力成熟和产生记忆B细胞和高亲和力浆细胞的另一个位点(19)。
已证实对于B淋巴细胞在T细胞依赖性免疫应答的多个步骤所起的作用而言，由TNF超家族的另一个成员CD40L触发的信号至关重要。然而，几项研究清楚地表明CD40L/CD40的相互作用不能解释B细胞的所有接触依赖性T细胞辅助。实际上，已证实分离自敲除小鼠或X-连锁高IgM综合征患者的CD40L-缺陷型T细胞能成功诱导B细胞增殖并分化成浆细胞。使用抗CD40L的封闭抗体的研究表明：分离自人扁桃体的表面IgD阳性B细胞子集以不依赖于CD40的方式对活化的T细胞作出反应而增殖和分化。还证实TNF家族的其它成员，如膜结合TNF和CD30L参与对B细胞的不依赖于CD40和表面Ig的刺激。与我们就BAFF的研究结果类似，已证实只要同时触发表面Ig受体，就可以用辅助T细胞刺激CD40-缺陷型B细胞增殖，并分化成浆细胞。BAFF以及CD30L和CD40L由T细胞表达，但其新颖性(originality)表现在其也可以由树突细胞表达，以及其受体在B细胞上的高度特异性定位，这与在很多种不同细胞上表达的CD40，CD30和TNF受体形成对照。这一观察结果表明B细胞上存在独立的和特异性的由BAFF-诱导的功能。
BAFF在T细胞-和树突细胞-诱导的B细胞生长和潜在成熟中的作用，我们发现BAFF共刺激来自于血液的B细胞的增殖，伴随有B细胞受体的交联，因此不依赖CD40产生的信号。另外，使用在体外分化成前-浆细胞/GC-样B细胞的CD19阳性B细胞(14)，我们观察到在存在活化T细胞的上清液或IL-2，IL-4和IL-10的混合物时，BAFF对这些B细胞的Ig分泌的共刺激作用。有趣的是，存在活化T细胞的上清液时，与细胞因子混合物相比，共刺激作用更强，这表明由活化T细胞分泌的其它可溶性因子参与抗体的产生，它们可以与BAFF或另外的BAFF自身协同作用。因此，BAFF可能对这些GC-样B细胞分化成浆细胞作出了有效的贡献。
显然，在体外，BAFF可以在首次用于试验的B细胞以及GC样(committed)B细胞中发信号。是否这一观察结果能应验于正常的免疫应答过程，还有待于适当体内实验的证实。
BAFF在B细胞中诱导的生物应答与CD40L诱导的应答不同，因为由CD40L引发的增殖对抗-μ共刺激物的依赖性较小(17)(图5D)。另外，CD40L在与B细胞受体相遇之后，可以抵消B细胞中的细胞凋亡信号(29)，而BAFF不能使B细胞系Ramos(尽管其能表达BAFF-R)免遭抗-μ介导的细胞凋亡(表1；F.M.和J.L.B.，未公开观察结果)。因此很可能CD40L和BAFF完成不同的功能。在此方面，值得注意的是：BAFF不能与受试的16种TNF家族重组受体中的任一种，包括CD40相互作用(P.S和J.T.未公开观察结果)。
用缺乏跨膜结构域的重组可溶性BAFF可有效地共刺激B细胞生长。该活性与几个TNF家族成员的活性形成对照，这些成员仅能作为膜结合配体发挥活性，例如TRAIL，FasL和CD40L。这些配体的可溶性形式具有微弱的生物活性，所述活性通过交联可以增加，从而模拟膜结合配体(15)。与之相反，使Flag-标记的sBAFF与抗-Flag抗体交联，或者使用上皮细胞表面表达的膜结合BAFF不会进一步增加BAFF的促***活性，这表明它可以象TNF那样，作为分泌型细胞因子在全身发挥作用。这与以下的观察结果一致：BAFF茎中存在的多碱序列作为蛋白酶底物起作用。类似的多碱序列也存在于APRIL和TWEAK的相应位置，对它们两个而言，存在蛋白酶裂解加工的证据(30)(N.H.和J.T.未公开观察结果)。尽管负责裂解的蛋白酶正有待测定，但它不可能是负责释放膜结合TNF的金属蛋白酶，因为它们的序列偏好完全不同(21)。BAFF(R-N-K-R)，APRIL(R-K-R-R)和TWEAK(R-P-R-R)中的多碱基元使人联想起前蛋白质转变酶家族原型弗林蛋白酶的基本裂解信号(R-X-K/R-R)(31)。
除非另有说明，本发明的实施将利用细胞生物学，细胞培养，分子生物学，微生物学，重组DNA，蛋白质化学和免疫学的常规技术，这些技术是本领域技术人员所熟知的。所述技术描述于文献中，例见分子克隆：实验室手册，第2版(Sambrook，Fritsch和Maniatis编)，冷泉港实验室出版社，1989；DNA克隆，第I和II卷(D.N.Glover编)，1985；寡核苷酸合成(M.J.Gait编)，1984；美国专利4,683,195(Mullis等)；核酸杂交(B.D.Hames和S.J.Higgins编)，1984；转录和翻译(B.D.Hames和S.J.Higgins编)，1984；动物细胞培养(R.I.Freshney编)，Alan R.Liss公司，1987；固定化细胞和酶，IRL出版社，1986；分子克隆实验指南(B.Perbal)，1984；酶学方法，第154和155卷(Wu等编)，Academic出版社，纽约；哺乳动物细胞的基因转移载体(J.H.Miller和M.P.Callos编)，1987，冷泉港实验室；细胞和分子生物学的免疫化学方法(Mayer和Walker编)，Academic出版社，伦敦，1987；实验免疫学手册，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)，1986；小鼠胚胎操作方法，冷泉港实验室出版社，1986。
提供下列实施例是为了阐明本发明，而不应被当成是对本发明的限制。
                 实施例
实施例1-6利用了下列实验方法。
产生鼠BAFF Tg小鼠的DNA构建体
以前已描述过人和鼠BAFF的cDNA序列(Schneider等，1999)。通过RT-PCR产生编码全长鼠BAFF的PCR片段。根据厂商(GibcoBRL，GrandIsland，纽约)的方法，使用寡dT由小鼠肺polyA+(Clontech，Palo Alto，CA)合成第一条cDNA链。PCR反应含有1×Pfu缓冲液(Stratagene，La Jola，CA)，0.2mM dNTP，10％DMSO，12.5pM引物，5个单位的Pfu酶(Stratagene)和具有NotI限制性位点的下列引物5’-TAAGAATGCGGCCGCGGAATGGATGAGTCTGCAAA-3’和5’-TAAGAATGCGGCCGCGGGATCACGCACTCCAGCAA-3’。以94℃ 1分钟，54℃ 2分钟和72℃ 3分钟将模板扩增30个循环，接着于72℃延伸10分钟。该序列对应于GenBank序列AF119383的核苷酸214至1171。用NotI消化PCR片段，然后克隆至经修饰的pCEP4载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)。用XbaI除去含有鼠BAFF的片段以包括SV40polyA添加位点序列。将该片段克隆至基于pUC的载体，所述载体中添加了启动子序列。启动子，即含有人ApoE增强子和AAT(α抗-胰蛋白酶)启动子的1Kb平端BglII-NotI片段纯化自质粒克隆540B(华盛顿大学(St.Louis，MO)的Katherine Parker Ponder博士馈赠)。EcoRV/BglII片段纯化自最终的载体，并用于产生转基因小鼠。使C57BL/6J雌性×DBA/2J雄性F1(BDF1)小鼠的经注射后代与C57BL/6小鼠回交。显微注射和产生转基因小鼠的技术已有人描述(Mcknights等，1983)。
分析方法：
使用线性12.5％凝胶对血清样品进行还原型SDS-PAGE分析。根据厂商说明，使用Promega(Madison，WI)的分离试剂盒制备小鼠肝脏的总RNA，并进行加工以进行Northern印迹分析。使用跨越转基因构建体的SV40 poly A尾的探针检测BAFF转基因-特异性的mRNA，通过用XbaI和BamHI消化经修饰的pCEP4载体得到所述mRNA。该探针识别对应于BAFF转基因的mRNA的1.8-2Kd带。在含有1×Taq聚合酶缓冲液(Stratagene)，0.2nMdNTP，10％DMSO和5个单位的Taq聚合酶(Stratagene)的反应中，使用12.5pM的下列引物5’-GCAGTTTCACAGCGATGTCCT-3’和5’-GTCTCCGTTGCGTGAAATCTG-3’对BAFF Tg小鼠的尾DNA进行PCR分析。以94℃ 30秒，54℃ 1分钟和72℃ 1.5分钟将719bp的转基因扩增35个循环，接着于72℃延伸10分钟。
使用用于分析尿的Multistix 10 SG试剂条(拜耳公司，诊断试剂部，Elkhart，IN)测定小鼠尿液中蛋白质的存在。
细胞-dyn和细胞荧光测定分析(FACS)
用Abbott Cell Dyne 3500仪器(芝加哥，IL)对新鲜的EDTA抗凝全血进行示差WBC计数。为了进行FACS分析，从Pharmingen(San Diego，CA)购得荧光素(FITC)-，Cy-chrome-和藻红蛋白-(PE)-标记的大鼠抗-小鼠抗体：抗-B220，抗-CD4，抗-CD8，抗-CD43，抗-IgM，抗-CD5，抗-CD25，抗-CD24，抗-CD38，抗-CD21，抗-CD44，抗-L-选择蛋白和仓鼠抗-Bcl-2/对照仓鼠Ig试剂盒。得自重组大肠杆菌以及哺乳动物细胞的人和小鼠经Flag-标记的BAFF的产生曾被描述过(Schneider等，1999)。所有抗体根据厂商说明使用。按下述从小鼠血液中纯化PBL：在含有EDTA的小管中收集小鼠血液，用PBS稀释一倍。将500□l经稀释的血液上样于4ml玻璃管中的1ml菲可(Celardane，Hornby，Ontario，加拿大)的上方，将该梯度室温2000rpm离心30分钟，收集含有淋巴细胞的界面，用PBS洗涤2次，然后进行FACS染色。在RPMI培养基(Life Technologies公司，Grand Island，纽约)中将脾脏，骨髓和肠系膜***磨成单细胞悬浮液，用FACS缓冲液(添加有2％胎牛血清(JRH Biosciences，Lenexa，KS)的PBS)洗涤。首先将细胞悬浮于添加有下列封闭试剂的FACS缓冲液：10□g/ml人Ig(Sandoz，Basel，瑞士)和10□g/ml抗-小鼠Fc封闭抗体(Pharmingen)，在冰上保温30分钟，然后用经荧光染料标记的抗体进行染色。所有抗体用含有上述封闭试剂的FACS缓冲液稀释。样品使用FACScan细胞荧光计(Becton Dickinson)分析。
通过ELISA试验检测小鼠血清中的小鼠总Ig和类风湿因子
于4℃，用含有10□g/ml山羊抗-小鼠总Ig溶液(Southern BiotechnologyAssociates公司，Birmingham，AL)的50mM碳酸氢钠缓冲液，pH9.6将ELISA板(Corning glass works，Corning，纽约)包被过夜。用PBS/0.1％吐温将板洗涤3次，并用含有1％明胶的PBS封闭过夜。在板中加入100□l/孔血清连续稀释液或标准稀释液，于37℃放置30分钟。于37℃，使用100□l/孔1□g/ml经碱性磷酸酶(AP)-标记的山羊抗-小鼠总Ig溶液(Southern BiotechnologyAssociates)检测小鼠Ig 30分钟。用PBS/0.1％吐温将板洗涤3次，最后一次洗涤之后，使用含有10□g/ml对硝基苯磷酸(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)的10％二乙醇胺溶液显色酶反应。通过加入100□l3NNaOH/孔终止反应。使用得自Molecular Devices(Sunnyvale，CA)的分光光度计测定405nm下的光密度(O.D.)。使用购自Southern Biotechnology Associates的纯化的小鼠Ig得到标准曲线。当检测类风湿因子(RF)时，用正常的山羊Ig(Jackson ImmunoResearch laboratories公司，West Grove，PA)替代山羊抗-小鼠Ig来包被ELISA板，按上述检测小鼠Ig。使用经AP-标记的山羊抗-小鼠IgA，IgM，IgG2a，IgG2b和IgG3在RF试验中检测小鼠同种型，并使用纯化的小鼠IgA，IgM，IgG2a，IgG2b和IgG3(Southern Biotechnology Associates)绘制标准曲线。通过分析方差进行所有统计学比较。
检测循环免疫复合物(CIC)并沉淀小鼠血清中的冷球蛋白
试验按前人所述(June等，1979；Singh和Tingle，1982)，作下列改动来进行：于4℃，用含有5□g/ml人Clq(Quidel，San Diego，CA)的50mM碳酸氢钠缓冲液，pH9.6将ELISA板(Corning glass works)包被过夜。用PBS/0.1％吐温将板洗涤3次。在板中加入50□l/孔0.3M EDTA，加上50□l/孔血清连续稀释液或已知浓度的标准免疫复合物(得自DAKO(Carpinteria，CA)的过氧化物酶-小鼠抗-过氧化物酶(PAP))溶液。将板置于37℃保温30分钟，用PBS/0.1％吐温将板洗涤3次。按上文ELISA试验中所述，使用100□l/孔1□g/ml经AP标记的山羊抗-小鼠Ig溶液(Southern Biotechnology Associates公司)检测免疫复合物中的小鼠Ig。通过于4℃将用水稀释15倍的小鼠血清保温过夜来检测冷球蛋白，用肉眼对沉淀物进行评分。
抗-双链(ds)和单链(ss)DNA试验
使用NUNC-immuno Plate MaxiSorp板(NUNC A/S，丹麦)进行抗-ssDNA试验。于4℃，首先用100□g/ml甲基化的BSA(Calbochem公司，La Jolla，CA)，接着用50□g/ml I级小牛胸腺DNA(Sigma，St.Louis，MO)将板包被过夜。通过超声处理剪切小牛胸腺DNA，然后用S1核酸酶消化待用。为了进行抗-ssDNA试验，将DNA煮沸10分钟，在冰上冷却待用。封闭之后，加入经连续稀释的血清样品，室温下保温2小时。用山羊抗-小鼠IgG-AP(Sigma)检测自身抗体，按上文ELISA试验中所述进行显色。使用同时特异于ss-和ds DNA的已知量的抗-DNA mAb 205得到标准曲线(Datta等，1987)。
免疫组织化学
在O.C.T.包埋介质(Miles，Elkhart，IN)中冷冻脾脏和***并封固以备恒冷切片。在丙酮中干燥和固定7-10□m厚的切片。用Tris-缓冲盐水A(TBS-A，0.05M Tris，0.15M NaCl，0.05％吐温-20(v/v)，0.25％BSA)稀释之后，在室温下，在湿盒中将所有Ab(10□g/ml)保温1小时，用TBS-B(0.05M Tris，0.15MNaCl，0.05％吐温-20)浸洗，并在甲醇中固定1分钟，然后开始进行酶反应。分别使用二氨基联苯胺(DAB)片剂底物试剂盒(Sigma)和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/氮蓝四唑(BCIP/NBT，Pierce，Rockford，IL)显色辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)的活性。最后用甲醇将经染色的组织切片固定5分钟，用吉姆萨(Fluka，Buchs，瑞士)进行复染。经生物素标记的抗体，大鼠抗-B220，抗-CD11c，抗-多配体蛋白聚糖-1以及未经标记的大鼠抗-CD4，抗-CD8□和抗-CD8□购自Pharmingen。经生物素标记的花生凝集素(PNA)得自Vector实验室(Burlingame，CA)。(HRP)-标记的小鼠抗-大鼠Ig和(HRP)-链霉抗生物素蛋白购自Jackson ImmunoResearch laboratories公司，经AP-标记的链霉抗生物素蛋白购自Southern Biotechnology Associates公司。当对肾脏组织进行免疫组化分析以检测Ig沉积时，使用石蜡切片，脱蜡，用经稀释的得自Vector(Burlingame，CA)的马血清进行封闭，然后用得自JacksonImmunoResearch的HRP-山羊抗-小鼠Ig染色。按上述进行检测。
实施例1
BAFF转基因(BAFF Tg)起始(founder)小鼠具有异常表型
使用具有APOE增强子的肝脏特异性α-1抗胰蛋白酶启动子，在转基因小鼠中表达全长鼠BAFF。选择全长形式，希望BAFF能被裂解并在全身起作用，或者如果以膜结合形式保留的话，能观察到可能提供功能线索的局部肝脏特异性异常。我们得到了13只BAFF转基因阳性的起始小鼠(表2)。其中的4只小鼠在幼年时死亡。对小鼠811和816进行常规的病理学研究(表2)。这些小鼠中没有明显的感染；然而，心血管和肾脏异常很明显，其与严重高血压的异常(Fu，1995)类似(表2)。起始小鼠816的用苏木精和伊红(H&E)-染色的肾脏组织切片表明：该小鼠肾小球形态学的异常，而其余肾脏组织看上去是正常的(信息未显示)。很多BAFF转基因起始小鼠具有蛋白尿症(表2)。对小鼠816的脾脏冷冻组织切片进行免疫组化分析，结果显示出异常和密集的B细胞染色和减少的T细胞染色，在后代中证实了这一观察结果(见下文，图12)。
使用双色FACS分析，计算出B220阳性B细胞的百分比与CD4阳性T细胞的百分比相比的比例。当与阴性BDF1小鼠对照相比时，BAFF Tg起始小鼠中的该比例要高2至7倍(表2)，这表明BAFF Tg小鼠中B细胞群体的增加。我们选择9只这样的起始小鼠来产生表2中下划线的不同转基因小鼠品系。其余的BAFF Tg起始小鼠或其繁衍的后代在起始小鼠696，700，811和816早期死亡之后，无一显示出任何患病的迹象，这表明这4只小鼠可能表达了导致它们死亡的较高水平的BAFF。通过Northern印迹分析证实了转基因小鼠肝脏中BAFF的过量表达(数据未显示)。在经过组织学检查的所有BAFF-Tg小鼠中，肝脏未显示出异常，这说明局部过量表达BAFF不会导致任何免疫学或病理学事件。未对鼠BAFF进行ELSA试验：然而，我们证实得自BAFF Tg小鼠，而不是对照小鼠的2％血清封闭了由哺乳动物细胞-得到的小鼠可溶性Flag-标记型BAFF与BJAB细胞的结合。另外，得自BAFF Tg小鼠，而不是对照小鼠的5％血清在抗-□存在下增加了得自PBL的人B细胞的增殖(数据未显示)。这些数据表明BAFF Tg的血液中存在大量可溶性的BAFF。
实施例2
BAFF Tg小鼠外周血淋巴细胞增多归因于B细胞数目的提高
当与阴性同窝对照小鼠相比时，转基因小鼠群体的血液中具有更多的淋巴细胞，其数目高达每□升血液中有13000个淋巴细胞(图7A)。相反，BAFFTg小鼠和对照小鼠每□升血液中的粒细胞数目保持在正常的限度内(图7A)。由6只不同起始小鼠繁殖出的18只BAFF Tg小鼠的外周血细胞(PBL)，因用抗-CD4和抗-B220抗体对它们进行的ACS分析显示出B/T比增加(图7B和7C)，故淋巴细胞水平的提高是由B细胞子集的扩展引起的。类似地，使用该方法计算出CD4循环T细胞的绝对数目，揭示出当与对照小鼠相比时，BAFF Tg小鼠中的该T细胞子集减少50％，CD8 T细胞子集也有相同的观察结果(数据未显示)。当与对照小鼠的B细胞相比时，来自BAFF Tg小鼠PBL的所有B细胞具有增加的MHC II类和Bcl-2表达(分别为图7D和7E)，这表明BAFF Tg小鼠PBL中存在一定水平的B细胞活化。BAFF Tg小鼠血液中的T细胞不表达早期活化标记CD69或CD25；然而，40至56％的CD4或CD8 T细胞是具有CD44hi，L-选择蛋白lo表型的活化的效应T细胞，而同窝对照小鼠中的该比例仅为8％至12％(图7F)。因此，BAFF Tg小鼠明显显示出B细胞淋巴细胞增多和总体B细胞活化以及T细胞改变的迹象。
实施例3
扩展的B细胞区室由成熟细胞组成
为了研究转基因小鼠中BAFF的过量表达是否会影响骨髓中央和次级淋巴器官外周的B细胞区室，我们通过FACS检查了衍生自4只不同起始小鼠的总共7只BAFF Tg小鼠和7只同窝对照小鼠的脾脏，骨髓和肠系膜***。成熟B细胞区室通过用抗-B220和抗-IgM抗体染色分析。图8中显示了两只代表性的BAFF Tg小鼠和一只代表性的同窝对照小鼠。在脾脏和肠系膜***中，成熟B细胞区室(IgM+，B220+)都有所增加(图8A，分别为上方和下方的实验组)。分析B220+/IgM+B细胞(图7A，中间的实验组)或骨髓中的原(pro)B细胞(CD43+/B220+)和前(pre)B细胞(CD43-/B220+)区室(图8B)，显示出BAFF Tg小鼠和同窝对照小鼠是类似的。这些数据表明BAFF的过量表达影响到外周成熟B细胞而不是骨髓祖代B细胞的增殖。通过FACS分析脾脏中的B细胞亚群，结果表明与对照小鼠相比，BAFF Tg小鼠中边缘区(MZ)B细胞的比例增加(表3)。在BAFF Tg和对照小鼠中，滤泡B细胞群体保持一定的比例，而BAFF Tg小鼠中新形成的B细胞组分略有减少(表3)。分别使用抗-CD38对抗-CD24抗体和抗-IgM对抗-IgD抗体，按文献(Oliver等，1997)所述，分析MZ B细胞群体的CD38hi/CD24+和IgMhi/IgDlo表型，也在B220+脾脏B细胞中证实了上述结果(数据未显示)。使用抗-小鼠IgM抗体进行免疫组化分析，显示出当与对照小鼠相比时，BAFF Tg小鼠脾脏中IgM-明亮的(bright)MZ B细胞区域的扩大(数据未显示)。与对照小鼠相比，所有BAFF Tg B220+脾脏B细胞也表达较高水平的MHC II类(表3)和Bcl-2(数据未显示)，这表明脾脏B细胞以及PBL中的B细胞处于活化状态。
实施例4
BAFF Tg小鼠在其血清中具有高水平的总免疫球蛋白，类风湿因子和循环免疫复合物
BAFF Tg小鼠中增加的B细胞区室表明：这些动物的血液中总Ig水平也有所增加。通过SDS-PAGE分析BAFF Tg小鼠和同窝对照小鼠的血清，证实与对照血清相比，4只BAFF Tg小鼠中的3只中的重链和轻链IgG带浓度至少高出10倍(图9A)。类似地，对BAFF Tg小鼠的血清进行ELISA检测，与对照小鼠相比，显示出显著较高的总Ig水平(图9B)。
尽管通过SDS-PAGE观察到高水平，但通过ELISA测定在一些小鼠，如697-5，816-8-3和823-20中观察到过高的水平，导致我们怀疑血清中是否存在类风湿因子(RF)或针对IgG Fc片段上的抗原决定簇的自身抗体(Jefferis，1995)。这些抗体可与用于包被ELISA板的山羊抗-小鼠Ig结合，给出错误的高值。用正常的不相关的山羊Ig包被ELISA板，测定BAFF Tg Ig与正常山羊Ig的结合。图9C证实大多数BAFF Tg小鼠的血清中都含有能与正常山羊Ig反应的Ig，而19只对照小鼠中只有两只在相同的试验中表现出活性。这些RF主要是IgM，IgA和IgG2a同种型(数据未显示)。
RF的存在与血液中高水平的循环免疫复合物(CIC)和冷球蛋白的存在相关(Jefferis，1995)。为了证实BAFF Tg小鼠是否具有异常的血清CIC水平，使用基于Clq的结合试验检测上文分析的21只BAFF Tg小鼠中的CIC。当与对照小鼠相比时，只有5只BAFF Tg显示出显著高的CIC水平，然而，这些小鼠对应于具有最高总Ig和类风湿因子水平的动物(图9D)。当用水将BAFF Tg小鼠血清而不是对照血清稀释15倍时，我们也观察到沉淀的形成，这表明这些小鼠中存在冷球蛋白(数据未显示)。因此，除了B细胞增生外，BAFF Tg小鼠还显示出严重的与RF和CIC相关的血球蛋白过多症。
实施例5
一些BAFF Tg小鼠具有高水平的抗-单链(ss)和双链(ds)DNA自身抗体
起初，我们在两个起始小鼠中观察到让人联想到狼疮-样疾病的肾脏异常(表II)。抗-DNA自身抗体的存在也已在SLE患者或SLE-样(SWR×NZB)F1(SNF1)小鼠中得以描述(Datta等，1987)。在曾被证实具有最高水平的总血清Ig的BAFF Tg小鼠中检测到抗-ssDNA自身抗体水平(图10A)。我们分析了两只抗ssDNA抗体为阴性的BAFF Tg小鼠(697-5和816-1-1)和3只能分泌抗-ssDNA抗体的转基因小鼠(820-14，816-8-3和820-7)，以及5只同窝对照小鼠的血清中抗dsDNA抗体的存在。BAFF Tg小鼠也分泌抗-dsDNA，然而，分泌水平不总是与抗-ssDNA抗体的分泌水平相关，因为不含有可测水平的抗-ssDNA抗体的BAFF Tg小鼠697-5的血清显然存在抗-dsDNA(图10B)。因此，显示出最严重的血球蛋白过多症的BAFF Tg小鼠分泌病理学水平的抗-DNA自身抗体。另外，也让人联想到这些小鼠中的狼疮-样问题，我们检测了所分析的6只BAFF Tg小鼠肾脏中的免疫球蛋白沉积(图10C)，其中的3只小鼠不能分泌可测水平的抗-DNA抗体(数据未显示)。
实施例6
BAFF Tg小鼠的脾脏和肠系膜***(MLN)中具有膨大的B细胞滤泡，多个生发中心，减少的树突细胞数目和增加的浆细胞数目
BAFF Tg具有大脾脏，MLN(数据未显示)和Peyer’s淋巴集结(图11)。免疫组化分析显示出BAFF Tg小鼠中膨大的B细胞滤泡和减少的外周小动脉淋巴sheet(PALS或T细胞区域)的存在(图12B)。有趣的是，在未经免疫的同窝对照小鼠中观察到很少几个生发中心(一般在该集落中具有典型性)，那些存在的生发中心较小(图12C)，而BAFF Tg小鼠在缺乏免疫时具有多个生发中心(图12D)。抗-CD11c对对照小鼠的T细胞区和边缘区中的树突细胞染色(图12E)在BAFF Tg小鼠中大大降低(图12F)。在同窝对照小鼠的脾脏中几乎检测不到多配体聚糖-1-阳性浆细胞(图12G)，而BAFF Tg小鼠的红髓为多配体聚糖-1-强阳性(图12H)。在MLN中获得很类似的观察结果(图13)。BAFFTg小鼠的MLN与正常***相比，其中的B细胞区域显著扩大(图13B)，而在正常***中，可在***外周的囊下方轻易识别出B细胞滤泡以及典型的副皮质T细胞区(图13A)。BAFF Tg小鼠的MLN髓质充满多配体聚糖-1阳性细胞，它们有可能是浆细胞(图13H)。结论是，对BAFF Tg小鼠中二级淋巴器官的分析与显示多细胞异常以及强免疫应答的扩大的B细胞表型一致。
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表I：BAFF-R在不同细胞系中的表达细胞类型          细胞系    MARCH结合      特别的细节上皮样细胞        HT-29        -           结肠腺癌
              A375         -/+         黑色素瘤
              MCF-7        -           乳腺癌
              ME260        -           黑色素瘤
              Cos          +           猴肾细胞成纤维细胞        WI-38        -           肺
              Hs-68        -           ***
              Hs-27        -           ***内皮细胞          HUVEC        -           脐静脉巨噬细胞/单核细胞 THP-1        -/+         单核细胞细胞系            Molt-4       -           成淋巴细胞白血病
              Hut-78       -           皮肤淋巴瘤
              Jurkat       -           成淋巴细胞白血病细胞系            BJAB         +++         Burkitt淋巴瘤
              Namalawa     ++          Burkitt淋巴瘤
              Dandi        +/-         Burkitt淋巴瘤EBNA+VCA+
              Ramos        ++          Burkitt淋巴瘤EBV-
              Raji         +++         Burkitt淋巴瘤
              JIYOYE       +           Burkitt淋巴瘤
              SKW.64       ++          LgM分泌型EBV+
              RPMI1788     +++         外周血，IgM分泌型
              IM-9         +++         成淋巴细胞，Ig分泌型
              NC-37        +++         成淋巴细胞，EBV+小鼠细胞系        WEHI-231     -           B细胞淋巴瘤
              A20          -           B细胞淋巴瘤按“材料和方法”中所述，使用FLAG-标记的MARCH，经FACS测定MARCH的表面表达。
表II：BAFF转基因起始小鼠列表小鼠数目     蛋白尿症a     R/Tb690雌性d      ND            2696雄性c      ND            ND697雌性        +++           ND700雄性c      ND            ND802雄性        ++            4.6804雌性        +++           5.4807雌性        ND            4810雄性        +++           7.8811雄性c/e    ND            ND813雄性        +             5.4816雌性e/f    ++            ND820雄性        4+            3823雄性        ++            2.9BDF1雌性对照   +/-           1.5BDF1雄性对照   +/-           2.5a蛋白尿症用浸没于小鼠尿中的医学显色条测定：-无蛋白尿症，+/-痕量，+(30mg/dl)，++(100mg/dl)，+++(300mg/dl)，++++(＞2000mg/dl)。bB/T：经FACS分析，用PE-标记的抗B220和FTTC-标记的抗CD4进行复染所测定的PBL中B细胞百分比对T细胞百分比的比例。c早期急性死亡d后代中无转基因传递。e尸检期间观察到的心血管和肾脏异常。f小鼠因尿中见血而处死。对所有组织的H&E-切片的分析显示，心脏、肾脏和动脉异常很明显。用生物素标记的抗小鼠B220和抗小鼠CD4，接着用碱性磷酸酶标记的链霉抗生物素蛋白和辣根过氧化物酶标记的抗大鼠Ig对冰冻切片进行免疫组化分析，测得脾脏B细胞群增加。下划线小鼠用于育种ND：未做
表3：B细胞上增加的MHC II类表达和BAFF Tg小鼠脾脏中增大的MZB细胞比例
             B220+B细胞上MHC       ％滤泡B细胞                 ％MZB细胞              ％新形成的B细胞
           II类的表达水平(MFI)   (B220+/IgMlo/CD21int)  (B220+/IgMhi/CD21hi)   (B220+/IgMhi/CD21lo)对照小鼠816-1-10             1170                   45                          6                       12802-21               1029                   48                          10.5                    9823-1                1240                   39                          9                       6.5Baff Tg小鼠802-6                1707                   49                          18                      5.9820-7                1900                   39                          23                      6.3816-1-1              2088                   40                          23                      5.8脾细胞用FACS分析并选通于B220+群体。所示为代表性实验。MFI：荧光强度的平均值

Claims (50)

1.刺激动物B细胞生长的方法，所述方法包括施用治疗有效量的选自下列的组合物的步骤：
(a)BAFF配体或其活性片断；
(b)BAFF配体或其活性片断和抗-μ抗体；
(c)BAFF配体或其活性片断和CD40配体；和
(d)BAFF配体或其活性片断和抗-CD40配体分子。
2.刺激动物产生免疫球蛋白的方法，所述方法包括施用治疗有效量的选自下列的组合物的步骤：
(a)BAFF配体或其活性片断；
(b)BAFF配体或其活性片断和抗-μ抗体；
(c)BAFF配体或其活性片断和CD40配体；和
(d)BAFF配体或其活性片断和抗-CD40配体分子。
3.共刺激动物中B细胞生长和免疫球蛋白产生的方法，所述方法包括施用治疗有效量的选自下列的组合物的步骤：
(a)BAFF配体或其活性片断；
(b)BAFF配体或其活性片断和抗-μ抗体；
(c)BAFF配体或其活性片断和CD40配体；和
(d)BAFF配体或其活性片断和抗-CD40配体分子。
4.刺激树突细胞-诱导的B细胞生长和成熟化的方法，所述方法包括施用治疗有效量的选自下列的组合物的步骤：
(a)BAFF配体或其活性片断；
(b)BAFF配体或其活性片断和抗-μ抗体；
(c)BAFF配体或其活性片断和CD40配体；和
(d)BAFF配体或其活性片断和抗-CD40配体分子。
5.根据权利要求1-4的方法，其中BAFF配体是可溶性BAFF配体。
6.根据权利要求5的方法，其中可溶性BAFF配体是重组BAFF配体。
7.根据权利要求1-4的方法，其中抗-CD40分子是单克隆抗体。
8.根据权利要求1-4的方法，其中动物源自哺乳动物。
9.根据权利要求8的方法，其中哺乳动物是人。
10.抑制动物中B细胞生长的方法，所述方法包括施用治疗有效量的选自下列的组合物的步骤：
(a)抗-BAFF配体分子或其活性片断；
(b)重组的，无正常功能的BAFF配体分子或其活性片断；
(c)特异于BAFF配体或其活性片断的抗体；和
(d)特异于BAFF配体受体或其表位的抗体。
11.抑制动物产生免疫球蛋白的方法，所述方法包括施用治疗有效量的选自下列的组合物的步骤：
(a)抗-BAFF配体分子或其活性片断；
(b)重组的，无正常功能的BAFF配体分子或其活性片断；
(c)特异于BAFF配体或其活性片断的抗体；和
(d)特异于BAFF配体受体或其表位的抗体。
12.共抑制动物中B细胞生长和免疫球蛋白产生的方法，所述方法包括施用治疗有效量的选自下列的组合物的步骤：
(a)抗-BAFF配体分子或其活性片断；
(b)重组的，无正常功能的BAFF配体分子或其活性片断；
(c)特异于BAFF配体或其活性片断的抗体；和
(d)特异于BAFF配体受体或其表位的抗体。
13.抑制动物中树突细胞-诱导的B细胞生长和成熟化的方法，所述方法包括施用治疗有效量的选自下列的组合物的步骤：
(a)抗-BAFF配体分子或其活性片断；
(b)重组的，无正常功能的BAFF配体分子或其活性片断；
(c)特异于BAFF配体或其活性片断的抗体；和
(d)特异于BAFF配体受体或其表位的抗体。
14.根据权利要求10-13的方法，其中抗-BAFF配体是可溶性的。
15.根据权利要求14的方法，其中可溶性的抗-BAFF配体是重组抗-BAFF配体。
16.根据权利要求10-13的方法，其中抗-BAFF抗体是单克隆抗体。
根据权利要求10-13的方法，其中抗-BAFF受体抗体是单克隆抗体。
17.治疗自身免疫病的方法，所述方法包括施用治疗有效量的选自下列的组合物的步骤：
(a)BAFF配体或其活性片断；
(b)BAFF配体或其活性片断和抗-μ抗体；
(c)BAFF配体或其活性片断和CD40配体；和
(d)BAFF配体或其活性片断和抗-CD40配体分子；
(e)抗-BAFF配体分子或其活性片断；
(f)重组的，无正常功能的BAFF配体分子或其活性片断；
(g)特异于BAFF配体或其活性片断的抗体；和
(h)特异于BAFF配体受体或其表位的抗体。
18.治疗与BAFF-配体相关的疾病的方法，所述方法包括下列步骤：
(a)在所需细胞中导入治疗有效量的载体，所述载体含有编码BAFF-相关分子的基因；和
(b)在所述细胞中表达所述基因。
19.根据权利要求18的方法，其中BAFF-相关分子选自：
(a)BAFF配体或其活性片断；
(b)BAFF配体或其活性片断和抗-μ抗体；
(c)BAFF配体或其活性片断和CD40配体；和
(d)BAFF配体或其活性片断和抗-CD40配体分子；
(e)抗-BAFF配体分子或其活性片断；
(f)重组的，无正常功能的BAFF配体分子或其活性片断；
(g)特异于BAFF配体或其活性片断的抗体；和
(h)特异于BAFF配体受体或其表位的抗体。
20.根据权利要求17-19的方法，其中BAFF配体是可溶性BAFF配体。
21.根据权利要求20的方法，其中可溶性BAFF配体是重组BAFF配体。
22.根据权利要求17-19的方法，其中抗-CD40分子是单克隆抗体。
23.根据权利要求17-19的方法，其中抗-BAFF配体是可溶性的。
24.根据权利要求23的方法，其中可溶性的抗-BAFF配体是重组抗-BAFF配体。
25.根据权利要求17-19的方法，其中抗-BAFF抗体是单克隆抗体。
26.根据权利要求17-19的方法，其中抗-BAFF受体抗体是单克隆抗体。
27.诱导细胞死亡的方法，所述方法包括施用能干扰BAFF-配体与受体结合的药剂。
28.治疗，抑制或改变涉及BAFF-配体及其受体之间信号传导途径的免疫应答的方法，所述方法包括施用有效量的药剂的步骤，所述药剂能干扰BAFF-配体与其受体之间的结合。
29.抑制炎症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的特异于BAFF-配体或其活性片断的抗体的步骤。
30.抑制炎症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的特异于BAFF-配体受体或其表位的抗体的步骤。
31.调节造血细胞发育的方法，所述方法包括施用治疗有效量的BAFF-配体或其活性片断的步骤。
32.治疗，抑制或改变涉及BAFF-配体及其受体之间信号传导途径的免疫应答的方法，所述方法包括施用有效量的药剂的步骤，所述药剂能干扰BAFF-配体与其受体之间的结合。
33.治疗动物高血压的方法，所述方法包括施用治疗有效量的B-细胞生长抑制剂的步骤。
34.根据权利要求33的方法，其中B-细胞生长抑制剂选自：
(e)(a)抗-BAFF配体分子或其活性片断；
(f)重组的，无正常功能的BAFF配体分子或其活性片断；
(g)特异于BAFF配体或其活性片断的抗体；和
(h)特异于BAFF配体受体或其表位的抗体。
35.根据权利要求34的方法，其中抗-BAFF配体是可溶性的。
36.根据权利要求35的方法，其中可溶性的抗-BAFF配体是重组抗-BAFF配体。
37.根据权利要求34的方法，其中抗-BAFF抗体是单克隆抗体。
38.根据权利要求34的方法，其中抗-BAFF受体抗体是单克隆抗体。
39.根据权利要求34的方法，其中动物源自哺乳动物。
40.根据权利要求39的方法，其中哺乳动物是人。
41.治疗动物高血压的方法，所述方法包括施用治疗有效量的B-细胞生长和免疫球蛋白分泌的共抑制剂的步骤。
42.治疗动物心血管病的方法，所述方法包括施用治疗有效量的B-细胞生长抑制剂的步骤。
43.治疗动物心血管病的方法，所述方法包括施用治疗有效量的B-细胞生长和免疫球蛋白产生的共抑制剂的步骤。
44.治疗动物肾病的方法，所述方法包括施用治疗有效量的B-细胞生长抑制剂的步骤。
45.治疗动物肾病的方法，所述方法包括施用治疗有效量的B-细胞生长和免疫球蛋白产生的共抑制剂的步骤。
46.台疗B-细胞淋巴-增生性疾病的方法，所述方法包括施用治疗有效量的B-细胞生长抑制剂的步骤。
47.刺激B-细胞产生以治疗免疫抑制疾病的方法，所述方法包括施用治疗有效量的选自下列的组合物的步骤：
(e)BAFF配体或其活性片断；
(f)BAFF配体或其活性片断和抗-μ抗体；
(g)BAFF配体或其活性片断和CD40配体；和
(h)BAFF配体或其活性片断和抗-CD40配体分子；
(i)抗-BAFF配体分子或其活性片断；
(j)重组的，无正常功能的BAFF配体分子或其活性片断；
(k)特异于BAFF配体或其活性片断的抗体；和
(l)特异于BAFF配体受体或其表位的抗体。
48.刺激B-细胞产生以治疗免疫抑制疾病的方法，所述方法包括施用治疗有效量的选自下列的组合物的步骤：
(i)BAFF配体或其活性片断；
(j)BAFF配体或其活性片断和抗-μ抗体；
(k)BAFF配体或其活性片断和CD40配体；和
(l)BAFF配体或其活性片断和抗-CD40配体分子；
(m)抗-BAFF配体分子或其活性片断；
(n)重组的，无正常功能的BAFF配体分子或其活性片断；
(o)特异于BAFF配体或其活性片断的抗体；和
49.根据权利要求48的方法，其中免疫抑制疾病是HIV。
50.根据权利要求49的方法，其中免疫抑制疾病与器官移植相关。
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