DE3887727T2 - Partikelstabilisierte Epitope zur Standardisierung und Kontrolle von Immuntests. - Google Patents
Partikelstabilisierte Epitope zur Standardisierung und Kontrolle von Immuntests.Info
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Description
- Immuntests für in biologischen Flüssigkeiten vorhandene antigene Substanzen (Antigene) werden häufig zur Bewertung physiologischer oder pathologischer Zustände bei Tieren und Menschen verwendet. Bestandteile der Immuntests sind das Antigen und der spezifische Antikörper, und der Test umfaßt die Bindung dieser Bestandteile aneinander in einer Weise, die von der Konzentration jedes Bestandteils abhängt.
- Die EP-A-0165811 beschreibt beispielsweise ein Verfahren zur Diagnose eines neoplastischen Zustandes (Krebs) in Säugetieren unter Verwendung eines sialylierten Lewisx-Antigens als Marker.
- In Abhängigkeit vom ausgewählten Immuntestverfahren wird ein gegen das sialylierte Lewisx-Antigen oder markierte sialylierte Lewisx-Antigen gerichteter markierter monoklonaler Antikörper als Reagenz verwendet. Die zum Nachweis verwendete Markierung kann aus einer großen Gruppe alternativer Markierungen ausgewählt werden, wozu Radioisotope, Fluoreszenzstoffe, Enzyme oder Enzymsubstrate und Teilchen gehören.
- Ein Antigen hat zwei Eigenschaften: (1) die Fähigkeit, die Bildung entsprechender Antikörper zu stimulieren und (2) die Fähigkeit, spezifisch mit den entsprechenden Antikörpern zu reagieren. Im wesentlichen wirken alle Proteine, viele Polysaccharide, Nucleoproteine, Lipoproteine, synthetische Polypeptide und kleinere Moleküle wie Haptene, wenn sie an größere Proteine gebunden sind, als Antigene. Ein Hapten ist ein kleines, unvollständiges Antigen, welches nicht in der Lage ist, alleine die Produktion von Antiköpern zu bewirken, welches jedoch in der Lage ist, mit spezifischen Antikörpern zu reagieren, die produziert werden, wenn das an eine größere antigene Substanz angelagerte Hapten in ein Tier gespritzt wird. Die Induktion der Antikörperbildung oder der Immunisierung tritt ein, wenn das Antigen in einen lebenden Körper durch die Haut oder den Muskel eingeführt wird, durch intraperitoneale Injektion oder durch intravenöse Injektion. Die Fähigkeit eines Antigens zur Stimulation der Antikörperproduktion wird verstärkt, wenn die Verbindung in den Geweben zurückgehalten wird. Aufgrund dieser Erkenntnis werden Materialien, die eine langsame Freisetzung des Antigens über längere Zeiträume ermöglichen (auch als Adjuvantien bekannt), verwendet, um die Antikörperantwort auf das Antigen zu erhöhen.
- Die Fähigkeit, eine Antikörperantwort hervorzurufen, ist vom verwendeten biologischen System und von den verwendeten Bedingungen, der Dosis, dem Applikationsweg usw. abhängig. Als Antwort auf ein Antigen produziert das Tier Antikörper, die in der Lage sind, mit jeder Stelle des Antigens, die es als fremd erkennt, zu reagieren. Der kleinste Anteil des Antigens, der eine Antikörperspezifität bestimmen kann, wird als antigene Determinante oder Epitop bezeichnet. Die vielen Antikörper, die gegen ein gegebenes Antigen produziert werden, sind das Ergebnis einer entsprechend großen Zahl verschiedener antikörper-produzierender Zellinien, und sie werden als polyklonale Antikörper und polyklonale Antiseren bezeichnet. Polyklonale Antikörper stellen Mischungen vieler verschiedener Antikörperspezifitäten gegen alle die vielen Antigene dar, denen ein Tier während seines Lebens ausgesetzt war.
- Da die meisten der in den Antiseren vorliegenden Antikörper für irgendein gegebenes Antigen unspezifisch sind, gibt es Schwierigkeiten bei der Reinigung von Antikörpern, die für ein gegebenes Antigen spezifisch sind. Polyklonale Antikörper sind bezüglich ihrer Affinitäten für ein Antigen extrem heterogen; die Wirkungen von Temperatur, pH und Ionenstärke auf die Geschwindigkeiten der Immunreaktion und die Variabilität der Immunantwort auf ein Antigen unterscheiden sich von Tier zu Tier. Die Verwendung monoklonaler Antikörper in der vorliegenden Erfindung, die durch ein von Köhler und Milstein, Nature 256, 495-497, 1975 beschriebenes Verfahren erhalten wurden, beseitigt viele Probleme, die mit der heterogenen Natur polyklonaler Antikörper assoziiert sind, und bei der Verwendung monoklonaler Antikörper verfügt man über ein homogenes. Reagenz, welches eine einheitliche Bindungsaffinität und -spezifität aufweist. Ein monoklonaler Antikörper reagiert mit nur einem sehr kleinen Anteil des größeren, komplexeren Antigens, welcher als antigene Determinante oder Epitop bezeichnet wird.
- Das Vorliegen eines Antigens in einer biologischen Flüssigkeit kann durch Vergleich der Reaktion der unbekannten Probe zu der des gleichen oder ähnlichen Antigens abgeschätzt werden. Durch Verwendung von Standardmengen des Antigens oder Standards in einem Immuntest kann die Konzentration einer unbekannten Antigenmenge durch ein als Standardisierung bekanntes Verfahren abgeschätzt werden. Die Reaktion der Standards steht in Beziehung zu ihrem Gehalt an Antigen, und sie kann graphisch auf der Y-Achse aufgetragen werden, während ihr bekannter Antigengehalt graphisch auf der X-Achse aufgetragen werden kann, um eine Standardkurve herzustellen. Die Reaktion einer Unbekannten wird dann auf der Y-Achse aufgefunden und verwendet, um einen Wert für die Unbekannte auf der X-Achse festzulegen. Dieses Standardisierungsverfahren beruht auf der Ahnlichkeit der Reaktivität der zum Test zugegebenen Standards und des unbekannten Antigens.
- Standardantigene können sich in ihrer Reaktivität mit einem gegebenen Antikörper über die Zeit verändern, und es ist deshalb notwendig, das Standardisierungsverfahren zu beobachten oder zu kontrollieren, so daß die Ergebnisse von zu unterschiedlichen Zeiten laufenden Tests vergleichbar sind. Dieses Verfahren zur Kontrolle von Immuntests umfaßt den Test von Kontrollproben, die das Antigen in einer Flüssigkeit ähnlich der zu messenden Testproben enthält. Die Kontrollproben werden jedes Mal, wenn der Test standardisiert wird, getestet, und es wird angenommen, daß sie in ähnlicher Weise über die Zeit reagieren. Variabilität und Tendenzen in den getesteten Kontrollwerten spiegeln Unterschiede in der Standardkurve wider, die aufgrund einer Verschlechterung der Standards auftreten können. Es ist sehr wichtig, zur Standardisierung und Kontrolle von Immuntests stabile Materialien zur Verfügung zu haben, um die Reproduzierbarkeit und die Fehlerfreiheit des Immuntests sicherzustellen. Die Fehlerfreiheit betrifft die Bewertung, wie nahe ein Wert dem wirklichen Wert kommt, während die Genauigkeit den Streuungsgrad von Beobachtungsreihen betrifft oder die Reproduzierbarkeit, wo die Streuung spezifisch angegeben wird, d.h. innerhalb der Laufgenauigkeit, der Genauigkeit von Tag zu Tag usw.. Diese Ausdrücke werden im einzelnen von Theodore Colton in seinem Buch Statistics in Medicine, Little, Brown and Company Publishers, S. 38 (1974) diskutiert. Kontrollen und Standards sind deshalb für die Gültigkeit irgendeines Immuntests genauso wichtig wie der Antikörper und das Antigen.
- Bestimmte Immuntests sind insbesondere schwierig zu standardisieren und zu kontrollieren, weil das interessierende Antigen instabil ist und keine einheitliche Reaktivität gegen Antikörper zeigt. Geringfügige Änderungen bestimmter Antigene, was zu Herstellung stabiler Standards und Kontrollen notwendig sein würde, können die Bindung des Antikörpers, die für den Immuntest essentiell ist, signifikant verändern. Weiterhin können auch subtilere Veränderungen in der Struktur der Antigene bezüglich ihrer Tertiär- oder Quartär-Struktur entstehen, die die Antikörper-Antigen-Reaktionen ungünstig beeinflussen können. Es besteht demnach ein Problem bei der Herstellung von Kontrollen und Standards für bestimmte Immuntests, da es notwendig ist, Standards und insbesondere Kontrollen über lange Zeiträume zu lagern, so daß sie für die Kontrolle der Fehlerfreiheit und Genauigkeit des Tests nutzbar sind. Die Standards und Kontrollen müssen weiterhin derart aufbewahrt werden, daß sie eine einheitliche Reaktivität mit dem Antikörper beibehalten.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, wodurch stabile Kontrollen und Standards herstellbar sind, die gleichmäßig mit dem Antikörper reagieren und die für die Langzeit- Standardisierung und Kontrolle von Immuntests mit labilen Antigenen bereitstehen.
- Ein wichtiger Teil dieser Erfindung betrifft die Isolierung und Reinigung spezifischer Epitope zur Verwendung als Standards und Kontrollen in Immuntests mit monoklonalem Antikörpern. Monoklonale Antikörper sind spezifisch für Epitope, die normalerweise nur einmal vorliegen, die jedoch auf bestimmten Antigenen auch repetitiv vorliegen können. Epitope von Proteinen können so wenig wie 5 - 7 Aminosäurereste umfassen, und sie können eine spezifische lineare Aminosäuresequenz oder eine räumliche Anordnung von Aminosäuren in Abhängigkeit von der Konformation repräsentieren. Unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers von geeigneter Affinität kann das entsprechende Epitop isoliert und aus einer Mischung von Antigenen oder von modifizierten oder fragmentierten Antigenen gereinigt werden. Im allgemeinen gilt: je größer das Antigen, desto wahrscheinlicher ist es instabil und wird in Fragmente oder kleinere Teile abgebaut. Da Epitope immer kleiner sind als das intakte Antigen, ist die Epitopstabilität gleichbleibend größer als die Stabilität des nativen Antigens.
- Während polyklonale Antikörper durch den Abbau des nativen Antigens stark beeinflußbar sind, bleiben sorgfältig ausgewählte monoklonale Antikörper, insbesondere solche Antikörper, die mit einer spezifischen Aminosäuresequenz reagieren, unbeeinflußt, weil das durch den monoklonalen Antikörper definierte Epitop vollständig innerhalb eines Fragments des nativen Antigens sitzt. Ein wichtiger Teil dieser Erfindung ist die Auswahl monoklonaler Antikörper, deren Epitope nach der Fragmentierung des nativen Antigens nicht zerstört werden.
- Die Bindung von Substanzen an Oberflächen erhöht die Stabilität dieser Substanz. Im Stand der Technik wurden Antigene und/oder Antikörper auf feste Oberflächen gebunden, um die Trennung von Antikörper-gebundenem Antigen von freiem Antigen nach der Reaktion zu erleichtern. Eine wichtige Unterscheidung in dieser Erfindung ist die Bindung eines Antigens und/oder Epitops an Teilchen, so daß das gebundene Epitop derart stabilisiert wird, daß es bei der Herstellung von Standards und Kontrollen für Immuntests nutzbringend einsetzbar ist. Weiterhin ermöglicht die Stabilisierung von Epitopen auf den Teilchen eine wesentlich größere Oberfläche und eine wesentlich höhere Konzentration des Epitops für die anschließende Reaktion. Hierdurch wird die Reaktionszeit signifikant verringert und hierdurch werden Kinetiktests praktikabel.
- Es gibt eine gut bekannte Beziehung zwischen der Cholesterinmenge im Blut und der Arteriosklerose und koronararteriellen Erkrankungen, beschrieben in "Complete Home Medical Guide, Columbia University College of Physicians and Surgeons, (Crown Publishers, S. 367, 1985)". Da Cholesterin eine Fettsubstanz (Lipid) ist, die in Blut unlöslich ist, welches wiederum zum größten Teil aus Wasser besteht (und Fette und Wasser sind nicht mischbar), muß Cholesterin deshalb mit einem Detergenzähnlichen Stoff verbunden werden, bevor es durch das Blut transportiert werden kann. Ein derartiger Stoff ist ein als Apolipoprotein bezeichnetes Protein, welches, wenn es mit Lipid kombiniert wird, ein sogenanntes Lipoprotein bildet. Es gibt verschiedene Arten von Lipoproteinen, die häufig aufgrund ihrer Größe oder Dichte, bestimmt durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation (Ultrazentrifugation), klassifiziert werden. Das schwerste Protein ist das hoch-dichte Lipoprotein (HDL = high density lipoprotein), welches den größten Proteinanteil aufweist. Das Lipoprotein von geringer Dichte (LDL = low density lipoprotein) ist leichter als HDL, und es trägt einen größeren Anteil Cholesterin. Das Lipoprotein von sehr geringer Dichte (VLDL = very low density lipoprotein) trägt den größten Anteil des Triglycerids, ein Lipid, welches im Fettstoffwechsel eine wichtige Rolle spielt. Kürzlich durchgeführte Untersuchungen gehen davon aus, daß HDL-Cholesterin von der arteriellen Zellen entfernt und daß es deshalb beim Ausgleich der Akkumulation von Cholesterin und anderen Fetten in den Arterien eine wichtige Rolle spielt. LDL trägt Cholesterin zu den arteriellen Zellen, und es wird angenommen, daß es einen Hauptfaktor bei der Entwicklung der Arteriosklerose spielt. Es wird deshalb angenommen, daß im Blutplasma ein hoher Level an HDL-Cholesterin in Bezug auf das LDL-Cholesterin wünschenswert ist. Je größer das Verhältnis HDL- zu LDL-Cholesterin, desto besser.
- Kürzlich durchgeführte Untersuchungen zeigen, daß die Menge der Hauptapolipoproteine von HDL (Apolipoprotein A-I, Apo AI) und LDL (Apolipoprotein B, Apo B) oder Apolipoproteine A-I bzw. B (Apo A-I und Apo B) noch bessere Faktoren zur Bestimmung des Risikos zur Entwicklung von Herzinfarkt sind als die Messung von HDL- und LDL-Cholesterin. Es besteht eine enge Korrelation (positiv) mit Apo B (LDL) und eine inverse Korrelation (negativ) mit Apo A-I (HDL) bezüglich des Risikos, eine klinisch manifeste koronare Herzerkrankung zu entwickeln.
- Es ist davon auszugehen, daß weitere Verbesserungen der quantitativen Bestimmungsverfahren für die assoziierten Apolipoproteine zur Identifizierung genauerer Beziehungen bezüglich der Ursache von Herzanfällen bei Menschen führt.
- Ein besonderes Problem in Immuntests mit Lipoprotein-Apolipoprotein ist die Anzahl an Reaktionen, deren Auftreten bestens bekannt ist, die die Proteinstruktur und die Konformation von Apolipoprotein-Antigenen verändern, was wiederum zu einer Veränderung der Immunreaktion führen kann. Derartige Reaktionen umfassen die Lipidperoxidation, die Proteinfragmentierung aufgrund von Peroxiden und Sauerstoff, die enzymatische Fragmentierung und die Aggregation. Jede dieser Reaktionen kann den Immuntest von Apo B und Apo A-I nachteilig beeinflussen. Es gibt eine starke Notwendigkeit für eine Verbesserung bei der Standardisierung und Kontrolle von Tests mit Apo B und Apo A- I, da diese besonders labil sind. Es ist bestens bekannt, daß die Änderung ihrer Fettumgebung die Konformation und die Immunreaktivität verändert. Es ist demnach eine wichtige Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Teilchen-stabilisierte Epitope bereitzustellen, die spezifisch für Apo B und Apo A-I sind, und die als Standards und Kontrollen in Immuntests dieser wichtigen Bestandteile von LDL und HDL einsetzbar sind.
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Kontrollen und Standards zur Verwendung in Immuntests zur Bestimmung des Vorhandenseins und der Konzentration von Antigenen im Blutplasma oder in anderen biologischen Flüssigkeiten; sie ist jedoch nicht auf biologische Flüssigkeiten beschränkt. Insbesondere betrifft die Erfindung die Herstellung teilchen-stabilisierter Epitope von Antigenen, von denen bekannt ist, daß sie mit spezifischen physiologischen und biochemischen Störungen assoziiert sind. Die Kontrollen und Standards werden so hergestellt, daß sie in der Lage sind, einheitlich mit dem Antikörper zu reagieren, und daß sie zur Langzeitstandardisierung und zur Kontrolle von Immuntests einsetzbar sind. Erfindungsgemäß wird ein kleines Fragment eines großen, komplexeren Antigens hergestellt, wobei eine antigene Determinante oder ein Epitop, welche bzw. welches eine monoklonale Antikörper spezifität definiert, verbleibt. Da Epitope kleiner als das native Antigen sind, sind Epitope stabiler als das Antigen. Ein wichtiger Teil dieser Erfindung umfaßt deshalb die Isolierung und Reinigung spezifischer Epitope, die als Standards und Kontrollen in monoklonale Antikörper einschließende Immuntests einsetzbar sind. Das Epitop kann ein chemisch modifiziertes Antigen sein oder ein Antigen, welches chemisch oder biologisch synthetisiert wurde. Das Epitop kann aus einem Protein, einem Peptid, einem Kohlenhydrat, einem Lipoprotein, einem Protein-Kohlenhydratkomplex, einem Lipid-Protein-Kohlenhydratkomplex, einem Immunglobulin, einer Nukleinsäure oder einem anderen antigenen Material oder einem Hapten bestehen. Das das in Frage stehende Epitop enthaltende Fragment wird kovalent oder durch physikalische Adsorption an Teilchen angelagert, die aus einem Material bestehen, welches beispielsweise ein Iodipamidethylester, ein Polyvinylchlorid oder ein Polystyrol ist, so daß das Epitop stabil bleibt. An die gleichen Teilchen oder an verschiedene Teilchen können viele Epitope zur Kontrolle und Standardisierung von mehr als einem Test angelagert werden.
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Kontrollen und Standards zur Verwendung in Immuntests zur Bestimmung des Vorhandenseins und der Konzentration von Antigenen in Blutplasma oder anderen biologischen Flüssigkeiten; es ist jedoch nicht auf biologische Flüssigkeiten beschränkt. Insbesondere betrifft die Erfindung die Herstellung teilchen-stabilisierter Epitope von Antigenen, von denen bekannt ist, daß sie mit spezifischen physiologischen und biochemischen Störungen assoziiert sind. Die Kontrollen und Standards werden so hergestellt, daß sie in der Lage sind, gleichmäßig mit dem Antikörper zu reagieren, und daß sie zur Langzeitstandardisierung und zur Kontrolle von Immuntests einsetzbar sind. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung stabiler Kontrollen und Standards umfaßt:
- (1) Auswählen eines monoklonalen Antikörpers, der ein Produkt einer Einzelzellinie ist, der die Reaktivität gegen das Epitop beibehält, nachdem das Epitop an die Teilchen angelagert ist;
- (2) Isolieren des Epitops durch Immunaffinität unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers, der für die zu untersuchende antigene Substanz spezifisch ist;
- (3) Stabilisieren des Epitops durch Anlagerung an Teilchen;
- (4) Herstellen teilchenstabilisierter Epitope als Standards durch Verdünnung in gepufferten wässrigen Trägern auf bekannte Konzentrationen im Bereich des 0,01 bis 10-fachen des normalen Wertes der antigenen Substanzen oder, alternativ hierzu,
- (5) Herstellen teilchenstabilisierter Epitope als Kontrollproben durch Suspendieren in einer Flüssigkeit, die die Zusammensetzung der Testprobe nachahmt, jedoch kein anderes Epitop enthält, welches mit dem monoklonalen Antikörper reagiert.
- Das Epitop ist eine Determinante einer antigenen Substanz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus dem intakten Antigen, chemisch-modifiziertem Antigen, Antigenfragment, chemisch synthetisiertem Antigen, biologisch synthetisiertem Antigen und Hapten, die ihre Fähigkeit behalten, mit dem monoklonalen Antikörper zu reagieren. Die antigene Substanz wird ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Protein, Peptid, Kohlenhydrat, Protein-Kohlenhydratkomplex, Lipid-Protein-Kohlenhydratkomplex, Immunglobulin und Nukleinsäure. Das Epitop kann von einem Lipoprotein abstammen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Lipoprotein von hoher Dichte, einem Lipoprotein von geringer Dichte und einem Lipoprotein von sehr geringer Dichte.
- Erfindungsgemäß wird der monoklonale Antikörper verwendet, um sein entsprechendes Epitop zu isolieren, welches aus einem Teilantigen bestehen kann oder einen sehr kleinen Teil des gesamten Antigens ausmachen kann. Das Epitop reagiert aufgrund der Art und Weise, wie es isoliert wurde, mit Sicherheit mit dem Antikörper. Die Epitope können auch auf andere Weise als durch ihre Bindung an den monoklonalen Antikörper isoliert werden, solange wie die gereinigten Epitope ihre Reaktivität mit dem Antikörper beibehalten. Epitope können durch vorläufige Isolierung durch Chromatographie, durch Elektrophorese und andere bekannte Trenntechniken unter nachfolgender Verwendung des monoklonalen Antikörpers isoliert werden. Das interessierende Epitop wird anschließend entweder kovalent oder durch physikalische Adsorption an Teilchen angelagert, die aus einem Material wie beispielsweise Iodipamidethylester, Polyvinylchlorid oder Polystyrol bestehen. Die Teilchen können chemisch modifiziert werden, so daß sie zur Bindung des Epitops befähigt sind. Durch die Bindung des Epitops wird das Epitop stabil. Obwohl die Teilchen aus vielen Arten von Materialien bestehen können, werden für das erfindungsgemäße Verfahren bestimmte Materialien insbesondere bevorzugt diese Materialien haben solche physikalischen Eigenschaften bezüglich ihrer Größe, ihrer Dichte und ihrer chemischen Zusammensetzung, so daß sie den tatsächlichen Immuntest erleichtern. Die Teilchenmaterialien können chemisch aktiviert werden, um die Anlagerung der Epitope und ihre anschließende Stabilisierung zu optimieren. Die Teilchen sind zusammengesetzt aus einer Substanz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Latex, Stärke, Harz, Ester, organischen Säuren und organischen Basen, die in biologischen Flüssigkeiten unlöslich sind. Erfindungsgemäß werden Beispiele für die Verwendung von Iodipamidethylester (IDE) als Teilchenmaterial angegeben. Es wird gezeigt, daß dieses Material Epitope von Apolipoproteinen derart binden kann, daß die Reaktivität mit dem monoklonalen Antikörper erhalten bleibt. Dieses Material hat die erwünschte Eigenschaft einer erhöhten Dichte, was die Abtrennung von der biologischen Flüssigkeit erleichtert. Teilchen mit Dichten im Bereich von 0,1 - 10 g/cm³ wurden erfindungsgemäß als geeignet erkannt. Teilchen mit mittleren Durchmessern im Bereich von 1 - 100000 nm mit einem Variationskoeffizienten von weniger als 25% können ausgewählt werden, um die Kinetiken der Wechselwirkung des Epitops und des Antikörpers bei einer beliebigen bekannten Konzentration des Antikörpers zu maximieren. Stabilisierte Epitope auf diesen Teilchen stellen einheitliche Eigenschaften bereit, die sie zur Verwendung in spezialisierten Immuntests, die insbesondere für Lipoproteine anwendbar sind, geeignet machen, wobei die Teilchen mit der Größe von Lipoproteinen zur Kontrolle und Standardisierung von Apolipoprotein-Immuntests ausgelegt werden können. Der klare Vorteil besteht darin, daß das Teilchenmaterial inert ist, während der Lipidkern eines Lipoproteins instabil ist.
- Der Immuntest wird durch die Zugabe bekannter Konzentrationen teilchen-stabilisierter Epitope und deren Titration gegen eine begrenzte Menge eines monoklonalen Antikörpers oder einer monoklonalen Antikörpermischung standardisiert. Hierdurch wird die Immunreaktion für jeden Standard verwendet, um eine Standardkurve zu erstellen, die eine Abschätzung unbekannter Antigenmengen in einer biologischen Flüssigkeit durch Vergleich ermöglicht. Für Kontrollproben wird das Epitop in einer Umgebung hergestellt, die der zu messenden biologischen Flüssigkeit gleicht und so getestet, als wenn sie eine unbekannte Probe darstellen würde. Für den Test von Serumproben bestehen die Kontrollproben aus teilchen-stabilisierten Epitopen im Serum aus einer Tierart, die sich von derjenigen unterscheidet, aus der die Epitope gewonnen wurden. Als monoklonale Antikörper werden artspezifische Antikörper ausgewählt, d.h. solche Antikörper, die für ein menschliches Antigen spezifisch sind, jedoch nicht das entsprechende Rinderantigen. Weil die Standards und Kontrollen aus teilchen-stabilisierten Epitopen hergestellt werden, bleibt ihre Reaktivität über die Zeit erhalten. Vorräte an Standards und Kontrollen können im gefrorenen oder gefriergetrockneten oder lyophilisierten Zustand aufbewahrt werden, und sie können bei Gebrauch wieder hergestellt werden.
- Da Epitope klein sind, können viele identische Epitope an die Teilchenoberfläche angelagert werden, um die physikalische Wechselwirkung zwischen dem Epitop und dem monoklonalen Antikörper zu optimieren. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung können verschiedene distinkte Epitope des gleichen Antigens, definiert durch zusätzliche monoklonale Antikörper, an die Teilchenoberfläche angelagert werden. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können viele Epitope von mehreren verschiedenen Antigenen an die Teilchenoberfläche angelagert und als Standards für mehrere Immuntest verwendet werden. Diese Tests arbeiten, weil teilchen-stabilisierte Epitope die Eigenschaften des intakten Antigens bezüglich ihrer Wechselwirkung mit dem Antikörper aufweisen; sie haben jedoch ihre Fähigkeit verloren, für Veränderungen in der Umgebung empfänglich zu sein. Schließlich können viele von verschiedenen antigenen Substanzen abstammende Epitope auf Teilchenmischungen stabilisiert werden, die sich in ihren physikalischen Eigenschaften einschließlich ihrer Größe, ihrer Dichte, ihrer Zusammensetzung und ihrem Aussehen unterscheiden, um die Trennung dieser Epitope nach der Reaktion mit ihren entsprechenden monoklonalen Antikörpern zu erleichtern. Deshalb kann eine Probe derartiger Teilchen für Kontrollen und für Standards einer Reihe verschiedener Immuntests dienen.
- Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Veranschaulichung der Erfindung; die Erfindung ist jedoch nicht auf die in den Beispielen genannten Ausführungsformen beschränkt.
- Lipoprotein von sehr geringer Dichte (VLDL) wurde aus menschlichem Serum durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation des Serums bei einer Durchschnittsgeschwindigkeit von 175000 x g für 16 Stunden bei 14ºC isoliert, nachdem das Serum auf eine Salzdichte von 1,019 g/ml durch Auflösen von 0,177 g Natriumbromid pro 10 ml Serum eingestellt war. Der VLDL-enthaltende trübe Überstand wurde entfernt, und der verbleibende Rest wurde auf eine Salzdichte von 1,063 g/ml durch Auflösen eine zusätzlichen Menge von 0,608 g an festem Natriumbromid pro ml eingestellt. Das Lipoprotein geringer Dichte (LDL) wurde durch Zentrifugation bei einer Durchschnittsgeschwindigkeit von 175000 x g für 18 Stunden bei 14ºC isoliert. Die gelbe Schicht aus LDL-Überstand wurde entfernt. Mehr als 95% des Proteins in der LDL-Fraktion war Apolipoprotein B (Apo B). Die Salze wurden aus der LDL-Präparation durch Dialyse gegen 0,15 M NaCl unter Verwendung einer semi-permeablen Cellulosemembran entfernt, wobei Verbindungen mit einem Molekulargewicht von mehr als 3500 Dalton ausgeschlossen wurden.
- Zwei 4 Wochen alte Mäuse wurden durch subkutane Injektion von 0,5 ml mit 100 ug LDL, emulgiert in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml eines Mineralöls, welches suspendierte Tuberkelbazillen (vollständiges Freunds Adjuvants) enthielt, immunisiert. Die Mäuse wurden 3 Wochen später durch subkutane Injektion einer Emulsion aus 100 ug LDL und Mineralöl in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml erneut immunisiert. 3 Wochen später wurde aus der Schwanzvene Serum gewonnen, und beide Mäuse zeigten eine spezifische Antikörperproduktion gegen menschliches Apo B (vergl. Tabelle I). Die Maus mit der höchsten Konzentration an spezifischem Antikörper gegen Apo B wurde mehrere Male pro Woche vor der Hybridisierung ihrer Milzzellen mit Myelomzellen (Fusion) reimmunisiert. Mehrere Tage vor der Hybridisierung wurde 1 ug LDL intraperitoneal injiziert. 4 Tage vor der Fusion wurden 100 ug LDL intraperitoneal injiziert; 3 Tage vor der Fusion wurden 200 ug LDL intraperitoneal und intravenös injiziert; 2 Tage vor der Fusion wurden 100 ug Apo B intravenös und 1 Tag vor der Fusion 200 ug menschliches Apo B intraperitoneal und intravenös appliziert. Einen Tag nach der letzten Injektion wurde die Maus getötet, ihre Milz entfernt und zu einer Einzelzellsuspension in 10 % v/v fötales Kälberserum (Medium) enthaltendes Nährmedium dispergiert. Die Milzzellen wurden 1 mal mit Medium gewaschen und anschließend mit Myelomzellen, die von der Zellinie P3-X63-Ag 8.653, die bei der American Type Culture Collection hinterlegt ist, abstammten, in einem Verhältnis zwischen 1 und 10 Milzzellen pro einer Myelomzelle in Gegenwart von Polyethylenglykol vermischt. Das Fusionsverfahren entsprach im wesentlichen dem von Köhler und Milstein beschriebenen Verfahren und ist im einzelnen in Nature 256, 495-497 (1975) beschrieben. Nachdem die Zellen hybridisiert wurden, wurden die fusionierten Zellen (Milz und Myelom) oder Hybridome, gewaschen und in Medium suspendiert, welches ein selektives Wachstum von Hybridomen, nicht jedoch von Myelomzellen ermöglicht; anschließend wurden die Zellen in 96 Well-Schalen verteilt. Das Hybridomwachstum wurde dadurch verstärkt, daß zur Kultur regelmäßig mit einer Konzentration von 10&sup6; Zellen pro Vertiefung Peritoneal-Makrophagen zugegeben wurden, die aus Waschungen des Peritonealraums anderer Mäuse mit steriler Saline erhalten wurden. Proliferierende Hybridome wurden dadurch erkannt, daß sie eine unterschiedliche Morphologie zeigten. Nach signifikantem Wachstum wurde das Medium über den Zellen oder der Kulturüberstand auf die Produktion von spezifischen Antikörpern gegen menschliches LDL getestet (vergl. Tabelle II). Hybridome, die monoklonale Antikörper gegen menschliches LDL sezernierten, wurden gezählt, in Medium verdünnt und in 96 Well-Schalen mit einer Konzentration von 1 Zelle pro 2 Wells rekultiviert, um sicherzustellen, daß das nachfolgende Wachstum antikörperproduzierender Zellen auf die Nachkommen eines Einzelzellhybridoms oder Einzelzellklons zurückzuführen war. Die Kulturüberstände von monoklonale Antikörper produzierenden Zellen wurden in bestimmten Zeiträumen auf die Gegenwart eines spezifischen Antikörpers gegen menschliches LDL erneut getestet. 5 Klone behielten eine spezifische Antikörperproduktion bei (Tabelle II). Diese Zellinien wurden dadurch expandiert, daß man sie zunächst in 24 Well-Schalen, anschließend in 50 ml Flaschen und später in 275 ml Flaschen wachsen ließ. Von jedem der 5 Klone wurden etwa 10&sup6; Hybridomzellen intraperitoneal in Mäuse injiziert, die vorher mit 0,5 ml 2, 6, 10, 14-Tetramethylpentadecan (Pristan) wenigstens 1 Woche vor der Injektion der Hybridome behandelt wurden. Nach etwa einem Monat traten Ascitestumore auf, und die Ascitesflüssigkeit wurde gesammelt; sie enthielt 22 - 35 mg/ml monoklonale Antikörper, die für menschliches LDL spezifisch waren.
- Polyklonale Antikörper gegen menschliches LDL in Mäuseseren wurden aus immunisierten Mäusen gesammelt, und monoklonale Antikörper in Kulturüberständen, in welchen Hybridome wuchsen, wurden in der nachfolgenden Weise getestet. Menschliches LDL wurde, wie in 1a dargestellt, hergestellt, auf eine Konzentration von 10 ug/ml in 0,15 M Natriumcarbonat/0,035 M Natriumbicarbonatpuffer, pH 9,0 verdünnt, und anschließend wurde 0,1 ml an verdünntem LDL zu jeder Vertiefung in einer 96 Well-Platte zugegeben und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Flüssigkeit aus jeder Vertiefung durch Absaugen entfernt. Die Vertiefungen wurden drei Mal mit 0,2 ml 1% w/v Rinderserumalbumin (BSA), aufgelöst in 0,15 M NaCl/0,05 M Phosphatpuffer, pH 7,4 (phosphatgepufferte Saline oder PBS), gewaschen. Nach dem Waschen wurden die Vertiefungen mit 0,25 ml 1% w/v BSA in PBS gefüllt und bei Raumtemperatur 2 - 4 Stunden lang inkubiert. Anschließend wurde die Flüssigkeit in jeder Vertiefung entfernt, und zu den Vertiefungen wurden 0,1 ml verdünnter Mäuseseren aus immunisierten Mäusen (Tabelle I) oder 0,1 ml eines Mediums aus Kulturüberständen von Hybridomen (Tabelle II) zugegeben und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Die Flüssigkeit aus jeder Vertiefung wurde durch Absaugen entfernt. Anschließend wurde in jede Vertiefung 0,1 ml ¹²&sup5;I-markierter Schaf-anti-Maus-Antikörper gegeben, verdünnt in 1% w/v, BSA in PBS und 600000 Zerfälle pro Minute pro ml (DPM/ml). Die Vertiefungen wurden 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Aus jeder Vertiefung wurde die Flüssigkeit durch Absaugen entfernt, und die Vertiefungen wurden 3 Mal mit 0,2 ml 1% w/v BSA in PBS gewaschen. Die Radioaktivität (DPM), die in jeder Vertiefung gebunden war und die den mit menschlichem LDL umgesetzten Maus-Antikörper repräsentierte, wurde radiogetestet, und die Ergebnisse sind in der Tabelle I und in der Tabelle II dargestellt. Die Tabelle I zeigt die Ergebnisse, die erhalten wurden, wenn Mäuse mit menschlichem LDL als Antigen injiziert wurden. Die Spalte Prä-Immunserum bezieht sich auf Testergebnisse, die erhalten wurden, bevor die Mäuse mit LDL injiziert wurden, und die Spalte Immunserum bezieht sich auf Ergebnisse, die nach der Injektion mit LDL erhalten wurden. Der Screeningtest für die Mäuse-Antikörper wurde bei Serumverdünnungen von 1:10, 1:100 und 1:1000 durchgeführt. Wie aus Tabelle I ersichtlich ist, zeigte die Maus 1 eine 43-fache Erhöhung an gebundenem DPM (Prä-Immun gegen Immunserum) unter Verwendung von 1:1000 verdünntem Serum, während die Maus 2 eine 38-fache Erhöhung an gebundenem DPM (Prä-Immun gegen Immunserum) unter Verwendung von 1:1000 verdünntem Serum zeigte. Die Ergebnisse zeigten, daß beide Mäuse gegen menschliches LDL stark immunisiert waren. TABELLE I Polyklonale Maus-Antikörperproduktion gegen menschliches Apo B, DPM/Well Maus Verdünnung Prä-Immunserum Immunserum
- Tabelle II zeigt die Ergebnisse, die erhalten wurden, wenn Kulturüberstände von 5 Hybridomklonen, hergestellt aus der Milz von Maus 1 (Tabelle I), auf die Produktion von monoklonalem Antikörper getestet wurden. Das Vorliegen von Antikörpern, die für menschliches LDL spezifisch sind, zeigte sich durch eine 5 - 10 fache Erhöhung über die negative Kontrolle der an die LDL-beschichteten Wells gebundenen Radioaktivität. Jeder der in Tabelle II gezeigten 5 Klone repräsentiert Zellen, die einen einzelnen monoklonalen Antikörper gegen menschliches Apo B produzieren. TABELLE II Screening auf die Produktion von monoklonalem Maus-Antikörper gegen menschliches Apo B, DPM/Well Negativ Klon
- Das Lipid wurde aus LDL durch Verdünnung von 1,0 ml LDL in einer Lösung aus 10 ml Chloroform, 10 ml Methanol und 20 ml Diethylether bei 4ºC entfernt. Das Apolipoprotein B (Apo B) von LDL bildete eine weißes Präzipitat, welches durch Zentrifugation bei 10000 x g für 20 Minuten bei 4ºC gesammelt wurde. Das Präzipitat wurde 1 Mal mit 20 ml Diethylether gewaschen, und anschließend wurde der Diethylether durch Absaugen entfernt. Das Präzipitat wurde auf etwa 35ºC erwärmt, um den restlichen Diethylether zu entfernen; anschließend wurde das Präzipitat in einer Lösung aus 0,067 M 2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol/HCl-Puffer (Tris-Puffer), pH 6,8, enthaltend 2% w/v Natriumdodecylsulfat, SDS, 10%, v/v, Glycerin und 5% v/v 2-Mercaptoethanol aufgelöst. Nach dem Auflösen des Apo B- Präzipitates wurde die Lösung für 3 Minuten auf 100ºC erhitzt und anschließend auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Die Proteine in der Lösung wurden durch Elektrophorese in einem 1,5 mm dicken rechteckigen Gel entsprechend ihrem Molekulargewicht aufgetrennt; das Gel wurde aus einer Lösung polymerisiert, welche 0,26% w/v N,N'- Methylenbisacrylamid und 2,85% w/v Acrylamid, 0,375 M 2- Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol/HCl-Puffer, pH 8,8,2% w/v Natriumdodecylsulfat, 0,025% w/v Ammoniumpersulfat und 0,5 ul/ml N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin enthielt. Der Reservoirpuffer enthielt 0,025 M 2-Amino-2- hydroxymethyl-1,3-propandiol/HCl-Puffer, pH 8,3, enthaltend 0,192 M Glycin und 1% w/v Natriumdodecylsulfat. Die Proteinlösung wurde an der Ecke des rechteckigen Gels aufgetragen, und Apo B und die Apo B-Fragmente wurden in einer Dimension durch Elektrophorese bei 150 V 4 Stunden lang aufgetrennt, während der Resevoir-Puffer auf 7ºC gekühlt war. Nach der Elektrophoresetrennung wurde das die aufgetrennten Proteine enthaltende rechteckige Gel 10 Minuten lang unter Bewegen in einen Puffer getaucht, der 0,30 % w/v 2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol, 1,44% w/v Glycin und 20% v/v Methanol enthielt. Dieses Verfahren wurde drei Mal wiederholt, um Natriumdodecylsulfat und Salze aus dem Acrylamidgel zu entfernen. Anschließend wurde ein rechteckiges festes Blatt aus Nitrocellulosefasern der gleichen Größe wie das rechteckige Gel hergestellt, im gleichen Puffer vorinkubiert und anschließend mit dem Acrylamidgel in nächsten Kontakt gebracht. Luftblasen wurden entfernt, und die zwei Bestandteile wurden dadurch zusammengepreßt, daß ein Teströhrchen über die Oberfläche gerollt wurde, um ein Nitrocellulose-Acrylamidgel-Sandwich zu bilden. Die auf dem Acrylamidgel getrennten Proteine wurden dann vom Acrylamidgel auf die Nitrocellulosefaser dadurch übertragen, daß das Sandwich in eine Elektrophoresekammer gegeben wurde, und die Elektrophorese in einem senkrechten Feld bei 0,1 amps 16 - 18 Stunden lang in einem auf 4ºC vorgekühlten Puffer durchgeführt wurde, der sich aus 0,30 % w/v 2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol (Tris), 1,44% w/v Glycin und 20% v/v Methanol zusammensetzte. Nachdem die Proteine auf die Nitrocellulosefasern übertragen waren, wurde ein dünner Streifen abgeschnitten und in Naphtholblauschwarz (C.I.20470; Amidoschwarz 10B; Buffaloschwarz NBR) gefärbt, um die Lage der Proteinbanden als spätere Referenz sichtbar zu machen. Das verbleibende Blatt wurde in 3% w/v Gelatine in 0,15 M NaCl, 0,02 M Tris-Puffer, pH 7,5, der 0,05% v/v Tween 20 enthielt, über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert, um alle verbliebenen Proteinbindungsstellen auf dein Nitrocelluloseblatt zu binden. Vom Gelatine-behandelten Nitrocelluloseblatt, welches die übertragenen Proteine enthielt, wurden dünne Streifen abgeschnitten und mit den Kulturüberständen aus einzelnen Hybridomklonen über Nacht in einem Puffer inkubiert, der 1% w/v Gelatine in 0,15 M NaCl, 0,02 M Tris-Puffer, pH 7,5 enthielt. Nach der Inkubation wurden die Streifen 3 Mal in 0,15M NaCl, 0,02 M Tris-Puffer pH 7,5, enthaltend 0,05% v/v Tween 20, gewaschen und anschließend 4 Stunden lang bei Raumtemperatur in einem alkalische Phosphatasekonjugiertem anti-Maus-Ziegenantikörper inkubiert. Die Streifen wurden 3 Mal in 0,15M NaCl, 0,02M Tris-Puffer pH 7,5 gewaschen; die Bindung des monoklonalen Antikörpers an die übertragenen Proteinbanden wurde durch eine abschließende Inkubation in einem alkalische Phosphatasesubstrat nachgewiesen, um die Bindung durch die alkalische Phosphatase-konjugierte anti-Maus-Ziegenantikörper- Reaktion nachzuweisen. Die Lösung des alkalische Phosphatasesubstrats enthielt 15 mg 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat, aufgelöst in 1,0 ml N,N-Dimethylformamid und 30 mg Nitroblautetrazolium oder 2,2,-Di-p-nitrophenyl-5,5'- diphenyl-3,3"-[3,3'-Dimeth-oxy-4,4'-diphenylen]ditetrazoliumchlorid, aufgelöst in 1,0 ml 70% v/v N,N-Dimethylformamid in 100 ml 0,1M Natriumbicarbonat, 1mM Magnesiumchlorid. Die Apo B-Spezifität wurde durch die Entstehung gefärbter Apo B-Banden nachgewiesen, die auf die Nitrocellulose übertragen wurden und die das charakteristische Molekulargewicht von Apo B aufwiesen.
- Jodipamidethylester (IDE)-Teilchen wurden dadurch hergestellt, daß zwei Teile einer wäßrigen Lösung (0,1% w/v) aus Polyvinylpyrrolidon (15000 MW) mit einer Geschwindigkeit von 5 ml/Min. in eine kalte (4ºC), schnell gerührte Lösung aus einem Teil IDE (5% w/v) in Dimethylsulfoxid (DMSO) und einem Teil Ethanol zugegeben wurden. Sofort nach der Bildung der Teilchen wurden zu 1,0 ml der IDE- Teilchen 1,0 ml an ¹²&sup5;I-markiertem Apo B-menschliches Lipoprotein von geringer Dichte mit einer bekannten Protein-spezifischen Aktivität (Zerfälle pro Minute pro mg Protein) und mit Konzentrationen zwischen 0,4 ug und 641 ug an Protein pro ml zugegeben. Die Teilchen und das Protein wurden vermischt, und anschließend wurden die Teilchen durch die Zugabe von 0,15M NaCl, 0,05M Natriumphosphat, pH 7,4 (PBS), welches menschliches Serumalbumin mit einer Konzentration von 0,1% w/v enthielt, gewaschen. Nach der Zentrifugation wurde die Waschlösung durch Absaugen entfernt, und die Teilchen wurden resuspendiert und wiederum gewaschen, bis die in die Waschlösung abgegebene Radioaktivität vernachlässigbar war (etwa 4 Waschungen). Das ¹²&sup5;I-markierte Apo B, gebunden an die IDE- Teilchen, wurde anschließend einem Radiotest unterzogen, und die an die IDE-Teilchen gebundene Menge an Apo B wurde unter Verwendung der spezifischen Aktivität des ursprünglichen ¹²&sup5;I-markierten Apolipoproteins B gemessen. Die Ergebnisse sind unten in der Tabelle III angegeben. TABELLE III Apolipoprotein B-gebunden an Jodipamidethylester-Teilchen Mikrogramm zugegeben Mikrogramm gebunden
- Jodipamidethylester (TDE)-Teilchen, die mit menschlichem Apo B beschichtet waren (B/IDE-Teilchen), wurden mit monoklonalen Antikörpern umgesetzt, deren Spezifitäten für Apo B wie in 2(d) beschrieben bestimmt wurden. Die B/IDE- Teilchen wurden über Nacht bei 4ºC mit den Kulturüberständen von 2 Hybridomklonen, die einzelne monoklonale Antikörper sezernierten und mit 185 und 208 bezeichnet wurden, inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Teilchen 3 Mal in PBS, welches 0,1% w/v Rinderserumalbumin (BSA) enthielt, gewaschen. Die B/IDE-Teilchen wurden anschließend 3 Stunden lang bei Raumtemperatur mit anti- Maus-Schafantikörper, der kovalent an Biotin (Hexahydro-2-oxo-1H-thienol[3,4-d]imidazol-4-pentansäure) gebunden war, inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Teilchen 3 Mal in 0,1 % w/v BSA in PBS gewaschen und anschließend mit Avidin, welches kovalent mit Fluorszeinisothiocyanat modifiziert war, 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das Fluorszein-markierte Avidin bildet mit Biotin einen sehr starken Komplex, wodurch die Teilchen, die die gebundenen anti-Maus-Schafantikörper enthalten, fluoreszieren. Deshalb sind Teilchen mit angelagertem Apo B, die mit monoklonalen Mausantikörpern reagierten, fluoreszierend. Die B/IDE-Teilchen wurden 3 Mal in einem 0,1% w/v BSA enthaltenden Puffer gewaschen, und anschließend wurden die fluoreszierenden Teilchen unter Verwendurg der Fluoreszenz-aktivierten Durchflußcytometrie analysiert. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle IV angegeben. TABELLE IV Reaktivität des anti-menschliches Apo B-monoklonalen Antikörpers gegen B/IDE-Teilchen unter Verwendung der Fluoreszenz-aktivierten Durchflußcytometrie Herstellung Kanalmittel ausschließlich B/IDE-Teilchen Negative Färbungskontrolle Irrelevanter monoklonaler Antikörper Monoklonaler Antikörper-menschliches Apo B
- Die Fluoreszenz der B/IDE-Teilchen wird auf einer Fluoreszenz-pro-Teilchenbasis unter Verwendung dieses Verfahrens bestimmt, und die Ergebnisse sind als Kanalmittel (Durchschnitt) der Fluoreszenz ausgedrückt und repräsentieren das Fluoreszenzmittel pro Teilchen. Je höher der Kanal, desto größer ist die Fluoreszenz pro Teilchen und desto mehr an monoklonalem Antikörper ist an die Teilchen gebunden. Es handelt sich hier jedoch nicht um einen linearen, sondern um einen logarithmischen Maßstab. Der Unterschied im Kanalmittel der negativen Färbungskontrolle, B/IDE-Teilchen alleine (kein Antikörper) und die Reaktion mit dem irrelevanten monoklonalen Antikörper, verglichen zur Reaktion mit den für menschliches Apo B spezifischen monoklonalen Antikörpern (185 und 208), betrug 18. Diese Ergebnisse zeigen klar, daß (1) Apo B an die IDE-Teilchen angelagert war; (2) die monoklonalen Antikörper mit den B/IDE-Teilchen reagierten und (3) die Reaktion für anti-menschliche Apo B monoklonale Antikörper spezifisch ist, weil eine Reaktion der Teilchen mit einem irrelevanten monoklonalen Antikörper fehlt. Dieses Beispiel zeigt, daß ein Epitop eines größeren Antigens an eine Teilchenoberfläche derart angelagert werden kann, daß seine Reaktivität für spezifische monoklonale Antikörper beibehalten wird.
- Die folgenden Versuche wurden in Übereinstimmung mit den in Beispiel (1) beschriebenen Verfahren durchgeführt. LDL wurde aus menschlichem Serum durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation isoliert, und gegen menschliches LDL gerichtete monoklonale Maus-Antikörper wurden aus Mäusen hergestellt, die mit menschlichem LDL immunisiert waren. Hybridome wurden auf eine spezifische monoklonale Antikörperproduktion gegen menschliches LDL gescreent, und die Apo B-Spezifitäten der so hergestellten monoklonalen Antikörper wurden, wie in Beispiel 1d beschrieben, bestimmt.
- Zu einem Polyvinylchlorid mit einer Oberfläche von 7,1 mm² wurde ¹²&sup5;I-markiertes Apo B mit einer bekannten Protein-spezifischen Aktivität (Zerfälle pro Minute pro mg Protein, DPM/mg) und mit Konzentrationen von zwischen 0,49 mg/ml und 3,9 mg/ml in phosphat-gepufferter Saline (PBS) zugegeben und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Die Flüssigkeit wurde entfernt und die Oberfläche 3 Mal in 1% w/v Rinderserumalbumin (BSA) in PBS gewaschen. Nach dem Entfernen der Waschlösung durch Absaugen wurde die Oberfläche einem Radiotest unterworfen, und die an das Polyvinylchlorid gebundene Menge an Apo B wurde unter Verwendung der spezifischen Aktivität des ursprünglichen ¹²&sup5;I- markierten Apo B berechnet. Die Ergebnisse sind in der unten stehenden Tabelle V gezeigt. TABELLE V Bindung von menschlichem Apolipoprotein B an Polyvinylchlorid Mikrogramm zugegeben Mikrogramm gebunden
- Eine Polyvinylchloridoberfläche von 7,1 mm² wurde mit menschlichem LDL mit einer Konzentration von 1,5 ug/ml, aufgelöst in 0,15 M Natriumcarbonat / 0,35 M Natriumbicarbonat, pH 9,0 bei 4ºC, inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Oberfläche 3 Mal in einer Lösung aus 1% w/v BSA in PBS gewaschen und in der gleichen Lösung 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Flüssigkeit von der Oberfläche durch Absaugen entfernt, und anschließend wurden 0,1 ml eines Überstandes einer anti-menschliches Apo B monoklonalen Mausantikörper-Kultur eines Hybridomklons (5.01), verdünnt 1:750 in 1% BSA in PBS, zugegeben. Sofort anschließend wurden 0,1 ml menschliches LDL, verdünnt in 1 % w/v BSA in PBS, zugegeben, welches zwischen 10 und 100 ng Apo B enthielt, um mit den an die Polyvinylchloridoberfläche angelagerten Apo B-Epitopen zu kompetieren. Die Mischung wurde 16 Stunden lang bei 4ºC inkubiert, und anschließend wurde die Oberfläche 3 Mal in 1% w/v BSA in PBS gewaschen. Der mit dem Apo B von LDL reagierende monoklonale Antikörper wurde durch das Waschen der Oberfläche entfernt, und der monoklonale Anzikörper, der mit den an das Polyvinylchlorid angelagerten Apo B-Epitopen reagierte, wurde durch eine abschließende Inkubation mit ¹²&sup5;I-markiertem anti-Maus/Schaf-Antikörper nachgewiesen. Die Ergebnisse des kompetitiven Immuntests von polyvinylchlorid-stabilisierten Epitopen von Apo B sind unten in der Tabelle VI dargestellt. Je mehr an LDL-Apo B zugeben wurde, desto weniger Radioaktivität wird an die polyvinylchlorid-stabilisierten Apo B-Epitope gebunden. Die Prozentzahl an addierten (added) Gesamtzählimpulsen (Y-Achse) kann graphisch gegen die Menge an zugegebenem LDL-Apo B (X- Achse) aufgetragen werden, um eine Standardkurve herzustellen. Für Proben, die eine unbekannte Menge an Apo B enthalten, wird der berechnete Prozentwert an für die Testprobe gefundenen insgesamt addierten (added) Counts verwendet, um einen Wert für den Apo B-Gehalt der unbekannten Probe festzulegen. TABELLE VI Kompetitiver Immuntest von an eine Polyvinylchloridoberfläche gebundenem Apo B und von menschlichem LDL-Apo B unter Verwendung eines anti-Mensch Apo B-monoklonalen Antikörpers DPM gebunden Mittelwert DPM % Gesamtzählimpulse
- LDL wurde aus menschlichem Serum unter Verwendung der Hochgeschwindigkeitszentrifugation gemäß den in Beispiel 1a beschriebenen Verfahren isoliert. Um die Bindung von Apo B-Epitopen an Polystyrolteilchen mit einem Durchmesser von 3 mm und einer Oberfläche von 2,8 mm² zu testen, wurde ¹²&sup5;I-markiertes Apo B einer bekannten proteinspezifischen Aktivität (Zerfälle pro Minute pro mg Protein, DPM/mg) verwendet. Die Teilchen wurden in 1,0 ml einer Lösung aus 50 - 150 ug ¹²&sup5;I-markiertem Apo B pro ml PBS über Nacht bei 4ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Teilchen 3 Mal gewaschen, und das gebundene ¹²&sup5;I-markierte Apo B wurde einem Radiotest unterworfen. Die an die Polystyrolteilchen gebundene Apo-B-Menge wurde unter Verwendung der spezifischen Aktivität des ursprünglichen ¹²&sup5;I-Apo B gemessen, und die Ergebnisse sind in Tabelle VII unten angegeben. TABELLE VII Bindung von menschlichem Apolipoprotein B an Polystyrolteilchen Mikrogramm zugegeben Mikrogramm gebunden
- Lipoprotein von sehr geringer Dichte (VLDL) und Lipoprotein von geringer Dichte (LDL) wurden aus menschlichem Serum durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation des Serums mit einer Durchschnittsgeschwindigkeit von 175000 x g für 18 Stunden bei 14ºC entfernt, nachdem das Serum auf eine Salzdichte von 1,063 g/ml durch Auflösen von 0,788 g Natriumbromid pro 10 ml Serum eingestellt war. Der VLDL und LDL enthaltende trübe Überstand wurde entfernt, und der verbleibende Rest wurde auf eine Salzdichte von 1,21 g/ml unter Auflösen einer zusätzlichen Menge an 2,145 g Natriumbromid pro 10 ml eingestellt. Das Lipoprotein mit hoher Dichte (HDL) wurde durch Zentrifugation mit einer Durchschnittsgeschwindigkeit von 175000 x g für 40 Stunden bei 14ºC isoliert. Die Schicht mit dem HDL-Überstand wurde entfernt, und die Salze wurden aus der HDL-Zubereitung durch Dialyse gegen 0,15 M NaCl unter Verwendung einer semi-permeablen Cellulosemembran, die Verbindungen mit einem Molekulargewicht von mehr als 3500 Dalton ausschloß, eliminiert.
- Zwei, vier Wochen alte Mäuse wurde durch subkutane Injektion von 0,5 ml von 100 ug HDL, emulgiert in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml Mineralöl, welches suspendierte Tuberkelbazillen enthielt, immunisiert. Die Mäuse wurden 3 Wochen später durch subkutane Injektion einer Emulsion mit 100 ug HDL und Mineralöl in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml reimmunisiert. Drei Wochen später wurde aus der Schwanzvene Serum gewonnen, um auf eine spezifische Antikörperproduktion gegen menschliches HDL, wie im Beispiel 4 beschrieben, zu testen. Die Maus mit der höchsten Konzentration an einer spezifischen Antikörperproduktion gegen HDL wurde mehrmals pro Woche reimmunisiert, bevor ihre Milzzellen mit Myelomzellen hybridisiert wurden (Fusion). Mehrere Tage vor der Hybridisierung wurde 1 ug HDL intraperitoneal injiziert. Vier Tage vor der Fusion wurden 100 ug HDL intraperitoneal appliziert; drei Tage vor der Fusion wurden 200 ug HDL intraperitoneal und intravenös appliziert; zwei Tage vor der Fusion wurden 100 ug HDL intravenös und einen Tag vor der Fusion 200 ug menschliches HDL intraperitoneal und intravenös appliziert. Die monoklonalen Antikörper wurden entsprechend den in Beispiel 1b beschriebenen Verfahren gewonnen.
- Antikörper gegen menschliches HDL aus Mäuseserum, welches aus immunisierten Mäusen gesammelt und in das Medium sezerniert wurde, in welchem die Hybridome wuchsen, wurden in der nachfolgend beschriebenen Weise getestet. Menschliches HDL wurde, wie in Beispiel 4a beschrieben, hergestellt und wurde auf eine Konzentration von 10 ug/ml in 0,15 M Natriumcarbonat/0,035 M Natriumbicarbonatpuffer, pH 9,0 verdünnt; genau 0,1 ml des verdünnten HDL wurde in jede Vertiefung einer 96 Well-Platte gegeben. Nach einer Inkubation bei 4ºC über Nacht wurde die Flüssigkeit aus jeder Vertiefung durch Absaugen entfernt. Die Vertiefungen wurden 3 Mal mit 0,2 ml 1% w/v Rinderserumalbumin (BSA), aufgelöst in 0,15 M NaCl/0,05 M Phosphatpuffer, pH 7,4 (phosphat-gepufferte Saline oder PBS), gelöst. Nach dem Waschen wurden die Vertiefungen mit 0,25 ml 1% w/v BSA in PBS aufgefüllt und bei Raumtemperatur 2 - 4 Stunden lang inkubiert. Anschließend wurde die Flüssigkeit in jeder Vertiefung entfernt, und es wurden 0,1 ml der verdünnten Mäuseseren aus den immunisierten Mäusen (Tabelle VIII) oder 0,1 ml der Kulturmedien aus den Hybridomen (Tabelle IX) den Vertiefungen zugegeben; die Vertiefungen wurden über Nacht bei 4ºC inkubiert. Anschließend wurde die Flüssigkeit aus jeder Vertiefung durch Absaugen entfernt. Zu jeder Vertiefung wurden 0,1 ml an ¹²&sup5;I-markiertem Schaf-anti-Maus-Antikörper, verdünnt in 1 % w/v BSA in PBS, enthaltend etwa 600000 DPM /ml (Zerfälle pro Minute pro ml), zugegeben. Die Vertiefungen wurden 4 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Flüssigkeit aus jeder Vertiefung wurde durch Absaugen entfernt, und die Vertiefungen wurden 3 Mal mit 0,2 ml 1% w/v BSA in PBS gewaschen. Die an jede Vertiefung gebundene Radioaktivität (DPM), die an menschliches HDL gebundene Maus-Antikörper repräsentiert, wurde einem Radiotest unterworfen; die Ergebnisse sind unten in den Tabellen VIII und IX angegeben.
- Die Tabelle VIII zeigt die Ergebnisse, die erhalten wurden, wenn die Mäuse mit menschlichem LDL als Antigen injiziert wurden. Die Ergebnisse des Prä-Immunserums beziehen sich auf getestete Antikörper, die erhalten wurden, bevor die Mäuse mit HDL injiziert wurden, und die Immunserumergebnisse beziehen sich auf getestete Antikörper, die nach der Injektion mit HDL erhalten wurden. Der Screeningtest für die Mäuse-Antikörperproduktion wird bei Serumverdünnungen von 1:10, 1:100, 1:1000, 1:2500, 1:5000 und 1:10000 durchgeführt. Wie aus Tabelle VIII ersichtlich ist, zeigte die Maus 1 eine 31-fache Zunahme an gebundenen DPM (Prä-Immun-gegen Immunserum) unter Verwendung eines 1:10000 verdünnten Serums, während die Maus 2 eine 13-fache Zunahme an gebundenem DPM (Prä-Immun gegen Immunserum) unter Verwendung der Ergebnisse von 1:10000 verdünnten Seren zeigte. Die Ergebnisse zeigten, daß beide Mäuse gegen menschliches HDL hoch immunisiert waren; die Maus 1 zeigte jedoch eine höhere Konzentration an spezifischer Antikörperproduktion gegen HDL. TABELLE VIII Testergebnisse unter Verwendung von polyklonalen Mausantikörpern gegen HDL Maus Verdunnung Prä-Immunserum
- Tabelle IX zeigt die Ergebnisse, die erhalten wuren, wenn die Medien aus den Hybridomen (Kulturüberstände), hergestellt aus der Milz von Maus 1 (Tabelle VIII), auf die Produktion von monoklonalem Antikörper getestet wurden. Die Produktion von monoklonalen Antikörpern, die für menschliches HDL spezifisch sind, wird durch eine 50-fache Zunahme über die negative Kontrolle angezeigt. Jeder der in Tabelle IX angegebenen 5 Klone repräsentiert eine Einzelzellinie, die einen einzelnen monoklonalen Antikörper gegen menschliches Apo A-I produziert. TABELLE IX Testergebnisse unter Verwendung von monoklonalen Maus-Antikörpern gegen menschliches Apo A-I Negativ Klon
- Von HDL wurde das Lipid durch Verdünnung von 1,0 ml HDL in einer Lösung aus 10 ml Chloroform, 10 ml Methanol und 20 ml Diethylether bei 4ºC entfernt. Die Apolipoproteine von HDL bilden ein weißes Präzipitat, welches durch Zentrifugation bei 10000 x g für 20 Minuten bei 4ºC gesammelt wurde. Das Präzipitat wurde 1 Mal mit 20 ml Diethylether gewaschen, und anschließend wurde der Diethylether durch Absaugen entfernt. Das Präzipitat wurde auf etwa 35ºC erwärmt, um den restlichen Diethylether zu entfernen und anschließend in einer Lösung aus 0,067 M 2-Amino-2- hydroxymethyl-1,3-propandiol/HCl-Puffer, pH 6,8, enthaltend 2% w/v an Natriumdodecylsulfat, 10%, v/v, Glycerin und 5% v/v 2-Mercaptoethanol, gelöst. Nach dem Lösen des Apolipoprotein-Präzipitates wurde die Lösung für 3 Minuten auf 100ºC erhitzt; anschließend ließ man die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen. Die Proteine in der Lösung wurden entsprechend ihrem Molekulargewicht durch Elektrophorese in Natriumdodecylsulfat aufgetrennt, wie dies für Apo B in Beispiel 1d beschrieben wurde. Die auf dem Acrylamidgel aufgetrennten Apolipoproteine wurden durch Elektrophorese auf eine Nitrocellulosefaser übertragen. Nachdem die Proteine auf die Nitrocellulosefasern übertragen wurden, wurde ein dünner Streifen abgeschnitten und gefärbt, um die Position der Proteinbanden für eine spätere Bezugnahme sichtbar zu machen. Das verbleibende Blatt wurde wie oben für Apo B in 1d beschrieben behandelt, mit der Ausnahme, daß die Kulturüberstände der gegen Apo A-I hergestellten einzelnen Hybridome mit den Streifen über Nacht inkubiert wurden. Die Reaktion des monoklonalen Antikörpers gegen die auf die Nitrocellulosestreifen übertragenen aufgetrennten Apolipoproteine von HDL wurde unter Verwendung einer mit Ziege-anti-Maus-Antikörper konjugierten alkalischen Phosphatase nachgewiesen, wie dies in 1d beschrieben wurde. Die Apo A-I-Spezifität der monoklonalen Antikörper wurde durch Immunreaktion der Apo A-I-Banden mit charakteristischem Molekulargewicht auf den Nitrocellulosestreifen bestimmt.
- Jodipamidethylester (IDE)-Teilchen wurden dadurch hergestellt, daß zwei Teile einer wäßrigen Lösung (0,1% w/v) aus Polyvinylpyrrolidon (15000 MW) mit einer Geschwindigkeit von 5 ml/Min. zu einer kalten (4ºC), schnell gerührten Lösung aus einem Teil IDE (5% w/v) in Dimethylsulfoxid (DMSO) und einem Teil Ethanol zugegeben wurden. Sofort nach der Bildung der Teilchen wurden zu 1,0 ml IDE- Teilchen 1,0 ml an menschlichem Lipoprotein mit hoher Dichte, enthaltend ¹²&sup5;I-markiertes Apo A-I bekannter Protein-spezifischer Aktivität (Zerfälle pro Minute pro mg Protein) und bei Konzentrationen zwischen 0,5 ug und 2,5 ug Protein pro ml, zugegeben. Die Teilchen und die Proteine wurden vermischt, und anschließend wurden die Teilchen durch die Zugabe von menschliches Serumalbumin enthaltendem PBS bei einer Konzentration von 0,1% w/v gewaschen und zentrifugiert. Nach dem Entfernen der Waschlösung durch Absaugen wurden die Teilchen resuspendiert und wiederum gewaschen, bis die in die Waschlösung freigesetzte Radioaktivität vernachlässigbar war (etwa 4 Waschungen). Das gebundene ¹²&sup5;I-markierte Apo A-I wurde anschließend einem Radiotest unterworfen, und die durch die IDE-Teilchen gebundene Menge an Apo A-I wurde unter Verwendung der spezifischen Aktivität des ursprünglichen ¹²&sup5;I-markierten Apo A-I (DPM/mg Protein) bestimmt. Die Ergebnisse sind in der unten angegebenen Tabelle X gezeigt. TABELLE X Apolipoprotein A-I,gebunden an IDE-Teilchen Mikrogramm zugegeben Mikrogramm gebunden
- Jodipamidethylester (IDE)-Teilchen mit angelagerten Epitopen von Apo A-I (A/IDE-Teilchen) wurden mit für Apo A-I spezifischen monoklonalen Antikörpern durch Inkubation über Nacht bei 4ºC umgesetzt. Nach der Inkubation wurden die Teilchen in PBS, enthaltend 0,1% Rinderserumalbumin, gewaschen, und anschließend wurden die Teilchen mit Biotin-konjugiertem anti-Maus-Schafantikörper und anschließend mit Fluoreszein-konjugiertem Avidin für 30 Minuten bei Raumtemperatur, wie in 1f beschrieben, umgesetzt. Die Apo A-I/IDE-Teilchen wurden 3 Mal in 0,1% Rinderserumalbumin enthaltendem PBS gewaschen, und anschließend wurden die fluoreszierenden Teilchen unter Verwendung einer Fluoreszenz-aktivierten Durchflußcytometrie analysiert. Die Ergebnisse sind in der untenstehenden Tabelle XI angegeben. TABELLE XI Reaktivität des anti-Mensch Apo A-I-monoklonalen Antikörpers gegen Apo A-I/IDE-Teilchen unter Verwendung der Fluoreszenz-aktivierten Durchflußcytometrie Präparation Kanalmittel ausschließlich IDE-Teilchen Negative Färbungskontrolle Irrelevanter monoklonaler Antikörper Monoklonaler Antikörper gegen menschliches Apo A-I
- Unter Verwendung dieses Verfahrens wurde die Fluoreszenz der Apo A-I/IDE-Teilchen auf einer Fluoreszenz-pro-Teilchen-Basis bestimmt. Die Ergebnisse sind als Kanalmittel oder als Durchschnitt der Fluoreszenz wiedergegeben und repräsentieren die mittlere Fluoreszenz pro Teilchen. Je höher der Kanal, desto mehr Fluoreszenz pro Teilchen und desto mehr an monoklonalem Antikörper wurde an die Teilchen gebunden. Die Skala ist nicht linear, sondern logarithmisch. Demnach zeigt der Unterschied im Kanalmittel der negativen Färbungskontrolle, Apo A-I/IDE-Teilchen alleine und irrelevanter monoklonaler Antikörper, verglichen mit den für die Epitope von menschlichem Apo A-I spezifischen monoklonalen Antikörpern von 9 und 66 klar, daß (1) Epitope von Apo A-I an die IDE-Teilchen angelagert wurden; (2) die monoklonalen Antikörper an die Apo A-I/IDE-Teilchen banden und (3) die Reaktion für die Epitope von Apo A-I spezifisch ist. Dieses Beispiel zeigt, daß Apo A-I-Epitope an Teilchen derart angelagert werden können, daß die Epitopreaktivität für spezifische monoklonale Antikörper beibehalten wird.
- Alle nachfolgenden Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den in Beispiel (4) beschriebenen Verfahren durchgeführt. Das Lipoprotein von hoher Dichte (HDL) wurde aus menschlichem Serum durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation isoliert, und die anti-Mensch HDL-monoklonalen Maus-Antikörper wurden aus Mäusen hergestellt, die mit HDL immunisiert waren. Hybridome wurden auf spezifische monoklonale Antikörperproduktion gegen menschliches HDL gescreent, und die Apo A-I-Spezifitäten der so hergestellten monoklonalen Antikörper wurden bestimmt.
- ¹²&sup5;I-markiertes Apo A-I (Apo A-I) mit einer bekannten Protein-spezifischen Aktivität (Zerfälle pro Minute pro mg Protein) und bei Konzentrationen zwischen 0,49 mg/ml und 15,6 mg/ml in PBS wurde zu Polyvinylchlorid mit einer Oberfläche von 7,1 mm² zugegeben. Die Lösung wurde über Nacht bei 4ºC inkubiert, und anschließend wurde die Oberfläche 3 Mal in 1% w/v BSA in PBS gewaschen. Nach dem Entfernen der Waschlösung durch Absaugen wurde das oberflächengebundene ¹²&sup5;I-markierte Apo A-I einem Radiotest unterzogen, und die durch das Polyvinylchlorid gebundene Masse wurde unter Verwendung der spezifischen Aktivität des ursprünglichen ¹²&sup5;I-Apo A-I bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle XII angegeben. TABELLE XII Bindung von menschlichem Apolipoprotein A-I an Polyvinylchlorid Mikrogramm zugegeben Mikrogramm gebunden
- Eine Polyvinylchloridoberfläche von 7,1 mm² wurde mit menschlichem HDL bei einer Konzentration von 1,5 ug/ml in 0,15 M Natriumcarbonat / 0,35 M Natriumbicarbonat, pH 9,0 bei 4ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Fläche 3 Mal in einer Lösung aus 1% w/v BSA in PBS gewaschen und in der gleichen Lösung 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Flüssigkeit von der Oberfläche durch Absaugen entfernt, und es wurde 0,1 ml einer 1:250 Verdünnung des Kulturüberstandes aus einem monoklonale Antikörper gegen Apo A-I produzierenden Hybridom zugegeben. Sofort anschließend wurden 0,1 ml menschliches HDL, enthaltend 10 und 100 ng Apo A-I zugegeben, um mit Polyvinylchlorid-stabilisierten Epitopen von Apo A-I zu kompetieren. Die Mischung wurde 16 Stunden lang bei 4ºC inkubiert, und anschließend wurde die Oberfläche 3 Mal unter Verwendung einer Lösung aus 1% w/v BSA in PBS gewaschen. Die Bindung des monoklonalen Antikörpers an Polyvinylchlorid-stabilisierte Epitope von Apo A- I wurde durch eine abschließende Inkubation mit ¹²&sup5;I-markiertem anti-Maus/Schaf-Antikörper nachgewiesen. Die Ergebnisse des Konkurrenztests sind in der unten angegebenen Tabelle XIII angeführt. Je mehr HDL-Apo A-I zugeben wurde, desto geringer war die an die Polyvinylchloridstabilisierten Epitope von Apo A-I gebundene Radioaktivität. Der Prozentsatz an gebundenen zu insgesamt zugegebenen Zählimpulsen (Y-Achse) kann graphisch gegen die Konzentration von HDL aufgetragen werden, um eine Standardkurve herzustellen. TABELLE XIII Kompetitiver Immuntest von an eine Polyvinvlchloridoberfläche gebundenem Apo A-I und von menschlichem HDL-Apo-A-I unter Verwendung eines anti-Mensch-Apo-A-I-monoklonalen Antikörpers Verdünnung gebundene DPM % Gesamtzählimpulse Puffer alleine
- Die Erfindung ist insbesondere zur Bestimmung der mit Cholesterin assoziierten Lipoproteinbestandteile nutzbringend verwendbar, und die Erfindung umfaßt einen auf monoklonalen Antikörpern basierenden Immuntestkit zur Bestimmung der Lipoproteinbestandteile in biologischen Flüssigkeiten, um das mit koronararteriellen Erkrankungen verbundene Risiko abzuschätzen, wie im Anspruch 19 näher ausgeführt wird.
- Weiterhin kann der Kit auch beliebige andere Materialien beinhalten, die in der Beschreibung der vorliegenden Erfindung als nutzvoll angegeben wurden.
Claims (19)
1. Verfahren zur Herstellung teilchenstabilisierter Epitope
zur Verwendung als Standards und Kontrollen für
Immuntests einer antigenen Substanz, wobei das Verfahren die
folgenden Schritte umfaßt:
a) Auswählen eines monoklonalen Antikörpers, der ein
Produkt einer Einzelzellinie ist, der die
Reaktivität gegen das Epitop beibehält, nachdem das Epitop
an die Teilchen angelagert ist;
b) Isolieren des Epitops durch Immunaffinität unter
Verwendung des monoklonalen Antikörpers, der für die
zu untersuchende antigene Substanz spezifisch ist;
c) Stabilisieren des Epitops durch Anlagerung an
Teilchen;
d) Herstellen teilchenstabilisierter Epitope als
Standards durch Verdünnung in gepufferten wässrigen
Trägern auf bekannte Konzentrationen im Bereich des
0,01 bis 10-fachen des normalen Wertes der antigenen
Substanzen oder, alternativ hierzu,
e) Herstellen teilchenstabilisierter Epitope als
Kontrollproben durch Suspendieren in einer Flüssigkeit,
die die Zusammensetzung der Testprobe nachahmt,
jedoch kein anderes Epitop enthält, welches mit dem
monoklonalen Antikörper reagiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Epitop eine
Determinante einer antigenen Substanz ist, ausgewählt aus der
Gruppe, bestehend aus dem intakten Antigen, einem
chemisch modifizierten Antigen, einem Antigenfragment,
einem chemisch synthetisierten Antigen, einem biologisch
synthetisierten Antigen und Hapten, welches die
Fähigkeit, mit dem monoklonalen Antikörper zu reagieren,
beibehält.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die antigene Substanz
ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus einem
Protein, Peptid, Kohlenhydrat, Protein-Kohlenhydratkomplex,
Lipid-Protein-Kohlenhydratkomplex, Immunglobulin und
Nukleinsäure.
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Epitop von einem
Lipoprotein abstammt, ausgewählt aus der Gruppe,
bestehend aus einem Lipoprotein von hoher Dichte, einem
Lipoprotein von geringer Dichte und einem Lipoprotein von
sehr geringer Dichte.
5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die antigene Substanz
chemisch in Fragmente geschnitten wird, die Epitope
enthalten.
6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Epitope durch
chemische Bindung an Teilchen stabilisiert werden.
7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Epitope durch
physikalische Adsorption an Teilchen stabilisiert werden.
8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Teilchen aus einer
Substanz zusammengesetzt sind, ausgewählt aus der Gruppe,
bestehend aus Latex, Stärke, Harz, Ester, organischen
Säuren und organischen Basen, die in biologischen
Flüssigkeiten unlöslich sind.
9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Teilchen aus
Iodipamidethylester (IDE) bestehen.
10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Dichte der Teilchen
im Bereich von 0,1 bis 10 g/cm³ liegt.
11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der mittlere Durchmesser
der Teilchen im Bereich von 1 bis 100.000 nm mit einem
Variationskoeffizienten von weniger als 25% liegt.
12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die
teilchenstabilisierten Standards und Kontrollen als Lyophilisate hergestellt
werden.
13. Verfahren nach Anspruch 1, wobei 2 bis 20 distinkte
Epitope, die von der gleichen antigenen Substanz stammen, an
Teilchen stabilisiert werden, um als Kontrollen und
Standards für Immuntests der antigenen Substanz zu dienen.
14. Verfahren nach Anspruch 1, wobei 2 bis 20 Epitope
verschiedener antigener Substanzen an Teilchen stabilisiert
werden, um als Kontrollen und Standards für den Immuntest
zwischen 2 und 20 verschiedener antigener Substanzen zu
dienen.
15. Verfahren nach Anspruch 1, 13 und 14, wobei die 2 bis 20
Epitope durch 2 bis 20 verschiedene monoklonale
Antikörper definiert werden, die Produkte von 2 bis 20
verschiedenen Zellinien sind.
16. Verfahren nach Anspruch 1, wobei 2 bis 20 Epitope, die
von antigenen Substanzen abstammen, an Teilchen
stabilisiert
werden, die in ihren physikalischen Eigenschaften
von einander abweichen, einschließlich der Gruppe der
Eigenschaften, bestehend aus Größe, Dichte,
Zusammensetzung und Aussehen, um die Trennung dieser Epitope nach
der Reaktion mit ihren jeweiligen monoklonalen
Antikörpern zu erleichtern.
17. Zusammensetzung mit teilchenstabilisierten Epitopen zur
Verwendung als Standards für Immuntests von antigenen
Substanzen, die wie folgt hergestellt werden:
a) Auswählen eines monoklonalen Antikörpers, der ein
Produkt einer Einzelzellinie ist, der die
Reaktivität gegen das Epitop beibehält, nachdem das Epitop
an die Teilchen angelagert ist;
b) Isolieren des Epitops durch Immunaffinität unter
Verwendung des monoklonalen Antikörpers, der für die
zu untersuchende antigene Substanz spezifisch ist;
c) Stabilisieren des Epitops durch Anlagerung an
Teilchen;
d) Herstellen teilchenstabilisierter Epitope als
Standards durch Verdünnen in gepufferten wässrigen
Trägern auf bekannte Konzentrationen im Bereich des
0,01 bis 10-fachen der normalen Werte der antigenen
Substanzen.
18. Zusammensetzung mit teilchenstabilisierten Epitopen zur
Verwendung als Kontrollen für Immuntests von antigenen
Substanzen, die wie folgt hergestellt werden:
a) Auswählen eines monoklonalen Antikörpers, der ein
Produkt einer Einzelzellinie ist, der die
Reaktivität gegen das Epitop beibehält, nachdem das Epitop
an die Teilchen angelagert ist;
b) Isolieren des Epitops durch Immunaffinität unter
Verwendung des monoklonalen Antikörpers, der für die
zu untersuchende antigene Substanz spezifisch ist;
c) Stabilisieren des Epitops durch Anlagerung an
Teilchen;
d) Herstellen teilchenstabilisierter Epitope als
Kontrollproben durch Suspendieren in einer Flüssigkeit,
die die Zusammensetzung der Testprobe nachahmt,
jedoch kein anderes Epitop enthält, welches mit dem
monoklonalen Antikörper reagiert.
19. Auf einem monoklonalen Antikörper basierender
Immuntestkit zur Bestimmung von Lipoproteinbestandteilen in
biologischen Flüssigkeiten, um das Risiko von Komplikationen
koronararterieller Erkrankungen zu bewerten, wobei die
Bestandteile einen monoklonalen Antikörper mit einer
Affinität für ein Lipoprotein und ein stabilisiertes
Lipoproteinepitop umfassen, hergestellt gemäß dem Verfahren
nach einem der Ansprüche 1 bis 16.
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