DE2934756C2

DE2934756C2 - Zusammensetzung zur Bestimmung von beta 2 -Humanmikroglobulin und Verfahren zu deren Herstellung und deren Anwendung

Info

Publication number: DE2934756C2
Application number: DE19792934756
Authority: DE
Inventors: Takashi Higashiyamato Tokio/Tokyo Ogura; Tesuo Tokio/Tokyo Tomiyama
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1978-08-28
Filing date: 1979-08-28
Publication date: 1984-11-08
Also published as: JPS5530652A; SE7907118L; FR2435039B1; GB2030294A; DE2934756A1; GB2030294B; CH645727A5; FR2435039A1; SE446130B

Description

Die Erfindung betrifft eine Zusammensetzung zur Bestimmung von ß-Humanmlkroglobulln, bestehend aus Trägerteilchen und einem auf die Oberfläche der Trägerteilchen aufgebrachten /VHumanmikroglobulin-Antikörper, ein Verfahren zu deren Herstellung und ein Verfahren zur Bestimmung von /?j-Humanmlkroglobulln unter Verwendung der Zusammensetzung.

/?j-Humanmlkroglobulin ist ein Protein mit einem relativ niedrigen Molekulargewicht von etwa 12 000 und es wird im Serum, im Urin, Cerebrosplnalflüssigkelt, Speichel, Milch oder dergleichen von Menschen gefunden. Die Wirkung In vivo von /?₂-Mlkroglobulln 1st bis jetzt noch nicht vollständig geklärt. Es wurde jedoch vor kurzem gefunden, daß bei bestimmten Krankheiten, wie Entzündungen, Karzinomerkrankungen und Nlerenerkrankungen der Gehalt an /?_:-Mlkroglobulin in den Körperflüssigkelten des Patienten ansteigt. Beispielsweise sind Nierenerkrankungen In solche, welche durch Glomerularstörung hervorgerufen werden, und in solche, welche durch Störungen In Hamkanälchen verursacht werden, unterteilt. Im letzteren Fall nimmt die Menge an ^2-Mikroglobulln zuerst Im Blut, genauer Im Serum, und dann Im Urin zu.

Das /3:-Mikroglobulin 1st ein Protein, welches die Glomerularbasalmembran durchdringt und dann von den Nlerenkanüichen oder Hamkanälchen absorbiert wird. Wenn jedoch eine Störung der Hamkanälchen auftritt, sickert dieses Protein In den Urin, ohne erneut absorbiert zu werden. Demgemäß ist der ^2-Mlkroglobullnspiegel Im Urin einer der besten Parameter für die Wirkung der Hamkanälchen. Auf diese Welse kann eine Störung der Nieren- oder Hamkanälchen durch die Bestimmung des Spiegels von ß-Mlkroglobulln im Serum und Urin diagnostiziert werden.

so Bisher war kein geeignetes Mittel zur Beurteilung einer Erkrankung der Nieren- oder Hamkanälchen verfügbar. Sie kann jedoch nun mühelos durch die Bestimmung des ^-Mikroglobullnsplegels Im Serum und Urin diagnostiziert werden, wodurch ein Weg für eine geeignete Behandlung der Erkrankung eröffnet wird. Dies Ist für die klinische Anwendung äußerst wichtig und wertvoll.
Es bestand ein Interesse für die Entwicklung eines Verfahrens, durch welches ^-Humanmikroglobulln im Serum oder im Ur:n mit einem hohen Ausmaß an Genauigkeit und Zuverlässigkeit bestimmt werden kann. Jedoch erwies sich keines der gebräuchlichen Mittel für die Bestimmung von ^-Humanmlkroglobulln als zufriedenstellend. Eine bekannte Maßnahme 1st ein Verfahren einer einzelnen Radiallmmunodiffuslon, bei welchem in einer Agarplatte, welche einen ^-Humanmlkroglobulln Antikörper enthält, Vertiefungen geschaffen werden, In diese Vertiefungen eine Versuchsprobe eingefüllt wird und aus einem Ausfällungsband, welches bei der Diffusion von /?₂-Mlkroglobulln auftritt, das /32-HumanmlkrogIobulln bestimmt wird. Da dieses Verfahren eine niedrige Empfindlichkeit besitzt, kann damit das ^-Mlkroglobulln in der Versuchsprobe lediglich In einer Konzentration oberhalb einer bestimmten Grenze bestimmt werden.

Die Radlolmmunoassay-Methode Ist ebenfalls eine gebräuchliche Methode, nach welcher /Jj-Mikroglobulln unter Verwendung eines mit einem Radioisotopen Indizierten ^-Humanmlkroglobulln-Antlkörper gemessen wird (vgl. Scand. J. elin. Lab. Invest., Vol. 28, 1971. S. 439-443). Dieses Verfahren Ist jedoch gefährlich und mühsam, da es die Verwendung einer radioaktiven Substanz umfaßt. Es kann daher nicht durchgeführt werden, wenn nicht eine ausreichende Kontrolle und Einrichtungen zur Anwendung der radioaktiven Substanz zur Verfügung stehen.

Ein weiteres Beispiel ist ein Verfahren unter Anwendung einer passiven Umkehr-Hämagglutlnationsreaktion (RPHA), nach welchem ft-Mikroglobulln mit einer äquivalenten Empfindlichkeit wie bei der Radiolmmunoassay-Methode mühelos bestimmt werden kann, vgl. Jap. J. Clin. Path., Vol. 25, 1977, Suppl., Bericht Nr. 54. Da als Träger rote Blutzellen eines Tiers verwendet werden, hat dieses Verfahren den Nachteil, da3 bei der Herstellung von antikörpersensibilisierten roten Blutzellen Vorbehandlungen der roten Blutzellen, z. B. die Fixierung der roten Blutzellen und Behandlung der roten Blutzellen mit Bindereagenzien, wie Glutaraldehyd oder Gerbsäure erforderlich sind. Da außerdem eine nicht spezifische Reaktion, welche einem Antikörper für die als Träger verwendeten roten Blutzellen zugeschrieben wird, bei der praktischen Bestimmung häufig auftritt, ist es notwendig, eine Absorptionsbehandlung mit den roten Blutzellen und einen Kontrollversuch unter Verwendung von gegerbten Zellen durchzuführen.

Schließlich beschreibt auch die DE-OS 22 04 684 ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern, bzw. Antigenen in einer Körperflüssigkeit, wobei synthetische Polymerlatexteilchen anstelle von roten Blutkörperchen verwendet werden (vgl. insbesondere Seite 4, letzter Absatz und Seite 16, Zeilen 4 bis 6). Jedoch wird auch in dieser Druckschrift nichts über eine Zusammensetzung zur Bestimmung von ft-Humanmikroglobulin oder über ein Verfahren zu dessen Bestimmung erwähnt. Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung einer neuen Zusammensetzung zur Bestimmung von ft-Humanmlkroglobulin (sowohl qualitativ als auch quantitativ), die eine überlegene Lagerungsstabilität besitzt und ml» guter Reproduzierbarkeit und einem hohen Grad an Genauigkeit rasch zuverlässige Ergebnisse liefert ohne Störung durch andere Proteine, welche in den Versuchs- oder Testproben enthalten sein können, wobei eine einfache Bestimmungsarbeitsweise und einfache Bestimmungsinstrumente zur Anwendung gelangen können. Ferner bezweckt die Erfindung die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung der genannten Zusammensetzung, sowie ein Verfahren zur Bestimmung von /J₂-Humanmikroglobu-Hn im menschlichen Urin oder Serum unter Verwendung der genannten Zusammensetzung.

Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt gemäß der Erfindung durch die Schaffung einer Zusammensetzung zur Bestimmung von ft-Humanmlkroglobulln, bestehend aus Trägertei'chen und einem auf die Oberfläche der Trägerteilchen aufgebrachten ft-Humanmikroglobulin-Antikörper, die dadurch gekennzeichnet 1st, daß die Trägerteilchen aus synthetischen Polymerlatexteilchen vom Styroltyp mit einem spezifischen Gewicht von 1,1 bis 1,4 bestehen und aus der Gruppe von Teilchen eines Styrolpolymeren, Styrolcopolymeren und carboxylierten oder Aminogruppen enthaltenden carboxylierten Produkten hiervon ausgewählt sind.

Ferner wird gemäß der Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung von ß-Humanmlkroglobulln Im menschlichen Urin oder Serum unter Verwendung einer Zusammensetzung, bestehend aus Trägerteilchen und einem auf die Oberfläche der Trägerteilchen aufgebrachten /Jj-Humanmlkroglobulln-Antikörper geschaffen, das dadurch gekennzeichnet 1st, daß die Trägerteilchen aus synthetischen Polymerlatexteilchen vom Styroltyp mit einem spezifischen Gewicht von 1,1 bis 1,4 bestehen und aus der Gruppe von Teilchen eines Styrolpolymeren, Styrolcopolymeren und carboxylierten oder Aminogruppen enthaltenden carboxylierten Produkten hiervon ausgewählt sind.

Die Mittel oder Verfahren zur Bestimmung von /}₂-Humanmikroglobulln sind frei von den Nachteilen und Mängeln der gebräuchlichen, vorstehend beschriebenen Arbeitswelsen und liefern zuverlässige Ergebnisse mit einem hohen Ausmaß an Genauigkeit unter Verwendung eines einfachen Gerätes und unter Anwendung einer einfachen Bestimmungsarbeitsweise.

Sie besitzen eine hervorragende LagerbestEndlgkelt und sind bei der raschen Bestimmung der Konzentration von /32-Humanmlkroglobulin in einer Versuchsprobe mit einem hohen Ausmaß an Genauigkeit und Zuverlässigkeit und einer guten Reproduzierbarkelt sehr wertvoll, wobei ein einfaches Meßinstrument und eine mühelose Bestimmungsarbeitsweise zur Anwendung gelangen, und wobei keine Störung durch andere Proteine, welche In der Versuchsprobe enthalten sein können, auftritt. Es wurde auch gefunden, daß die vorstehend genannte Zusammensetzung in einfacher Weise hergestellt und nicht nur als Latex, sondern auch als getrocknetes Produkt gelagert werden kann.

/J₂-Humanmlkroglobulln Ist in verschiedenen menschlichen Körperflüssigkelten vorhanden. So körnen Urin, Milch, Serum und dergleichen als Ausgangs-/?₂-Humanmlkroglobulln für die Herstellung des /VHumanmikroglobulin-Antlkörpers In der Zusammensetzung gemäß der Erfindung verwendet werden. Am zweckmäßigsten iii wird das Ausgangsmaterial aus dem Urin eines Patienten, der an einer der vorstehend beschriebenen Krankhel- so

ten erkrankt Ist, hergestellt. Die Abtrennung des /J₂-Humanmikroglobullns kann unter Anwendung von

verschiedenen, an sich bekannten Arbeltswelsen ausgeführt werden. Beispiele für derartige Arbeltswelsen umfassen ein Zonenelektrophoretlsches Verfahren, das Verfahren von Berggärd u. a. (I. Berggärd et al: J. Blol. Chem., ij; 243, 4095, 1968) durch Ionenaustausch-Chromatographie, Gelfiltration und das Verfahren von Ohsawa u. a. (M.

Ohsawa et al: Experlentla, 29, Ϊ179, 1973).

Ii Das AusgangS'/Jj-Humanmlkroglobulln Ist zweckmäßig eine Probe eines einzigen Proteins, da der Einschluß

|-^r! von Verunreinigungen den nachfolgenden Arbeltsgang erschwert.

!i; Ein Antikörper des ft-Humanmikroglobullns, welches unter Anwendung der vorstehend genannten bekann-

% ten Arbeltsweisen erhalten werden kann, kann durch Verabreichung des /?₃-Mlkroglobullns als ein Antigen an

1$ ein Tier mit der Fähigkeit zur Erzeugung eines Antikörpers, z. B. Meerschweinchen, Kaninchen oder Ziegen, in ω

üblicher Weise zur Immunisierung desselben, Abnahme von Blut aus dem Immunisierten Tier und Abtrennung des /!2-Humanmlkroglobulin-Antlkörpers aus dem so erhaltenen Blut hergestellt werden.

Das bei diesem Verfahren verwendete Tier kann Irgendein Tier sein, das die Fähigkeit zur Erzeugung von Antikörpern besitzt. Um jedoch eine große Menge an Antikörper zu erhalten, wird die Verwendung eines großen Tieres bevorzugt. Gewöhnlich sind Kaninchen oder Ziegen geeignet, wobei jedoch das zu verwendende Tier nicht auf diese beschränkt 1st. Die Abtrennung eines /Jj-Humanmlkroglobulin-AnUkörpers aus dem diesen enthaltenden Antiserum kann unter Anwendung von bekannten Maßnahmen ausgeführt werden. Beispielsweise wird das Antiserum ausgesalzen und eine Absorptlon-Elulerung unter Verwendung eines unlöslichen Antigens

wird wiederholt.

Als synthetische Latexteilchen können für die Herstellung der Zusammensetzung für die Bestimmung von ß₂-Humanmikroglobulin gemäß der Erfindung z. B. Polystyrol, carboxyliertes Polystyrol, aminohaltiges carboxyliertes Polystyrol, Styrol/Butadien-Copolymeres, carboxyliertes Styrol/Butadien-Copolymeres, Styrol/Divinylbenzol-Copolymeres und Acrylnitril/Butadie.i/Styrol-Copolymeres verwendet werden.

Bevorzugte Teilchen von synthetischem Polymerlatex sind solche aus der Gruppe von Styrolpolymeren, Copolymeren von Styrol mit einem Monomeren aus der Gruppe von Chlorstyrol, Methylmethacrylat und Vinylidenchlorid und carboxylierte oder amlnohaltlge carboxylierte Produkte hiervon. Diese synthetischen Polymerlatexteilchen können nach Vorbehandlung ihrer Oberflächen mit einem nicht Ionischen oberflächenaktiven Mittel ίο verwendet werden. Beispielsweise werden diese Teilchen bevorzugt verwendet, nachdem ein nicht ionisches oberflächenaktives Mittel vom Äthyienoxydtyp nach einem Verfahren zum Anhaften daran gebracht wurde (vgl. JP-OS Nr. 9716/76), Beispiele für geeignete nichtionische oberflächenaktive Mittel vom Äthylenoxydtyp sind ein Blockcopolymeres von Äthylenoxyd und Polyoxypropylenglykol, Polyoxyäthylenalkyläther und Polyoxyäthylenalkylarylä:her.

Gemäß der Erfindung besitzen die synthetischen Polymerlatexteilchen vorzugsweise einen mittleren Teilchendurchmesser von 0,01 bis 10 μπι, insbesondere 0,1 bis 1 μπι. Zur Erhöhung der Reproduzierbarkeit der Meßergebnisse werden vorzugsweise Teilchen mit einem relativ engen Bereich der Größenverteilung verwendet. Das spezifische Gewicht der Latexteilchen beträgt 1,1 bis 1,4 vorzugsweise 1,1 bis 1,3. Die Bestimmung kann unter Anwendung einer Agglutinationsreaktion auf einer Objektträgerplatte oder als Mikrotitermethode durchgeführt werden. Die Zusammensetzung zur Bestimmung von /^-Humanmikroglobulln gemäß der Erfindung kann in einfacher Weise hergestellt werden. Erfindungsgemäß wird sie dadurch hergestellt, daß man synthetische Polymerlatexteilchen vom Styroltyp mit einem spezifischen Gewicht von 1,1 bis 1,4 aus der Gruppe von Teilchen eines Styrolpolymeren, Siyrolcopolymeren und carboxyllerten oder Aminogruppen enthaltenden carboxylierten Produkten hiervon in einer Konzentration von 0,05 bis 5% mit einem /^-Humanmikroglobulin-Antikörper In einer Konzentration von 0,0001 bis 1% in einem Puffer bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 5 bis 10, Insbesondere 6,5 bis 8, bei einer Temperatur von 4 bis 40° C In Berührung bringt. Das Inberührungbringen kann unter schwachem Rühren während etwa 30 min bis etwa 24 h ausgeführt werden.

Der zur Anwendung gelangende Puffer kann z. B. eine mit Phosphat gepufferte Salzlösung [M/60 Phosphatpuffer (pH 7,2) mit einem Gehalt von 0,15 M NaCl, abgekürzt PBS] und eine glyclngepufferte Salzlösung sein. Erwünschtenfalls kann 0,01 bis 0,1% eines Proteins z.B. Rinderserumalbumin (abgekürzt BSA) zu einer Antikörperlösung vorzugsweise zugesetzt werden, um eine nicht spezifische Agglutination zu verhindern. Nach der Beschlchtungs- oder Überzugsreaktion wird die Reaktionsmischung mehrmals durch Zentrifuglerung in einer neutralen Salzlösung z. B. einer glycingepufferten Salzlösung oder in PBS gewaschen. Schließlich können die Latexteilchen mit dem darauf aufgebrachten Überzug von dem /?₂-Humanmlkroglobuliri-Antikörper In Form einer Suspension in einem Verdünnungsmittel gelagert werden. Das Verdünnungsmittel ist vorzugsweise eine Mischung, die durch Zugabe von etwa 0,1% BSA zu einer glycingepufferten Salzlösung oder zu PBS erhalten, wurde. Es wird ferner bevorzugt, dem Verdünnungsmittel 0,01 bis 0,5% von Natriumazid (NaN₃) zuzusetzen.

Die Zusammensetzung zur Bestimmung von /?2-Humanrnikroglobulin gemäß der Erfindung kann In Form einer Latex-Suspension, wie vorstehend beschrieben, und auch in Form eines getrockneten Produktes vorliegen. Die Zusammensetzung in Form eines getrockneten Produktes kann erhalten werden, indem man einen Stabilisator, z. B. eine Aminosäure (z. B. Glycin oder Natriumglutamat) oder Dextran zu dem vorstehend beschriebenen Verdünnungsmittel zusetzt, die Latexmasse mit dem darauf befindlichen Überzug des ^-Humanmikroglobulin-Antikörpers in dem Verdünnungsmittel suspendiert und die Suspension gefriertrocknet. Die Mengen von Aminosäuren und Dextran sind etwa 1,2 bis etwa 4 Gew.-Teile, beziehungsweise etwa 1,6 bis etwa 6 Gew.-Teile je 1 Gew.-icil Latexteilchen.

Die Zusammensetzung zur Bestimmung von /)₂-Humanmlkroglobulln gemäß der Erfindung besitzt eine gute Stabilität sowohl In Form einer Latex-Suspension als auch in Form eines getrockneten Produktes. Das getrocknete Produkt kann während einer längeren Zeitdauer, beispielsweise während mehrerer Jahre stabil gelagert werden.

so Zur Bestimmung können an sich bekannte Maßnahmen zur Anwendung gelangen; beispielsweise kann die Konzentration von ß-Mlkroglobulln in Serum oder Urin nach einem Mikrotlterverfahren mühelos bestimmt werden. Gemäß dieser Arbeltsweise wird eine bestimmte Menge eines Verdünnungsmittels der vorstehend erläuterten Art anteilsweise auf eine Mikroplatte gegossen und dann wird eine bestimmte Menge einer Versuchsprobe, z. B. von Serum oder Urin, in die erste Bohrung oder den ersten Boden eingeführt und allmäh-Hch mit einem Verdünner verdünnt. Ebenfalls wird eine Verdünnungsreihe In der gleichen Welse unter Verwendung eines Standardantigens hergestellt. Eine bestimmte Menge eines mit /?:-Humanmlkroglobultn-Anttkörpers senslbllislerten Latlces wird zu jeder Verdünnungsreihe zugegeben und damit gemischt. Nach Stehenlassen während einer bestimmten Zeitdauer bei Raumtemperatur wird der Endpunkt der Agglutination beobachtet und die absolute Menge von /?2-Mlkroglobulln kann durch Vergleich mit der Standaidantlgenrelhe bestimmt werden.

Bei dem gebräuchlichen Verfahren der Elnzelradialimmunodlffuslon zur Bestimmung von /^-Mlkroglobulln kann das /^-Mlkroglobulln nicht bestimmt werden, wenn nicht dessen Menge wenigstens 5 μg je ml einer Versuchsprobe beträgt, falls die Versuchsprobe Serum oder Urin Ist. Da die Neigung zum Auftreten von Fehlern bei einem /^-Mlkroglobullngehalt von etwa 5 bis 10 μg besteht, wird eine etwas höhere Konzentration bevorzugt. Im Gegensatz dazu Ist es bei dem Verfahren zur Bestimmung von /J₂-Mlkroglobulin gemäß der Erfindung unter Verwendung des mit dem ^-Humanmikroglobulln-Antlkörper senslbillslerten Latex möglich, eine Bestimmung auszuführen, wenn die Menge von A-Mlkroglobulln mehr als 1 ng je ml beträgt. Somit zeigt das Verfahren gemäß der Erfindung eine sehr hohe Empfindlichkeit, und die Empfindlichkeit Ist derjenigen äquivalent

oder höher als diese der Radiolmmunoassay-Methode, die als eine Methode mit der höchsten Empfindlichkeit bei gebräuchlichen Analysen angesehen wird.

Bei einer anderen Ausführungsform der Bestimmung gemäß der Erfindung wird eine bestimmte Menge einer Versuchsprobe auf eine Objektträgerglasplatte getropft, und gelrennt davon wird eine festgelegte Menge einer /)₂-Humanmlkroglobullnlösung von einer bekannten Konzentration tropfenweise zugegeben. Eine bestimmte Menge des mit dem ^-Humanmikroglobulln-Antikörper senslblllslerten Latex wird zu jeder der Lösungen zugegeben, worauf eine schwache Schwingbewegung erteilt wird. Bei Bewertung des sich ergebenden Agglutinationsmusters kann die Konzentration von dem /J₂-Humanmlkroglobulin in der Versuchsprobe Innerhalb weniger Minuten qualitativ bestimmt werden. Eine halbquantitative Bestimmung kann ebenfalls ausgeführt werden, wenn die Versuchsprobe in einem Probeglas verdünnt wird und die Reaktion mit Bezug auf die jeweilige Verdünnung beobachtet wird.

Die Zusammensetzung für die Bestimmung von ^-Humanmikroglobulin in Form eines Latex oder in Form eines getrockneten Produktes Ist den Zusammensetzungen überlegen, die durch Überziehen von roten Blutkörperchen oder anderen Trägermaterlallen mit /?₂-HumanmikrogIobulin erhalten wurden, da aufgrund des Fehlens einer Antlgenizltät des Trägers nicht-spezifische Reaktionen außer der gewünschten Antigen-Antikörperreaktlon nicht stattfinden, und weil ein /i₂-Humanmlkroglobulin-Antlkörper direkt auf einen Latex mühelos durch einfaches Eintauchen einer Antikörperlösung In den Latex ohne Verwendung eines Binders als Überzug aufgebracht werden kann, und well sie eine gute Lagerstabilität besitzt.

Die neuartige Zusammensetzung gemäß der Erfindung reagiert überhaupt nicht mit anderen Proteinen als dem /?2-Humanmlkroglobulin und der Träger reagiert ebenfalls nicht mit ft-Mikroglobulln.

Die Erfindung wird nachstehend anhand von Herstellungsbelspielen und Arbeltsbelsplelen näher erläutert.

Herstellungsbelsplel 1
Herstellung von /VHumanmikroglobulin:

Ein Kilogramm Ammoniumsulfat wurde zu etwa 2 1 Urin eines an Nierenentzündung erkrankten Patienten gegeben und die Lösung wurde über Nacht bei 4° C stehengelassen. Die gebildete Ausfällung wurde gesammelt und In Wasser gelöst. Das unlösliche Material wurde durch Zentrlfuglerung abgetrennt und die Ausfällung wurde in Salzlösung aufgelöst und auf eine Sephadex GlOO-Säule (ein Produkt von Pharmacia Fine Chemicals Co., Ltd., Schweden) (5 χ 100 cm), gepuffert mit einer 0.02M Trispufferlösung (pH 8,0) mit einem Gehalt von IM Natriumchlorid aufgebracht. Der Puffer wurde bei einem Strömungsausmaß von 40 ml/h fließen gelassen, um eine Gelfiltration auszuführen. 400 ml elulener Fraktionen wurden gesammelt, entsalzen und auf ein Volumen von 10 ml konzentriert. Dann wurde das Produkt auf eine DEAE-Cellulose-Säule (ein Produkt von Brown Company, USA) (2,5 χ 40 cm) gepuffert mit einem 0,01M Phosphatpuffer (pH 7,5) aufgebracht und die Eluierung wurde ausgeführt, während die Konzentration von Natriumchlorid in dem Puffer linear auf 0,2 Mol zunahm. 70 ml einer Proteinfraktion, die an erster Stelle elulert wurde, wurde gesammelt, entsalzen und auf 10 ml konzentriert. Die Flüssigkeit wurde auf eine SP-Sephadex C 50-Säule (Pharmacia Fine Chemicals Co., Ltd., Schweden) (2 χ 35 cm), gepuffert mit einem 0,04M Phosphatpuffer (pH 5,9) aufgebracht und die Eluierung wurde bei einem Strömungsausmaß von 25 ml je h ausgeführt, wobei die Konzentration des Puffers linear auf 0,02 Mol erhöht wurde. 100 ml von Fraktionen von 75 ml bis 175 ml Eluat wurden gesammelt, entsalzen, konzentriert und gefriergetrocknet, wobei 60 ml eines weißen Pulvers erhalten wurden.

Das Produkt zeigte ein einziges Band bei der Scheibenelektrophorese.

Herstellungsbeispiel 2

Herstellung von A-Humanmikroglobulin-Antikörper:

Das im Herstellungsbeispiel 1 erhaltene /^-Humanmikroglobulin wurde In einer physiologischen Salzlösung In einer Konzentration von 4 mg/ml der letzteren aufgelöst. Die Lösung wurde mit einer gleichen Menge eines vollständigen Freundschen Hilfsmittels vermischt. Die Mischung wurde in einer Menge von 0,1 m! In jedes Fußpolster von 4 gesunden Kaninchen mit einem Gewicht von etwa 2,3 bis 2,5 kg dreimal In der Woche eingespritzt. Eine Woche später wurde 1 ml einer 0,l%Igen /32-Humanmlkroglobulinlösung injiziert. Drei Wochen nach der letzten Injektion wurde das Gesamtblut aus der Halsschlagader der Kaninchen entnommen. Das Blut wurde in üblicher Weise zentrifugiert und das sich ergebende Serum wurde bei 56° C während 30 min gehalten, wobei etwa 200 ml Antlserum gebildet wurden.

Aus der Tatsache, daß ein einziges Ausfällungsband mit einem Antigen nach einem Ouchterlony-Verfahren und nach der Immunoelektrophorese gebildet wurde, wurde festgestellt, daß das sich ergebende Antlserum ein einziger Antikörper war.

Herstellungsbeispiel 3 Herstellung von unlöslichem /82-Humanmikroglobulin:

5 mg von ft-Humanmikroglobulin wurden in 5 ml einer 0,2M Essigsäurepufferlösung (pH 5,0) gelöst und etwa 0,5 ml einer 5%Igen Rinderserumalbuminlösung wurden zugegeben. Dann wurde 5%iger Glutaraldehyd tropfenweise zugegeben, bis eine Ausfällung gebildet wurde. Die Ausfällung wurde gesammelt, homogenisiert und mit PBS und dann mit einem Glycin-Salzsäure-Puffer (pH 2,8) und ferner mit PBS gewaschen und bei

unter -20° C gelagert. iff

Herstellungsbeispiel 4 jfi

Reinigung von ft-Humanmlkroglobulin-Antikörper: ;'|

Zu dem Antlserum wurde eine gleiche Menge einer gesättigten Lösung von Ammonlumsulfat gegeben, iw

worauf vollständig gemischt wurde. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur während 30 min stehengelassen. j.#

Die sich dabei bildende Ausfällung wurde durch Zentrlfugalabscheidung gesammelt, mit 0,5 gesättigter Lösung "!';

von Ammonlumsulfat gewaschen und dann gegen PBS dlalysiert. Dann wurde das im Herstellungsbelsplel 3 fe";

hergestellte unlösliche /?2-Humanmikroglobulln zu dem Dialysat zugegeben und die Mischung wurde anschlle- fi

ßend bei Raumtemperatur 30 min stehengelassen. Die Mischung wurde zur Trennung In eine überstehende ^

Flüssigkeit und In eine Abscheidung zentrifugiert. Zu der überstehenden Flüssigkeit wurde erneut unlösliches $.

^-Humanmlkroglobulln zugegeben und die Mischung wurde in gleicher Welse behandelt. Die zwei Ausfällun- !$!

gen wurden vereinigt und mit PBS gewaschen. Dann wurde ein Glycin-Salzsäure-Puffer (pH 2,8) zugegeben und S

die Mischung wurde 5 rnin lang geschüttelt, worauf zentrifugiert wurde. Die Ausfällung wurde !n ähnlicher S

Welse mit einem Glycin-Salzsäure-Puffer behandelt und die sich ergebenden überstehenden Flüssigkeiten verel- p

nlgt. Die Mischung wurde gegen PBS dialysiert, wobei ein gereinigter ft-Humanmikroglobulin-Antikörper gebil- ψ

det wurde. U

i

Arbeitsbeispiel 1 ff

Mit ft-Humanmikroglobulin-Antlkörper sensibillslerter Latex: M

Polystyrollatex (ein Produkt von Takeda Chemical Industry Co., Ltd; SDL 59; spezifisches Gewicht 1,14; Tell- I

chendurchmesser 0,9 μη) wurde mit PBS so verdünnt, daß die Konzentration der Teilchen 0,25% erreichte, worauf eine gleiche Menge eines gereinigten Antikörpers, der bis auf das 60fache mit PBS verdünnt wurde, zugegeben wurde. Die Mischung wurde bei 37° C während zwei Stunden gehalten, worauf zentrifugiert wurde. Die Latexteilchen wurden gesammelt und mit PBS und dann mit einem Verdünnungsmittel gewaschen. Danach wurden die Laiexteilchen bis auf eine Konzentration von 0,25% unter Verwendung eines Verdünnungsmittels suspendiert, wobei ein mit ^-Humanmikroglobulln-Antlkörper senslbllislerter Latex gebildet wurde.

Wenn eine /^-Humanmlkroglobullnlösung zu diesem senslbilisierten Latex zugegeben wurde, trat eine Agglutination ein. Es fand jedoch keine Agglutination statt, wenn Albumin-, IgG-, IgM- und IgA-Lösungen jeweils hierzu zugegeben wurden.

Das verwendete Verdünnungsmittel war PBS mit einem Gehalt an 0,08% BSA und 0,1% Natriumazid.

Arbeitsbeispiel 2
Bestimmung von /?₂-Humanmikroglobulin:

Ein Verdünnungsmittel In einer Menge von 0,025 ml wurde jeweils in eine Bohrung einer Mikroplatte vom V-Typ gegossen und 0,025 ml Serum oder eines mit einem geeigneten Verdünnungsmittel verdünnten Serums wurden der ersten Bohrung zugegeben und mit einem Verdünner nach einem Reihendoppelverdünnungsverfahren allmählich verdünnt. Ferner wurden 0,025 ml einer Standardlösung mit einem Gehalt von 0,01 μg ft-Humanmikroglobulin je ml der ersten Bohrung einer weiteren Reihe zugegeben und In gleicher Welse verdünnt. Dann wurden 0,025 ml des mit ft-Humanmlkroglobulln-Antikörper senslbilisierten Latex In jede der Bohrungen gegossen und nach ausreichendem Vermischen bei Raumtemperatur während mehr als 10 h stehengelassen, um den Endpunkt der Agglutination zu beobachten. Wenn eine Antlgen-Antikörper-Reaktlon stattfand, wurden die Latexteilchen auf der gesamten Oberfläche des Bodens einer Bohrung disperglert. Wenn keine

so Antigen-Antikörper-Reaktion stattfand, sammelten sich die Latexteilchen In der Mitte von jeder Bohrung. Auf diese Welse kann der Endpunkt der Agglutination bewertet werden. Nach dem vorstehend angegebenen Verfahren wuide die Menge von Ä-Mlkroglobulin mit Bezug auf sieben Proben vor. Serjm, das auf das lOOfache verdünnt war, und sieben Proben von Urin, der auf das SOfache verdünnt war, bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle I zusammengestellt.

Tabelle 1: Latexagglutinationswert

Probe

Konzentration von
Standard-Zi-Mlkroglobulln (ng/ml)
Agglutatlonsmuster

Nr.

3 4 5 6 7 8 Konzentration

in der Probe
2.5 1.25 0.625 0.312 0,156 0.078 0,039 (ng/ml)

Gesunder Erwachsener (32 Jahre alter Mann)

Gesunder Erwachsener (43 Jahre alter Mann)

Gesunder Erwachsener (22 Jahre alter Mann)

Leukämie-Patient (9 Jahre alt, männlich) Jahre alter Mann, erkrankt an Magenkrebs Jahre alter Mann, erkrankt an Nlerenversagen Jahre alte Frau, erkrankt an SLE

1
0.5

über 16

Gesunder Erwachsener +

(32 Jahre alter Mann)

Gesunder Erwachsener +

(43 Jahre alter Mann)

Gesunder Erwachsener +

(22 Jahre alter Mann

Jahre alter Mann +

mit Knochenmarkerkrankung (Myeloma)

Jahre alt, männlich +

erkrankt an Leukämie

Jahre alter Mann, +

erkrankt an Nlerenversagen

Jahre alte Frau, +

erkrankt an SLE

Anmerkung: + = positiv; - = negativ

0	.25
0	.13
0	.25
4
4
über 8
4

Arbeitsbeispiel 3 so

Durch Ausführung einer Behandlung in gleicher Weise wie in Arbeitsbeispiel 1 wurde ein Latex sensibllislert.

gewaschen und in einem Verdünnungsmittel mit einem Gehalt
Produkt von Pharmacia Fine Chemicals Co.. Ltd., Schweden) so suspendiert, daß die Konzentration der Latexteilchen 1,25% erreichte. Die Suspension wurde dann In üblicher Weise gefriergetrocknet, wobei eine Zusammensetzung von Latexteilchen mit einer Empfindlichkeit gegenüber einem /82-Humanmikroglobulin-Antlkörper erhalten wurde.

Arbeitsbeispiel 4

Ein Verdünnungsmittel wurde zu der In Arbeitsbeispiel 3 erhaltenen Latexteilchenzusammensetzung mit einer Empfindlichkeit gegenüber ft-Humanmikroglobulln-Antikörper zugegeben. Bei Ausführung der gleichen Arbeltsweise wie in Arbeitsbeispiel 2 wurde dann die Menge von ft-Mlkroglobulin in Serum und Urin bestimmt. Es wurden dabei ähnliche Ergebnisse erhalten.

Aus den in den vorstehenden Beispielen erhaltenen Ergebnissen ist klar ersichtlich, daß die Menge von /S₂-Mlkroglobulin in Serum und Urin von Patienten, die an verschiedenen Krankheiten erkrankt sind, einen offensichtlich höheren Wert als derjenige In den Seren und Urinflüssigkelten von gesunden Erwachsenen zeigten. Demgemäß ist die Bestimmung der Menge von ft-Mlkroglobulin in Blut und Urin äußerst wertvoll für die

Diagnose von diesen Erkrankungen.

Getrennt wurde die Menge von /ij-Mikroglobulln in dem Serum und In Urin von Menschen gemessen, wobei ein mit /Ji-Humanmikroglobulin-Antikörper senslbllislerter Latex, hergestellt aus dem Antiserum einer Ziege unter Anwendung der gleichen Arbeitsweise wie in Herstellungsbeispiel 4 und In den nachfolgenden Arbeitsbeispielen, verwendet wurden. Die Ergebnisse waren völlig die gleichen wie in den vorstehend aufgeführten Tabellen.

Unter Verwendung des mit /ij-Humanmikroglobulin-Antlkörper senslblllsierten Latev oder der den sensibllisierten Latex gemäß der Erfindung enthaltenden Zusammensetzung kann die Menge von /?₂-Mlkroglobulin Innerhalb einer kürzeren Zeltdauer gemessen werden, wenn eine Probe (menschliches Serum oder menschlicher Urin) in einer sehr geringen Menge von weniger als 0,03 ml vorhanden Ist. Die Empfindlichkeit Ist äußerst hoch und ein ng von ^2-Mikroglobulln je 1 ml der Versuchsprobe kann bestimmt werden. Demgemäß gewährt die Zusammensetzung gemäß der Erfindung eine wichtige und brauchbare Information für die Diagnose von Leukämie, Nierenerkrankungen, Entzündungen oder dergleichen, und ihr Anwendungsbereich ist sehr breit. Da ferner die Menge der Versuchsprobe sehr gering sein kann. Ist die Zusammensetzung gemäß der Erfindung besonders geeignet für Kinder, Insbesondere für Neugeborene und Säuglinge, von welchen lediglich eine kleine Blutmenge entnommen werden kann.

Claims

Patentansprüche:

1. Zusammensetzung zur Bestimmung von ft-Humanmlkroglobulln, bestenend aus Trägerteilchen und einem auf die Oberfläche der Trägerteilchen aufgebrachten /fe-Humanmlkroglobulin-Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerteilchen aus synthetischen Polymerlatexteilchen vom Sfyroltyp mit einem spezifischen Gewicht von 1,1 bis 1,4 bestehen und aus der Gruppe von Teilchen eines Styrolpolymeren, Styrolcopolymeren und carboxylierten oder Aminogruppen enthaltenden carboxylierten Produkten hiervon ausgewählt sind.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Latexteilchen einen mittleren ίο Teilchendurchmesser von 0,01 bis 10 μπι besitzen.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie ferner einen Stabilisator aus der Gruppe von Aminosäuren und Dextran enthält.

4. Verfahren zur Bestimmung von /^-Humanmikroglobulin Im menschlichen Urin oder Serum unter Verwendung einer Zusammensetzung, bestehend aus Trägerteilchen und einem auf die Oberfläche der Trägerteilchen aufgebrachten ft-Humanmikroglobulln-Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerteilchen aus synthetischen Polymerlatexteilchen vom Styroltyp mit einem spezifischen Gewicht von 1,1 bis 1,4 bestehen und aus der Gruppe von Teilchen eines Styrolpolymeren, Styrolcopolymeren und carboxylierten oder Aminogruppen enthaltenden carboxylierten Produkten hiervon ausgewählt sind.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung unter Anwendung eines Mikrotlterverfahrens ausgeführt wird.

6. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Bestimmung von ft-Humanmikroglobulln gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man synthetische Polymerlatextelichen vom Styroltyp mit einem spezifischen Gewicht von 1,1 bis 1,4 aus der Gruppe von Teilchen eines Styrolpolymeren, Styrolcopolymeren und carboxylierten oder Aminogruppen enthaltenden carboyyllerten Produkten hiervon In einer Konzentration von 0,05 bis 5% mit einem ^-Humanmikroglobulln-Antikörper in einer Konzentration von 0,0001 bis \% In einem Puffer bei einem pH-Wert Im Bereich von 5 bis 10 bei einer Temperatur von 4 bis 40° C in Berührung bringt.